CN110870913A - 氨基酸类营养素作为疫苗佐剂的应用以及包含氨基酸营养素作为佐剂的疫苗 - Google Patents

Abstract

本申请公开涉及氨基酸类营养素作为佐剂在疫苗中的应用、包含该氨基酸类营养素佐剂的疫苗、使用该疫苗预防和治疗实体肿瘤的方法。

Description

氨基酸类营养素作为疫苗佐剂的应用以及包含氨基酸营养素 作为佐剂的疫苗

技术领域

本项发明涉及氨基酸类营养素作为佐剂在疫苗中的应用、包含该氨基酸类营养素佐剂的疫苗、使用该疫苗预防和治疗实体肿瘤的方法。

背景技术

由于有大量研究工作支持，实体肿瘤常被用作局部病变疾病、尤其是难治性局部病变疾病的研究模型。实体肿瘤是一种具有瘤体征状的肿瘤疾病，瘤体是包含有肿瘤细胞的一种特征性病变组织。以胰腺癌瘤体为例，胰腺癌细胞在其中仅占约30％的体积比。可见，除了肿瘤细胞，瘤体组织中往往还存在更大量的其它组成(有时亦被称作肿瘤细胞的微环境)，包括其它多种细胞、多种细胞间质、多种管道等。

抗肿瘤药物开发所面临的一个主要问题是特异性。细胞毒药物基于肿瘤细胞抑制实验的阳性结果，可以通过全身用药靶向肿瘤细胞。然而，由于不能对靶细胞和正常细胞作足够区别，其有效剂量与安全限量之差不够大，故在产生全身性疗效(瘤体内、外的肿瘤细胞抑制效应)的同时，也会产生全身性毒性的较大风险。此外，药物分子需在瘤体组织内有效渗透才能与其间的肿瘤细胞发生作用，而这并不是一个无障碍事件。对于某些瘤体乏血供肿瘤(例如胰腺癌)而言，患者受益的机会则更小。

局部给药具有将药物进行物理靶向的优点。于是曾经有人认为，细胞毒药物的局部给药可以提高其瘤内浓度、从而提高其疗效。然而，局部给药细胞毒药物却并未显示出疗效的明显提高。仅仅提高其瘤内浓度，似乎尚不能明显提高其靶向瘤内组织中癌细胞的效率。除了求助于其缓释形式以外,细胞毒药物在临床上几乎仍全身给药。化学消融剂(高纯度乙醇、高浓度酸碱)不以细胞破坏而以组织破坏为特征。与细胞毒药物相比,其几乎无靶向癌细胞的全身疗效,却往往显示出更高局部疗效。然而,它们通常是不能对靶组织和其它组织作足够区别的強破坏剂。这使得它们实际能够应用的介入体积(例如酸碱用量不超过0.2ml/kg)和介入部位非常受限(例如对瘤体所在器官的限制、瘤体边缘消融受限、等等)。因而，近十年来化学消融剂以经从恶性实体肿瘤临床上淡出。实际上,目前临床上以几乎没有局部安全性和局部疗效均高的局部药物。

免疫治疗药物方兴未艾。单克隆抗体主要是通过靶向以下肿瘤相关分子产生疗效：肿瘤生存的某些关键分子(例如CD20、VEGF/VEGFR2、HER2、EGFR、CD19、CD25、SLAMF7、CD38等)、肿瘤免疫固有性和适应性相关分子(例如抑制某些免疫细胞因子)、尤其是肿瘤免疫抑制/激活调节分子(例如靶向免疫抑制分子如CTLA-4、PD-1及PD-L1、靶向免疫激活分子如CD137/OX40等)。尽管其适应症和疗效仍然有限，却使人们对免疫治疗史无前例地热切期待起来。

抗肿瘤疫苗是另一个热门方向。其利用含有肿瘤抗原(肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原)的肿瘤细胞、胞外体、多肽及核酸序列等诱发患者自身免疫应答，意图克服免疫抑制状态，以期抑制肿瘤生长甚至清除肿瘤。然而，肿瘤抗原的抗原性通常较弱，加入疫苗佐剂似乎是一种好的策略。可是，在现有技术中，可供选择的疫苗佐剂不多，限制了更多疫苗的开发。因而，仍然需要开发新的抗肿瘤疫苗佐剂及新的疫苗，以满足现有技术尚不能满足的各种临床需求。实际上，其它局部病变、尤其是顽固性局部病变疾病的防治也都有这个急迫需要。

发明内容

本发明专利申请的目的在于提供氨基酸类营养素作为疫苗佐剂的应用，包含该氨基酸类营养素作为佐剂的疫苗，以及用该疫苗治疗实体肿瘤的方法和应用。

根据本申请公开的一个方面，其提供氨基酸营养素作为疫苗佐剂的应用。根据其一个实施方案，所述疫苗还包含非原位抗原或/和原位抗原激活剂以及药物学可接受的液体载体。

根据本申请公开的另一个方面，其提供一种疫苗，该疫苗包含作为佐剂的氨基酸类营养素、非原位抗原或/和原位抗原激活剂以及药物学可接受的液体载体。

根据本申请公开的再一个方面，其提供一种预防和治疗实体肿瘤的方法，该方法包括向有此需要的个体局部给药根据本申请公开的疫苗。

根据本发明的氨基酸类营养素应用技术方案与现有技术的氨基酸类营养素应用相比具有以下优点：其能够作为佐剂参与特异性免疫作用；与现有疫苗佐剂相比具有以下优点：在本发明的动物实验条件下可以更好地增强免疫效果。

根据本发明的包含氨基酸类营养素佐剂的疫苗与现有技术其它疫苗相比具有以下优点：显示出更快更高的疗效。

根据本发明的实施方案与局部病变疾病治疗的现有技术相比具有以下优点：与现有细胞毒药物相比，显示出几乎无毒的全身安全性和明显较高的局部病变疗效；与现有分子靶向药物相比，显示出不那么苛刻的适应症筛选，以及针对快速生长瘤体、大瘤体和乏血供瘤体的巨大潜力；与现有化学消融剂相比，显示出更高的特异性，即在显示出对局部病变的有效性的同时，也显示出对非病变组织明显低得多的局部刺激性，从而可以有较大的介入适应范围和较高的应用体积；与现有硬化剂相比，显示出更高的疗效和安全性。本发明的应用和疫苗也不受现有细胞毒性药物和现有分子靶向药物遭遇的耐药性问题的困扰。此外，该应用和疫苗制备方便、成本便宜，特别有助于使难以承受高额费用的广大人群也享受到安全、有效治疗。

具体实施方式

本发明的发明人在一个荷瘤动物试验中发现了氨基酸类营养素如精氨酸可以作为佐剂应用于实体肿瘤的治疗疫苗，并增强相应疫苗的效力。

在本发明的范围中，术语“疫苗”是指任何能够特异性地诱发机体针对目标抗原的免疫应答，从而有效预防或治疗目标抗原相关疾病的药物。术语“疫苗佐剂”(简称佐剂)是指能够增强疫苗的特异性免疫功能的物质。疫苗佐剂与通常意义上的免疫增强剂有所不同，后者往往通过吸收作用来增强机体的非特异性免疫功能。

根据本申请公开的一个方面，其提供氨基酸营养素作为疫苗佐剂的应用。根据其一个实施方案，所述疫苗还包含非原位抗原或/和原位抗原激活剂以及药物学可接受的液体载体。

根据本申请公开的另一个方面，其提供一种疫苗，该疫苗包含作为佐剂的氨基酸类营养素、非原位抗原或/和原位抗原激活剂以及药物学可接受的液体载体。

根据本申请公开的再一个方面，其提供一种预防和治疗实体肿瘤的方法，该方法包括向有此需要的个体局部给药治疗有效量的根据本申请公开的疫苗。

在本申请公开中，所用术语“氨基酸类营养素”是指具有营养保健效应的氨基酸类化合物，优选为选自具有营养保健效应的氨基酸、氨基酸聚合物及氨基酸衍生物，更优选为选自中国、美国或欧洲官方药典或指南所载的氨基酸类营养药和具有营养保健作用的氨基酸类辅料。在本发明的范围中，所用术语“营养保健效应”是指由以下之一种或多种生物作用产生的体内效应：提供能量、参与生物活性物质(例如蛋白质)的合成、参与部分新陈代谢、维持动物肠道微生态平衡、以及参与有利于机体健康的其它生理调节(例如调节蛋白质合成、调节免疫反应)。

在本申请公开中，作为所述氨基酸类营养素的氨基酸、氨基酸聚合物及氨基酸衍生物优选为选自以下组中的氨基酸、或者包含以下组中的氨基酸的氨基酸聚合物、或者以下组中的氨基酸或者包含以下组中的氨基酸的氨基酸聚合物的氨基酸衍生物：蛋白氨基酸和非蛋白氨基酸。在一个实施方案中，所述氨基酸营养素在所述疫苗中的浓度(w/v)为2-40％、5-40％、7.5-30％、10-25％或18-25％，优选为15％-25％或20％-25％。

在本发明的范围中，术语“蛋白氨基酸”是指构成蛋白质的主要氨基酸；而术语“非蛋白氨基酸”是指蛋白氨基酸之外的、也可在营养保健品、传统饮食及功能性饮食(例如保健饮食)中用作营养保健功能组分的其它氨基酸。

具体而言，在本申请公开中，所述蛋白氨基酸包括选自以下组中的氨基酸：非极性氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸)，极性中性氨基酸(例如色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸)，碱性氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)。以上除甘氨酸以外均为L型α-氨基酸。所述非蛋白氨基酸可包括以下氨基酸：β-丙氨酸、牛磺酸、γ-氨基丁酸(GABA)、茶多酚(茶氨酸)、南瓜子氨基酸(3-氨基-3-羧基吡烷酸)、谷氨酰胺、瓜氨酸、鸟氨酸等。

所述氨基酸聚合物可以为选自包含如上所述之氨基酸的寡肽和多肽。

在本申请公开中，所用术语“寡肽”是指包含2-10个相同或不同的以肽键相连的氨基酸的氨基酸聚合物；而术语“多肽”是指包含11-100个相同或不同的以肽键相连的氨基酸聚合物。对于组成所述寡肽或多肽的氨基酸，可以全部是上述一种或多种氨基酸，也可以额外包含其他氨基酸。在一个实施方案中，所述寡肽可以为选自以下之一种或多种：甘氨酰-L-酪氨酸、甘氨酰丙氨酸、双甘氨肽、赖氨酸-甘氨酸二肽、丙谷二肽、肌肽(β-丙氨酸组氨酸共聚物)、谷胱甘肽、胶原蛋白寡肽、酪蛋白水解肽、大豆寡肽、寡聚精氨酸、寡聚甘氨酸、寡聚赖氨酸。在一个实施方案中，所述多肽可以为选自以下之一种或多种：聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚赖氨酸。

所述氨基酸衍生物例如可以是选自包含如上所述之氨基酸的氨基酸盐。在本发明的范围中，所用术语“氨基酸盐”是指如上所述之氨基酸与酸或碱所形成的盐，例如与碱形成的钠盐、钙盐、钾盐、铁盐、镁盐、锌盐、镁盐等，以及与酸形成的盐，如盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、磷酸氢盐、磷酸二氢盐、乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、酒石酸盐、乳酸盐、扁桃酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐、氨基酸盐等。更具体地例如有赖氨酸盐酸盐、组氨酸盐酸盐、谷氨酸盐酸盐、半胱氨酸盐酸盐、精氨酸盐酸盐、硫酸甘氨酸、硫酸甘氨酸铁、赖氨酸盐酸盐、天冬氨酸盐酸盐等。

在本申请公开中，所述氨基酸类营养素包括具有营养保健效应的以下氨基酸类化合物之一种或多种：氨基酸、氨基酸盐、寡肽和多肽。在本发明的药物组合物中，所述氨基酸类营养素可以是氨基酸、氨基酸盐、寡肽和多肽中的一种或多种，例如是2种、3种、4种或5种或者更多种。

在本申请公开中，作为所述氨基酸类营养素的氨基酸、氨基酸盐、寡肽和多肽优选为选自以下组中的氨基酸或其盐或者包含或由以下氨基酸构成的寡肽和多肽：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、β-丙氨酸、牛磺酸、γ氨基丁酸(GABA)、茶氨酸、瓜氨酸、鸟氨酸；更优选为选自以下组中的氨基酸或其盐或者包含或由以下氨基酸构成的寡肽和多肽：精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸。

在一个实施方案中，所述氨基酸类营养素选自精氨酸、精氨酸盐、或含有精氨酸的寡肽或多肽。

在一个实施方案中，所述氨基酸类营养素选自赖氨酸、赖氨酸盐、或含有赖氨酸的寡肽或多肽。

在一个实施方案中，所述氨基酸类营养素选自甘氨酸、甘氨酸盐、或含有甘氨酸的寡肽或多肽。

在一个实施方案中，所述氨基酸类营养素选自谷氨酸、谷氨酸盐、或含有谷氨酸的寡肽或多肽。

在一个实施方案中，所述氨基酸类营养素选自具有营养保健效应的氨基酸或氨基酸盐，且所述氨基酸或氨基酸盐在该局部药物组合物中的浓度(w/v)为≥2％、≥2.5、≥5％、≥7.5％、10-25％或18-25％，优选为15％-25％或20％-25％。

在一个实施方案中，所述氨基酸类营养素选自具有营养保健效应的寡肽和多肽，且所述寡肽和多肽在该局部药物组合物中的浓度(w/v)为大于≥5％、优选为7.5-25％、更优选为10％-25％。

在一个实施方案中，所述氨基酸类营养素为所述氨基酸和/或氨基酸盐与所述寡肽和/或多肽的组合，且该组合在该局部药物组合物中的浓度(w/v)为大于≥5％、优选为7.5％-25％、更优选为10-25％。

在本发明的范围中，除非另有说明，术语“浓度”是指所述局部药物组合物中指定组分的重量/体积百分比浓度％(w/v)。术语“局部给药浓度”是指指定组分在药物实施局部给药时的浓度，其可以是指定组分在药物接触靶区处(例如注射针孔或灌注管出口)的浓度。

根据本申请公开的疫苗为局部病变疾病原位治疗疫苗。在本发明的范围中，术语“治疗疫苗”是指能够特异性地诱发机体针对目标抗原的免疫应答、克服其免疫抑制，从而有效抑制、甚至清除目标抗原相关病变的药物。术语“局部病变疾病原位治疗疫苗”是指局部给药至局部病变原位的治疗疫苗。在根据本申请公开的疫苗中，所述原位抗原激活剂选自以下组：酸化剂/糖类营养素的组合、酸化剂/活体染料的组合。

在本申请公开中，所用术语“原位抗原”是指个体局部病变中包含的有可能诱发机体的特异性免疫应答的物质，例如含有肿瘤抗原信息的肿瘤细胞材料、胞外体、多肽及核酸序列等。术语“非原位抗原”是指来自局部病变原位之外的具有特定抗原原性的物质(例如外源性抗原)，是目前疫苗制备中最通常使用的抗原，例如细菌疫苗中的细菌抗原、基因工程蛋白质疫苗中的蛋白质抗原、癌细胞疫苗中的同种癌细胞抗原等。

在本申请公开中，所用术语“原位抗原激活剂”是指通过对个体局部病变(例如瘤体)局部给药可以使其中的潜在抗原脱离其抑制状态进入激活状态从而显示出其特定抗原原性的药物。以瘤体为例，其实际上包含大量的有别于正常机体的抗原信息，只是这些信息被某些病理因素(例如肿瘤细胞微环境)所抑制，从而不能被常规免疫系统识别并应变(例如免疫耐受)。大量实验证实，某些物理(例如反复冻融)或/和物质处理可以降低这种抑制，使瘤内材料显示出被激活的抗原原性。原位抗原激活剂便是可以在体内原位激活这种抗原原性从而引发机体的免疫应答的物质。

在根据本申请公开的疫苗中，所述原位抗原激活剂例如可以是酸化剂/糖类营养素的组合。根据一个实施方案，在该疫苗中，该酸化剂/糖类营养素的组合按照以下量存在：所述酸化剂的浓度(w/v)≥0.5％、优选为0.75-15％、更优选为0.75-1.5％、1.5-3.5％、或4-12％，而所述糖类营养素的浓度≥5％、优选为10-50％、更优选为10-30％、15-40％、15-35％。

在根据本申请公开的疫苗中，所述原位抗原激活剂例如可以是酸化剂/活体染料的组合。根据一个实施方案，在该疫苗中，该酸化剂/活体染料的组合按照以下量存在：所述酸化剂的浓度(w/v)≥0.5％、优选为0.75-15％、更优选为0.75-1.5％、1.5-3.5％、或4-12％，而所述活体染料的浓度≥0.35％、优选为0.5％-10％。

在本申请公开中，术语“酸化剂”是指在药物制备中主要用作辅料、更具体讲用作pH调节的酸，其在使用时除提供酸性外通常并不引入特殊的生物活性。所述酸化剂优选为选自经公认的主管行政部门(例如FDA或中国食药监局)批准、或经公认的药典或指南(例如中国药典2015年版第四部之“药用辅料”，或R.C.罗等编《药用辅料手册》第四版)载入的酸化剂。所述酸化剂包括強酸化剂、中强酸化剂和弱酸化剂。

在本申请公开中，所述酸化剂包括强酸酸化剂、中强酸酸化剂和弱酸酸化剂。酸按其在水溶液中的电离程度，被区分为强酸、中强酸和弱酸。酸的电离程度由电离常数(Ka)来表示，Ka越小酸性越弱,例如弱酸的电离常数(Ka)小于0.0001。更通常地，电离程度由电离常数的负对数(称作酸度系数，pKa)来表示，pKa越大酸性越弱。术语“强酸”是指pKa小于1的酸，例如盐酸、硫酸、硝酸、高氯酸、硒酸、氢溴酸、氢碘酸、氯酸等。术语“弱酸”是指pKa大于4的酸，例如碳酸、硼酸、乙酸等。术语“中強酸”是指pKa＝1-4的酸，例如磷酸、亚硫酸、丙酮酸、草酸、酒石酸、亚硝酸等。

在本发明的范围中，术语“強酸化剂”是指选自强酸的酸化剂，其包括以下之一种或多种：盐酸、硫酸、硝酸，优选为盐酸。术语“中強酸化剂”是指选自中强酸的酸化剂，其包括以下之一种或多种：磷酸、马来酸、乙二酸和酒石酸。术语“弱酸化剂”是指选自弱酸的酸化剂，可以为任选被1-3个羟基取代的C1-10羧酸，该羧酸可以是一元、二元或三元羧酸。该弱酸酸化剂包括选自水溶性饱和脂肪烃基羧酸或/和水溶性羟基羧酸的酸化剂，其中：选自水溶性饱和酯肪烃基羧酸的酸化剂包括以下之一种或多种：乙酸、丙酸、丁酸、丙二酸、丁二酸；和选自水溶性羟基羧酸的酸化剂包括以下之一种或多种:羟基乙酸、乳酸(2-羟基丙酸)、柠檬酸(2-羟基-1,2,3-丙三羧酸)、苹果酸(2-羟基丁二酸)，优选为乙酸。

根据一个实施方案，所述酸化酸化剂选自強酸化剂，且其在该疫苗中的浓度为0.75-3.5％、优选为0.75-1.5％。

根据一个实施方案，所述酸化剂选自中強酸化剂，且其在该疫苗中的浓度为1.5-7.5％、优选为1.5-3.5％。

根据一个实施方案，所述酸化剂选自弱酸化剂，优选为乙酸，且其在该疫苗中的浓度为3.5-15％、优选为5-10％、4-12％。

根据一个实施方案，所述酸化剂选自乙酸、丙酸、丁酸、丙二酸、丁二酸、羟基乙酸、乳酸(2-羟基丙酸)、柠檬酸(2-羟基-1,2,3-丙三羧酸)、苹果酸(2-羟基丁二酸)和酒石酸。在一个实施方案中，上述酸化剂在所述疫苗中的浓度(w/v)为1.5-15％、优选为1.5-7.5％、1.5-12％、3.5-12％、优选为5-10％、4-12％。

根据一个实施方案，所述酸化剂为強酸化剂和弱酸化剂的组合，且该组合在所述疫苗中的浓度(w/v)为1-15％、优选为1.5-10％。

在本发明的范围中，所用术语“糖类营养素”是指具有营养保健效应的糖类化合物，优选为选自具有营养保健效应的单糖、糖聚合物及糖衍生物，更优选为选自中国、美国或欧洲官方药典或指南所载的糖类营养药和具有营养保健作用的糖类辅料。

在本申请公开中，作为所述糖类营养素的单糖、糖聚合物及糖衍生物优选为选自以下组中的单糖、包含以下组中的单糖的糖聚合物、或者它们的衍生物：葡萄糖、核糖、脱氧核糖、木糖、果糖、半乳糖、岩藻糖。

所述糖聚合物可以为选自包含如上所述之单糖的双糖、寡糖和多糖。在本发明的范围中，所用术语“双糖”是指包含有2个通过糖苷键相连的单糖的聚合物；所用术语“寡糖”是指包含有3-10个由糖苷键相连的单糖的聚合物；以及所用术语“多糖”是指包含10个以上由糖苷键相连的单糖的聚合物。对于组成所述双糖、寡糖或多糖的单糖，可以全部是上述一种或多种单糖，也可以额外包含其他单糖。在一个实施方案中，所述双糖可以为选自以下之一种或多种：乳果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、海藻糖。在一个实施方案中，所述寡糖可以为选自以下之一种或多种：壳寡糖、木寡糖、果寡糖、甘露寡糖、麦芽寡糖、异麦芽寡糖。在一个实施方案中，所述多糖可以为选自以下之一种或多种：淀粉、纤维素、右旋糖酐、糖胺聚糖。

所述糖衍生物例如可以为选自如上所述之单糖或糖聚合物的以下糖衍生物：糖酸、糖酸盐、糖醇。在本发明的范围中，所用术语“糖酸”是指单糖或糖聚合物的酸类衍生物；所用术语“糖酸盐”是指单糖或糖聚合物的盐类衍生物；术语“糖醇”是指单糖或糖聚合物的醇类衍生物。在一个实施方案中，所述糖酸可以为选自以下之一种或多种：葡萄糖酸、甘露糖酸、阿糖酸。在一个实施方案中，所述糖酸盐可以为选自以下之一种或多种：葡萄糖酸钠、甘露糖酸钠、阿糖酸钠。在一个实施方案中，所述糖醇可以为选自以下之一种或多种：甘露醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇。

在本发明的药物组合物中，所述糖类营养素可以是单糖、寡糖、多糖、糖酸、糖酸盐、糖醇中的一种或多种，例如是2种、3种、4种或5种或者更多种。

在一个实施方案中，所述糖类营养素选自葡萄糖、包含葡萄糖的糖聚合物、或葡萄糖衍生物。

在一个实施方案中，所述糖类营养素选自核糖、包含核糖的糖聚合物、或核糖衍生物。

在一个实施方案中，所述糖类营养素选自木糖、包含木糖的糖聚合物、或木糖衍生物。

在一个实施方案中，所述糖类营养素优选为选自以下之一种或多种：葡萄糖、果糖、壳寡糖、氨基葡萄糖、乳果糖、山梨醇、核糖、山梨糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、海藻糖、木寡糖、果寡糖、甘露寡糖、木糖醇，更优选为选自以下之一种或多种：葡萄糖、葡萄糖酸钠、壳寡糖、氨基葡萄糖、乳果糖、核糖、甘露寡糖、木糖醇。

在本发明的范围中，术语“活体染料”是指局部给药时能够使靶区内的结构上色、但其副作用又在药学上可以接受的范围之内的有机物，其选自药学上可接受的任何活体染料，优选为选自本领域公知的活体染料，更优选为选自中国、美国或欧洲官方主管行政部门(例如FDA或中国药监局)曾批准或将批准、或经中国、美国或欧洲官方药典(例如美国药典、欧洲药典或中国药典)曾载入或将载入的活体染料。

具体而言，在本申请公开中，所述活体染料可以为选自以下化合物及其衍生物之一种或多种：亚甲蓝(包括其水合物)、专利蓝、异硫蓝、甲苯胺蓝、台盼蓝、碱性蓝、伊红、碱性品红、结晶紫、龙胆紫、中性红、詹纳斯绿B、番红、孟加拉红等。

所述活体染料优选为选自亚甲蓝类染料和孟加拉红，其中所述亚甲蓝类染料为选自以下活体染料及其衍生物之一种或多种：亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝。根据一个实施方案，所述活体染料更优选为亚甲蓝。根据一个实施方案，所述亚甲蓝类染色剂在所述疫苗中的浓度≥0.35％，优选为0.35-2％、更优选为0.35-1.5％或0.5-1％。

根据一个实施方案，所述活体染料选自孟加拉红。根据一个实施方案，所述孟加拉红在所述疫苗中的浓度≥3％，优选为5-10％。

在根据本申请公开的疫苗中，其还可进一步任选包含止痛剂。所述止痛剂用以减轻患者的疼痛感，其可以是本领域技术人员已知的任意合适者，例如苯甲醇、盐酸普鲁卡因、三氯叔丁醇、盐酸利多卡等。

根据本申请公开的疫苗还可进一步任选包含缓释载体。所述缓释载体可以是本领域技术人员已知的任意合适者，包括例如凝胶基质、微粒载体、胶束基质等。

根据本申请公开的疫苗可以是可包含活性成分(所述氨基酸类营养素、非原位抗原或/和原位抗原激活剂)和液体载体(例如水、乙醇、或者水/乙醇混合物)的任何可局部给药的剂型，优选为注射剂，更优选为局部注射剂。

在本发明的范围中，术语“注射剂”是指含活性成分和液体载体并供体内给药的无菌制剂。注射剂按给药方式分为局部注射剂、静脉注射剂等，静脉注射剂只有在给定局部给药浓度后方可作为局部注射剂使用。注射剂按商品形式分为液体注射剂、注射用粉针剂等。注射用粉针剂包含无菌干粉和溶媒，无菌干粉中包含部分或全部活性成分，溶媒中包含全部液体载体。注射剂中所述活性成分的浓度均为其与全部所述液体载体的混合物中的活性成分浓度，通常是局部给药器械(注射器、穿刺器、注入导管等)终点(例如针孔、导管出口等)的液体药物中的活性成分浓度。对注射用粉针剂而言，所述活性成分的浓度即为无菌干粉和溶媒(或所述药物学可接受的液体载体)的混合物(例如复溶液)中的活性成分浓度。

因此，根据本申请公开的疫苗可以为注射剂的剂型，所述注射剂包括液体注射剂和注射用粉针剂。

对于所述注射用粉针剂，其可包括无菌干粉和溶媒，且所述酸化剂和抗肿瘤化疗药物之一部或全部包含于所述无菌干粉，以及所述液体载体包含于所述溶媒，而且所述酸化剂和抗肿瘤化疗药物的浓度分别为它们在无菌干粉和溶媒混合物中的浓度。

根据本申请公开的另一个方面，其提供一种冻干或半冻干形式的用于治疗实体肿瘤的疫苗，其是通过冻干或半冻干根据本申请公开的包含所述作为疫苗佐剂的氨基酸类营养素、原位抗原激活剂以及药物学可接受的载体的疫苗之一部分或全部而得到的。

根据本申请公开的疫苗还可进一步任选地包含赋形剂。所述赋形剂可以是本领域技术人员已知的任意合适者，其可包括例如以下之一种或多种：分散介质、防腐剂、稳定剂、湿润剂和/或乳化剂、增溶剂、增粘剂等。所述增粘剂例如为羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、聚乙烯毗咯烷酮或明胶。所述防腐剂例如抗氧化剂例(如抗坏血酸)。

本领域技术人员会理解，根据本申请公开的疫苗应被制成可向所述靶区局部给药的剂型、优选为注射剂、更优选为局部注射剂。

根据本申请公开的疫苗可如下制备：制备含所述作为疫苗佐剂的氨基酸类营养素、原位抗原激活剂、溶媒(药物学可接受的液体载体)和任选存在的其它物质的液体药物。该液体药物可以是包含局部活性成分的溶液(例如为亲水溶媒的溶液、优选为水溶液)、悬浮液、或乳浊液。当所述液体药物为悬浊液时，其中的分散介质可以本领域技术人员已知的任意合适者，例如微米材料或纳米材料。当所述液体药物为乳浊液时，其中的分散介质可以本领域技术人员已知的任意合适者，例如可用于注射的植物油、合成油或半合成油。所述植物油可以是例如棉籽油、杏仁油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、大豆油和花生油。

根据本发明的制备方法，所述作为疫苗佐剂的氨基酸类营养素、原位抗原激活剂、以及任选存在的其它成分的浓度大于或等于其在本发明的疫苗中的局部给药浓度。当大于在本发明之药物组合物中的浓度时，可进一步被稀释使用。

根据本申请公开的一个实施方案，本发明的疫苗液体注射剂可通过包括以下步骤的方法制备：1)将根据局部给药浓度所需量的所述作为疫苗佐剂的氨基酸类营养素、原位抗原激活剂加入溶媒中制备为液体；2)将根据局部给药浓度所需量的任选存在的其它组分(例如止痛剂等)加入至在步骤1)中制备的液体混合均匀获得液体药物；3)将步骤2)中制备的液体药物除菌后制成液体注射剂。使用时，液体注射剂中的除菌液体药物可直接或稀释后用作局部给药液体药物。

根据本申请公开的一个实施方案，本发明的疫苗液体注射剂可通过包括以下步骤的方法制备：1)将根据局部给药浓度所需量的所述作为疫苗佐剂的氨基酸类营养素、原位抗原激活剂以及任选存在的其他组分加入溶媒(或者药物学可接受的液体载体)中混合均匀并经除菌后制备为除菌液体I；2)将根据局部给药浓度所需量的任选存在的其他组分(例如止痛剂等)加入溶媒(或者药物学可接受的液体载体)中混合均匀并经除菌后制备为除菌液体II。使用时，除菌液体I和除菌液体II在进入局部给药器械前或后形成混合液，其即可直接或稀释后用作局部给药液体药物。

根据本申请公开的一个实施方案，本发明的疫苗之注射用粉针剂可通过包括以下步骤的方法制备：制备含根据局部给药浓度所需量的所述作为疫苗佐剂的氨基酸类营养素和原位抗原激活剂的无菌干粉；和制备包含根据局部给药浓度所需量的所述其它组分(例如止痛剂)的无菌溶媒。所述除菌干粉优选为除菌冻干干粉，其制备方法包括：1)制备包含所述作为疫苗佐剂的氨基酸类营养素、原位抗原激活剂、以及任选存在的其他组分的溶液；2)除菌过滤和分装；3)冷冻干燥；4)压塞、轧盖。所述冷冻干燥的工艺条件例如包括：预冻条件为在预冻温度-45℃保持4小时；升华干燥条件为升温速率为0.1℃/分钟、且升至-15℃时至少保持10小时；解吸附干燥条件为30℃保持6小时。使用时，将注射用粉针剂的无菌干粉复溶于无菌溶媒中形成复溶液体药物，其即可直接或稀释后用作局部给药液体药物。

在本申请公开中，所述疫苗主要是用于通过局部给药预防和治疗实体肿瘤，其中所述实体肿瘤包括恶性肿瘤和非恶性肿瘤。

在根据本申请公开的局部治疗和预防实体肿瘤的应用和方法中，所述作为疫苗佐剂的氨基酸类营养素和原位抗原激活剂以它们在所述局部药物组合物中的浓度或量比局部给药。该浓度或量比局部给药能够提供局部反应的协同作用。

在本发明的范围内，所用术语“实体肿瘤”是指具有瘤体的肿瘤，其可以是由于任何病理(恶性和非恶性)和处于任何阶段的肿瘤，包括例如按照肿瘤细胞类型进行分类的以下组：上皮细胞肿瘤、肉瘤、淋巴瘤、生殖细胞肿瘤、胚细胞瘤；以及包括按照肿瘤细胞集中区所在的器官或组织来命名的肿瘤，包括例如按照以下器官或组织来命名的肿瘤：皮肤、骨、肌肉、乳腺、肾、肝、肺、胆囊、胰腺、脑、食道、膀肌、大肠、小肠、脾、胃、前列腺、翠丸、卵巢或子宫。

具体而言，所述恶性肿瘤包括例如乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、食道癌、胃癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌等。

所述非恶性肿瘤包括例如乳腺瘤、胰腺瘤、甲状腺瘤、前列腺瘤、肝瘤、肺瘤、肠瘤、口腔瘤、食道瘤、胃瘤、鼻咽瘤、喉瘤、睾丸瘤、阴道瘤、子宫瘤、输卵管瘤、卵巢瘤等。

本发明中的所述局部药物是一种治疗药物，当其用于预防和治疗局部病变疾病时，还可与其它介入疗法、全身化疗、免疫疗法、光动力疗法、声动力疗法、手术干预或此类疗法的组合相组合施用，以进一步提高疗效。

本申请公开包括以下项目：

项目1、氨基酸营养素作为疫苗佐剂的应用。

项目2、根据项目1的应用，其中所述疫苗还包含非原位抗原或/和原位抗原激活剂以及药物学可接受的液体载体。

项目3、一种疫苗，其包含作为佐剂的氨基酸类营养素、非原位抗原或/和原位抗原激活剂以及药物学可接受的液体载体。

项目4、根据项目1-3之一的应用或疫苗，其中所述氨基酸类营养素包括具有营养保健效应的以下氨基酸类化合物之一种或多种：氨基酸、氨基酸盐、寡肽和多肽；优选为选自以下组中的氨基酸或其盐或者包含或由以下氨基酸构成的寡肽和多肽：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、β-丙氨酸、牛磺酸、γ氨基丁酸(GABA)、茶多酚(茶氨酸)、南瓜子氨基酸(3-氨基-3-羧基吡烷酸)、谷氨酰胺、瓜氨酸、鸟氨酸；更优选为选自以下组中的氨基酸或其盐或者包含或由以下氨基酸构成的寡肽和多肽：精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸。

项目5、根据项目4的应用或疫苗，其中所述氨基酸类营养素选自具有营养保健效应的氨基酸或氨基酸盐，且所述氨基酸或氨基酸盐在所述疫苗中的浓度(w/v)为大于≥5％、优选为10-25％或18-25％。

项目6、根据项目4的应用或疫苗，其中所述氨基酸类营养素选自具有营养保健效应的寡肽和多肽，且所述寡肽和多肽在所述疫苗中的浓度(w/v)为大于≥5％、优选为7.5-25％。

项目7、根据项目4的应用或疫苗，其中所述氨基酸类营养素为所述氨基酸和/或氨基酸盐与所述寡肽和/或多肽的组合，且该组合在该局部药物组合物中的浓度(w/v)为大于≥5％、优选为10-25％。

项目8、根据项目4的药物组合物或应用，其中所述寡肽为选自以下组之一种或多种：甘氨酰-L-酪氨酸、甘氨酰丙氨酸、双甘氨肽、赖氨酸-甘氨酸二肽、丙谷二肽、肌肽(β-丙氨酸组氨酸共聚物)、谷胱甘肽、胶原蛋白寡肽、酪蛋白水解肽、大豆寡肽、寡聚精氨酸、寡聚甘氨酸、寡聚赖氨酸；所述多肽为选自以下组之一种或多种：聚天冬氨酸、聚谷氨酸、聚赖氨酸。

项目9、根据项目2或3的应用或疫苗，其中所述原位抗原激活剂选自以下组：酸化剂/糖类营养素的组合、酸化剂/活体染料的组合。

项目10、根据项目9的应用或疫苗，其中所述原位抗原激活剂为酸化剂/糖类营养素的组合，且在该疫苗中，所述酸化剂的浓度(w/v)≥0.5％、优选为0.75-15％、更优选为0.75-1.5％、1.5-3.5％、或4-12％，而所述糖类营养素的浓度≥5％、优选为10-50％、更优选为15-35％。

项目11、根据项目9的应用或疫苗，其中所述原位抗原激活剂为酸化剂/活体染料的组合，且在该疫苗中，所述酸化剂的浓度(w/v)≥0.5％、优选为0.75-15％、更优选为0.75-1.5％、1.5-3.5％、或4-12％，而所述活体染料的浓度≥0.35％、优选为0.5％-10％。

项目12、根据项目9-11之一的应用或疫苗，其中所述酸化剂包括強酸化剂、中强酸化剂和弱酸化剂，其中所述強酸化剂为选自以下之一种或多种：盐酸、硫酸、硝酸，优选为盐酸；所述中強酸化剂为选自以下之一种或多种：磷酸、乙二酸、马来酸；以及所述弱酸化剂为选自以下之一种或多种：乙酸、丙酸、丁酸、丙二酸、丁二酸、羟基乙酸、乳酸(2-羟基丙酸)、柠檬酸(2-羟基-1，2，3-丙三羧酸)、苹果酸(2-羟基丁二酸)、酒石酸，优选为乙酸。

项目13、根据项目12的应用或疫苗，其中所述酸化酸化剂选自強酸化剂，且其在该疫苗中的浓度为0.75-3.5％、优选为0.75-1.5％。

项目14、根据项目12的应用或疫苗，其中所述酸化剂选自中強酸化剂，且其在该疫苗中的浓度为1.5-7.5％、优选为1.5-3.5％。

项目15、根据项目12的应用或疫苗，其中所述酸化剂选自弱酸化剂，且其在该疫苗中的浓度为3.5-15％、优选为4-12％。

项目16、根据项目12的应用或疫苗，其中所述酸化剂为強酸化剂和弱酸化剂的组合，且该组合在所述疫苗中的浓度为1-15％、优选为1.5-10％。

项目17、根据项目9或10的应用或疫苗，其中所述糖类营养素为选自包含以下糖单元之一种或多种的糖类化合物:葡萄糖、核糖、木糖、果糖、半乳糖,优选为选自以下之一种或多种:葡萄糖、果糖、壳寡糖、氨基葡萄糖、乳果糖、山梨醇、核糖、山梨糖、甘露糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、木寡糖、果寡糖、甘露寡糖、葡萄糖酸、葡萄糖酸钠、木糖醇、甘露醇、麦芽糖醇、乳糖醇，更优选为选自以下之一种或多种：葡萄糖、葡萄糖酸钠、壳寡糖、氨基葡萄糖、乳果糖、核糖、低聚甘露糖、木糖醇。

项目18、根据项目9或11的应用或疫苗，其中所述活体染料选自亚甲蓝类染料和孟加拉红。

项目19、根据项目18的应用或疫苗，其中所述亚甲蓝类染料包括以下化合物及其衍生物：亚甲蓝、专利蓝、异硫蓝，且其中所述亚甲蓝类染色剂在该疫苗中的浓度≥0.35％，优选为0.35-2％、更优选为0.35-1.5％或0.5-1％。

项目20、根据项目18的应用或疫苗，其中所述活体染料选自孟加拉红，且其中所述孟加拉红在该疫苗中的浓度≥5％，优选为5-10％。

项目21、一种疫苗，其是通过冻干或者半冻干部分或全部根据项目3-20之一的疫苗而制备的。

项目22、根据项目1-21之一的疫苗，其为治疗疫苗。

项目23、根据项目1-22之一的应用或疫苗，其中所述疫苗是用于预防或治疗实体肿瘤。

项目24、一种预防和治疗实体肿瘤的方法，其包括向有此需要的个体局部给药根据项目3-23之一的疫苗。

项目25、根据项目23或24的应用、疫苗或方法，其中所述实体肿瘤包括恶性肿瘤和非恶性肿瘤。

项目26、根据项目25的应用、疫苗或方法，其中所述恶性肿瘤包括乳腺癌、胰腺癌、甲状腺癌、鼻咽癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、肠癌、口腔癌、食道癌、胃癌、喉癌、睾丸癌、阴道癌、子宫癌、卵巢癌。

项目27、根据项目25的应用、疫苗或方法，其中所述非恶性肿瘤包括乳腺瘤、胰腺瘤、甲状腺瘤、前列腺瘤、肝瘤、肺瘤、肠瘤、口腔瘤、食道瘤、胃瘤、鼻咽瘤、喉瘤、睾丸瘤、阴道瘤、子宫瘤、输卵管瘤、卵巢瘤。

项目28、根据项目23或24的疫苗、应用或方法，其中所述实体肿瘤包括分泌腺肿瘤、皮肤肿瘤和肉瘤。

项目29、根据项目28的疫苗、应用或方法，其中所述分泌腺肿瘤包括乳腺肿瘤、肝肿瘤、结肠肿瘤、胰腺肿瘤、甲状腺肿瘤、前列腺肿瘤、肺肿瘤、头颈肿瘤、鼻咽肿瘤、睾丸肿瘤、阴道肿瘤、子宫肿瘤、卵巢肿瘤。

项目30、根据项目29的疫苗、应用或方法，其中所述皮肤肿瘤包括黑色素瘤。

基于在下文中更详细描述的研究，尽管具体机理尚待进一步研究，本发明的疫苗显示出促进局部病变所在组织的相关结构(例如病变组织、病变细胞及参与构成它们的任一结构)的有效破坏、同时对患者正常组织仅有最小化的损害，从而达到安全、有效治疗局部病变疾病的药学效果。

实施例

通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为对本发明的限制。在以下实施例中，所有的试验动物均依照相关法规及行业自律进行。如无特殊说明，所有试验均按常规方法进行。

以下具体实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中所用的部分氨基酸类营养素、活体染料、糖类营养素组合物和酸化剂列于表1中。

表1

在本发明中，L-氨基酸均简写为氨基酸(例如L-精氨酸均简写为精氨酸)，还原型谷胱甘肽简写为谷胱甘肽,丙氨酰-谷氨酰胺二肽简写为丙谷二肽。

在以下实施例中，除非另有说明，皮下移植瘤动物试验均按药管当局颁发的试验指南进行。试验动物为6-8周龄、体重17.5-20.5g的Balb/c裸鼠或小鼠。皮下移植均按常规的肿瘤细胞皮下接种方法进行。除非另有说明，待肿瘤长至所需体积(例如75-500mm³)，采用PEMS 3.2软件(四川大学华西公共卫生学院编制)随机分为若干个组，每组6只动物。试验观察、测量和分析的项目，包括一般状态、体重、摄食量、肿瘤体积、瘤重、胸腺重量、脾脏重量等。

肿瘤体积计算公式如下：

肿瘤体积(V)＝l/2×a×b²，其中a表示肿瘤长，b表示肿瘤宽。

肿瘤生长抑制率(本发明中简记为抑瘤率)计算公式如下：

抑瘤率Y(％)＝(TW-CW)/CW×100％，其中TW为研究组的平均瘤重；CW为阴性对照组的平均瘤重。

在以下实施例中，试验均采用重复测量方差分析(Repeated Measμres ANOVA)分别对指标均数的组别差异进行统计学检验。组别差异有统计学意义时(P≤0.05)，采用最小显著差异法对各组与阴性对照组间差异进行比较。定量指标采用均数±标准误(X±SEM)描述。当LEVENE方差齐性检验提示方差不齐时(P≤0.05)，采用Mann-Whitney Μ秩和检验(M-W法)比较组间差异。所有的统计分析，均在SPSS for Windows 13.0软件下完成。

实施例1：疫苗的制备

本实施例制备的部分本发明的疫苗的组成列于表2。

表2

以下列出本发明的组合物的制备试验的几个例子。

1)、非原位抗原/氨基酸类营养素佐剂疫苗的制备

将肿瘤细胞(例如黑色素瘤B16-f10细胞)悬液接种于6只BALB/c小鼠左前肢腋部皮下，每只接种2×10⁶个细胞，16天后处死小鼠，剥取瘤块，剔除坏死组织，经200目滤网研磨后收集获得细胞悬液并测定和稀释至所需细胞数目，再加入1/10体积DNase(0.01mg/mL)，经反复冻融(-20℃冻存30min再37℃融化10min)直至肿瘤细胞被完全裂解(台盼兰蓝染后显微镜观察)，且经验证(接种BALB/c小鼠)其己丧失致瘤性。在本发明中，该制备物记为细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)，可用作特异性抗原用于疫苗制备。

将细胞裂解物与佐剂混合，即制备出抗原/佐剂疫苗。例如3ml细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)中加入0.6g精氨酸即制得细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)/20％精氨酸疫苗。

2)、原位抗原激活剂/氨基酸类营养素佐剂疫苗的制备

(1)、液体注射剂的制备(1)

按所需浓度(如表2所述)量取氨基酸类营养素(例如10g谷胱甘肽)、原位抗原激活剂(例如5g乙酸、30g葡萄糖)、任选存在的其他组分及适量(例如70％配制体积)的溶媒(例如注射用水)，并将它们在室温下缓慢混合均匀，然后加溶媒定容至总体积(例如100ml)，再混合均匀除菌过滤后分装为所需量(例如10ml/瓶)备用。该制备物(例如10％谷胱甘肽/30％葡萄糖/5％乙酸水溶液)可作为液体注射剂局部给药。

(2)、液体注射剂的制备(2)

1)、按所需浓度(如表2所述)量取氨基酸类营养素(例如10g谷胱甘肽)、其它必须成分(例如30g葡萄糖)、任选存在的其他组分及适量(例如60％配制体积)的溶媒(例如注射用水)，并将它们在室温下缓慢混合均匀，然后加溶媒定容至总体积(例如85ml)，再混合均匀除菌过滤后分装为所需量(例如8.5ml/瓶)储存备用，此为溶液I；2)、按所需浓度(如表2所述)量取其它必须成分(例如5g乙酸)、任选存在的其他组分及配制总体积10％-14％的注射用水(例如10ml)，并将它们在室温下缓慢混合均匀，然后加水定容至总体积(例如15ml)混合均匀，再将其除菌过滤后分装为所需量(例如1.5ml/瓶)储存备用，此为溶液II。溶液I和溶液II按各组分所需浓度混合均匀(例如将8.5ml溶液I和1.5ml溶液II混合)为混合液(例如10％谷胱甘肽/30％葡萄糖/5％乙酸水溶液)后即可作为液体注射剂局部给药。

(3)、注射用粉针剂的制备

1)、按所需浓度(如表2所述)量取氨基酸类营养素(例如10g谷胱甘肽)、其它必须成分(例如30g葡萄糖)、任选存在的其他组分及适量(例如60％配制体积)的溶媒(例如注射用水)，并将它们在室温下缓慢混合均匀，然后加溶媒定容至总体积(例如85ml)，再混合均匀除菌过滤后分装为所需量(例如8.5ml/瓶)进行冷冻干燥及压塞、轧盖，制备为除菌干粉备用；

2)、按所需浓度(如表2所述)量取其它必须成分(例如5g乙酸)、任选存在的其他组分及配制总体积10％-14％的注射用水(例如10ml)，并将它们在室温下缓慢混合均匀，然后加水定容至总体积(例如15ml)混合均匀，此为溶媒，再将其分装为所需量(例如1.5ml/瓶)储存备用。

按各组分所需浓度将所需量的除菌干粉(例如1瓶上述干粉)复溶于所需量的溶媒(例如1瓶上述溶媒)为所需复溶液(例如10％谷胱甘肽/30％葡萄糖/5％乙酸水溶液)后即可作为注射剂局部给药。

实施例2：氨基酸类营养素佐剂效应研究

1、佐剂效应

将小鼠随机分为9组，每组6只，其中2个阴性对照组和9个研究组。造模细胞为黑色素瘤B16-f10细胞，按前述方法(2×10⁶个细胞/0.1ml)进行移植瘤建模。阴性对照物为生理盐水，其分别行腹腔注射和行皮下注射。4个研究药物及其用药方式如下表所示。药物均为水溶液，按实施例1的制备方法配置而成。各组均在接种肿瘤后第2、8、15日进行1次注射，每次100μl/只。用药结束后5日，对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从各用药方式的阴性对照组计算抑瘤率，结果示于表3。

表3

在上表腹腔注射各组中，阳性对照组符合以下预期：抗肿瘤细胞药物可以靶向肿瘤细胞从而抑制瘤体生长，而精氨酸、黑色素瘤细胞裂解物、精氨酸/黑色素瘤细胞裂解物组均未显示出抑制瘤体生长的作用。在皮下注射各组中，与阴性对照组相比，精氨酸和黑色素瘤细胞裂解物均没有显著差异(P>0.05)，而精氨酸/黑色素瘤细胞裂解物则显示出显著性差异(P<0.05)。据此结果，精氨酸显示出明显的佐剂效应。

2、氨基酸类营养素佐剂的更多应用例

以下实验研究了氨基酸类营养素佐剂在多种疫苗中的应用。在以下实验中，阴性对照物均为生理盐水，药物均为水溶液，均按实施例1的制备方法配置而成。实验均在用药结束后5日，对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重，并从各自阴性对照组计算抑瘤率。

1)、在抗乳腺肿瘤疫苗中的应用

将小鼠随机分为4组，每组6只，其中1个阴性对照组和3个研究组(A、B、C组)。造模细胞为乳腺瘤4T1细胞，按前述方法(0.1×10⁶个细胞/0.1ml)进行移植瘤建模。阴性对照物为生理盐水，3个研究药物分别为:20％赖氨酸、4T1细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)、4T1细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)/20％赖氨酸。药物均为水溶液，按实施例1的制备方法配置而成。各组均在接种肿瘤后第2、8、15日进行1次皮下注射，每次100μl/只。用药结束后5日，对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重并计算抑瘤率。

A、B、C组的抑瘤率分别为4％、9％、27％。与阴性对照组相比，赖氨酸和4T1细胞裂解物均没有显著差异(P>0.05)，而赖氨酸/4T1细胞裂解物则显示出显著性差异(P<0.05)，赖氨酸显示出明显的佐剂效应。

2)、在抗肝肿瘤疫苗中的应用

将小鼠随机分为4组，每组6只，其中1个阴性对照组和3个研究组(A、B、C组)。造模细胞为鼠肝癌H22细胞，按前述方法(2×10⁶个细胞/0.1ml)进行移植瘤建模。阴性对照物为生理盐水，3个研究药物分别为:20％赖氨酸、H22细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)、H22细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)/20％赖氨酸。药物均为水溶液，按实施例1的制备方法配置而成。各组均在接种肿瘤后第2、8、15日进行1次皮下注射，每次100μl/只。用药结束后5日，对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重并计算抑瘤率。

A、B、C组的抑瘤率分别为3％、11％、29％。与阴性对照组相比，赖氨酸和未配伍佐剂的H22细胞裂解物均没有显著差异(P>0.05)，而赖氨酸/H22细胞裂解物则显示出显著性差异(P<0.05)，赖氨酸显示出明显的佐剂效应。

3)、在抗结肠肿瘤疫苗中的应用

将小鼠随机分为4组，每组6只，其中1个阴性对照组和3个研究组(A、B、C组)。造模细胞为鼠结肠癌CT26细胞，按前述方法(1×10⁶个细胞/0.1ml)进行移植瘤建模。阴性对照物为生理盐水，3个研究药物分别为:20％精氨酸、乳腺瘤细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)、乳腺瘤细胞裂解物(2×10⁷个细胞/ml)/20％精氨酸。药物均为水溶液，按实施例1的制备方法配置而成。各组均在接种肿瘤后第2、8、15日进行1次皮下注射，每次100μl/只。用药结束后5日，对动物进行安乐死，解剖后测定瘤重并计算抑瘤率。

A、B、C组的抑瘤率分别为7％、13％、31％。与阴性对照组相比，精氨酸和CT26细胞裂解物均没有显著差异(P>0.05)，而精氨酸/CT26细胞裂解物则显示出显著性差异(P<0.05)，精氨酸显示出明显的佐剂效应。

按照以上结果，氨基酸类营养素能够作为佐剂应用于制备疫苗。

实施例3：包含原位抗原激活剂和氨基酸类营养素的原位疫苗的免疫性研究

1、氨基酸类营养素/酸化剂/葡萄糖类营养素组合物的免疫性研究

造模细胞为黑色素瘤B16-f10细胞，按前述方法分别于小鼠左、右肋下进行移植瘤建模(每个移植点2×10⁶个细胞/0.1ml)。造模成功的小鼠(左、右肋下肿瘤体积73-105mm³)随机分为6组，每组6只，其中1个阴性对照组和5个研究组(A、B、C、D、E组)。阴性对照物为生理盐水，5个研究药物如下表所示。药物均为水溶液，按实施例1的制备方法配置而成。各组均在分组后第1、4、7日分别对右肋下移植瘤进行1次瘤内注射，每次100μl/只。用药结束后5日，对动物进行安乐死，解剖后测定两胁下瘤重并计算抑瘤率，结果示于表4。

表4

在上表中，在未注射药物的左肋下移植瘤中，与阴性对照组相比，A、B、C、D组均没有显著差异(P>0.05)，只有E组显示出显著性差异(P<0.05)，表现出明显的原位疫苗免疫效应。

使用实施例1的方法制备的其它类似疫苗(例如表2中的氨基酸类营养素/酸化剂/葡萄糖类营养素佐剂疫苗)，也可以观察到类似原位疫苗免疫效应。

2、氨基酸类营养素/活体染料/酸化剂的免疫性研究

造模细胞为黑色素瘤B16-f10细胞，按前述方法分别于小鼠左、右肋下进行移植瘤建模(每个移植点2×10⁶个细胞/0.1ml)。造模成功的小鼠(左、右肋下肿瘤体积73-105mm³)随机分为6组，每组6只，其中1个阴性对照组和5个研究组(A、B、C、D、E组)。阴性对照物为生理盐水，5个研究药物如下表所示。药物均为水溶液，按实施例1的制备方法配置而成。各组均在分组后第1、4、7日分别对右肋下移植瘤进行1次瘤内注射，每次100μl/只。用药结束后5日，对动物进行安乐死，解剖后测定两胁下瘤重并计算抑瘤率，结果示于表5。

表5

在上表中，在未注射药物的左肋下移植瘤中，与阴性对照组相比，A、B、C、D组均没有显著差异(P>0.05)，只有E组显示出显著性差异(P<0.05)，表现出明显的原位疫苗免疫效应。

使用实施例1的方法制备的其它类似疫苗(例如表2中的氨基酸类营养素/活体染料/酸化剂疫苗)，也可以观察到类似原位疫苗免疫效应。

3、抗原/原位抗原激活剂/氨基酸类营养素佐剂疫苗

造模细胞为黑色素瘤B16-f10细胞，按前述方法分别于小鼠左、右肋下进行移植瘤建模(每个移植点2×10⁶个细胞/0.1ml)。造模成功的小鼠(左、右肋下肿瘤体积53-95mm³)随机分为8组，每组6只，其中1个阴性对照组和7个研究组(A、B、C、D、E、F、G组)。阴性对照物为生理盐水，6个研究药物如下表所示。药物均为水溶液，按实施例1的制备方法配置而成。各组均在分组后第1、4、7日分别对右肋下移植瘤进行1次瘤内注射，每次100μl/只。用药结束后5日，对动物进行安乐死，解剖后测定两胁下瘤重并计算抑瘤率，结果示于表6。

表6

在上表中，在未注射药物的左肋下移植瘤中，与阴性对照组相比，A、B、C、D、F组均没有显著差异(P>0.05)，只有E、G组显示出显著性差异(P<0.05)，表现出明显的原位疫苗免疫效应。

使用实施例1的方法制备的其它类似疫苗(例如表2中的抗原/原位抗原激活剂/葡萄糖类营养素佐剂疫苗)，也可以观察到类似疫苗免疫效应。

实施例4：包含原位抗原激活剂和氨基酸类营养素佐剂的疫苗的更多应用例

在以下试验中，造模成功的小鼠随机分为4组，每组6只，其中1个阴性对照组和3个研究组(A、B、C组)。药物均为水溶液，按实施例1的制备方法配置而成。各组均在分组后第1、4、7日分别对右肋下移植瘤进行1次瘤内注射，每次100μl/只。

1)、在抗乳腺肿瘤疫苗中的应用

造模细胞为乳腺瘤4T1细胞，按前述方法分别于小鼠左、右肋下进行移植瘤建模(每个移植点0.5×10⁶个细胞/0.1ml)。造模成功的小鼠(左、右肋下肿瘤体积53-81mm³)随机分为4组，其中1个阴性对照组和3个研究组(A、B、C组)。阴性对照物为生理盐水，3个研究药物如下表所示。用药结束后5日，对动物进行安乐死，解剖后测定两胁下瘤重并计算抑瘤率，结果示于表7。

表7

在上表中，在未注射药物的左肋下移植瘤中，与阴性对照组相比，A、B、C组均显示出显著性差异(P<0.05)，表现出明显的原位疫苗免疫效应。

使用实施例1的方法制备的其它疫苗(例如表2中的的疫苗)，也可以观察到类似疫苗免疫效应。

2)、在抗肝肿瘤疫苗中的应用

造模细胞为鼠肝癌H22细胞，按前述方法分别于小鼠左、右肋下进行移植瘤建模(每个移植点2×10⁶个细胞/0.1ml)。造模成功的小鼠(左、右肋下肿瘤体积57-74mm³)随机分为4组，其中1个阴性对照组和3个研究组(A、B、C、D组)。阴性对照物为生理盐水，3个研究药物如下表所示。用药结束后5日，对动物进行安乐死，解剖后测定两胁下瘤重并计算抑瘤率，结果示于表8。

表8

在上表中，在未注射药物的左肋下移植瘤中，与阴性对照组相比，A、B、C组均显示出显著性差异(P<0.05)，表现出明显的原位疫苗免疫效应。

使用实施例1的方法制备的其它疫苗(例如表2中的的疫苗)，也可以观察到类似疫苗免疫效应。

3)、在抗结肠肿瘤疫苗中的应用

造模细胞为鼠结肠癌CT26细胞，按前述方法分别于小鼠左、右肋下进行移植瘤建模(每个移植点2×10⁶个细胞/0.1ml)。造模成功的小鼠(左、右肋下肿瘤体积53-71mm³)随机分为3组，其中1个阴性对照组和2个研究组(A、B组)。阴性对照物为生理盐水，3个研究药物如下表所示。用药结束后5日，对动物进行安乐死，解剖后测定两胁下瘤重并计算抑瘤率，结果示于表9。

表9

在上表中，在未注射药物的左肋下移植瘤中，与阴性对照组相比，A、B组均显示出显著性差异(P<0.05)，表现出明显的原位疫苗免疫效应。

使用实施例1的方法制备的其它疫苗(例如表2中的的疫苗)，也可以观察到类似疫苗免疫效应。

除本文中描述的那些外，根据前述描述，本发明的多种修改对本领域技术人员而言会是显而易见的。这样的修改也意图落入所附权利要求书的范围内。本申请中所引用的各参考文献(包括所有专利、专利申请、期刊文章、书籍及任何其它公开)均以其整体援引加入本文。

Claims (10)

1.氨基酸营养素作为疫苗佐剂的应用。

2.根据权利要求1的应用，其中所述疫苗还包含非原位抗原或/和原位抗原激活剂以及药物学可接受的液体载体。

3.一种疫苗，其包含作为佐剂的氨基酸类营养素、非原位抗原或/和原位抗原激活剂以及药物学可接受的液体载体。

4.根据权利要求1-3之一的应用或疫苗，其中所述氨基酸类营养素包括具有营养保健效应的以下氨基酸类化合物之一种或多种：氨基酸、氨基酸盐、寡肽和多肽；优选为选自以下组中的氨基酸或其盐或者包含或由以下氨基酸构成的寡肽和多肽：丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、β-丙氨酸、牛磺酸、γ氨基丁酸(GABA)、茶多酚(茶氨酸)、南瓜子氨基酸(3-氨基-3-羧基吡烷酸)、谷氨酰胺、瓜氨酸、鸟氨酸；更优选为选自以下组中的氨基酸或其盐或者包含或由以下氨基酸构成的寡肽和多肽：精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、谷氨酸。

5.根据权利要求4的应用或疫苗，其中所述氨基酸类营养素选自具有营养保健效应的氨基酸或氨基酸盐，且所述氨基酸或氨基酸盐在所述疫苗中的浓度(w/v)为大于≥5％、优选为10-25％或18-25％。

6.根据权利要求4的应用或疫苗，其中所述氨基酸类营养素选自具有营养保健效应的寡肽和多肽，且所述寡肽和多肽在所述疫苗中的浓度(w/v)为大于≥5％、优选为7.5-25％。

7.根据权利要求4的应用或疫苗，其中所述氨基酸类营养素为所述氨基酸和/或氨基酸盐与所述寡肽和/或多肽的组合，且该组合在该局部药物组合物中的浓度(w/v)为大于≥5％、优选为10-25％。

8.根据权利要求2或3的应用或疫苗，其中所述原位抗原激活剂选自以下组：酸化剂/糖类营养素的组合、酸化剂/活体染料的组合。

9.一种疫苗，其是通过冻干或者半冻干部分或全部根据权利要求3-8之一的疫苗而制备的。

10.根据权利要求1-9之一的应用或疫苗，其中所述疫苗是用于预防或治疗实体肿瘤。