JPS61500767A - エイズに関係するレトロウイルス（ｈｔｌｖ―３）の連続的産生のための方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 エイズに関係するレトロウィルス（ＨＴＬＶ−１）の連続的産生のための方法お よび細厳株本発明は後天性免役不全症候群（エイズ）、前エイズの患者および謎 尿なキャリヤーからの細胞変性または殺細胞効果を持つ（ＨＴＬＶ−Ｉｌｌ　） 　ヒト向Ｔ細胞レトロウィルス（）ＨＴＬＶ群）の再現性ある構出および分離の ための細胞系に関する。リンパ葎白皿病の成人から誘導され、ＨＴと名付けられ たひとつの新生物性異数性Ｔ細胞株は、）ｆＩ’ＬＶ−■の感染を受け、　ＨＴ ＬＶ−厘に高度に感受性で計容性のＴ細胞集団を生じ、ウィルスの大量培養、分 離および。

生物学的検出に４１５合がよい、他の０ＫＴ４浦性の操作性細５ｓｌｔｔにはＭ ｏｌ　ｔ　Ｓ　、　ＣＥＭ、Ｔｉ　Ｚ４および）ｌＵＴ３８が含まれ、これらは 、ＨＴＬＶ−ｎ［ウィルスｇ栗後、無期限の生育能を生じ、珠持可馳である。

発明の背景 疫学的データから、後天性免役不全症候群（エイズ）は明らかに密接な接触を九 は二液生成物による水平伝達される感染性剤によって起ることが強く示役される 。この病気は日和見賂呆、主としてニューモアステイス　ヵルシニ（Ｐｎｅｕｍ ｏｃｙｓｔｉｓ　ｃａｒｃｉｎｉｉ）肺灸およびカポジ悶腺によって証明されて はいるものの、基にある障害は絶対的リンパ球減少およびヘルパー１９７７球（ ＯＫＴａ”）数の減少による患者の細胞性免疫に影響ヲ与えることでらる。その 上、この病気発病の完全な臨床的証明の前に、その前駆症、前エイズが説明でき ない慢性リンパ線速および／またはヘルパーＴＭｌｆ＠の一群を含む白皿球減少 としてしばしば認められる。これは、り者の重′４な免疫不全につながり、Ｔｋ Ｂ％の特異な一群が感染剤の一次的標的であることを示唆している。エイズまた は前エイズ患者はしばしば慢性的に巨大細胞ウィルスまたはＢ型つィルス肝灸に 感染しているものの、種々の理由から、これらは明らかに免役反応不全に関係の ない日和見または偶然の感染と思われる。

エイズの原因はヒトＴＰＦ＠同すンパ性レトロウィルス（ＨＴＬｖ）であり、こ れには本発明以前にヒ）Ｔ細胞白血病／リンパ腫ウィルス、ＨＴＬＶ−Ｉおよび ＨＴＬＶ−１１と呼ばれる二種の主要な性質の艮く判っ之ヒトのレトロウィルス の群が含まれる。最も一般に分離されるｊ（ＴＬＶ−Ｉは主として底入Ｔ細施癌 、叡者から得られる。皿清疫学的研究。

試櫃管円での生物学的効果および＆１ハイプリダイゼイションのデータから、Ｈ ＴＬＶ−Ｉは病源学的にこの癌に結びつき、これは最初、日本の南部の、更にカ リブ地方およびアフリカの成人がかがる。サブグルーグ■のＨＴＬＶ（ＨＴＬＶ 〜■）は最初、毛細側白血病のＴ細胞変種の患者から分離された。現在までの所 、これが新生物病の患者゛からＨＴＬＶ　−１が分離された唯一のものである。

ウィルスの分離および皿清疫学的データから、両サブグループのＨＴＬＶはエイ ズ患者に見いだされることがある。

下記の事に基いてＨＴＬＶ詳のレトロウィルスがエイズＯＮ源学的物質であるこ とが証拠に基い−Ｃ示峻される２（１１動物のレトロウィルスが免疫不全の原因 になるという先例がある（ネコのネコ白血病ウィルス）　；　ｆ２１　ＨＴＬＶ 群のレトロウィルスは同ＴｗＩ胞性である；（３）これらは好んで「ヘルパー」 Ｔａ施（ＯＫＴ４”）に感染する：（４）細胞合胞体形成の肪纒で児られるよう な種々のヒトおよび唾乳動物細胞に細施変性効果を持つ；（５）これらはいくつ かのＴ細胞機能を変える；（６）ある場合には、感染により選択的にＴ細胞を殺 す；および（７）これらは密接な接層または二液生成物によって伝達される。Ｈ ＴＬＶ　＃染細側の細胞涙仇原に対する抗体の存在がエイズ患者の４０％以上の 血清に見られた（エセックス（Ｅｓ５ｅｘ　）　等、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃ ｅ）、２２０呑　８５９頁、１９８３年）。この抗原はそれ以ｔ＆ＨＴＬＶのエ ンベローブの部分とされた（ジョグバッハ（５ｃｈｏｐｂａｃｈ　）　４　、サ イｘ　ンス（５ｃｉｅｎｃｅ　）２２４巻、５０３頁、５月４日、１９’８４年 およびリー（Ｌｅｅ）等。

プロシーディングズ　オプ　ザ　ナショナル　アカデミーオブ　サイエンシズ　 オブ　ユナイテッド　スティソ　ォブ　アメリカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　投稿中、徨々の分離さｎたＨＴＬＶの最初の検出 と分離によりふたつの初期の進歩が可能になっ友：インターロイキン２　・（Ｉ Ｉ−２）とも呼ばれるＴ紬厄生育因子（ＴＣＧＦ）の発見で、これは正常および 新生ぞ住のＷ、態Ｔ紬施の異った二群を定常的な選択的生育を可能にする（ラセ ッティ（Ｒｕｓ　ｃｅ　ｔ　ｔ　ｉ　）等、ジャーナル　オブ　イムノロジー（ Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）：Ｎ９巻、１３１頁、１９７７年；およびボイエズ（Ｐ ｏｉｅｓｚ）等、プロシーディングズ　オプ　ザ　ナショナル　アカデミ−オプ サイエンゾズ　オプ　ユナイテッド　スティソ　オプ　アメリカ（Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）、７７％、　６１３４頁、１９８０ 年および逆転写１４肪延に基くレトロウィルスの玩賊な演出法の開発である。Ｈ ＴＬＶの分離と伝達の方法にはウィルスに計容性のＴ細胞を使用する共培養法が 含まれる。

共培養実雇に正常ヒ）Ｔ細胞を使用すると標的Ｔ細Ｂ包のいくつかに対し不朽化 （形質転換）籠を持つふたつのサブグループのＨＴＬＶが優先的に得られる。

しかしながら、ＨＴＬＶ変種（今や）ｉＴＬＶ−１１１と名付けられている）は 正常Ｔ　ｍ　Ｉ地に対する不朽化性を欠き、主としてＴ細胞に細胞変性効果を示 し、そして今やエイズの原因と信じられている。実際に、このような変種は共培 養または魚帽服伝達央戚において標的としてのこれらの正常Ｔ細施ｔＩＥってし ばしば、しかし一時的に検出され感受性で計容性の、したがって、ウィルスのＭ ＆東後も水入に生育する能力を′床付する細胞を見い出すことによシ見服される 。本発明は、この新規な不朽化Ｔ細胞糸回の同定および性質、およびエイズ２よ び前エイズ患者からのこのようなウィルスを分蔵し、連続的に高レベルで産生さ せることにこれを使用することを明らかにする。

ひとつの新生物性異数性Ｔ細胞体を同定し、これは新しい細厩変性ウィルス分離 株の感染に感受性であった。

この箭胞株はこれらの分離ウィルス（ＨＴＬＶ−１１１）の伝達に対して感受性 の標的であり、これにより連続的なウィルスの大孟窄養が可能であり、またこの ウィルス自身同志の、およびＨＴＬＶ−ＩやＨ’ｌ’ＬＶ−１１との比較にＭ用 な特異性のある免役拭蘂２よび核離プローブの開発を可能にする。ＨＴＬＶ−Ｉ およびＨＴＬＶ−Ｉｆと区別さｎる生物学効果における遅いに卯えて、ＨＴＬＶ −ｍはいくつかの免疫学的分析および形感学的にこれらの公知のＩ（ＴＬＶ群と 異っている。しかし、この新しいレトロウィルスも向Ｔ４リンパ性であり、逆転 写酵素、患者の血清および動物の超、免疫血清を使った異族性拮抗ラジオイムノ アッセイで調べた構這蛋白質の父差反応および合膿体誘尋を含む、ＨＴＬＶ−■ およびＨＴＬＶ−ｉｆと多くの虜似したｆｆ：責を示す。これらの新たに分離さ れたウィルスを総称的に）ｉＴＬＶ−Ｉｌｌは名付けられた。その蛋白貞および 遺伝学的清報のいくつかに演出される差異と茶に、）ｉＴＬＶ−１１１がＴ細胞 を殺す能力がＨＴＬＶ群の他のものからこのｆ８！を明らかに区別して本発明に 相当する細胞株でＨ９／ＨＴＬＶ−ＩＨＢと名付けるもの′ｔ−ＡＴｃｃ　Ａ　 ＣＲＬ　８５４３として１９８４年４月１９日、アメリカン　タイプ　カルチャ ー　コレクション（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃ ｔｉｏｎ）　（、エイ　ティー　シー　シー、アメリカ合衆国、メリーランド　 ２０８５２−１７７６　、ロックビル、　１２５０１パークローン　ドライブ（ ＡＴＣＣ。

１２３０１　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、　Ｒｏｃｋｖｉ口ｅ　、　Ｍａ　 ｒｙ　ｌ　ａｎｄ２０８５２−１７７６　ＵＳＡ）に寄託した。この寄託によシ 寄託物の水枕性が確保され、また一般に容易に入手できる。

Ｈ９は本発明にしたがった代表的で望、ましい細胞株である。更にＭｏ　１　ｔ 　５　／　−ＨＴＬＶ　−ＩＩＩ　ｎもＡＴＣＣＡ　ＣＲＬ８６０２として１９ ８４年４月１５日にエイ　ティー　シー　シー（ＡＴＣＣ）に寄託され、寄託物 の水成性が保証されると共に、一般に容易に入手できる。

感受性細胞体ＨＴ、は、試験管内感染の前に、ＨＴＬＶについて試賦され、プロ ウィルス配列が欠除していることも含めてすべての点でＩ性であった。前エイズ またはエイズ患者から出たＴ細組の短期間培養（ＴＣＵＦを用いて生育）から果 めたＨＴ　ＬＶ　−Ｉｌｌを含む濃縮培養液に対し、親のＨＴ＃ｌ胞（ポリプレ ン処理した３×１０個の細胞）ｔ−繰返し暴露してＨＴＬＶ−１１１を遅統元生 させる。この濃縮液が逆転写券素（凡Ｔ）を持つ粒子を含むことを最初に見た。

線側増殖が下降した時、逍常培誉液に暴露して１０乃至２０日後に、新鮮な（感 染していない）ＨＴ親細胞を培養に加える。ｇ染親細胞株の培養液はＲＴ活性を 持つ程子について陽性であり、感染細胞数の約２０％が前エイズ皿友病思者（患 者Ｅ、Ｔ、）の血清を用いた間接免疫螢光分析（ＩＦＡ）に陽性であった。Ｅ、 Ｔ、からの血清も破砕ＨＴＬＶ−■の蛋白質に対する抗体を含んでいたが、ＨＴ ＬＶ−エま友はＨＴＬＶ−１惑染細胞の蛋白質と反応しなかった。

詳細な説明 既に述べたように、異数性ＨＴａ胞株はＨＴＬＶ−１１１の連続的：ｌｌ！！Ｉ 殖の望ましい必要条件を示した。この細胞体はリンパ様白皿病の成人患者から出 た新生柳性異数性Ｔ細胞株で、蛍光活性化セルソーターを使用したサイトフルオ ロメトリーにより調べて成熟Ｔ細施表現型（０ＫＴ５”Ｃ６２％）　、　０ＫＴ ４”（５９％）および０ＫＴ８−）について選択したものである。この細厩の培 養は２０％仔ウシつ仔血甫と抗生物質を別えたＲＰＭＩ／１６４０中で定常的に 保持される。

この培養を実施例１．第２表に示す。Ｈ９クローンが望ましく、）ｉ４クローン は二番目に望ましい。

Ｈ’ｒＬｖ　−ｍ培養液を後天的免疫不全症候群（エイズ）、へ者のｆ＠女細胞 から分離する。患者の末梢血白血球をＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ中でバンド 形成させ、５り／ｆｎｔ７アイトヘムアグルチニン（ＰＨＡ−Ｐ）ｔ−含む生育 培地（ＲＰＭＩ　１６４ｏ、２゜％仔つシ胎仔皿清、１２９ｍ／ｄグルタミン） で３７℃。

４８時間、５％ＣＯ２雰囲気下に培養する。次いでこの白血球に１０％精＆Ｔ細 施生胃因子（ＴＣＧＦ　）を含む生育培地を加える；望みに応じて、細胞の一部 にアルファーインターフェロンに対するウサギ抗体を与えた。その後、この白血 球の細胞および生育培地について）ｉＴＬＶのサブグループｌ−１１１の存在を 調べる。下記の中のひとつ以上を示す番試料を陽性と考えた二上澄液にＭ　ｇ４ τ存逆転写酵素活性が繰返し検出される；電子顕微鏡でウィルスが観察される； 陽性血清者または超免疫血清からの抗体によってウィルス関連抗原が細胞内に表 現される；または、逆転写酵素または電子顕微鏡媛察により検出された粒子が新 鮮なヒトの中心の血液（ｃｏｒｅ　ｂｌｏｏｄ　）　＋　？髄、または末梢血Ｔ 、リンパ球に伝達される。免疫学的またはジ酸分析によシ）ｉＴＬＶ−ＩにもＨ ＴＬＶ−ＩＩにも分類されないすべての分層ウィルスはＨＴＬＶ　−１１として 分類した。ＨＴＬＶ−１１１産生細廊培養の細胞は確立された免疫学同手法を使 って性質ｔｇｎべた所、はとんど１４表現型（ＯＫＴａ　、　Ｉｅｕ　３　ａ陽 性）ｔ−持つｆ　１７７７球（Ｅロゼツト受容坏、　ＯＫＴ／　Ｓおよびｌｅｕ ／１陽性）である。この過程はガロ（Ｇａｌｌｏ）等によりサイエンス（５ｃｉ ｅｎｃｅ）　２２０巻、　８６５−８６７頁。

１９８３年にも記載されている。宿主ＨＴ細胞および他のクローン化細胞集団の 感染は、エイズまたは前エイズ患者からのＴｍ砲培養のａ４または非濃縮培養液 にこれらの細胞を暴膳すること（無Ｉｖａ］胞感染）または共培養によって起り ；すなわち、Ｈ’ｒ７施は）ｉＴＬＶ−１１錫性Ｔ細胞培誉に対し恭露されるこ とによって感染される。通常の無細胞感染方法は次の剋シでろる：２乃至５Ｘ１ ０’細胞をＣＯ２インキュベーター中で３７℃、３０分間、ポリブレン（２ｆ／ ｄ）またはＤＥＡＥデキストランで処理する。次いでそのインキュベーター内で （Ｃｏ２１５７℃）１時間、ウィルス接種物（α１乃至１！ｎｌ）に暴嬉する。

細胞を定期的に振とうすることによって叶濁状態に保つ。１時間置いた後に正規 の生育培地を加える。感染培養が）ｉＴＬＶ−１１１に陽性かどうかを培養１． ２および５週間後に調べる。

ＨＴ細＠（クローン）の感染も共培養法−ＨＴ＃ｌ＠をエイズまたは前エイズ思 考からのＴ細胞の短期培養（約５乃至２０日）と糎々の比率（通常１：５）で混 合する−によって行う。ｈＴＬＶ−ＩｉＩ闇性は、共培ｆ索、種々の間４　（７ 、１４、２１日等）で感染した受容体細胞にウィルス抗原またはウィルスジ鎖配 列を検出することによって行う。混合培誉は生Ｗ冶地で数ケ月間株待される。

共廻餐を細胞処理のための標準法にする。ｆｄ胞を生育させる保準条件は９５％ の湿度を与えた空気と５％ＣＯ２の雰囲気下の３７℃である。徐作において、ヒ トの血液からの供与細胞が、共粗餐をするための標的細胞（ＨＴ新竺吻性異数性 Ｔ細胞）に作用するウィルスを生成する。

レトロウィルス陽性−胞の共培ｔはウィルスを産生し、水入の生育または不滅の 生育（ＨＴＬＶ−［１＞よびＨＴ９として）；すなわち不死粂件が保持される。

ｂ９にフロえて、ウィルスＨＴＬＶ−Ｉ［［陽性細胞の共培養を許容する許容性 −施が更に見い出され、同定された；これらは八１ｏｌｔ３およびＨＵＴ　７８ セ施、およびＧＥＭおよびＴｉ７．４でるる。しかし、後者、Ｔｉ７．４はヘル ペス様ウィルスであり、その意味ｌこおいて使用できない。注目した細胞の性質 は両性も４性も下記の第１表に掲げる。

第１表 Ｍｏ１ｔ３　Ｔ（ＯＫＴ４）　５８　９５００００／　５０００ＣＥＭ　Ｔ　Ｉ 　５３　８４０００／１５０００Ｔｉ７．４　Ｔ　ｌ　２２　９０００００／１ ００００Ｈ［ＪＴ７８　Ｔ　ｚ　６４　１５００００／１２００００Ｆ−２Ｂ　 Ｏ１５００／　５０００ Ｄａｎｄｉｅ　Ｂ　０　６０００／　６０００Ｒａｊ　ｉ　Ｂ　Ｏ８５００／　 ５５００に５６２　Ｅｒｙｔｒ、Ｉｅｕ、　０　５５０００／１９０００ＨＬ６ ０　Ｐｒｃｘｎｙｅｌｏｃ、ｌｅｕ、　０　６０００／　５０００笑胞例１ 下記の第２表に示すよりに、単一細胞ＨＴクローンをボボビック（Ｐｏｐｏｖｉ ｃ）等によりネオプラズマ（Ｎｅｏｐｌａｓｍａ）１ａ巻、２５７頁、　１９７ １年に、およびバック（Ｂａｃｈ）等イムノロジカル　レビｘ　−（Ｉｍｍｕｎ ｏｌ、　Ｒｅｖ、）　５４巻、５頁、１９８１年に記或さ才しているようにして 、螢光活性化セルノーターを使ったサイトフルオロメトリーによう調べて成熟Ｔ 、１ｉｉｉｌ施表現型（ＯＫＴ　ｓ“（６２％）　、　０ＫＴａ”　＜５９％） および０ＫＴｓ　＋　）を表わす長期培誉異数性ＨＴ細胞体から分難した。この 培養は２０％仔ウシつ仔皿清および抗生物質を含むＲＰＭＩ／１６４０−’＋？ 定常定例的持した。２Ｘ１０５細胞／培養培堆−の′ａ度で汽母添別した親細胞 培養の最終細胞濃度は、培養５日麦でｊＸ１０’乃至１．５ｘ１０’細胞／ｌＬ ｌの範囲内であった。

多桜細胞検出のために、郡染後６および１４日に細胞塗床を行い、Ｗｒｉｇｈｔ −Ｕｉｅｍｓａ染色した。５個以上の俵を持つ細胞を多核粕、沼と考えた。非感 呆培養からのクローン化細胞もいくつか多核巨大細胞を含む；しかじ、リング形 成は無く、これらの細胞の数ははるかに少い（α７％乃至１０％）。

免役螢光−性細匡をリン峨収倫化食塩液（ＰＢＳ）で洗浄し、同じ緩衝液にｄ当 り１０６細胞のａ度で再懸濁した。

約５０λの＃Ｉ厩砦濁液をスライド上に取り、風乾、アセトン中で１０分間、室 温で固定した。スライドは使用するまで一２０℃に保管した。）ＩＴＬＶ−１１ １に対する超免疫ウサギ抗血清（ＰＢＳで１／２０００に希釈）またはＰＢＳで １７８に希釈した患者（Ｅ、　Ｔ、　）の皿盾の２０マイクロリツトルを細胞に 通用し、３７℃で５０分分間−た。ウサギまたはヒト免役グロブリンＧに対する フルオレッセイン結合抗皿清を希釈し、一定した細胞に室温で３０分間適用した 。次いでスライドを顕傾鏡暖移の前に十分に洗浄した。

非感染親細昭抹およびそのクローンは本試恢で常に陽性であった。

逆転写醇紫后性を測定するために、ウィルス粒子を下記のようにして無ｆＬａ鴨 上＆ｆｉから沈殿させた：４へ１Ｎａｃ１α４ｄおよび３０％（重量／容積）ポ リエチレングリコール（Ｃａｒｂｏｗａｘ　６０００　）五６ｔｔｌを果めた培 養液８ｄに加え、その懸濁液を水冷下に一夜漬いた。懸濁液を５ｏｒｖａｌ　ｌ 凡Ｃ−ｓ遠心分離機を使って２０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心分離した。

沈殿を５０％（各損／容槓）グリセロｋ　（２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　、　 ｐＨ７，５７５ｍＭジチオスレイトール／、１５０ｍＭＫＣｌ／［＋２５％Ｔｒ ｉｔｏｎ　Ｘ−１００）５００ｐｔに再懸凋した。粒子を［Ｌ９％Ｔｒｉｔｏｎ 　Ｘ−１００／１．５Ｍ　ＫＣＩを加えて破砕した一逆転写酵素（ルＴ）分析は ポイエズ（Ｐｏｉｅｓｚ）　４　、プロシーディングズ　オプ　ザ　ナショナル 　アカデミ−オブ　サイエンシズ　オプ　ユナイテッド　スティソ　オプ　アメ リカ（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、　ＵＳＡ）　７７巻、７４１５頁、１９８０年記載のようにして行い、 培養ｉミ’）リットル当りのｃｐｍで辰わした。

実施例２ 下記の第５表に示すように、Ｈ４受容体Ｔ細胞クローンとの共培養を、それぞれ 患者ＲＦおよびＳＮの末梢血からの新鮮な単球を使って行った。患者ＢＫとＬＳ の場合には、外部から加えたＴＣ（）Ｆ　（１０％容積／容墳）の存妊下に１０ 日間生有したＴｒ６胞を使って共培養を行った。受容体／供与体（患者のもの） 細胞の比は１．５であった。混合培誉は几ＰＭＩ／１６４０　（２０％ＦＣ８お よび抗生物質）中、外部からＴ　ＣＧＦを加えずに維持した。Ｈ９Ｔ細雁クロー ンの無ｍ１服感染は患者ＷＴのＴ細胞培養から集めた３鰯培養液を使って行った 。そのＴ細胞培養は外部から、’ｉ’ＣＧＦを加えて２ユ１間生肯させた埃、培 養液を果めでα渦した。Ｈ９クローンの細胞ハボリブレン（２μ２／ａｇ）で２ ０分間前処理し、２Ｘ１０６細施を粒子ＲＴ活住場住の１００倍ｊ禰廻養液１５ ｄに１時間暴露した。

共場繋および無細胞感染細胞培養のいずれにおいてもＨＴＬ’ｌ／−１１１ウィ ルス表現は試貌管Ｐ′３廻養後１月間して測定した。ｆ−ＩＴＬＶ−ＩＩＩ表男 には相当の変動がめった（第５表参照）。逆転写＃累（几Ｔ）分析および間接免 疫蛍光分析（ＩＦ″Ａ）の詳細は実ゐす１」１を参照のこと。

冥施例３ ）（ＴＬＶ−Ｈに対する高度の肝容注を違択し、永続的生育と連続的ウィルス産 生を保持する几めに、ＨＴ瓶Ｔ細胞呆団の広いクローニングを行った。総ｔｒ５ １の単細胞クローンを、供給者として健康な献血者の末梢皿からの照射した草原 を便い、毛細管法および限足希釈法によって得た。これらの細胞クローンの生育 を１１−１ＴＬＶ−感染埃に比軟した。ＨＴＬＶ−Ｉｌｌに感受性で計容性でめ る８種のＴ細胞クローンのウィルス感染に対する反応の代表的例を第２表に示す 。同一実験を２に行い、各Ｔ細胞クローン２Ｘ１０　細胞をα１ｍｌの濃縮ウィ ルスに林蕗した。細胞生育と形態、細胞のウィルス抗原の表現および瑞養液のＲ Ｔ活性を、■染６および１４日後に調べた。８クローンすべてウィルスに感受性 で計容性であるが、感染後の瑠殖能に相当の正真があった。細胞畝はＩ舒染６日 以内に最初の細、咀νから１０％乃至９０％減少し、＃呆した８クローンすべて に多′＆；（巨大）細胞が常に尚比率に見られた。

エイズ像者（Ｅ、Ｔ、）からの二種または破砕ＨＴＬＶ−Ｉｌｌ全体に対してつ くった超免疫ウサギ皿ｆ＃を使った免疫螢光分析で鉤ヘタウィルス仇原陽任Ｔ＋ ？ｌｊ胞のパーセント上１０％乃至８０％の範囲でめった。感染１４日後には、 ８クローンすべてにおいて、全細胞数およびＨＴＬＶ−１［１１１性細胞の比率 が上昇した。ウィルス陽性培養には常に多数のしを含む丸い巨犬袖もが見られた 。これらの多少巨大細胞は）ｉＴＬＶ−ＩおよびＨＴＬＶ−１によシ誘纏される ものと類似しているが、夕が連像的なリング形成を示す。電子題做鏡検査から、 細πｉはかなりの葉のウィルスを放出することがわかった。

災厖例４ ＨＴＩ、Ｖ−Ｂが１代呆Ｔ釉胞により＊期間培養において連続的に喧生されるか どうかを調べるために、感染クローン。

Ｈ４のウィルス逅生と生細胞Ｖを数ケ月にわたって追跡した。ウィルス雇主は変 動するものの、約１４日毎にＨ４１って粒子の几Ｔ活往を常に示した。生細島≦ は６５％乃至８５％の範囲であり、Ｈ４／ＨＴＬＶ−Ｉｎと呼ばれる細凪果口の ダブリングタイムは約５０乃至４０時間でめった。

し九がって、この永続的に生育するＴ細胞楽団は遵ルデ的にＨＴＬＶ−１［を産 生することができる。

Ｈａ／ＨＴＬＶ−１［ｉ細胞によって厘生されたウィルスの収量を、庶権密厩勾 配による１縮培養液の精製と８度勾配から糸められた各自分の程子几Ｔ活狂分析 により調べた。

敢昼几Ｔ活注は甑のレトロウィルスに漬１以して桁度１，１６？／ｌｒｉの所に 見らｎた。

工粂的応用性 本発明の生成吻である望ましい細胞株（）１９／）ｉＴＬＶ　−ｉｌｌ　、　） は、今や、エイズの故障および二液試料中のウィルスに対する抗体の検出のため のワクチン製造に有用である。

国際調査報告 “ｍｙｌｌ１６”１ＡＤＤ“°”″″−コＣＴ／ニアＳ七／○−クリ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）標的丁細胞にＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスを感染させ、ＨＴＬＶ−ＩＩＩの 正常な細胞変性効果を克服し、標的丁細胞の不死の生育能を保持することを特徴 とするＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスの製造法。 （２）標的丁細胞が標的ＯＫＴ４＋丁細胞であることを特徴とする請求の範囲第 （１）項記載の方法。 （３）標的丁細胞がＨＴクローンであることを特徴とする請求の範囲第（１）項 記載の方法。 （４）ＨＴクローンがＨ４クローンであることを特徴とする請求の範囲第（３） 項記載の方法。 （５）ＨＴクローンがＨ９クローンであることを特徴とする請求の範囲第（３） 項記載の方法。 （６）ＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスが細胞変性効果を示し、非形質転換性であるヒ ト向丁リンパ性レトロウイルスの変種を含むことを特徴とする請求の範囲第（１ ）項記載の方法。 （７）標的Ｔ細胞が新生物性異数性Ｔ細胞であることを特徴とする請求の範囲第 （１）項から第（６）項までの中のひとつに記載の方法。 （８）標的Ｔ細胞かリンパ様白血病から出たＴ細胞株であることを特徴とする請 求の範囲第（７）項記載の方法。 （９）Ｔ細胞がＯＫＴ３＋（６２％），ＯＫＴ４＋（３９％）およびＯＫＴ８− の成熟Ｔ細胞表現型を持つことを特徴とする請求の範囲第（８）項記載の方法。 （１０）標的Ｔ細胞がＭｏｌｔ３，ＣＥＭ，ＴｉＺ４およびＨＵＴ７８・細胞か ら選ばれることを特徴とする請求の範囲第（２）項記載の方法。 （１１）細胞株がＨＴＬＶ−ＩＩＩを連続的に大量産生することができることを 特徴とする請求の範囲第（８）項記載の方法。 （１２）標的Ｔ細胞が共培養によってＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスに感染されるこ とを特徴とする請求の範囲第（１）項から第（６）項，第（９）項および第（１ ０）項の中のひとつに記載の方法。 （１３）標的Ｔ細胞が共培養によってＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスに感染されるこ とを特徴とする請求の範囲第（７）項記載の方法。 （１４）標的Ｔ細胞が共培養によってＨＴＬＶ−ＩＩＩウィルスに感染されるこ とを特徴とする請求の範囲第（８）項記載の方法。 （１５）標的Ｔ細胞が無細胞感染によってＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスに感染され ることを特徴とする請求の範囲第（１）項から第（６）項，第（９）項および第 （１０）項のひとつに記載の方法。 （１６）標的Ｔ細胞が無細胞感染によってＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスに感染され ることを特徴とする請求の範囲第（７）項記載の方法。 （１７）標的Ｔ細胞が無細胞感染によってＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスに感染され ることを特徴とする請求の範囲第（８）項記載の方法。 （１８）標的Ｔ細胞が無細胞感染によってＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスに感染され ることを特徴とする請求の範囲第（１１）項記載の方法。 （１９）細胞株がＨＴＬＶ−ＩＩＩウイルスによって感染したＴ細胞を含むこと を特徴とする不死の生育能を持つ細胞株。 （２０）Ｔ細胞様がＨ９／ＨＴＬＶ−ＩＩＩＢ（ＡＴＣＣＡｃｃｃｅｓｓｉｏｎ 　Ｎｏ．ＣＲＬ８５４３）であることを特徴とする請求の範囲第（１９）項記載 のＴ細胞株。 （２１）Ｔ細胞がＯＫＴ４＋許容性細胞であることを特徴とする請求の範囲第（ １９）項記載のＴ細胞株。 （２２）ＯＫＴ４＋許容性細胞がＭｏｌｔ３，ＣＥＭ，Ｔｉｚ４およびＨＵＴ７ ８細胞の中の少くともひとつを含むことを特徴とする請求の範囲第（２１）項記 載のＴ細胞株。