RU2556128C2 - Профилактическая противораковая вакцина - Google Patents
Профилактическая противораковая вакцина Download PDFInfo
- Publication number
- RU2556128C2 RU2556128C2 RU2010110441/10A RU2010110441A RU2556128C2 RU 2556128 C2 RU2556128 C2 RU 2556128C2 RU 2010110441/10 A RU2010110441/10 A RU 2010110441/10A RU 2010110441 A RU2010110441 A RU 2010110441A RU 2556128 C2 RU2556128 C2 RU 2556128C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- boris
- cells
- functional
- protein
- composition
- Prior art date
Links
- 229940022399 cancer vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 5
- 238000009566 cancer vaccine Methods 0.000 title claims abstract description 4
- 230000001759 immunoprophylactic effect Effects 0.000 title abstract 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 80
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 29
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 101000894428 Homo sapiens Transcriptional repressor CTCFL Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 18
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 102100021393 Transcriptional repressor CTCFL Human genes 0.000 claims abstract 21
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 claims abstract 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 105
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 79
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 78
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 67
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 34
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 33
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 25
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 25
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 24
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 claims description 15
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims description 14
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 9
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 9
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 8
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims description 6
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims description 6
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 5
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000010361 transduction Methods 0.000 claims description 5
- 230000026683 transduction Effects 0.000 claims description 5
- 208000034826 Genetic Predisposition to Disease Diseases 0.000 claims description 3
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 3
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 claims 1
- 230000005975 antitumor immune response Effects 0.000 claims 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 11
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 abstract description 5
- 229940022511 therapeutic cancer vaccine Drugs 0.000 abstract description 2
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 abstract 1
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 abstract 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 80
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 79
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 79
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 60
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 41
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 30
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 29
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 24
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 23
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 22
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 20
- 102000003810 Interleukin-18 Human genes 0.000 description 20
- 108090000171 Interleukin-18 Proteins 0.000 description 20
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 18
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 16
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 16
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 16
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 16
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 15
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 13
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 12
- 230000006870 function Effects 0.000 description 12
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 12
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 11
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 11
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 10
- 101100329707 Mus musculus Ctcfl gene Proteins 0.000 description 10
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 10
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 10
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 9
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 9
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 9
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 9
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 8
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 8
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 8
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 8
- 230000004044 response Effects 0.000 description 8
- 210000001550 testis Anatomy 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 6
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 5
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 5
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 5
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 4
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 4
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 4
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 3
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 3
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 3
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 3
- 101000804764 Homo sapiens Lymphotactin Proteins 0.000 description 3
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 3
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 3
- 102100035304 Lymphotactin Human genes 0.000 description 3
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 3
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 3
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 3
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 3
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 3
- 230000009471 action Effects 0.000 description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 3
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 3
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 3
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 3
- 230000005714 functional activity Effects 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 208000029824 high grade glioma Diseases 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 3
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 3
- 201000011614 malignant glioma Diseases 0.000 description 3
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 3
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 3
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 3
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 3
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 3
- WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 6-Mercaptoguanine Natural products N1C(N)=NC(=S)C2=C1N=CN2 WYWHKKSPHMUBEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 231100000699 Bacterial toxin Toxicity 0.000 description 2
- 102100036849 C-C motif chemokine 24 Human genes 0.000 description 2
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 2
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 2
- 101000599037 Homo sapiens Zinc finger protein Helios Proteins 0.000 description 2
- 102000043129 MHC class I family Human genes 0.000 description 2
- 108091054437 MHC class I family Proteins 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 108010084455 Zeocin Proteins 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000005784 autoimmunity Effects 0.000 description 2
- 239000000688 bacterial toxin Substances 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000036755 cellular response Effects 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 2
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000057056 human CTCFL Human genes 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 230000008775 paternal effect Effects 0.000 description 2
- 210000001539 phagocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N phleomycin D1 Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@H](C)[C@@H](O)[C@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)NCCC=1SC[C@@H](N=1)C=1SC=C(N=1)C(=O)NCCCCNC(N)=N)[C@@H](O[C@H]1[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CO)O1)O[C@@H]1[C@H]([C@@H](OC(N)=O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)C=1N=CNC=1)C(=O)C1=NC([C@H](CC(N)=O)NC[C@H](N)C(N)=O)=NC(N)=C1C CWCMIVBLVUHDHK-ZSNHEYEWSA-N 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- MNRILEROXIRVNJ-UHFFFAOYSA-N tioguanine Chemical compound N1C(N)=NC(=S)C2=NC=N[C]21 MNRILEROXIRVNJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960003087 tioguanine Drugs 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 2
- RAVVEEJGALCVIN-AGVBWZICSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-5-amino-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-6-amino-2-[[(2s)-2-[[2-[[(2s)-2-amino-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]acetyl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]hexanoyl]amino]hexanoyl]amino]-5-(diamino Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 RAVVEEJGALCVIN-AGVBWZICSA-N 0.000 description 1
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006306 Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010083359 Antigen Receptors Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101710125298 Beta-defensin 2 Proteins 0.000 description 1
- 102100038326 Beta-defensin 4A Human genes 0.000 description 1
- 101710176951 Beta-defensin 4A Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100021935 C-C motif chemokine 26 Human genes 0.000 description 1
- 102100025250 C-X-C motif chemokine 14 Human genes 0.000 description 1
- -1 CKβ6 Proteins 0.000 description 1
- 101100028791 Caenorhabditis elegans pbs-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100193519 Caenorhabditis elegans qui-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100455522 Caenorhabditis elegans spr-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010039939 Cell Wall Skeleton Proteins 0.000 description 1
- 102100025064 Cellular tumor antigen p53 Human genes 0.000 description 1
- 108010083647 Chemokine CCL24 Proteins 0.000 description 1
- 108010083698 Chemokine CCL26 Proteins 0.000 description 1
- 102000014464 Chemokine CX3CL1 Human genes 0.000 description 1
- 108010078239 Chemokine CX3CL1 Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100035298 Cytokine SCM-1 beta Human genes 0.000 description 1
- YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N DDT Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1C(C(Cl)(Cl)Cl)C1=CC=C(Cl)C=C1 YVGGHNCTFXOJCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000052510 DNA-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710096438 DNA-binding protein Proteins 0.000 description 1
- 108010002069 Defensins Proteins 0.000 description 1
- 102000000541 Defensins Human genes 0.000 description 1
- 101150029707 ERBB2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000353621 Eilat virus Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102100041003 Glutamate carboxypeptidase 2 Human genes 0.000 description 1
- 102100028976 HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Human genes 0.000 description 1
- 102100029966 HLA class II histocompatibility antigen, DP alpha 1 chain Human genes 0.000 description 1
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010088652 Histocompatibility Antigens Class I Proteins 0.000 description 1
- 102000008949 Histocompatibility Antigens Class I Human genes 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000713078 Homo sapiens C-C motif chemokine 24 Proteins 0.000 description 1
- 101000858068 Homo sapiens C-X-C motif chemokine 14 Proteins 0.000 description 1
- 101000804771 Homo sapiens Cytokine SCM-1 beta Proteins 0.000 description 1
- 101000892862 Homo sapiens Glutamate carboxypeptidase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000986087 Homo sapiens HLA class I histocompatibility antigen, B alpha chain Proteins 0.000 description 1
- 101000864089 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DP alpha 1 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000930802 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DQ alpha 1 chain Proteins 0.000 description 1
- 101000968032 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DR beta 3 chain Proteins 0.000 description 1
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 1
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- 101000578784 Homo sapiens Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001133056 Homo sapiens Mucin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 108010070875 Human Immunodeficiency Virus tat Gene Products Proteins 0.000 description 1
- 108700000788 Human immunodeficiency virus 1 tat peptide (47-57) Proteins 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 1
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 1
- 102100028389 Melanoma antigen recognized by T-cells 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100034256 Mucin-1 Human genes 0.000 description 1
- 241000187481 Mycobacterium phlei Species 0.000 description 1
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 101710149951 Protein Tat Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 230000006044 T cell activation Effects 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 238000010162 Tukey test Methods 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 208000008383 Wilms tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000014102 antigen processing and presentation of exogenous peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 108050002883 beta-defensin Proteins 0.000 description 1
- 102000012265 beta-defensin Human genes 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000002798 bone marrow cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000004520 cell wall skeleton Anatomy 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000003162 effector t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 210000001508 eye Anatomy 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 102000054766 genetic haplotypes Human genes 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 230000008348 humoral response Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012212 insulator Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000007257 malfunction Effects 0.000 description 1
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004216 mammary stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012737 microarray-based gene expression Methods 0.000 description 1
- 239000011325 microbead Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 238000012243 multiplex automated genomic engineering Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009826 neoplastic cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 201000008026 nephroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007764 o/w emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000003571 opsonizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 1
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 description 1
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001481 poly(stearyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000009800 post vaccination immunity Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 208000023958 prostate neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000002303 tibia Anatomy 0.000 description 1
- 230000009258 tissue cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002211 ultraviolet spectrum Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000000689 upper leg Anatomy 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 239000000277 virosome Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K39/4615—Dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
- A61K39/4622—Antigen presenting cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/46—Cellular immunotherapy
- A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
- A61K39/4643—Vertebrate antigens
- A61K39/4644—Cancer antigens
- A61K39/464484—Cancer testis antigens, e.g. SSX, BAGE, GAGE or SAGE
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0639—Dendritic cells, e.g. Langherhans cells in the epidermis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5158—Antigen-pulsed cells, e.g. T-cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
- A61K2039/55511—Organic adjuvants
- A61K2039/55516—Proteins; Peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/60—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characteristics by the carrier linked to the antigen
- A61K2039/6031—Proteins
- A61K2039/6075—Viral proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
- A61K2239/31—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the route of administration
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Inert Electrodes (AREA)
- Bidet-Like Cleaning Device And Other Flush Toilet Accessories (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к биотехнологии и представляет собой иммуногенную композицию для предупреждения и лечения раковых заболеваний, которая содержит нефункциональный BORIS белок, в последовательности которого отсутствуют все «цинковые пальцы». Настоящее изобретение также раскрывает иммунотерапевтическую композицию против рака, содержащую указанный нефункциональный BORIS белок или клетку бактерии, млекопитающего или дрожжей или вирусную частицу, способную к экспрессии указанного нефункционального BORIS белка. Настоящее изобретение раскрывает также способ иммунизации пациента путём введения эффективного количества указанной иммунотерапевтической композиции, а также применение указанной иммунотерапевтической композиции для приготовления вакцины против рака. Изобретение позволяет повысить эффективность профилактической и терапевтической вакцины против рака. 4 н. и 18 з.п. ф-лы, 7 ил., 2 табл., 8 пр.
Description
ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ
Настоящее изобретение относится к композициям и методам, используемым для получения противоопухолевой вакцины.
ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Позвоночные обладают способностью вырабатывать иммунный ответ в качестве защиты от окружающей среды, а также от аберрантных клеток, таких как опухолевые клетки, развивающиеся в организме. Иммунный ответ является результатом сложных взаимодействий различных клеток и факторов, но обычно включает два основных аспекта. Один из них является клеточным иммунным ответом, характеризующимся тем, что специализированные клетки непосредственно атакуют агент-нарушитель (несущий антиген), тогда как второй является гуморальным ответом, при котором молекулы антитела специфически связываются с антигеном и способствуют его элиминации. Действуя совместно, отдельные элементы очень эффективно ограничивают первичную атаку вторгающихся патогенов и выделяют их из организма-хозяина.
Первичными клетками, участвующими в выработке иммунного ответа, являются лимфоциты, которые в целом делятся на два основных класса. Клетки первого из них, называемые В клетками или В лимфоцитами, обычно образуются в костном мозге и, среди других выполняемых функций, ответственны за продуцирование и секретирование антител. Продукты В-клеточных антител имеют тенденцию реагировать непосредственно с чужеродными антигенами и нейтрализовать их или активировать другие компоненты иммунной системы, которая затем их элиминирует. В частности, опсонизирующие антитела связываются с внеклеточными чужеродными агентами, тем самым делая их чувствительными к фагоцитозу и последующему внутриклеточному киллингу. С другой стороны, Т клетки или Т лимфоциты, которые обычно образуются или созревают в тимусе, ответственны за опосредование клеточного иммунного ответа. Эти клетки не распознают весь антиген, но, вместо этого, реагируют на его короткие пептидные фрагменты, которые обнаруживаются на поверхности клетки-мишени, а также антигенпрезентирующей клетки. Более конкретно, очевидно, что белки, продуцированные в клетке или захваченные клеткой из внеклеточного пространства, при нормальном метаболизме непрерывно расщепляются до пептидов. Образующиеся в результате короткие фрагменты ассоциируются с молекулами внеклеточного главного комплекса гистосовместимости (МНС) и комплексы МНС-пептид переносятся на поверхность клетки и распознаются Т-клетками. Таким образом, клеточная иммунная система непрерывно контролирует полный спектр белков, продуцируемых или усваиваемых клетками, и вынуждает элиминировать любые клетки, презентирующие чужеродные антигены или опухолевые антигены, т.е. клетки, инфицированные вирусами, или раковые клетки.
Структура иммуноглобулина G (IgG) представляет собой сложный тетрамерный белок, содержащий две идентичных тяжелых (Н) цепи и две идентичных легких (L) цепи иммуноглобулина. Эти цепи соединяются вместе дисульфидными связями с образованием Y-образного антитела. Однако, в растворе молекула принимает очертания глобул и легко связывается с чужеродными антигенами, присутствующими в биологических жидкостях. Анализ аминокислотных последовательностей иммуноглобулинов привел к определению специфических областей с различными функциональными активностями внутри цепей. Каждая легкая и каждая тяжелая цепь содержит вариабельную область (VL и VH, соответственно), содержащую первые 110 аминокислотных концевых остатков. Трехмерный участок соединения областей VL и VH составляет участок распознавания "антигенсвязывающего сайта" ("ACS") молекулы иммуноглобулина. Вследствие тетрамерной природы иммуноглобулинов в молекуле имеется два идентичных антигенсвязывающих сайта. Вариабельные домены этих цепей содержат высокогетерогенные последовательности и сообщают разнообразие антигенсвязывающим сайтам, в высшей степени специфическим в отношении большого ряда антигенных структур. Гетерогенность вариабельных доменов неравномерно распределена по вариабельным областям, но расположена в трех сегментах, называемых гипервариабельными областями ("CDR"), обозначенными CDR1, CDR2 и CDR3. Подробнее об этих структурах см. монографию Watson et al., 1987, Molecular Biology of the Gene, Forth Edition, Benjamin/Cummings Publishing Co., Inc. Menio Park, Calif.
Каждая из тяжелых цепей включает также константную область, определяющую конкретный изотип и позволяющую отнести иммуноглобулин к одному из классов и подклассов иммуноглобулинов. Константная область содержит сегменты, называемые доменами (т.е. CH1, CH2 и т.д.), которые незначительно отличаются в антителах одного класса. Константная область не участвует в антигенном связывании, но может ассоциироваться с рядом биологических активностей, известных как "эффекторные функции", такими как связывание с Fc рецепторами на клеточной поверхности, а также связывание с белками комплемента. Антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки и макрофаги, помимо других особенностей, отличаются обычно присутствием Fc рецептора. Соответственно, если антитело связано с патогеном, оно может затем связываться с фагоцитом через Fc участок. Это позволяет фагоцитам заглатывать и разрушать патоген, патогенные антигены могут процессироваться и выявляться с использованием АРС для дальнейшей стимуляции иммунного ответа.
В отличие от тяжелых цепей легкие цепи содержат единственную константную область (CL). Легкая цепь соединяется с тяжелой цепью дисульфидной связью, которая связывает константную область тяжелой цепи СН с CL. Кроме того, тяжелые цепи также содержат шарнирную область, отделяющую константные области CH1 и СН2 от остальной части молекулы. Эта та шарнирная область, которая в значительной степени отвечает за гибкость тетрамера. Две тяжелых цепи молекулы связываются вместе дисульфидными связями в точке между шарнирной областью и CH2.
Чтобы создать такой обширный спектр, получают гены иммуноглобулина таким образом, чтобы можно было образовывать большое число различных белков иммуноглобулина из ограниченного количества генов, т.е. внутренний полиморфизм. Благодаря внутреннему полиморфизму млекопитающие способны продуцировать антитела к, предположительно, бесконечному множеству антигенов. Обзор по генетике иммуноглобулинов и структуре белков см. Lewin, "Genes III", John Wiley & Sons, N.Y. (1987) и Benjamin and Leskovitz, 1988, Immunology, Alan R. Liss. Inc., New York.
За последние несколько лет антитела приобрели чрезвычайно важное значение в диагностике и терапии благодаря их многообразию и специфичности. Методы молекулярной биологии все больше используются для расширения разнообразия и доступности антител для научных исследований. Например, единичная продуцирующая антитело В клетка может быть иммортализована путем слияния с опухолевой клеткой и размножена с целью получения in vitro источника единичной специфичности, известной как "моноклональное антитело" (mAb). Такая бессмертная линия В клеток называется "гибридомой".
До последнего времени источником большинства mAb были мышиные гибридомы, культивируемые in vitro. To есть, мыши обычно инъецировали выбранный антиген или иммуноген. Затем животное умерщвляли и выделенные клетки селезенки сливали с бессмертными клетками миеломы. Мышиные клетки, хотя их широко использовали для диагностики, не очень подходят для применения в терапии большинства млекопитающих, включая человека. Частично вследствие того, что мышиные антитела другими млекопитающими распознаются как чужеродные и вызывают иммунный ответ, который сам по себе может вызвать заболевание. Для того, чтобы преодолеть, по меньшей мере, некоторые из проблем, связанных с иммунным ответом, вызываемым чужеродным mAb, и недостаток подходящего человеческого mAb, для создания (конструкции) химерных молекул гуманизированного иммуноглобулина, которые содержат антигенсвязывающие гипервариабельные области мышиных антител, при этом остальная часть молекулы состоит из последовательностей человеческого антитела, которые не распознаются как чужеродные, используют методы рекомбинантной ДНК. Такие антитела используются для лечения опухолей, так как мышиная вариабельная область распознает опухолевый антиген, и гуманизированный участок молекулы способен опосредовать иммунный ответ и при этом не выделяться быстро из организма. См., например, статью Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986).
Другие применения таких антител подробно описаны в опубликованной международной заявке WO 94/14847. В этих случаях эпитопы чужеродных антигенов, такие как вирусные или бактериальные эпитопы, "пересаживают" в гипервариабельную область иммуноглобулина с целью вызвать ответ. То есть созданные антитела используют в качестве вакцины для того, чтобы вызвать иммунный ответ и наделить долговременной иммуногенной памятью, тем самым способствовать победе субъекта над будущими инфекциями.
Эти и более традиционные вакцины эффективны потому, что они стимулируют обе составляющих иммунной системы. Несмотря на трудности, связанные с гуморальным компонентом иммунного ответа, он не может, по своей природе и без связи с другими явлениями, эффективно защитить животное от несметного числа патогенных атак, которым оно подвергается каждый день. Скорее, только наличие сильного клеточного ответа позволяет высшим организмам выживать и размножаться.
Как указывается выше, Т лимфоциты, или Т клетки, которые образуются из предшественников в костном мозге, являются главными участниками при создании иммунного ответа против поражающих вирусов и других микробов. Предшественники-стволовые клетки мигрируют в тимус (вилочковую железу), где они становятся специализированными в качестве так называемых тимоцитов. В частности, они начинают визуализировать рецепторные молекулы, которые позже позволяют зрелым Т клетками обнаруживать инфекцию. Для того чтобы быть полезными, Т клетки должны быть способны с помощью рецепторов связываться с антигенами (белковые маркеры передают сигнал о присутствии возбудителя ("интервента")). В то же время они не должны реагировать на вещества, образующиеся в организме, так как аутореактивные Т клетки могут разрушать нормальные ткани. Обычно только те тимоциты, которые образуют полезные рецепторы, созревают полностью и попадают в кровоток, стоят на страже здоровья организма. Другие тимоциты, неэффективные или те, которые атакуют собственные ткани организма, у здоровых людей элиминируются по механизму апоптоза перед тем, как оставить тимус.
Зрелые Т клетки, которые в конечном счете попадают в кровоток, либо в виде цитолитических Т лимфоцитов, либо Т-хелперных клеток, покоящихся, если они не встречают антигены, которые могут распознать их рецепторы. При столкновении со специфическим антигеном, в отношении которого лимфоциты проявляют аффинность, они пролиферируют и осуществляют эффекторные функции, результатом чего является элиминация чужеродных антигенов.
Т клетки разделяются на несколько субпопуляций с учетом различных задач, которые они выполняют. Эти субпопуляции включают хелперные Т клетки (Th), которые необходимы для стимулирования или повышения Т- и В-клеточного ответа; цитотоксические (или цитолитические) Т лимфоциты (CTL), которые непосредственно убивают их клетки-мишени с помощью лизиса клеток, и Т-супрессоры, или регуляторные Т клетки (Ts или Tr), которые подавляют иммунный ответ. В каждом случае Т клетки распознают антигены, но только когда присутствуют на поверхности клетки в виде специализированного белкового комплекса, связанного с поверхностью антигенпрезентирующей клетки. Более конкретно, Т клетки используют специфический рецептор, так называемый специфический к антигену Т-клеточный рецептор (TCR), который является трансмембранным белком, способным распознавать антиген в ассоциации с группой белков, в целом называемых главным комплексом гистосовместимости (МНС, ГКГ). Тысячи идентичных TCR экспрессируются на каждой клетке. TCR относится, как по функции, так и по структуре, к поверхностному антителу (несекретированным), которое В клетки используют в качестве рецепторов антигена. Кроме того, различные субпопуляции Т клеток также экспрессируют ряд белков клеточной поверхности, некоторые из которых называются "маркерными белками", так как они характерны для конкретных субпопуляций. Например, большинство Th клеток экспрессируют белок клеточной поверхности CD4, тогда как большинство клеток CTL экспрессируют белок клеточной поверхности CD 8, а клетки Tr экспрессируют молекулы CD25 и CD4. Эти поверхностные белки играют важную роль в инициации и сохранении иммунных ответов, которые зависят от распознавания конкретных белков или белковых комплексов на поверхности АРС или взаимодействия между этими белками или белковыми комплексами.
Недавно стало известно, что главный комплекс гистосовместимости, или MHC, на самом деле содержит ряд гликозилированных белков, имеющих определенные четвертичные структуры. Вообще структуры относятся к двум типам: класса I MHC, который визуализует пептиды белков, полученных внутри клетки (такие как аутобелки или белки, продуцируемые после вирусной репликации), и класса II MHC, который в целом визуализует пептиды белков, попавших в клетку извне, со стороны (растворимые антигены, такие как бактериальные токсины). Распознавание различных антигенов обеспечивается внутренним полиморфизмом, который непрерывно создает многообразный пул MHC молекул, способных связывать любые могущие образовываться патогенные пептиды. По существу, все ядросодержащие клетки продуцируют и экспрессируют белки класса I MHC, который может проявлять природные пептиды, пептиды, ассоциированные с опухолью, или пептиды, продуцированные вирусным "захватчиком". Напротив, некоторые другие ядросодержащие клетки, и среди них специализированные лимфоидные клетки, известные как антигенпрезентирующие (антигенпредставляющие) клетки, продуцируют и экспрессируют белки класса II MHC. Вне зависимости от типа клеток, оба класса MHC несут пептиды к клеточной поверхности и представляют их покоящимся Т лимфоцитам. Обычно Th клетки распознают комплексы класса II МНС-антиген, тогда как CTL имеют тенденцию распознавать комплексы класса I МНС-антиген, хотя также происходит перекрестная (кросс-) презентация антигенов.
Когда покоящаяся Т клетка, несущая подходящий TCR, встречает АЗС, визуализующую пептид на своей поверхности, TCR связывается с комплексом пептид-МНС. Более конкретно, сотни TCR связываются с многочисленными комплексами пептид-МНС. Когда контактирует достаточное количество TCR, кумулятивный эффект активирует Т клетки. Рецепторы на Т клетках, отвечающие за специфическое распознавание комплекса МНС-антиген и за ответ на него, состоят из комплекса нескольких интегральных белков плазматической мембраны. Как и ранее обсуждавшийся MHC комплекс, разнообразный пул TCR обеспечивается внутренним полиморфизмом, приводящим к соматической реаранжировке. Следует подчеркнуть, что хотя пул TCR может быть разно(много)образным, каждая индивидуальная Т клетка экспрессирует только единственный специфический TCR. Однако, каждая Т клетка обычно экспонирует тысячи копий этого рецептора, специфического в отношении только одного пептида, на поверхности каждой клетки. Кроме того, несколько других типов мембраносвязанных белков участвуют в связывании и активации Т клеток.
Активация Т клеток влечет за собой появление ряда химических сигналов (главным образом цитокинов), которые непосредственно заставляют клетки действовать или стимулировать действие других клеток иммунной системы. В случае активации комплекса белков МНС класса 1-антиген CTL пролиферируют и разрушают инфицированные клетки, презентирующие тот же антиген. Киллинг инфицированных клеток лишает вирус жизненно важной поддержки и делает его доступным для антител, которые, наконец, их удаляют. Напротив, активация Th клеток комплексами белок МНС класса П-антиген не разрушает антигенпрезентирующую клетку (которая является частью защитной системы хозяина), но, скорее, стимулирует Th клетку размножаться и генерировать сигналы (опять же главным образом цитокины), которые влияют на многие клетки. Помимо этих результатов, передача сигнала вызывает В-клеточную стимуляцию, активацию макрофагов, дифференцировку CTL и стимуляцию воспаления. Этот согласованный ответ является относительно специфическим и направлен на чужеродные элементы, несущие пептид, представляемый системой класса II МНС.
Постоянный контроль эпитопов во всех этих структурах в организме, находящемся под воздействием системы иммунного контроля, дает очень эффективные способы распознавания и сохранения "своих" и уничтожения эпитопов и их носителей, поражающих организм или вызывающих патологию. При правильном действии иммунный ответ вызывает поразительно эффективное элиминации микроскопических патогенов и неопластических (опухолевых) клеток, которые, как полагают, постоянно возникают в организме и, по большей части, удаляются иммунной системой ранее, чем их можно обнаружить. Некоторые части тела, такие как мозг, глаз и яички, защищены от иммунного контроля, про эти области также говорится, что они обладают иммунной привилегией. Обычно сложные механизмы распознавания "своего" очень эффективны и способствуют направлению сильного ответа на чужеродные антигены. К сожалению, иммунная система иногда работает неправильно (отказывает) и направляет свое действие против клеток хозяина, вызывая аутоиммунный ответ. Как правило, аутоиммунная реакция происходит, когда антигенные рецепторы на иммунных клетках распознают специфические антигены на здоровых клетках и вызывают гибель клеток, несущих эти конкретные вещества. Во многих случаях аутоиммунные реакции являются самоограниченными, так как они прекращаются, когда вызвавшие их антигены исчезают. Однако, в некоторых случаях аутореактивные лимфоциты живут дольше, чем должны были бы, и продолжают индуцировать апоптоз или иным способом элиминировать нормальные клетки.
Последние данные показывают, что иммунная защита против всех видов рака требует генерирования сильного клеточного иммунного ответа на уникальный опухолевый антиген, экспрессируемый в клетках злокачественных опухолей. В результате для успешной иммунной защиты, во-первых, требуется уникальный антиген, экспрессируемый в опухолевых клетках (опухолеспецифический антиген), и, во-вторых, индукция мощного Т-клеточного иммунного ответа, нацеленного на опухолевый антиген.
В настоящее время известно несколько ассоциированных с опухолями антигенов, они используются в преклинических и клинических исследованиях для получения вакцин. Например, PSMA, РАР и PSA представляют собой антигены, экспрессирующиеся в опухолевых клетках простаты. Her2/neu и MUC1, экспрессируемые раковыми клетками молочной железы и другими раковыми клетками, включая клетки рака легкого, яичников, толстой кишки и поджелудочной железы. MAGE и MART-1 являются антигенами, связанными с опухолевыми клетками меланомы, а СЕА представляет собой антиген, ассоциированный с поджелудочной железой или колоректальным раком. Описаны также другие ткане- и/или опухолеспецифические антигены. Однако, хотя все эти антигены экспрессируются в опухолевых клетках в нормальной или аберрантной форме, они также экспрессируются в ряде нормальных клеток и, следовательно, не могут использоваться для профилактической вакцинации. Другими словами, эти опухолевые антигены распознаются также иммунными клетками как "свои" молекулы, и, следовательно, не происходит настоящей активации иммунной системы. Это создает, по меньшей мере, два препятствия для применения этих ассоциированных с опухолями молекул в качестве основы для вакцины. Первым препятствием является иммунологическая неотвечаемость (толерантность) иммунной системы на "свои" молекулы, что ограничивает ее способность вырабатывать мощный клеточный иммунный ответ. Вторая трудность заключается в том, что любой выработанный мощный клеточный иммунный ответ не должен быть направлен на нормальные клетки, которые экспрессируют антиген-мишень. По этой причине все обсуждавшиеся выше опухолевые антигены предлагается использовать только в качестве мишеней для терапевтической вакцинации.
Недавно описан новый белок, который позволит преодолеть трудности, связанные с известными опухолевыми антигенами. Близкий родственник ("брат") регулятора импринтных сайтов (BORIS) впервые был описан как ДНК-связывающий белок, обнаруженный в яичке. Этот белок содержит 11 доменов цинковых пальцев (ZF), общих с CCCNC-связывающим фактором (CTCF), который является поливалентным нуклеарным фактором, содержащим 11 цинковых пальцев. CTCF является консервативным, убиквитарным и в высшей степени изменчивым фактором, участвующим в различных аспектах регуляции гена и образующим подверженные метилированию инсуляторы, которые регулируют инактивацию Х хромосомы и экспрессию импринтных генов. Однако, BORIS отличается от CTCF на N и на С конце и экспрессируется взаимоисключающе с CTCF в процессе развития клеток эмбриона мужского пола. Экспрессия BORIS ограничивается яичком, а затем только выбранной клеточной субпопуляцией сперматоцитов, которые вместе с регуляцией (восстановлением) меток метилирования участвуют в процессе развития клеток эмбриона мужского пола. Эта субпопуляция клеток яичек также является единственным типом нормальных клеток, о котором известно, что он не экспрессирует CTCF. Так как ингибирование экспрессии CTCF в культивированных клетках ведет к апоптозу, резонно предположить, что BORIS активируется, сохраняя некоторые жизненно важные функции BORIS в клетках яичек (Loukinov et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. 99 (10): 6806-6811).
Позднее было показано, что хотя сверхэкспрессия CTCF также блокирует клеточную пролиферацию, экспрессия BORIS в нормальных BORIS-негативных клетках стимулирует рост клеток, который может привести к трансформации (Klenova et al. (2002) Cancer Biol. 12: 399-414). Человеческий BORIS картирован в области 20q13, которая общеизвестна по частым конверсиям и/или амплификациям, наблюдаемым во многих опухолях тех же типов, в которых также часто наблюдается потеря гетерозиготности (LOH) в паралогичных генах на 16q22, где расположен CTCF. Эти области ассоциированы с "горячими точками", связанными с раком молочной железы, простаты, яичника, желудка, печени, эндометриального рака, злокачественной глиомы, рака толстой (ободочной) кишки и эзофагального рака, а также опухолей Вилмса. Важно, что аномальная активация экспрессии BORIS обнаруживается в значительном числе широкого ряда новообразований. Используя Нозерн-блоттинг или RT-PCR, Klenova et al. (2002) проанализировали уровни мРНК BORIS в более чем 200 линиях клеток, представляющих большинство основных форм человеческих опухолей, и обнаружили транскрипты в более чем половине испытанных линий клеток. Последующий анализ первичного рака, для выборки рака молочной железы, подтвердил результаты, полученные с этими клеточными линиями.
СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Настоящее изобретение относится к нефункциональным мутантным полинуклеотидам, кодирующим опухолевый антиген "брата" регулятора импринтных сайтов (BORIS), и применению таких полинуклеотидов для профилактической вакцинации и иммунотерапии первичного или метастатического рака. Полинуклеотид может представлять собой либо ДНК, либо РНК. В одном предпочтительном варианте изобретения опухолевый антиген представляет собой нефункциональную мутантную форму молекулы BORIS, лишенной способности связываться с ДНК. В другом предпочтительном варианте изобретения, по меньшей мере, одни домен "цинковый палец" (ZF) является нефункциональным вследствие мутации или делеции, и функция BORIS элиминируется. В другом предпочтительном варианте изобретения любая комбинация доменов "цинковый палец" мутирует или удаляется, и функция белка, полипептида или пептида BORIS элиминируется. Еще в одном предпочтительном варианте изобретения удаляются (делегируются) все ZF-связывающие сайты. Еще в одном предпочтительном варианте полинуклеотид, кодирующий мутантную форму BORIS, сливается с молекулярным адъювантом. Еще в одном предпочтительном варианте полинуклеотид, кодирующий нефункциональную мутантную форму BORIS, смешивается, по меньшей мере, с одним отличным полинуклеотидом, кодирующим молекулярный адъювант. Можно использовать любой молекулярный адъювант, который повышает клеточный иммунный ответ. Цитокины, хемокины и молекулы костимуляторов являются особенно предпочтительными. Особенно предпочтительными хемокинами, цитокинами и молекулами костимуляторов являются бета-дефензин2, IL12, IL18, MIPα3, IFNγ и CD80/86.
Настоящее изобретение относится также к вектору, содержащему полинуклеотид, кодирующий нефункциональную мутантную форму BORIS. В предпочтительном варианте изобретения вектор направляет экспрессию в системе бактериальных клеток, клеток млекопитающих, клеток дрожжей или в вирусной системе.
Кроме того, настоящее изобретение относится к нефункциональной
модифицированной (мутантной) форме белка, полипептида или пептида BORIS. Нефункциональный мутант можно получать любым известным методом, который вводит в последовательность делеции, замены или добавления, что приводит в результате к нефункциональному белку. В предпочтительном варианте изобретения мутантный BORIS белок, полипептид или пептид лишен ДНК-связывающей способности. В другом предпочтительном варианте изобретения мутантный BORIS белок, полипептид или пептид смешивается с обычным адъювантом. Еще в одном предпочтительном варианте изобретения нефункциональный мутантный BORIS белок, полипептид или пептид связывается с фармацевтически приемлемым носителем (остов). Еще в одном предпочтительном варианте изобретения нефункциональный мутантный BORIS белок, полипептид или пептид связывается с пептидом, который модифицирует BORIS и сохраняет его антигенные свойства. Еще в одном предпочтительном варианте изобретения нефункциональный мутантный BORIS белок, полипептид или пептид связывается с областью белковой трансдукции (PTD).
Настоящее изобретение также относится к дендритным клеткам, экспрессирующим молекулу нефункционального мутантного BORIS. В предпочтительном варианте изобретения дендритные клетки трансфецируются при использовании ДНК, кодирующей молекулу мутантного BORIS. Еще в одном предпочтительном варианте изобретения дендритные клетки инфицируются вирусным вектором, который кодирует молекулу нефункционального мутантного BORIS. Еще в одном предпочтительном варианте изобретения дендритные клетки "нагружают" нефункциональным мутантным BORIS белком, полипептидом или пептидом, или любой нефункциональной модифицированной белковой формой BORIS.
Настоящее изобретение охватывает клеточные иммунные ответы, вырабатываемые против нефункциональной мутантной формы BORIS белка, полипептида или пептида или любой нефункциональной модифицированной белковой формы BORIS. Настоящее изобретение охватывает антитела к нефункциональной мутантной форме BORIS белка, полипептида или пептида или любой модифицированной белковой форме BORIS.
Настоящее изобретение также охватывает профилактическую или терапевтическую вакцину против рака, содержащую полинуклеотид, кодирующий нефункциональную мутантную форму BORIS, нефункциональную мутантную BORIS белка, полипептида или пептида, или дендритные клетки, экспрессирующие нефункциональную мутантную молекулу BORIS.
Настоящее изобретение также относится к способу лечения рака, заключающемуся во введении пациенту (нуждающемуся в профилактической вакцине), эффективного количества полинуклеотида, кодирующего нефункциональную мутантную форму BORIS, нефункциональной мутантной формы BORIS белка, полипептида или пептида, или дендритных клеток, экспрессирующих или содержащих нефункциональную мутантную молекулу BORIS. Введение может быть осуществлено внутримышечным, подкожным, интрадермальным, внутривенным, назальным, ректальным, вагинальным или перитонеальным способом. Рак может представлять собой первичный или метастатический рак. У пациента может быть рак нескольких различных типов. В предпочтительном варианте изобретения рак представляет собой рак молочной железы, простаты, яичника, желудка, печени, эндометриальный рак, злокачественную глиому, рак толстой (ободочной) кишки или эзофагальный рак.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ
На Фигурах 1a, b представлены результаты вакцинации мышей (n=10) с помощью BORIS (иммунизация ДНК) pIL12/IL18 (молекулярный адъювант). Это приводит к защите мышей от контрольного заражения опухолевыми клетками 104 4Т1, естественно экспрессирующими мышиный BORIS. На Фигуре 1а по оси Y показана степень выживания, а по оси Х откладываются дни после контрольного заражения для pBORIS/pIL12/IL18, pIL12/IL18 и одного лишь вектора. На Фигуре 1b показано соотношение между объемом опухоли и количеством дней после контрольного заражения опухолью для pBORIS/pIL12/IL18 по сравнению с pIL12/IL18 и одним лишь вектором (*Р<0.001).
На Фигуре 2а и b показано соотношение между процентом выживших и числом дней после контрольного заражения клетками опухоли (а) и между объемом опухоли и числом дней после контрольного заражения для мышей, вакцинированных pBORIS (ДНК-иммунизация) с последующим Ad5-BORIS (вирусоподобные частицы), и зараженных с помощью 104 4Т1 клеток. Данные демонстрируют полную защиту против контрольного заражения клетками опухоли, по меньшей мере, через 33 дня после контрольного заражения.
На Фигуре 3а, b и с показаны результаты иммунизации мышей pBORIS плюс pIFNγ или pIL12/IL18 с помощью генного пистолета с последующим контрольным заражением 105 клетками опухоли 4Т1. На Фигуре 3а показано продолжительное время роста опухоли до объема 2 см3, а на Фигуре 3b показано более низкая степень роста опухоли. На Фигуре 3с показана значительная разница объема опухоли на день 14 между группами pBORIS/pIFNγ по сравнению с вектором (р<0.05), pBORIS/pIL12/IL18 по сравнению с pIL12/IL18 (Р0.05), и pBORIS/pIL12/IL18 по сравнению с вектором (Р<0.01).
На Фигуре 4а, b и с показаны результаты вакцинации с помощью pBORIS (ДНК-иммунизация) с последующей инъекцией Ad5-BORIS (вирусоподобные частицы). На Фигуре 4а показана значительно пролонгированная продолжительность жизни вакцинированных мышей, тогда как на Фигуре 4b показано, что у этих мышей наблюдается более низкая скорость роста опухоли и более продолжительное время роста опухоли до объема 2 см3 после контрольного заражения мышей опухолевыми клетками 4Т1 105. На Фигуре 4 с показана значительная разница в объеме опухоли на день 15 между группами Ad5-BORIS по сравнению с Ad5 (P<0.001).
На Фигуре 5 показано выравнивание методом наилучшего приближения человеческого и мышиного BORIS полипептидов, осуществляемое с помощью пакета программ GCG, по умолчанию расширение гэпов принимается равным нулю, причем консервативные области цинковых пальцев выделены и указаны как ZF-11.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Хотя настоящее изобретение может быть воплощено во многих различных формах, в данном описании раскрываются конкретные иллюстрирующие варианты изобретения, которые поясняют на примерах принципы изобретения. Следует подчеркнуть, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными ограничивающими примерами.
Настоящее изобретение включает применение антигена, экспрессируемого только в иммунологически привилегированных клетках яичка и появляющегося во многих трансформированных опухолевых клетках, для предупреждения эффекта толерантности, который может индуцировать другие опухолевые антигены. Данное изобретение также включает введение специфических изменений в ДНК, кодирующую антиген, для элиминации побочных эффектов и аутоиммунных реакций. В данном контексте применяются следующие определения.
Термин "опухоль", "рак", "новообразование", "неоплазия" и их этимологические родственники применяются попеременно (на равных правах, взаимозаменяемо) в контексте данной заявки для обозначения в целом аномальных пролиферативных заболеваний и сопутствующих пораженных клеток или клеточных масс. Предпочтительно, клетки с аномальной пролиферацией относятся в данном описании к антигену с иммунной привилегией.
Цитотоксические Т лимфоциты (CTL) представляют собой эффекторные Т клетки, обычно CD8+, которые могут опосредовать лизис клеток-мишеней, несущих антигенные пептиды, ассоциированные с молекулой МНС. Другие цитотоксические клетки включают гамма/дельта и CD4+ NK.1.1+ клетки.
Выражения "антиген с иммунной привилегией" и "иммунологически привилегированный антиген" относятся к выделению определенных сайтов и антигенов в организме из иммунной системы и, следовательно, связаны с антигенами, в отношении которых вырабатывается аномальный иммунный ответ. Антигены с иммунной привилегией, экспрессируемые эктопически (т.е. вне их обычно иммунологически привилегированных сайтов), могут вызвать аутоиммунитет или иммунитет к опухоли. Иммунологически привилегированные антигены экспрессируются в некоторых опухолях, что приводит к выработке иммунного ответа как в отношении опухолевого, так и неопухолевого сайта, экспрессирующего те же иммунологически привилегированные антигены.
Антигенпрезентирующие клетки (АРС) представляют собой клетки, включая дендритные клетки, макрофаги и В клетки, которые могут процессировать и презентировать (представлять) антигенные пептиды совместно с молекулами МНС класса I или класса II и доставлять костимулирующий сигнал, необходимый для активации Т клеток.
"Область (домен) цинкового пальца" ("цинковые пальцы") относится к малому независимо складывающемуся ("выпетливающемуся") домену, которому для стабилизации его структуры необходима координация с одним или более ионов цинка. Пальцы связываются с субсайтами из трех пар оснований, а специфические контакты опосредуются аминокислотами в положениях - 1, 2, 3 и 6 относительно начала альфа-спирали.
"Нефункциональная мутантная форма BORIS" относится к BORIS белку, полипептиду или пептиду с потерей функции. "Потеря функции" предполагает обозначать невозможность осуществить любую из важных активностей молекулы дикого типа BORIS, такую как ДНК-связывание, восстановление "отцовского" ("родительского") паттерна ДНК-метилирования и т.д.
"Нефункциональный мутант" относится к изменениям уровня ДНК или белка, которые нарушают активность дикого типа полученного белка. Такие изменения могут представлять собой аминокислотные замены, делеции или добавления в областях молекулы, ведущих себя как каталитические сайты и/или принимающих участие в связывании ДНК или белка. Примерами изменений, способных нарушить (уничтожить) активность, являются делеции или замены важных аминокислот, принимающих участие в каталитическом или связывающем взаимодействии, добавления аминокислот, которые изменяют необходимую трехмерную структуру сайта, участвующего в каталитических и/или связывающих взаимодействиях, или добавления или делении нуклеотидов, которые вызывают сдвиги рамки считывания, тем самым нарушая необходимую трехмерную структуру. Мутации можно осуществлять обычными молекулярными методами, такими как ПЦР, применение олигонуклеотидов и т.д. (см., например, Sambrook, Maniatis и Fritsch). Природные мутации также можно выделить из популяции клеток (см., например, Sambrook, Maniatis и Fritsch).
"Пептид" относится к молекуле, содержащей, по меньшей мере, 2 аминокислоты, соединенные пептидной связью. "Полипептид" относится к молекуле, содержащей, по меньшей мере, 10 аминокислот, соединенных пептидными связями, а "белок" относится к молекуле, содержащей, по меньшей мере, 20 аминокислот.
"Полинуклеотид, кодирующий нефункциональную мутантную форму BORIS" относится к любому полинуклеотиду, последовательность которого, по меньшей мере, на 50%, 60% или 70% идентична последовательности человеческого (SEQ ID NO:1) или мышиного (SEQ ID NO:3) полинуклеотида BORIS, более предпочтительно, на 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности человеческого (SEQ ID NO:1) или мышиного (SEQ ID NO:3) полинуклеотида BORIS.
"Нефункциональный мутантный BORIS пептид, полипептид или белок" относится к молекуле BORIS, которая лишена возможности осуществить любую из важных активностей молекулы дикого типа BORIS, такую как ДНК-связывание, восстановление "отцовского" ("родительского") паттерна ДНК-метилирования и т.д. "Нефункциональный мутантный BORIS пептид, полипептид или белок" имеет последовательность, которая, по меньшей мере, на 50%, 60% или 70% идентична последовательности человеческого (SEQ ID NO:2) или мышиного (SEQ ID NO:4) пептида, полипептида или белка BORIS, более предпочтительно, на 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности человеческого (SEQ ID NO:2) или мышиного (SEQ ID NO:4) пептида, полипептида или белка BORIS.
Молекула нефункционального мутантного BORIS распознается как "чужой" антиген, экспрессируемый только в трансформированных опухолевых клетках, и используется в качестве антигена для преодоления ограничений предыдущего уровня техники. Мутантная форма BORIS используется в качестве идеальной нетоксической вакцины, так как она не должна вызывать нежелательных побочных эффектов, вызываемых его активностью ДНК-связывания и/или нативной функцией. Другими словами, мутантный BORIS, применяемый для вакцинации, не обладает функциональной активностью и присутствует только как иммуноген (антиген). В отличие от других опухолеспецифических антигенов, BORIS не экспрессируется в нормальных тканях у женщин. Кроме того, даже хотя BORIS экспрессируется в процессе полового созревания в нормальном яичке у мужчин, введение и/или экспрессия нефункционального мутантного BORIS должна быть безвредной, так как яичко является иммунологически привилегированным органом (недоступным для иммунных клеток). Другими словами, анти-BORIS иммунный ответ, вырабатывающийся после иммунизации, не является опасным для нормальных клеток, а вакцина BORIS не вызывает аутоиммунитет. Помимо этого, гарантируется вырабатывание мощного иммунного ответа, так как BORIS, в отличие от других опухолеспецифических антигенов, распознается как чужеродный антиген. BORIS-специфические Т клетки не уничтожаются в тимусе, распознают мутантный BORIS как "чужой" антиген и вырабатывают иммунный ответ.
В одном варианте изобретения кДНК, кодирующую мышиный BORIS (mBORIS), получают методом RT-PCR на мРНК, выделенной из мышиного или человеческого яичка. ДНК-связывающий домен молекулы делегируется и заменяется малым спейсером, о котором известно, что он хорошо работает при создании антител-одноцепочечных Fv доменов. Корректная последовательность подтверждается автоматизированным анализом нуклеотидной последовательности. В полученной в результате молекуле отсутствуют 11 ZF доменов, и она состоит из N-концевой области m BORIS (аминокислоты 1-258), связанной с С-концевой областью (аминокислоты 573-636) через спейсер, содержащий 18 аминокислот.
Мутантную кДНК клонируют в вектор pORF под контролем промотора hEF1-HTLV, однако можно использовать другие векторы экспрессии. Мутантная кДНК функционально связывается с промотором и/или регуляторными молекулами, способными вызывать экспрессию в клетке-хозяине. Можно применять вирусные векторы, включая векторы а вирусной ДНК или РНК, аденовирусы и ретровирусы (см. Vasilevko, V. et al. (2003) Clin. Exp.Metastas. 20: 489-98; Leitner, W.W. et al. (2003) Nat Med 9: 33-39; Ribas, A et al (2002) Curr. Gene Ther 2: 57-58).
Помимо приведенного выше, изобретение охватывает применение вирусоподобных частиц, кодирующих молекулы нефункционального мутантного BORIS, таких как аденовирус, вирус человеческого гепатита В, вирус человеческого гепатита С, вирус осповакцины, полиовирус и т.д.. Рекомбинантные вирусные белки различных вирусов обладают полезным свойством самосборки в вирусоподобные частицы (VLP). Эти частицы не содержат вирусных нуклеиновых кислот, и, следовательно, являются нерепликативными, неинфекционными и сохраняют конформационно корректные антигенные эпитопы. Продуцирование VLP показано во многих экспериментальных системах, таких как клетки млекопитающих, инфицированные бакуловирусом клетки насекомых, дрожжей, Е. coli, бесклеточные системы и трансгенные растения. Важно отметить, что вакцинация с помощью VLP вызывает вырабатывание не только гуморального, но также и клеточного иммунных ответов. VLP инфицируют "профессиональные" АРС, а затем индуцируют защитные клеточные иммунные реакции, включая CD4+Th1 (тип CD4+T клеток, помогающих клеткам CD8+T) и CD8+CTL ответы. Таким образом, VLP четко показали исключительную способность активировать клеточный иммунный ответ (Т-клеточный ответ). Возможное применение VLP в качестве профилактических вакцин в настоящее время проверяют в ряде различных клинических испытаний. Результаты этих испытаний обнадеживают вследствие прекрасной переносимости и высокой иммуногенности, о которых сообщается в этих исследованиях. Получение VLP вакцины, состоящей из переносимого BORIS антигена, будет стимулировать сильный клеточный иммунный ответ против раковых клеток, экспрессирующих этот опухолевый антиген. Коровый антиген (HBcAg) вируса гепатита В (HBV) и VSV являются примерами подходящих VLP.
Для получения более сильного (устойчивого) клеточного иммунного ответа усеченный или мутантный mBORIS перед клонированием в вектор объединяют с молекулярными адъювантами, такими как молекулы костимулятора В7, бета-дефензин 2/3, MIP3α, IFNγ, цитокины, хемокины и т.д. Другие подходящие молекулярные адъюванты перечислены в нижеприведенной Таблице 1.
Таблица 1 | |
XCL1 (Лимфолактин α, SCM-1α, ATAC) | |
XCL2 (Лимфолактин β, SCM-1β, ATAC) | |
СС124 (MPIF-2, СКβ6, эотаксин-2) | |
СС126 (Эотаксин-3) | |
CXCL14 (болекин) | |
CX3CL1 (Фракталкин, нейротактин) | |
Дефензин |
Или же для ДНК-иммунизации можно использовать обычные адъюванты, такие как Tween 80, 5% этанол или бупивокаин. Другие примеры традиционных адъювантов включают минеральные соли (такие как гели гидроксида алюминия или фосфата алюминия), масляные эмульсии и составы на основе поверхностно-активных веществ,такие как MF59, QS21, AS08 [SBAS2] (эмульсия масло- в воде+MPL+QS21), Монтанид ISA-51 и ISA-720, адъюванты из макрочастиц, такие как виросомы, AS04 [SBAS4] соль А1 с MPL), ISCOMS, сополимер лактида с гликолидом (PLG), соединения микробиального происхождения (природные и синтетические), включая монофосфориллипид А (MPL), Detox (MPL+M.Phlei скелета клеточных стенок), AGP [RC-529], DC_Chol, ОМ-174 (производное липида А), мотивы CpG, модифицированные LT и СТ (генетически модифицированные бактериальные токсины), эндогенные иммуномодуляторы, такие как GM-CSF, IL-12, иммудаптин, а также все другие хемокины, цитокины и костимулирующие молекулы, перечисленные в Таблице, приведенной выше, и инертные носители, такие как частицы золота.
Адъюванты можно смешивать с полинуклеотидом, кодирующим нефункциональную мутантную форму белка, полипептида или пептида родственника регулятора импринтных сайтов (BORIS), нефункциональным мутантным BORIS белком, полипептидом или пептидом и дендритной клеткой, экспрессирующей нефункциональный мутантный BORIS пептид, полипептид или белок.
Для повышения/промотирования презентации нефункционального мутантного BORIS "профессиональными" антигенпрезентирующими клетками (АРС) метаболического пути МНС класса в конструкции нефункционального мутантного BORIS можно включать дополнительные пептидные молекулы. Одним из таких примеров является конструкция, создаваемая с помощью трансдуцирующего пептид домена (PTD). В целом, иммунный ответ основывается на процессировании и презентации нативного антигена. Опухолевые антигены могут экспрессироваться в клетках бактерий, дрожжей и млекопитающих, однако белковые антигены, экспрессируемые в этих системах, по-видимому, не стимулируют максимальный Т-клеточный иммунный ответ (ответы, склонные либо к CTL, либо к Тh1 ответам), так как растворимые экзогенные белки процессируются, в основном, с использованием метаболического пути МНС класса II. На самом деле, многие противоопухолевые вакцины основаны на индукции CD8+CTL, но для этого обычно требуется, чтобы белок синтезировался в цитозоле АРС. К сожалению, в целом плазматические мембраны эукариотических клеток непроницаемы для большинства белков. Недавно было показано, что чужеродные белки, соединенные с белок-традуцирующим доменом (PTD), могут проникать через плазматическую мембрану, что позволяет аккумулировать белок внутри клеток. Это повышает презентацию чужеродных пептидов молекулами МНС класса II АРС антигенспецифическим CD8+Т клеткам.
Вакцинация/иммунизация
Препараты (рецептуры, композиции) вакцин до настоящему изобретению содержат иммуногенное количество полинуклеотида, кодирующего нефункциональную мутантную форму белка, полипептида или пептида BORIS, нефункционального мутантного BORIS белка, полипептида или пептида, или дендритных клеток, экспрессирующих нефункциональный мутантный BORIS пептид, полипептид или белок, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем. Можно использовать мимеотопы, которые представляют собой полипептиды с неродственной последовательностью, но с трехмерной структурой, соответствующей нефункциональному мутантному BORIS белку, полипептиду или пептиду, и которые функционируют идентичным образом. Мимеотипы, которые представляют собой любую биологическую молекулу, не родственную структуру BORIS, но имеющую идентичный(е) 3х-мерный(е) эпитоп(ы), могут распознаваться анти-BORIS клетками.
"Иммуногенное количество" представляет собой количество полинуклеотида, кодирующего нефункциональный мутантный BORIS, белок, полипептид или пептид; нефункционального мутантного BORIS, белка, полипептида или пептида; или дендритных клеток, экспрессирующих нефункциональный мутантный BORIS, белок, полипептид или пептид, достаточное для того, чтобы вызвать иммунный ответ у субъекта, которому вводится вакцина. Вводимое количество представляет собой количество, которое индуцирует заданный иммунный ответ и заданную степень защиты. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают, но без ограничения, стерильную апирогенную воду и стерильный апирогенный физиологический солевой раствор.
Рецептуры вакцин по настоящему изобретению пригодны для пациентов, у которых диагностирован, по меньшей мере, один тип рака, включая, но без ограничения, рак молочной железы, простаты, яичника, желудка, печени, эндометриальный рак, злокачественную глиому, рак толстой (ободочной) кишки или эзофагальный рак. Рецептуры вакцин по данному изобретению также годятся для пациентов с известной генетической предрасположенностью к раку. Кроме того, рецептуры вакцин по настоящему изобретению пригодны для всей популяции в целом, включая представителей популяции, не болеющих раком или не имеющих генетической предрасположенности к раку, желающих прибегнуть к защите от контакта, по меньшей мере, с одним типом раковых опухолей, в которых экспрессируется BORIS, белок, полипептид или пептид.
Введение вакцины можно осуществлять любым подходящим способом, включая парентеральную инъекцию (такую как интраперитонеальная, подкожная или внутримышечная инъекция), интрадермальную, внутривенную инъекцию, назальное, ректальное, вагинальное применение или введение через дыхательные пути. Местное применение вируса для введения через дыхательные пути можно осуществлять с помощью интраназального введения (например, с помощью пипетки, тампона (турундочки) или ингалятора, которые вводят в нос фармацевтический препарат). Местное применение вируса для введения в дыхательные пути также можно вводить ингаляцией, например, создавая фармацевтический препарат в виде респирабельных частиц (включая как твердые частицы, так и частицы жидкости), содержащих репликон, а затем побуждая субъекта вдыхать респирабельные частицы. Способы и аппаратура для введения респирабельных частиц фармацевтических препаратов общеизвестны, и может применяться любой обычный метод. "Иммуногенное количество" представляет собой количество частиц репликона, достаточное для того, чтобы вызвать иммунный ответ у субъекта, которому вводится вакцина.
Если в качестве вакцины используют РНК или ДНК, РНК и ДНК можно вводить непосредственно методами, известными специалистам в данной области техники, такими как доставка на золотых гранулах (генный пистолет), доставка с помощью липосом, или непосредственная инъекция. Одна или более конструкция или реплицирующая РНК может использоваться в любой комбинации, эффективно вызывая иммуногенный ответ у субъекта. Обычно количество нуклеиновых кислот во вводимой вакцине может быть таким, чтобы индуцировать заданный иммунный ответ и заданную степень защиты. Точные количества вводимой вакцины могут зависеть от решения практикующего врача и могут быть индивидуальными для каждого субъекта и антигена.
Вакцину можно вводить по схеме, предусматривающей однократный прием, или, предпочтительно, по схеме, предусматривающей многократный прием, когда первичный курс вакцинации может состоять из 1-10 раздельных доз, а затем, через последовательные временные интервалы дают другие дозы с целью сохранения или усиления иммунного ответа, например, 1-4 месяца для второй дозы и, при необходимости, последующая(ие) доза(ы) через несколько месяцев. Примеры подходящих схем иммунизации включают: (ш) 0, 1 месяц и 6 месяцев, (ii) 0, 7 дней и 1 месяц, (iii) 0 и 1 месяц, (iv) 0 и 6 месяцев, или другие схемы, пригодные для выявления заданных иммунных ответов, предположительно, обеспечивающих защитный иммунитет или уменьшающих симптомы заболевания или уменьшающих тяжесть заболевания.
Человеческий hBORIS можно выделять из человеческого яичка и манипулировать с ним подобным образом. Аналогично, BORIS можно выделять из яичка любого млекопитающего или позвоночного и использовать подобным образом.
ПРИМЕРЫ
1. Получение плазмиды, кодирующей ZF-делегированную форму молекулы mBORIS под контролем промотора hEF1-HTLV
Реакцию RT-PCR осуществляют, используя РНК поли-А мышиного яичка и следующие праймеры:
MB1F 5'-CGTCACCATGGCI GCCGCTGAGGTCCCTG
MB1R 5'-AAGCTTCTGAAAGCTCTGAGGCTITCCCTTOG
MB2F 5'-GGATCCGAGACGTTAGCCCCCAACAAGGACAGG
MB2R 5'-GAATTCTCACTTATCCATCATGTTAAAGATCATCTCGCAGG
SpF 5'-AGCTTGGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCGG
SpR 5'-OATCCCOATCCOCCACCOCCAOAOCCACCTCCOCCTOAACCOCCTCCACCA
Условия ПЦР следующие: 94°С 30 сек, 60°С 30 сек, 72°С 2 мин. Проводят тридцать (30) циклов.
Продукты ПЦР субклонируют в клонирующий вектор PCRII-TOPO (Invitrogen). С-концевую кДНК в PCRII-TOPO подвергают рестрикции с помощью фермента BamHI, a позитивные клоны, содержащие инсерт, собирают и затем разрезают при использовании фермента HindIII. Праймеры (SpF и SpR) для амплификации спейсера отжигают, получают выступающие липкие концы и лигируют в вектор, разрезанный с помощью BamHI-HindIII. N-концевой кодируемый фрагмент разрезают, используя HindIII и инсерты (вставки), теперь отделенные от вектора, собирают и лигируют в конструкцию, разрезанную с помощью HindIII, содержащую С-конец и спейсер. Затем клоны с подходящей ориентацией отбирают, секвенируют (например, см. ниже последовательность молекулы ZF-делетированного BORIS) и субклонируют в плазмиду pORF под контролем промотора hEF1-HTLV (Invitrogen).
Клетки СНО трансфецируют с помощью полученной конструкции, используя стандартные методы молекулярной генетики (Sambrook J, Fritsch EF and Maniatis Т (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor).
Экспрессию конструкции mBORIS без цинковых пальцев (с делениями цинковых пальцев) анализируют Нозерн-блоттингом мРНК, выделенной из клеток СНО стандартным методом молекулярной генетики Sambrook et al. 1989).
2. Иммунизация мышей с помощью ДНК. кодирующей ZF-делетированную форму молекулы BORIS
Плазмиду, кодирующую ZF-делетированную конструкцию mBORIS, выделяют, используя набор EndoFree Plasmid maxi (Qiagen). Чистоту плазмиды ДНК подтверждают УФ-спектром (соотношение оптический плотностей при 260 нм/280 нм >1.7) и гель-электрофорезом.
Золотые гранулы покрывают ДНК (1 мкг/0.5 мг золота) и 5-7-недельных мышей Balb/c иммунизируют с помощью генного пистолета Helios. Мышей иммунизирую (обстреливают) подобным образом трижды за две недели. Через десять дней после последнего "обстрела" у мышей отбирают пробу крови и заражают, вводя 1.0×104 или 1.0×105 клеток 4Т1 рака молочной железы. Размер опухоли измеряют каждый день или каждые два-три дня с помощью штангенциркуля.
3. Иммунные исследования
Иммунизация мышей плазмидной вакциной:
Одним из примеров метода с применением профилактической противораковой вакцины является применение ДНК, кодирующей делегированную форму молекулы мышиного BORIS, в которой отсутствуют домены цинкового пальца и, следовательно, отсутствует свойство ДНК-связывания.
Очищенную плазмиду используют для покрытия золотых гранул (2 мкг плазмиды/0.5 мг золотых гранул), как описано нами ранее (Ghochikyan et al. (2003) Eur. J. hnmunol 33: 3232-41). Иммунизацию мышей BALB/с осуществляют через выбритую кожу живота с помощью генного пистолета Helios (Bio-Rad, Hercules, CA), как описано Ross et al. (2000, Nat. hnmunol 1: 127-131). Коротко говоря, мышей "бомбардируют" 3 раза дозами, содержащими 2 мкг ДНК на 0.5 мг золотых гранул размером ~1 мкм (DeGussa-Huls Corp., Ridefield Park, NJ) под давлением гелия 400 psi (2758 кПа). Мышей иммунизируют и обогащают (обстреливают) тем же методом раз в две недели и контрольно заражают двумя различными дозами клеток рака молочной железы (105 или 104) через десять дней после последнего обогащения, как описано (Vasilevko, V. et al. (2003). Различные группы мышей иммунизируют плазмидой, кодирующей модифицированный BORIS, смешивают с ДНК, кодирующей определенный(е) молекулярный(е) адъювант(ы) (подробнее см. Таблицу 2). Известно, что такие молекулярные адъюванты повышают клеточный иммунный ответ на различные антигены.
Таблица 2. | ||||
Мышей иммунизируют через каждые две недели, всего пять раз, с помощью профилактической вакцины BORIS (pORF-mBORIS), смешанной с pORF-mGMCSF (кодирующей мышиный mGMCSF), pORF-mIFNγ (кодирующей мышиный mIFNγ) или pORF-mIL12+pIRES-mIL18 (две плазмиды, кодирующих мышиный IL12 и IL18, соответственно). После последнего обстрела мышей контрольно заражают с помощью 105 или 104 клеток 4Т1 рака молочной железы мышей, которые экспрессируют модифицированный BORIS | ||||
Группы | Иммуноген | Молекулярный адъювант | Контрольное заражение клетками 4Т1 | |
1 | pBORIS | pGM- CSF | 105 | |
2 | pBORIS | pIFNγ | 105 | |
3 | pBORIS | pIL12/IL18 | 105 | |
4 | Вектор | - | 105 | |
5 | - | pIL12/IL18 | 105 | |
6 | pBORIS | pIL12/IL18 | 104 | |
7 | Вектор | 104 | ||
8 | - | pIL12/IL18 | 104 |
Получение аденовирусного вектора, кодирующего ZF- делетированную фоуму молекулы мышиного BORIS (Ad5-BORIS), и иммунизация мышей Рекомбинантный вирус Ad5-BORIS получают, используя аденовирусную векторную систему AdEasy XL от Stratagene. Шаттл-вектор конструируют субклонированием фрагмента ZF-делетированного mBORIS в плазмиду pShnttle-CMV. Для этой цели фрагмент BORIS синтезируют методом ПЦР, используя в качестве матрицы плазмиду pORF-mBORIS и следующие праймеры:
Продукт ПЦР субклонируют в клонирующий вектор PCR4-TOPO (Invitrogen). Фрагмент BORIS разрезают, используя рестриктазы Sail и Notl. Полученный продукт очищают на агарозном геле и субклонируют, используя сайты клонирования SalI-NotI, в вектор pShnttle-CMV.
Экспрессию in vitro ZF-делетированного mBORIS анализируют в клетках СНО иммуноблоттингом (на Фигуре 6, см. ниже).
Шаттл-вектор, несущий делегированный BORIS, линеаризуют с помощью Pmel и очищают на агарозном геле. Электрокомпетентные клетки BJ-5183-Ad-1 трансформируют с использованием плазмиды pShuttle-mBORIS, расщепляемой с помощью Рте, получают рекомбинантную Ad плазмиду. Клетки AD-293 трансфецируют при использовании ДНК выбранного рекомбинантного Ad-BORIS и готовят первичные исходные вирусные растворы. Полученный первичный вирусный раствор (10 бое/мл) амплифицируют в клетках AD-293, а затем очищают в CsCl-градиенте. Очищенный вирус диализуют против PBS - 5% сахароза и используют для иммунизации мышей.
Мышам Balb/c, иммунизированным с помощью pBORIS четыре раза через две недели, один раз вводят в.м. бустерную инъекцию Ad5-BORIS (109 БОЕ). Контрольным животным инъецируют векторы и проводят бустерную иммунизацию Ad5. Через десять дней после последней бустерной инъекции проводят контрольное заражение двумя различными дозами клеток 4Т1 рака молочной железы (105 или 104), как описано (Vasilevko, V. et al. (2003).
Линии опухолевых клеток
Используют опухолевые клетки млекопитающих, предоставленные доктором F. Miller (Karmanos Cancer Institute, Detroit, MI). Клетки 4Т1.2 представляют собой устойчивый к тиогуанину вариант, полученный из клеток 410.4 (клеточная линия млекопитающих, первоначально выделенная из единичной спонтанно выросшей опухоли млекопитающих у мышей BALB/c fC3H) без воздействия мутагена. Клетки культивируют (37°С, 10% СО2) в основной среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM), с низким содержанием глюкозы и с добавлением 5% фетальной бычьей сыворотки, 5% сыворотки новорожденных телят, 2 мМ глутамина, 100 Ед./мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина, 0.1 мМ заменимых аминокислот и 1 мМ пирувата натрия (D10) (Life Technologies, Inc.).
Определение объема опухоли
Объемы опухолей определяют ежедневно, делая измерения по двум направлениям и рассчитывая по формуле L×(W2)/2, где L обозначает длину, a W обозначает ширину опухоли. Эксперименты заканчиваются со смертью мыши или по достижении опухолью размера около 1.5 см3 в экспериментах, включающих контрольное заражение с помощью 104 клеток, и 2 см3 в экспериментах, включающих контрольное заражение с помощью 105 клеток 4Т1.
Время образования (латентный период) обозначается как время до момента, когда опухоль достигнет объема более 0.1 см3. Для определения скорости роста опухолей анализируют кривые рассеяния в периоды почти линейного роста опухоли.
Статистический анализ
Результаты, полученные при определении среднего времени появления опухолевых узлов (латентный период) и роста опухоли (объем опухоли), а также время поствакцинального иммунитета, изучают методом анализа вариантов (ANOVA) и после испытания используют критерий Тьюки для множественных сравнений. Среднее и стандартное отклонение (девиацию) (SD) рассчитывают, используя программное обеспечение GraphPad Prism 3.0.
4. Иммунология
В- и Т-клеточный иммунный ответ против BORIS анализируют, применяя два различных протокола иммунизации.
1. Получение мышиных BORIS белков и иммунизация мышей.
ZF-делетированный фрагмент мышиного BORIS субклонируют в бактериальный экспрессирующий вектор pET24d(+), используя NcoI-XhoI сайты клонирования в рамке считывания с С-концевым 6His "хвостом". Вводят оба сайта и удаляют стоп-кодон на стадии клонирования ПЦР. Кроме того, создают плазмиды, кодирующие молекулу делегированного BORIS, слитую с доменом белковой трансдукции (PTD). Домен белковой трансдукции HIV-Tat (Tat47-57 YGRKKRRQRRR) соединяют с N-концом делегированного BORIS методом ПЦР, а затем клонируют в сайты клонирования NcoI-XhoI вектора pET24d(+). Штамм E.coli BL21(DE3), трансформированный при использовании полученных плазмид pET-mBORIS или pET-TATmBORIS, выращивают в LB с канамицином при 28°С до достижения А600 0-8. Синтез белка индуцируют, добавляя IPTG до конечной концентрации 1 мМ. Клетки собирают через три-пять часов центрифугированием и используют для очистки белка аффинной хроматографией на колонке с никель-NTA (нитрилотриуксусная кислота) (Qiagen). См. Фигуру 7.
Кроме того, ZF-делетированный фрагмент BORIS, слитый с PTD, субклонируют в экспрессирующий вектор дрожжей рОАРгальфа в рамке считывания с сигнальной последовательностью в сайты клонирования EcoRI-XbaI. Оба сайта вводят, а инициирующий кодон ATG удаляют в ходе ПЦР стадии клонирования. Штамм Pichia pastoris X33 трансформируют электропорацией с pGAPZ-BORIS, линеаризуют с использованием рестриктазы AvrII и позитивные клоны отбирают на среде YPD, содержащей 100 мкг/мл Zeocin. Для анализа экспрессии отобранные клоны выращивают в бульоне YPD/Zeocin и анализируют в супернатанте в различные временные точки иммуноблоттингом.
2. Иммунизация мышей дендритными клетками (DC).
Первичные DC костного мозга получают из клеток-предшественников в костном мозге мышей следующим образом. Истощенные эритроцитами клетки костного мозга из бедренных и большеберцовых костей засевают в полной среде RPMI-10 с добавлением рекомбинантного мышиного GM-CSF (100 Ед./мл). На день 3 не прикрепленные к субстрату гранулоциты осторожно удаляют и прибавляют свежую среду. Не прикрепленные к субстрату DC собирают на день 7 и очищают, используя набор для позитивной селекции (Miltenyi) с микрогранулами CD11c.
DC собирают на день 7 культивирования, очищают позитивной селекцией и инфицируют с помощью Ad5-BORIS, инкубируя при плотности клеток 107 клеток/мл в RPMI-1640 при множественности заражения 1000-2000. Через 1 час полную среду добавляют для разбавления DC до конечной концентрации 1×106-2×106 клеток/мл. Через 24 часа клетки собирают, интенсивно отмывают, чтобы исключить любой перенос аденовирусных частиц, и используют для иммунизации. Кроме того, DC, которые собраны в день 7 культивирования и очищены позитивной селекцией, инкубируют с 10 мкг/мл ZF-делетированного белка mBORIS при 37°С, 5% СО2 в течение 24 часов, дважды отмывают PBS. Поглощение белка клетками DC анализируют в аликвотах методом проточной цитометрии с применением антител против мышиного BORIS и соответствующих вторичных антител, меченных FITC. Мышей Balb/c иммунизируют и.п.(интраперитонеально) трижды каждые три недели с помощью 106 DC и Т-клеточный ответ анализируют через 10 дней после последнего введения в культуры (бустер) культуры спленоцитов.
5. Результаты
Результаты иммунизации представлены на Фигурах 1-4.
ДНК, кодирующую мутантную форму специфического в отношении раковых клеток мышиного BORIS антигена без ДНК-связывающей функции (делеция 11-цинковых пальцев), создают, используя экспрессирующие векторы млекопитающих pORF (hivivogen) и аденовирусную векторную систему AdEasy XL (Stratagene). Эти вакцины используют в качестве профилактической противораковой вакцины на мышиной модели рака молочной железы. Для этой модели используют мышей BALB/c (гаплотип H-2d) и нативную линию опухолевых клеток млекопитающих 4Т1, которая представляет собой устойчивый к тиогуанину вариант, образованный из клеток 410.4 без мутагенной обработки. Важно отметить, что эти мышиные клетки молочной железы экспрессируют полноразмерную молекулу мышиного BORIS, как было продемонстрировано методом RT-PCR. Следовательно, имеется идеальная модель для изучения способности молекулы BORIS применяться в качестве иммунной вакцины против рака.
Проводят два различных типа экспериментов. Первый тип экспериментов включает группу мышей, вакцинированных pBORIS (плазмидой, кодирующей делегированную молекулу мышиного BORIS), смешанный с ДНК, кодирующей различные мышиные цитокины (pGM-CSF; pIL12/IL18; pIFNγ) в качестве молекулярных адъювантов. Мышей инъецируют вектором (pORF) или pIL12/IL18 в качестве контроля. Мышей иммунизируют и проводят бустерную иммунизацию с помощью генного пистолета, а затем проводят контрольное заражение с помощью 104 или 105 клеток 4Т1.
Второй тип эксперимента включает группу мышей, вакцинированных с помощью pBORIS, буферную иммунизацию которых проводят дефектным по репликации аденовирусным вектором (Ad5), который модифицирован таким образом, чтобы экспрессировать ZF-делетированную молекулу мышиного BORIS (Ad5-BORIS). В качестве контрольной используют группу мышей, инъецированных вектором с последующей бустерной иммунизацией с помощью Ad5. Контрольное заражение животных проводят с помощью 104 или 105 клеток 4Т1 и анализируют появление и рост опухоли. Заметим, ранее было найдено, что инъекция такого малого количества как 104 клеток 4Т1.2 в молочные железы мышей BALB/c приводит к локальному росту опухолей молочной железы у 100% животных с контрольным заражением.
Вакцинация с помощью pBORIS плюс pIL12/IL18 или pBORIS с последующим Ad5-BORIS приводит к защите мышей от контрольного заражения с помощью 104 немодифицированных 4Т1 опухолевых клеток. Хотя у 50% мышей из группы, иммунизированной с помощью pBORIS в смеси с pIL12/IL18, образуются небольшие опухоли (0.2-0.4 см3), они все жизнеспособны на день 39. Все подопытные мыши умерли, примерно, десятью днями ранее.
Результаты, полученные на мышах, иммунизированных с помощью Ad5-BORIS, являются выдающимися. На день 24, когда мыши в контрольной группе умерли от опухоли, 100% мышей, иммунизированных вакциной Ad5-BORIS, были не только живы, но у них совсем не образовалась опухолей. На самом деле у них не образуется опухоль вплоть до дня 33 после контрольного заражения. Эти результаты показывают, что вакцина ZF-делетированного BORIS эффективно защищает при введении 104 опухолевых клеток молочной железы.
Второй ряд экспериментов проводят в более жестких условиях и с контрольным заражением мышей 105 4Т1 опухолевых клеток. Вакцинация плазмидой pBORIS плюс pIFNy или pIL12/IL18 значительно продлевает время роста опухоли до объема 2 см3 и повышает выживаемость мышей BALB/c. Вакцинация также снижает скорость роста опухоли при контрольном заражении с помощью 105 опухолевых клеток 4Т1. Более глубокий эффект обнаруживают у мышей, вакцинированных с помощью pBORIS с последующей бустерной иммунизацией вакциной Ad5-BORIS перед заражением с помощью 105 немодифицированных клеток 4Т1. В этом случае на день 23, когда все мыши в контрольной группе умерли в результате роста опухоли, 80% мышей, иммунизированных вакциной Ad5-BORIS, остаются живыми и у выживших мышей опухоли значительно меньше по размеру.
Отдельные группы мышей BALB/c иммунизируют делегированным мышиным белком BORIS, очищенным от Е. coli системы. В данном случае пяти мышам подкожно инъецируют белок (50 мкг/мышь), смешанный с обычным адъювантом типа Qui1 A Th1 (Sigma). После четырех иммунизации у всех животных наблюдается появление заметного титра антител против BORIS. Другую группу из 5 мышей одновременно иммунизируют интраперитонеально выделенными дендритными клетками, инфицированными вакциной Ad5-BORIS. После трех инъекций у мышей вырабатывается Т-клеточный ответ против mBORIS, который обнаруживается in vitro в культуре спленоцитов, активированных белком mBORIS. Следовательно, иммунизация с помощью BORIS индуцирует В- и Т-клеточный иммунный ответ у мышей и этот иммунный ответ предохраняет животное от (контрольного) заражения.
6. Усеченный BORIS, связанный с PTD, как субъединичная вакцина
PTD связывается с нефункциональным усеченным или мутантным белком BORIS, и продукт слияния образует дрожжевую экспрессирующую систему. Гены, кодирующие PTD и нефункциональный мутантный BORIS, субклонируют в дрожжевой экспрессирующий вектор, такой как pGAPZα. Экспрессированный и секретированный белок очищают стандартными методами молекулярной генетики. Мышей иммунизируют антигеном, приготовленным в двух различных обычных адъювантах, и анализируют иммунный ответ, а также защиту от опухолевого антигена.
7. Вирусоподобные частицы, кодирующие нефункциональный мутантный BORIS, как субъединичная вакцина
Получают субъединичную вакцину VLP-BORIS на основе корового антигена (HBcAg) вируса гепатита В (HBV). Этот антиген "самособирается" в VLP после экспрессии в клетках дрожжей. Чужеродные последовательности можно встраивать в некоторые области HBcAg, не нарушая процесс сборки. Соответственно, получают частицы химерного HBcAg-BORIS, которые используют для иммунизации мышей.
8. Анализ на мышах BALB/c и р53 КО
Анализируют иммунный ответ у мышей BALB/c без заражения и молодых мышей с нокаутом гена р53, у которых к этому возрасту не появляется опухоль. Определяют как гуморальный, так и клеточный иммунный ответ у мышей, иммунизированных различными вакцинами BORIS. Анализируют сыворотки иммунизированных мышей с целью обнаружения продукции антитела против BORIS в течение 3х-месячного эксперимента. Определяют пролиферацию CD4+ и CD8+ Т клеток и активацию регуляторных Т клеток до и после заражения мышей BALB/c. Одновременно анализируют активацию NK клеток, которые могут непосредственно вызывать киллинг опухолевых клеток молочной железы. Показана функциональная активность BORIS-специфических цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) до и после заражения опухолевыми клетками молочной железы 4Т1. Для обнаружения NK и CTL активности в качестве клеток-мишеней используют опухолевые клетки Р815, которые естественно (в природе) экспрессируют молекулы BORIS дикого типа, наряду с 4Т1 клетками.
Дополнительные ссылки
Filippova, G.N. et al. Tumor-associated Zinc Finger Mutations in the CTCF Transcription Factor Selectively Alter Its DNA- binding Specificity. Cancer Research 62: 48-52 (2002).
Kim, J.J. et al. In vivo engineering of a cellular immune response by co-administration of IL-12 expression vector with a DNA immunogen. J. Immunol 158: 816-826 (1997).
Kim, J.J. et al. CD8 positive Т cells influence antigen-specific immune responses through the expression of chemokines. Journal of Clinical Investigation 102: 1112-24 (1998).
Kim, J.J. et al. Modulation of amplitude and direction of n vivo immune responses by co-administration of cytokine gene expression cassettes with DNA immunogens. European Journal of Immunology 28: 1089-1103. (1998).
Kim, J.J. et al. Intracellular adhesion molecule-1 modulates beta-chemokines and directly costimulates Т cells in vivo. Journal of Clinical Investigation 103: 869-77 (1999).
Kim, J.J. et al. Macrophage Colony-Stimulating Factor Can Modulate Immune Responses and Attract Dendritic Cells in Vivo. Human Gene Therapy 11: 305-321 (2000).
Lutz, M.В. et al. An advanced culture method for generating large quantities of highly pure dendritic cells from mouse bone marrow. Immunol. Meth. 223: 77-92 (1999).
Nardelli, В. & Tarn, J. P. The MAP system. A flexible and unambiguous vaccine design of branched peptides. Pharm. Biotechnol. 6: 803-819 (1995).
Resko, J.E. J. et al. Cell Growth Inhibition by the Multivalent Transcription Factor CTCF. Cancer Research 61: 6002-7 (2001).
Ribas, A., Butterfield, L.H., Glaspy, J.A. & Economou, J.S. Cancer Immunotherapy Using Gene- modified Dendritic Cells. Curr. Gene Ther 2: 57-78 (2002).
Ross, R.M., Xu, Y., Bright, R.A. & Robinson, H.L. C3d enhancement of antibodies to hemagglutinin accelerates protection against influenza virus challenge. Nat. Immunol. 1, 127-131 (2000).
Smith, M., Burchell, J. M., Graham, R., E.P., C. & J., T.-P. Expression of B7.1 in a MUC1-expressing mouse mammary epithelial tumor cell line inhibits tumorigenicity but does not induce autoimmunity in MUC1 transgenic mice. Immunol. 97, 648-655 (1999).
Рядовому специалисту в данной области техники очевидно, что можно использовать различные модификации материалов и методов при применении вышеописанного изобретения. Такие модификации можно рассматривать как входящие в объем настоящего изобретения, определяемый нижеприведенной формулой изобретения.
Описание последовательности: нуклеотидная последовательность молекулы BORIS с ZF-делецией
Описание последовательности: нуклеотидная последовательность мышиного BORIS дикого типа
Описание последовательности: нуклеотидная последовательность человеческого BORIS дикого типа
Описание последовательности: аминокислотная последовательность человеческого BORIS
Описание последовательности: аминокислотная последовательность мышиного BORIS
Описание последовательности: аминокислотная последовательность мышиного BORIS с ZF-делецией
Claims (22)
1. Иммуногенная композиция для предупреждения и лечения раковых заболеваний, содержащая нефункциональный BORIS белок, и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или адъювант, где нефункциональный BORIS белок содержит SEQ ID NO:2, в которой отсутствуют все цинковые пальцы.
2. Композиция по п. 1, в которой нефункциональный мутантный BORIS не связывается с ДНК.
3. Композиция по п. 1, в которой нефункциональный BORIS белок присоединен к фармацевтически приемлемому носителю.
4. Композиция по п. 1, в которой BORIS белок связан с доменом белковой трансдукции (PTD).
5. Композиция по п. 1, в которой нефункциональный BORIS белок связан с пептидом, который модифицирует BORIS и сохраняет или повышает антигенность указанного нефункционального BORIS белка
6. Композиция по п. 1, где нефункциональный BORIS белок экспрессируется в бактериальной клетке, клетке млекопитающего (включая дендритную клетку), клетке дрожжей или в вирусных частицах.
7. Композиция по п. 1, где адъювант является обычным или молекулярным и усиливает ее иммуногенность.
8. Композиция по п. 7, в которой адъювант или молекулярный адъювант смешивается, сшивается или объединяется с указанным нефункциональным BORIS белком.
9. Композиция по п. 7, в которой адъювантом могут быть молекулы из группы цитокинов, хемокинов или костимулирующих молекул.
10. Композиция по п. 1, где нефункциональный BORIS белок экспрессируется дендритной клеткой млекопитающего.
11. Иммунотерапевтическая композиция против рака, содержащая нефункциональный BORIS белок или бактериальную клетку, клетку млекопитающего (включая дендритную клетку), клетку дрожжей или вирусную частицу, экспрессирующую нефункциональную форму BORIS белка, содержащего SEQ ID NO:2, в которой отсутствуют все цинковые пальцы, и дополнительно содержащая адъювант, молекулярный адъювант, фармацевтически приемлемое вещество, усиливающее антиопухолевый иммунный ответ.
12. Способ иммунизации пациента, заключающийся во введении ему эффективного количества иммунотерапевтической композиции по п. 11, который повышает иммунный ответ к опухолям.
13. Способ по п. 12, в котором эффективное количество иммунотерапевтической композиции содержит молекулярный адъювант из группы цитокинов, хемокинов или костимулирующих молекул.
14. Способ по п. 12, в котором эффективное количество иммунотерапевтической композиции содержит фармацевтически приемлемый носитель.
15. Способ по п. 12, в котором эффективное количество иммунотерапевтической композиции содержит нефункциональный BORIS белок, связанный с пептидом, который модифицирует BORIS и сохраняет или повышает его антигенное и противоопухолевое свойства.
16. Способ по п. 12, в котором эффективное количество иммунотерапевтической композиции содержит нефункциональный BORIS белок, который дополнительно содержит домен белковой трансдукции (PTD).
17. Способ по п. 12, в котором введение осуществляют внутримышечно, подкожно, интрадермально, внутривенно, назально, ректально, вагинально или перитонеально.
18. Способ по п. 12, в котором пациент болен более чем одним типом рака.
19. Способ по п. 12, в котором у пациента рак.
20. Способ по п. 12, в котором у пациента есть генетическая предрасположенность к раку.
21. Способ по п. 12, в котором иммунизация приводит к выработанному клеточному иммунному ответу, включающему Т клетки, которые распознают эпитоп нефункционального BORIS белка.
22. Применение иммунотерапевтической композиции по п. 11 для приготовления вакцины против рака, при котором иммунотерапевтическая композиция содержит эффективное количество нефункционального BORIS белка, содержащего SEQ ID NO:2, в которой отсутствуют все цинковые пальцы.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US49751103P | 2003-08-25 | 2003-08-25 | |
US60/497,511 | 2003-08-25 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2006109359/13A Division RU2385163C2 (ru) | 2003-08-25 | 2004-08-25 | Профилактическая противораковая вакцина |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2010110441A RU2010110441A (ru) | 2011-09-27 |
RU2556128C2 true RU2556128C2 (ru) | 2015-07-10 |
Family
ID=34272574
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2010110441/10A RU2556128C2 (ru) | 2003-08-25 | 2004-08-25 | Профилактическая противораковая вакцина |
RU2006109359/13A RU2385163C2 (ru) | 2003-08-25 | 2004-08-25 | Профилактическая противораковая вакцина |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2006109359/13A RU2385163C2 (ru) | 2003-08-25 | 2004-08-25 | Профилактическая противораковая вакцина |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US7579452B2 (ru) |
EP (1) | EP1667711B1 (ru) |
JP (1) | JP2007504154A (ru) |
CN (1) | CN1871025B (ru) |
AT (1) | ATE475430T1 (ru) |
AU (1) | AU2004268001B2 (ru) |
CA (1) | CA2537161C (ru) |
DE (1) | DE602004028381D1 (ru) |
DK (1) | DK1667711T3 (ru) |
IL (1) | IL173943A (ru) |
RU (2) | RU2556128C2 (ru) |
WO (1) | WO2005021029A2 (ru) |
Families Citing this family (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006034335A2 (en) * | 2004-09-21 | 2006-03-30 | Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Method of detecting cancer based on immune reaction to boris |
US20090081245A1 (en) * | 2007-09-07 | 2009-03-26 | Reznik Boris N | Assays for development of boris mutants suitable for vaccine development and small molecule inhibitors of wild-type boris |
EP2376089B1 (en) * | 2008-11-17 | 2018-03-14 | The Regents of the University of Michigan | Cancer vaccine compositions and methods of using the same |
BR112015032713B1 (pt) * | 2013-09-17 | 2023-03-21 | Obi Pharma, Inc | Composto, composição farmacêutica, uso de uma quantidade terapeuticamente efetiva da composição farmacêutica, e uso do composto |
US11028136B2 (en) * | 2014-09-24 | 2021-06-08 | Sapporo Medical University | Tumor antigen peptide |
US11130798B2 (en) | 2015-05-19 | 2021-09-28 | La Jolla Institute For Allergy And Immunology | Human APOB100 epitopes, methods and uses for modulating inflammatory responses, and treating adverse cardiovascular events, disease and atherosclerosis |
US10935544B2 (en) | 2015-09-04 | 2021-03-02 | Obi Pharma, Inc. | Glycan arrays and method of use |
US10980894B2 (en) | 2016-03-29 | 2021-04-20 | Obi Pharma, Inc. | Antibodies, pharmaceutical compositions and methods |
WO2017172990A1 (en) | 2016-03-29 | 2017-10-05 | Obi Pharma, Inc. | Antibodies, pharmaceutical compositions and methods |
MY200886A (en) | 2016-04-22 | 2024-01-22 | Obi Pharma Inc | Cancer Immunotherapy by Immune Activation or Immune Modulation Via Globo Series Antigens |
EP3490592A4 (en) | 2016-07-27 | 2020-03-25 | OBI Pharma, Inc. | IMMUNOGENIC / THERAPEUTIC GLYCAN COMPOSITIONS AND USES THEREOF |
WO2018023121A1 (en) | 2016-07-29 | 2018-02-01 | Obi Pharma, Inc. | Human antibodies, pharmaceutical compositions and methods |
AU2017361549B2 (en) | 2016-11-21 | 2023-12-21 | Obi Pharma, Inc. | Conjugated biological molecules, pharmaceutical compositions and methods |
RU2759681C1 (ru) * | 2017-12-13 | 2021-11-16 | Иновио Фармасьютикалз, Инк. | Противораковые вакцины, нацеленные на boris, и способы их применения |
WO2020006176A1 (en) | 2018-06-27 | 2020-01-02 | Obi Pharma, Inc. | Glycosynthase variants for glycoprotein engineering and methods of use |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5156841A (en) * | 1988-08-26 | 1992-10-20 | United States Of America | Anti-tumor vaccine |
WO2002083879A2 (en) * | 2001-04-02 | 2002-10-24 | Alimentary Health Limited | Immunotherapy based on dendritic cells |
RU2206329C2 (ru) * | 1995-11-23 | 2003-06-20 | Берингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх | Иммуностимулятор, вызывающий специфичный к опухоли клеточный иммунный ответ и способ его получения |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1326974A (zh) * | 2000-06-07 | 2001-12-19 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——人转录阻抑蛋白ccctc-结合因子(ctcf)10.23和编码这种多肽的多核苷酸 |
WO2003072799A2 (en) * | 2002-02-22 | 2003-09-04 | The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services | Brother of the regulator of imprinted sites (boris) |
-
2004
- 2004-08-25 WO PCT/US2004/027856 patent/WO2005021029A2/en active Application Filing
- 2004-08-25 RU RU2010110441/10A patent/RU2556128C2/ru active
- 2004-08-25 EP EP04782353A patent/EP1667711B1/en not_active Not-in-force
- 2004-08-25 AT AT04782353T patent/ATE475430T1/de active
- 2004-08-25 CA CA2537161A patent/CA2537161C/en not_active Expired - Fee Related
- 2004-08-25 DE DE602004028381T patent/DE602004028381D1/de active Active
- 2004-08-25 AU AU2004268001A patent/AU2004268001B2/en not_active Ceased
- 2004-08-25 RU RU2006109359/13A patent/RU2385163C2/ru active
- 2004-08-25 CN CN2004800314130A patent/CN1871025B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2004-08-25 DK DK04782353.9T patent/DK1667711T3/da active
- 2004-08-25 US US10/569,907 patent/US7579452B2/en active Active
- 2004-08-25 JP JP2006524877A patent/JP2007504154A/ja active Pending
-
2006
- 2006-02-26 IL IL173943A patent/IL173943A/en active IP Right Grant
-
2009
- 2009-08-24 US US12/546,561 patent/US8114405B2/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5156841A (en) * | 1988-08-26 | 1992-10-20 | United States Of America | Anti-tumor vaccine |
RU2206329C2 (ru) * | 1995-11-23 | 2003-06-20 | Берингер Ингельхайм Интернациональ Гмбх | Иммуностимулятор, вызывающий специфичный к опухоли клеточный иммунный ответ и способ его получения |
WO2002083879A2 (en) * | 2001-04-02 | 2002-10-24 | Alimentary Health Limited | Immunotherapy based on dendritic cells |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
LOUKINOV DMITRI I., et al., BORIS, A novel male germ-line-spercific protein associated with epigenetic reprogramming events, shares the same 11-zinc-finger domain with CTCF, the insulator protein involved in reading imprinting marks in the soma, PNAS, Vol.99, No.10, 14.05.2002, pp.6806-6811. KLENOVA E.M., et al., The novel BORIS + CTCF gene family is uniquely involved in the epigenetics of normal biology and cancer, Semin Cancer Biol, Vol.12, No.5, October 2002, pp.399-414. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1667711A2 (en) | 2006-06-14 |
AU2004268001B2 (en) | 2010-04-22 |
IL173943A (en) | 2011-04-28 |
WO2005021029A2 (en) | 2005-03-10 |
RU2385163C2 (ru) | 2010-03-27 |
CA2537161C (en) | 2014-07-29 |
DE602004028381D1 (en) | 2010-09-09 |
US7579452B2 (en) | 2009-08-25 |
US20100166790A1 (en) | 2010-07-01 |
EP1667711B1 (en) | 2010-07-28 |
CN1871025A (zh) | 2006-11-29 |
JP2007504154A (ja) | 2007-03-01 |
RU2010110441A (ru) | 2011-09-27 |
DK1667711T3 (da) | 2010-11-22 |
ATE475430T1 (de) | 2010-08-15 |
US20060286115A1 (en) | 2006-12-21 |
CA2537161A1 (en) | 2005-03-10 |
RU2006109359A (ru) | 2007-10-10 |
WO2005021029A3 (en) | 2005-05-26 |
US8114405B2 (en) | 2012-02-14 |
AU2004268001A1 (en) | 2005-03-10 |
IL173943A0 (en) | 2006-07-05 |
CN1871025B (zh) | 2013-06-05 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US8114405B2 (en) | Cancer vaccine based on brother of regulator of imprinted sites molecule (BORIS) | |
US20200165302A1 (en) | Modified vsv-g and vaccines thereof | |
JP5230579B2 (ja) | 癌抑制遺伝子wt1の産物に基づく癌抗原 | |
US8470560B2 (en) | CR-2 binding peptide P28 as molecular adjuvant for DNA vaccines | |
TW201639594A (zh) | 利用重組李斯特菌菌株之組合療法 | |
AU2016281958A1 (en) | Manufacturing device and process for personalized delivery vector-based immunotherapy | |
US8258261B2 (en) | Induction of tumor immunity by variants of folate binding protein | |
JP2022046617A (ja) | 異種ポリペプチドを含むCyaAベースのキメラタンパク質及び免疫応答の誘導におけるその使用 | |
Shiku et al. | Development of a cancer vaccine: peptides, proteins, and DNA | |
JP2008528004A (ja) | 突然変異癌タンパク質抗原およびカルレティキュリンをコードするプラスミドを用いる抗癌dnaワクチン | |
JP5110674B2 (ja) | 樹状細胞に基づく免疫治療のための組成物および方法 | |
US20050063952A1 (en) | Immunogenic CEA | |
Neglia et al. | DNA vaccination against the ovarian carcinoma-associated antigen folate receptor α (FRα) induces cytotoxic T lymphocyte and antibody responses in mice | |
US20020177547A1 (en) | Pharmaceutical compositions for treating or preventing cancer | |
WO2005061538A2 (en) | Vaccine comprising an angiomotin or a polynucleotide encoding an angiomotin and its uses for the treatment of angiogenic-related disorders | |
JP2007505601A (ja) | ワクチン | |
JP2005247861A (ja) | 免疫増強特性を有するムチンペプチド | |
Van Pel et al. | Induction of cytolytic T lymphocytes by immunization of mice with an adenovirus containing a mouse homolog of the human MAGE-A genes | |
JP2005526511A (ja) | ワクチン | |
JP4459060B2 (ja) | ポリヌクレオチドからなるワクチン | |
JP2006516258A (ja) | ワクチンおよび抗腫瘍ワクチンを調製する方法 | |
EP1222928A2 (en) | Pharmaceutical compositions for treating or preventing cancer, especially melanoma | |
Sas | HER-2/neu-targeted immunoprevention of breast cancer | |
WO2008040759A1 (en) | Method for down-regulation of cripto | |
Lees | Cancer immunotherapy with Mucin-1 and cytokines |