CN108096563A - 细胞毒性二肽的冻干制剂 - Google Patents

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Abstract

本方面涉及一种包含细胞毒性二肽例如美法仑氟灭酰胺和一种或更多种赋形剂的新型冻干药物制剂，所述赋形剂选自下组：聚山梨酯；聚乙二醇；β‑环糊精；α‑环糊精；羟丙基‑β‑环糊精；磺基丁基醚‑β‑环糊精；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；克列莫弗EL；二甲亚砜；D‑甘露醇；海藻糖；蔗糖和氨基酸。该制剂可进一步配制并有助于癌症治疗。

Description

细胞毒性二肽的冻干制剂
技术领域
本发明涉及包含细胞毒性二肽或其药学上可接受的盐的冻干药物制剂、其制备方法、包含该冻干药物制剂的组合物及其在癌症治疗中的应用。
背景技术
癌症是一种难以治愈并且可能会致死的疾病。因此，研究学会持续致力于努力开发对癌症的新疗法。绝大多数癌症以实体瘤形式存在，例如肺癌、乳腺癌、前列腺癌，其他的是血液学和淋巴样恶性肿瘤，例如白血病和淋巴瘤。
常采用化疗来尝试治愈或减轻疾病。由于癌细胞一般分裂快速，化疗通常通过杀死快速分裂的细胞起作用。广义而言，大多数化疗药物通过破坏有丝分裂(即细胞分裂)有效靶向快速分裂细胞来起作用。因为这些药物引起细胞损伤，所以称之为细胞毒性的。一些药物引起细胞凋亡(所谓的“程序性细胞死亡”)。当两种或更多种药物作用模式不同时常使用联合化疗来使抗肿瘤作用最优化、副作用最小化并防止耐受性发生。化疗获得的结果根据肿瘤类型而不同。一些肿瘤非常敏感，那么治疗后发生治愈的可能性就很高。
化疗药物一般分为烷化剂、抗代谢剂、蒽环类抗生素、植物生物碱、拓扑异构酶抑制剂、和其它抗肿瘤剂。所述药物影响细胞分裂或DNA合成。
烷化剂例如衍生自氮芥的药物，即二(2-氯乙基)胺衍生物，在多种肿瘤疾病的治疗中用作化疗药物。烷化剂能将烷基共价结合到细胞中的电负性位点。所以这些试剂通过与生物重要分子例如RNA、DNA和蛋白质中的杂原子形成共价键来破坏细胞功能从而起作用。烷化剂的示例是化学修饰细胞DNA的氮芥、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、异环磷酰胺、替莫唑胺和美法仑。
WO01/96367公开了烷基化二肽和三肽以及一种或两种其它氨基酸或氨基酸衍生物。证实这些衍生物对多种肿瘤类型有改进的疗效。
美法仑，即对[二-(2-氯乙基)氨基]苯丙氨酸，是氮芥和苯丙氨酸氨基酸的偶联物，该偶联物合成于二十世纪50年代中期(美国专利No.3,032,584)。这类烷基化物质很快成为化疗领域中的宝贵药物，在(例如骨髓瘤的)治疗中仍起重要作用。但美法仑在临床应用上对晚期实体瘤的治疗疗效有限。因此在对恶性细胞更佳选择性的研究中，合成了美法仑类似物。
Larionov L.F.,Cancer Res(1961),21,99-104公开了多种与美法仑相关的衍生物。
STN注册文件RN:1060633-95-5,RN:88 7609-28-1,RN 790650-89-4,RN:781606-39-1,RN:773046-98-3,RN:767621-58-9,RN:760165-58-0和RN:757941-61-0公开了多种与美法仑相关的衍生物。
Koltun,M等，Biopharmaceutics&Drug disposition(“生物药物&药物处置”)(210),31,450-454公开了美法仑的形式。
Ma D Q等，International Journal of Pharmaceutics(“国际药物杂志”)(1999),189,227-234公开了美法仑的形式。
Murav’ev I等，Farmatsiya(1978),27,(2),13-15(Chemical Abstracts(化学文摘)no.1978:412066中的摘要)公开了与美法仑相关的衍生物。
冻干或冷冻干燥是用于保存或提高稳定性或终止降解的样品脱水方法。由于冻干产品中含水量很低，通常约1～4％，微生物和酶的作用受到抑制从而延长了产品保质期。冻干过程中，将待冻干样品溶于水性溶液(aqueous solution)中然后冷冻，之后降低环境压力。随后该样品受到升华(任选地用加热方式)以将冷冻水从固相直接升华至气相。产品中最终的水含量很低，通常约1％～4％。药物领域中通常采用冻干方法以延长药物产品的保质期。
发明内容
亲脂二肽酯衍生物在水性溶液中的溶解度通常较差。因此，必须使用有机溶剂例如DMA(二甲基乙酰胺)来溶解此类二肽。但有机溶剂通常有毒性，而且会破坏用于向对象(例如癌症患者)给予二肽的药物装置。因此，为了解决溶解问题以及在有机溶剂中提供细胞毒性二肽的问题，需要细胞毒性二肽的替代药物制剂，该制剂在生理上可接受的溶液中有足够的溶解度。
本发明涉及包含以下物质的冻干制剂：美法仑基(melphalanyl)-L-对氟苯丙氨酸乙酯，也称为美法仑氟灭酰胺(melphalan flufenamide)及其药学上可接受的盐，特别是盐酸美法仑基-L-对氟苯丙氨酸乙酯，也称为盐酸美法仑氟灭酰胺，或J1。
本发明的一方面涉及包含以下物质的冻干药物制剂：
(i)美法仑氟灭酰胺，或其药学上可接受的盐；以及
(ii)选自下组的至少一种赋形剂：聚山梨酯；聚乙二醇；β-环糊精；α-环糊精；羟丙基-β-环糊精；磺基丁基醚-β-环糊精；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；克列莫弗EL(Cremophor EL)；二甲亚砜；D-甘露醇；海藻糖；蔗糖和氨基酸。
本发明的另一方面是可溶于水性溶液的冻干药物制剂。
本发明的另一方面是本文所述冻干药物制剂的制备方法，其中：
a.将美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐溶于有机溶剂以获得美法仑氟灭酰胺溶液；
b.向该美法仑氟灭酰胺溶液中添加水以获得浓度约0.2～3.0mg/ml的水性美法仑氟灭酰胺溶液；
c.向该美法仑氟灭酰胺溶液中添加选自下组的至少一种赋形剂：聚山梨酯；聚乙二醇；β-环糊精；α-环糊精；羟丙基-β-环糊精；磺基丁基醚-β-环糊精；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；克列莫弗EL(Cremophor EL)；二甲亚砜；D-甘露醇；海藻糖；蔗糖和氨基酸；并且
d.将含有赋形剂的水性美法仑氟灭酰胺溶液进行冻干。
本发明的另一方面是含有第一容器和第二容器的部分试剂盒(kit of parts)，所述第一容器含有本文所限定的冻干药物制剂，所述第二容器含有生理上可接受的溶液。
本发明的另一方面是用作药物的本文所限定的冻干药物制剂。
本发明的另一方面是用作药物的本文所限定的部分试剂盒。
本发明的一方面是用于治疗和/或预防癌症的本文所述的冻干药物制剂，所述癌症为例如卵巢癌、肺癌、膀胱癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌和/或任何实体瘤或血液癌症。
本发明的另一方面是用于治疗和/或预防癌症的本文所述的部分试剂盒，所述癌症为例如卵巢癌、肺癌、膀胱癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌和/或任何实体瘤或血液癌症。
本发明的另一方面是治疗和/或预防癌症的方法，所述癌症为例如卵巢癌、肺癌、膀胱癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌和/或任何实体瘤或血液癌症，其中给予需要的对象治疗有效剂量的本文所述的冻干药物制剂。
除非另外定义，本文使用的所有技术和科学术语的意义与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同。虽然在本发明的实施或测试中可以采用类似于或等同于本文所述的那些方法和材料，但是下面描述了合适的方法和材料。本文中述及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用全文纳入本文。在抵触的情况下，以本说明书(包括定义在内)为准。此外，材料、方法和实施例都仅是说明性的，并不意在构成限制。
从下面的详述、附图和实施例以及权利要求很容易了解本发明的其他特征和优点。
附图说明
图1A-D包含四个重复的美法仑氟灭酰胺溶解速度测试图，该美法仑氟灭酰胺根据实施例2的方法A在不含赋形剂的条件下冻干。在所示时间点取出样品，通过HPLC测定溶解的美法仑氟灭酰胺的量。y轴表示美法仑氟灭酰胺的量(μg/mL)。
图2A-E包含美法仑氟灭酰胺溶解速度测试图，该美法仑氟灭酰胺根据实施例2的方法A在如图所示的赋形剂的存在下冻干。在所示时间点取出样品，通过HPLC测定溶解的美法仑氟灭酰胺的量。y轴表示美法仑氟灭酰胺的量(μg/mL)。
图3是美法仑氟灭酰胺的溶解速度测试图，该美法仑氟灭酰胺根据实施例2的方法B在不含赋形剂的条件下冻干。在所示时间点取出样品，通过HPLC测定溶解的美法仑氟灭酰胺的量。y轴表示美法仑氟灭酰胺的量(μg/mL)。
图4A-E包含美法仑氟灭酰胺溶解速度测试图，该美法仑氟灭酰胺根据方法B在如图所示的赋形剂的存在下冻干。在所示时间点取出样品，通过HPLC测定溶解的美法仑氟灭酰胺的量。y轴表示美法仑氟灭酰胺的量(μg/mL)。
图5包含以下溶解速度测试的图，A：在不含聚山梨酯80的条件下冻干的美法仑氟灭酰胺；B在10％聚山梨酯80的存在下冻干的美法仑氟灭酰胺；C在50％聚山梨酯80的存在下冻干的美法仑氟灭酰胺；D在100％聚山梨酯80的存在下冻干的美法仑氟灭酰胺.量与美法仑氟灭酰胺的量相关。y轴显示采用HPLC所测定的相对于内标的已溶解美法仑氟灭酰胺量。
图6是含有美法仑氟灭酰胺(J1)的玻璃管照片，该美法仑氟灭酰胺在冻干后以1mg/ml的浓度溶于含50％(mol)聚山梨酯80(左)和不含聚山梨酯80(右)的5％葡萄糖溶液中。
图7包含美法仑氟灭酰胺(L-美法仑基-L-对氟苯丙氨酸乙酯)、L-美法仑基-L-对氟苯丙氨酸异丙酯(JV28)、L-脯氨酰-L-美法仑基-L-对氟苯丙氨酸乙酯(J3)的结构式。
发明详述
非冻干的细胞毒性二肽或其药学上可接受的盐可能在水性溶液中溶解度较低，这就必须使用有机溶剂，例如DMA(二甲基乙酰胺)来溶解所述二肽或其药学上可接受的盐。因此，给予患者细胞毒性二肽时，首先将该物质溶于有机溶剂例如DMA，然后在给予患者前在溶液中稀释该物质以用于输注。患者通过该方法接触到有机溶剂，该接触对患者可能有害。同样地，所述有机溶剂可能损坏用于向患者(例如癌症患者)给予美法仑氟灭酰胺的医疗装置。
本发明人现已意外发现，在赋形剂的存在下冻干某些细胞毒性二肽或其药学上可接受的盐时，所得冻干药物制剂在生理上可接受的溶液中的溶解度甚至更高。事实上，所述溶解度非常高以至于细胞毒性二肽或其药学上可接受的盐在有机溶剂中的溶解步骤可省略，并且可将细胞毒性二肽直接溶于生理上可接受的水性溶液中并给予患者。优选地，所述细胞毒性二肽是美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐。
在以前的制备中，通过合成获得晶体形式的白色粉末美法仑氟灭酰胺。该晶体形式只能溶于强酸性水溶液中，这对于实际生产的目的而言是不可能的。同样在赋形剂的存在下也不能充分改进溶解度。因此，先前将美法仑氟灭酰胺替代性地溶于葡萄糖溶液中所含的DMA(二甲基乙酰胺)中。该制备是可行的但不稳定：7％降解/小时。此外，还出现二聚化并且溶液变成亮黄色。然而该制剂不可靠，且聚合速率以不可接受的方式变化。
因此，需要鉴别出可替代的方法以提供包含稳定性提高的可溶性美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐的制剂。另外，为避免给予患者的产品中所含有机溶剂(例如DMA)带来的负面问题，该制剂应该是水溶性的。
本发明的一方面是包含以下物质的冻干药物制剂：
(i)美法仑氟灭酰胺，或其药学上可接受的盐；以及
(ii)选自下组的至少一种赋形剂：聚山梨酯；聚乙二醇；β-环糊精；α-环糊精；羟丙基-β-环糊精；磺基丁基醚-β-环糊精；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；克列莫弗EL(Cremophor EL)；二甲亚砜；D-甘露醇；海藻糖；蔗糖；和氨基酸。
在本方面的一个实施方式中，所述赋形剂选自下组：聚山梨酯80；PEG 400；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；PEG 300；克列莫弗EL(Cremophor EL)；二甲亚砜；D-甘露醇；海藻糖；蔗糖；和组氨酸。
在本方面的另一个实施方式中，所述美法仑氟灭酰胺是盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)。
本发明的另一个方面提供了一种包含以下物质的药物制剂：
(i)盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)；以及
(ii)选自下组的至少一种赋形剂：聚山梨酯；聚乙二醇；β-环糊精；α-环糊精；羟丙基-β-环糊精；磺基丁基醚-β-环糊精；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；克列莫弗EL(Cremophor EL)；二甲亚砜；D-甘露醇；海藻糖；蔗糖；和氨基酸。
本方面的一个实施方式中，所述至少一种赋形剂是聚山梨酯或聚乙二醇。
本方面另一个实施方式中，所述至少一种赋形剂是聚山梨酯80。
本方面另一个实施方式中，所述至少一种赋形剂具有表面活性剂特性。该特性会提高冻干药物制剂的稳定性。所述至少一种具有表面活性剂特性的赋形剂可以是聚山梨酯或聚乙二酯，例如聚山梨酯80或PEG 400。
本方面另一个实施方式中，该制剂包含盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)和赋形剂聚山梨酯80。赋形剂聚山梨酯80的存在会提高冻干药物制剂的稳定性。而且最终的制剂会不含或基本不含有机溶剂，因此具有更少的毒性。
本发明提供一种在干燥形式下稳定且在有机溶剂不存在的情况下可溶于水性溶液的冻干制剂。虽然之前能制备单独的美法仑氟灭酰胺冻干制剂，但相比降解时间这种制剂在水性溶液中的溶解太慢。在冻干美法仑氟灭酰胺制剂中引入赋形剂(通过原先在有机溶剂中的溶液)显著改进了重建时间，但没有明显改变重建美法仑氟灭酰胺的稳定性。因此，重建的美法仑氟灭酰胺的时间窗得到扩宽，而且这样改进了对患者的治疗，例如在需要时能降低输注速率。“不存在有机溶剂”的制剂可包含痕量的有机溶剂，一般少于0.5％(w/w)。
相比可以是略黄色紧密粉末形式的非冻干美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐，本文所述的美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐的冻干药物制剂是一种白色蓬松粉末。
冻干通常包括四个步骤，预处理、冷冻、初次干燥和二次干燥。在预处理步骤中，制备待冻干的物质以备于冻干，例如通过制备具有所需浓度的溶液或将该物质与其它组分混合以获得可接受的结果。冷冻步骤可在通过例如机械制冷、干冰和甲醇或液氮冷却的冷浴中在冷冻干燥瓶中进行。冷冻干燥器可用于更大规模的冻干。通常冷冻温度在-50℃至-80℃之间。
在初次干燥步骤中，将压力降到几毫巴的范围中，然后施加热量以使水分从该物质中升华。必需的热量可用升华分子的升华潜热计算。该阶段持续的时间依情况而定，但可持续数日以保护物质结构。
最后的二次干燥步骤的目的是去除任何未冷冻的水分子。该阶段中，温度可超过0℃以破坏水分子和冷冻材料间形成的任何理化相互作用。
在本发明内容中，应理解美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐是冻干的。因此，术语“美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐的冻干药物制剂”应理解为表示美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐是冻干的。
本发明另一方面提供冻干的美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐、包含该美法仑氟灭酰胺的部分试剂盒、制备该美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐的方法，包含该冻干的美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐的组合物及其应用。
本文中“冻干”、“冻干的”等可与“冷冻干燥”、“冷冻干燥的”等互换使用。
根据文中所述可冻干的细胞毒性二肽的示例描述在WO01/96367中。分子N末端应优选不作为酰胺或氨基甲酸酯保护。这表示本文式I中的R4应优选不是保护基团，例如甲酰基、乙酰基或丙酰基、或苯甲酰基，因为化合物保护形式的细胞毒性活性比相应的游离形式低。天然氨基酸是指通常存在于活有机体中并在其中发挥作用的氨基酸。修饰的氨基酸指以某种方式被修饰成与天然氨基酸不同的化学结构和化学组成的氨基酸。天然环氨基酸的示例是脯氨酸。芳族氨基酸的示例是苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸。
该细胞毒性二肽，例如美法仑氟灭酰胺，也可在其一个或多个原子上含有非天然比例的原子同位素。例如，可用放射性同位素，例如氚(3H)、氘(2H)、碘-125(125I)或碳-14(14C)对该化合物进行放射性标记。
该细胞毒性二肽美法仑氟灭酰胺与美法仑有显著的区别：
■结构的区别(美法仑氟灭酰胺在C末端是乙酯，其取代了美法仑中的羧酸。因此美法仑是两性分子，而美法仑氟灭酰胺不是)。
■大小区别(美法仑氟灭酰胺是二肽，即约为美法仑的两倍大小)。
■亲脂性的区别，其中美法仑氟灭酰胺明显更亲脂。
■在水性溶液中稳定性的区别。美法仑在水性溶液中的稳定性是J1的10000倍。J1在水中快速水解。
■降解途径的区别。美法仑氟灭酰胺的主要降解途径涉及乙酯的水解，而美法仑的主要降解涉及(氯)烷基的反应。
基于但不限于上述区别，很明显关于美法仑及(特别是)其制备和制剂的教导不能应用于美法仑氟灭酰胺及其制备和制剂中。
包含至少一种赋形剂(例如具有表面活性剂活性的聚山梨酯80)提供了具有以下性质的冻干制剂：同样稳定，并且在不存在有机溶剂的情况下具有与降解速率可比的充足的水溶速率，从而有助于治疗而且毒性低。
根据本发明的冻干药物制剂可仅含有美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐，或含有美法仑氟灭酰胺和一种或更多种不同细胞毒性二肽或其药学上可接受的盐的混合物。另外，冻干药物制剂可含有两种或更多种不同药学上可接受的盐的混合物。
本发明的一方面是包含以下物质的冻干药物制剂：
(i)美法仑氟灭酰胺；以及
选自下组的两种或更多种赋形剂的组合：聚山梨酯；聚乙二醇；β-环糊精；α-环糊精；羟丙基-β-环糊精；磺基丁基醚-β-环糊精；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；克列莫弗EL(Cremophor EL)；二甲亚砜；D-甘露醇；海藻糖；蔗糖；和氨基酸。
本发明的另一方面是包含以下物质的冻干药物制剂：
(i)盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)；以及
(ii)选自下组的两种或更多种赋形剂的组合：聚山梨酯；聚乙二醇；β-环糊精；α-环糊精；羟丙基-β-环糊精；磺基丁基醚-β-环糊精；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；克列莫弗EL；二甲亚砜；D-甘露醇；海藻糖；蔗糖；和氨基酸。
在本方面的一个实施方式中，所述赋形剂的组合是聚山梨酯80和PEG400的混合物。
本发明所有方面的药学上可接受的盐可以是，例如，呈足够碱性的本文所述化合物的酸加成盐，例如，与无机酸或有机酸的酸加成盐，所述无机酸或有机酸例如盐酸、氢溴酸、硝酸、甲磺酸、硫酸、磷酸、三氟乙酸、对甲苯磺酸、2-(2,4,6-三甲苯基(mesitylen))磺酸、柠檬酸、乙酸、酒石酸、富马酸、乳酸、琥珀酸、苹果酸、丙二酸、马来酸、1,2-乙二磺酸(1,2-ethanedisulphonic)、己二酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、乙磺酸或烟酸。
本文中，当使用术语“美法仑氟灭酰胺”时，也旨在包括其药学上可接受的盐，即使没有明确指明。
如上文所述，将美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐在药学上可接受的赋形剂的存在下冻干时，冻干药物制剂的溶解度可得到出乎意料地提高，这使冻干的美法仑氟灭酰胺可直接溶解于水性溶液，例如生理上可接受的溶液，所述赋形剂例如选自下组的任何一种：聚山梨酯；聚乙二醇；β-环糊精；α-环糊精；羟丙基-β-环糊精；磺基丁基醚-β-环糊精；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；克列莫弗EL；二甲亚砜；D-甘露醇；海藻糖；蔗糖；和氨基酸。这与非冻干的美法仑氟灭酰胺不同，非冻干的美法仑氟灭酰胺不能直接溶解于水性溶液，而是必须先在有机溶剂中溶解随后在水性溶液中稀释。因此本文提供了包含美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐的冻干药物制剂，其中美法仑氟灭酰胺在赋形剂的存在下冻干。优选地，所述赋形剂选自聚山梨酯或聚乙二醇，例如聚山梨酯80或PEG400。
美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐可在一种或更多种赋形剂(例如，1、2、3、4、5或更多种赋形剂)的存在下冻干。根据本文所述可使用的赋形剂的示例包括但不限于：聚山梨酯例如聚山梨酯20、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯80；聚乙二醇例如PEG 400和PEG 300；β-环糊精、α-环糊精、磺基丁基醚-β-环糊精、羟丙基-β-环糊精、乳糖、苯甲醇、琥珀酸二钠、丙二醇、克列莫弗EL、二甲亚砜、D-甘露糖、海藻糖、蔗糖和氨基酸例如组氨酸。
在本发明的一方面中，赋形剂为选自下列物质中的任何一种：聚山梨酯80；PEG400；β-环糊精；α-环糊精；磺基丁基醚-β-环糊精；羟丙基-β-环糊精；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；PEG 300；克列莫弗EL；二甲亚砜；D-甘露醇；海藻糖；蔗糖；和组氨酸。
在本发明的一方面中，所述赋形剂选自：聚山梨酯80；PEG 400；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；PEG 300；克列莫弗EL；二甲亚砜；D-甘露醇；海藻糖；蔗糖；和组氨酸，或两种或更多种所述赋形剂的组合。
本发明的一个实施方式中，赋形剂选自聚山梨酯80和PEG 400，或所述两种赋形剂的组合。
赋形剂，例如聚山梨酯80、PEG 400或β-环糊精，的量通常约为10～100重量％，以美法仑氟灭酰胺的量计，例如以美法仑氟灭酰胺的量计，100、90、80、70、60、50、40、30、20或10重量％。
本发明的另一方面中，赋形剂，例如聚山梨酯80、PEG 400或β-环糊精的量通常约为10～50重量％，以美法仑氟灭酰胺的量计，例如以美法仑氟灭酰胺的量计，100、90、80、70、60、50、40、30、20或10重量％。
本方面的另一实施方式中，赋形剂代表聚山梨酯80或PEG 40，其量通常约为10～50重量％，以美法仑氟灭酰胺的量计，例如以美法仑氟灭酰胺的量计，100、90、80、70、60、50、40、30、20或10重量％。
本发明的另一方面是包含以下物质的冻干药物制剂：
(i)美法仑氟灭酰胺，或其药学上可接受的盐；以及
(ii)选自下组的至少一种赋形剂：聚山梨酯80；PEG 400；β-环糊精；α-环糊精；羟丙基-β-环糊精；磺基丁基醚-β-环糊精；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；PEG 300；克列莫弗EL；二甲亚砜；D-甘露醇；海藻糖；蔗糖；和组氨酸；
其中赋形剂的量约为美法仑氟灭酰胺重量的10～100％。
本方面的一个实施方式中，所述至少一种赋形剂选自聚山梨酯80和PEG400。
在本方面的另一实施方式中，美法仑氟灭酰胺由盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)表示。
本发明的另一方面是包含以下物质的冻干药物制剂：
(i)美法仑氟灭酰胺，或其药学上可接受的盐；以及
(ii)选自下组的至少一种赋形剂：聚山梨酯80；PEG 400；β-环糊精；α-环糊精；羟丙基-β-环糊精；磺基丁基醚-β-环糊精；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；PEG 300；克列莫弗EL；二甲亚砜；D-甘露醇；海藻糖；蔗糖；和组氨酸；
其中赋形剂的量约为盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)重量的10～50％。
本方面的一个实施方式中，所述至少一种赋形剂选自聚山梨酯80和PEG400。
在本方面的另一实施方式中，美法仑氟灭酰胺由盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)表示。
本发明的另一方面是包含以下物质的冻干药物制剂：
(i)盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)；以及
(ii)选自下组的至少一种赋形剂：聚山梨酯80；PEG 400；β-环糊精；α-环糊精；羟丙基-β-环糊精；磺基丁基醚-β-环糊精；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；PEG 300；克列莫弗EL；二甲亚砜；D-甘露醇；海藻糖；蔗糖；和组氨酸；
其中赋形剂的量约为盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)重量的10～100％。
本方面的一个实施方式中，所述至少一种赋形剂选自聚山梨80和PEG 400。
本发明的另一方面是包含以下物质的冻干药物制剂：
(i)盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)；以及
(ii)选自下组的至少一种赋形剂：聚山梨酯80；PEG 400；β-环糊精；α-环糊精；羟丙基-β-环糊精；磺基丁基醚-β-环糊精；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；PEG 300；克列莫弗EL；二甲亚砜；D-甘露醇；海藻糖；蔗糖；和组氨酸；
其中赋形剂的量约为盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)重量的10～50％。
本方面的一个实施方式中，所述至少一种赋形剂选自聚山梨酯80和PEG400。
本发明的一个实施方式中，赋形剂，例如聚山梨酯80和PEG 400，的量可最高至临床可接受的量。
本发明的一个实施方式中，赋形剂，例如聚山梨酯80和PEG 400，的量可最高至临床可接受的量。
当用作唯一的赋形剂时，聚山梨酯80和PEG 400的量，约为例如50重量％，以盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)的量计。
本发明的一方面是赋形剂聚山梨酯80和PEG 400的组合。
本发明的一方面是赋形剂聚山梨酯80、PEG 400和β-环糊精的组合，例如80重量％的聚山梨酯80、80重量％的PEG 400和50重量％的β-环糊精，以美法仑氟灭酰胺的量计。
美法仑衍生物或其药学上可接受的盐的冻干药物制剂可根据本发明包含一种或更多种美法仑衍生物或其药学上可接受的盐，以及一种或更多种本文所限定的赋形剂。
如上文所述，冻干过程中存在赋形剂的一个作用是：相对于在不存在本文所述赋形剂的情况下冻干美法仑氟灭酰胺，所得含有法仑氟灭酰胺的冻干药物制剂在水性溶液(例如生理上可接受的溶液)中的溶解度得到提高。具体地，美法仑氟灭酰胺在赋形剂存在的条件下冻干时，其在水性溶液中的溶解度比非冻干产品的溶解度高。相对于非冻干产品，美法仑氟灭酰胺，特别是在本文所述赋形剂存在的条件下冻干时，其所提高的溶解度在给予患者美法仑氟灭酰胺时具有显著益处。
由于非冻干美法仑氟灭酰胺在用于向患者给予药物的生理上可接受的水性溶液中的溶解度很低，必须先将非冻干美法仑氟灭酰胺溶解在有机溶剂，例如DMA中。因此，美法仑氟灭酰胺通常溶解在DMA中储存。以前美法仑氟灭酰胺不可能直接溶解在水性溶液中，而是必须使用有机溶剂。一旦溶解在有机溶剂中，美法仑氟灭酰胺溶液和有机溶剂的该溶液可溶解在用于向对象给药的生理上可接受的溶液中。
美法仑氟灭酰胺有很大的毒性，为了最小化医疗人员对该类药物的接触，在溶于有机溶剂后使用特殊装置将该药物转移至给药的溶液中。这些转移装置通常是包含聚碳酸酯的塑料管。但这类管子对有机溶剂，例如DMA敏感，而且可能受其损坏。因此，在待给予的药物溶解在这种有机溶剂的情况下不太可能使用该转移装置，而是替代性地在即将向患者给药时直接将所溶解药物添加到用于给药的生理上可接受的溶液中，这样会对医疗人员有害，他们将面临接触到毒性药物的风险。
如上所述，美法仑氟灭酰胺的冻干提高了其在生理上可接受溶液中的溶解度。当美法仑氟灭酰胺在一种或更多种赋形剂存在的条件下冻干时，这种提高甚至更加明显。如本文所述，当美法仑氟灭酰胺在本文所述的赋形剂存在的条件下冻干时，美法仑氟灭酰胺的溶解度比非冻干的美法仑氟灭酰胺高。可避免先用有机溶剂，例如DMA来溶解美法仑氟灭酰胺。
在至少一种赋形剂存在下冻干的美法仑氟灭酰胺可直接溶解在生理上可接受的溶液中，例如约4.5～5.5wt％(例如约5％)的葡萄糖溶液或水性NaCl溶液(例如约0.9wt％的NaCl)，所述赋形剂为例如聚山梨酯，例如可以是聚山梨酯80；聚乙二醇，例如可以是PEG400或PEG 300；β-环糊精；α-环糊精；羟丙基-β-环糊精；磺基丁基醚-β-环糊精；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；克列莫弗EL；二甲亚砜；D-甘露醇；海藻糖；蔗糖；或氨基酸，如组氨酸；或两种或更多种所述赋形剂的组合。
因此，能够使用包含聚碳酸酯并用于给予美法仑氟灭酰胺的装置，使医疗人员接触该药物的风险降到最低。而且，这种方法可避免给予患者有毒的DMA。这就能直接制备含有适于向患者给药的浓度的美法仑氟灭酰胺的溶液。另外，可先制备包含了溶解在生理上可接受溶液中的美法仑氟灭酰胺冻干药物制剂的浓缩溶液，然后使用常规的转移装置将其转移到袋子中以用于输注。
而且，美法仑氟灭酰胺溶解在DMA中时，会形成美法仑氟灭酰胺和DMA的加合物。通过使用根据本发明提供的冻干药物制剂，能将冻干的美法仑氟灭酰胺直接溶解在生理上可接受的溶液中，避免了先将美法仑氟灭酰胺溶解在DMA中。因此，可避免形成DMA-美法仑氟灭酰胺加合物，而且不再不得不给予患者该加合物或DMA。
还提供了包含本文所述美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐的冻干药物制剂的药物组合物，所述冻干药物制剂任选地通过本文所述的制备该冻干制剂的方法获得。该药物组合物还可包含生理上可接受的溶液，例如水性NaCl(例如约0.9wt％)或葡萄糖溶液(例如约4.5-5.5wt％葡萄糖，如约5wt％葡萄糖)。该药物组合物可以是给予对象前用来稀释的浓缩溶液，或是能直接给予患者的溶液。
由于在一种或更多种本文所述的赋形剂存在下冻干后的美法仑氟灭酰胺的溶解度提高，能够制备溶解的美法仑氟灭酰胺溶液，例如包含美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐的药物组合物，该溶液基本不含有机溶剂，例如DMA、二氯甲烷、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、丙酮、二甲基甲酰胺、乙腈、二甲亚砜、二噁烷、二乙醚、乙酸、正丁醇、异丙醇、正丙醇、叔丁醇、仲丁醇、甲醇、乙醇和乙酸。本文中的“基本不含”指药物组合物只含痕量的有机溶剂，例如少于约总共约0.1wt％的有机溶剂。一方面，冻干制剂或其药物组合物不含任何可测定量的有机溶剂。这类制剂毒性更低，因此患者对其更耐受，即在输注时出现更少的副作用例如呕吐、恶心或其它常见症状。
本发明的一方面提供了如本文所述不含或基本不含有机溶剂的冻干药物制剂。
该药物组合物可由本文所述的冻干药物制剂组成，该制剂包含美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐，以及生理上可接受的溶液，例如葡萄糖溶液。如上文所述，美法仑衍生物可以是美法仑氟灭酰胺或可共同冻干或单独冻干的美法仑氟灭酰胺和一种或更多种不同细胞毒性二肽的混合物。
药物组合物可通过将美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐溶解在生理上可接受的溶液中获得。因此，本文还提供了制备该药物组合物的方法，该方法包括将包含美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐的冻干药物制剂溶解在生理上可接受的溶液中的步骤。
本文所定义的用语“生理上可接受的溶液”是一种水性溶液，例如NaCl溶液(例如约0.9wt％NaCl)或葡萄糖溶液，例如约4.5-5.5wt％葡萄糖，如约5wt％，或其它生理上可接受的溶液。可任选缓冲任何此类溶液。
包含冻干美法仑氟灭酰胺和生理上可接受的溶液、用于直接给予对象的药物组合物通常包含浓度约为1mg/ml或更低，例如约0.2mg/ml的美法仑氟灭酰胺。然而，该药物组合物可包含浓度高至约4mg/ml的美法仑氟灭酰胺，以在给予患者前稀释于生理上可接受的溶液中。
本发明的一方面提供一种制备冻干药物制剂的方法，其中：
a)将美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐溶于有机溶剂以获得美法仑氟灭酰胺溶液；
b)向美法仑氟灭酰胺溶液中添加水以获得浓度约0.2～3.0mg/ml的水性美法仑氟灭酰胺溶液；
c)向美法仑氟灭酰胺溶液中添加选自下组的至少一种赋形剂：聚山梨酯；聚乙二醇；β-环糊精；α-环糊精；羟丙基-β-环糊精；磺基丁基醚-β-环糊精；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；克列莫弗EL(Cremophor EL)；二甲亚砜；D-甘露醇；海藻糖；葡萄糖和氨基酸；并且
d)对含有赋形剂的水性美法仑氟灭酰胺溶液进行冻干。
本方面的一个实施方式提供一种方法，其中：
a)将美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐溶于有机溶剂；
b)向步骤a)中所得的溶液中添加水以获得浓度约0.2～3.0mg/ml的所述美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐的溶液；
c)向步骤b)中所得的溶液中添加选自下组的至少一种赋形剂：聚山梨酯；聚乙二醇；β-环糊精；α-环糊精；羟丙基-β-环糊精；磺基丁基醚-β-环糊精；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；克列莫弗EL；二甲亚砜；D-甘露醇；海藻糖；蔗糖和氨基酸；并且
d)对步骤c)所得的溶液进行冻干。
该有机溶剂可为选自以下物质中的任何一种：乙醇、含酸乙醇、丙三醇、丙二醇、苯甲醇、二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯酮、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、甲基叔丁基醚、丙二醇、二甲亚砜、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、丙酮、二甲基甲酰胺、乙腈、二噁烷、乙酸、乳酸、丙酸、正丁醇、异丙醇、正丙醇、叔丁醇、仲丁醇、甲醇、以及乙醇和水的混合物。优选地，所述有机溶剂是乙醇。
该赋形剂可选自下组：聚山梨酯80；PEG 400；β-环糊精；α-环糊精；羟丙基-β-环糊精；磺基丁基醚-β-环糊精；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；PEG 300；克列莫弗EL；二甲亚砜；D-甘露醇；海藻糖；蔗糖；和组氨酸。优选地，所述赋形剂选自聚山梨酯80和PEG 400。
所述方法中的美法仑氟灭酰胺优选为盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)。
本发明的一方面是一种制备本文所述冻干药物制剂的方法，其中：
a)将美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐溶于有机溶剂；
b)向步骤a)中所得的溶液中添加水以获得浓度约0.2～3.0mg/ml的所述美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐的溶液；
c)向步骤b)所得的溶液中加入至少一种本文所定义的赋形剂；并且
d)对步骤c)所得的溶液进行冻干。
优选地，所述有机溶剂是乙醇。
本发明的一方面是一种制备本文所述冻干药物制剂的方法，其中：
a)将盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)溶于有机溶剂；
b)向步骤a)所得的溶液中添加水以获得浓度约0.2～3.0mg/ml的所述盐酸美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐的溶液；
c)向步骤b)所得的溶液中加入至少一种本文所定义的赋形剂；并且
d)对步骤c)所得的溶液进行冻干。
步骤a)中用于溶解美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐的有机溶剂示例可以是选自下组的任何一种：乙醇、含酸乙醇、丙三醇、丙二醇、苯甲醇、二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯酮、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、甲基叔丁基醚、丙二醇、二甲亚砜、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、丙酮、二甲基甲酰胺、乙腈、二噁烷、乙酸、乳酸、丙酸、正丁醇、异丙醇、正丙醇、叔丁醇、仲丁醇、甲醇、以及乙醇和水的混合物。
本发明的一方面是一种制备本文所述冻干药物制剂的方法，其中：
a)将美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐溶于选自以下的任何一种有机溶剂：乙醇、含酸乙醇、丙三醇、丙二醇、苯甲醇、二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯酮、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、甲基叔丁基醚、丙二醇、二甲亚砜、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、丙酮、二甲基甲酰胺、乙腈、二噁烷、乙酸、乳酸、丙酸、正丁醇、异丙醇、正丙醇、叔丁醇、仲丁醇、甲醇、以及乙醇和水的混合物；
b)向步骤a)中所得的溶液中添加水以获得浓度约0.2～3.0mg/ml的所述美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐的溶液；
c)向步骤b)所得的溶液中加入至少一种本文所定义的赋形剂；并且
d)对步骤c)所得的溶液进行冻干。
本发明的一方面是一种制备本文所述冻干药物制剂的方法，其中：
a)将盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)溶于选自以下的任何一种有机溶剂：乙醇、含酸乙醇、丙三醇、丙二醇、苯甲醇、二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯酮、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、甲基叔丁基醚、丙二醇、二甲亚砜、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、丙酮、二甲基甲酰胺、乙腈、二噁烷、乙酸、乳酸、丙酸、正丁醇、异丙醇、正丙醇、叔丁醇、仲丁醇、甲醇、以及乙醇和水的混合物；
b)向步骤a)所得的溶液中添加水以获得浓度约0.2～3.0mg/ml的所述盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)或其药学上可接受的盐的溶液；
c)向步骤b)所得的溶液中加入至少一种本文所定义的赋形剂；并且
d)对步骤c)所得的溶液进行冻干。
本发明的一方面是一种制备本文所述冻干药物制剂的方法，其中：
a)将盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)溶于有机溶剂；
b)向步骤a)中所得的溶液中添加水以获得浓度约0.2～3.0mg/ml的所述盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)的溶液；
c)向步骤b)所得的溶液中加入至少一种本文所定义的赋形剂；并且
d)对步骤c)所得的溶液进行冻干。
其中，所述至少一种赋形剂选自聚山梨酯80和PEG 400。
上述方法中的步骤a)中使用含酸乙醇来溶解美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐时，所述酸可以是HCl，其在乙醇中的浓度为例如5～20mM，或者HCl浓度可以例如为10mM。
美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐溶于乙醇和水中时，乙醇浓度可约为10～100体积％，例如10～90体积％、50～90体积％或70体积％。
用于溶解和/或稀释本发明所述冻干药物制剂样品的水可以是无菌的或纯化水，或注射用水(WFI)。
使用乙醇来溶解美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐时，在步骤b)中稀释步骤a)所得的溶液以使乙醇浓度按体积计约为2％～100％，例如约2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或100％，或例如5～15％，或例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15％。通常稀释步骤b)后得到的乙醇浓度约为9％。
步骤b)得到的溶液可以在冻干步骤c)前进行无菌过滤。
冻干步骤c)包括本文所述的一般冷冻以及初次和二次干燥步骤。如何进行冻干的信息可参见例如Rey,L.和May,J.Freeze Drying/Lyophilization of Pharmaceuticaland Biological Products(“药物和生物制品的冷冻干燥/冻干”)(2010),ISBN 978-1439B2575-4。冷冻步骤中，该样品例如在干冰-丙酮浴中以约-70℃至-90℃的温度，例如约-70℃、-75℃、-78℃、-80℃、-82℃、-85℃、-88℃或-90℃的温度冷冻例如10～120分钟。
或者，该样品可在冷冻器中以约-14℃至-25℃的温度，例如-14℃、-16℃、-18℃、-20℃、-22℃或-25℃的温度冷冻例如10分钟～24小时。也可以在液氮中冷冻样品。
可采用冻干的常规技术进行步骤c)，参见例如Rey,L.和May,J.Freeze Drying/Lyophilization of Pharmaceutical and Biological Products(“药物或生物制品的冷冻干燥/冻干”)(2010),ISBN 978-1439B2575-4。
例如，在初次干燥步骤中，可将压力降至约0.1毫巴～50毫巴，例如1毫巴～10毫巴。温度通常低于0℃，例如-50至0℃，或-20至-1℃，例如-50、-40、-30、-20、-10或-5℃。该阶段可例如持续4～48小时，如12～24小时。
在最终的二次干燥步骤中，大部分水已经蒸发时，温度可与初次干燥步骤相同或高于0℃。
当要在冻干期间存在一种或更多种本文所定义的赋形剂时，可在稀释步骤a)所得的溶液之前或之后且在进行冻干之前将其加到步骤b)中。赋形剂可以粉末形式添加，但通常以水性溶液形式添加。因此，赋形剂可在冻干期间存在。
本发明还涉及通过上述方法所得的本发明所定义的冻干药物制剂。
本文还提供包含以下物质的部分试剂盒：
(i)包含本文所述含有美法仑氟灭酰胺的冻干药物制剂的第一容器；以及
(ii)含有生理上可接受溶液的第二容器，例如NaCl溶液(例如约0.9wt％NaCl)或葡萄糖溶液，例如约4.5-5.5wt％葡萄糖溶液，如约5wt％葡萄糖溶液，或其它生理上可接受的溶液。
该试剂盒也可包含用于互相混合所述两个容器中内含物的装置，和/或用于将所得混合物转移至某一装置(例如含有葡萄糖溶液的袋子)的装置，以用来向患者给药。
该试剂盒可由含有本文所述美法仑氟灭酰胺的冻干药物制剂的第一容器和含有生理上可接受溶液的第二容器组成。该试剂盒中的美法仑氟灭酰胺也可为与生理上可接受的载体和/或赋形剂的混合物。一个示例是含有例如1％白蛋白或其他蛋白质或化合物的5％葡萄糖。生理上可接受的溶液的量可以是少量从而制备包含美法仑氟灭酰胺的冻干药物制剂的浓缩溶液，或者较大量从而能制备具有给予患者所需浓度的溶液。或者，该试剂盒可包含两个容器，一个含有用于制备冻干药物制剂浓缩溶液的生理上可接受的溶液，另一个是第二容器，例如用于输注的袋子，该容器包含更大量的生理上可接受的溶液以制备用于给予对象的更稀释的溶液。
本文所提供的冻干药物制剂、药物组合物或试剂盒可只含有作为抗肿瘤剂的美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐。然而，美法仑氟灭酰胺也可与一种或更多种抗肿瘤剂联用，例如其它抗肿瘤物质，如吉西他滨、依托泊甙、多柔比星或紫杉烷或其它治疗上有效的物质。与其它抗肿瘤剂联用时，这些物质可在冻干前与美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐混合，从而与美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐一起冻干，或者在冻干后，例如在试剂盒或药物组合物中，与美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐组合。在美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐冻干后，冻干美法仑氟灭酰胺也可与一种或更多种虽然未经冻干但呈干燥形式的抗肿瘤物质混合。
本文所提供的美法仑氟灭酰胺具有细胞毒性活性，因此可用于预防和/或治疗他处所描述的癌症(参见例如WO 01/96367)。WO 01/96367证实，对于不同的血液癌症和/或实体瘤，例如肺癌、骨髓瘤、淋巴癌、白血病、乳腺癌和卵巢癌而言，这些化合物降低了肿瘤细胞的存活。另外，WO 01/96367证实这些化合物避免了美法仑耐受性。因此，这些化合物可用于预防和/或治疗癌症、减少肿瘤生长和/或杀死肿瘤细胞。由此，该化合物可用于治愈和/或延长癌症疾病患者的存活。
本文还提供了用作药物的、本文所公开的以及所要求保护的冻干药物制剂、试剂盒或药物组合物。本发明还涉及用于治疗和/或预防癌症的此种冻干药物制剂、试剂盒或药物组合物，所述癌症为例如卵巢癌、肺癌、膀胱癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌和/或任何其它实体瘤或血液癌症。
本发明的一方面是本文所公开的以及所要求保护的冻干药物制剂、试剂盒或药物组合物在制备用于治疗和/或预防癌症的药物中的应用，所述癌症为例如卵巢癌、肺癌、膀胱癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌和/或任何其它实体瘤或血液癌症。
本发明的另一方面提供了一种包含盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)与另一种有助于治疗癌症的药物的冻干药物制剂、试剂盒或药物组合物，其用于治疗和/或预防癌症，例如卵巢癌、肺癌、膀胱癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌和/或任何其它实体瘤或血液癌症。
本发明的另一方面是一种治疗和/或预防癌症例如卵巢癌、肺癌、膀胱癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌和/或任何其它实体瘤或血液癌症的方法。本方法包括给予需要的对象治疗有效剂量的本文所提供的冻干药物制剂、试剂盒或药物组合物。该对象通常是人或家养动物。
本发明的另一方面是一种治疗和/或预防癌症的方法，所述癌症为例如卵巢癌、肺癌、膀胱癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌和/或任何其它实体瘤或血液癌症，其中包含盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)的冻干药物制剂、试剂盒或药物组合物与有助于治疗癌症的另一种药物联用，以治疗有效剂量提供给需要的对象。该对象通常是人或家养动物。
可通过静脉内注射给予需要的对象冻干药物制剂、试剂盒或药物组合物。也可以在体腔内给予冻干美法仑氟灭酰胺或包含该冻干美法仑氟灭酰胺的药物制剂，例如向膀胱，或腹膜或胸膜腔内灌注。
美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐的给予量可约为每次给予总量为20～130mg的美法仑氟灭酰胺，例如每次给予总量为30～75mg的美法仑氟灭酰胺，如每次给予总量为50mg美法仑氟灭酰胺。因此，本文所提供的含有美法仑氟灭酰胺的药物组合物或试剂盒可含有一定量的冻干美法仑氟灭酰胺，从而可给予该量。
冻干美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐可每天、每两天或三天、每周、每两周、三周或四周或甚至以高单次剂量(例如在移植前)给予，这取决于待治疗的癌症形式以及对象。
本文所用的用语“预防”旨在包括在如下患者中的治疗：该患者已经过针对本文所述任何癌症形式的化疗，并在以防止所述癌症发生转移为目的继续进行治疗。
本方面的另一方面提供了美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐的冻干制剂中的赋形剂在减少该美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐的冻干制剂在水性溶剂中重建时的重建时间中的应用，所述赋形剂选自下组：聚山梨酯80；PEG 400；β-环糊精；α-环糊精；磺基丁基醚-β-环糊精；羟丙基-β-环糊精；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；PEG 300；克列莫弗EL；二甲亚砜；D-甘露醇；海藻糖；蔗糖；和组氨酸。
所述美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐优选盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)。
所述赋形剂优选选自聚山梨酯80和PEG 400。
所述美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐优选溶于乙醇，然后再使所述美法仑氟灭酰胺与所述赋形剂接触。
本文中“冻干”、“冷冻干燥”、“冻干的”、“冷冻干燥的”等可互换使用。
聚山梨酯80(化学名为聚氧乙烯20失水山梨糖醇单油酸酯，CAS注册号为9005-65-6)可从例如伏路卡公司(Fluka)或西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)市售获得。
PEG 40的经验式为HOCH2(CH2OCH2)mCH2OH，其中m是8.7，平均分子量为380～420，可从例如伏路卡公司(Fluka)或西格玛-艾尔德里奇公司(Sigma-Aldrich)市售获得。
PEG 300的经验式为HOCH2(CH2OCH2)mCH2OH，其中m是6.4，平均分子量为283～315，可从例如伏路卡公司或西格玛-艾尔德里奇公司市售获得。
是西格玛-艾尔德里奇公司公司销售的商标，是CAS注册号为61791-12-6的聚氧乙烯蓖麻油。
根据本文所述可用的示例性细胞毒性二肽也公开在WO01/96367中并具有式V
其中，
R1是烷氧基、环烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基、NH2、烷基氨基、环烷基氨基或芳基氨基；
R3是NH2、OH、O-烷基、N-烷基、O-酰基、NH-酰基、N(CH2CH2Cl)2、NO2、F、CF3或H；并且
R4是天然或修饰的环氨基酸或芳族氨基酸，或H；以及其药学上可接受的盐。
而且，可根据本文使用的细胞毒性肽包括式I或V的肽，其中R3是F。二肽是式I或V的肽的示例，其中R1是烷氧基；R3是F、CF3、H、OH、O-烷基、NO2、N(CH2CH2Cl)2、NH-芳基或NH2；R4是H。
三肽是式I或V的肽的示例，其中R1是烷氧基；R3是F、CF3、H、OH、O-烷基、NH-酰基、NO2、N(CH2CH2Cl)2或NH2；R4是天然或修饰的环氨基酸或芳族氨基酸。
美法仑氟灭酰胺或其药学上可接受的盐可根据WO 01/96367所公开的内容制备，其内容通过引用纳入本文。WO 01/96367的实施例1公开了美法仑氟灭酰胺(L-美法仑基-L-对氟苯丙氨酸乙酯)及其盐酸盐――盐酸美法仑氟灭酰胺J1(L-美法仑基-L-对氟苯丙氨酸乙酯，化合物J1)的合成方法，其内容通过引用纳入本文。
WO01/96367所述的二肽衍生物可根据其文中所述从叔丁氧基羰基(Boc)保护的美法仑合成，并可根据本文所述冻干并使用。WO01/96367还公开了三肽衍生物的制备，其中通过使用EDC/NMM/HOBt(EDC是三乙胺或1-[3-二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，NMM是N-甲基吗啉，HOBt是1-羟基苯并三唑)作为偶联剂，将Boc保护的氨基酸与含有二肽衍生物的美法仑偶联。该三肽衍生物可根据本文所述冻干并使用。
可根据本文所有方面所述冻干且使用的美法仑衍生物的示例包括但不限于：美法仑氟灭酰胺、L-美法仑基-L-对氟苯丙氨酸异丙酯(JV28)、L-脯氨酰基-L-美法仑基-L-对氟苯丙氨酸乙酯(J3)(图7)及其药学上可接受的盐。这些化合物之前公开在WO01/96367中，该文献也提供了它们的制备方法。美法仑氟灭酰胺、JV28和J3可在体内转化为美法仑。WO 01/96367中证实它们的衍生物对肿瘤具有更高的细胞杀伤活性，即使在低于美法仑的浓度下使用。另外，可以避免美法仑耐受性。
以下实施例将进一步描述本发明，这些实施例不限制本发明的范围。
实验部分
实施例1：不同条件下盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)的冻干
该实验中，测试了各种条件下盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)的冻干。
实施例1A
将所称取量的J1溶解在不同体积的去离子水中，在超声波浴中略微加热以得到澄清溶液。将样品在干冰-丙酮浴(-78℃，样品A1-A3)中或在冷冻器中-16℃下(样品B1-B3)冷冻。然后在1毫巴的压力下，用干燥瓶和泵之间的干冰-丙酮(-78℃)阱在室温下冷冻干燥16小时。
干燥后的视觉外观总结在表1中。
表1.不同冷冻浓度或温度下的6种不同J1溶液。
实施例1B
将干燥的化合物样品溶于50％的水性乙腈中并用HPLC分析(ACE柱、C8、50x3mm、3分钟内10-97％CH3CN、1mL/分钟)。在一种情况下(J1A1)，在冷冻干燥前通过HPLC分析该水性溶液(J1A1-起始)。干燥后的纯度总结在表2中。
表2.冷冻干燥后的纯度Rt＝保留时间
实施例1C
随后用弱酸性水(例如0.01％HCl)提高溶解速度，或在添加水(中性或弱酸性)之前先将J1溶解在乙醇中进行测试。
通过将美法仑氟灭酰胺(约3mg)溶解在70％乙醇水溶液(0.5mL)中来制备3种J1样品。该溶液用5mM HCl稀释以达到0.4mg/mL的浓度。由于美法仑氟灭酰胺在乙醇水溶液中快速溶解，不必使用超声波浴或加热来得到澄清溶液。随后将该溶液在干燥瓶和泵之间的干冰-丙酮(-78℃)阱中冷浴冰冻。干燥后的视觉外观总结在表3中。
表3.溶解在乙醇和酸中的三个J1重复样品
实施例1D
每个样品进行2轮HPLC:一轮来自可从烧瓶中移取的固体化合物，一轮通过溶解瓶子中化合物的残留物(表4)。
表4.冷冻干燥后的纯度
轮次1
轮次2
总之，通过将J1溶解于70％乙醇、用5mM HCl稀释并且冷冻干燥，得到纯度>95％的三种样品。
实施例1E
然后省去酸并替代性地用去离子水稀释乙醇来测试。
通过将J1(约3mg)在室温下溶解在70％乙醇水溶液(0.5mL)中来制备3个J1样品。该溶液用去离子水稀释以达到0.4mg/mL的浓度。然后在干冰-丙醇(-78℃)中冷冻该溶液。然后在1毫巴的压力下，用干燥瓶和泵之间的干冰-丙酮(-78℃)阱在室温下冷冻干燥超过16小时。干燥后的视觉外观总结在表5中，纯度总结在表6中。
表5.溶解在乙醇和水中的三个J1重复样品
表6.冷冻干燥后的纯度
通过将JI溶解在70％乙醇中，用水稀释并冷冻干燥；得到与原料相同纯度的三个重复样品。
实施例2：赋形剂对冻干美法仑氟灭酰胺溶解速率的影响
该实验中测试了在盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)冷冻干燥过程中添加赋形剂对溶解速度的影响。使用以下赋形剂，所有赋形剂都是根据FDA(美国食品药品管理局)“通常被认为是安全的”(GRAS)的常规配方试剂：
-D-甘露醇、海藻糖和蔗糖；
-瑞兹姆(Trizma)盐酸和L-组氨酸；
-聚山梨酯80，β-环糊精；
所有实验中均使用J1。
D-甘露醇购买自西格玛公司(Sigma)目录号33440；
D-(+)-二水海藻糖购买自西格玛公司目录号T9449-25g；
瑞兹姆盐酸购买自西格玛公司目录号T3253-100g；
β-环糊精水合物购买自西格玛公司目录号856088-5g；
聚山梨酯80购买自伏路卡公司(Fluka)目录59924-100g。
在Leybold Lyovac GT2设备上进行冷冻干燥。使用含乙腈-0.1％三氟乙酸的水溶液作为洗脱液在HP1100系统中进行LCMS(液相色谱-质谱)。使用ACE-柱C8，50x 3mm和3分钟的10-97％梯度乙腈。过滤瓶来自沃特曼(Whatman)，小型UniPrep(Mini-UniPrep)，0.45μm。
(i)方法A，冷冻干燥
将美法仑氟灭酰胺(30.1mg)溶于5mL含1mM HCl的70％乙醇中，在18-19℃下12分钟内完全溶解。用水(70mL)稀释该溶液，并分散(10mL)在含和不含赋形剂(例如，β-环糊精，9mg)的250mL圆底烧瓶中。所有物质都溶解时，通过将该溶液浸泡在-78℃的干冰/丙酮浴中来冷冻该溶液。然后在<0.1毫巴的压力和室温下过夜冷冻干燥该冷冻溶液，蒸发使该样品持续冷冻直至干燥。
(ii)方法A，溶解速度的测量
在18.5～19℃下将5％葡萄糖溶液(10mL)一次性加入冷冻干燥物质中并用磁体搅拌。在不同时间用1-mL注射器取各等分(约0.3mL)并通过过滤瓶(0.45□m)过滤。用HPLC分析该滤液(8□L)。
(iii)方法B，冷冻干燥
将美法仑氟灭酰胺(10.2mg)溶于1.67mL含5mM HCl的70％乙醇中，25℃下在5分钟内完全溶解。用水(23.3mL)稀释该溶液并分散(10mL)在含和不含赋形剂(例如，β-环糊精，9mg)的烧瓶中。将J1和赋形剂的溶液分散到具有装配插入式0.45μm过滤器(fittinginsert 0.45μm filter)的塑料瓶中(每瓶0.25mL)。通过浸泡在-78℃的干冰/丙酮浴中冷冻这些瓶子，随后在-20℃在适宜这些瓶子的架子上放置过夜。用铝箔覆盖在冷冻的瓶上以防止交叉污染，并放置在架子上预冷至-20℃，同时将架子暴露在干燥器中在＜0.1毫巴的压力下过夜，蒸发使该样品保持冷冻直至干燥。
(iv)方法B，溶解速度的测量
加入含有内标(3-甲氧基苯甲酸，0.08 mg/mL)的5％葡萄糖溶液(0.5 mL)。经过不同时间后(15秒～12分种)过滤瓶子的内含物，直接将滤液转移至玻璃瓶以防止将未溶解物质泄露到滤液中，并将8μL滤液注射到LCMS中。
溶解速度的测定
在第一种方案中，方法A，在圆底烧瓶中冷冻干燥含有不同添加物的J1水溶液。向各冷冻干燥的化合物中加入葡萄糖溶液并同时控制搅拌。用注射器在特定时间点取出小等分并通过0.45μm GHP注射过滤器过滤。随后用HPLC测定滤液中J1的溶解程度。采用单独的冷冻干燥美法仑氟灭酰胺以及同时采用D-甘露醇、海藻糖、蔗糖、聚山梨酯80和β-环糊精来进行该方法。这些测试结果显示，无论是否存在赋形剂，J1在2-4分钟内完全溶解(参见图1，无赋形剂，以及图2，存在赋形剂。也可参见表7)。事实上，在赋形剂存在下冻干的J1的溶解速率实际上比该方法所能测得的速度更快。
表7.在冷冻干燥时向J1(4 mg)中添加赋形剂，方法A。
冷冻干燥物质 J1：添加物的比例(mg J1:mg添加物) 实验编号
D-甘露醇 4:2 1
D-甘露醇 4:10 2
海藻糖 4:2 1
海藻糖 4:10 2
蔗糖 4:10 1
β-环糊精 4:9 1
β-环糊精 4:18 2
聚山梨酯80 4:0.05 1
聚山梨酯80 4:0.265 2
为改进精确度并能测量更短间隔时间内的溶解度，研发了方法B。该方法中，将美法仑氟灭酰胺和赋形剂(参见表2)的水溶液添加到2mL塑料瓶中并冷冻干燥。然后加入含有内标3-甲氧基苯甲酸的葡萄糖溶液，不进行搅拌。在不同时间后(15秒～6分钟)，用0.45μmGHP瓶插入器(vial insert)过滤瓶子的内含物，将滤液转移至玻璃瓶中，并用内标通过HPLC测定盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)的溶解程度。不进行搅拌能减缓溶解过程，更具有临床相关性并且更易于测定其动力学。
通过该方法，冷冻干燥的J1的溶解动力学可跟踪到3～4分钟后的完全溶解(参见图3，无赋形剂，和图4，存在赋形剂，也可参见表8)。
表8.在冷冻干燥时向J1(4 mg)中添加赋形剂，方法B。
冷冻干燥物质 J1：添加物的比例(mg J1:mg添加物) 实验编号
J1:甘露醇 4:20 1
J1:海藻糖 4:20 1
J1:β-环糊精 4:9 1
J1-聚山梨酯 4:5 1
J1:瑞兹姆HCl 4:8 1
用方法A和B所测定的含和不含添加物的J1的溶解速度总结在表9中。
表9.含和不含添加物的J1的溶解时间的总结，方法A和B。
J1的纯度和回收
将盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)样品溶于50％乙腈水溶液中并立即用LCMS(
液相色谱-质谱)分析，只显示一个峰(＞99％)。发现溶解于含有1mM HCl或5mMHCl的70％乙醇后直接测得的J1纯度约为97％，次要副产品的纯度约为3％。如果该溶液放置在室温下，该副产品的量会上升。
这些结果证实，冷冻干燥的J1在葡萄糖溶液中在搅拌下的溶解速度要快于可测量的速度(方法A)，从而不能观察到添加赋形剂的影响。使用临床相关性更大的不进行搅拌的方法B，冷冻干燥的美法仑氟灭酰胺在葡萄糖溶液中的溶解可跟踪到3～4分钟后的完全溶解。在冷冻干燥前向美法仑氟灭酰胺溶液中加入赋形剂β-环糊精、聚山梨酯80、甘露醇和海藻糖，都使其在1分钟内达到完全溶解。通过加入聚山梨酯80得到最快的溶解，在15秒的第一时间点达到完全溶解。
实施例3：赋形剂聚山梨酯80的浓度对美法仑氟灭酰胺溶解速率的影响的测试
进行以下实验来测试在美法仑氟灭酰胺冷冻干燥过程中加入赋形剂聚山梨酯80的量以及在5％葡萄糖溶液中使溶解速率达到最大化的赋形剂聚山梨酯80的量。使用以美法仑氟灭酰胺计，0、10、50和100重量％的聚山梨酯80。该实验重复两次。
所有实验都使用盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)。聚山梨酯80购买自伏路卡公司，目录号59924-100g。
在Leybold Lyovac GT2设备上进行冷冻干燥。使用乙腈-0.1％三氟乙酸的水溶液作为洗脱液在HP1100系统中进行LCMS。使用ACE-柱C8，50x 3mm和3分钟的10-97％梯度乙腈。过滤瓶来自沃特曼(Whatman)，小型UniPrep(Mini-UniPrep)，0.45μm。
按照以下方法在冷冻干燥前进行美法仑氟灭酰胺2mg/mL母液的通用制备：
将11.0mg美法仑氟灭酰胺混悬于10mM的含HCl纯EtOH(0.5mL)中。搅拌该混合物30分钟，然后加入0.2mL水。在室温下搅拌该混合物10分钟(澄清溶液)，随后将该溶液添加到0℃的水溶液(4.8mL)中。将0.25mL该溶液转移到含有10重量％、50重量％或100重量％的聚山梨酯80的塑料瓶中。振荡、冷却并冷冻干燥该瓶子。
通过在水(15mL)中溶解3-甲氧基苯甲酸(1.2mg)制备含有内标3-甲氧基苯甲酸的5％葡萄糖溶液。搅拌该混合物1小时，然后在搅拌下加入750mg葡萄糖。向各冷冻干燥的塑料瓶中加入0.5mL的5％葡萄糖溶液并过滤该混合物，在不同时间点转移至玻璃瓶中，并通过HPLC测定J1的溶解度。
溶解速率的测定
将J1(11mg)混悬于EtOH(0.5mL)并在室温下搅拌30分钟，随后加入水(5mL)。将该溶液分到含有0重量％、10重量％、50重量％或100重量％(相对J1)的聚山梨酯80的4个不同的烧瓶中。将该溶液转移至2mL塑料瓶中，并冷冻干燥过夜。
含有内标3-甲氧基苯甲酸的5％葡萄糖溶液加到各瓶子中并不进行搅拌，在不同时间点(2～300秒)通过0.45μm GHP瓶插入器过滤该混合物。将滤液立即转移至玻璃瓶中以防止渗入未溶解物质。使用HPLC测定相对于内标的J1溶解量。
结果
含和不含聚山梨酯80的J1溶解速度(1mg/mL溶于5％葡萄糖溶液)总结在表10并显示在图5中。
表10.
表10显示含冷冻干燥的J1和赋形剂聚山梨酯80的所有样品比赋形剂不存在条件下冷冻干燥的J1要溶解得快的多。对含10％的聚山梨酯80的样品进行了特别留意，该实验中的时间点是：
立即过滤、2秒、15秒、30秒和5分钟。在对样品立即过滤的第一个时间点时，大约溶解了40％，2秒后大约溶解了70％。在30～60秒后达到完全溶解。
对于所有样品，含有不同量聚山梨酯80的1mg/mL冷冻干燥J1在5％葡萄糖溶解中的溶解速率低于1分钟。用来快速溶解的聚山梨酯80最低量为10～50重量％。
实施例4：赋形剂聚山梨酯80、PEG400和β-环糊精的浓度对美法仑氟灭酰胺溶解速 率的影响的测试
进行该实施例是为了研究在美法仑氟灭酰胺冷冻干燥中加入不同浓度的赋形剂聚山梨酯80、PEG 400和β-环糊精对最大化在5％葡萄糖溶液中的溶解度和溶解速度的影响，从而达到开发一种储存稳定并且配药时便于配制的冻干物质的长期目标。
所有实验中都使用盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)。
所用的聚山梨酯80购买自伏路卡公司(59924-100g)，β-环糊精购自奥德里奇公司(856088)，PEG 400购自克莱瑞特公司(Clariant)(100316)。
在Leybold Lyovac GT2设备上进行冷冻干燥。使用乙腈-0.1％三氟乙酸的水溶液作为洗脱液在HP1100系统中进行LCMS。使用ACE-柱C8，50x 3mm和3分钟的10-97％梯度乙腈。过滤瓶来自沃特曼(Whatman)，小型UniPrep(Mini-UniPrep)，0.45μm。
用于冷冻干燥的美法仑氟灭酰胺2mg/mL母液的通用制备
将11.1mg美法仑氟灭酰胺混悬于10mM含HCl的纯EtOH(0.5mL)溶液中。搅拌该混合物30分钟，然后加入0.2mL水。在室温下搅拌该混合物10分钟(澄清溶液)，随后将该溶液逐滴添加到0℃的水溶液(4.8mL)中。将0.25mL或0.5mL的溶液转移到含有赋形剂的塑料瓶中。振荡、冷却并冷冻干燥该瓶子。
溶解度实验
通过在水(15mL)中溶解3-甲氧基苯甲酸(1.2mg)制备含有内标的5％葡萄糖溶液。搅拌混合物1小时，然后在搅拌下加入750mg葡萄糖。向各冷冻干燥的塑料瓶中加入0.2mL的5％葡萄糖溶液，并振荡该溶液10～15秒，5分钟后过滤。将该滤液转移到玻璃瓶中，通过HPLC和校准曲线测定美法仑氟灭酰胺溶解度。
溶解度的测定
之前实验中所用的2mg/mL的盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)母液。
对于2.5mg/mL的J1在5％葡萄糖溶液溶液中的溶解度，将0.25mL母液分散在含有根据实验设计确定的赋形剂混合物的2mL塑料瓶子，并立即将该混合物冷却并冷冻干燥。
以下为高/低水平的各种赋形剂(相对美法仑氟灭酰胺的重量％)：聚山梨酯80(8％～80％)、PEG 400(80％～400％)和β-环糊精(10％～50％)。各赋形剂的最高量根据FDA非活性成分数据库中登记的IV-给药药物确定。β-环糊精在FDA的GRAS(通常被认为是安全的)列表中，但跟据我们的了解不推荐静脉内注射，这会导致待设定的防腐剂水平相当高(a fairly conservative high level to be set)。各赋形剂相对盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)(重量)的重量百分数示于表11。
表11.各赋形剂相对J1的重量百分数。
正如本文中其它实验所证实的那样，冷冻干燥过程中添加聚山梨酯80使J1的溶解速率显著提高。进行三次实验以尝试达到5mg/mL的溶解度。将J1母液添加到3个含有聚山梨酯80(相对美法仑氟灭酰胺10重量％、50重量％和100重量％)的不同的塑料瓶(实验12、13和14)中。立即冷却并冷冻干燥该混合物。
向每个瓶子中加入含有内标(3-甲氧基苯甲酸)的5％葡萄糖溶液，然后振荡瓶子并静置5分钟。通过0.45μm GHP过滤瓶过滤该混合物，并立即将滤液转移至玻璃瓶中以防止渗入未溶解物质。通过HPLC和校准曲线测定J1的溶解量。
结果
含有高/低水平赋形剂聚山梨酯80、PEG 400和β-环糊精的J1的溶解度(mg/mL)总结在表12中。
表12.J1(mg/mL)的溶解度
*实验15～16不使用冷冻干燥的J1，实验15使用细粉末，实验16使用更大的团块。
表12提供的结果证实，所有含赋形剂实验中的J1溶解度比非冷冻干燥的J1(条目15和16)有所提高。非冷冻干燥J1的溶解度的较大偏差可能是由批次中的不同粒径所致，因为条目15是白色细粉末的悬液，而条目16是较大团块，该大团块使在5分钟内的溶解速率更低并因此得到更低的J1溶解度。分析的精确度显示在中间赋形剂浓度相同的实验9～11中(1.9、1.8和1.7)。3个将聚山梨酯80作为赋形剂的样品(10、50和100％)分别展现出1.0、1.2和1.4mg/mL的溶解度。
用赋形剂聚山梨酯80、Peg 400和β-环糊精的混合物的条目展现了溶解度为2.0mg/mL或接近该值的数种组合。仅在高水平PEG 400的情况下测得最高溶解度2.0(条目3、5和7)，其在冷冻干燥后得到液体或半固体。
含较低量PEG 400的样品(条目2、4、6和8)在冷冻干燥后形成白色蓬松粉末，测到的最高溶解度为条目8中的1.9mg/mL。这提示了测试是否更高的溶解度可通过降低PEG 400的量并增加β-环糊精的量来获得。另一个样品(表12中第17排)是含有50％聚山梨酯80、80％PEG 400和100％β-环糊精下冷冻干燥的。含有该赋形剂混合物的J1溶解度是1.2mg/mL。
结果证实，含有赋形剂组合的J1的最大溶解度接近于2mg/mL。
实验13显示只含有50％聚山梨酯的J1溶液得到约1.2mg/mL的溶解度，对于1.0mg/mL制剂而言是充足的，并且可以不包含PEG 400和β-环糊精。
目测确定实验
为了在更具有临床上相关性的背景中确定溶解度，在透明玻璃瓶中进行更大规模的实验来取代塑料瓶。瓶1含有4.8mg盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)和2.4mg聚山梨酯80的溶液。作为对照，瓶2含有4.8mg盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)并且不含聚山梨酯80。将瓶子冷冻干燥过夜。
向含有呈白色蓬松物质的冷冻干燥美法仑J1的每个瓶子中加入4.70mL 5％葡萄糖溶液以得到1.02mg/mL的J1浓度。振荡混合物10～15秒，15秒后含有J1和50％的聚山梨酯80的试管显示出澄清溶液，参见图6，左瓶。含有冷冻干燥J1但不含聚山梨酯的对照试管显示出小颗粒并且在30分钟后仍没有完全溶解，参见图6，右瓶。LC-MS分析揭示了30分钟后两个瓶子中美法仑氟灭酰胺的纯度都>95％。
本文提供的结果证实，J1在5％葡萄糖溶液中的溶解度可通过使用赋形剂聚山梨酯80、PEG 400和β-环糊精的混合物提高到1.9mg/mL。这种含有J1和赋形剂的混合物在冻干后形成蓬松白色固体。
将50重量％的聚山梨酯80与J1一起冻干，得到在5％葡萄糖溶液中快速溶解的白色蓬松固体。1.2mg/mL的饱和浓度足够用于在临床环境下以1.0mg/mL的浓度配制制剂。
实施例5：稳定性测试
本研究的第一部分的目的是研究盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)(与聚山梨酯80一起冷冻干燥)在5％葡萄糖溶液中的溶解速率。
在另一个实验中将测定J1(冷冻干燥的)在含有聚山梨酯80的5％葡萄糖溶液中的溶解速度。
最后将测定非冷冻干燥的J1在含有聚山梨酯80的5％葡萄糖溶液中的溶解速度。
第二部分是研究高温下两种不同制剂中J1的降解。第一种制剂是含有聚山梨酯80的冷冻干燥固体，第二种是溶于N,N-二甲基乙酰胺(DMA)的25mg/ml J1溶液。用两种制剂在+40℃下跟踪降解情况1个月。
(i)溶解速率的测定
向每个含J1的塑料瓶中加入5％葡萄糖溶液。然后振荡瓶子并在不同时间点过滤。将滤液转移到玻璃瓶中，用HPLC测定溶解的J1的量。
(ii)稳定性加速实验设计。
将含有冷冻干燥的J1和聚山梨酯80的10个瓶子和含有溶于DMA的J1溶液的10个瓶子在40℃下储存1个月。将两瓶装有冷冻干燥物质的瓶子(下表中称为冷冻干燥1和2)和一瓶装有DMA溶液的瓶子(表1中称为DMA)从40℃的室中取出，并在-20℃下储存，在同一时间用于实验和J1纯度的分析。取样时间为0、1、3、10和30天。每个冷冻干燥瓶含有0.25mg的J1。溶于DMA中的25mg/ml溶液来自肿瘤肽公司(Oncopeptides)。
(iii)分析和结果
将冷冻干燥样品溶于沃特曼0.45μm过滤瓶中的500μl DMA中。将瓶中两个部分压在一起之前简单涡旋样品，然后过滤该样品。用DMA通过以下方式稀释25mg/ml溶液样品：取20μl溶液等分置于HPLC瓶中并用980μl DMA稀释。取4μl注射到色谱系统中。
由于冷冻干燥瓶中的J1量存在略微变化，以相对纯度评价稳定性。通过使用相对纯度，各样品对其自身标准化，J1量的变化对稳定性结果的影响被最小化。
在PS的存在下J1在5％葡萄糖溶液中的溶解速度总结在表13中：
表13：溶解实验的总结。
稳定性测试结果
表14.在40℃下稳定性测试的结果，+40℃/环境相对湿度下DMA溶液和冷冻干燥的J1的比较
表14中的结果显示在测试期间内该冷冻干燥物质基本没有变化。只观察到很小的纯度变化。而且，在聚山梨酯80的存在下，1mg/mL冷冻干燥J1在5％葡萄糖溶液中的溶解速率短于1分钟。1mg/mL的非冷冻干燥J1在含有聚山梨酯80的5％葡萄糖溶液中的溶解速率估计为1～2分钟。
DMA溶液中的J1在+40℃下的1个月储存期内显著降解。相对量从约96.8％降至86.9％。以冷冻干燥固体形式储存的J1在相同期间内只显示出从98.7％降至98.3％的很小的降解。
其他实施方式
应理解虽然本发明已结合其详述进行描述，但以上描述意在说明而不是限制本发明的范围，该范围由所附权利要求的范围限定。其他方面、优势和修改在以下权利要求的范围内。

Claims (12)

1.一种冻干药物制剂，其包含：
(i)盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)；以及
(ii)赋形剂，所述赋形剂是蔗糖。
2.如权利要求1所述的冻干药物制剂，其特征在于，所述赋形剂的量以所述美法仑氟灭酰胺的重量计约为10～100％。
3.如权利要求2所述的冻干药物制剂，其特征在于，所述赋形剂的量以所述美法仑氟灭酰胺的重量计为10～50％。
4.如权利要求1或3所述的冻干药物制剂，其特征在于，包含25mg盐酸美法仑氟灭酰胺J1和12.5mg蔗糖。
5.如权利要求1-4任一所述的冻干药物制剂，其特征在于，所述制剂不含或基本不含有机溶剂。
6.如权利要求1-5任一所述的冻干药物制剂，其特征在于，所述制剂作为药物使用。
7.如权利要求1-5任一所述的冻干药物制剂，其特征在于，所述制剂用于治疗和/或预防癌症。
8.如权利要求7所述的冻干药物制剂，其特征在于，所述癌症是以下癌症中的任何一种：卵巢癌、肺癌、膀胱癌、间皮瘤、多发性骨髓瘤、乳腺癌或血液癌症。
9.一种制备如权利要求1-8任一所述的冻干药物制剂的方法，其中：
a.将盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)溶于有机溶剂以获得盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)溶液；
b.向所述盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)溶液中添加水以获得浓度约0.2～3.0mg/ml的水性盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)溶液；
c.向所述盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)溶液中添加赋形剂，所述赋形剂是蔗糖；并且
d.对含有赋形剂的水性盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)溶液进行冻干。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
a)将盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)或其药学上可接受的盐溶于有机溶剂；
b)向步骤a)中所得的溶液中添加水以获得浓度约0.2～3.0mg/ml的所述盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)或其药学上可接受的盐的溶液；
c)向步骤b)中所得的溶液中添加赋形剂，所述赋形剂是蔗糖；并且
d)对步骤c)所得的溶液进行冻干。
11.如权利要求9或10所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂为选自以下中的任何一种：乙醇、含酸乙醇、丙三醇、丙二醇、苯甲醇、二甲基乙酰胺(DMA)、N-甲基-2-吡咯酮、异丙醇、正丁醇、叔丁醇、甲基叔丁基醚、丙二醇、二甲亚砜、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、丙酮、二甲基甲酰胺、乙腈、二噁烷、乙酸、乳酸、丙酸、正丁醇、异丙醇、正丙醇、叔丁醇、仲丁醇、甲醇、以及乙醇和水的混合物。
12.蔗糖的应用，其用于盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)或其药学上可接受的盐的冻干制剂中以减少盐酸美法仑氟灭酰胺(J1)或其药学上可接受的盐的冻干制剂在水性溶剂中重建时的重建时间。
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