CN1177610C - 用于免疫调节的基于肽和佐剂的药物组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种含有至少一种免疫调节肽或一种蛋白质(片段)，以及一种助剂的药物组合物。该肽是由病原体或肿瘤抗原衍生的。该助剂能增加该肽与要治疗的人体细胞的结合，或增加该细胞对该肽的吸收能力，并且增强该肽的免疫调节功能。优选的助剂是碱性聚氨基酸，例如多精氨酸或多赖氨酸，它们可任选地与细胞配位体，例如碳水化物基因或运铁蛋白共轭。该组合物特别可用作疫苗，如肿瘤疫苗。
Description
本发明涉及免疫调节领域
本发明是基于肿瘤细胞的治疗性疫苗的研制。它主要基于以下前提：在肿瘤细胞与正常细胞之间存在量或质的区别；免疫系统基本上具有识别这种区别的能力；免疫系统能够通过用疫苗进行主动特异性免疫而被刺激，从而根据上述区别来识别肿瘤细胞并导致排斥这些细胞。
为了形成抗肿瘤应答，至少必须满足两个条件：首先，肿瘤细胞必须表达抗原，该抗原在正常细胞上不能产生或只能产生到免疫系统可在正常组织与肿瘤组织之间的质量上进行区别的程度。其次，该免疫系统必须适当活化，以便与抗原反应。在肿瘤的免疫治疗中存在的主要障碍是其低的免疫原性，尤其是在人体中。
目前，已发现肿瘤相关抗原和肿瘤特异性抗原。它们构成这种新的表位，因此，应该构成被免疫系统袭击的潜在的目标。但实际上免疫系统没有能成功消除表达这种新表位的肿瘤，这明显不是由于缺乏新表位，而是由于对这些新抗原的免疫应答不够之故。
对基于细胞的癌症的免疫治疗而言，通常有两个对策：一方面，采用过继性免疫治疗，它是在活体外使肿瘤反应性T-淋巴细胞扩增，然后将它们重新输入到患者体内；另一方面，是主动免疫治疗，它使用肿瘤细胞，要求引起对抗肿瘤抗原的新的或增强的免疫应答，以导致系统性的肿瘤应答。主动免疫治疗的肿瘤疫苗已以不同的方式制备；其中的一个实例是与免疫刺激佐剂如小棒杆菌或结核杆菌(BCG)混合的经辐射处理的肿瘤细胞，以便诱发对肿瘤抗原的免疫反应(Oettgen与Old，1991年)。
最近几年，人们已将遗传改造的肿瘤细胞用于癌症的主动免疫治疗。Zatloukal等人，1993年综述了这些不同的方法。其中，肿瘤细胞通过引入不同的基因而外来化以便增强免疫原性。一个至今仍采用的方法中使用了经过遗传改造能产生细胞因子的肿瘤细胞。
肿瘤抗原和肿瘤相关抗原(TAS)及其衍生的肽的鉴定和分离，(例如，Wolfel等人，1994年a.)和1994年b.)；Carrel等人，1993年，Lehmann等人，1989年，Tibbets等人，1993年，或者国际专利申请文献WO 92/20356，WO 94/05304，WO 94/23031，WO 95/00159所描述)，是另一个方法的先决条件。在该方法中，使用肿瘤抗原作为肿瘤疫苗的免疫原，它可以是蛋白质形式也可以是肽的形式。由Boon等人，1992年；Boon等人，1994年；Boon等人1995年；Van Peel等人，1995年；Van der Eynde，1995年等的研究可知，恶性黑素瘤在MHC-1环境中呈递由肿瘤抗原衍生的肽。但是这种肿瘤抗原形式的肿瘤疫苗的免疫原性不足以引发消除带有肿瘤抗原的肿瘤细胞所必要的细胞免疫应答(Marchand等人，1995年)。为了保证抗原呈递细胞(APCs)在其表面上呈递限定的肽抗原，建议使肽“脉动”，结果是导致这些细胞上肽的无效负载(Tykocinski等人，1996年)。还要指出，佐剂的共施用在加强免疫应答方面是有限的(Offegen与Old，1991年)。
用于提高肿瘤疫苗功效的第三个主动免疫治疗方法是基于异基因化(异源化的)自体肿瘤细胞。这概念是基于以下的一种假设，即免疫系统与表达异种蛋白的肿瘤细胞反应，而且在该反应过程中，也引起一种对疫苗中肿瘤细胞所呈递的肿瘤抗原的免疫应答。
在特异免疫应答的调节中，由T-细胞抗原受体，MHC(主要组织相容性复合物)分子和其配体(它是由蛋白质衍生的肽片段)所组成的三分子复合物起中心作用。
MHC分子(或其相应的人的分子，HLAs)是允许以严格特异性与众多不同配体相结合的肽受体。其前体由等位基因特异性肽基元提供，它具有如下的特异性标准：肽具有取决于MHC单元型的限定的长度，该长度通常在MHC-I单元型中是8-10个氨基酸。通常由其中两个氨基酸位置构成所谓的“锚”，它们只能被单独的氨基酸或具有紧密关联的侧链的氨基酸基团所占有。在肽中的锚定氨基酸的确切位置，以及其特性要求是随MHC单元型而不同的。肽-配体的C-末端常常是脂族基团或带电荷的基团。此外，这种MHC-I肽配体基元至今已知的有H-2Kd、Kb、Kk、Kkml、Db、HLA-A*0201，A*0205与B*2705单元型。
在细胞内蛋白质转变的范围内，有规则的、退化的及异种的基因产物，如病毒蛋白或肿瘤抗原，分解成小的肽。其中一些肽形成了MHC分子的潜在的配体。这使它们有可能由MHC分子呈递，并因此引发细胞免疫应答。但目前还不能清楚地解释这些肽是如何在细胞中成为MHC配体的。异源或异化的蛋白质及其片段也可以被组成体液免疫应答的免疫球蛋白识别、结合和消除。这也适用于所有的肿瘤抗原：例如已证实，对肿瘤相关抗原MUC1，CEA和HER2/neu具有特异性的免疫球蛋白，可以识别和消灭携带这些蛋白的细胞。因此，为了触发肿瘤抗原特异性体液免疫应答，可以将不同形式的MUC1和CEA作为免疫原(例如在重组的痘载体中；Bronte等人，J.Immunol.154：5282，1995年)，用在动物模型中和初步临床试验中。
本发明的范围内，在开发细胞性肿瘤疫苗的过程中出现一些想法：非恶性的正常体细胞能耐受免疫系统，但当正常的细胞由于诸如病毒感染等而合成异体的蛋白质时，人体通过免疫应答而对正常的细胞进行反应。其原因在于MHC分子呈递了来源于异体蛋白质的外源肽。结果，免疫系统记录了对该细胞的不期望的和异化的作用。APCs(包括巨噬细胞，树突细胞，郎氏细胞(Langerhans cell)，B-细胞，可能还有新近发现的双表型细胞，它不仅具有B-细胞特性，而且还具有巨噬细胞特性。Tykocinski等人，1996年)被活化，产生新的特异性免疫，并消除该细胞。
肿瘤细胞公认含有有关肿瘤特异性的肿瘤抗原，然而只是作为一种无效的疫苗，因为它们因其低免疫原性而被免疫系统忽略。如果肿瘤细胞不是带有外源蛋白质，而是带有外源肽，则除了所述外源肽，该细胞本身的肿瘤抗原也被该细胞识别为外来物质。通过用肽进行异化作用，导致由这些外源肽激发了对肿瘤抗原的细胞免疫应答。
肿瘤细胞免疫原性低的原因可能是量的问题，而不是质的问题。对于肿瘤抗原衍生的肽而言，这意味着：虽然被MHC分子呈递，但其浓度太低以致不能引发肿瘤特异性细胞免疫应答。因此提高肿瘤细胞表面肿瘤特异性肽的量，也会导致肿瘤细胞的异化作用，从而可引发细胞免疫应答。有人提出，将肿瘤抗原或由其衍生的肽通过用编码有关蛋白质或肽的DNA转染而呈递在细胞表面。这已描述于国际专利申请文献WO 92/20356，WO94/05304，WO 94/23031和WO 95/00159中。
德国专利申请文献P19543649.0描述了一种细胞疫苗，它含有作为活性组分的带有一个或多个肽的肿瘤细胞，以致于这种载有肽的肿瘤细胞被病患者的免疫系统识别为外来的，并引发细胞免疫应答。这种肽的主要特征是，它们是该患者的MHC单元型的配体。因此，这种肽被患者的免疫系统识别为外源的，因为它们一方面可以是“外源肽”或“异化肽”，也就是说，它们不同于由患者的肿瘤细胞所表达的蛋白质衍生的肽。另一类肽是从病人细胞表达的肿瘤抗原衍生的。这些会起到提高免疫原性的作用，因为它们以一定的浓度存在于疫苗的肿瘤细胞上，该浓度高于在患者的肿瘤细胞上相同肽的浓度。
本发明的任务在于，制备一种新的具有免疫调节作用的药物组合物，特别是疫苗。
根据德国专利申请文献P19543649.0公开的细胞疫苗的概念继续研究，可以研制本发明范围的药物组合物，它含有起免疫调节作用的肽，此肽不处在细胞环境中，而是和佐剂一起使用，以便引发或加强针对病原体的细胞免疫应答和/或体液免疫应答，优选系统性免疫应答或抗肿瘤应答或者形成对具有自体免疫作用的蛋白质的耐受性。
令人惊奇地发现，一些佐剂，如聚阳离子可以提高肽的免疫原性，所述聚阳离子首先已在1965年公布为可以增强蛋白质向细胞内的转移(Ryser等人，1965年；Ryser等人，1978年；Shen等人，1981年)。
本发明涉及一种药物组合物，它含有一个或多个具有免疫调节作用的肽、蛋白质或蛋白质片段，以及一种佐剂。该组合物的特点在于，该佐剂具有增强将该肽或蛋白质或蛋白质片段与需要治疗的人体的细胞结合的能力，或促进其进入到该细胞中的能力，从而导致增强肽或蛋白质或蛋白质片段的免疫调节功能。
通常，为简化起见，将具有免疫调节作用的肽、蛋白质或蛋白质片段简称为“肽”。当不特别涉及配体时，上述“肽”也可以理解为更大些的蛋白质片段或衍生出该肽的蛋白质，或细胞分解产物。
上述的“免疫调节作用”，一方面可理解为细胞免疫反应和/或体液免疫反应，优选系统性免疫反应的引发或增强。在本实施方案中，本发明的药物组合物是起疫苗作用的。
在一个优选的实施方案中，所述肽是至少一种MHC分子的配体，该MHC分子是被要治疗的人体所表达的。
人体的MHC分子，根据国际惯例，以下也称为“HLA”(人的白细胞抗原)。
本文中的“细胞免疫应答”，首先是理解为细胞毒性T-细胞免疫，它产生细胞毒性的CD8-阳性T-细胞和CD4-阳性辅助T-细胞，其结果会造成肿瘤细胞的破坏或被病原体侵袭的细胞的破坏。
本文中的“体液免疫应答”，可理解为产生免疫球蛋白，它可选择性地识别肿瘤细胞或从病原体衍生的结构，因而，与其他的系统，如补体，ADCC(抗体依赖性细胞毒性)或吞噬作用一起，起到破坏这些肿瘤细胞或病原体或被病原体袭击的细胞的作用。
包含在疫苗中的肽是由抗原衍生的，或者在蛋白质的情况下，是要引发细胞免疫应答和/或体液免疫应答的抗原，这确保产生能识别含有所述抗原的致病体或肿瘤细胞的T-细胞或其它细胞毒性效应细胞，和/或产生抗体。
为了针对疾病的致病物，如细菌、病毒、寄生物产生免疫作用，可以使用组成所述病原体的蛋白或由其衍生的蛋白或肽。特别适用的是不受所述病原体通常较高的突变率干扰的蛋白。已公布的实例有，HPV 16/17(人乳头瘤病毒。Feltkamp等人，1995年)，乙肝病毒核心抗原(Vitiello等人，1995年)，伯氏疟原虫(Plasmodium Bergheii)(Widmaun等人，1992年)，流感核蛋白质，丙肝病毒。
本发明的一个实施方案中为了引发抗肿瘤应答，使用蛋白质或肿瘤抗原或由肿瘤抗原衍生的肽，以及药物组合物作为肿瘤疫苗。在这种情况下，当疫苗用于治疗时，该肽是由患者的肿瘤细胞所表达的肿瘤抗原衍生的。这些肿瘤抗原可以是例如被患者表达的浓度太低，以致于不能使所述肿瘤细胞被识别为外来细胞的那些抗原。
在诊断和治疗过程中，可以用标准方法测定出患者的肿瘤抗原。可以使用抗体通过简单的免疫组织化学方法，检测肿瘤抗原。当该肿瘤抗原是酶时，如酪氨酸酶，则可以用酶试验法检测。当肿瘤抗原具有已知的序列时，则可以用RT-PCR方法(Boon，T.等人，1994年，Coulie P.G.等人，1994年，Weynants，P.等人1994年)。检测肿瘤抗原的其他方法是基于待测肿瘤抗原的特异性CTLs的试验法。此外，上述试验方法可以参见Herin等人，1987年；Coulie等人，1993年；Cox等人，1994年；Rivoltini等人，1995年；Kawakami等，1995年，以及WO 94/14459等文献。上述文献也公开了适用于本发明的各种肿瘤抗原以及由其衍生的肽表位。例如，在最近发表的Rosenberg，1996年与Henderson和Finn，1996年的综述文章所介绍的适用的肿瘤抗原实例。可用于本发明的有关肿瘤抗原并不受任何限制。本发明可用的已知肿瘤抗原以及由其衍生的肽的一些实例列于表中。
一种含有肿瘤抗原或由肿瘤抗原衍生的肽的肿瘤疫苗，除了可用于治疗外，也可用于预防。在用于预防时，优选使用由常见肿瘤抗原衍生的肽的混合物。本发明的肿瘤疫苗用于治疗时，可以使用一或多种预期包含在患者肿瘤抗原中的肽。
本发明的肿瘤疫苗与基于自体肿瘤细胞的细胞疫苗相比的优势在于，甚至对疾病早期(一期和二期)的病人也可以进行有效治疗，这样的病人是没有足够的肿瘤细胞来产生细胞疫苗的。
本发明的优选实施方案中，为了引发细胞免疫应答，可以使肽与将要施用疫苗的患者的MHC-I或MHC-II亚型相匹配，该肽因而具有或包含确保与MHC分子结合的序列。
本发明的另一个实施方案中，用作肿瘤疫苗的药物组合物，也含有有免疫刺激作用的多肽，特别是细胞因子。本发明的一个优选实施方案中，使用白细胞介素2(IL-2)或GM-CSF作为细胞因子，其剂量约为1000个单位。适用的细胞因子还有IL-4、IL-12、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、IFN-ω、TNF-α以及其组合物，如IL-2+IFN-γ、IL-2+IL-4、IL-2+TNF-α、或TNF-α+IFN-γ。
本发明的一个实施方案中，药物组合物赋予对引起自体免疫病的蛋白质或其片段的耐受性，也就是用于治疗自体免疫疾病。在本发明的实施方案中所用的肽是由引起自体免疫疾病的蛋白质衍生的。
本发明可以作为肿瘤疫苗或作为对抗致病因子的疫苗来使用，其中的肽基本上与原始蛋白质(肿瘤抗原或病原体蛋白质)的一部分相匹配，其匹配程度使所述肽被识别为“原始抗原”。与此相反，在本发明用于治疗自体免疫疾病的情况下，所用的肽与原始蛋白质的氨基酸序列在关键方面有区别。这种肽借助其锚定位置结合在MHC分子上，然而在其序列中有突变，这导致这些肽起拮抗剂的作用，从而再次关闭已活化的特异性T-细胞(Kersh与Allen，1996年)。
合适的肽拮抗剂既是病毒中发现的“天然”拮抗剂(Betroletti等人，1994)也可以是通过筛选肽库等系统研究而发现的拮抗剂。肽拮抗剂的实例是能关闭对髓鞘碱性蛋白具有特异性的T-细胞的那些肽；这些在动物试验中测试其功效(Brocke等人，1996)。
一个可以引发细胞免疫应答的肽，必须可以结合到MHC分子上。为了在患者中引发免疫应答，要治疗的个体在其所有组成成分中必须具有相应的HLA分子。患者的HLA亚型的测定，是对患者有效施用肽以获得细胞免疫应答的一个重要前提。
可以使用标准方法，例如微淋巴毒性试验，测定患者的HLA亚型(Practical immunology，1989年)。该测试方法所根据的原则是：首先，将由患者血中离析的淋巴细胞，在有家免补体(c)的参与下，与对特异性HLA分子的抗血清或单克隆抗体进行混合。使阳性细胞裂解，然后吸收一种指示剂染料，而未受损坏的细胞保持不被染色。
可以用RT-PCR法测定患者的HLA-I或HLA-II单元型(Curr，Prot.Mol.Biol.第2，15章)。为此，采取患者的血样，并从中分离出其RNA。首先，对该RNA进行逆转录，导致形成患者的cDNA。用这种cDNA作基质，使用引物对进行聚合酶链反应，从而使代表确定的HLA单元型的DNA片段被扩增。当用琼脂糖凝胶电泳法显示出DNA带时，说明患者表达相应的HLA分子。如果没有显示DNA带时，说明患者是阴性。
用HLA分子定义本发明所用的肽，可以确定其锚定氨基酸和其长度。限定的锚定位置与长度可确保该肽与有关HLA分子的肽结合叉口吻合。这意味着如果使用由肿瘤抗原衍生的肽，将刺激免疫系统，并引起对患者肿瘤细胞的细胞免疫反应。
适用于本发明的肽可以从多方面获得。其序列可以源自天然产生的免疫原性蛋白质或其细胞分解产物，如病毒的或细菌的肽，或源自肿瘤抗原，或者它们可以是由诱发自体免疫疾病的蛋白质衍生的肽的拮抗剂。
适用的肽可以例如根据文献上已知的肽序列来选择。
为了引发细胞免疫应答，所用的肽可以是由Rammensee等人，1993年，Rammensee等人，1995年，Falk等人1991年，描述的用于各种HLA基元的肽，由各种不同来源的免疫原性蛋白质衍生的肽，这些肽适合于各种HLA亚型的分子的结合叉口。
具有免疫原性蛋白质的部分序列的肽，可以依据已知的或仍要测定的多肽序列，并考虑HLA的特定需求，通过序列比对来确定。合适肽的实例有，例如，Rammensee等人，1993年，Falk等人1991年和Rammensee，1995年，以及WO 91/09869(HIV-肽)所描述的肽，以及在国际专利申请文件WO95/00159、WO 94/05304中所述的，由肿瘤抗原衍生的肽。在上述公开的文献，以及所引用的与肽有关的文章在此都引入作为参考。优选适用的是已证明免疫原性的肽，即由已知的免疫原，如病毒的或细菌的蛋白质衍生的肽。
除了使用适合于MHC-I或MHC-II分子的结合叉口的原始肽，即由天然蛋白质衍生的未改变的肽，还可以按需要，基于原始的肽序列，使用有关锚定位置和长度的最低要求进行改变，只要这些改变不仅不损害而且优选增强所述肽的有效免疫原性，即其与MHC分子的结合亲合力以及其刺激T-细胞受体的能力即可。因此，在这种情况下本发明使用按照有关与MHC分子相结合的要求而设计的合成肽。例如，由H2-Kd-配体Leu Phe Glu Ala IleGlu Gly Phe Ile(LFEAI EGFI)开始，可以改变不锚定的氨基酸，以致得到PhePhe Ile Gly Ala Leu Glu Glu Ile(FFIGA LEEI)序列的肽。此外，可以用Leu代替第九位置上的锚定氨基酸Ile。使用Rammensee等人，1995年所述的原则，可以测定MHC-I或MHC-II配体或其变体的表位。肽的长度最好相当于结合MHC-I分子所必需的8-10个氨基酸的最小序列以及所需的锚定氨基酸。
跨越9个氨基酸的MHC-II结合基元在锚定位置上具有更高程度的变性。最近，开展基于MHC-II分子的X光结构分析法的方法。它能够精确分析MHC-II结合基元，并在其基础上，可以改变肽序列(Rammensee等人，1995年及其引用的原始文件)。
此外，该肽还可以在C终端和/或N终端延长，只要这种延长不损害结合到MHC分子上的能力，或者延长的肽可以在细胞水平经过加工而降到最小序列。
在本发明的一个实施方案中，该肽是负电荷的。在本实施方案中，可以用具有负电荷的氨基酸使肽延长，或者可以把负电荷的氨基酸嵌入到肽中，或优选的是嵌入到并非特异性CTL识别所必需的位置或作为锚定氨基酸，以便使肽与多阳离子佐剂如多赖氨酸进行静电结合。
在本发明的一个实施方案中，所用抗原不是以肽形式，而是以蛋白质或蛋白质片段，或是蛋白质或蛋白质片段的混合物形式。在本发明范围内，适用更大的蛋白质片段或整个的蛋白质，它们在应用于病人APC后，可以被处理成与MHC分子相匹配的肽。
蛋白质是抗原或肿瘤抗原，在处理后可以衍生得到片段。在本实施方案中，该佐剂可用于使细胞，特别是APCs，如树突细胞或巨噬细胞装载(“转载”)肿瘤抗原或片段。这样吸收的蛋白质或蛋白质片段被细胞所处理。此后，在MHC环境中呈递给免疫效应细胞，并由此引发或加强免疫应答(Braciale和Braciale，1991年；Kovacsovics Bankowski和Rock，1995年；York和Rock，1996年)。
本发明使用蛋白质或较大的蛋白质片段作为抗原的实施方案，其优点包括对病人的HLA型的依赖性较小，因为该蛋白质被处理成许多片段，所以肽的“适配形式”具有更大的可变性。
在施用蛋白质或蛋白质片段时，可以用化学分析法(经处理的片段的Edman降解法或质谱分析法，参见Rammensee等人，1995年的综评文章及其中引证的原文)，或者用生物分析法(APCs刺激特异于经处理的片段的T细胞的能力)测试被处理的最终产物的特性。
原则上适于产生细胞免疫应答的肽是以几个步骤进行选择。通常，先进行肽结合试验，以测试选用的肽与MHC分子结合的能力，优选进行系列试验。
较适用的研究方法是基于肽使空载MHC分子稳定的能力，这已由Stuber等人，1994年和McIntyre等人，1996年所描述。将肽加到能表达有关MHC分子，但由于基因缺陷，不能结合MHC环境中的任何内源肽的细胞上。这种类型的适用细胞系是RMA-S(鼠)和T2(人)以及其转染的变体。仅有那些由有关肽稳定的MHC-分子是可检测的，优选是用基于流式细胞计量术的FACS分析法进行测定(Flowcytometry，1989年；FACS VantageTM用户指南，1994年；CELL QuestTM用户指南，1994)。稳定的MHC分子可以用相应抗MHC抗体和带有荧光染料如FIFC(异硫氰酸荧光素)标记的第二抗体(如，多克隆抗体)检测。流动的各个细胞被具有一定波长的激光所激发，可以测量发射出的荧光，后者是取决于与细胞结合的肽的量。
另一个测定肽结合量的方法是由Settle等人，1994年描述的Scatchard-blot。其中，将肽用I125进行标记，然后在4℃下，用分离的或重组产生的MHC分子与各种不同浓度的肽培育过夜。为了测定肽的非特异性相互作用，向一些试样中加入过量的未标记的肽，抑制标记肽的非特异性相互作用。然后，用凝胶色谱法除去非特异性结合的肽。使用闪烁计数器，用发出的放射性测得结合肽的量。然后，用标准方法评价上述所得的数据。
Rammensee等人，1995年描述了可以用于本发明范围内的鉴定MHC/肽的相互作用的方法，MHC-配体的分析以肽结合试验。
在下一步骤中，测试所选用的具有优良结合质量的肽的免疫原性：
例如按Blomberg等人，1993年描述的，或Current Protocols inImmunology第三章所描述的方法，通过检测肽特异性CTLs，可以证实细胞免疫应答的引发。另一个指示细胞免疫应答存在的方法是，当没有T-细胞时，在实验动物中没有免疫应答(这种免疫应答可以用缺失CD4-或CD8-细胞的抗体处理该试验动物来获得)。
也可以通过检测被免疫动物中的“迟发型超敏反应”(DTH)来证实细胞免疫应答。为此，可以在试验鼠的足底注入肽，并且，测量被注射部位的肿胀情况(Grohman，等人，1995年；Puccetti等人，1994年)。
可以通过检测血清中特异性的抗体来测定肽对体液免疫应答的诱导，这里所述的肽是对该生物而言的外来抗原或待处理的生物以低浓度表达的抗原。检测血清中抗体量的合适方法，是酶联免疫试验法(ELISA)。特异性抗体在与用于免疫的肽结合后可以通过染色反应检测。另一个方法是Western印迹法。其中，使特异性血清抗体结合到固定在膜上的肽。然后，再用染色反应检测结合的抗体(上述两个方法可参阅：Gurrent ProtocolsImmunology编者：Coligan等人，1991年)。
用外源抗原，如病毒来源的抗原接种后，可形成抗体。然而也不能排除可以形成抗突变的肽或由细胞肿瘤抗原衍生的过表达的肽的特异性抗体。这些抗体在与肿瘤细胞结合后，通过免疫系统的其他组分，如补体，抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或巨噬细胞的吞噬作用，而导致肿瘤的毁灭(Rott I.M.，Brostoff J，Male D.K.Immunology，Churchipl Livingstone)。
由致免疫活性未知的蛋白质衍生的肽而引发的细胞免疫应答可以，例如按Rivoltini等人，1995年，或Kawakami等人，1994a所述方法测试。为此，需要能识别由MHC分子呈递的所需肽的T-细胞。当使用源自肿瘤细胞的肽的情况下，可以由肿瘤浸润淋巴细胞(TILs)得到相应的T-细胞，方法如Kawakami等人1994b所述。当使用外源肽时，这种类型的T-细胞可类似地由外周血得到。将T-细胞与已混有有关肽的细胞系，如T2(Alexander等人，1989年)或RMA-S(Karre等人，1986年)一起培育，在所述有关肽为免疫原性肽的情况下，T细胞使上述细胞系的细胞裂解。
另一个测试MHC结合肽候选者的免疫原性的方法是，检测肽与T2-细胞的结合。这种试验是基于T2-细胞(Alexauder等人，1989年)或RMA-S细胞(Karre等人，1986年)的以下特定性质：它们在TAP-肽-转运机制中有缺陷，并且将它们应用于呈递在MHC环境中的肽时只呈递稳定的MHC分子。在该试验中，使用已被HLA基因，如HLA-A1和/或HLA-A2基因稳定转染T2-细胞或RMA-S细胞。当所述细胞与作为良好的HLA-配体的肽混合时，通过呈递在HLA环境中，致使这些肽被免疫系统识别为外来物，从而引起HLA分子以显著的量显示在细胞表面上。利用单克隆抗体等检测细胞表面HLAs，使得有可能鉴别合适的肽(Malnati等人，1995年；Sykuler等人，1994年)。这里也可适当使用已知具有良好HLA结合能力的标准肽。
考虑到本发明药物组合物的广泛应用，优选使用多种肽的混合物，其中，每种肽可以结合另外的MHC分子，最好是结合两个或三个最常见MHC亚型中的一个。可以用基于肽混合物的疫苗来涵盖广泛的患者群体，其中所述肽能结合这些单元型。
本发明的一个实施方案中，该疫苗可以具有许多不同序列的肽。在这种情况下，所用的肽可以彼此不同，它们可结合不同的HLA亚型。这样就可以检测一个患者或更多患者的多个或全部HLA亚型。
另外，所用的肽还可以有另外的变异性，包括结合到一定的HLA亚型上的肽，在其对HLA结合不起决定性作用的序列中有所不同，它们是由相同致病因子的不同蛋白质或由不同的病原体所衍生的。根据这种变异性，可以增强免疫应答的刺激，或赋予对各种不同病原体的免疫性。
本发明组合物中有效肽的用量可以在较大范围内变化。肽的用量取决于该组合物的施用方法和所用的具体配方。肽的施用量，可以是每剂量约为1.0-5000微克，通常为1.0-1000微克，并以约10-约500微克为宜。可以一次或分多次施用。在多次施用时，优选至少是三次。特别是用于治疗时，每次施用的间隔(例如，每周一次-每月一次)可以任意选定，这取决于患者的特异的免疫状态及疾病进程。
本发明的药物组合物也可以体外(ex vivo)施用。体外施用的原则是，将APCs，如树突细胞在体外培养。将该细胞培养物与本发明的组合物一起培育并将现已呈递MHC-环境中的肽的APCs给与待治疗的个体。可以使用文献已知的方法进行这类施用。如Porgador和Gilboa，1995年；Yourg和Inabe，1996年所描述的。
含于本发明组合物中的佐剂，具有辅助肽进入到病人的细胞，或使肽结合病人的细胞，并加强肽的免疫原性的特点。例如，佐剂可以使靶细胞的膜至少在短时间内允许肽透过，以使该肽送入到细胞中。通过在电负性肽与多阳离子佐剂之间的静电相互作用，使肽结合到佐剂上，这是有利的，但并非绝对需要的。因此，只要该佐剂使得肽能通透，这些肽就能基于其与细胞膜的空间紧密关联性而穿过细胞膜，从而使肽进入到细胞中。佐剂的作用也可以基于，其提高细胞表面上的肽浓度(这对于肽被吸收到细胞中是至关重要的)，或者导致对肽的吞噬作用或液体转送(胞饮作用)。
令人惊奇的是，有佐剂存在不仅可以促进肽被吸收到细胞中，而且也可增强肽的免疫调节作用，这归因于MHC分子对肽的正确呈递。
本发明的一个实施方案中，佐剂原则上全部是可以用于将核酸转运到细胞中的膜通透性物质，关于这方面可以参考WO 93/19768，它提及了这种物质。
本发明的一个较佳实施方案中，佐剂可以是碱性多氨基酸或碱性多氨基酸的混合物。
上述多氨基酸的聚合度可以在较大范围内变化。其聚合度约为5-1000，并以15-500为宜。
本发明范围内所用的佐剂优选是多精氨酸。
本发明范围内所用的佐剂优选是多赖氨酸。
其他适用的佐剂还可以是多阳离子有机化合物(碱性多氨基酸)，如多鸟氨酸、组蛋白、鱼精蛋白、乙烯亚胺、或其混合物。
佐剂可任选地与细胞配体偶联，(如与运铁蛋白，gp120，LDL(低密度脂蛋白)，α-胎球蛋白，EGF(表皮生长因子)肽或者与其他细胞配体的代表物(如在专利文献WO 93/07283所述的用于通过受体介导的胞吞作用而转运DNA的配体)，碳水化物残基，如甘露糖或岩藻糖(用于巨噬细胞的配体)，或针对细胞表面蛋白的抗体或抗体片段进行偶联。
一些多阳离子佐剂，如与细胞配体任选地偶联的多精氨酸或多赖氨酸可以作为包含DNA的复合物的组份，如质粒DNA的形式。上述DNA可以不含编码功能性肽的序列，这种情况下，该DNA是空质粒。
本发明的一个实施方案中，该DNA含有编码免疫调节蛋白，特别是细胞因子，如IL-2，干扰素，GM-CSF的序列。
为了研究被碱性多氨基酸介导的肽转运的机理，在本发明范围内要测定乳酸脱氢酶(LDH)的释放情况。在多精氨酸处理的试样中，实际上不能检出被释放的LDH的浓度，而在用多赖氨酸培育后，可以在细胞上清液中检测出较高LDH浓度。这些结果表明，多赖氨酸的效应必定是由于细胞膜的通透。
不受规定理论的束缚，本发明药物组合物的功能在于，通过佐剂的辅助，使肽透入靶细胞，或在皮肤内皮层的情况下与细胞结合。靶细胞包括抗原呈递细胞，其中经处理后的肽被呈递给B-细胞和/或T-细胞。靶细胞的实例是巨噬细胞，成纤维细胞，角质形成细胞，郎氏细胞(Langerhans Cells)，树突细胞或B-细胞。
在本发明的范围内，研究在有碱性多氨基酸或糖基化形式的多阳离子的存在下，巨噬细胞样的抗原呈递细胞(APCs)是否导致小肽被大量地吸收。已知所用的糖基是通过受体介导的胞吞作用而被巨噬细胞吸收的。至于APCs，假定它们在体内构成一类细胞，这些细胞吸收肽并呈递其它免疫细胞。体外试验中，在有所测试的佐剂的存在下，APCs胞吞更多的肽抗原，该结果表明，这种佐剂也适用于体内增强将肽呈递给细胞毒性效应细胞的作用及其活化作用，导致对疫苗中的标的物更强有力的总体免疫应答。
除了上面提及的佐剂，佐剂也可以是粒状的组分。原则上该微粒状物质可以是用于制备肽合成柱材料，例如，硅胶或合成树脂的任何物质，只要它们是生理学上可接受的，而且可以由其制备出足够小的，可进入到细胞中的微粒就行。使用粒状佐剂，可以得到肽的局部高浓度，使其易于被细胞吸收。
所用佐剂的种类，其用细胞配体改性时的适应性，或DNA的加入，以及佐剂相对于肽的必要用量都可以用经验来决定。例如，肽对佐剂的具体比例原则上可在较广范围内变化，它可通过滴定法测定。
原则上，佐剂可以用和肽同样的方法测试，该方法分有多个步骤：
可以测试佐剂提高肽与APCs的结合和/或被内在化的能力，例如，第一步，将APCs与荧光标记的肽和佐剂一起进行培育。通过直流式细胞计量计测量并与混有肽的细胞本身进行比较，可以测定由佐剂导致的吸收或结合的增加。
在第二步中，可以将要测试的佐剂在体外进行检定，在有佐剂存在的情况下，是否或在多大程度上导致肽在APCs上的呈递。上述用于测试肽的方法可以用于测定出在细胞上的MHC浓度。
另一个用于测试佐剂功效的方法是使用体外模型系统。其中，将APCs与佐剂和肽一起进行培育，并测定特异性识别所用的肽的T-细胞克隆的相对活性(Coligan等人，1991年；Lopez等人，1993年)。
配制剂的功效也可以通过在经过免疫的试验动物中证实“迟发型超敏反应”(DTH)的细胞免疫应答来证实。
最后，进行动物试验，以测定出配制剂的免疫调节作用。还可以使用已有的肿瘤模型，其中免疫细胞所识别的肽序列是已知的。含有肽和佐剂的疫苗，可以根据肽与佐剂的不同比例施用和按照总量进行施用。防止肿瘤生长是肿瘤疫苗有效性的量度。
本发明的药物组合物可以以非肠道、局部、口服的方式进行施用。优选采用非肠道途径，如皮下的，皮内的或肌内的途径。其中，以皮下的或皮内的途径为宜，以便达到作为靶细胞的皮肤细胞特别是(角质形成细胞，成纤维细胞)，树突细胞，郎氏细胞或巨噬细胞。在肿瘤治疗时，也可以以肿瘤内途径施用肿瘤疫苗。
以非肠道途径施用的本发明组合物，通常采用肽和佐剂在可药用载体(优选含水载体)中的溶液或悬浮液形式。可用的含水载体可以是水，缓冲的水，盐水(0.4％)，甘氨酸溶液(0.3％)，透明质酸及其他类似的已知载体。除了含水载体外，还可使用溶剂，如二甲基亚砜，丙二醇，二甲基甲酰胺及其混合物。上述组合物还可以含有可药用的赋形剂，如缓冲物质及无机盐，以便达到正常的渗透压力和/或实现有效的冷冻干燥。上述添加剂的实例可以是钠盐和钾盐，如氯化物、磷酸盐、蔗糖、葡萄糖、蛋白质水解物、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇。组合物可以用惯用的方法进行除菌，例如用过滤除菌法，组合物可以直接采用上述形式或也可进行冷冻干燥，并在施用前与无菌溶液混合。
在本发明的一个实施方案中，药物组合物被制成局部施用的剂型，例如，皮肤施用或经皮施用的剂型。药物组合物例如可以制成基于聚丙烯酸或聚丙烯酰胺的水凝胶形式(如，Dolobene，Merckle)，或作为软膏，如用聚乙二醇(PEG)作为赋形剂，如标准软膏DAB 8(50％的PEG 300，50％的PEG 1500)，或者作为乳液，特别是作为基于油包水或水包油的微滴乳状液，可选择加入脂质体。此外，适宜的渗透促进剂(夹带剂)有亚砜衍生物，如二甲基亚砜(DMSO)或癸甲基亚砜(Decyl-MSO)，以及Transcutol(二乙二醇单乙基醚)或环糊精，以及吡咯烷酮，如2-吡咯烷酮，N-甲基-2吡咯烷酮，2-吡咯烷酮-5-羧酸或可生物分解的N-(2-羟基乙基)-2-吡咯烷酮以及其脂肪酸酯，脲的衍生物，如十二烷基脲，1，3-双十二烷基脲及1，3-二苯基脲；萜烯，如D-苎烯，薄荷酮，a-萜品油，香芹酮，苎烯氧化物，或者1，8-桉树脑。
其他的剂型还可以包括气溶胶，如用于鼻孔喷雾或用于吸入。
本发明的组合物也通过脂质体而施用，它可以是乳液、泡沫、微胶粒、不溶的单层、磷脂分散液、薄片层、或类似物。它们可用作赋形剂，用于将肽输送到其具体组织标靶，如淋巴组织或肿瘤组织，或者用于延长肽的半衰期。
当把本发明的组合物制成局部施用的剂型时，它也可以含有紫外线吸收剂，以便例如在用于预防黑素瘤的同时，也可用作防晒霜。
本领域专业人员可从“Remington＇s药物科学”，1990年等标准著作中找到合适的佐剂与配方。
附图概述
图1.对DBA/2鼠接种肽KYQAVTTTL以抵抗肥大细胞瘤P815。
图2.对DBA/2鼠接种肽SYFEITHI以抵抗肥大细胞瘤P815。
图3.对DBA2鼠接种肽SYFPEITHI以抵抗肥大细菌瘤P815。
图4.对DBA/2鼠接种肽混合物以抵抗黑(素)瘤M-3。
图5.用局部施用方式对DBA/2鼠接种以抵抗黑素瘤M-3。
图6.对DBA/2鼠接种以抵抗性黑素瘤M-3转移。
图7.经接种肽混合物后，有M-3微转移的鼠被治愈。
图8.用酪氨酸酶对细胞实施多赖氨酸介导的装载。
图9.在治疗模型中，经过接种后的T-细胞活化(经过接种的试验动物的脾细胞释放IFN-γ，作为对M-3细胞的反应)。
图10.通过流感核衣壳肽ASNENMETM和作为佐剂的岩藻糖基化多赖氨酸诱导抗病毒的免疫性(CTL活化作用)。
图11.通过碱性多氨基酸加强肽与APC的结合。
图12.通过碱性多氨基酸使细胞膜通透化(细胞经多赖氨酸或多精氨酸处理后的LDH释放)。
图13.通过多精氨酸使肽内在化。
图14.肽转运入骨髓抗原呈递细胞中。
图15.多阳离子性多氨基酸和组蛋白导致肽向抗原呈递细胞中的转运增加。
图16.转运效率相对于碱性氨基酸的聚合度的关系图。
图17.通过低分子量的多精氨酸转运肽。
图18.肽载量对转运效率的影响。
在下列实例中，若无特别说明，采用下列物质与方法：
A).细胞
a).细胞系
鼠黑素瘤细胞系Cloudman S91(克隆M-3；ATCC No.CCL 53.1)，肥大细胞瘤P815(ATCC No.TIB 64)，单核细胞巨噬细胞细胞系P388 D1(ATCCTIB 63)得自ATCC。这些细胞是在补加有10％FCS，2mML-谷氨酰胺与20微克/毫升庆大霉素的高葡萄糖含量DMEM培养基(“高葡萄糖DMEM”，Life Technologies)中进行培养。用常规方法(PCR-支原体检测试剂盒，Stratagene)检测上述细胞证实没有污染支原体。
鼠细胞系RMA/S(鼠淋巴瘤)已由Karre等人，1986年和Ljunggren等人，1990年，所描述。
b)来自骨髓的抗原呈递细胞
首先，冲洗DBA/2试验鼠的股骨。将骨髓的细胞置于高葡萄糖含量的，含10％FCS，5％马血清，2mM L-谷氨酰胺和20微克/毫升庆大霉素的DMEM培养基中，在有200单位/毫升鼠GM-CSF存在下进行培养(Li等人，1989年；Genzyme，Cambridge，MA.USA)。在最初的5天期间，每24个小时更换三分之二的培养基，以去除未粘附的粒细胞与B-细胞(Inaba等人，1992年)。在第8-10天，通过用PBS/5mM EDTA一起保温，收集粘附的细胞和疏松粘附的细胞并以每孔3×104细胞的浓度接种在8孔显微载片(Nunc，Roskilde，Denmark)上。其中，90％以上的细胞对抗体F4/80(Endogen，Cambridge，MA，USA)显示阳性反应。
B)肽合成
可以按Fmoc方法(HBTU-活化作用，FastmocTM，大小为0∶25毫摩尔)，用TentaGel S PHB(Rapp，Tubingen)作为固相，在肽合成器(具有反馈检测器的433A型，Applied Biosystems，Foster City，Kanada)中合成肽。将肽溶于1MTEAA，pH＝7.3中。并用反相色谱法，在Vydac C18-柱上纯化。然后，用快速(blight time)质谱仪在MAT Lasermat(Finnigan，San Jose，Kanada)上确定其序列。
C)所用的肽的列表
| 肽名称 | 序列 | 相关抗原 | 在蛋白质中的氨基酸编号 | MHC-单元型 |
| kpep117 | SYFPEITHI | 酪氨酸激酶JAK1 | 355-363 | H2-Kd |
| kpep118 | KYQAVTTTL | Tum-P198 | 14-22 | H2-Kd |
| kpep162 | GPPHSNNF GY | Tum-P35B | 4-13 | H2-Dd |
| kpep163 | ISTQNHRAL | P91A | 12-20 | H2-Ld |
| kpep164 | LPYLGWLVF | P815 | 35-43 | H2-Ld |
| kpep143 | RYAEDYEEL | trp-1 | H2-Kd | |
| kpep145 | PYLEQASRI | 酪氨酸酶 | H2-Kd | |
| kpep146 | YYVSRDTLL | 酪氨酸酶 | H2-Kd | |
| kpep150 | YYSVKKTFL | trp-1 | H2-Kd | |
| ASNENMETM | 流感核衣壳肽 | H2-Kb |
肽混合物
用于M-3黑素瘤疫苗的肽混合物I：
kpep143，kpep145，kpep146，kpep150。
用于肥大细胞瘤P815疫苗的肽混合物III：
kpep117，kpep118，kpep162，kpep163，kpep164。
D)疫苗的制备
D1)单独的肽疫苗
a)取肽在PBS中1毫克/毫升的浓度而制备没有佐剂的单独肽对照疫苗。直至注射前的培育时间为室温下4小时。
b)制备含有多赖氨酸作为佐剂的单独肽疫苗(除非另有说明，该多赖氨酸链长为200)。它通过确定量的肽与多赖氨酸在HBS中混合而制备。直至注射前的培育时间为室温下4小时。
i)为了制得含有16微克有效肽的疫苗，把11.8微克多赖氨酸与160微克的肽kpep117，在总容量为1毫升的HBS中混合。
ii)为了制得含有100微克有效肽的疫苗，把74微克多赖氨酸与1毫克的肽kpep117，在总容量为1毫升的HBS中混合。
c)制备具有不完全弗氏佐剂(IFA)的单独肽对照疫苗。它通过将确定量的肽与IFA进行乳化来制备。直至注射前的培育时间为室温下30分钟。
i)为制得含有16微克有效肽的对照疫苗，将192微克的肽kpep117用600微升的IFA在600微升HBS中乳化而制备。
ii)为制得含有100微克有效肽的对照疫苗，将1.2毫克的肽kpep117用600微升的IFA于600微升HBS中乳化。
D2)作为疫苗的肽混合物
a)作为不含佐剂的对照疫苗的肽混合物I，在总容量为1毫升的PBS中含有各为250微克的肽kpep143，kpep145，kpep146，kpep150。
b)作为不含佐剂的对照疫苗的肽混合物III，在总容量为1毫升的PBS中含有各为250微克的肽kpep117，kpep118，kpep162，kpep163，kpep164。
c)制备含有多赖氨酸作为佐剂的疫苗的肽混合物I，通过把1毫克的肽混合物I(含有每种肽各250微克)与74微克的多赖氨酸在HBS中混合。直至注射前的培育时间为室温下4小时。
d)制备含有多赖氨酸作为佐剂的疫苗的肽混合物III，通过把1.25毫克的肽混合物III(含有每种肽各250微克)与93微克的多赖氨酸在HBS中混合。直至注射前的培育时间为室温下4小时。
e)制备含有不完全弗氏佐剂的作为对照疫苗的肽混合物I。通过把1.2毫克的肽混合物I(含每种肽各300微克)用600微升的IFA在600微升HBS中乳化来制备。直至注射前的培育时间为室温下30分钟。
f)制备含有不完全弗氏佐剂的作为对照疫苗的肽混合物III。通过把1.5毫克的肽混合物III(含有每种肽各300微克)用600微升的IFA在600微升HBS中乳化。直至注射前的培育时间为室温下30分钟。
g)为了制得含有多赖氨酸作为佐剂的局部施用制剂，把1毫克的肽混合物I(含每种肽各250微克)与74微克的多赖氨酸，在总容量为400微升的HBS中培育4个小时。把上述制得的混合物搅拌加入1.6克的水凝胶DOLOBENE(Merckle)中。
h)为了制得没有佐剂的对照疫苗的局部施用制剂，把在总容量为200微升HBS的1毫克的肽混合物I(含有每种肽各250微克)搅拌加入1.8克的水凝胶DOLOBENE(Merckle)中。
i)使用MacBroom等人，1992年描述的方法，制备偶联岩藻糖的多赖氨酸(链长为240或200)，得到约40％的取代(所用的原料是由Sigma获得的β-L-岩藻吡喃糖基苯基异硫氰酸酯和多赖氨酸)。
j)当使用运铁蛋白/多赖氨酸偶联物(按文献WO 93/07283描述的方法制备)时，其用量要调整到每毫克肽有75微克的多赖氨酸。如在复合物中整合有质粒DNA(空质粒pSP65，不含LPS，Boehringer Mannhein)时，则其比例为37.5微克DNA/75微克多赖氨酸/1毫克肽。当肽的用量是160微克，而不是1毫克时，则其他组分的量以同样的系数(6.25)减少。
E)疫苗的注射
在皮下注射前，把每组至多8只鼠的试验动物在一个隔离的气室中麻醉。经3.5分钟的氟烷处理后(O2中4％，流速为4)，试验鼠处于约1分钟的麻醉状态。在这期间皮下注射疫苗。
不经预先麻醉处理，就对试验动物进行腹膜内注射。每只试验动物的疫苗注射量为100微升，这相当于每只试验动物接受100微克的单独肽或肽混合物I。在用肽混合物III的情况下，每只试验鼠接受的总肽量为125微克。
F)局部使用的疫苗
在经剃毛的每只试验鼠的皮肤上，整个背部和其耳部，涂擦200毫克膏剂，其中含有100微克的肽或肽混合物I，或125微克的肽混合物I。确切的涂擦用量可用天平控制。
G)鼠模型中使用抗肿瘤生长的疫苗
除非另有说明，用DBA/2型作试验鼠模型，根据WO 94/21808所述原则，在预防性或治疗性的鼠模型中进行测试癌疫苗的效用试验。
实施例1
对DBA/2试验鼠接种抗肥大细胞瘤P815的疫苗。
把160微克由Lethe等人，1992年所述的肿瘤抗原P815(H2-Kd的配体)衍生而得的具有KYQAVTTTL序列的肽，与11.8微克的多赖氨酸300，在500微升的HBS中进行混合，并在室温下培育4小时。然后，添加500微升的EBSS(Earl缓冲盐液)。以一周的间隔，把100微升等份的上述所得混合物给8只试验鼠皮下注射。经上述预免疫处理的一周后，向试验鼠引入肿瘤，方法是每只鼠对侧地注射在100微升EBSS中的5×104细胞的肥大细胞瘤细胞系P815(ATCC No.TIB64，这些细胞表达肿瘤抗原，由后者衍生出肽P815)。试验结果列于图1中(黑方块)。
在平行试验中，将200微克肽与500微升HBS相混合，接着用500微升弗氏佐剂进行乳化。用各100微升的所得乳状液分别对8只试验鼠进行预免疫处理。然后，如上述引入P815细胞以形成肿瘤(图1中的黑圆点)。
为了进行另外的平行试验，如下制备细胞肿瘤疫苗。
把160微克的肽kpep118和3微克运铁蛋白-多赖氨酸(TfpL)，10微克pL和6微克质粒psp65(无LPS)，在500微升HBC缓冲液中混合。经在室温下放置30分钟后，将上述溶液加到具有在20毫升DMEM培养基(10％FCS，20毫摩尔葡萄糖)中的1.5×106个异源成纤维细胞系NIH 3T3(ATCC.No.CRL 1658)的T75细胞培养瓶中，并在37℃中培育。3小时后，向细胞中加入15毫升的新鲜培养基。并在37℃，5％CO2气氛中培育过夜。在施用前4小时，用20gy辐射处理细胞，按WO 94/21808中所述制备疫苗。以一周的时间间隔，用105细胞的疫苗进行预免疫。又经一周后，如上述植入肿瘤(图1中的黑色三角)。发现，含有与多赖氨酸组合的肽的疫苗，对试验鼠提供最好的防止肿瘤形成的作用。
实施例2
对DBA/2鼠接种抗肥大细胞瘤P815的单独肽疫苗。
a)三种单独肽疫苗，其中分别含有在PBS中的单纯肽kpep117(图2a)，或含有在IFA中乳化的肽kpep117(图2b)，或含有肽kpep117与作为佐剂的多赖氨酸(链长：240)(图2C)。分别测试其防止P815肿瘤攻击的保护作用。按照上述D章节所述制备疫苗。每例的注射剂量为100微升。注射采用皮下(sc)或腹膜内(ip)途径。其中，用幼鼠作为阴性对照，而包含分泌GM-CSF的P815细胞的全细胞疫苗用作阳性对照(P815-GM-CSF；对每只试验鼠皮下注射在100微升中的105细胞)。每个试验组有8只鼠。它们分别以7天的间隔接种(sc)疫苗三次。在最后一次接种的一周后，每只鼠对侧引入5×104P815细胞进行肿瘤攻击。每天观测试验鼠。并每周监控任何肿瘤的情况。
当每只试验动物皮下注射100微克肽kpep117以及作为佐剂的多赖氨酸时，能获得最佳的抗肿瘤作用(8只试验鼠中有三只得到防护)，其效用大约与用全细胞疫苗的试验结果(8只试验动物有4只得到防护)一样好。当每只试验动物接种和多赖氨酸一起的16微克的肽时，其抗肿瘤作用就小些(8只试验鼠有2只受保护)，但是，明显地优于PBC中的100微克的肽(图2a，没有防护作用)。但在IFA乳化的情况下，该肽没有达到结合多赖氨酸的肽所具有的作用(图2C)。
b)在P815肥大细胞瘤模型上进行的另一项试验中，比较两个具有不同链长的未改性的多赖氨酸，短链仅具有16个赖氨酸基团(pL16)，长链具有240个基团(pL240)。对照组的试验动物注射100微克肽kpep117，它溶于PBS中或乳化在IFA中。使用两种分泌GM-CSF的细胞对照疫苗作为阳性对照(见a))。一种是由稳定转染P815细胞获得的疫苗，第二种疫苗是用Wagner等人，1992年描述的方法(AVET)经瞬时转染而获得的。这两种全细胞疫苗可使总共8只试验动物中有4只或5只受保护。基于单纯肽或乳化于IFA中的肽的疫苗没有防护作用。所有的试验动物在引入肿瘤后，肿瘤迅速生长。但是，当肽与多赖氨酸一起施用时，该肽疫苗就保护试验动物免遭肿瘤的袭击：使用长链的多赖氨酸(pL240)时，8只试验动物中有2只受保护。当使用短链的多赖氨酸时，8只试验动物有4只受保护。这些结果列于图3中，它们表明单独的肽与作为佐剂的多赖氨酸一起使用时，可提供足够的抗肿瘤的保护作用。该作用与文献中最有效的分泌细胞因子的全细胞疫苗之一相当，而后者是抗肿瘤疫苗接种的标准(Dranoffi等人，1993年；Schmidt等人，1995年)。
实施例3
用含有P815单独肽或P815肽混合物的肿瘤疫苗对DBA/2鼠接种以抗肥大细胞瘤P815。
使用下述肽制备疫苗：
kpep118(每针剂为100微克)
肽混合物III(kpep117，kpep118，kpep162，kpep163，kpep164)，该肽混合物含有至今已知的所有P815肽；每针剂中含有每种肽各25微克)。
用分泌GM-CSF的P815细胞作为阳性对照。
在初步试验中已表明，当将100微克的肽和多赖氨酸一起使用时(7.5微克的多赖氨酸/100微克的肽，符合标准比例；多赖氨酸的链长为200)，肽kpep117具有最好的抗植入的P815肿瘤的保护作用。kpep117的含量愈低(16微克)则其效用愈小。在本实例中，每只试验动物注射100微克的kpep118，在一种情况下只和多赖氨酸联合使用(B组)，另一组与运铁蛋白多赖氨酸联合使用(C组)，第三组与运铁蛋白-多赖氨酸/DNA联合使用(D组)。使用与IFA联合的kpep118作为对照。在本试验中，只用肽kpep118本身时对植入肿瘤没有保护作用。
在实施例4进行的试验中表明，含有黑素瘤肽的肽混合物的疫苗具有抗黑素瘤的保护作用。因此，在本实施例用于测试肽混合物这概念是否也适用于P815。
肽混合物III在一组试验中只与多赖氨酸联合使用(E组)，在另一组试验中与运铁蛋白-多赖氨酸联合使用(F组)，又一组是和运铁蛋白-多赖氨酸/DNA联合使用(G组)。使用在IFA中的肽混合物III作为对照。用幼鼠作为阴性对照，并且GM-CSF转染的P-815细胞作为阳性对照(每鼠为105细胞)。
在本实例中进行的试验发现，与其他的试验比较，是很不典型的，在阳性对照试验组(分泌GM-CSF的细胞)中，在植入肿瘤后，所有的试验动物的肿瘤立刻发展。而，大部分的这些肿瘤像它们形成时一样也很快消失。对此的一种可能的解释是，在肿瘤破坏前，它们有短时生长。第二种可能的解释是，被诊断为肿瘤的肿胀并不出自肿瘤的生长而是强烈的免疫细胞系浸润(肉芽肿)的结果。因为没有进行解剖，所以没法确定其原因。总之，产生的肿瘤最终被破坏。更有趣的试验结果得自试验G组，其中试验动物用肽混合物III与多赖氨酸所组成的组合物处理。所有的试验动物都产生肿瘤，但有两只动物的肿瘤肿胀(或免疫细胞浸润)程度相当小，不再增长，而且鼠并不显示不健康。这两只鼠没有死，而是继续处于监视下。令人惊奇地发现，植入肿瘤后第9个星期，肿瘤已不可检出。这是以前从未观测到的结果。最后八只中有二只试验动物破坏了其肿瘤。上述肿瘤的破坏，应归因于在肽混合物中肽kpep117的含量，如同在实例2中用16微克kpep117时，八只中有二只试验动物受到抗肿瘤的保护，当用100微克kpep117时，八只中有三只试验动物受保护。但保护作用也可以通过该混合物中一个以上的肽而产生。
实施例4
用含有肽混合物的肿瘤疫苗向DBA/2鼠进行预免疫，以提供抗黑素瘤M-3的保护作用。
使用预防性疫苗，其中含有黑素瘤肽的混合物(肽混合物I，上述的D2段)。
按实例2所述步骤，用疫苗进行预免疫，并植入肿瘤，不同的是植入肿瘤时采用M-3细胞(每只试验动物105细胞)；所用的对照疫苗是来自分泌适量IL-2(每105细胞有1000-2000单位)的M-3细胞的全细胞疫苗，并如Schmidt等人，1995年所描述进行制备。在所用的试验条件下，该疫苗获得100％的保护作用(图4)。用含有肽混合物的疫苗对四组试验动物进行试验。有两组试验采用皮下(s.c.)或腹膜内(i.p.)途径注射经IFA乳化的肽，而另两组试验采用皮下(s.c.)或腹膜内(i.p.)途径注射所述肽以及多赖氨酸(pL240)。
图4说明含有多赖氨酸(PL240)佐剂的肽疫苗的保护效用；50％的试验鼠防止了M-3肿瘤的袭击，未受处理的试验鼠的实体肿瘤迅速增长。当皮下注射肽-多赖氨酸疫苗或作为水凝胶涂擦在皮肤上时，可以达到这种效果(图5)。在另三个腹膜内注射肽-多赖氨酸疫苗，或肽-IFA疫苗的对照组中，这些疫苗基本上没有效果。在这里，植入的肿瘤并没有被排斥，与没有处理的对照试验动物相比较，其肿瘤生长仅稍有延迟。这些结果表明，含有肽混合物的疫苗在含有多赖氨酸时，能给出抗肿瘤的保护作用。在所择试验条件下，这种肽疫苗只有细胞IL-2疫苗的效用的一半。后者与最近发表的报告(Zatloukal，1993年；Zatloukal，1995年)相一致，用105M3-活细胞进行肿瘤攻击时，可以使至多达100％的试验动物受到保护。
实施例5
对DBA/2鼠的防M-3转移的保护
a)使用治疗性疫苗，其中含有黑素瘤肽的混合物(肽混合物I，上述D2段所述)。以一周的间隔进行三次疫苗接种(sc)。第一次接种是在植入转移肿瘤五天后进行的，后续接种是为抗五天的转移肿瘤而施用的。为植入转移肿瘤，使用文献WO 94/21808和Schmidt等人，1996年所述方法，注入1.2×104的M-3细胞。
所用疫苗是肽混合物I，其中有不含佐剂的(Pepmix I PBS)，含有IFA作为佐剂(IFA Pepmix I)或含有经岩藻糖改性的多赖氨酸的(fpL Pepmix1)。对照试验组没有接种疫苗(空白)，或实例4所述的产IL-2的M-3全细胞疫苗。
图6中表示，当用含有岩藻糖改性的多赖氨酸作为佐剂的肽混合物I处理试验动物时，将会得到最好的保护(图6a)，50％的试验鼠可以排斥转移肿瘤(4/8鼠)。这种处理甚至优于用全细胞疫苗进行的处理，后者只保护33％的试验鼠(3/9鼠)。用含有IFA的或没有佐剂的肽疫苗仅能延迟转移肿瘤生长成肿瘤(图6b)。
b)在另一个试验中，研究了治疗模型中含有肽混合物I的疫苗皮下施用的保护作用。对照试验组施用PBS中的肽混合物(不含佐剂)或含IFA的肽混合物。用未改性的多赖氨酸240作为佐剂。此外，用岩藻糖修饰型多赖氨酸200(fpL200)作为佐剂。对照试验是用表达IL-2的细胞疫苗处理一组试验动物。如图7a所示，肽-多赖氨酸疫苗在处理M-3-转移肿瘤时是有效的。在本试验中，只有用岩藻糖修饰型多赖氨酸才能达到明显的治愈率。上述处理可以使50％的试验动物排斥转移肿瘤。而与治愈70％试验动物的IL-2疫苗相比较，结果也是好的。
c)在另外的一个试验中，研究了治疗模型中多阳离子的变化和改进对抗肿瘤作用的影响。为此，除了对未改性的和岩藻糖改性的多赖氨酸200外，还对短的未改性的多赖氨酸pL16，长的多赖氨酸pL450，以及其他的多阳离子，即多精氨酸(pArg 720)进行试验。使用分泌适量(每105细胞≥10ng)GM-CSF的M3-细胞疫苗作为阳性对照(Schmidt，1995年)。在本试验中，对照试验组含有在IFA中的肽混合物或没有任一佐剂的肽混合物。如实例5b)中那样，当用岩藻糖-多赖氨酸作为佐剂时，如图7b所示，能得到最好的效果。在这些试验组中，与只有30％排斥的短多赖氨酸pL16组相比较，有40％的试验动物排斥转移肿瘤。除了联合使用多精氨酸和肽的试验组外，其他施用肽疫苗的试验组的试验动物在形成肿瘤前只有短时间的延迟。在本试验中，未改性的多精氨酸却与岩藻糖改进的多赖氨酸具有相同效果，使10只试验动物中有4只排斥转移肿瘤。
图7C表明在分开单独的试验中，用多精氨酸重现了这种作用。在这里，联合使用多精氨酸和肽混合物进行接种，表明可使8只试验动物中有4只具有抗肿瘤作用。
实施例6
使用多赖氨酸作为佐剂的情况下，用酪氨酸酶转载细胞。
本实例表明，多赖氨酸适于作为佐剂用于在细胞上负载较大的蛋白质片段或整个蛋白质，其中用M-3细胞作为细胞实例。
为了加载细胞，首先向160微克FITC标记的酪氨酸酶(EC 1.14.18.1；Sigma)中加入3微克的多赖氨酸(pL240)，并在室温下培育3小时。然后，把所得溶液放入装有2×106M-3细胞的T75细胞培养瓶中，并在37℃下培育。接着用PBS两次洗涤细胞。用PBS/2毫摩尔EDTA使细胞脱粘附，并置入1ml PBS/5％FCS中，以进行FACS-分析。图8表示在M-3-细胞上载有酪氨酸酶的情况(左边曲线表示对照试验，右边曲线表示载有酪氨酸酶的试验)。
实施例7
在治疗性模型中测定免疫接种后的T-细胞活化
肽/多阳离子疫苗在治疗性试验鼠模型中显示效果(参见实例5)后，研究了这种处理是否也会引起T-细胞活化。为此，将接种疫苗的试验动物的脾细胞与亲代M-3细胞进行共培育，使得分泌细胞因子，以此作为标记(Kawakami等人，1994b)。
从已接种疫苗的和未处理的试验动物制取脾细胞的单细胞悬浮液。接着用低渗缓冲液(0.15NH4Cl，1mM KHCO3，0.1mM EDTA，pH7.4)使红细胞溶解。在37℃温度下，在Petri培养皿中，用每毫升DMEM培养基将3×106脾细胞培育90分钟以除去粘附的细胞。将不粘附的细胞谨慎的移液并以不同比例与1×103亲代细胞进行共培养。细胞是在有200μlDMEM培养基(10％FCS)，2mML-谷氨酰胺和20μg/ml庆大霉素的96孔平底-组织培养盘中进行培养。到第九天，收集100微升的上清液，并通过市场购得的ELISA试剂盒(Endogen，Cambridgc，MA，USA)，按厂商提出的指南，测定出IFN-γ含量。从中发现，九天培育后，只有已接种疫苗的动物的脾细胞向培养基中分泌大量IFN-γ。而在M-3细胞和未处理动物的脾细胞的共培养中，实际上没有检出IFN-γ。这些试验结果示于图9中。
实施例8
用流感核衣壳肽ASNENMETM和岩藻糖化多赖氨酸佐剂诱导抗病毒免疫。
使用一种每毫克肽ASNENMETM含有75微克fpLys的疫苗。按方法部分所述，将该疫苗通过单次注射而施用，每只试验动物注入100微克肽/7.5微克fpLys。在对照试验中，只注射100微克纯肽(PBS)，或根本就不进行注射(空白对照试验)。
RMA-S鼠淋巴瘤细胞是在26℃温度下，在无血清的培养基中，用10微克/毫升的肽ASNENMETM培育过夜。
接种疫苗十天后，从接种疫苗的动物中分离出脾细胞。并与载有肽的RMA-S细胞以5∶1的比例相混合，并再次培养5天(Stuber，等人，1994年)。测定在不同培养物中存活的效应脾细胞的量。然后，为了使用标准4小时铕释放试验(Blomberg等人，1993年)测定CTL活性，细胞以不同的比例与事先已和肽ASNENMETM和铕螯合物混合的RMA-S细胞进行混合。如图10所示，在本试验中的特异性免疫只有通过接种含有肽与fpLys的疫苗才能获得，施用只含有肽的疫苗则不能得到。
实施例9
测试各种碱性多氨基酸提高肽被APCs内在化和/或与APC结合的能力。
在本试验中，使用了荧光试验：根据制造商的指南(Molecular Probes)，用荧光染料异硫氰酸荧光素(FITC)标记LFEAIEGFI序列的肽抗原模型(MHC Kd限制型)。MHC Kd-限制性单核细胞巨噬细胞细胞系P388 D1摄取或结合单纯的FITC标记肽(“脉冲”)，或者在该肽和各种不同浓度的碱性多氨基酸(有16-490链长的多赖氨酸，链长为15-720的多精氨酸)的混合物的情况，用直流式细胞计量仪测定。为此，在离心试管中，在最终容积为1毫升的培养基(DMEM/10％FCS)中将1×106个P388 D1细胞和5μg单独的FITC标记肽，或者肽和多氨基酸的混合物，在37℃培育30分钟。接着进行充分洗涤，以去除游离肽。加入的多氨基酸的浓度是每毫升含有5微克FITC标记肽的培养基中有50，25，12，6和3微克。比较不同试样的相对荧光强度，以便评判肽的摄取和/或结合能力。这些试验的结果示于图11，试验是分别用25微克的pL450或pArg450进行的。在所用条件下，多精氨酸的效应比多赖氨酸的高约5倍。
实施例10
研究APCs吸收肽的机理。
APCs可以通过诸如大胞饮作用或受体-介导胞吞作用(Lanzavecchia，1996年)等具体机理吸收肽。另一个机理是由多氨基酸导致细胞膜通透，从而允许肽从培养基质中扩散到胞质中。
a)测试细胞膜的通透可能性，方法是，用市售试剂盒(Cytotox 96，Promega，Madison，Wiscosin，USA)按制造商的指南，测量P388 D1细胞与多氨基酸(多赖氨酸或多精氨酸)一起培育后，在等渗条件下胞质乳酸脱氢酶(LDH)的释放。据图12a所得的结果可知，pLys的作用在于，使细胞膜可通透，其表现为在等渗条件下释放出高浓度的胞质酶。与此相反，经过pArg处理(图12b)后，实际上没有检出LDH。当试样进行比较时，发现当只用多氨基酸进行处理时，与用多赖氨酸或多精氨酸和肽进行联合处理时相比，在LDH释放方面并不存在差异。当只用肽进行培养时，就没有检出LDH活性。
b)在有碱性多氨基酸或没有碱性多氨基酸存在的情况下，研究FITC标记的肽的内在化行为。这是基于Midoux等人，1993年公开的原理：被细胞内在化的颗粒被传输到核内体中。与胞质或有中性pH值的细胞培养基进行比较，这些细胞器是酸性，其pH值约5。由FITC发射的荧光受pH值较大影响。在诸如核内体等pH值环境下，荧光受抑制。因此，由细胞吸收到核内体中的FITC标记肽显示降低的荧光。在加入莫能菌素后，核内体的低pH值被中和，导致内化的FITC标记肽具有可测定的更强的荧光。
在4℃或37℃下，使细胞与多精氨酸(平均分子量为100,000，链长为490)和荧光标记肽的混合物一起培育。将在37℃中培育的一份等分试样作为本底，并在进行直流式细胞计量分析前，在4℃用50μM的莫能菌素处理。
发现，当用特定碱性多氨基酸，如多赖氨酸(pLys)和多精氨酸(pArg)培养APCs时，增强肽被APCs吸收或与APCs结合的能力。
如图13所示，在只用肽处理和用莫能菌素处理的细胞中，只观测到荧光略有增强。与其相比较，发现当用莫能菌素和由多精氨酸和肽组成的混合物处理试样时，其荧光信号大大增强。当在4℃下培育试样时，未观测到肽的吸收。经用莫能菌素处理后，荧光明显增强，这表明负载pArg和肽导致它们在细胞内的小泡中积累(Midoux等人，1993年，图13)。正如所料，负载多赖氨酸的试样经莫能菌素处理后，仅可观测到荧光略有增强。在4℃下负载多赖氨酸则可以导致荧光明显增强，可予以测量，这表明：多赖氨酸的作用主要是归于细胞膜的通透化(图12b)。
实施例11
研究用短链肽装载APCs。
把源于骨髓的和用GM-CSF取得的APCs，用由荧光标记肽和多赖氨酸(pL 200；Sigma)组成的组合物，或者用单纯的肽通过荧光显微镜进行研究。为了用显微镜检测肽的吸收，将APCs放在载物片上，并在37℃下，用40微克单纯的荧光素标记肽LFEAIEGFI或用由50微克/毫升多赖氨酸(pL200)与40微克/毫升肽LFEAIEGFI所组成的混合物，培育30分钟。经充分洗涤后，用4％的多聚甲醛固定这些细胞，并用抗-褪色剂(Dako，Glostrup，丹麦)覆盖，然后用荧光显微镜(Zeiss)检测。用4，6-二脒基2-苯基吲哚(DAPI；Sigma)对核进行复染。如同图14的荧光显微照片所示，与肽和多赖氨酸一起培育的细胞(A)比只用肽处理的细胞(B)相比较，显示出明显更强的肽吸收能力。只用肽处理的细胞(“脉冲”)中所显示的荧光是分散的，并呈粒状，而在有多赖氨酸的情况下以肽装载的细胞显示强烈荧光，并通常是均匀分布在整个细胞上。
实施例12
用直流式细胞计量仪对载有肽的细胞进行定量测定(“TransloadingAssay”-“转载试验”)。
a)通过实例11的试验可知，载有小肽的APC是最好的靶细胞。接下来在体外进行FACS试验，以便鉴定出用于肽疫苗的适用佐剂。这个试验允许快速定量测试荧光标记的肽；用LFEAIEGFI序列的肽作为模式肽。在这些试验中，用鼠细胞系P388 D1作为APC。在37℃，把1×106个细胞放入终容积为1毫升的高葡萄糖DMEM培养基和10％FCS中，与5微克肽(其中荧光素终浓度为5nmol/ml)一起进行培育。将上述细胞用单纯的肽，或者用肽和多阳离子的组合物，或用肽和组蛋白的组合物，在如图15所示浓度递增(3-50微克/毫升)的情况下进行处理。其中，要使用下列化合物：A：聚鸟氨酸(平均分子量110,000，链长为580)；B：富含精氨酸的组蛋白；C：富含赖氨酸的组蛋白；D：多精氨酸(平均分子量100,000，链长490)；E：多赖氨酸(平均分子量94,000，链长450)。在初步试验中发现，经30分钟的培育时间，可以得到最大的肽吸收。更长处理时间(例如4或8个小时)，其荧光信号也没有明显增加。在进行分析前，细胞用大量的含0.2％BSA的PBS洗涤五次。然后，把细胞放入1ml冰冷的PBS/0.2％BSA中，并用流式细胞计量仪(FACScan；Becton Dickinson，San Jose，CA，USA)进行分析。
结果证明，在选定的条件下，多精氨酸和多赖氨酸是最有效的佐剂，多鸟氨酸显示细胞毒性作用。多精氨酸和多赖氨酸所引起的肽吸收量的增加是与浓度是有关的(图15d，e)。吸收量也随着链长而增加(图16)。
结果还观测到，多精氨酸比多赖氨酸具有更宽的适用浓度范围，其中多精氨酸相对于对照增加了10的3次方，而多赖氨酸相对于对照最多增加不到10的2次方，而且多精氨酸使用所有链长时传输蛋白质的有效性都高于多赖氨酸(图16)：即使在非常低的浓度，如3微克/毫升的情况下，多精氨酸也允许充分的传送。然而，对于多赖氨酸，则需要＞25微克/毫升的浓度来获得荧光的明显增强(图15d，e)。
b)为了验证在肽传输作用中是否存在链长的下限，合成了各种不同链长的多精氨酸(10-30基团)，在有高浓度多阳离子的存在下，测定其增加肽传输的能力(图17)。在这些试验中，使用序列为LFEAIEGFI的肽，而所试验的多精氨酸聚合物的浓度是100微克/毫升。
即使使用最短链长的多精氨酸进行试验，也能测出肽传输的增加，只不过这种增加是微小的。
c)碱性氨基酸是正电荷的分子。因此，可以假设：通过静电的作用，可以使负电荷的肽结合到这些多阳离子上。这就有可能使肽吸收加强。为了验证上述假设，比较了阳离子多氨基酸将短链肽吸收入P388 D1细胞中的能力相对于其电荷的函数。在下表中，列出了所用的负电荷肽，它们都满足了与MHC-I结合时的所有必要条件(Rammensee，等人，1995年)。肽1是从鼠-TRP(酪氨酸酶相关蛋白)衍生的。肽2是由流感血凝素(Schmidt等人，1996年)衍生的，肽3来自鼠-酪氨酸酶，肽4来自P198肿瘤抗原，肽5来自β-半乳糖苷酶(Gavin等人，1993年)。(“Mr”代表分子量范围，“Fluor”表示荧光素)。
表
| 序列 | Mr | Mr Fluor | 电荷 | 电荷+fluor |
| YAEDYEEL | 1031 | 1389 | 4×负 | 6×负 |
| LFEAIEGFI | 1038 | 1396 | 2×负 | 4×负 |
| IFMNGTMSQV | 1127 | 1485 | 中性 | 2×负 |
| KYQAVTTTL | 1024 | 1382 | 1×正 | 1×负 |
| TPHPARIGL | 961 | 1319 | 2×正 | 中性 |
由于用荧光素标记肽时所用的方法，引入了两个负电荷。结果发现，用多精氨酸培育后，有最高负电荷值的肽(每个样品5nmol)被最有效地传输入P388 D1细胞中，这表明：在肽与多阳离子之间的离子相互作用进一步提高了肽向细胞中的传输(图18)。但是与只用肽处理的细胞比较，在有多阳离子存在时，在中性肽的情况下吸收量较大。只用肽进行处理的情况下，其结果实际上和试验的所有肽具有相类似的荧光信号。用肽LFEAIEGFI得到的荧光信号在图18中以“单独肽”表示，作为代表例。
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Claims (33)
1.药物组合物，它含有
a)至少一种抗原肽，所述抗原肽与个体所表达的MHC分子的结合叉口相吻合并结合，以及
b)一种佐剂，其选自：
i.多精氨酸，
ii.经修饰或未经修饰的多赖氨酸，
iii.多鸟氨酸，
iv.组蛋白，
v.鱼精蛋白，
vi.多乙烯亚胺，或
vii.它们的混合物，该佐剂能提高所述肽与所述个体的抗原呈递细胞的结合和/或促进所述肽进入所述抗原呈递细胞，并因此有益于加强该肽的免疫调节作用。
2.根据权利要求1的药物组合物，其特征是，所述肽的细胞分解产物或片段是所述个体所表达的至少一种MHC分子的配体。
3.根据权利要求2的药物组合物，其特征是，所述肽的细胞分解产物或片段是MHC-I分子的配体。
4.根据权利要求2的药物组合物，其特征是，所述肽的细胞分解产物或片段是MHC-II分子的配体。
5.根据权利要求中1-4中之一的药物组合物，其特征是，它含有从病原体的蛋白质衍生的肽。
6.根据权利要求5的药物组合物，其特征是，该肽是从细菌蛋白质衍生的。
7.根据权利要求5的药物组合物，其特征是，该肽是从病毒蛋白质衍生的。
8.用作肿瘤疫苗的根据权利要求1-4中之一的药物组合物，其中所述肽是肿瘤抗原或者是从肿瘤抗原衍生的。
9.用于治疗的根据权利要求8的药物组合物，其特征是，所述肿瘤抗原是从所述个体所表达的肿瘤抗原衍生的。
10.用于预防的根据权利要求8的药物组合物，其特征是，该肿瘤抗原是从常见的肿瘤抗原衍生的。
11.根据权利要求8的药物组合物，其特征是，所述肿瘤抗原是黑素瘤抗原。
12.根据权利要求8的药物组合物，其特征是，该组合物还含有细胞因子。
13.根据权利要求12的药物组合物，其特征是，该细胞因子选自IL-2，IL-4，IL-12，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，IFN-ω，TNF-α，GM-CSF或其混合物。
14.根据权利要求2的药物组合物，其特征是，它含有与所述个体的不同MHC-亚型结合的一组肽。
15.根据权利要求2的药物组合物，其特征是，它含有一或多种肽，它们是从天然产生的免疫原性蛋白或肿瘤抗原或其细胞分解产物中衍生的。
16.根据权利要求2的药物组合物，其特征是，它含有一或多种肽，它们不同于从天然产生的免疫原性蛋白或肿瘤抗原或其细胞分解产物中衍生的肽。
17.根据权利要求1的药物组合物，其中所述肽是从引起自身免疫病的蛋白衍生的肽的拮抗物。
18.根据权利要求1的药物组合物，其特征是，所述佐剂是一种有机的多聚阳离子，或者是有机的多聚阳离子的混合物。
19.根据权利要求18的药物组合物，其特征是，该肽是负电荷的。
20.根据权利要求18或19的药物组合物，其特征是，该佐剂是一种碱性多氨基酸，或者是碱性多氨基酸的混合物。
21.根据权利要求20的药物组合物，其特征是，该佐剂是多精氨酸。
22.根据权利要求20的药物组合物，其特征是，该佐剂是多赖氨酸。
23.根据权利要求18的药物组合物，其特征是，所述佐剂与一种细胞性配体偶联。
24.根据权利要求23的药物组合物，其特征是，该配体是碳水化合物基。
25.根据权利要求24的药物组合物，其特征是，该配体是岩藻糖。
26.根据权利要求23的药物组合物，其特征是，该配体是运铁蛋白。
27.根据权利要求18的药物组合物，其特征是，它还含有DNA，该DNA不含有编码功能性蛋白质的序列。
28.根据权利要求18的药物组合物，其特征是，它还含有编码免疫调节蛋白的DNA。
29.根据权利要求28的药物组合物，其特征是，该免疫调节蛋白是选自IL-2，IL-4，IL-12，IFN-α，IFN-β，IFN-γ，IFN-ω，TNF-α，或GM-CSF的细胞因子。
30.根据权利要求1的药物组合物，为非肠道给药剂型。
31.根据权利要求30的药物组合物，其特征是，它是所述肽和佐剂在可药用载体中的佐剂溶液或悬浮液。
32.局部应用的根据权利要求1的药物组合物，它为局部给药剂型。
33.根据权利要求32的药物组合物，是水凝胶形式的。
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