PT1658848E - Formulações contendo ecteinascidina e um dissacarídeo - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "FORMULAÇÕES CONTENDO ECTEINASCIDINA E UM DISSACARÍDEO" O presente invento relaciona-se com formulações. Mais particularmente relaciona-se com composições e formulações de ecteinascidinas, tal como ecteinascidina 743 .

ANTECEDENTES DO INVENTO

As ecteinascidinas foram identificadas, estruturalmente caracterizadas e foram descritos métodos sintéticos para as fazer. Ver por exemplo, R. Sakai, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, páginas 11456-11460, "

Additional antitumor ecteinascidins from Caribbean tunicate: Crystal structures and activities in vivo"; R. Menchaca, et al., 2003, J. Org. Chem. 68(23), páginas 8859-8866, "Synthesis of natural ecteinascidins (ET-729, ET-745, ET-759-B, ET-736, ET-637, ET-594) from cyanosafracin B »; e I. Manzanares, et al., 2001, Curr. Med. Chem.- Anti-Cancer Agents, 1, páginas 257-276, "Advances in the Chemistry and Pharmacology of Ecteinascidins, A Promising New Class of Anticancer Agents"; e referências ai contidas. Estas referências descrevem ecteinascidinas. Exemplos de ecteinascidinas são proporcionados por ET-743, ET-729, ET-745, ET-759A, ET-759B, ET-759C, ET-770, ET-815, ET-731, ET- 2 ΡΕ1658848 745Β, ΕΤ-722, ΕΤ-736, ΕΤ-738, ΕΤ-808, ΕΤ-752, ΕΤ-594, ΕΤ-552, ΕΤ-637, ΕΤ-652, ΕΤ-583, ΕΤ-597, ΕΤ-596, ΕΤ-639, ΕΤ-641, e derivados destas, tais como formas acetiladas, formas formiladas, formas metiladas, e formas de óxido, tais como formas N-óxido. A caracterização estrutural de tais ecteinas-cidinas não é dada novamente aqui de forma explicita porque a partir da descrição detalhada fornecida em tais referências e citações qualquer especialista ordinário neste tecnologia é capaz de obter tal informação directamente a partir das fontes citadas aqui e fontes relacionadas.

Pelo menos um dos compostos ecteinascidina, ET-743, foi extensivamente estudado, e será especificamente referido aqui para ilustrar caracteristicas deste invento. A ecteinascidina 743 (ET-743) é um alcaloide tetrahidroisoquinolina isolado a partir do tunicado marinho Ecteinascidia turbinata e tem a seguinte estrutura:

Uma composição farmacêutica compreendendo ET-743 3 ΡΕ1658848 em combinação com um veículo, diluente ou excipiente farma-ceuticamente aceitável é reivindicado na EUA 5 256 663.

Um artigo de revisão recente de ET-743, da sua química, mecanismo de acção e desenvolvimento pré-clínico e clínico pode ser encontrado em van Kesteren, Ch, et al., 2003, Anti-Cancer Drugs, 14(7), páginas 487-502: Yondelis (trabectedin, ET-743): the development of an anticancer agent of marine origin", e referências aí contidas. A ET-743 possui actividade antineoplásica potente contra uma variedade de tumores humanos xenoenxertados em ratinhos atímicos, incluindo melanoma e carcinoma de ovário e mama.

Em estudos de ET-743 na fase clínica I, foram observadas respostas promissoras em doentes com sarcoma e carcinoma de mama e ovário. Portanto este novo fármaco está correntemente sob investigação intensa em vários ensaios clínicos de fase II em doentes com cancro com uma variedade de neoplasias.

Como é explicado na WO 0069441, incorporada completamente como referência, a ET-743 é fornecida e armazenada como um produto liofilizado estéril, tendo ET-743, manitol e um tampão fosfato. Uma formulação preferida é aquela obtida a partir de 0,9% de cloreto de sódio ou outro veículo de infusão adequado, 250 pg de ET-743 com 250 mg de manitol, 34 mg de fosfato de manopotássio e ácido 4 ΡΕ1658848 fosfórico para ajustar o pH. Esta formulação é então reconstituída e diluída para injecção intravenosa. A ET-743 é uma entidade química complexa, como revelado pelas suas características estruturais. Além disso, a ET-743 apresenta solubilidade aquosa limitada, e a sua estabilidade, particularmente em formas e formulações biocompatíveis é difícil de prever e atingir. Estas características desafiam as competências ordinárias e metodologias convencionais nesta tecnologia, particularmente quando se trata da preparação de formulações de ET-743 que são para ser prontamente usadas para fins médicos. Tais usos assentam preferencialmente em formulações cujas características incluem um ou mais dos seguintes: biocom-patibilidade, estabilidade em condições ambiente, ou em condições que estão tão próximas quanto possível das condições ambiente, com um tempo de armazenamento tão longo quanto possível, e facilmente reconstituíveis para formar soluções reconstituídas que sejam estáveis em condições ambiente, ou próximas do ambiente, durante o maior tempo possível.

Contudo, formulações e metodologias convencionais para preparar tais formulações não proporcionam características desejáveis tais como aquelas referidas acima. Por exemplo, o artigo de revisão citado de 2003 por van Kesteren Ch. et al. relata que a ET-743 tem uma solubilidade em água limitada. Contudo, por ajuste do pH a 4, puderam ser atingidas concentrações de ET 743 adequadas. A 5 ΡΕ1658848 instabilidade de ET 743 em solução aquosa necessitou de liofilização de modo a aumentar a estabilidade ao armazenamento do produto farmacêutico. A ET 743 é correntemente formulada como um produto liofilizado estéril contendo 250 pg de substância activa por unidade de dosagem, 250 mg de manitol como agente de volume e tampão fosfato 0,05 M a pH 4 de modo a solubilizar a ET 743. Esta formulação é instável com armazenamento a longo termo refrigerado e à temperatura ambiente, e deve portanto ser guardada entre -15 e -25°C, protegida da luz. A reconstituição é realizada adicionando 5 ml de água para injecção, com diluição subsequente em solução salina normal antes de infusão i.v.. A solução reconstituída é estável à temperatura ambiente durante 24 h.

Na prática este produto contendo 250 pg de ET-743 é manufacturado liofilizando 5 ml de solução contendo ET-743, manitol, tampão fosfato e água num frasquinho moldado. Os frasquinhos moldados contendo 1 mg de ET-743 são também manufacturados liofilizando 20 ml de solução. A liofilização envolve tipicamente liofilizar a solução, reduzindo a pressão durante um período de secagem primária para remover o vapor de água do material congelado por sublimação e dar uma massa semi-seca, e aumentando a temperatura durante um período de secagem secundária para remover a água residual da massa semi-seca. Os frasquinhos são então selados. 6 ΡΕ1658848 A formulação de ET-743 convencional acima descrita sofre de várias desvantagens. Uma delas é que a formulação de ET-743 liofilizada tem de ser armazenada a cerca de -20°C para evitar a decomposição da ET-743 de modo a atingir um tempo de armazenamento de pelo menos 18 meses.

Além disso, as formulações de ET-743 enfrentam o problema de formação de quantidades relativamente grandes de ET-701 como impureza. A ET-701 é a impureza principal produzida durante a o processo de liofilização e durante o armazenamento da formulação de ET-743. Provém da hidrólise da ET-743 e tem a estrutura seguinte:

Contudo, a formação de impurezas, diminui e impede mesmo a capacidade de padronizar formulações. É, em consequência disto, desejável providenciar formulações e métodos para fazer as mesmas que proporcionam modelos de realização cuja composição não se altere facilmente e de forma imprevista para a formação descontrolada de impurezas .

Além disso, outra desvantagem da metodologia de 7 ΡΕ1658848 formulação de ET-743 convencional descrita acima é que de modo a obter a formulação liofilizada é necessário liofilizar uma quantidade relativamente grande de solução com volumes de enchimento da ordem de 5 a 20 ml. Por contraste, seria desejável desenvolver uma metodologia de manufactura para formulações com compostos tão complexos como ET-743 que permita fazer formulações com concentrações mais elevadas de substância activa, de modo a que os volumes a ser manuseados sejam consequentemente reduzidos. Em métodos convencionais, são necessários tempo e energia para o passo de liofilização, devido aos volumes de enchimento relativamente elevados de 5 ou 20 ml. Juntamente com o tempo e energia, existe também o risco de decomposição da ET-743, particularmente na secagem secundária.

Em virtude do potencial das formulações de ET-743 como agentes anti-tumorais, existe a necessidade de providenciar uma formulação que possa resolver problemas aos quais as formulações e metodologias de manufactura convencionais não se dirigem ou não resolvem completamente. Estes problemas incluem o problema da estabilidade de ET-743. Modelos de realização das formulações de ET-743 devem preferencialmente apresentar propriedades de liofilização favoráveis, devem preferencialmente ser susceptíveis de pronta reconstituição, e devem de preferência apresentar propriedades de diluição, tais como diluição com o fluido de infusão, enquanto apresentam o maior número possível das características desejáveis de formulações para uso médico como referido aqui. Como indicado acima, os modelos de ΡΕ1658848 realização das formulações de ET-743 devem ser estáveis durante o armazenamento a longo termo. Além disso, a formulação e a sua metodologia de manufactura devem satisfazer os padrões de biocompatibilidade e devem assim permitir o uso eficaz de um veiculo de formulação que não seja tóxico, pelo menos nas concentrações usadas para infusão.

Um artigo de revisão geral de interacções exci-piente-fármaco em formulações parentéricas é providenciado por Akers, MJ, em Journal of Pharmaceutical Sciences, 91, 2002, 2283-2300. Esta referência proporciona, inter alia, uma secção em agentes de volumes e lioprotectores, incluindo este conteúdo no contexto da liofilização.

Considera-se que as metodologias e formulações desenvolvidas no contexto deste invento são aplicáveis a outras ecteinascidinas, além da ET-743.

OBJECTIVOS DO INVENTO E um objectivo deste invento providenciar formulações estáveis de ecteinascidinas, e métodos de fazer tais formulações. É um objectivo especifico deste invento providenciar uma nova formulação estável de ET-743. Em particular, é necessária uma formulação que tenha uma estabilidade maior ao armazenamento. Existe especialmente uma necessi- 9 ΡΕ1658848 dade para evitar a formação de impurezas. Em particular, é desejável providenciar modelos de realização de formulações que estejam substancialmente isentas de ET-701.

Além disso, outros objectivos deste invento dizem respeito ao desenvolvimento de metodologias de manufactura que permitam a preparação de formulações de ET-743 com concentrações de ET-743 que sejam mais elevadas do que as atingidas por meios convencionais. Objectivos adicionais dizem respeito ao desenvolvimento de processos para melhorar a solubilidade de entidades químicas tão complexas como a ET-743, aumentando eventualmente a concentração de ET-743 na solução para liofilização, e reduzindo assim o volume de enchimento nos frasquinhos antes de liofilizar a formulação.

SUMARIO DO INVENTO

De acordo com o presente invento são providenciadas composições de ET-743 que compreendem ET-743 e um dissacarídeo, e métodos para preparar tais composições. Modelos de realização preferidos de tais composições são de pureza farmacêutica.

Outros modelos de realização deste invento são providenciados por composições que compreendem uma ecteinascidina e um dissacarídeo.

Alguns modelos de realização de tais composições 10 ΡΕ1658848 são providenciados por formulações liofilizadas que compreendem uma ecteinascidina tal como ET 743 e um dissacarideo. São providenciados métodos para preparar tais formulações. O invento providencia métodos para reduzir, ou eventualmente eliminar, a formação de impurezas nas formulações de et-743. Tais modelos de realização incluem metodologia para reduzir, ou mesmo substancialmente eliminar, a formação de ET-701 nas formulações de ET-743. O invento também providencia metodologia para manusear mais eficazmente formulações de uma ecteinascidina tal como a ET-743, incluindo métodos para fazer formulações de concentração mais elevada e métodos para reduzir o volume de enchimento de um frasquinho quando se produz uma formulação liofilizada. O presente invento também providencia métodos para solubilizar entidades químicas complexas, tais como ecteinascidinas, incluindo mas não estando limitado a ET-743. Tais métodos permitem a manufactura de uma solução mais concentrada de ET-743 na solução global a lioflizar, conduzindo a volumes de enchimento mais reduzidos.

DETALHES DO INVENTO

Verificámos no contexto deste invento que os dissacarídeos estabilizam formulações de ecteinascidina. As 11 ΡΕ1658848 ecteinascidinas, incluindo a ET-743, são entidades químicas complexas cujo comportamento em formulações não é previsível em termos do comportamento de outras substâncias químicas não relacionadas. Tal comportamento é mesmo mais difícil de prever quando pelo menos uma ecteinascidina é incluída como substância activa numa formulação que pretende satisfazer padrões de biocompatibilidade, incluindo padrões médicos. Verificámos ainda no que respeita a isto que o uso de dissacarídeos como agentes de volumes pode reduzir drasticamente a formação de impurezas durante o processo de liofilização e armazenamento de composições de ET-743.

Quando modelos de realização deste invento são para proporcionar formulações de ET-743 que são substancialmente isentas de outras ecteinascidinas tal como a ET-701, ou pelos menos com um teor em ET-701 tão abaixo quanto possível, então a ET-701 é olhada como uma impureza cuja presença na formulação é para ser pelo menos reduzida.

Além disso, o uso de dissacarídeos também melhora as condições de armazenamento permitindo armazenamento de longo termo da formulação liofilizada num vasto intervalo de temperatura, incluindo condições de refrigeração e temperatura ambiente. 0 termo "estável" como usado aqui, por exemplo a expressão "uma formulação de ET-743 estável", refere-se a uma formulação que satisfaz características de estabilidade como registadas aqui e equivalentes destas, que não são possuídas por formulações convencionais e que 12 ΡΕ1658848 não são atingidas quando a formulação é preparada por metodologias de manufactura convencionais.

Exemplos de modelos de realização do presente invento são providenciados por novas composições farmaceu-ticamente aceitáveis compreendendo uma ecteinascidina tal como ET-743 e um dissacarideo.

Como notado na introdução, as ecteinascidinas foram amplamente descritas. Elas podem ter a seguinte fórmula geral (I) :

em que: R5 é OH, alcoxilo ou alcanoiloxilo; R6 é hidrogénio, alquilo, alquenilo ou arilo; R12 é hidrogénio, alquilo, alquenilo ou arilo; R16 é hidrogénio, alquilo, alquenilo ou arilo; 13 ΡΕ1658848 R17 é OH, alcoxilo ou alcanoiloxilo; R18 OH, alcoxilo ou alcanoiloxilo; R21 é H, OH ou CN ou aoutro grupo nucleofilico; e

Ra é hidrogénio e Rb é amino opcionalmente substituído, ou

Ra com Rb forma uma função carbonilo =0, ou

Ra, Rb e o carbono ao qual estão ligados formam um grupo tetrahidroisoquinolina.

Nestes compostos os substituintes podem ser seleccionados de acordo com a seguinte orientação:

Grupos alquilo e alcoxilo têm de preferência desde 1 até 12 átomos de carbono. Uma classe mais preferida de grupos alquilo e alcoxilo têm desde 1 até cerca de 6 átomos de carbono, e com mais preferência 1, 2, 3 ou 4 átomos de carbono. Metilo, etilo e propilo incluindo isopropilo são grupos alquilo particularmente preferidos nos compostos do presente invento. Metoxilo, etoxilo e propoxilo incluindo isopropoxilo são grupos alquilo particularmente preferidos nos compostos do presente invento. Uma outra classe mais preferida de grupos alquilo e alcoxilo tem desde 4 até cerca de 12 átomos de carbono, ainda com mais preferência desde 5 até cerca de 8 átomos de 14 ΡΕ1658848 carbono, e com maior preferência 5, 6, 7 ou 8 átomos de carbono. Como usado aqui, o termo alquilo, salvo modificação em contrário, refere-se a ambos os grupos ciclicos e não ciclicos, embora os grupos ciclicos compreendam pelo menos três carbonos no anel.

Grupos alquenilo e alquinilo preferidos nos compostos do presente invento têm uma ou mais ligações insaturadas e desde 2 até cerca de 12 átomos de carbono. Uma classe mais preferida de grupos alquenilo ou alquinilo tem desde 2 até cerca de 6 átomos de carbono, e com mais preferência 2,3 ou 4 átomos de carbono. Uma outra classe mais preferida de grupos alquenilo ou alquinilo tem desde 4 até cerca de 12 átomos de carbono, ainda com mais preferência desde 5 até 8 átomos de carbono, e com maior preferência 5, 6, 7 ou 8 átomos de carbono. Os termos alquenilo e alquinilo como usados aqui referem-se a ambos os grupos ciclicos e não cíclicos.

Grupos arilo adequados nos compostos do presente invento incluem compostos com um único anel ou múltiplos anéis, incluindo compostos com múltiplos anéis que contêm grupos arilo separados e/ou fundidos. Grupos arilo típicos contêm desde 1 até 3 anéis separados ou fundidos e desde 6 até cerca de 18 carbonos no anel. Grupos arilo especialmente preferidos incluem fenilo, naftilo, bifenilo, fenantrilo e antracilo substituídos ou não substituídos.

Grupos alcanoiloxilo e alcanoílo adequados têm 15 ΡΕ1658848 desde 2 até cerca de 20 átomos de carbono, com mais preferência desde 2 até cerca de 8 átomos de carbono, ainda com maior preferência desde 2 até cerca de 6 átomos de carbono, mesmo com maior preferência 2 átomos de carbono. Outra classe preferida de grupos alcanoiloxilo tem desde 12 até cerca de 20 carbonos, ainda com maior preferência desde 14 até cerca de 18 átomos de carbono, e com maior preferência 15, 16, 17 ou 18 átomos de carbono.

Os grupos mencionados acima podem ser substituídos numa ou mais posições disponíveis por um ou mais grupos adequdos tais como OR', =0, SR', SOR“, NO2, NHR~, N(R“)2, =N-R', NHCOR', N(COR')2, NHS02R^, CN, halogéneo, C(=0)R“, C02R~, 0C(=0)R' em que cada um dos grupos R' é independentemente seleccionado a partir do grupo consistindo de H, OH, N02, NH2, SH, CN, halogéneo, =0, C(=0)H, C(=0)CH3, C02H, Ci-Ci2 alquilo substituído ou não substituído, C2-Ci2 alquenilo substituído ou não substituído, C2—Ci2 alquinilo substituído ou não substituído ou arilo substituído ou não substituído. Substituintes halogéneo adequados aos compostos do presente invento incluem F, Cl, Br e I.

Compostos preferidos do invento são aqueles de fórmula geral (I) em que uma ou mais das definições seguintes se aplicam: R5 é um alcanoiloxilo; 16 ΡΕ1658848 R6 é metilo; R12 é metilo; R16 é metilo; R17 é metoxilo; R18 é OH; R21 é H, OH ou CN; e

Ra é hidrogénio e Rb é um grupo amido, ou

Ra com Rb formam =0, ou

Ra, Rb e o carbono ao qual estão ligados formam um grupo de fórmula (II):

Exemplos de compostos para o presente invento incluem ecteinascidinas naturais, tal como ecteinascidina 743 e outros compostos ecteinascidina fundidos através de uma ponte 1,4 revelados por exemplo em EUA 5 089 273, EUA 5 478 932, EUA 5 654 426, EUA 5 721 362, EUA 6 124 293, EUA 5 149 804, EUA 09/546 877, EUA 5 985 876 e WO 01/77115. 17 ΡΕ1658848 são particu-

Compostos da fórmula (II) seguinte larmente preferidos:

onde

Ra é hidrogénio e Rb é amido de fórmula -NHRf-onde Rf é alcanoílo, ou Ra com Rb forma =0, ou R% Rb e o carbono ao qual estão ligados formam um grupo de fórmula (II) :

Rd é alcanoílo; e R21 é H, OH ou CN. 18 ΡΕ1658848

Os grupos alcanoílo podem ser acetilo ou supe riores, por exemplo até C20 ·

Assim, compostos preferidos deste invento in cluem:

e compostos relacionados com diferentes grupos acilo. 19 ΡΕ1658848

Ecteinascidina 743, também conhecida como ET-743 ou ecteinascidina 743 é particularmente preferida.

Exemplos de dissacarideos adequados para as composições deste invento incluem lactose, trealose, sacarose e combinações destes. Exemplos adicionais de dissacarideos que podem ser usados nalguns modelos de realização deste invento incluem pelo menos um de entre maltose, isomaltose, celobiose, isosacarose, isotrealose, sorbose, turanose, melibiose, gentiobiose, e misturas destes. Sacarose é correntemente preferido.

Noutros modelos de realização do invento, a composição compreende uma ecteinascidina tal como ET-743 e um dissacarídeo isento de lactose. Noutros modelos de realização do invento, a composição compreende uma ecteinascidina tal como ET-743 e um dissacarídeo isento de trealose. Noutros modelos de realização do invento, a composição compreende uma ecteinascidina tal como ET-743 e um dissacarídeo isento de sacarose. Noutros modelos de realização do invento, a composição compreende uma ecteinascidina tal como ET-743 e um dissacarídeo isento de maltose. Noutros modelos de realização do invento, a composição compreende uma ecteinascidina tal como ET-743 e um dissacarídeo isento de isomaltose. Noutros modelos de realização do invento, a composição compreende uma ecteinascidina tal como ET-743 e um dissacarídeo isento de celobiose. Noutros modelos de realização do invento, a 20 ΡΕ1658848 composição compreende uma ecteinascidina tal como ET-743 e um dissacarídeo isento de isosacarose. Noutros modelos de realização do invento, a composição compreende uma ecteinascidina tal como ET-743 e um dissacarídeo isento de isotrealose. Noutros modelos de realização do invento, a composição compreende uma ecteinascidina tal como ET-743 e um dissacarídeo isento de sorbose. Noutros modelos de realização do invento, a composição compreende uma ecteinascidina tal como ET-743 e um dissacarídeo isento de turanose. Noutros modelos de realização do invento, a composição compreende uma ecteinascidina tal como ET-743 e um dissacarídeo isento de melibiose. Noutros modelos de realização do invento, a composição compreende uma ecteinascidina tal como ET-743 e um dissacarídeo isento de gentobiose.

Assim, nalguns modelos de realização, a composição deste invento contém menos do que 2% ou menos do que 1% ou menos do que 0,5% ou menos do que 0,2% ou menos do que 0,1% por peso de pelo menos um, ou de preferência de cada um de lactose, trealose, sacarose, maltose, isomaltose, celobiose, isosacarose, isoteralose, sorbose, turanose, melibiose, e gentiobiose.

Os termos "misturas destes" e "combinações destes" como usados aqui referem-se a pelo menos duas entidades que providenciam o antecedente para os termos "misturas destes" ou "combinações destes". Como ilustração, mas não como limitação, os termos "produtos compreendendo 21 ΡΕ1658848 pelo menos um dentre A, B, C, e misturas destes" referem-se a modelos de realização do produto para os quais qualquer uma das afirmações seguintes é satisfeita: A está no produto; B está no produto; C está no produto; A e B estão no produto; A e C estão no produto; B e C estão no produto; e A; B e C estão no produto.

Além disso, é para ser compreendido que termos tais como "reagir", "formar", e termos relacionados, aplicados aqui a uma entidade química referem-se a qualquer um dos seguintes: (a) a entidade quimica como tal, e (b) a entidade quimica na forma na qual tal entidade está presente no meio da reacção. De forma análoga, para nomear uma entidade quimica ou para dar a sua fórmula no contexto de uma operação ou passo de reacção, ou para a nomear ou dar a sua fórmula como estando num meio, quer seja sólido ou liquido, incluindo produtos, formulações, e combinações, refere-se aqui a qualquer uma das seguintes: (a) a entidade como tal, e (b) a entidade na forma na qual tal entidade está presente no meio. Por exemplo, nomear uma entidade quimica acidica aqui refere-se a forma ou formas sejam elas quais forem em que tal entidade está presente no contexto no qual é nomeada. Como ilustração, mas não como limitação, nomear a entidade quimica "cloreto de sódio" ou providenciar a sua fórmula quimica refere-se aqui à entidade NaCl como molécula diatómica, se tal for a forma sob a qual o cloreto de sódio está presente no meio relevante; refere-se também ao conjunto de espécies quimicas não dissociadas e/ou dissociadas se o cloreto de sódio no meio relevante 22 ΡΕ1658848 estiver inteira ou parcialmente dissociado, incluindo espécies em tal meio que estão solvatadas, são partes de cadeias, ou estão associadas com outras espécies, etc.

Qualquer composto referido aqui pretende representar tal composto especifico bem como certas variações ou formas. Em particular, compostos referidos aqui podem ter centros assimétricos e existir portanto em diferentes formas enantioméricas. Todos os isómeros ópticos e estereoisómeros dos compostos referidos aqui, e misturas destes, são considerados dentro do âmbito das formulações e metodologias deste invento. Assim qualquer composto referido aqui pretende representar qualquer um dos racematos, uma ou mais formas enantioméricas, uma ou mais formas diastereoméricas, uma ou mais formas atropisoméricas e misturas destes.

Além disso, compostos referidos aqui podem existir como isómeros geométricos (i.e., isómeros eis e trans), como tautómeros, ou como atropisómeros. Adicionalmente, qualquer composto referido aqui pretende representar hidratos, solvatos e polinorfos, e misturas destes quando tais formas existem no meio. Além disso, compostos referidos aqui podem existir nas formas marcadas com isótopos. Todos os isómeros geométricos, tautómeros, atropisómeros, hidratos, solvatos, polimorfos, e formas marcadas com isótopos dos compostos referidos aqui, e misturas destes, são considerados dentro do âmbito das formulações e metodologias deste invento. 23 ΡΕ1658848

Para providenciar uma descrição mais concisa, algumas das expressões quantitativas dadas aqui não estão classificadas com o termo "cerca de". É para ser compreendido que, quer o termo "cerca de" seja usado explici-tamente ou não, toda a quantidade dada aqui pretende referir-se ao valor real dado, e pretende também referir-se à aproximação a tal valor dado que seria razoável inferir com base na competência ordinária na arte, incluindo equivalentes e aproximações devidas às condições experimentais e/ou de medida para tal valor dado. A substância ou substâncias activas no contexto deste invento podem ser de origem natural, semi-sintética ou sintética, incluindo combinações de origens. Em modelos de realização onde a substância activa é uma ecteinascidina tal como ET-743, a ET-743 pode ser de origem natural, isolada por exemplo do tunicato do género Ecteinascidia, de preferência a espécie Esteinascidia turbinata. A ET-743 pode ser de origem sintética ou semi-sintética. É feita referência por exemplo a WO 0069862 e WO 0187895, sendo ambos incorporados na totalidade como referência. A proporção da substância activa para o agente de volume em modelos de realização deste invento é determinada de acordo com a solubilidade do agente de volume e, quando a formulação é liofilizada, também de acordo capacidade de liofilização do agente de volume. É considerado que esta proporção (p/p) pode ser de cerca de 1:1 nalguns modelos de 24 ΡΕ1658848 realização, cerca de 1% noutros modelos de realização, cerca de 1:10 até cerca de 1:1. É considerado que outros modelos de realização têm proporções tais como cerca de 1:10 até cerca de 1:X00, e ainda modelos de realização adicionais têm proporções tais no intervalo desde cerca de 1:100 até cerca de 1:1500. Quando o composto activo é ET-743, a proporção (p/p) de ET-743 para agente de volume é tipicamente desde cerca de 1:100 até cerca de 1:1500, de preferência desde cerca de 1:200 até cerca de 1:800, com mais preferência desde cerca de 1:250 até cerca de 1:600, e mesmo com maior preferência cerca de 1:400. O material liofilizado é usualmente apresentado num frasquinho que contém uma quantidade especifica de ecteinascidina ou composto activo. Quando o composto activo é ET-743, quantidades activas são ilustradas por 250 μρ e 1 mg. O presente invento não está limitado pelas formas ou designs específicos dos recipientes, desde que o recipiente seja aceitável para o uso pretendido e normas. Modelos de realização deste invento são fornecidas com uma formulação contida em frasquinhos, de preferência tubos.

As formulações liofilizadas deste invento podem ser reconstituídas e diluídas para dar uma composição deste invento na forma de uma solução pronta para injecção intravenosa. As quantidades reais do fluido reconstituinte não são características limitativas dos modelos de 25 ΡΕ1658848 realização deste invento. Como ilustrações, mas não como limitações, modelos de realização das formulações liofi-lizadas de acordo com este invento são reconstituídas com um volume de água. A maior parte de tais volumes não excedem cerca de 20 ml, com volumes preferidos estando no intervalo desde cerca de 1 ml até cerca de 15 ml, com mais preferência no intervalo desde cerca de 1 ml até cerca de 10 ml, e mesmo com maior preferência no intervalo desde cerca de 1 ml até cerca de 10 ml, e mesmo com maior preferência no intervalo desde cerca de 1 ml até cerca de 4 ml. Quando o modelo de realização da substância activa é ET-743, a solução reconstituída em tais modelos de realização contém uma concentração de ET-743 até 500 pg/ml, com concentrações até cerca de 50 pg/ml, cerca de 100 pg/ml, e cerca de 250 pg/ml a serem preferidas.

Modelos de realização reconstituídos do presente invento podem ainda ser diluídos se desejado, não sendo esta diluição adicional uma limitação do presente invento. Esta diluição adicional é de preferência levada a cabo com um sistema aquoso o qual é usualmente 0,9% de cloreto de sódio ou 5% de glucose. A solução reconstituída será diluída dependendo da concentração na solução reconstituída e da concentração desejada na solução diluída.

Modelos de realização de formulações de ET-743 de acordo com este invento podem ser usados no tratamento de uma variedade de cancros, incluindo o tratamento de qualquer dos sarcoma, leiomiossarcoma, lipossarcoma, 26 ΡΕ1658848 osteossarcoma, cancro de ovário, cancro da mama, melanoma, cancro colorectal, mesotelioma, cancro renal, cancro do endométrio e cancro do pulmão, e estados com uma pluralidade de tais formas de cancro. É para ser compreendido que "tratamento" neste contexto refere-se a uma acção que conduz a uma melhoria do estado(s) do cancro. Modelos de realização de formulações de ET-743 de acordo com este invento podem também ser usados no tratamento de estados refractários de cancro que não responderam favoravelmente a outros tratamentos. Além disso, modelos de realização de formulações de acordo com este invento podem ser usadas em ensaios com tecidos de laboratório, incluindo mas não estando limitados a ensaios clínicos, ensaios analíticos, e ensaios de modelação.

Modelos de realização deste invento que compreendem uma ecteinascidina tal como ET-743 são de preferência administrados por infusão. 0 passo de infusão é tipicamente repetido numa base cíclica, o qual pode ser repetido como apropriado durante por exemplo 1 a 20 ciclos. O ciclo inclui uma fase de infusão da formulação de ET-743, e usualmente também uma fase de não infusão de ET-743. Tipicamente o ciclo é realizado em semanas, e assim o ciclo compreende normalmente uma ou mais semanas de uma fase de infusão de ET-743, e uma ou mais semanas para completar o ciclo. É preferido um ciclo de 3 semanas, mas alternativamente pode ser de 1 até 6 semanas. A fase de infusão pode ela própria ser uma administração única em cada ciclo de digamos 1 a 72 horas, mais usualmente de cerca de 1, 3 27 ΡΕ1658848 ou 24 horas; ou uma infusão numa base diária na fase de infusão do ciclo durante preferencialmente 1 a 5 horas, especialmente 1 ou 3 horas; ou uma infusão numa base semanal na fase de infusão do ciclo durante preferencialmente 1 a 3 horas, especialmente 2 ou 3 horas. É preferida uma administração única no inicio de cada ciclo. De preferência o tempo de infusão é de cerca de 1, 3 ou 24 horas.

As soluções diluídas e reconstituídas exemplificam modelos de realização deste invento. Uma formulação que é reconstituída e diluída pode ser administrada de forma intravenosa usando os protocolos disponíveis. A dose será seleccionada de acordo com o esquema de dosagem, tendo atenção aos dados existentes em "Dose Limiting Toxicity", para os quais ver por exemplo WO 0069441, WO 0236135 e WO 0339571, e van Kesteren, Ch. et al., 2003, Anti-Cancer Drugs, 14 (7), 487-502. Estas três especificações de patente WO e este artigo de van Kesteren são incorporados como referência específica.

Protocolos de dosagem preferidos incluem: a) cerca de 1,5 mg/m2 de área superficial corporal, administrada como uma infusão intravenosa durante 24 horas com um intervalo de três semanas entre ciclos; b) cerca de 1,3 mg/m2 de área superficial corporal, administrada como uma infusão intravenosa durante 3 horas com um intervalo de três semanas entre ciclos; 28 ΡΕ1658848 c) cerca de 0,580 mg/m2 de área superficial corporal, administrada semanalmente como uma infusão intravenosa durante 3 horas durante 3 semanas e uma semana de repouso.

Uma ecteinascidina tal como ET-743 pode ser usada em combinação com outra droga. Por exemplo, pode ser administrada com outra droga antitumoral. O leitor é referido à lista na WO 0069441 e WO 0236135, sendo ambos incorporados aqui como referência especifica. Exemplos de tais outras drogas incluem doxorubicina, cisplatina, paclitaxel, carboplatina, doxorubicina liposomal pegilada, docetaxel, capecitabina, e gemcitabina. Podem ser usados fármacos com outros modos de acção, incluindo dexametasona. Administração de outro fármaco pode ser antes, durante ou depois da administração de ecteinascidina tal como ET-743.

Modelos de realização de formulações deste invento que contêm uma ecteinascidina tal como ET-743 podem ser feitos por liofilização de uma composição deste invento na forma de uma solução global incluindo a ecteinascidina e dissacarideo. Usualmente a solução global será tamponizada, por exemplo a um pH de cerca de 4. Agentes tamponizantes adequados incluem tampão fosfato e tampão citrato. Podem ser usados outros tampões possíveis, tais como tampão fosfato/citrato (uma mistura de tampão fosfato e tampão citrato), tampão lactato, tampão ascorbato, tampão tartá-rico/citrato, tampão bicarbonato/ácido clorídrico, tampão 29 ΡΕ1658848 acetato, tampão succinato e tampão glicina/ácido clorídrico. Podem ser usadas misturas de tampões. Tampões biocompatíveis que permitem o controle de pH a uma valor desejado providenciam modelos de realização adicional deste invento.

Podem ser incluídos outros componentes na solução global, por exemplo agentes tensioactivos tais como mono-oleato de polioxietileno 20-sorbitano ou estearato de poli-oxilo 40. Outros agentes tensioactivos possíveis incluem fosfolípidos, tal como lecitina; copolímeros de polioxieti-leno-polioxipropileno, tal como tensioactivo Pluronic; ésteres polioxietileno do ácido 1,2-hidroxiesteárico, tal como tensioactivo Solutol; etoxilatos de colesterol, tal como diacilglicerol, dialquilglicerol; sais biliares, tais como colato de sódio, deoxicolato de sódio; ésteres de sacarose, tais como monolaurato de sacarose, mono-oleato de sacarose; polivinilpirrolidona (PVP); ou álcool poli-vínilico (PVA). A formulação é normalmente distribuída como um frasquinho contendo o produto liofilizado. Esta forma de distribuição, não é, contudo, uma limitação do presente invento. Para fornecer um frasquinho contendo o produto liofilizado, a solução global é adicionada ao frasquinho e liofilizada. Como mencionado aqui, outro objectivo do presente invento é o de fornecer um processo para melhorar a solubilidade de uma ecteinascidina tal como ET-743 de modo a aumentar a concentração de ecteinascidina na solução 30 ΡΕ1658848 e reduzir o volume de enchimento nos fresquinhos antes de prosseguir com o processo de liofilização. Esta metodologia desenvolvida no contexto do presente invento permite a manufactura de modelos de realização da solução global com concentração de substancia activa que é superior àquela obtida de acordo com metodologias convencionais. Volumes de enchimento reduzidos quando comparados com a formulação convencional com manitol são assim obtidos com a presente metodologia. Esta redução de volumes de enchimento permite poupar tempo e energia durante o passo de liofilização. Além disso, existe também uma diminuição do risco de decomposição de ET-743, particularmente na secagem secundária.

Como notado acima, a ET 743 tem solubilidade aquosa limitada, ver por exemplo van Kesteren, Ch., et al., 2003, Anti-cancer Drugs, 14 (7), páginas 487-502. Metodologias convencionais cuidam disto por ajuste do pH do meio a 4 com tampão, para solubilizar a ET 743. Este controle de pH é convencionalmente conseguido com um tampão fosfato 0,05 M a pH 4. Verificou-se no contexto deste invento que a solubilidade de ET-743 é melhorada na solução global formando uma pré-solução de ET-743 num ácido. Com esta pré-dissolução a concentração de ET-743 na solução global e frasquinho pode ser aumentada e o volume de enchimento e o volume de enchimento nos frasquinhos pode ser reduzido. Nestes modelos de realização do presente invento, o volume de enchimento é usualmente reduzido em cerca de 80%, relativamente ao volume de enchimento convencional. Como ilustração, mas não como limitação, 31 ΡΕ1658848 modelos de realização deste invento proporcionam um volume de enchimento de 1 ml para um frasquinho consistindo de 0,25 mg de ET-743, e 4 ml para um frasquinho contendo 1 mg de ET-743. O volume de enchimento pode opcionalmente ser ainda mais reduzido noutros modelos de realização deste invento aumentando a concentração de ET-743. A metodologia convencional compreendia a dissolução de ET-743, manitol e tampão fosfato 0,05 M a pH 4 junto com água para injecção; a solubilidade da solução global foi limitada devido à baixa solubilidade de ET-743 neste meio. Verificou-se no contexto do presente invento que pré-tratamento de ET-743 numa solução ácida melhora a solubilidade de ET-743 e permite ter soluções globais com concentrações mais elevadas de ET-743. Assim, o presente invento proporciona processos úteis para melhorar a solubilidade de ET-743 na solução global que compreende a dissolução de ET-743 em meio ácido, misturar o meio com ET-743 com outros componentes da solução global, e, opcionalmente ajustar o pH. Nalguns modelos de realização ilustrativos deste invento, mas não limitativos, o ajuste de pH é realizado com um tampão fosfato. O meio ácido não contém substancialmente componentes tampão, e consiste usualmente em ácido aquoso.

Modelos de realização ilustrativos da solução global para liofilização de acordo com o presente invento são proporcionados por uma solução de ET-743 tamponizada a pH 4 com di-hidrogenofosfato de potássio e ácido fosfórico com sacarose como agente de volume. 32 ΡΕ1658848

Um modelo de realização ilustrativo da metodologia de acordo com este invento é fornecido como se segue: ET-743 é dissolvido em ácido fosfórico 0,1 N. Depois água para injecção ("WFI"), di-hidrogenofosfato de potássio, sacarose e ET-743 (pré-dissolvido em ácido fosfórico 0,1 N) são misturados. A dissolução é visualmente confirmada antes de continuar, e a dissolução é considerada completa quando isso é constatado visualmente. O pH da solução é verificado e ajustado a um valor no intervalo desde cerca de 1 até cerca de 5, com mais preferência no intervalo desde cerca de 2 até cerca de 4,5, ainda com maior preferência no intervalo desde cerca de 3 até cerca de 4,5, e com maior preferência a um pH de cerca de 4,0 por adição lenta de um ácido adequado. Um modelo de realização preferido de tal ácido é ácido fosfórico, caso em que uma concentração preferida é de cerca de 0,1 N. Uma base adequada é opcionalmente adicionada para controle de pH. Um modelo de realização preferido de tal base é hidróxido de potássio, de preferência em solução, caso em que uma concentração preferida é cerca de 0,1 N. O volume é finalmente ajustado por adição de um fluido adequado biocompativel, de preferência WFI. A solução global é então deitada em frasquinhos de acordo com a dose desejada. A liofilização é levada a cabo nalguns modelos de realização deste invento usando tempos de secagem secundária reduzidos. Um protocolo preferido envolve arrefecimento a uma temperatura de cerca de -40°C, secagem 33 ΡΕ1658848 primária a 40 até 80 pbar durante 10 até 50 horas, e secagem secundária a uma pressão inferior e acima de 0°C durante 10 a 50 horas. Noutros protocolos no contexto deste invento é realizado o arrefecimento a temperaturas abaixo de -40°C.

Modelos de realização deste invento compreendem liofilização por arrefecimento do produto abaixo dos -40°C. A secagem primária é realizada a uma temperatura desde cerca de -20°C até cerca de -26°C e uma pressão de cerca de 60 μbar durante aproximadamente 15 até 40 horas. A secagem secundária é realizada a uma temperatura desde cerca de 20°C até cerca de 30°C e uma pressão de cerca de 100 pbar durante aproximadamente 20 a 40 horas.

Modelos de realização de formulações liofilizadas deste invento são adequados para armazenamento a temperaturas significativamente mais elevadas do que as temperaturas de armazenamento da formulação convencional. Exemplos de temperaturas de armazenamento para formulações de acordo com este invento estão à volta dos +5°C. Estas temperaturas são facilmente proporcionadas por frigoríficos ordinários.

FIGURAS DO INVENTO

Figura 1. Estudo de estabilidade comparativa. Avaliação da pureza de ET-743 após 6 meses de armazenamento a 5°C. 34 ΡΕ1658848

Figura 2. Estudo de estabilidade comparativa. Avaliação da pureza de et-743 após 12 meses a 5°C.

Figura 3. Produção da impureza ET-701 em diferentes formulações armazenadas durante 9 meses a 5°C.

Figura 4. Evolução comparativa da % pureza de ET-743 das novas formulações e 3 lotes da formulação de referência armazenadas durante 3 meses a 5°C.

Figura 5. Produção da impureza ET-701 em diferentes formulações armazenadas durante 3 meses a 5°C.

Figura 6. Evolução comparativa da % pureza de ET-743 das novas formulações e 3 lotes da formulação de referência armazenadas durante 3 meses a 25°C/65% HR.

Figura 7. Produção da impureza ET-701 em diferentes formulações armazenadas durante 3 meses a 25°C/65% HR.

Figura 8. Evolução comparativa da % pureza de ET-743 das novas formulações armazenadas a 40°C/70% HR durante 3 meses.

Figura 9. Evolução comparativa da % pureza de ET-743 das novas formulações armazenadas a 40°C/70% HR durante 3 meses. ΡΕ1658848 35

EXEMPLOS

Exemplo 1

Este exemplo revela um estudo de estabilidade comparativa de 8 novas formulações com a formulação convencional de ET-743 (com manitol). A lactose e sacarose foram usadas para ilustrar o presente invento. Foi feita uma formulação de referência usando manitol. Foram tentados outros agentes de volume conhecidos tal como dextrano (Dextrano 40) e povidona (Kolidon 12, PVP) para comparação. Agentes tensioactivos estearato de polioxilo 40 (Mirj 45) ou mono-oleato de polioxietileno 20-sorbitano (Polisorbato 80) foram usados nalgumas formulações, e o tampão foi omitido nalgumas formulações.

Foram preparadas soluções globais e liofilizadas por um procedimento padrão. Foi preparado um volume de 150 ml de cada formulação. A quantidade de fosfato de potássio para a solução final (1,02 g) foi pesada e dissolvida em 90% de volume final (135 ml) de água. Então, o pH foi ajustado a pH 4,0 com ácido fosfórico 0,1 N.

Foram adicionadas 7,85 mg de ET-743 a um recipiente de vidro de fazer misturas e dissolvidos por agitação magnética em 2/3 do volume (90 ml) da solução de fosfato de potássio durante aproximadamente 1 h (a dissolução foi verificada visualmente). 36 ΡΕ1658848 A quantidade de agente de volume e tensioactivos foram adicionadas e dissolvidos em 1/3 do volume de solução de fosfato de potássio.

Depois a solução foi adicionada à solução de ET-743 e a agitação foi mantida durante mais 1 hora. A solução foi levada ao peso final com água (foi adoptada uma densidade de 1,019 g/cc para todas as formulações). A solução foi filtrada através de um filtro de celulose de 0,22 pm. A solução foi deitada em frasquinhos de vidro de 25 ml a 5 ml/frasquinho e mantida a -20°C até ao processo de liofilização. A liofilização foi realizada de acordo com a tabela I seguinte:

Tabela I

Tempo de congelamento a -48°C 4h Secagem primária 48 h Secagem secundária 44h

Após liofilização, os frasquinhos foram selados. 37 ΡΕ1658848

Os frasquinhos foram transferidos para uma área refrigerada (-20°C). A composição para cada frasquinho foi como se segue (Tabela II), notando que a água evapora durante o processo de liofilização.

Tabela li

Referência Sacarose Dextrano PVP Lactose ET-743 0,250 mg 0,250 mg 0,250 mg 0,250 mg 0,250 mg Manitol 250 mg Sacarose 500 mg Dextrano 40 500 mg Kolidon 12 375 mg Lactose 500 mg Di-hidrogenofos-fato de potássio 34 mg 34 mg 34 mg 34 mg 34 mg Acido Fosfórico q.s. pH 4,0 q.s. pH 4,0 q.s. pH 4,0 q.s. pH 4,0 q.s. pH 4,0 Agua para injecção q.s. 5 ml q.s. 5 ml q.s. 5 ml q.s. 5 ml q.s. 5 ml

Tabela II (cont.) ET-poli80 ET-mirj ET-poli80sac ET-tampão p80sacun ET-743 0,250 mg 0,250 mg 0,250 mg 0,250 mg Manitol 250 mg 250 mg Sacarose 500 mg 500 mg Polisorbato 80 50 mg 50 mg 50 mg Mirj 45 50 mg Di-hidrogenofosfato de potássio 34 mg 34 mg 34 mg Acido Fosfórico q.s. pH 4,0 q. s.pH 4,0 q.s. pH 4,0 Água para injecção q.s. 5 ml q.s. 5 ml q.s. 5 ml q.s. 5 ml 38 ΡΕ1658848 0 teste de estabilidade foi realizado a uma temperatura de 5±3°C. A avaliação da pureza de nove formulações a 5°C durante 3 meses está mostrada na Tabela iii e Figura 1. No caso de formulações apresentando uma estabilidade mais elevada (Referência, Sacarose, Lactose e ET-poli80sac), o teste de estabilidade foi prolongado até aos 9 meses, e no caso de formulações de Lactose e Sacarose o teste de estabilidade foi mesmo prolongado até aos 12 meses devido à sua estabilidade mais elevada. Os dados na Tabela III e Figura 2 mostram que as formulações contendo sacarose e lactose apresentam uma estabilidade melhorada com uma diminuição na pureza de apenas 2%. Esta diminuição é significativamente mais baixa do que a diminuição observada nas outras formulações ensaiadas.

Tabela III ET-743 pureza (%) Referência Sacarose Lactose ET-poli80sac Antes de liofilizar 98,04 98, 34 98,06 97,96 t=0 97,67 98, 15 97,21 97,85 1 mês 96,06 96, 89 96,35 97,72 3 meses 94,37 96, 64 95,33 97,58 6 meses 92,81 97, 01 94,07 95,98 9 meses 88,17 95,36 94,83 96,01 12 meses 96,31 95,22 39 ΡΕ1658848

Tabela III (cont.) ET-743 pureza (%) Dextrano PVP ET-poli80 ET-mirj ET-tampão p80sacun Antes de liofilizar 96,18 97,62 96, 45 97,46 97,45 t=0 94,64 93,72 92,46 96,36 95,80 1 mês 93,42 91,96 89,38 94,36 91,84 3 meses 84,90 90,40 81,18 85,31 88,46

Como se mostra na Tabela IV e Figura 3, o produto principal de degradação da formulação de referência, ET-701, foi dramaticamente reduzido quando ET-743 foi formulado na presença de sacarose ou lactose.

Tabela iv ET-701 pureza (%) Referência Sacarose Lactose ET-poli80sac O II -P 0,188 0,066 0,060 0,050 1 mês 0,533 0,063 0,076 0,060 3 meses 0,890 0,057 0,054 0,050 6 meses 1, 732 0,050 0,062 0,050 9 meses 3,225 0,050 0,050 0,050

Verificou-se no contexto deste invento que os dissacarideos melhoram a estabilidade de ET-743 quando comparados com manitol. Modelos de realização de tais dissacarideos incluem lactose, sacarose e misturas destes. A estabilidade das formulações compreendendo dissacarideos 40 ΡΕ1658848 é também melhorada em comparação com outras formulações contendo outros agentes de volume convencionais tais como dextrano e povidona. Modelos de realização de formulações de dissacarideos de acordo com este invento foram determinadas como estáveis durante pelo menos 12 meses a 5°C. Modelos de realização de formulações de acordo com este invento têm um teor em impurezas que é reduzido de forma significativa relativamente ao das formulações convencionais. A presença de ET-701 está assim reduzida. Modelos de realização deste invento compreendem pelo menos um tensio-activo, tal como Polisorbato 80. Estes modelos de realização apresentam propriedades de solubilidade de ET-743 e características de estabilização favoráveis. A presença de pelo menos um agente tensioactivo, contuso, não é uma caracteristica limitativa deste invento, e outros modelos de realização não compreendem tal(is) agente(s).

Exemplo 2 O objectivo deste estudo foi o de comparar a estabilidade da formulação padrão de ET743 com cinco novas formulações. O estudo avaliou a estabilidade das formulações a +5°C. A composição das formulações testadas foi a seguinte (Tabela V), notando que a água evapora durante o processo de liofilização. 41 ΡΕ1658848

Tabela v

Referência ETtreal ETP80treal ETP80treal 250 ETP80sac 250 ETP80 treal-gli 250 ET-743 0,250 mg 0,250 mg 0,250 mg 0,250 mg 0,250 mg 0,250 mg Manitol 250 mg Trealose 500 mg 100 mg 100 mg 200 mg Sacarose 100 mg Polisorbato 80 10 mg 10 mg 10 mg 150 mg Glicina 15 mg Di-hidrogenofos-fato de potássio 34 mg 34 mg 34 mg 6,8 mg 6,8 mg Ácido fosfórico q.s. pH 4,0 q.s. pH 4,0 q.s. pH 4,0 q.s. pH 4,0 q.s. pH 4,0 Ácido clorídrico q.s. pH 4,5 Água para injecção q. s. 5 ml q.s. 5 ml q.s. 5 ml q.s. 1 ml q.s. 1 ml q.s. 1 ml

As soluções globais foram preparadas e liofili-zadas usando os seguintes protocolos particulares:

Formulações ETtreal, ETP80treal e Referência

Uma massa de 100 g de cada formulação foi preparada como se segue: A quantidade de fosfato de potássio para a solução final foi pesada e dissolvida em 90% de volume final (90 ml) de água. Depois, o pH foi ajustado a pH 4,0 com ácido fosfórico. A quantidade de ET-743 (5,0 mg) foi adicionada a um recipiente de vidro de fazer misturas e dissolvida por agitação magnética em 2/3 do volume (60 ml) da solução de fosfato de potássio durante aproximadamente 1 h (a dissolução foi verificada visualmente). 42 ΡΕ1658848

As quantidades de agente de volume e tensio-activos foram adicionados e dissolvidos em 1/3 do volume de solução de fosfato de potássio.

Depois a solução foi adicionada à solução de ET-743 e a agitação foi mantida durante mais 1 hora. A solução foi levada ao peso final com água. A solução foi filtrada através de um filtro de celulose de 0,22 pm, tomando uma aliquota antes da filtração para IPC. A solução foi deitada em frasquinhos de 25 ml a 5 ml/frasquinho e mantida a -20°C até ao processo de liofilização.

Formulações ETP80sac250, ETP80treal250, ETP80-trealgli250

Uma massa de 30 g de cada formulação foi preparada como se segue: A quantidade de fosfato de potássio ou glicina para a solução final foi pesada e dissolvida em 90% de volume final (27 ml) de água. Depois, o pH foi ajustado a pH 4,0 com ácido fosfórico 0,1 N ou HC1 0,1 N. A quantidade de polisorbato 80 foi pesada e adicionada a 1/3 do volume de solução tampão. 43 ΡΕ1658848 A quantidade de ET-743 (7,5 mg) foi adicionada a um recipiente de vidro de fazer misturas e dissolvida por agitação magnética em 2/3 do volume (60 ml) da solução de fosfato de potássio durante aproximadamente 1 h (a dissolução foi verificada visualmente). A quantidades de agente de volume foi adicionada e dissolvida em 2/3 do volume de solução tampão. Depois a solução foi adicionada à solução de ET-743 e a agitação foi mantida durante 10 min. A solução foi levada ao peso final com água. A solução foi filtrada através de um filtro de celulose de 0,22 μπι. A solução foi deitada em frasquinhos de 10 ml a 1 ml/frasquinho e mantida a -20°C até ao processo de liofilização. O processo de liofilização em todas as seis formulações foi realizado de acordo com a tabela VI seguinte:

Tabela VI

Tempo de congelamento a -48°C 2h 30 min Secagem primária 29 h Secagem secundária 36h 44 ΡΕ1658848

Após liofilização, os frasquinhos foram selados. Os frasquinhos foram transferidos para uma área refrigerada (-20°C). 0 teste de estabilidade foi realizado a uma temperatura de 5+3°C.

Todas as formulações eram mais estáveis a 5°C do que a formulação de referência. Não se notaram grandes diferenças entre as novas formulações. A Tabela VII revela a pureza cromatográfica da ET-743 das formulações em estudo.

Tabela VII ET-743 pureza (%) Referência ET ETP80 ETP80 ETP80 ETP80treal- treal treal Treal 250 Sac 250 gli 250 Antes da filtração 98,63 98,30 97,10 97,67 97,22 98,3 Depois da filtração 98,62 98, 46 97,27 97,67 97,06 98, 46 Após lio-filização 97,96 98,18 97,65 97,37 97,79 98,18 1 mês 97,35 98,22 97, 78 96,39 97, 40 98,22 3 meses 97,65 98,53 98,25 96,61 96, 66 98,53 6 meses 95,28 97,38 98,93 97,01 97,06 97,38

Exemplo 3

Seis formulações ET-NF A, ET-NF B, ET-NF C, ET-NF D, ET-NF E e ET-NF F foram manufacturadas e usadas para estudo adicional de estabilidade a diferentes temperaturas. 45 ΡΕ1658848 A sacarose e lactose foram seleccionadas como agente de volume. Foram usados dois tampões diferentes: tampão citrato de sódio 0,1 M pH 4 e fosfato de potássio 0,05 M tampão pH 4,0. Foram testadas duas concentrações diferentes de ET-743 na solução global: 0,250 mg/ml e 0,100 mg/ml. Foram usados dois ciclos de liofilização diferentes dependendo do volume de enchimento (4 ml vs 10 ml). Um lote de pelo menos 125 frasquinhos foi manufacturado para cada formulação.

Para cada frasquinho a composição da solução global foi como se segue (Tabela VIII), notando que a água evapora durante o procedimento de liofilização:

Tabela VIII ET-NF A ET-NF B ET-NF C ET-NF D ET-NF E ET-NF F Ingrediente ET-743 1 mg 1 mg 1 mg 1 mg 1 mg 1 mg Sacarose 400 mg _ _ 1000 mg 1000 mg _ Lactose _ 400 mg 1000 mg _ _ 200 mg Acido cítrico mono-hidratado 43,6 mg 43, 6 mg 109 mg 109 mg - 43,6 mg Citrato de sódio di-hidratado 45,12 mg 45,12 mg 112,8 mg 112,8 mg - 45,12 mg Di-hidrogenofos-fato de potássio - - - - 68 mg - Ácido fosfórico _ _ _ _ q.s. pH 4 _ Água para injecção 4 ml 4 ml 10 ml 10 ml 10 ml 4 ml 46 ΡΕ1658848

As soluções globais foram preparadas e liofilizadas usando os protocolos particulares seguintes:

Formulações ET-NF A, ET-NF B e ET-NF F

Preparação de 2L de ácido citrico aproximadamente 0,2 M: 76,96 g de ácido citrico foram dissolvidos num balão volumétrico de 2L e o volume foi completado com água para injecção. A molaridade final da solução de ácido citrico foi de 0,183 M.

Preparação de 2L de citrato de sódio aproximadamente 0,2 M: 117,64 g de citrato de sódio foram dissolvidas num balão volumétrico de 2L e o volume foi completado com água para injecção. A molaridade final da solução de citrato de sódio foi de 0,175 M.

Preparação de 4L de tampão citrato pH 4 aproximadamente 0,1 M: 1125 mL de solução de ácido citrico 0,2M foram misturados com 875 mL de solução de citrato de sódio 0,2 M num balão volumétrico de 4 L. O volume final foi completado com água para injecção. O pH da solução foi verificado e ajustado a pH 4. a molaridade final da solução de tampão citrato foi de 0,089 M. 143,83 mg de ET-743 foram adicionadas a um recipiente de vidro de fazer misturas e dissolvida por agitação magnética em aproximadamente 80% do volume total requerido de tampão citrato aproximadamente 0,1 durante 47 ΡΕ1658848 aproximadamente 1 h (a dissolução foi verificada visualmente) .

Depois, a quantidade de sacarose ou lactose (55 g de sacarose na formulação A e B, e 27,5 g de lactose na formulação F) foi adicionada e a mistura foi agitada durante um período adicional de aproximadamente 1 h até dissolução.

Após verificar o pH, o volume final foi completado adicionando tampão citrato 0,1 M pH 4. O reajuste a pH 4 com ácido cítrico foi necessário para a formulação A. Densidade da solução final: 1,04 g/1. Peso final 572 mg. A solução foi filtrada através de um filtro de PVDF de 0,22 μιη. A solução foi deitada em frasquinhos de 25 ml usando uma bomba automática e tubo de silicone-platina de 3,2 mm. O volume de enchimento padrão foi de 4 ml. O volume de enchimento foi verificado a intervalos regulares (cada 15 frasquinhos), e o volume de enchimento ajustado se necessário. Após enchimento foram colocadas tampas de lio-filização e os frasquinhos foram colocados no liofilizador a 5°C. O processo de liofilização foi realizado de acordo com a tabela IX seguinte: ΡΕ1658848 48

Tabela IX

Ciclo Passo Pressão Ponto fixo T (°C) Declive (min) Tempo de espera Carregament o Colocação Ta atm 5°C Arrefecimento Arrefecer 1 atm -50°C 1H 50 min 0,5°C/min Arrefecer 2 atm -50°C 6h Vácuo Vácuo 0,5 mb Sublimação 1° secagem 0,080 mb -27°C 45 min 0,5°C/min 1° secagem 0,080 mb -27°C 58 h 2â secagem 2° secagem <0,020 mb 25°C 3h 30 min 0,25°C/min 2° secagem <0,020 mb 25°C 40 h Paragem 0,010 mb 25°C

Os frasquinhos foram selados. Foi realizada um ajuste final. Os frasquinhos foram transferidos para uma área refrigerada (-20°C) .

Formulações ET-NF C e ET-NF D

Preparação de 1L de ácido citrico aproximadamente 0,2 M: 38,48 g de ácido cítrico foram dissolvidos num balão volumétrico de 1L e o volume foi completado com água para injecção. A molaridade final da solução de ácido cítrico foi de 0,183 M.

Preparação de 1L de citrato de sódio aproximadamente 0,2 M: 58,82 g de citrato de sódio foram dissolvidos num balão volumétrico de 1L e o volume foi completado com água para injecção. A molaridade final da solução de citrato de sódio foi de 0,175 M. 49 ΡΕ1658848

Preparação de 2L de tampão citrato pH 4 aproxi-madamente 0,1 M: 850 mL de solução de ácido cítrico 0,2M foram misturados com 650 mL de solução de citrato de sódio 0,2 M num balão volumétrico de 2 L. O volume final foi completado com água para injecção. O pH da solução foi verificado e ajustado a pH 4. A molaridade final da solução de tampão citrato foi de 0,089 M. 141,21 mg de ET-743 foram adicionadas a um recipiente de vidro de fazer misturas e dissolvida por agitação magnética em aproximadamente 80% do volume total de tampão citrato 0,1 M aproximadamente 1 h (a dissolução foi verificada visualmente). A quantidade de sacarose ou lactose (135 g) foi adicionada e a mistura foi agitada durante um período adicional de aproximadamente 1 h até dissolução.

Após verificar o pH, o volume final foi completado adicionando tampão citrato 0,1 M pH 4. Não foi necessário reajuste de pH. Densidade da solução final: 1,04 g/1. Peso final 1404 mg. A solução foi filtrada através de um filtro de PVDF de 0,45 pm.

A solução foi deitada em frasquinhos de 25 ml usando uma bomba automática e tubo de silicone-platina de 3,2 mm. O volume de enchimento padrão foi de 10 ml. O 50 ΡΕ1658848 volume de enchimento foi verificado a intervalos regulares (cada 15 frasquinhos), e o volume de enchimento ajustado se necessário. Após enchimento foram colocadas tampas de liofilização e os frasquinhos foram colocados no liofi-lizador a 5°C. O processo de liofilização foi realizado como anteriormente para as formulações et-NF a, ET-NF b e et-nf F (Tabela IX).

Devido ao volume grande nos frasquinhos, o ciclo proposto não produziu uma liofilização adequada e ocorreu um colpaso.

Para evitar nova manufactura, todos os frasquinhos foram reconstituídos com 10 ml de água purificada, o perfil de pureza de algumas soluções reconstituídas foi verificado, as tampas foram substiuídas por tampas com dois furos e foi usado o novo ciclo seguinte (Tabela X):

Tabela X

Ciclo Passo Pressão Ponto fixo Declive (min) Tempo de H o O espera Arrefecer 2 atm -50°C 6h Vácuo Vácuo 0,5 mb Sublimação 1° secagem 0,080 mb -23°C 45 min 0,5°C/min 1° secagem 0,080 mb -23°C 80 h 2a secagem 2o secagem <0,020 mb 0°C lOh 0,045°C/min 2o secagem <0,020 mb 25°C 62h 0,006°C/min Paragem 0,010 mb 25°C 51 ΡΕ1658848

Após liofilização, os frasquinhos foram selados. Foi realizada um ajuste final. Os frasquinhos foram transferidos para uma área refrigerada (-20°C) .

Formulação ET-NF E 141,21 mg de ET-743 (7,5 mg) foram adicionadas a um recipiente de vidro de fazer misturas e dissolvidas por agitação magnética em 1080 ml wfi + 3240 mL de ácido fosfórico IN durante aproximadamente 1 h (a dissolução foi verificada visualmente).

As quantidades de sacarose (135 g) e fosfato de potássio (9,18 g) foram adicionadas e a mistura foi agitada durante um período adicional de aproximadamente 1 hora até total dissolução da molécula.

Depois de verificar o pH e reajustar a pH 4 com ácido fosfórico IN, a solução foi levada ao volume final adicionado água para injecção. Densidade da solução final: 1,04 g/1. Peso final 1404 mg. A solução foi filtrada através de um filtro PVDF de 0,45 μιη. A solução foi deitada em frasquinhos de 25 ml 52 ΡΕ1658848 usando uma bomba automática e tubo de silicone-platina de 3,2 mm. 0 volume de enchimento padrão foi de 10 ml. O volume de enchimento foi verificado a intervalos regulares (cada 15 frasquinhos), e o volume de enchimento ajustado se necessário. Após enchimento foram colocadas tampas de liofilização e os frasquinhos foram colocados no liofili-zador a 5°C. O processo de liofilização foi realizado como anteriormente para as formulações ET-NF A, ET-NF B e ET-NF F (Tabela IX).

Devido ao volume grande nos frasquinhos, o ciclo proposto não produziu uma liofilização adequada e ocorreu um colapso.

Para evitar nova manufactura, todos os frasquinhos foram reconstituídos com 10 ml de água purificada, o perfil de pureza de algumas soluções reconstituídas foi verificado, as tampas foram substituídas por tampas com dois furos e foi usado o novo ciclo como no caso das formulações ET-NF C e ET-NF D (Tabela X).

Após liofilização, os frasquinhos foram selados. Foi realizada um ajuste final. Os frasquinhos foram transferidos para uma área refrigerada (-20°C) . 53 ΡΕ1658848 A concentração desejada de ET-743 foi atingida em todos os casos e o perfil de impurezas foi similar entre as formulações. Não foram observadas diferenças na concentração de ET-743 e perfis de impurezas durante a amnufac-tura (antes e depois da filtração, ou após enchimento). A cor da solução global era ligeiramente amarelada naquelas formulações que continham lactose.

As formulações com enchimento de 4 ml ou enchimento de 10 ml foram inicialmente liofilizadas seguindo o protocolo indicado. Enquanto as formulações com enchimento de 4 ml foram correctamente liofilizadas, as formulações com 10 ml de enchimento entraram em colapso. Uma variação de pressão na secagem secundária indicou colapso e fervura do bolo liofilizado. Os frasquinhos das formulações ET-NF C, ET-NF D e ET-NF E foram reconstiuidos com 10 ml de água purificada. O perfil de pureza das formulações foi verificado. Como não se observou modificação no perfil de pureza em comparação com as soluções globais, foi decidido voltar a liofilizar os frasquinhos usando o ciclo de liofilização revisto indicado. Os lotes liofilizados como descrito, tinham bom aspecto sem colapso mas com alguma contracção no fundo. O teor de ET-743 dos frasquinhos estava dentro das especificações (95%—105%). Os perfis de impurezas mostraram semelhanças entre formulações e aqueles perfis são comparáveis com impurezas de soluções globais. O teor 54 ΡΕ1658848 de água residual era inferior ou igual a 2% com os valores maiores a serem os das formulações de 10 ml de enchimento. O pH das soluções reconstituídas estava entre pH 4 e pH 4,2 em todos os casos. As soluções eram limpidas e incolores sem matéria estranha visivel ou precipitação. O tempo de reconstituição era similar para todas as formulações e inferior a 30 s.

Exemplo 4 O objectivo deste estudo foi o de identificar a estabilidade de ET-743 nas diferentes formulações Et-NF A, ET- NF B, ET-NF C, ET-NF D, ET-NF E, e ET-NF F a 1 mg/frasquinho em diferentes condições de temperatura.

Um lote de 130 frasquinhos de cada formulação ET-NF A, ET- NF B, ET-NF C, ET-NF D, ET-NF E, e ET-NF F, 1 mg de ΕΤ-743/frasquinho, foi manufacturado de acordo com o exemplo 3. O teste de estabilidade foi realizado a uma temperatura de 5°C, 25°C/65% HR e 40°C/70% HR. A Figura 4 e a tabela XI mostram a evolução da pureza de ET-743 das novas formulações durante o armazenamento a 5°C, em comparação com três formulações convencionais (contendo ET-743, manitol e tampão fosfato). ΡΕ1658848 55

Tabela XI ET-743 pureza (%) Referência 1 Referência 2 Referência 3 ET-NF A ET-NF B t=0 97, 70 96,90 97, 70 99, 06 99, 00 1 mês 94, 70 94,60 94,00 99, 28 98, 86 2 meses 93,80 92,70 93,70 99,21 98, 97 3 meses 92,50 91,00 91,20 99,22 98, 88

Tabela xi (cont.) ET-743 pureza (%) ET-NF C ET-NF D ET-NF E ET-NF F t=0 98, 83 98, 98 99,15 98,88 1 mês 98,53 99, 03 99,14 98, 71 2 meses 98, 88 99, 15 99,21 98, 80 3 meses 98, 86 99, 12 99, 16 98, 92 A Figura 6 e Tabela XII mostram a evolução da pureza de ET-743 das novas formulações durante o armazenamento a 25°C/65% HR, em comparação com três formulações convencionais (contendo ET-743 e tampão fosfato).

Tabela XII ET-743 pureza (%) Referência 1 Referência 2 Referência 3 ET-NF A ET-NF B t=0 97, 70 96,90 97,70 99, 06 99, 00 15 dias 84,70 84,50 89,50 98, 97 98, 09 1 mês 74,50 72, 40 81,90 99, 08 98,13 2 meses 99,10 98,38 3 meses 98, 98 98,15 ΡΕ1658848 56

Tabela xii (cont.) ET-743 pureza (%) ET-NF C ET-NF D ET-NF E ET-NF F O II -P 98, 83 98, 98 99, 15 98,88 15 dias 98,35 98, 90 99, 11 98,31 1 mês 98, 01 99, 03 99, 13 98,32 2 meses 98,35 98, 99 99,10 98,28 3 meses 98,33 98, 93 99,09 98,14 A Figura 8 e Tabela XIII mostram a evolução da pureza de ET-743 das novas formulações durante o armazenamento a 40°C/70% HR, em comparação com uma formulação convencional (contendo ET-743, manitol e tampão fosfato) .

Tabela xiii ET-743 pureza (%) Referência 4 ET-NF A ET-NF B ET-NF C ET-NF D ET-NF E ET-NF F t=0 94, 92 99, 06 99,00 98,83 98, 98 99, 15 98, 88 2 dias 87,17 99, 02 98,10 98, 48 98, 95 99, 12 97, 53 7 dias 82,04 98, 68 97, 08 97, 86 98, 63 98, 89 97, 20 15 dias 76,33 98, 75 97,33 97, 77 98, 55 98, 71 96,66 1,5 mês 98, 52 96, 99 97,53 97, 54 98, 47 95, 79 3 meses 98, 24 95,92 96,67 94, 79 97,84 95, 91

Além disso, a Figura 5 e a Tabela XIV mostram que 57 ΡΕ1658848 a produção da impureza ET-701 das novas formulações durante o armazenamento a 5°C, em comparação com três formulações convencionais (contendo ET-743, manitol e tampão fosfato).

Tabela XIV ET-701 (%) Referência 1 Referência 2 Referência 3 ET-NF A ET-NF B O II -P 0, 70 0, 84 0,53 0, 11 1 mês 2,56 3, 09 1,73 0, 12 2 meses 3, 45 3,54 2,69 0, 12 0, 13 3 meses 4,61 5, 04 4,28 0, 13 0, 13

Tabela XIV (cont.) ET-701 (%) ET-NF C ET-NF D ET-NF E ET-NF F t=0 0,15 0,16 0,15 0,11 1 mês 0,12 0,12 0,14 0,11 2 meses 0,16 0,14 0,15 0,12 3 meses 0,16 0,15 0,15 0,12 A Figura 7 e a Tabela XV mostram que a produção da impureza ET-701 das novas formulações durante o armazenamento a 25°C/65% HR, em comparação com as três formulações convencionais (contendo ET-743, manitol e tampão fosfato) . ΡΕ1658848 58

Tabela XV ET-701 (%) Referência 1 Referência 2 Referência 3 ET-NF A ET-NF B t=0 0, 70 0, 84 0,53 0, 09 0, 11 15 dias 7, 99 8,20 4,22 0, 14 0, 12 1 mês 10,56 14, 18 6,86 0, 11 0, 12 2 meses 0, 15 0, 16 3 meses 0, 17 0, 17

Tabela XV (cont.) ET-701 (%) ET-NF C ET-NF D ET-NF E ET-NF F O 11 -P 0, 15 0, 16 0, 15 0, 11 15 dias 0, 18 0, 17 0, 16 0,13 1 mês 0, 18 0, 18 2 meses 0, 18 0, 19 0,24 0, 15 3 meses 0,22 0,23 0,24 0, 18

Como se mostra nestas figuras, a estabilidade das novas formulações foi mais elevada do que a estabilidade das formulações convencionais. Além disso, a produto principal de degradação das formulações convencionais, ET-701, foi dramaticamente reduzido nas novas formulações. 59 ΡΕ1658848

Exemplo 5

Três novas formulações baseadas na sacarose como agente de volume foram usadas sem estudos de estabilidade adicionais. Estas novas formulações diferem na molaridade do tampão fosfato (0,05M vs. 0,1M) e no volume de enchimento ou, por outras palavras, na concentração de ET-743 na solução global (10 ml vs 4 ml). É descrita a manufactura de um lote de pelo menos 50 frasquinhos de cada uma destas formulações. Um sumário da descrição da fórmula por frasquinho é como se segue /Tabela XVI), notando que a água evapora durante o procedimento de liofilização.

Tabela XVI ET-NF G ET-NF H ET-NF I Concentração (mg/ml) Composição final Concentração (mg/ml) Composição final Concentração (mg/ml) Composição final Ingrediente ET-743 0,250 1 mg 0,100 1 mg 0,250 1 mg Sacarose 100 400 mg 100 i q 100 400 mg Di-hidrogenofos-fato de potássio 6,8 27,2 mg 13,6 136 mg 13,6 54,4 mg Ácido fosfórico q.s pH 4,0 q.s pH 4,0 q.s pH 4,0 q.s pH 4,0 q.s pH 4,0 q.s pH 4,0 Agua parainjecção q.s. até 1 ml 4 ml q.s. até 1 ml 10 ml q.s. até 1 ml 4 ml

Foi preparado um volume de 240 ml para formulações ET-NF G e ET-NF I: 60 ΡΕ1658848 62,76 mg de ET-743 foram adicionadas a um recipiente de vidro de fazer misturas e dissolvidas por agitação magnética numa solução de 192 ml de wfi + ácido fosfórico IN (576 μΐ para NF G, 816 μΐ para NF I) durante aproximadamente 1 hora (a dissolução foi verificada visualmente) .

As quantidades de sacarose (24 g) e fosfato de potássio (1,63 g para NF G; 3,26 g para NF I) foram adicionadas e a mistura foi agitada durante um periodo adicional de aproximadamente 1 hora até dissolução.

Depois de verificar o pH e reajustar a pH 4 se necessário com ácido fosfórico IN, a solução foi levada ao volume final adicionado água para injecção. Densidade da solução final: 1,04 g/1. Peso final 249,6 g. A solução foi filtrada através de um filtro PVDF de 0,45 μπι. A solução foi deitada em frasquinhos de 25 ml usando uma bomba automática e tubo de silicone-platina de 3,2 mm. O volume de enchimento padrão foi de 4 ml. O volume de enchimento foi verificado a intervalos regulares (cada 15 frasquinhos), e ajustado se necessário. Após enchimento foram colocadas tampas de liofilização e os frasquinhos foram colocados no liofilizador a 5°C. 61 ΡΕ1658848 0 processo de liofilização foi realizado de acordo com os seguintes parâmetros:

Tabela XVII

Ciclo Passo Pressão Ponto fixo T (°C) Declive (min) Tempo de espera Arrefecimento Colocação atm 5°C Arrefecer 1 atm -50°C 1H 50 min 0,5°C/min Arrefecer 2 atm -50°C 6h Vácuo Vácuo 0, 5 mb 1° secagem 0,080 mb -27°C 45 min 0,5°C/min 1° secagem 0,080 mb -27°C 58 h 2a secagem 2o secagem <0,020 mb 25°C 3h 30 min 0,25°C/min 2° secagem 25°C 40 h Paragem 0,010 mb 25°C

Após liofilização os frasquinhos foram selados. Foi realizada um ajuste final. Os frasquinhos foram transferidos para uma área refrigerada (-20°C) .

Foi preparado um volume de 600 ml para a formulação ET-NF H como se segue: 62,76 mg de ET-743 foram adicionadas a um recipiente de vidro de fazer misturas e dissolvidas por agitação magnética numa solução de 480 ml de wfi + 1,44 ml 62 ΡΕ1658848 de ácido fosfórico IN durante aproximadamente 1 hora (a dissolução foi verificada visualmente).

As quantidades de sacarose (60 g) e fosfato de potássio (8,16 g) foram adicionadas e a mistura foi agitada durante um período adicional de aproximadamente 1 hora até dissolução.

Depois de verificar o pH e reajustar a pH 4 se necessário com ácido fosfórico IN, a solução foi levada ao volume final adicionando água para injecção. Densidade da solução final: 1,04 g/1. Peso final 624 g. A solução foi filtrada através de um filtro PVDF de 0,45 pm. A solução foi deitada em frasquinhos de 25 ml usando uma bomba automática e tubo de silicone-platina de 3,2 mm. 0 volume de enchimento padrão foi de 10 ml. 0 volume de enchimento foi verificado a intervalos regulares (cada 15 frasquinhos), e ajustado se necessário. Após enchimento foram colocadas tampas de liofilização e os frasquinhos foram colocados no liofilizador a 5°C. O processo de liofilização foi realizado de acordo com os seguintes parâmetros (Tabela XVIII): 63 ΡΕ1658848

Tabela XVIII

Ciclo Passo Pressão Ponto fixo Declive (min) Tempo de O o H espera Colocação Ta atm 5°C Arrefecimento Arrefecer 1 atm -50°C 1H 50 min 0,5°C/min Arrefecer 2 atm -50°C 6h Vácuo Vácuo 0,5 mb Sublimação 1° secagem 0,080 mb -27°C 45 min 0,5°C/min 1° secagem 0,080 mb -27°C 62 h 2a secagem 2° secagem <0,020 mb 25°C 3h 30 min 0,25°C/min 50 h 2° secagem Fim 0,010 mb 25°C Pós liofilização os frasquinhos foram selados. Foi realizada um ajuste final. Os frasquinhos foram transferidos para uma área refrigerada (-20°C) . 0 teor em ET-743 estava dentro das especificações (95% —105%) . Os perfis de impurezas mostraram semelhanças para todas as formulações e eram comparáveis com impurezas das soluções globais. O teor em água residual era menor do que 2%, sendo o valor mais alto para a formulação de 10 ml de enchimento. O pH das soluções reconstituídas estava entre pH 4 e pH 4,28 em todos os casos. As soluções estavam límpidas e incolores sem matéria estranha visível ou precipitação. O tempo de reconstituição foi similar para todas as formulações e inferior a 30 s. -64 - ΡΕ1658848 0 teste de estabilidade foi realizado durante 3 meses a uma temperatura de armazenamento de 40°C/70% HR. A Figura 9 e a Tabela XIX mostram a evolução da pureza da ET-743 das novas formulações durante o armazenamento a 40°C/70% HR.

Tabela xix ET-743 pureza (%) ET-NF G ET-NF H ET-NF I o II 4-1 99,18 99,23 99, 00 7 dias 99,04 98,68 15 dias 98,97 98, 86 98, 79 1,5 mês 98,72 98, 61 98, 40 2 meses 98,29 3 meses 97, 71

Além disso, na Figura 8 os dados de estabilidade estão mostrados em comparação com a formulação convencional (contendo ET-743, manitol e tampão fosfato).

Os resultados obtidos nos Exemplos 4 e 5 indicam que todas as formulações compreendendo um dissacarídeo como agente de volume são mais estáveis do que as formulações convencionais contendo manitol como agente de volume. A formulação ET-NF G é a formulação preferida.

Modelos de realização de formulações de acordo 65 ΡΕ1658848 com este invento foram testadas após armazenamento sob uma pluralidade de condições de armazenamento (incluindo temperaturas de -20°C, 4°C, e 25°C/60% HR) a vários tempos de armazenamento (incluindo tempos de armazenamento de 3 meses, 6 meses, e 9 meses). Os resultaods do ensaio indicaram que pleo menos 99,5% de ET-743 permaneceram após 9 meses de armazenamento a -20°C, pelo menos 99% de ET-743 permaneceram após 9 meses de armazenamento a 4°C, e pelo menos 97% de ET-743 permaneceram após 9 meses de armazenamento a 25°C/60% HR. As impurezas totais, incluindo ET-701, ET-745, e outras impurezas não excederam 1,66% após 9 meses de armazenamento a 25°C/60% HR. Além disso, o nível da impureza ET-701 não excedeu 0,21% após 9 meses das referidas condições de armazenamento.

Todas as referências citadas aqui são incorporadas como referência na sua totalidade. As características e vantagens deste invento são aparentes à luz da revelação proporcionada aqui. Baseado nesta revelação, podem ser feitas modificações e adaptações às várias condições e usos, gerando assim modelos de realização dentro do âmbito deste invento.

Lisboa, 23 de Outubro de 2007

Claims (25)

1. ΡΕ1658848 1 REIVINDICAÇÕES 1. Uma composição que compreende uma ecteinas-cidina e um dissacarídeo.
2. 2. Uma composição de acordo com a reivindicação 1, em que a ecteinascidina compreende ET-743.
3. 3. Uma composição de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que o referido dissacarídeo é selec-cionado a partir do grupo consistindo de lactose, trealose, sacarose, e misturas destas.
4. 4. Uma composição de acordo com a reivindicação 3, em que o referido dissacarídeo é sacarose.
5. 5. Uma composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a proporção (p/p) de ET-743 para dissacarídeo é desde cerca de 1:100 até cerca de 1:1500.
6. 6. Uma composição de acordo com a reivindicação 5, em que a proporção (p/p) de ET-743 para dissacarídeo é desde cerca de 1:250 até cerca de 1:600.
7. 7. Uma composição de acordo com a reivindicação 6, em que a proporção (p/p) de ET-743 para dissacarídeo é de cerca de 1:400. 2 ΡΕ1658848
8. 8. Uma composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, a qual compreende ainda um agente tamponizante.
9. 9. Uma composição de acordo com a reivindicação 8, em que o referido agente tamponizante é seleccionado a partir do tampão fosfato, tampão citrato, tampão gli-cina/ácido clorídrico, e misturas destes.
10. 10. Uma composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, a qual compreende ainda um agente tensioactivo.
11. 11. Uma composição de acordo com a reivindicação 10, em que o agente tensioactivo é seleccionado a partir de mono-oleato de polioxietileno 20-sorbitano, estearato de polioxilo 40, e misturas destes.
12. 12. Uma composição de acordo com qualquer reivindicação precedente, em que a composição está na forma de uma formulação liofilizada.
13. 13. Uma formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 12, em que a formulação liofilizada está num frasquinho e inclui uma quantidade de ET-743.
14. 14. Uma formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 13, em que a referida quantidade de ET-743 é de cerca de 250 μρ 3 ΡΕ1658848
15. 15. Uma formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 14, em que o referido frasquinho contém uma formulação compreendendo: cerca de 0,25 mg de ET-743, cerca de 100 mg de sacarose, e cerca de 6,8 mg de fosfato, em que os referidos 6,8 mg de fosfato são calculadas como di-hidrogenofosfato de potássio.
16. 16. Uma formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 13, em que a referida quantidade de ET-743 é de cerca de 1 mg.
17. 17. Uma formulação liofilizada de acordo com a reivindicação 16, em que o referido frasquinho contém uma formulação compreendendo: cerca de 1,0 mg de ET-743, cerca de 400 mg de sacarose, e cerca de 27,2 mg de fosfato, em que as referidas 27,2 mg de fosfato são calculadas como di-hidrogenofosfato de potássio.
18. 18. Um método de fazer um frasquinho contendo uma formulação liofilizada de uma ecteinascidina, compreendendo a liofilização de uma solução global que compreende a ecteinascidina e um dissacarideo.
19. 19. Um método de acordo com a reivindicação 18, em que a ecteinascidina é ET-743.
20. 20. Um método de reduzir a formação de ET-701 numa formulação de ET-743, compreendendo liofilização de uma solução global que compreende ET-743 e um dissacarideo. 4 ΡΕ1658848
21. 21. Um método de preparar uma solução global para liofilização, compreendendo a dissolução de uma ectei-nascidina num meio ácido, a mistura de ecteinascidina pré-dissolvida com os outros componentes da solução global e, opcionalmente, ajustar o pH da solução final.
22. 22. Um método de acordo com a reivindicação 21, em que a ecteinascidina é ET-743.
23. 23. Um método de preparar uma solução para infusão ultravenosa, compreendendo: providenciar um fras-quinho que compreende ecteinascidina liofilizada e um dissacarideo, adicionar água para formar uma solução reconstituída, e diluir a referida solução reconstituída com um sistema aquoso.
24. 24. Um método de acordo com a reivindicação 23, em que a ecteinascidina é ET-743.
25. 25. Um método de tratar cancro, que compreende a infusão intravenosa de uma solução preparada pelo método da reivindicação 23. Lisboa, 23 de Outubro de 2007