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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Identifizierung von Zytokin sekre- tierenden Zellen, insbesondere ELISPOT-Assays.
T-Lymphozyten spielen bei der Bildung, Lenkung und Ausführung zellulärer Immunantworten eine entscheidende Rolle. Es gibt 2 gut definierte Subpopulationen von T-Zellen: T-Helfer- (Th) und zytotoxische T-Zellen (CTL).
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gen-präsentierende Zellen (APC) - erkennt und mit ihm interagiert, wird die Th-Zelle aktiviert und wird ein Effektorlymphozyt, der verschiedene Zytokine sekretiert. Diese Zytokine spielen eine wichtige Rolle bei der Aktivierung und Hilfe von B-Zellen, Tc-Zellen, NK-Zellen, Makrophagen, den- dritischen Zellen und verschiedenen anderen Zellen, die an Immunantworten beteiligt sind. Unter- schiede im Muster der Zytokine, die von aktivierten Th-Zellen erzeugt werden, führen zu qualitati- ven Unterschieden bei den Arten von Immunantworten, die sich entwickeln.
CTL-Vorläufer-Lymphozyten andererseits erkennen einen Antigen-MHC I-Komplex mit Hilfe ih- res Antigen-spezifischen T-Zellenrezeptors. Dies führt zur Vermehrung und Differenzierung zu Ef- fektorzellen, die als zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) bezeichnet werden. MHC-Klasse I-Molekü- le werden von jeder nukleierten Zelle exprimiert. CTLs erkennen proteinartige Antigene in Form von kurzen, im Allgemeinen 8 bis 11 Aminosäuren langen Peptiden, die an MHC-Klasse I gebun- den sind. Die vitalen Funktionen von CTL sind die Beobachtung von Zellen des Körpers und die Eliminierung "veränderter" Selbstzellen (z. B. Virus-infizierte Zellen, Zellen, die intrazelluläre Bakte- rien oder Protozoen beherbergen, sowie Tumorzellen).
Antigen-spezifische CTL sekretieren Zytoki- ne, die sich von jenen unterscheiden, die von Th-Zellen sekretiert werden, wenn ihre T-Zellenre- zeptoren an einen bestimmten MHC-Klasse I-Peptidkomplex einschliesslich Interferon-y binden.
Daher ergibt die Identifizierung der verschiedenen Zytokine, die durch aktivierte Lymphozyten synthetisiert werden, und die Messung der Anzahl von Zellen, die diese Zytokine sekretieren, die während einer Immunantwort gebildet werden, ein Mass für die Qualität und Quantität der Immun- antwort, die gegen ein bestimmtes Antigen aufgebaut wird (Okamoto Y et al., Immunopharmaco- logy (1998): 39 (2), 107-16).
Zur Messung von Zytokinen werden allgemein verschiedene Assays verwendet, z.B. ELISA sekretierter Zytokine, "Limiting Dilution Assays" [limitierende Verdünnungs-Assays], traditionelle CTL-Assays auf Basis der Freisetzung radioaktiven Chroms (51Cr), RT-PCR von Zytokin-mRNA und enzyme-linked immunosorbent spot assay (Festphasen-Enzymimmuno-Spot-Assay, ELIS- POT-Assay). Der ELISPOT-Assay detektiert Zytokinmoleküle, die von einzelnen Zellen sekretiert werden (Czerkinsky C., J. Immunol. Methods (1988): 110, 29). Dieser Assay ist extensiv verwendet worden, um die CTL-Antworten in Tiermodellen sowie auch bei Menschen aufzuzählen. Da die Zytokinproduktion auf dem Niveau einzelner Zellen gemessen wird, ist dieser Assay äusserst emp- findlich.
Der Assay wird in Mikrotiterplatten durchgeführt, die mit Antikörpern vorbeschichtet sind, die für das in Frage kommende Zytokin spezifisch sind, welche das Zytokin in der unmittelbaren Umgebung der sekretierenden Zelle fangen. Tatsächlich ist die ELISPOT-Technik um vieles emp- findlicher als die Messung der Zytokinproduktion mittels ELISA (Miyahira Y. et al., J. Immun. Met.
(1995) : 181, 45), Scheibenbogen C. et al., Clin. Can. Res. (1997) : 3,221-226; Tanguay et al., Lym- phokine and Cytokine Res. (1994) : 13,259), Limiting Dilution Analysis (Scheibenbogen C. et al., Clin. Can. Res. (1997): 3,221-226) oder traditionelle CTL-Assays auf der Basis der Freisetzung von 5 C1 (Lalvani A. et al., J. Exp. Med. (1997) : 186 (6), 859 ; Y. et al., J. Immun Met.
(1995) : 181,45). Ausserdem kann dieser Assay ohne radioaktive Verbindungen durchgeführt wer- den und ist weniger zeitaufwendig als eine limitierende Verdünnungsanalyse (Miyahira Y. et al , J.
Immun. Met. (1995): 181, 45). Weiters ermöglicht dieser Assay eine direkte Beurteilung der Anzahl aktivierter Effektor-T-Zellen (Murali-Krishna K. et al., Immunity (1998) : 8,177-187; Miyahira Y. et al., J. Immun. Met. (1995): 181, 45; Herr W. et al., J. Immun. Met. (1996)- 191, 131; Herr W. et al., JIB (1998) : 178,260-266).
Für die Messung der Zytokinproduktion durch T-Lymphozyten im ELISPOT-Assay müssen T-Zellen stimuliert werden, zum Beispiel durch Antigen präsentierende Zellen, die mit endogen zugesetztem (zugesetzten) Peptid(en) beladen sind. Um den Hintergrund zu reduzieren und die Verhältnisse zwischen Signal und Rauschen zu verbessern - schwere Nachteile üblicher ELIS- POTs-, wurde versucht, die Bindung exogener spezifischer Antigene an MHC-Moleküle noch
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(Herr et al., J. Immunol. Meth. (1996) : 191,131-142). Obwohl die Zugabe von freiem menschli- chem #2-Mikroglobulin die allgemeine HLA-A2.1-Zellenoberflächenexpression erhöht und die spe- zifische Bindung exogener Peptide verstärkt (Nijman at al., Eur. J. Immunol.
(1993) : 23,1215- 1219), wurde im Zuge der vorliegenden Erfindung gefunden, dass die Zugabe von #2-Mikroglobulin das Verhältnis von Signal zu Rauschen des ELISPOT-Assays nicht signifikant verbessert (siehe Beispiele).
Neben #2-Mikroglobulin ist auch von vielen anderen Substanzen gezeigt worden, dass sie die Peptid-Antigen-Präsentation verstärken ; ihnen sind polykationische Moleküle, wie Poly(L)-Ly- sin (siehe deKroon et al., PNAS (1993): 8797-8801).
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Identifizierung von Zytokin sekretierenden Zellen zur Verfügung zu stellen. Eine weitere Aufgabe besteht darin, einen verbesserten ELISPOT-Assay zur Verfügung zu stellen, insbesondere einen ELISPOT-As- say mit einem hohen Verhältnis von Signal zu Rauschen. Dieses neue und verbesserte Verfahren sollte nicht von sehr teuren Substanzen, wie #2-Mikroglobulin, abhängig sein.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren zur Identifizierung von Zytokin sekretierenden Zellen erreicht, welches Verfahren durch die folgenden Schritte gekennzeichnet ist: - Zur-Verfügung-Stellung einer Suspension von Zellen, die Antigen-spezifische Zellen enthält, die in der Lage sind, bei Aktivierung mit einem spezifischen Antigen mindestens eine Art von
Zytokin zu sekretieren, - Inkubation der Zellsuspension mit dem spezifischen Antigen in Gegenwart einer polykationi- schen Substanz, was zu einer Zytokinsekretion der Antigen-spezifischen Zellen führt, und - Identifizierung der Zytokin sekretierenden Zellen durch Nachweis des sekretierten Zytokins.
Überraschenderweise ist gefunden worden, dass die Zugabe von polykationischen Substanzen in einem Assay zur Identifizierung von Zytokin sekretierenden Zellen, wie ELISPOT-Assays, das Verhältnis von Signal zu Rauschen dramatisch verbessert. Daher ist es möglich, die hohe Empfind- lichkeit z. B. eines ELISPOT-Assays beizubehalten, auch wenn Personen mit relativ niedrigen Werten von zirkulierenden CTLs getestet werden. Es ist gefunden worden, dass die Zugabe von #2-Mikroglobulin alleine einen bestimmten Assay nicht signifikant optimiert. Tatsächlich ist die Wirkung polykationischer Substanzen bei weitem grösser als die Wirkung von #2-Mikroglobulin.
Daher ist es möglich, einen solchen Test auch in Abwesenheit von #2-Mikroglobulin, jedoch in Ge- genwart polykationischer Substanzen mit einem hohen Verhältnis von Signal zu Rauschen durch- zuführen.
Vorzugsweise wird die Sekretion von Zytokinen durch Verwendung eines ELISPOT-Assays nachgewiesen, für welchen zahlreiche Arten der Durchführung beschrieben worden sind (siehe z.B. Czerkinsky et al., "The Solid Phase Enzyme-Linked Immunospot Assay (ELISPOT) for Enume- rating Antibody Secreting Cells: Methodology and Applications" [Der Festphasen-Enzymimmuno- Spot-Assay (ELISPOT) zur Aufzählung Antikörper sekretierender Zellen: Methoden und Anwen- dungen], insbesondere Kapitel 10, S. 217-240, ELISA and Other Solid Phase Immunoassays: Theoretical and Practical Aspects [ELISA und andere Festphasen-Immunoassays: Theoretische und praktische Aspekte] (1988) ; US 5,939,281 ; 5,750,356 und EP 0 957 359 A2). Im Allgemei- nen wird bei einem ELISPOT-Assay ein fester Träger zur Verfügung gestellt (z. B.
Vertiefungen von Mikrotiterplatten; die Vertiefungen der Mikrotiterplatten enthalten oft eine Membran, z. B. mit Nitro- zellulose besprenkelte Mikrotiterplatten). Diese festen Träger werden mit Mitteln zum Fangen beschichtet - für Zytokine z.B. monoklonale oder polyklonale Anti-Zytokin-Antikörper. Nach dem Beschichten und Blockieren werden die Behältnisse oder Vertiefungen mit einem Assaymedium gefüllt, das dafür geeignet ist, es den Zytokin produzierenden Zellen zu ermöglichen, bei Aktivie- rung mit einem bestimmten Antigen ein Zytokin zu sekretieren. Dann werden die Zytokin sekretie- renden Zellen zusammen mit dem Antigen zugegeben.
Das Antigen kann von APC präsentiert werden, die in der zu untersuchenden Probe enthalten sind, oder spezifischen HLA-kompatiblen APCs, die mit dem spezifischen Antigen geladen oder gepulst wurden, oder von Antigen-bela- denen MHC-Molekülen in Gegenwart von co-stimulierenden Molekülen. Während der Inkubation kommt es zur Aktivierung, was den Zytokin sekretierenden Zellen ermöglicht, Zytokine zu sekretie- ren. Nach einer bestimmten Zeit, die von den Zellen und den Kulturbedingungen abhängig ist (d.h. nachdem geeignete Mengen von Zytokinen von den Zellen sekretiert worden sind, um eine gute (optimale) Detektion dieser Moleküle im gegebenen System zu ermöglichen), werden die Zellen
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durch Waschen entfernt, und die gefangenen Zytokine werden detektiert.
Die Detektion der gefan- genen Zytokine wird vorzugsweise durch polyklonale oder monoklonale Antikörper und, wenn ein monoklonaler Antikörper in der Vertiefung immobilisiert worden ist, durch einen monoklonalen Antikörper durchgeführt, der ein anderes Epitop des Zytokins als das immobilisierte identifiziert Der detektierende Antikörper wird dann durch übliche Verfahren identifiziert und quantifiziert, wie Markierung mit Farbe entwickelnden Enzymen, Radioaktvität, oder Fluoreszenz.
Obwohl der EISPOT-Assay auf Grund seiner hohen Spezifizität bevorzugt wird, ist die vorlie- gende Erfindung auch auf alle anderen Assays anwendbar, die die Zytokinsekretion nach einer Stimulierung messen (z. B. die oben genannten Assays, z.B. ELISA oder 51Cr-Freisetzung, limitie- render Verdünnungs-Assay oder RT-PCR).
Die Auswahl und Optimierung der Parameter für solche Assays, wie die Fangmittel für die Zy- tokine, Antikörper, Zelltypen, Kulturbedingungen, Nachweismittel für Zytokine etc., ist für einen Fachmann Routine und für die vorliegende Erfindung nicht kritisch. Zum Beispiel können die Modi- fikationen gemäss EP 0 957 359 A2 angewendet werden, wie die Reduktion der Nachweisfläche, die Anwendung von Nachweismitteln, wie eine CCD-Kamera, der Nachweis von Spotgrössen, Vielfarbenreaktion, Auftragungsflächen etc.
Das Zytokin kann vorzugsweise aus Interleukinen, insbesondere Interleukin 2, Interleukin 4 und Interleukin 5, Interferonen, insbesondere Interferon-y, Tumornekrosefaktoren (TNF), insbesondere TNF-alpha, koloniestimulierenden Faktoren, insbesondere GM-CSF, oder Mischungen davon ausgewählt werden. Wenn mehr als ein Zytokin oder Mischungen von Zytokinen getestet werden sollen, wird die Anwendung von doppelt- oder dreifarbigen ELISPOT-Assays (Okamoto et al., Immunopharm. (1998) : 39,170-116) bevorzugt, z. B. mit unterschiedlich markierten Detektionsanti- körpern (z. B. verschiedene Enzymreaktionen, Fluoreszenzmarker etc. ). Die Antigen-spezifischen (Responder-) Zellen, die in der Lage sind, entweder nach der Stimulierung durch spezifisches Antigen oder nach polyklonaler Stimulierung Zytokine zu sekretieren, sind für die vorliegende Erfin- dung nicht kritisch.
Dies gilt auch für die Antigen-präsentierenden Zellen. Standard Responderzel- len, die üblicherweise in ELISPOT-Assays beobachtet werden, sind ConA-stimulierte Zellen, B-Lymphozyten, T-Lymphozyten und andere periphere mononukleare Blutzellen, einschliesslich kurzzeitige Zelllinien, zytotoxische T-Lymphozyten, insbesondere CD8+ und CD4+ T-Zellen oder Mischungen davon. Beispiele für Antigen-präsentierende Zellen sind autologe professionelle Anti- gen-präsentierende Zellen, wie Monozyten oder dendritische Zellen, HLA-kompatible T2-Zellen oder RMA-5-Zellen oder Zellen, die mit geeigneten MHC-Molekülen transfiziert sind/diese expri- mieren, sowie co-stimulierende Moleküle. Alternativ dazu können isolierte MHC-Moleküle, die mit Peptid beladen sind, zusammen mit co-stimulierenden Molekülen für die Aktivierung der Effektor- zellen verwendet werden.
Polykationische Substanzen sind vorzugsweise organische Polykationen oder eine Mischung von organischen Polykationen, die in der WO 97/30721 beschrieben sind. Obwohl gezeigt worden ist, dass diese Substanzen in vitro und in vivo eine sehr effiziente Beladung von APC mit Antige- nen ermöglichen, ist das Verhalten dieser Substanzen in den vorliegenden Assays völlig unerwar- tet, insbesondere im Hinblick auf das Verhalten von #2-Mikroglobulin, das einen pl von 5,3-5,7 hat.
Bevorzugte polykationische Substanzen sind ausgewählt aus polykationischen Polypeptiden, organischen Polykationen, basischen Polyaminosäuren oder Mischungen davon. Diese Polyamino- säuren sollten vorzugsweise eine Kettenlänge von mindestens 4 Aminosäureresten haben, beson- ders bevorzugt sind Substanzen wie Polylysin, Polyarginin und Polypeptide, die mehr als 50% basische Aminosäuren in einem Bereich von mehr als 8, insbesondere mehr als 20 Aminosäure- resten aufweisen, oder Mischungen davon. Bevorzugt enthält das Polypeptid mehr als 80%, insbe- sondere mehr als 90% basische Aminosäuren und enthält mehr als 30 Aminosaurereste.
Diese polykationischen Verbindungen können chemisch oder rekombinant hergestellt werden oder können von natürlichen Quellen stammen. Es ist auch möglich, Polypeptide durch Einfügung zusätzlicher kationischer Gruppen chemisch zu modifizieren.
Vorzugsweise werden die polykationischen Substanzen in Konzentrationen zwischen 1 und 30 ug/ml angewendet, insbesondere zwischen 5 und 20 pg/ml, z. B. im Fall von Poly-L-arginin (PR60). Für alle anderen polykationischen Substanzen kann die optimale Konzentration im erfin- dungsgemässen Verfahren von einem Fachmann leicht ermittelt werden.
Wie oben dargelegt, wird bevorzugt, die Zytokm sekretierenden Zellen mit einem spezifischen
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Antigen zu aktivieren, indem das Antigen an Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) präsentiert wird, die mit dem Antigen beladen worden sind. Dies ist auch z.B. für ELISPOT-Assays üblich. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird dieses Beladen oder Pulsen der Antigen-präsentierenden Zellen mit dem Antigen in Gegenwart polykationischer Substanzen durchgeführt. Alternativ dazu können die kationischen Verbindungen vor dem Beladen der APC mit Antigen zugesetzt werden. Wenn isolierte MHC-Moleküle mit Antigen beladen werden, kann dieses Beladen auch in Gegenwart polykationischer Substanzen erfolgen.
Gemäss einem weiteren Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Kit zur Identifizie- rung von Zytokin sekretierenden Zellen, umfassend - ein Reagens zur Aktivierung dieser Zytokin sekretierenden Zellen umfassend das spezifi- sche Antigen, - eine polykationische Substanz oder eine Mischung polykationischer Substanzen und - Reagenzien zum Nachweis mindestens eines Zytokins.
Mit dem vorliegenden Kit können Sonden, die Antigen-spezifische Zellen enthalten, die in der Lage sind, bei Aktivierung mit einem spezifischen Antigen mindestens eine Art von Zytokin zu sekretieren, auf effiziente Weise mit signifikant reduziertem Hintergrund analysiert werden.
Vorzugsweise beeinflusst das Reagens zur Aktivierung der Zytokin sekretierenden Zellen APC, insbesondere APC, die bereits mit dem spezifischen Antigen gepulst worden sind.
Wenn isolierte MHC-Moleküle und co-stimulierende Moleküle zur Aktivierung der Effektorzellen verwendet werden, können diese lyophilisiert zusammen mit dem Peptid zur Verfügung gestellt werden.
Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform werden Peptide alleine oder HLA-kompatible Anti- gen-präsentierende Zellen plus Peptide oder MHC-Moleküle plus Peptide und co-stimulierende Moleküle als aktivierende Reagenzien verwendet.
Das Reagens zum Nachweis von mindestens einem Zytokin umfasst vorzugsweise Zytokinan- tikörper, insbesondere markierte Antikörper.
Als weitere Komponenten kann das Kit ein Behältnis für die Zytokin sekretierenden Zellen ent- halten, vorzugsweise mit Mitteln zum "Einfangen" ("capturing") der Zytokine. Beispiele für ein sol- ches Behältnis sind Mikrotiterplatten auf Basis von Nitrozellulose, gegebenenfalls bereits mit Zyto- kin-spezifischen Antikörpern beschichtet. Andere bevorzugte Ausführungsformen schliessen Mikro- titerplatten auf Basis anderer Membranen, wie PVDF oder gemischten Zelluloseestern, oder Be- hältnisse mit ähnlichen Abmessungen wie Mikrotiterplatten auf Basis einer der oben genannten Membranen ein.
Das erfindungsgemässe Kit kann weiters auch Vergleichsreagenzien (wie ein Vergleichsantigen und die entsprechenden, Antigen aktivierenden Substanzen oder polyklonal stimulierende Verbin- dungen, wie ConA oder Phorbolester und lonomycin), Standardisierungsmittel, z. B. für die Quanti- fizierung des Nachweises der Zytokine, zusätzliche Nachweismittel, wie Zähl- oder Datenverarbei- tungsmittel oder Mikroskope zum Zählen der Farbspots oder elektronische Geräte zur Durchfüh- rung solcher Tätigkeiten enthalten. Das Kit kann weiters schriftliche Anweisungen oder Vergleichs- tabellen oder Graphiken enthalten. Ausserdem können einige oder alle Reagenzien in lyophilisierter oder stabilisierter Form zur Verfügung gestellt werden, um Lagerstabilität zu gewährleisten. Die Zellen werden gefroren zur Verfügung gestellt.
Isolierte MHC-Moleküle können bereits vorbe- schichtet an die Membran geliefert werden.
Das Kit kann auch Reagenzien zur Abtrennung von Responderzellen von Originalproben, wie T-Zellen von peripheren Blutmonozyten, enthalten. Solche Reagenzien sind Medien zur Auftren- nung durch Zentrifugieren, wie Ficoll, oder Gefässe, die bereits ein Antikoagulans und Trennmedi- um enthalten.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und Figuren weiter dargestellt, sie ist jedoch natürlich nicht darauf beschränkt.
Fig. 1 zeigt die Wirkung von #2-Mikroglobulin und die optimale Anzahl von T-Zellen.
Fig. 2 zeigt die Wirkung von pKRR10 auf menschlichen IFN y ELISPOT.
Fig. 3a und 3b zeigen die Wirkung von pR 60 auf menschlichen IFN y ELISPOT.
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Beispiele
MATERIALIEN UND METHODEN:
Der menschliche IFN y ELISPOT-Assay wurde im Wesentlichen durchgeführt, wie von Herr W. et al./ J. Immunological Methods (1997) : 203 ; beschrieben, jedoch mit geringfügigen Modi- fikationen:
T2-Zellen wurden als APC verwendet. Die Zellen wurden in komplettem RPMI 1640 (RPMI 1640 (RPMI = Roswell Park Memorial Institute 1640) + 2 mM L-Glutamin, 0,1 mM nicht essentielle Aminosäuren, 50 g/ml Gentamycin und 50 um 2-Mercaptoethanol (alle von LifeTechnology)), supplementiert mit 20% Kälberfetalserum (FCS, SIGMA) gezüchtet. T2-Zellen wurden nur 8 Wo- chen lang kultiviert und dann verworfen. Frisch aufgetaute T2-Zellen wurden 2 Wochen vor ihrer ersten Verwendung in Kultur gehalten. 3 Tage vor dem Pulsieren der T2-Zellen mit dem Peptid wurde die Anzahl der Zellen auf 4 x 105 c/ml gebracht.
T2-Zellen wurden über Nacht mit Peptid beladen. Zu diesem Zweck wurden die Zellen 2 mal mit PBS, 1% menschlichem Albumin (SIGMA) gewaschen. Danach wurden die Zellen in komplet- tem RPMI 1640 ohne FCS verdünnt, und die Anzahl der Zellen wurde auf 2,5 x 106 c/ml gebracht Das Medium wurde entweder mit Peptid alleine (10 g/ml) oder mit einer Kombination von Peptid und #2-Mikroglobulin (10 g/ml, ICN) oder Peptid und Poly-L-arginin (pR60) oder dem Oligopeptid
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befeuchteten Inkubator gepulst.
MultiScreen-HA Mikrotiterplatten (Millipore, Bedford, MA) wurden mit 50 I Anti-human IFN y mab von Mäusen (Klon 1-DIK, Mabtech, 5 g/ml in 0,1 M NaHC03, pH 9,5) beschichtet. Nach der Inkubation über Nacht bei 4 C wurde ungebundenes mab durch 3 aufeinanderfolgende Waschun- gen mit PBS, 0,1% Tween-20 entfernt Die beschichteten Vertiefungen wurden 1 Stunde lang mit 100 ul komplettem RPMI 1640, supplementiert mit 10% menschlichem AB-Serum (BioWhittacker) blockiert.
Parallel zur Blockierung der Platten wurden CD8+ Lymphozyten unter Verwendung der MACS- Technik (Miltenyi Biotec) aus peripheren Blutleukozyten (PBL) gereinigt. Kurz gesagt wurden PBL aus heparinisierten Blut- oder Buffy Coats mittels Zentrifugieren (400 x g, 30 min) durch Ficoll- Gradienten (Lymphoprep, Nycomed) hergestellt. Die Leukozyten enthaltende Fraktion wurde iso- liert, 1 mal mit komplettem RPMI 1640, supplementiert mit 10% FCS, gewaschen. PBL wurde entweder in flüssigem Stickstoff eingefroren und für eine spätere Verwendung gelagert oder direkt mit anti-human-CD8+ Microbeads (Miltenyi; 15 ul Beads/1 x 107 PBL in 100 ul MACS-Puffer) mar- kiert und 15 min lang auf Eis inkubiert.
Danach wurden die Zellen mit 10 x Überschuss von MACS- Puffer (0,5% BSA, 2 mM EDTA in PBS) gewaschen, CD8+ Zellen wurden an magnetischen Mini- säulen (Miltenyi Biotech) isoliert, und die isolierten CD8+ Lymphozyten wurden den blockierten Mikrotiterplatten zugesetzt (1 x 105/Vertiefung in 100 ul)
Gepulste T2-Zellen wurden ein Mal mit komplettem RPMI 1640, supplementiert mit 10% menschlichem AB-Serum (BioWhittacker), gewaschen. Nach dem Waschen wurden die Zellen ge- zählt, auf die in den Beispielen angegebenen Endkonzentrationen gebracht und mit 20 g/ml Peptid sowie, je nach Beispiel, mit verschiedenen Mengen #2-Mikroglobulin, KRR10 und pR60 supplementiert 100 ul dieser Zellsuspension wurde pro Vertiefung zugesetzt.
Nach 20 Stunden Co-Kultur wurden die Zellen durch 4 x Waschen mit PBS, 0,1 % Tween 20 entfernt. Gebundenes IFNy wurde am Ort seiner Sekretion durch 2 Stunden Inkubation bei 37 C mit 50 ul biotinyliertem Anti-human-IFNy mab von Mäusen (Klon 7B6-1, Mabtech, 1 g/ml in PBS/0,1 % BSA) nachgewiesen. Nach extensivem Waschen mit PBS wurde 0,1 % Tween 20,100 ul Streptavidin-Peroxidase-Konjugat (Boehringer Mannheim) in einer Verdünnung von 1:5000 zuge- setzt, und die Platten wurden eine weitere Stunde lang bei 37 C inkubiert.
Die Peroxidase-Färbung wurde durch Zugabe von 0,8 mg/ml DAB, 0,4 mg/ml NiC12 (beide von SIGMA) in 0,1 M Tris, pH 9,5, durchgeführt Die Farbreaktion wurde durch Waschen der Platten unter fliessendem Leitungswasser beendet
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Vergleichsbeispiel 1:
Wirkung von #
2-Mikroglobulin und optimale Anzahl von T2-Zellen auf das Verhältnis von Signal zu Rauschen und Hintergrund des menschlichen IFNy ELISPOT
T2-Zellen wurden über Nacht mit 10 ug/ml eines der folgenden Peptide (Influenza-Peptid (HLA A0201 CTL Epitop vom Influenza Matrix-Protein, aa 58-66, GILGFVFTLT), EBV-Peptid (HLA A020-1 CTL Epitop von EBV-Antigen BMLF 1, aa 280-288, GLCTLVAML) oder Ovalbumin-Peptid (H-2Kb CTL Epitop von Ovalbumin, aa 257-264, SIINFEKL) als negative Kontrolle) entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit von 10 g/ml #2-Mikroglobulin gepulst.
Am Tag 2 wurden CD8+ T-Zellen von einem HLA A2-positiven Buffy-Coat isoliert. Die isolierten CD8+ T-Zellen wurden mit den gepulsten T2-Zellen, verdünnt auf 1 x 105, 7,5 x 104 und 3,75 x 104 Zellen pro Vertiefung in Gegenwart von wiederum 10 ug/ml des korrespondierenden Peptids und entweder in Abwesenheit oder in Gegenwart von 10 g/ml #2-Mikroglobulin co-kultiviert.
Fig. 1 zeigt, dass #2-Mikroglobulin den Hintergrund auf 10 bis 25 Spots pro 10b CD8+ T-Zellen reduziert, ohne die spezifischen Spots signifikant zu beeinträchtigen.
Beispiel 2:
Wirkung von KRR10 (ein gemischtes Polylysin, Polyarginin-Polymer)
Für dieses Experiment wurden T2-Zellen mit 10 ug/ml des EBV-Peptids oder einem HIV-Peptid (HLA A2 CTL Epitop von HIV reverser Transkriptase, aa 476-484) als negative Kontrolle in Gegen- wart von 10 ug/ml KRR10 gepulst. Kontrollproben wurden mit EBV-oder HIV-Peptid alleine ohne KRR10 gepulst.
Am nächsten Tag wurden gepulste T2-Zellen in einer Endkonzentration von 5 x 104 Zellen pro Vertiefung mit isolierten CD8+ T-Zellen vom gleichen HIV-negativen HLA A2-positiven Buffy-Coat, wie er im Beispiel 1 verwendet wurde, co-kultiviert. Wieder wurde das Medium während der Co- Kultivierung mit 10 ug/ml des korrespondierenden Peptids und je nach Probe mit oder ohne KRR10 supplementiert (siehe Fig. 2).
Fig. 2 zeigt, dass 10 ug/ml KRR10 die Anzahl der spezifischen Spots im Vergleich zu T2-Zel- len, die nur mit Peptid alleine gepulst wurden, um etwa 50% erhöht.
Beispiel 3:
Wirkung von pR60 (ein Homopolymer von L-Arginin mit einer durchschittlichen Kettenlänge von 60 Argininresten)
In diesem Experiment wurden T2-Zellen mit 10 g/ml des EBV-Peptids oder des HIV-Peptids als negative Kontrolle in Gegenwart verschiedener Mengen von pR60 gepulst. Die gepulsten T2-Zellen wurden mit CD8+ T-Zellen, die vom gleichen Buffy-Coat isoliert wurden wie in Beispiel 1 und 2, in Gegenwart der gleichen Konzentrationen von pR60, wie sie während des Pulsens von T2-Zellen verwendet wurden, und 10 g/ml des korrespondierenden Peptids co-kultiviert.
Fig. 3 zeigt, dass pR60, angewendet in der optimalen Konzentration von 10 ug/ml. die Anzahl der Spots im Vergleich zu T2-Zellen, die nur mit Peptid alleine gepulst wurden, um 100% erhöhte.
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