DE3650468T2 - Methoden zur Verwendung von an humanen Klasse-II-Histokompatibilitätsantigenen mangelnden Zellinien - Google Patents

Methoden zur Verwendung von an humanen Klasse-II-Histokompatibilitätsantigenen mangelnden Zellinien

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Description

    Technischer Bereich
  • Diese Erfindung betrifft allgemein menschliche Zellinien, welche zur Propagierung von durch Blutproben übertragbaren Viren geeignet sind, und insbesondere solche Zellinien, denen die menschlichen Klasse II-Histokompatibilitätsantigene fehlen.
    • Stand der Technik
  • Für Viren wurde gezeigt, daß sie eine wachsende Zahl klinisch bedeutsamer Erkrankungen beim Menschen verursachen. Diese umfassen Grippeviren, die Herpes-Viren (Herpessimplex-Virus Typ I und Typ II (HSV-I und -II), Cytomegalo- Virus (CMV), Epstein-Barr-Virus (EBV) und Varicella-zoster (VZ)), Hepatitis-B-Virus (HBV), Adenovirus, Rotavirus, respiratorischer Syncytiumvirus, Poliomyelitis-Virus und Masernvirus.
  • Es sind jetzt auch menschliche Retroviren bekannt, wobei die ersten davon von einem Patienten mit kutanem T-Zellen- Lymphom (Poiesz et al., PNAS 77:7415, 1980) erhalten und Human-T-Zellen-Leukämie/Lymphoma-Virus Typ 1 (HTLV I) genannt worden sind. Nachfolgend wurde ein zweiter menschlicher Retrovirus, der mit HTLV II bezeichnet wurde, von einer T-Zellenvariante von Haarzellen-Leukämie (Kalyanaraman et al., Science 218:571, 1982) isoliert. Kürzlich wurde für das ätiologische Agens von Acquired Immune Deficiency Syndrom (AIDS) gezeigt, daß es ein Retrovirus ist, der verschiedentlich als mit Lymphadenopathie verbundener Virus (LAV, Barré-Sinoussi et al., Science 220:868, 1983), Human- T-Zellen-Lymphotrop-Virus III (Popovic et al., Science 224:497, 1984) oder AIDS bezogener Virus (ARV, Levy et al., Science 225:840, 1984) bezeichnet wird. Es gibt auch den Hinweis, daß nicht-A-nicht-B-Hepatitis (NANB) durch einen Retrovirus verursacht werden kann (Seto et al., Lancet ii:941, 1984; Iwarson et al., J. Med. Virol. 16:37, 1985).
  • Die Labordiagnose einer Virusinfektion kann entweder den Nachweis des Virus selbst oder seiner Bestandteile oder den Nachweis der Immunantwort des Wirts auf den Virus (serologischer Nachweis) beinhalten. Abhängig von der Natur des Virus kann der Nachweis des Virus selbst oder seiner Bestandteile durch eine Kultur oder durch direkte Diagnose schwer oder unmöglich sein. Obwohl Retroviren beispielsweise bei Lebewesen, einschließlich dem Menschen, persistente Infektionen verursachen, sind Retrovirus-Antigene nicht immer einfach beim infizierten Lebewesen nachweisbar (Zagury et al., Science 226:449, 1984). Für solche Viren kann ein serologischer Nachweis dem direkten Nachweis vorgezogen werden.
  • Die serologische Diagnose einer Virusinfektion erfordert eine Quelle von Virusprotein, mit welchem Patientensera umgesetzt werden können, um die Gegenwart oder Menge von Antikörpern auf das Virusagens von Interesse zu bestimmen. Typischerweise wird der Virus in einer menschlichen Zellinie gezüchtet, aus welcher er durch im Stand der Technik gut bekannte Verfahren rein gewonnen werden kann. Viele Viren, einschließlich der Herpesviren, Polio-myelitis- und Masernviren, werden in menschlichen diploiden Fibroplastlinien, wie MRC5 oder W138 (Smith in Diagnosis of Viral Infection, Lenette et al., Hrsg., Baltimore: University Park Press (1979) 5. 33) kultiviert. HTLV-I und -II werden in kontinuierlichen T-Zellinien, wie HUT-102 (Gazdan et al., Blood 55:409, 1980; Poiesz et al., oben) kultiviert. LAV kann in B-Lymphblastoid-Zellinien (Montagnier et al., Science 225:62, 1984) oder in bestimmten kontinuierlichen T-Zellinien, wie die durch Popovic et al., oben, beschriebene H9-Zellinie, kultiviert werden. Es gab widersprüchliche Berichte betreffend die Fähigkeit von CEM-Zellen von LAV infiziert zu werden. Barre-Sinoussi et al. (oben) waren bei der Übertragung von LAV auf CEM nicht erfolgreich. Jedoch haben Cheingsong-Popov et al. (Lancet i:447, 1984) und Folks et al. (PNAS (USA) 82:4539, 1985)) die Infektion von CEM oder HAT-empfindlichen CEM-Derivaten mit LAV beschrieben.
  • Eine Anzahl von Viren sind dafür bekannt, durch Blutprodukte (Blut, Blutserum, Blutplasma und Fraktionen davon) übertragbar zu sein, was es wichtig macht, die Blutprodukte zu untersuchen, um zu bestimmen, ob der Donor dem Virus ausgesetzt war. Das Screenen bzw. Untersuchen kann die Form eines direkten Antigennachweises (HBV/Hepatitis) oder den Nachweis von Antikörper auf den Virus (LAV/AIDS) annehmen. Der Nachweis von Antikörper auf den Virus kann auf alle von einigen Wegen durchgeführt werden, einschließlich dem "enzyme-linked immunosorbent assay" bzw. dem heterogenen Immunoassay (ELISA). Individuen, deren Blut Antikörrer auf Virusagens von Interesse enthalten, werden seropositiv genannt. Blut von seropositiven Donoren wird auf den Nachweis hin aus der Blutversorgung entfernt, wodurch geholfen wird, die Verbreitung von Krankheit zu vermeiden.
  • Die EP 156 120 offenbart ein Verfahren zur Propagierung eines vorher an B-Lymphozyten angepaßten LAV-Virus in B- Lymphoblastoid-Zellinien. Jedoch hat sich ergeben, daß alle untersuchten Zellinien, einschließlich eine MOLT/4, für dieses Verfahren nicht nützlich sind.
  • Wenn Screening- bzw. Untersuchungsverfahren, die auf ELISA basieren, für den Nachweis von antiviralem Antikörper verwendet werden, kann das Auftreten von falschen Positivergebnissen relativ hoch sein. Kürzliche Daten über die Verwendung von ELISA-Screeningässays für den Nachweis von Antikörpern auf LAV legen nahe, daß das Problem wenigstens teilweise eine Folge der Anwesentheit von Antikörpern in Donorblut auf menschliche Klasse II-Histokompatibilitätsantigene ist. Diese Antikörper reagieren mit Antigenen aus den Zellen (H9), in denen der Virus kultiviert wurde (Schorr et al., New Eng. J. Med. 313:384, 1985).
  • Der Haupthistokompatibilitäskomplex (MHC) beim Menschen wird als HLA bezeichnet und wird durch eine Reihe von verbundenen Loci, die sich auf dem kurzen Arm des Chromosoms 6 befinden, codiert. Klasse I HLV-Antigene werden durch HLA- A, B und C-Loci codiert, während Klasse 11-Antigene durch die HLA-DR, DP und DQ-Loci codiert werden. Klasse I-HLA Antigene werden auf tatsächlich allen kernhaltigen Zellen exprimiert, während Klasse II-Antigene hauptsächlich auf Zellen des Immunsystems gefunden werden. Die HLA-Antigene sind stark polymorph, d.h. es befindet sich eine große Anzahl von Allelen an jedem Locus, folglich ist es nicht ungewöhnlich, Antikörper auf HLA-Antigene in den Seren von Individuen zu finden, welche den Zellen von anderen Individuen ausgesetzt waren, beispielsweise bei Personen, welche mehrfach Transfusionen erhalten haben oder mehrfache Schwangerschaften hatten. In der Tat werden Seren von solchen Individuen derzeit als Quelle für Antikörper zur HLA- Typifizierung verwendet.
  • Infolge des Auftretens von falschen Positivantworten bei derzeitigen Screeningverfahren, besteht auf dem Fachgebiet ein Bedarf für Zellinien, welche zur Kultivierung von menschlichen Viren geeignet sind, welche Zellinien jedoch keine Oberflächenantigene besitzen, welche falsche Positivreaktionen in serologischen Assays hervorrufen können. Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses Erfordernis und liefert derweiteren andere damit verbundene Vorteile.
    • Offenbarung der Erfindung
  • Kurz gesagt offenbart die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Propagierung von Viren, welche dafür bekannt sind, mit Blutprodukten übertragbar zu sein, in menschlichen Wirtszellen, worin die Wirtszellen menschliche Klasse II- Histokompatibilitätsantigene nicht exprimieren. Das Verfahren umfaßt im allgemeinen das Aufrechterhalten einer lebensfähigen Kultur von menschlichen Zellen, denen die menschlichen Klasse II-Histokompatibilitätsantigene fehlen, in einem Nährkulturmedium, ein Impfen der Kultur mit einem Virus für den die Zellen empfänglich sind, und nachfolgendes Propagieren des Virus in der Kultur.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung offenbart ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder Menge von Antikörper auf einen wie oben definierten Virus in einer biologischen Flüssigkeit, das (a) ein Inkubieren der biologischen Flüssigkeit mit einem mikrobiellen Protein, das aus einer menschlichen Wirtszelle, der menschliche Klasse II-Histokompatibilitätsantigene fehlen, isoliert wurde, wobei ein Reaktionsgemisch gebildet wird und (b) Analysieren der Reaktionsmischung, um die Anwesenheit und/oder Menge von Antikörpern zu bestimmen, umfaßt.
  • Ein zusätzlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung offenbart ein etwas ähnliches Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern auf einen wie oben definierten Virus in einer biologischen Flüssigkeit, das (a) Konjugieren von Latexkügelchen an mikrobielles Protein, das aus einer menschlichen Wirtszelle, der menschliche Klasse II- Histokompatibilitätsantigene fehlen, isoliert wurde, (b) Inkubieren der biologischen Flüssigkeit mit dem Kügelchen/Protein-Konjugat unter Bildung einer Reaktionsmischung und (c) Analysieren der Reaktionsmischung, um die Anwesenheit von Antikörpern zu bestimmen, umfaßt.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung offenbart ein Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern auf einen ausgewählten Virus, das ein Immunisieren eines Lebewesens mit einem mikrobiellen Protein, das aus einer menschlichen Wirtszelle, der menschliche Klasse II-Histokompatibilitätsantigene fehlen, gereinigt wurde, umfaßt.
  • Weitere Aspekte der Erfindung werden unter Bezugnahme auf die nachfolgende detailierte Beschreibung offenbar.
    • Beste Ausführungsform der Erfindung
  • Vor der Erläuterung der Erfindung kann es für ein Verständnis dafür hilfreich sein, Definitionen von bestimmten nachfolgend verwendeten Ausdrücken zu erläutern.
  • Lymphadenopathie-verbundener Virus (LAV) - Ein menschlicher T-lymphotroper Retrovirus. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird ein Virus als ein LAV oder äquivalent zu LAV betrachtet, wenn er im wesentlichen die folgenden Kriterien erfüllt:
  • a) der Virus ist tropisch für T-Lymphozyten, insbesondere T-Helferzellen (CD4-positiv, gemäß der internationalen Nomenklatur, die in Bernard et al., Hrgb. Leukocyte Typing, New York: Springer Verlag, 1984) definiert ist;
  • b) der Virus ist cytopathisch für infizierte CD4-positive Zellen, eher als transformierend, wie es HTLV I und II sind;
  • c) der Virus codiert eine RN-abhängige DNA-Polymerase (reverse Transcriptase), welche Mg²&spplus;-abhängig ist (optimale Konzentration 5 mM, optimaler pH-Wert 7,8, nicht durch Aktinomycin D inhibierbar) und kann Oligo-(dT)12-18 als Primer für die reverse Transcription von seinem 3'-LTR-Ende verwendet werden;
  • d) der Virus bildet in einem Sucrosegradienten bei einer Dichte von 1,16 Banden;
  • e) der Virus kann mit [³H]-Uridin markiert werden;
  • f) der Virus unterscheidet sich durch immunologische und Nucleotidsequenzkriterien von anderen Mitgliedern der HTLV I/II-Familie von Viren (bei diesem Kriterium wird HTLV-III nicht als Mitglied der HTLV I/II-Familie betrachtet)
  • g) der Virus ist im wesentlichen immunologisch quer-reaktiv mit durch gag- und env-Bereichen von LAV codierten Proteinen; und
  • h) der Virus teilt im wesentlichen Nucleotidsequenzhomologie (75-100 %, häufiger 85-100 %) und Aminosäuresequenzhomologie (75-100 %, häufiger 85-100 %) mit LAV.
  • Der Lymphadenopathie-verbundene Virus (LAV) kann aus Patienten mit AIDS oder Lymphadenopathie-Syndrom isoliert werden. Die Lymphknoten von solchen Patienten werden typischerweise biopsiert. Nach Dilaceration werden die Lymphknotenzellen in ein wie erforderlich ergänztes Kulturmedium, um das Wachstum zu unterstützen, eingebracht. Ein Mitogen, wie Phytohämagglutinin (PHA) oder Lymphokin, wie Interleukin-2 (IL-2) können vorliegen. Antiserum auf Humaninterferon kann ebenfalls vorliegen. Die reverse Transcriptaseaktivität erscheint typischerweise etwa am Tag 15 der Kultivierung, was die Anwesenheit von Virus anzeigt. Der Virus kann aus dem Kulturüberstand unter Verwendung eines nicht-ionischen Detergiermittels, gefolgt durch Bandenanalyse in einem Sucrosegradienten, konzentriert werden. Diese und andere Verfahren zur Reinigung sind im Stand der Technik gut bekannt und werden z.B. im Montelaro et al., J. Virol. 42:1029, 1982, was unter Bezugnahme darauf hier eingeschlossen ist, beschrieben.
  • LAV kann in jeder einer Anzahl von Wegen propagiert werden. Er kann in T-Lymphocyten, die aus der Nabelschnur oder periphärem Blut oder aus Knochenmark stammen, kultiviert werden. Alternativ dazu kann er in unsterblich gemachten T- Zellinien oder B-Zellen propagiert werden, siehe beispielsweise Popovic et al., oben, und Montagnier et al., oben. Das Wachstum des Virus wird üblicherweise durch die Anwesenheit reverser Transcriptaseaktivität verfolgt. Eine Virusinfektion kann cytopathisch oder nicht-cytopathisch sein. Beispielsweise sind die H9-Zellinie und die FR 8 EBV- transformierte B-Zellinie (Popovic et al., oben; Montagnier et al., oben) kontinuierliche Erzeuger von LAV und zeigen eine minimale virale cytopathische Wirkung (CPE). Im Gegensatz dazu sind andere T-Zellinien, wie die hierin beschriebene CEM-F, für eine virale CPE empfänglich und sterben nach und nach über einen Zeitraum von 3 bis 5 Tagen, was sich mit der maximalen reversen Transcriptaseaktivität (RT) deckt.
  • Die Literatur enthält widersprüchliche Berichte über die Fähigkeit von LAV die CEM-Zellinie zu infizieren. Das ist höchstwahrscheinlich die Folge der Heterogenität in der CEM-Linie selbst, wie sie aus ATCC (CCRF-CEM) erhalten wird. Die CCRF-CEM-Linie bildet HLA-A1, A9; B30, Cw3, 7-Typen und DR&supmin;-Typen (Folks et al., oben). Diese Linie ist nicht klonal, was durch unsere Fähigkeit zum Klonieren einer Variante (CEM-F) mit einem unterschiedlichen HLA-Typ (gezeigt in Tabelle-3 unten) bewiesen ist.
  • Es ist wahrscheinlich, daß innerhalb der hinterlegten Linie Varianten existieren, welche mehr oder weniger auf Virusinfektion empfänglich sind, daher die widersprüchliche Literatur. Um eine solche Variante zu selektieren, wurden CCRF- CEM-Zellen mit einem fluoreszinierten monoklonalen Antikörper auf das CD4-Antigen angefärbt und durch Durchfluß- Mikrofluorimetrie gemäß der Antigendichte sortiert. Eine klonale Linie, CEM-F bezeichnet, wurde aus der CD4&spplus;-starken Population gewonnen. Der HLA-Typ dieser Linie ist in Tabelle 3 gezeigt. Diese Linie ist extrem stark für Virusinfektion empfänglich, produziert aber Virus nicht kontinuierlich. Im Gegenteil zeigt sie eine virale CPE nach mehreren Tagen in Kultur und stirbt nach und nach.
  • Wenn LAV in einer kontinuierlichen T-Zellinie, wie der durch Popovic (oben) beschriebenen H9-Zellinie, kultiviert wird, trennen sich HLA-CR4 und DW3-Antigene, welche auf der Oberfläche von H9-Zellen vorliegen, rein zusammen mit dem Virus ab. Kuhnl et al, (The Lancet, 25. Mai 1985, S. 1222) und Weiss et al., (The Lancet, 20. Juli 1985, S. 157) haben gezeigt, daß den HLA-DR4-Typ bildende Seren mit Virus reagieren, der aus der H9-Zellinie gereinigt wurde. Jüngste Daten (Schorr et al., oben) zeigen, daß soviel wie 77 % von Blut-einheiten, welche durch den ELISA-Test auf Antikörper auf LAV ein positives Ergebnis ergeben, bei den strengeren Kriterien der Western Blot-Analyse tatsächlich negativ sind. Es wird angenommen, daß viele dieser falschen Positivantworten (d.h. ELISA-positiv, Western Blot-negativ) eine Folge von Donorantikörpern sind, welche mit HLA-DR4- Antigenen in den LAV-Zubereitungen, welche aus infizierten H9-Zellen stammen, reagieren.
  • Die vorliegende Erfindung offenbart Zellinien, denen menschliche Klasse II- Histokompatibilitätsantigene, wie DR4 und DW3, fehlen und daher zur Kultivierung von Viren, wie HTLV, LAV und verwandten Retroviren, für serologische Screeningassays nützlich sind. Einige repräsentative CD4- positive Zellinien sind in Tabelle 1 gezeigt. Von diesen sind die Linien CEM und CEM-F besonders zur Kultivierung von HTLV- und LAV-Viren bevorzugt. Tabelle 1 CD4-positive kontinuierliche T-Zellinien T-Zellinien HLA Klasse II Referenz JURKAT (JM)
  • 1 Foley et al, Cancer 18:522, 1965.
  • 2 Martin et al., Immunogenetics 15:385, 1982.
  • 3 Ravid et al., Cancer 15:705, 1980.
  • 4 Schneider et al., Cancer 19: 621, 1977.
  • Die CEM-Zellinie ist bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer CCL 119 hinterlegt. CEM-F ist eine Variante von CEM, die für hohe Exprimierung von CD4-Antigen durch Durchfluß- Mikrofluorimetrie und Klonieren selektiert wurde. CEM-F wurde bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer (noch keine Nummer zugewiesen) hinterlegt.
  • Die Tabelle 2 führt einige zusätzliche Zellinien auf, denen auch die Klasse II-Antigene fehlen, welche aber CD4-negativ sind. Diese Linien sind zur Kultivierung von lymphotropen Viren nützlich, welche nicht bevorzugt T-Helferzellen (CD4- positiv) infizieren. Tabelle 2 CD4-negative kontinuierliche T-Zellinien T-Zellinien HLA Klasse II Referenz
  • 1 Adams et al., Exp. Cell. Res. 62:5; 1970.
  • 2 Minowanda et al., J. Natl. Cancer Inst. 49;891, 1972.
  • 3 Chechik et al., J. Natl. Cancer Inst. 63:609, 1979.
  • 4 Moore et al., In Vitro 8:434, 1973.
  • Die HSB2-Zellinie (ATCC Nr. CCL 120.1) sowie die MOLT-3- und MOLT-4-Zellinien (ATCC Nr. CRL 1552 bzw. CRL 1982) wurden hinterlegt.
  • Die phänotypischen Eigenschaften von menschlichen Zellinien, welche zur Verwendung bei den Verfahren dieser Erfindung geeignet sind, können durch alle von mehreren Wegen bestimmt werden. Typischerweise werden die Zellinien unter Verwendung von Fluoreszenz-markierten Antikörpern auf die Zelloberflächenantigene von Interesse phänotypifiziert. Eine Antikörperbindung wird entweder durch Fluoreszenzmikroskopie oder durch Durchfluß-Mikrofluorimetrie sichtbar gemacht. Letztere Methode wird gewöhnlich bevorzugt, da sie eine quantitative Information über die Exprimierung der besonderen Antigene von Interesse liefert.
  • Auf diesem Wege können menschliche Zellinien selektiert werden, welche Klasse II-Histokompatibilitätsantigene nicht exprimieren, welche aber anderen Antigene von Interesse exprimieren, z.B. das CD4-Antigen. Es wird auch für nützlich gehalten, die Zellinie nach der Infizierung mit dem Virus erneut zu phänotypifizieren, um sicherzustellen, daß ein Exprimieren unerwünschter Antigene durch das virale Agens nicht hervorgerufen wurde. Das kann durch die gleichen Verfahren, die oben beschrieben sind, erreicht werden.
  • Alternativ dazu können menschliche Zellinien, denen die Klasse II-Antigene fehlen, durch einen Mikrocytotoxititätsassay identifiziert werden, bei dem durch Komplement bewirkte Lyse von Antigen-tragenden Zellen bestimmt wird.
  • In der Literatur sind zahlreiche Antikörper beschrieben, welche bei der Bestimmung, ob oder ob nicht eine gegebene menschliche Zellinie Klasse II-Antigene exprimiert, nützlich sind (siehe Ninth Int'l Histocompatibility Workshop and Conference, Munich, West Germany, 6.-11. Mai 1984, veröffentlicht in "Histocompatibility Testing", Hrsg. Albert, Bauer und Mayr, Springer-Verlag, Berlin, 1984 und darin enthaltene Referenzen für Beispiele). Antikörper, entweder polyklonale oder monoklonale, welche mit polymorphen Determinanten auf Klasse 11-Antigene reagieren, können verwendet werden. Es wird jedoch bevorzugt, Antikörper zu verwenden, welche mit Rahmendeterminatenten auf Klasse II- Antigenen reagieren, da dies die Analyse vereinfacht.
  • Aus Klasse II-negativen Zellinien isolierte Mikroorganismen, wie aus den in den Tabellen beschriebenen Zellinien isolierten Viren, können für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, einschließlich als Immunogene und als Antigene in Immunoassays. Zur Verwendung als Immunogene können der Mikroorganismus, Virus oder deren Komponentenproteine in ein Lebewesen, wie eine Maus, ein Kaninchen, eine Ziege etc. entweder in Pufferlösung oder im Adjuvans injiziert werden. Alternativ dazu können zum Injizieren in das Wirtslebewesen die viralen, mikrobiellen oder Komponentenproteine teilweise gereinigt, wie durch Polyacrylamid- Gelelektrophorese, und die Banden von Interesse aus dem Gel geschnitten, trituriert und in Puffer resuspendiert werden. Entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper können hergestellt werden.
  • Insbesondere können monoklonale Antikörper hergestellt werden durch: (a) Immunisieren eines Lebewesens mit einem Virusprotein, das aus einer Zellinie, der menschliche Klasse II-Histokompatibilitätsantigene fehlen, gereinigt wurde, (b) Verschmelzen von Milzzellen aus dem immunisierten Lebewesens mit Myelomazellen, um Hybridzellinien zu bilden, welche zur Erzeugung monoklonaler Antikörper auf den Virus fähig sind, (c) Kultivieren der Hybridzellinien, um die monoklonalen Antikörper zu erzeugen, und (d) Sammeln der Antikörper als ein Produkt der Hybridzellinien.
  • Zur Verwendung als Antigene bei Immunoassays können aus Klasse II-negativen Zellinien isolierte Mikroorganismen, wie ein aus den in Tabelle 1 angegebenen Zellinien isolierter Virus, in markierter oder unmarkierter Form verwendet werden. Wenn die mikrobiellen oder viralen Proteine markiert werden, können die Marker Radioisotope, Fluorophore, Enzyme, Lumineszenzmittel oder Teilchen einschließen. Diese und andere Marker sind im Stand der Technik bekannt und beispielsweise in den folgenden US-Patenten beschrieben: 3,766,162, 3,791,932, 3,817,837, 3,996,345 und 4,233,402. Assays, welche die aus Zellinien isolierten mikrobiellen oder viralen Proteine verwenden, können heterogen sein, d.h. einen Abtrennschritt erfordern, oder homogen. Wenn der Assay heterogen ist, kann eine Vielzahl von Abtrennmitteln verwendet werden, einschließlich Zentrifugieren, Filtrieren, Chromatographie oder Magnetismus.
  • Ein bevorzugter Assay bzw. Versuch zum Screenen bzw. Untersuchen von Blutprodukten oder anderen physiologischen Flüssigkeiten auf die Anwesenheit von anti-viralen Antikörpern ist ein ELISA-Assay. Typischerweise wird ein Lysat von aus einer der in Tabelle 1 beschriebenen Zellinien gereinigtem Virus an der Oberfläche einer Mikrotiter-Quelle adsorbiert. Restliche Proteinbindungsstellen auf der Oberfläche werden dann mit einem geeigneten Agens blockiert, wie Rinderserumalbumin (BSA), Hitze-inaktiviertem normalem Ziegenserum (NGS), oder BLOTTO (eine Pufferlösung von Magermilchpulver, das auch ein Konservierungsmittel und ein Antischaummittel enthält). Die Quelle wird dann mit einer Probe inkubiert, von der angenommen wird, einen spezifischen Antikörper zu enthalten. Die Probe kann wie sie ist aufgetragen werden, oder häufiger kann sie verdünnt werden, gewöhnlich in einer Pufferlösung, welche eine geringe Menge (typischerweise 0,1 bis 5,0 Gew.-%) von Proteinen enthält, wie BSA, NGS oder BLOTTO. Nach dem Inkubieren für eine ausreichend lange Zeit, damit eine spezifische Bindung auftreten kann, wird die Quelle gewaschen, um nicht gebundenes Protein zu entfernen, und dann mit markiertem Anti-Humanimmunoglobulin (α-HuIg) inkubiert. Der Marker kann aus einer Vielzahl von Enzymen ausgewählt werden, einschließlich Meerrettichperoxidase (HRP), β-Galactosidase (β-gal), alkalische Phosphatase (AP) und Glucoseoxidase (GO). Damit eine spezifische Bindung auftreten kann, läßt man ausreichend lange wirken, dann wird die Quelle erneut gewaschen, um nicht gebundenes Konjugat zu entfernen, und das Substrat für das Enzym wird zugefügt. Man läßt die Farbe entwickeln und die optische Dichte der Inhalte der Quelle wird visuell oder instrumentell bestimmt.
  • In geeigneter Weise können Reagenzien für den ELISA-Test in Kit-Form zur Verfügung gestellt werden. Diese Kits können Mikrotiterplatten, auf denen ein Viruslysat adsorbiert wurde, verschiedene Verdünnungsmittel und Puffer, markierte Konjugate für den Nachweis von spezifisch gebundenen Antikörpern und andere signalerzeugende Reagenzien, wie Enzymsubstrate, Cofaktoren und Chromogene beinhalten.
  • Um die nachfolgenden Beispiele zusammenzufassen, veranschaulicht Beispiel 1 die Phänotypifizierung von nicht infizierten und LAV-infizierten CEM-F-Zellen. Beispiel II veranschaulicht das Autreten einer bedeutenden Zahl von falschen Positivantworten, wenn Bluteinheiten auf die Anwesenheit von Antikörpern auf LAV untersucht werden, indem ein handelsüblicher ELISA-Test verwendet wird, der LAV (HTLV-III), abgeleitet voh infizierten H9-Zellen, (welche Klasse II-Antigene exprimieren) verwendet. Die Spezifität des LAV-serologischen Screeningstests wurde überaus verbessert, wenn die Proben, welche falsche Positivergebnisse erzielten, unter Verwendung von LAV, abgeleitet von infizierten CEM-F-Zellen, welche Klasse II-Antigene nicht exprimieren, erneut untersucht wurden.
  • Die folgenden Beispiele werden zur Veranschaulichung, aber nicht in beschränkender Weise angegeben.
    • BEISPIEL I
  • Wie in der folgenden Tabelle gezeigt ist, trat nach Infektion einer auf LAV-empfindlichen Zellinie keine Anderung des HLA- Typs auf. Tabelle 3 HLA-Typ nicht infiziert infiziert
    • BEISPIEL II
  • Ein ELISA-Test für den Nachweis von Antikörpern auf LAV wurde am Puget Sound Blood Center (PSBC) unter Verwendung eines handelsüblichen Kits durchgeführt, der HTLV-III, abgeleitet von H9 (DR4&spplus;)-Zellen (Abbott Laboratories, HTLV III ELISA) (Tabelle 4) verwendet. Die ersten 38 wiederholbar reaktiven Patientenseren wurden erneut durch den ELISA- Test bei den Abbott Laboratories untersucht. Von diesen 38 blieben 14 beim ELISA-Test reaktiv. Diese 14 wurden durch die Western-Blot-Analyse untersucht und nur vier davon waren reaktiv. Die vier im Western-Blot reaktiven Proben wurden als tatsächlich positiv beurteilt, wohingegen die verbleibenden zehn als falsch positiv beurteilt wurden. Diese zehn Proben wurden erneut in einem ELISA-Test untersucht, der als Quelle des Antigen LAV, abgeleitet von infizierten CEM-F-Zellen, welche DR4&supmin; sind, verwendet. Alle zehn Proben waren bei diesem Versuch negativ.
  • Die zehn Seren, welche im Abbott-ELISA-Test positiv waren, aber in dem auf CEM-F basierenden ELISA-Test negativ, enthielten Antikörper auf HLA-DR4, was durch ihre Fähigkeit, durch Komplement bewirkte Cytoxizität von DR4&spplus;-Zellen hervorzurufen, gezeigt wurde. Daher ergeben Antikörper auf Klasse II-Antigene in Patientenseren falsch positive Ergebnisse im ELISA-Versuch, der einen Virus verwendet, der von Klasse II-positiven Zellen abgeleitet ist. Tabelle 4 PSBC-Ergebnisse Abbott-Ergebnisse Verhältnis* Nr. von Donoren gesamt:
  • * Das Verhältnis wird durch Teilen des Probenabsorptionswertes durch den Abschaltwert berechnet. Daher wird jeder Wert größer als 1,0 als positiv betrachtet.
  • Die Erfindung betrifft des weiteren die Zellinien selbst, zur Verwendung bei den hierin beschriebenem Verfahren. Insbesondere betrifft die Erfindung eine geklonte oder klonale Zellinie, wobei die klonale Zellinie nicht infizierbar oder infiziert mit einem LAV-Virus, frei von Klasse II- Histokompatibilitätsantigenen, nachweisbar durch die entsprechenden Antikörper, insbesondere von Antigenen, die durch die HLA-DR, HLA-DP und HLA-DQ-Loci codiert werden, ist, wobei die klonierte Zellinie einen stabilen HLA-Typ besitzt, ob mit LAV infiziert oder nicht.
  • In ähnlicher Weise betrifft die Erfindung die Zusammensetzungen, welche die für Diagnosezwecke konditionierten LAV- Antigene, wie LAV-Lysate oder LAV-Extrakte, welche frei von den selben Antigenen sind, insbesonderen von Antigenen, welche fähig sind, mit Antikörpern auf HLA-DR4 zu reagieren, enthalten.
  • Bevorzugte Zellinien zur Verwendung bei dem Verfahren dieser Erfindung sind, Zellinien, welche, wie die CEM-F- Zellinien, Komplement-unempfindlich (oder Komplement-nicht empfindlich) sind.

Claims (14)

1. Verfahren zur In-vitro-Propagierung eines durch Blutprodukte übertragbaren Virus umfassend die Propagierung dieses Virus in menschlichen Wirtszellen, denen die menschlichen Klasse II-Histokompatibilitätsantigene fehlen, und die Isolierung des Virus nach dem Propagierungsschritt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Virus ein LAV- Virus ist oder ein Virus, der im wesentlichen LAV äquivalent ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Wirtszellen eine kontinuierliche Zellinie sind.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Wirtszellen, denen menschliche Klasse II-Histokompatibilitätsantigene fehlen, eine CD4-positive kontinuierliche Zellinie sind.
5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Wirtszellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus CEM, CEM-F (hinterlegt bei ATCC unter der Hinterlegungsnummer NR CRL 8904), HPB-ALL, HPB-MLT, PEER, JURKAT, TALL-1, DND-41, CHAN Zellinien.
6. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die virale Infektion der Wirtszellen cytopathisch ist.
7. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Wirtszellen CEM-F sind (hinterlegt bei ATCC unter der Hinterlegungsnummer NR CRL 8904).
8. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Wirtszellen, denen menschliche Klasse II-Histokompatibilitätsantigene fehlen, eine CD4-negative kontinuierliche Zellinie sind.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Wirtszellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus HSB2, MOLT-1, MOLT-2, MOLT-3, MOLT-4 und 8402-ALL Zellinien.
10. Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern in einer biologischen Flüssigkeit gegenüber einem Virus, das durch Blutprodukte übertragbar ist und ausgewählt ist unter jenen, die in einer Wirtszelle propagiert werden können, wobei diese Methode umfaßt:
- Inkubierung der biologischen Flüssigkeit mit einem viralen Protein, das aus Wirtszellen isoliert wurde wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definiert, wodurch eine Reaktionsmischung erhalten wird und
- Analysierung der Reaktionsmischung zur Bestimmung der Anwesenheit von Antikörpern.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Wirtszellen so wie in einem der Ansprüche 3 bis 7 definiert sind und wobei der Virus ein LAV-Virus ist oder ein Virus, der im wesentlichen LAV äquivalent ist.
12. Verfahren zur Herstellung von Antikörpern gegen einen Virus, das durch Blutprodukte übertragbar ist und ausgewählt ist unter jenen, die in einer Wirtszelle propagiert werden, wobei das Verfahren umfaßt:
- Immunisierung eines Tieres mit einem viralen Protein des aus einer wie in einem der Ansprüche 1 bis 9 definierten Wirtszelle isolierten Virus, wobei die Wirtszelle zuvor mit dem ausgewählten Virus infiziert wurde.
13. Verfahren nach Anspruch 11, wobei die Wirtszellen wie in einem der Ansprüche 3 bis 7 definiet sind und der ausgewählte Mikroorganismus ein LAV-Virus ist oder ein Virus, der im wesentlichen LAV äquivalent ist.
14. Zellinie hinterlegt bei der ATCC unter der Hinterlegungsnummer NR CRL 8904 am 13. September 1985.
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