DE69710360T3 - Testverfahren für peptidspezifische t-zellen - Google Patents

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Description

  • Diese Erfindung betrifft einen Verfahren (Methode) zur Analyse aktivierter Peptid-spezifischer T-Zellen, worin Peptid-spezifische Effektor-T-Zellen aufgezählt werden. Es handelt sich um eine Weiterentwicklung des bekannten ELISPOT-Assay, der in aktuellen Protokollen in Immunology, Einheit 6.19, Seiten 6.19.1-8, im Überblick dargestellt ist.
  • Der Filter Immunoplaque-Assay, auch Enzyme-linked Immunospot Assay (ELISPOT) genannt, wurde ursprünglich zum Detektieren und Quantifizieren individueller Antikörper-sekretierender B-Zellen entwickelt. Zum Zeitpunkt ihrer Entwicklung bot die Methode eine schnelle und vielseitige Alternative zu herkömmlichen Plaque-bildenden Zell-Assays. Jüngste Modifikationen haben die Empfindlichkeit des ELISPOT Assays derart verbessert, dass Zellen nachgewiesen werden können, die lediglich 100 Moleküle eines spezifischen Proteins pro Sekunde produzieren. Diese Assays ziehen Nutzen aus der relativ hohen Konzentration eines gegebenen Proteins (z.B. eines Zytokins) in der die Protein-sekretierende Zelle unmittelbar umgebenden Umgebung. Diese Zellprodukte werden unter Verwendung hochaffiner Antikörper eingefangen und nachgewiesen.
  • Herr et al. (1996) Journal of Immunological Methods 191, 131-42 beschreibt die Verwendung des ELISPOT-Assay für den Nachweis und die Quantifizierung von aus Blut stammendem CD8+-T-Lymphozyten-sekretierendem TNF-α als Reaktion auf HLA-A2.1-bindendes Melanom und virale Peptid-Antigene.
  • Der ELISPOT-Assay nutzt zwei hochaffine Zytokin-spezifische Antikörper aus, die gegen unterschiedliche Epitope auf demselben Zytokin-Molekül gerichtet sind: entweder zwei monoklonale Antikörper oder eine Kombination aus einem monoklonalen Antikörper und einem polyvalenten Antiserum. Bei ELISPOT werden Spots erzeugt, basierend auf einer kolorimetrischen Reaktion, die das von einer einzigen Zelle sekretierte Zytokin nachweist. Der Spot stellt einen "foot print" der ursprünglichen Zytokinerzeugenden Zelle dar. Die Spots sind permanent und können visuell, mikroskopisch oder elektronisch quantifiziert werden.
  • Der ELISPOT Assay umfasst fünf spezifische Schritte: (1) Auftragen eines gereinigten Zytokinspezifischen Antikörpers auf eine Nitrozellulose-verstärkte Mikrotiterplatte; (2) Blockieren der Platte zur Verhinderung der nicht-spezifischen Absorption jeglicher anderer Proteine; (3) Inkubieren der Zytokinsekretierenden Zellen bei mehreren verschiedenen Verdünnungen; (4) Zugeben eines markierten zweiten Anti-Zytokin-Antikörpers; und (b) Nachweisen des Antikörper-Zytokin-Komplexes.
  • Bei dieser Erfindung wurde die Methode zur Entwicklung eines Assays für Peptid-spezifsche T-Zellen eingesetzt, die für ein bestimmtes Peptid in vivo vorsensibilisiert worden sind.
  • So bietet die vorliegende Erfindung eine Analysemethode, worin Peptid-spezifische Effektor-T-Zellen aufgezählt werden, welche Methode umfasst: das Bereitstellen einer Flüssigkeit enthaltend frische T-Zellen, die nicht in vitro kultiviert wurden, wobei dieselbe Flüssigkeit in Kontakt mit einer Oberfläche steht, die einen immobilisierten ersten Antikörper zum Interferon-γ-Zytokin trägt;
    das Präsentieren eines T-Zell-aktivierenden Peptids an die T-Zellen;
    das Inkubieren der Flüssigkeit, um die Freisetzung von Zytokin zu bewirken, und das Nachweisen des freigesetzten Interferons-γ, das an dem immobilisierten Antikörper gebunden ist, umfasst;
    wobei die Inkubation über einen Zeitraum hinweg fortgesetzt wird, der die Freisetzung von Zytokin durch lediglich jene T-Zellen zulässt, die für das Peptid in vivo vorsensibilisiert wurden und zur sofortigen Effektor-Funktion fähig sind, ohne dass eine Teilung/Differenzierung durch in vitro-Kultur in Gegenwart vom Peptid bewirkt werden müsste;
    und das Verfahren auf die Diagnose oder die Überwachung einer Infektion mit einem intrazellulären Pathogen wie Hepatitis B, Hepatitis C, Tuberkulose, Malaria, HIV oder Influenza angewandt wird.
  • Vorzugsweise ist bei der Methode die Flüssigkeit in Kontakt mit einer Oberfläche, die einen immobilisierten ersten Antikörper gegen das Zytokin trägt, wobei das Zytokin in an den immobilisierten ersten Antikörper gebundener Form nachgewiesen wird.
  • Bei den Zellen handelt es sich vorzugsweise um periphere mononukleare Blutzellen (PMBC). Sie können geeigneterweise einem Patienten entnommen werden, von dem eine aktuelle oder frühere Infektionserkrankung mit einem intrazellularen Pathogen, z.B. einem Virus, bekannt ist. Es stellt ein Merkmal der Erfindung dar, dass Frischzellen verwendet werden, da in vitro kultivierte Zellen veränderte Eigenschaften entwickeln können und dadurch den diagnostischen Wert des Assays mindern können. Der Zweck des Assays besteht in der Identifizierung oder Quantifizierung Peptid-spezifischer T-Zellen, z.B. CD8+- oder CD4+-Zellen, die in vivo aktiviert oder für ein bestimmtes Peptid vorsensibilisiert wurden. Bei diesen handelt es sich um unrestimulierte T-Zellen, d.h. um Zellen, die zur sofortigen Effektor-Funktion in der Lage sind, ohne dass die Bewirkung einer Teilung/Differenzierung durch in vitro-Kultur bewirkt werden müsste. Wird das fragliche Peptid solchen Zellen präsentiert, so sekretieren die Zellen verschiedene Zytokine, von denen jegliches für die Zwecke dieses Assays ausgewählt werden kann. Das gewählte Zytokin ist Interferon-γ (IFN-γ).
  • Das sekretierte Zytokin kann mittels einer Vielfalt von in der Literatur bekannten Methoden nachgewiesen werden. Vorzugsweise umfasst die Assay-Methode die Bereitstellung einer Oberfläche, die einen immobilisierten ersten Antikörper zum IFN-γ oder ein anderes Zytokin trägt. Eine Flüssigkeit, enthaltend die PBMC oder andere Frischzellen, wird in Kontakt mit jenem immobilisierten Antikörper gebracht. Etwa 80% der PBMC sind CD8+-Zellen. Bei den PBMC eines Patienten, der sich von einer vorangegangenen Influenza Virusinfektion erholt hat, ist etwa 1 CD8+-Zelle von 105-106 eine Gedächtniszelle, die. für ein spezifisches Epitop in Verbindung mit dem Influenza Virus vorsensibilisiert worden ist.
  • Das Verfahren der Erfindung umfasst das Präsentieren eines Peptids den Effektor-T-Zellen. Das Peptid kann ein bekanntes Epitop für eine gut charakterisierte Virusinfektion sein; oder kann ein Kandidat-Epitop sein, das möglicherweise mit einer weniger gut charakterisierten Virusinfektion assoziiert ist. Das Flüssigkeitsgemisch wird unter Bedingungen inkubiert, bei denen jegliche Peptid-spezifischen T-Zellen stimuliert werden, die für jenes bestimmte vom Virus stammende Peptid in vivo vorsensibilisiert worden sein könnten. Das Peptid muss von einer Länge von z.B. 7 bis 15, und insbesondere 8 bis 12 oder 8 bis 10 Aminosäure-Resten sein, da diese von den CD8+-Zellen erkannt wird. Es wird angenommen, dass die große Masse der CD8+-Zellen (und anderer PBMC) das Peptid der kleinen Minderheit der CD8+-Zellen präsentieren, die für das Peptid möglicherweise vorsensibilisiert wurden. Sind solche aktivierte oder vorsensibilisierte Peptid-spezifische T-Zellen in der Testflüssigkeit vorhanden, so reagieren diese durch Sekretieren von IFN-γ oder eines anderen Zytokins, das dann an den immobilisierten Antikörper gebunden wird.
  • Vorzugsweise wird das Peptid den Frischzellen in unkombinierter Form zugegeben. Zwar ist die Zugabe kultivierter Zellen möglich, die mit dem Peptid pulsiert wurden, doch ist dies nicht erforderlich, wenn definierte Peptid-Epitope verwendet werden. Die Peptide sollten in einer ausreichenden Menge zur Erzeugung eines beobachtbaren Signals zugegeben werden; ein bevorzugter Konzentrationsbereich in der Flüssigkeit beträgt 0,01 bis zu 140 μM, insbesondere 0,5 bis 5,0 μM.
  • Die Inkubation sollte über einen ausreichend langen Zeitraum fortgesetzt werden, um CD8+-Zellen zu erhalten, die in vivo für das bestimmte Peptid vorsensibilisiert wurden, das zur Sekretierung des IFN-γ oder anderen Zytokins ausgewählt wurde. Die Inkubation sollte nicht so lange fortgesetzt werden, dass ruhende CD8+-Zellen genug Zeit zur Differenzierung und zur Aktivierung durch das Peptid und Sekretierung von Zytokinen bekommen. Dies legt eine Inkubationsdauer von 4 bis 24 Stunden, genauer 5 bis 15 Stunden nahe. Ein Vorteil der Erfindung besteht darin, dass der Inkubationsschritt des Tests an einem einzigen Arbeitstag oder über Nacht und ohne Anlegung steriler Bedingungen, wie für Zellkulturen in vitro erforderlich, durchgeführt werden kann.
  • Während der Inkubation wird jegliches durch die CD8+-Zellen sekretierte IFN-γ oder andere Zytokin an den an der Oberfläche immobilisierten ersten Antikörper gebunden. Nach der Inkubation kann die Oberfläche zur Entfernung ungebundenen Materials gewaschen werden. Für den Nachweis wird vorzugsweise ein markierter zweiter Antikörper zum Zytokin verwendet. Wird dieser auf die Oberfläche aufgebracht, so bindet er an jegliches vorhandene Zytokin. Der zweite Antikörper sollte vorzugsweise ein anderes Epitop als der erste Antikörper erkennen. Einer oder beide von erstem und zweitem Antikörper sollten vorzugsweise monoklonal sein. Die -Markierung kann eine beliebige von den herkömmlicherweise im Fachbereich verwendeten sein, einschließlich Radioisotopen, Enzymen zur Erzeugung von Farbe oder Chemilumineszenz, fluoreszierende Gruppen oder Gruppen zum Nachweis durch Massenspektrometrie oder Refraktionsindex (z.B. durch Oberflächenplasmonresonanz). Die Verwendung eines markierten Antikörpers ist bequem, doch nicht zwingend erforderlich, da auch jegliches Reagens, das spezifisch an das Zytokin bindet; markiert und eingesetzt werden könnte. Der Nachweis und möglicherweise die Quantifizierung der Markierung wird mittels im Fachbereich wohlbekannter Methoden und der Beschaffenheit der verwendeten Markierung gemäßer Methoden vorgenommen.
  • Der Assay kann in bequemer Weise in einer Multiwell-Platte vorgenommen werden. Jeder Well der Platte weist eine Oberfläche auf, die einen gebundenen ersten Antikörper trägt. Jedem Well wird eine Flüssigkeit zugegeben, die eine geeignete Anzahl von z.B. 103 bis 105 Zellen enthält. Verschiedene Peptide und/oder Kontrollen werden den einzelnen Wells der Platte zugegeben. Zellen, die ein Zytokin während der Inkubation sekretieren, zeigen sich in Form von Tüpfeln (spot forming cells (Spot-bildende Zellen) oder SFCs), wobei sich die Zahl oder Dichte dieser Spots in jedem Well ohne weiteres bestimmen lässt.
  • Die Assay-Methode weist eine Reihe von Vorteilen gegenüber bisher bekannten Methoden auf:
    • a) Sie ist schneller und bequemer; die Dauer des Assays beträgt lediglich 6 Stunden und erfordert daher keine sterilen Bedingungen oder Methoden. Aktuelle Methoden der Zählung von Vorläufer-Effektor-T-Zellen erfordern eine in vitro-Kultur mit dem spezifischen Antigen und autologen Feederzellen in einem beschränkenden Verdünnungs-Assay (limiting dilution assay – LDA). Die Methode ist mühsam und zeitraubend.
    • b) Sie erfordert eine minimale technische Ausstattung und eignet sich für Feldbedingungen in den Tropen und den Entwicklungsländern als auch für routinemäßige diagnostische Labors. Der LDA erfordert im Gegensatz dazu viele periphere Blutlymphozyten, eine Quelle für Gamma-Strahlen zur Inaktivierung der Feederzellen und außerdem sterile Bedingungen, da die Zeilen 1 bis 2 Wochen kultiviert werden müssen.
    • c) Sie ist sicher und nicht radioaktiv. Beim LDA allerdings werden die kultivierten Zellen in einem zytotoxischen T-Zell-Assay (cytotoxic T cell assay – CTL) unter Verwendung des radioaktiven Isotops Chrom 51 untersucht.
    • d) Es handelt sich um einen unmittelbaren ex vivo-Assay. Als solches misst er Effektor-Zellen in ihrem natürlichen Zustand, ohne dass unbekannte systematische Fehler eingeführt würden, die als Folge der Fortpflanzung von Zellen in in vitro-Kultur mit Antigen und exogenen Zytokinen auftreten.
    • e) Der Assay wird innerhalb von lediglich 6 Stunden vorgenommen; als solches misst er Peptid-spezifische Effektor-Zellen direkt, ohne dass eine in vitro-Vermehrung dieser Zellen erforderlich wäre. Die kurze Dauer des Assays schaltet auch die Möglichkeit aus, dass die Zellen in vitro aktiviert werden könnten; er misst daher die Effektor-Funktion, die in vivo vorhanden ist. Bei LDAs ist eine vielfache Vermehrung der Zellen erforderlich; viele Effektor-Zellen vermehren sich allerdings unter diesen Bedingungen nicht, weshalb das Ergebnis des LDA oftmals einen unterschätzten Wert der wahren Zahl der zirkulierenden Effektoren darstellt.
  • Von der Assay-Methode steht zu erwarten, dass sie in unterschiedlicher Weise nutzbringend sein wird:
    • i) Zur Quantifizierung Peptid-spezifischer Effektoren bei HIV-infizierten Personen direkt aus peripherem Blut.
    • ii) Zur Überwachung des Verlaufs oder der Resistenz gegen eine chronische Infektionskrankheit, z.B. als Reaktion auf einen Arzneistoff oder einen therapeutischen Impfstoff. Hiervon wird eine besondere Nützlichkeit bei HIV, Hepatitis B und Hepatitis C erwartet.
    • iii) Zur Überwachung des Grades, in dem ein Patient, der an einer bestimmten Erkrankung wie Influenza litt, gegen künftige Infektionen resistent sein kann.
  • Die folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung der Erfindung.
  • BEISPIEL 1
  • Immunologisches Gedächtnis für Influenza-Virus: Ex vivo-Zählung und Charakterisierung zirkulierender Peptid-spezifischer CD8+-aktivierter T-Zellen im Gedächtniszustand
  • Bei den Versuchspersonen handelte es sich um gesundes Laborpersonal oder gesunde erwachsene Freiwillige, die serologisch durch Komplement-vermittelte Lymphozytotoxizität HLA-typisiert wurden. 5 auf MHC-Klasse-1 beschränkte Influenza-Epitope wurden verwendet, wie in Tabelle 1 aufgelistet.
  • 96-Well-PVDE verstärkte Platten wurden mit 100 μl an 15 μg/ml des Anti-IFN-γ-Mab-1-DIK über Nacht bei 4°C oder 3 Stunden lang bei Raumtemperatur beschichtet. Die Platten wurden gewaschen und dann mit R10 (standardmäßiges Gewebekulturmedium, enthaltend 10% fötales Kälberserum) 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert. Die PBMC der Versuchspersonen wurden aus heparinisiertem Vollblut mittels Zentrifugation abgetrennt, in R10 resuspendiert und in einem Endvolumen von 100 μl R10/Well den 96-Well-PVDF-verstärkten Mikrotiterplatten zugegeben. Die zugeführten Zellzahlen betrugen gewöhnlich 5 × 105 pro Well, wobei alle Assays in Duplikat-Wells-vorgenommen wurden. Die Peptide wurden gewöhnlich zu einer Endkonzentration von 1 bis 2 μM zugegeben, mit Ausnahme von einem Peptid-Titrationsexperiment, bei dem die Konzentration des M1 58-66-Peptids auf 20 nM verdünnt wurde. Die Assays wurden gewöhnlich über 12 bis 14 Stunden hinweg vorgenommen, bis auf bestimmte Assays, die in nur 6 Stunden erfolgten, um zu bestätigen, dass die Antigen-spezifischen Zellen zur sofortigen Effektor-Funktion in der Lage waren. Die Inkubation wurde bei 37°C in einer 5 % CO2-haltigen Atmosphäre vorgenommen. Die Inkubation wurde durch Abschütteln der Well-Inhalte und Waschen beendet. Dann wurden 100 μl an 1 μg/ml eines biotinylierten zweiten Anti-IFN-γ-MAB-7-B6-1-Biotins (Mabtech, Stockholm, Schweden) den Wells zugegeben und die Platten 3 Stunden lang inkubiert. 100 μl einer 1:1000-Verdünnung des Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugats wurden den Wells zugegeben und die Platten bei Raumtemperatur über weitere 2 Stunden hinweg inkubiert. Die Wells wurden nochmals gewaschen, woraufhin 100 μl eines chromogenen alkalische Phosphatase-Substrats, verdünnt 1:25 mit entionisiertem Wasser, den Wells zugegeben wurde. Nach einer weiteren 30-60-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Wells gewaschen, um die kolorimetrische Reaktion abzubrechen. Die Spots wurden unter einer 20-fachen Vergrößerung mit einem Präparierstereomikroskop gezählt.
  • Ergebnisse
  • Unter Verwendung von 5 wohldefinierten auf HLA-Klasse-I beschränkten Influenza-Epitopen wurde freies Peptid bis zu einer Endkonzentration von 2 μm direkt den frisch isolierten PBMC im ELISPOT-Assay zugegeben. Bei nahezu allen auf diese Weise getesteten Versuchspersonen wurde unter Verwendung von in den Versuchspersonen vorhandenen auf HLA-Klasse-I Allele beschränkten Epitopen IFN-γ-sekretierende Peptid-spezifische Effektor-T-Zellen nachgewiesen. In Tabelle 1 sind die Reaktionen auf diese fünf Epitope zusammengefasst: Die meisten dieser Assays wurden über 12 bis 14 Stunden hinweg durchgeführt; 1 zeigt ein Säulendiagramm; das die Reaktion auf unterschiedliche Konzentrationen der PBMC pro Well wiedergibt. Um jedoch die Möglichkeit auszuschließen, dass Gedächtnis-T-Zellen sich vermehren oder, während des Verlaufs eines 14-ständigen Assays in vitro aktiviert werden könnten, wurden auch 6-stündige Assays vorgenommen. Peptid-spezifische SFCs wurden nachgewiesen, wie in 2 für dasselbe M1 58-66-Epitop quantitativ gezeigt. Für eine negative Kontrolle wurden irrelevante Peptide aus infektiösen Agenzien, mit denen-der Spender nicht infiziert war, den frischen PBMC direkt zugegeben.
  • Die meisten Experimente wurden bei Peptid-Endkonzentrationen von 2 μm durchgeführt. Die Reaktionen waren jedoch ohne weiteres noch nachweisbar, wenn die Peptidkonzentrationen auf 0,02 μm reduziert wurden, wie in 3 für das auf HLA-A2.01 beschränkte Influenza-Matrixepitop gezeigt.
  • Die Ausschüttung von CD8+-T-Zellen aus frischen PBMC mit Anti-CD8-Antikörper beschichteten Magnetkügelchen hob die Peptid-spezifische Reaktion vollständig auf, was bestätigte, dass die Effektoren, die zu Spots führten, wie durch bekannte auf, Klasse I beschränkte Epitope hervorgerufen, CD8+-T-Lymphozyten sind. Umgekehrt verminderte eine Ausschüttung der CD4+-Zellen die Zahl der IFN-γ-SFCs nicht, was darauf hinwies, dass weder CD4+ noch deren Zytokin-Produkte für den Erwerb oder die Entfaltung der Effektor-Funktion durch die frisch isolierten Peptid-spezifischen CD8+-T-Zellen erforderlich waren. Sofortige Effektor-Reaktionen wurden lediglich bei auf HLA Klasse-I-Allele beschränkten Influenza-Epitopen nachgewiesen, die bei dem bestimmten getesteten Spender vorhanden waren; die Zugabe von auf HLA-Klasse-I-Moleküle beschränkten Influenza-Epitopen, die-nicht im Spender vorhanden waren, ergaben in keinem Fall SFCs. (Daten nicht gezeigt).
  • Während eine Expansion der Peptid-spezifischen CD8+-Effektor-CTL während einer akuten Influenza die Zellen mittels des bekannten 51Cr-Freisetzungs-Zytotoxizitäts-Assay, der mit frischen unkultivierten PBMC durchgeführt wird, nachweisbar macht, sind solche Zellen nach Genesung von der akuten Erkrankung nicht mehr nachweisbar. Es scheint, dass dies nicht deshalb so ist, weil sie nicht vorhanden, wären, sondern vielmehr deshalb, weil sie in zu geringer Menge,.vorhanden sind, um nachweisbar zu sein. Nach Genesung von der akuten Erkrankung bleiben solche Zellen mittels der ELISPOT Assay-Methode der vorliegenden Erfindung nachweisbar.
  • Eine Zählung der Spots unter Vergrößerung und ein Vergleich dieser Zahl zur Eingabezahl der frischen PBMC ergibt eine Maßzahl der relativen Häufigkeit zirkulierender aktivierter Peptid-spezifischer CD8+-Effektoren in peripherem Blut. Die Häufigkeit IFN-γ-sekretierender CD8+-Effektoren für das auf HLA-A2.11 beschränkte Epitop M158-56 bei Spender WB wurde mittels des Assays der Erfindung (1/15000), und mittels herkömmlicher beschränkender Verdünnungs-Analyse (LDA) (1/103000) gemessen. TABELLE I. Auf Klasse I beschränkte Influenza-Epitope, wie erkannt durch frisch isolierte CD8+-Effektor-T-Zellen
    Protein Sequenz MHC-Klasse-I-Beschränkung Zahl der Reaktionen Zahl der getesteten Spender
    M1 58-66 GILGFVFTL A2.01 6 6
    NP 380-388 ELRSRYWAI B8 3 4
    M1 128-135 ASCMGLIY B35 2 2
    NP 265-273 ILRGSVAHK A3 1 2
    NP 383-391 SRYWAIRT B27.05 1 1
  • Das obige Experiment ist in größerer Ausführlichkeit in J. Exp. Med. 186, 6, 15. September 1997, 859-865, beschrieben.
  • BEISPIEL 2
  • Anwendung zur Quantifizierung Peptid-spezifscher Effektoren in HIV-infizierten Personen direkt aus peripherem Blut
  • Kryokonservierte periphere Blutlymphozyten (PBL), die aus dem peripheren Blut des Patienten 868 frisch isoliert worden waren, wurden zu 50.000 Zellen pro Well auf eine PVDF-beschichtete 96-Well-Platte ausplattiert, die zuvor mit Anti-Interferon-Gamma-monoklonalem Antikörper beschichtet worden war. Für jedes Antigen wurden Duplikat-Wells eingerichtet. Es wurden zwei Arten von Duplikat-Kontroll-Wells angewendet: kein Peptid und ein irrelevantes HIV-GAG-Epitop, beschränkt durch HLA-B8, ein bei Patient 868 nicht vorhandenes HLA-Allel.
  • Ein Bereich von Peptiden und deren jeweiligen natürlich vorkommenden Varianten (zuvor bei Patient 868 identifiziert) wurden den Zellen bei einer Endkonzentration von 2 μm direkt zugegeben. Die Platte wurden 12 Stunden lang bei 37°C in 5 % CO2 inkubiert und wie zuvor beschrieben (siehe Beispiel 1) entwickelt. Die resultierenden Spots wurden mit einem 40-fach vergrößernden Präpariermikroskop gezählt.
  • Diese Ergebnisse sind in tabellarischer Form in 4 gezeigt.
  • BEISPIEL 3
  • Identifikation von CD4+- und CD8+-Epitopen in sekretierten Antigenen von M. tuberculosis.
  • Zunehmende Beweise deuten auf eine schützende Rolle von CD8+-zytotoxischen T.-Lymphozyten bei Mycobacterium tuberculosis-Infektion hin, doch wurden M. tuberculosis-spezifische CD8+-T-Zellen bisher nicht beim Menschen identifiziert. Unter Anwendung eines umgekehrten immungenetischen Ansatzes synthetisierten die Erfinder eine Reihe von Kandidat-HLA-Klasse-I-beschränkten Peptiden aus zwei immundominanten Antigenen von M. tuberculosis, nämlich ESAT-6 und Antigen 85. Die Erfinder screenten 75 Patienten, die ein breites klinisches Spektrum der M. tuberculosis-Infektion verkörperten. Periphere Blutlymphozyten wurden in vitro mit den Peptiden stimuliert und dann auf ihre zytolytische Aktivität in einem 51Cr-Freisetzungs-Assay und auf die Einzelzell-Interferon-γ-Freisetzung in einem ELISPOT-Assay getestet. Die Erfinder haben mehrere Octamer- und Nonamer-Epitope von ESAT-6 und Antigen 85 bei Patienten und exponierten Kontaktpersonen identifiziert. Bestimmte Epitope werden durch CD8+-Lymphozyten in einer auf MHC-Klasse-I beschränkten Weise erkannt; andere werden präferenziell durch CD4+-T-Zellen erkannt.
  • Die Sequenzen an ESAT-6 und Antigen 85A, B und C wurden mit Allel-spezifischen Peptid-Motiven für die HLA-Klasse-I-Typen-A2, -B7, -B8, -B35, -B52 und -B53 gescannt, die alle in der Studienpopulation vorhanden waren.
  • Bei ESAT-6 wurden mit den Peptid-Motiven für HLA-A2, -B8 und -B52 übereinstimmende Sequenzen identifiziert; diese Peptide wurden synthetisiert und sind in Tabelle 2 gezeigt. Keine mit HLA-B7, -B35 und -B53 übereinstimmende Sequenzen waren in ESAT-6 vorhanden, und folglich wurden keine Peptide für diese HLA-Klasse-I-Allele synthetisiert. Die Peptide wurden in Pools sortiert, die zur in vitro-Restimulation der Spender-PBMC verwendet wurden. Peptide, die als CD8+-Epitope befunden wurden, sind fett gedruckt gezeigt. Ähnlich wurden 42 Peptide basierend auf den Sequenzen der Antigene 85 und 85C synthetisiert. Unter diesen wurden keine CD8+-Epitope identifiziert, weshalb die Peptide nicht gezeigt sind. TABELLE 2
    HLA-Klasse-I-Allel Peptid-Motiv Peptid Sequenz Position
    HLA-A2 -L/I/M-------V/L/I ES8 GIEAAASAI 10-18
    ES9 AIQGNVTSI 17-25
    ES10 LLDEGKQSL 28-36
    ES 11 ELNNALQNL 64-72
    ES13 AMASTEGNV 82-90
    HLA-B8 -K-K---L/I ES7 EGKQSLTKL 31-39
    HLA-B52 -Q----I/V ES12 LQNLARTI 69-76
  • ELISPOT-Assay für IFN-γ
  • 96-Well-PVDF-verstärkte Platten, die mit dem Anti-IFN-γ-mAb-1-DIK bei 15 μg/ml vorbeschichtet waren, wurden mit RPNII gewaschen und mit R10 1 Stunde lang bei Raumtemperatur blockiert. Bei einem Experiment wurden 500.000 frisch isolierte unkultivierte PBMC pro Well verwendet. Bei einem anderen Experiment wurden Kurzzeit-Zelllinien (short term cell lins – ATCL) oder CD8+-zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) oder Klone zweimal in RPMI gewaschen, -in R10 resuspendiert und bei bekannter Zelleingabezahl/Well in Duplikat-Wells eingetaucht. Die Reaktionen wurden als signifikant erachtet, wenn ein Minimum von 10 SFCs pro Well vorhanden war und diese Zahl außerdem mindestens das Doppelte der Zahl in den Kontroll-Wells betrug. Peptid wurde dem Überstand bei einer Endkonzentration von 2 μl (freies Peptid) direkt zugegeben. Die Platten wurden 12 Stunden lang bei 37°C, 5 % CO2 inkubiert. Nach sechsmaligem Waschen mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung 0,05 % und Tween-20 zur Entfernung der Zellen wurden die Platten 3 Stunden lang mit dem zweiten biotinylierten Anti-IFN-γ-mAb-7-B6-1-Biotin bei 1 μg/ml inkubiert. Einem weiteren Waschgang wie oben folgte eine Inkubation mit einer 1:1000-Verdünnung von Streptavidin-alkalische Phosphatase-Konjugat über 2 Stunden hinweg. Nach einem weiteren Waschgang wurde chromogenes alkalische Phosphatase-Substrat den Wells zugegeben und die Platten 30 Minuten später mit Leitungswasser gewaschen, Nach denn Trocknen wurden die Spot-bildenden Zellen (SFC) unter 20-facher Vergrößerung gezählt.
  • Die STCL wurden mittels der in Nature 346 (1990) 183-7 beschriebenen Methode generiert. Die CD8+-T-Zellenklone würden mittels standardmäßiger Methoden generiert.
  • Identifikation von ESAT-6-spezifischen Effektor-T-Zellen direkt aua peripherem Blut
  • Zwei CD8+-Epitope wurden in ESAT-6 identifiziert. Die T-Zellen des Spenders NPH54, der tuberkulöse Mediastinallymphadenitis hatte, erkannten Peptide entsprechend diesen beiden Epitopen. Unkultivierte PBMC, die zum Zeitpunkt der Diagnose aus NPH54 isoliert wurden, der HLA-B52 und HLA-A2.01 aufwies, sekretierten IFN-γ als Reaktion auf einen von ESAT-6 stammenden Peptid-Pool für diese Klasse-I-Allele in einem ex vivo-ELISPOT-Assay. Die durchschnittliche Anzahl der IFN-γ-Spot-bildenden Zellen (SFCs), wie gezählt aus 5 × 105 PBMC in Duplikat-Wells, betrug 19 für die ESAT-6-Peptide im Vergleich zu 2 bei den Kontroll-Wells ohne Peptid. Bei einem anschließenden Assay wurden frisch isolierte PBMC gegen jedes der individuellen Peptide innerhalb der reagierenden Pools getestet; IFN-SFCs wurden als Reaktion auf Peptide ES12 und ES13 nachgewiesen, deren Sequenzen mit den HLA-B52 bzw. HLA-A2.01-Peptid-Motiven übereinstimmten. Die Häufigkeit der ES12- und ES 13-spezifischen IFN-γ-SFCs ist von derselben Größenordnung wie die SFCs für das auf HLA-A2.01 beschränkte Influenza-Matrixepitop M1 58-66. Unrestimulierte PBMC von einem zweiten Spender, NPH97, mit tuberkulöser Osteomyelitis, erkannten das ES12-Peptid ebenfalls. Dieser Patient weist ebenfalls HLA-B52 und HLA-A2.01 auf, wobei die Größe der ES 12-spezifischen Reaktion ähnlich der Reaktion auf das auf HLA-A2-beschränkte Influenza-Matrixepitop war, Die Einzelzell-IFN-γ-Freisetzung durch frisch isolierte T-Zellen bei diesen kurzen, 12-stündigen ex vivo-Assays unter Anwendung keines anderen Stimulus als dem verwandten Peptid, weist darauf hin, dass diese Zellen mit hoher Wahrscheinlichkeit zirkulierende aktivierte Effektor-T-Zellen sind.

Claims (10)

  1. Untersuchungsverfahren worin Peptid-spezifische Effektor-T-Zellen aufgezählt werden, welches Verfahren umfasst: das Bereitstellen einer Flüssigkeit, die frische T-Zellen enthält, die nicht in vitro kultiviert wurden, die in Kontakt mit einer Oberfläche steht, die einen immobilisierten ersten Antikörper zum Interferon-γ-Zytokin trägt; das Präsentieren eines T-Zell-aktivierenden Peptids an die T-Zellen; das Inkubieren der Flüssigkeit, um die Freisetzung von Zytokin zu bewirken, und das Nachweisen des freigesetzten Interferons-γ, das an dem immobilisierten Antikörper gebunden ist, umfasst; wobei die Inkubation über einen Zeitraum hinweg fortgesetzt wird, der die Freisetzung von Zytokin durch lediglich jene T-Zellen zulässt, die für das Peptid in vivo vorsensibilisiert wurden und zur sofortigen Effektor-Funktion fähig sind, ohne dass eine Teilung-Differenzierung durch in vitro-Kultur in Gegenwart vom Peptid bewirkt werden müsste; und das Verfahren auf die Diagnose oder die Überwachung einer Infektion mit einem intrazellulären Pathogen wie Hepatitis B, Hepatitis C, Tuberkulose, Malaria, HIV oder Influenza angewendet wird.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein von ESAT-6 oder M. tuberculosis stammendes Peptid den T-Zellen präsentiert wird.
  3. Verfahren nach Anspruche 1 oder 2, wobei die T-Zellen mononukleare Zellen aus peripherem Blut sind.
  4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei ein Peptid einer Länge von 712 Aminosäure-Resten der T-Zellen enthaltenden Flüssigkeit zugegeben wird, das von den CD8+-Zellen erkannt wird.
  5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das resultierende Flüssigkeitsgemisch unter nicht-sterilen Bedingungen inkubiert wird.
  6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Peptid ein bekanntes Epitop ist.
  7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Inkubation über einen Zeitraum von 4 bis 24 Stunden hinweg fortgesetzt wird.
  8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die T-Zellen von einem Patienten entnommen werden, der bekanntermaßen an einer Infektion mit einem intrazellulären Pathogen leidet oder litt.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 3 bis 8, durchgeführt zur Überwachung des Verlaufs einer HIV-Infektion.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, durchgeführt zur Überwachung der Wirkung eines Impfstoffs.
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