DE19505795C1 - Proteine enthaltende Komponente aus Thujapflanzen sowie diese enthaltende Arzneimittel - Google Patents
Proteine enthaltende Komponente aus Thujapflanzen sowie diese enthaltende ArzneimittelInfo
- Publication number
- DE19505795C1 DE19505795C1 DE1995105795 DE19505795A DE19505795C1 DE 19505795 C1 DE19505795 C1 DE 19505795C1 DE 1995105795 DE1995105795 DE 1995105795 DE 19505795 A DE19505795 A DE 19505795A DE 19505795 C1 DE19505795 C1 DE 19505795C1
- Authority
- DE
- Germany
- Prior art keywords
- proteins
- precipitate
- ammonium sulfate
- thuja
- solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Botany (AREA)
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
Description
Die Erfindung betrifft Proteine enthaltende Komponenten aus
Thujapflanzen, insbesondere aus Thuja occidentale L., welche
immun-modulierende Wirkungen insbesondere auf das spezifische
Immunsystem von Säugetieren und Menschen besitzt. Als Immunmodu
lation wird die gezielte Stimulation immunkompetenter Zellen und
immunologischer Funktionen bezeichnet.
Derzeit sind etwa 200 verschiedene Präparate zur Immunstimulie
rung bei Abwehrschwäche bekannt, von denen etwa 60% aus
Pflanzenextrakten hergestellt werden.
Im Gegensatz zu Impfstoffen und Immunglobulinen stimulieren diese
Präparate den unspezifischen Anteil des Abwehrsystems, eine
spezifische Therapie ist bisher von keinem dieser Pflanzen
präparate bekannt.
Wissenschaftliche Untersuchungen über den Wirkungsmechanismus von
Pflanzenextrakten auf das Abwehrsystem liegen bisher kaum vor.
Nur bei wenigen Phytopräparaten ist etwas über ihre Wirkungs
mechanismen bekannt und nur in Einzelfällen konnten immunologisch
wirksame Komplexe isoliert werden.
Wagner et al. isolierten beispielsweise aus Echinacea purpurea
Polysaccharide, die eine Steigerung der Phagozytoseaktivität von
Granulocyten bewirken und eine Anregung der Cytokin-Produktion
in Knochenmark-Makrophagen sowie eine Stimulierung der B- und T-
Lymphozyten hervorrufen (H. Wagner et al., Arzneim.-Forsch. 35
(II) (1985) 1069).
Aus der EP-PS 0 315 182 ist eine proteinfreie polysaccharidhalti
ge Komponente aus Thujapflanzen bekannt (Thuja Polysaccharid
Gesamtfraktion, TPSg), die einen selektiven mitogenen Effekt auf
T-Helfer-Lymphozyten besitzt und sowohl das unspezifische Abwehr
system als auch das spezifische B-Lymphozytensystem aktiviert.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Isolation weiterer
aktiver Komponenten aus Thujapflanzen, die eine immunmodulierende
Wirkung zeigen.
Überraschenderweise wurde diese Aufgabe dadurch gelöst, daß man
den durch Alkoholfällung aus einem alkalischen Extrakt aus Thuja-
Pflanzen gewonnenen Rückstand einer fraktionierten Ammoniumsul
fatfällung unterwirft.
Zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Komponenten aus Thujapflanzen
wurden zunächst die oberirdischen Pflanzenteile von Thuja-
Pflanzen, vorzugsweise von Thuja occidentale L, zerkleinert und
durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln wie beispiels
weise Petrolether, Dichlormethan und Methanol aufgeschlossen und
gereinigt. Nach dem Trocknen wurde der Rückstand mit einer
wäßrigen alkalischen Lösung, vorzugsweise mit einer 0,1 bis 1,0
N, insbesondere 0,5 N wäßrigen NaOH-Lösung, extrahiert und das
Extrakt mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise mit
einem Alkohol und besonders bevorzugt mit Ethanol versetzt.
Sowohl die Extraktion als auch die Alkoholfällung erfolgt
vorzugsweise bei 1 bis 10°C, besonders bevorzugt bei 2 bis 6°C.
Nach der Alkoholzugabe wurde der sich bildende Niederschlag
beispielsweise durch Ultrazentrifugation abgetrennt, in Wasser
gelöst und die Lösung zur Fällung eines Großteils der Proteine
mit Säure, vorzugsweise mit Trichloressigsäure versetzt. Der sich
bildende Niederschlag wurde abgetrennt und verworfen, der klare
Überstand wurde erneut mit Alkohol, vorzugsweise Ethanol,
versetzt. Der sich bildende Niederschlag wurde abgetrennt, zur
Reinigung in 2%-iger Natriumacetatlösung gelöst, durch Zugabe
von Alkohol, vorzugsweise Ethanol gefällt, in destilliertem
Wasser aufgenommen und gegen Wasser dialysiert. Zur Dialyse wird
vorzugsweise ein Dialyseschlauch mit einer Ausschlußgrenze von
10 000 Da, besonders bevorzugt von 12 000 Da verwendet.
Nach der Dialyse wurde die Lösung lyophilisiert und der Rückstand
einer Ammoniumsulfatfällung unterworfen. Hierzu wurde das
Dialyseprodukt in Wasser gelöst und mit Ammoniumsulfat, vorzugs
weise in Form einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung, versetzt,
so daß die Endkonzentration des Ammoniumsulfats in der Gesamt
lösung vorzugsweise 10 bis 70 Gew.-% betrug.
Als besonders vorteilhaft erwies sich die fraktionierte Ammonium
sulfatfällung des Rückstands. Hierzu wurde die Lösung des
Rückstands schrittweise mit Ammoniumsulfat versetzt und dabei
vorzugsweise Ammoniumsulfatkonzentrationen von 10 bis 80 Gew.-%
in Abstufungen von 10% eingestellt.
Nach jeder Ammoniumsulfatzugabe wurde der gebildete Niederschlag
abgetrennt und sofort bei -20°C eingefroren. Nach dem letzten
Fällungsschritt wurden die Fällungsfraktionen getrennt in destil
liertem Wasser gelöst und durch Dialyse vom Ammoniumsulfat
befreit, um so die einer bestimmten Fraktion entsprechende Kom
ponente zu gewinnen. Ebenso wurde ein Teil des Überstandes nach
dem letzten Fällungsschritt (80Ü) dialysiert. Die gereinigten
Fällungsprodukte wurden getrocknet, vorzugsweise gefrierge
trocknet, und bei -20°C aufbewahrt.
Zur Ermittlung der mitogenen Aktivität der einzelnen Fraktionen
wurde die DNA-Syntheserate von humanen peripheren mononuklearen
Blutleukozyten (PBL) nach Aktivierung mit den Ammoniumsulfatfäl
lungsprodukten anhand des Einbaus von ³H-markiertem Thymidin
bestimmt. Insbesondere die 10%-Fraktion führte zu einer starken
Steigerung der Syntheserate. Bei einer Konzentration von 2 mg/ml
wurde eine 230-fache Steigerung gegenüber dem Leerwert gemessen.
Selbst eine Konzentration von 0,5 mg/ml des Rückstands der 10%-
Fraktion bewirkte noch eine 150-fachen Zunahme der Proliferation.
Für die bei 20, 30 und 70% Ammoniumsulfat erhaltenen Fraktionen
wurde bei Konzentrationen von 2 mg/ml in allen drei Fällen eine
etwa 15-fache Steigerung der Syntheserate registriert (Ab
bildung 3). Die aus dem 80%-Überstand gewonnene Fraktion zeigte
in diesem Test keinerlei biologische Aktivität.
Durch Verdünnungsreihen wurde festgestellt, daß der wachstum
stimulierende Effekt in nahezu linearer Weise mit der Konzen
tration abfällt. Eine Ausnahme bildet die 10%-Fraktion beim
Übergang von einer Konzentration von 2 mg/ml auf 1 mg/ml. Dies
ist vermutlich darauf zurückzuführen, daß in diesem Bereich eine
Sättigung des verwendeten Systems vorlag und die maximal mögliche
Aktivitätssteigerung erreicht wurde.
Zur Untersuchung des Einflusses der Fällungsprodukte auf die
Cytokininduktion wurden PBL in Gegenwart der Ammoniumsulfatfäll
produkte kultiviert. Nach 4-tägiger Inkubation unter den üblichen
Bedingungen wurden die Zellen abzentrifugiert und die Probenüber
stände mittels eines Enzym Linked Immuno Sorbent-Assays (ELISA)
auf das Vorhandensein von Interleukin-6 (IL-6) und TNF-α
untersucht.
Die in Abbildung 4 graphisch dargestellten Ergebnisse zeigen, daß
die Zugabe von 2 mg/ml der 10% Fraktion zu einer 10-fachen
Erhöhung des IL-6-Spiegels gegenüber der Kontrolle bewirkt. Das
20%-Fällungsprodukt führt bei gleicher Konzentration zu einer
etwa 6-fachen Steigerung der IL-6-Konzentration. Darüber hinaus
wurden geringe Steigerungen der IL-6-Produktion für die 30% und
70% Fraktion beobachtet. Die Verteilung der Aktivitäten
entsprach weitgehend der des Mitogenitätstests.
Für TNF-α wurde nach Zugabe der 10% Fraktion eine vierfache und
nach Zugabe der 20% Fraktion eine 5-fache Steigerung der
Konzentration des Cytokins beobachtet. Interessant ist, daß in
diesem Fall die Interleukinexpression durch die 20% Fraktion
stärker stimuliert wurde als durch die 10% Fraktion.
Die erfindungsgemäßen Produkte zeigen darüber hinaus eine
Stimulation der Interleukine 1 bis 4, CFU, GMCFU, GM-CSF, CFU-S-
8, GCSF, GMCSF, α-IFN und CFU-S-11 sowie von Interferonen und
anderen Tumornekrosisfaktoren (TNF). Auch eine Aktivierung der
makrophagenabhängigen Proliferation und der spezifischen Antwort
der B-Lymphozyten wurde nachgewiesen.
Zur näheren Charakterisierung der Ammoniumsulfatfällungsprodukte
wurden diese hinsichtlich ihrer Protein- und Zuckergehalte hin
analysiert. Etwa 60% der Gesamtproteinmasse der Fällungsprodukte
waren in der 10% Fraktion enthalten (Abbildung 5), während sich
in der 20%- und 70% Fraktion etwa 15 bzw. etwa 7% der Gesamt
proteinmasse wiederfanden. Im Überstand nach Fällung mit 80%
Ammoniumsulfat konnte mit dieser Methode kein Protein nach
gewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Aktivität der
Fällungsprodukte eng mit dem Proteingehalten korreliert ist.
Während ein hoher Proteingehalt eine hohe biologische Aktivität
bedingt, sind Proben ohne Protein in den verwendeten Testsystemen
praktisch wirkungslos.
Im Gegensatz zum Protein wurden über 90% der Gesamtkohlenhy
dratmasse im Überstand nach Fällung mit 80% Ammoniumsulfat nach
gewiesen, während die 10% Fraktion lediglich etwa 4% der
Gesamtmasse der Polysaccharide enthielt (Abbildung 6). Die
übrigen 6% der Gesamtkohlenhydratmasse verteilten sich gleichmä
ßig auf die restlichen Fraktionen. Eine eindeutige Korrelation
der biologischen Aktivität mit dem Kohlenhydratgehalt ist nicht
möglich. Die Möglichkeit, daß Polysaccharide die oben geschilder
te biologische Aktivitäten vermitteln, kann daher ausgeschlossen
werden.
Auffallend ist jedoch, daß die 10%-Fraktion im Vergleich zu den
übrigen Fällungsfraktionen einen relativ hohen Polysaccharidge
halt aufweist. Im Zusammenhang mit dem Proteingehalt deutet
dieser Sachverhalt darauf hin, daß es sich bei den in dieser
Fraktion nachgewiesenen Polysacchariden mit großer Wahrschein
lichkeit um den Zuckeranteil von Glycoproteinen handelt, so daß
es sich bei den erfindungsgemäßen Fällungsfraktionen höchstwahr
scheinlich zumindest teilweise um Glykoproteine handelt. Der
Begriff "Protein" wird im Rahmen dieser Erfindung sowohl zur
Bezeichnung von Proteinen als auch von Glykoproteine sowie
Mischungen aus Proteinen und Glykoproteinen verwendet.
In weiteren Untersuchungen wurden die Fällungsfraktionen mit
Proteinase K und mit Aceton behandelt. Durch Proteinase K werden
Proteine vollständig abgebaut und damit zerstört, die Behandlung
mit Aceton bewirkt eine Zerstörung der Sekundärstruktur von
Proteinen. Nach der Behandlung mit Proteinase K bzw. Aceton wurde
erneut die mitogene Aktivität der Fällungsfraktionen im PBL-Test
bestimmt (Abbildung 7).
Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, daß die Aktivierung
der DNA-Syntheserate sowohl durch die Proteinase K Behandlung als
auch durch die Behandlung mit Aceton aufgehoben werden. Während
jedoch die Behandlung mit Proteinase K zu einem vollständigen
Aktivitätsverlust führt, ist bei der 10%-Fraktion nach Denaturie
rung mit Aceton noch eine geringe Restaktivität zu beobachten.
Die unvollständige Desaktivierung der biologischen Aktivität nach
der Acetonbehandlung ist vermutlich auf eine unvollständige Zer
störung der Sekundärstruktur der Proteine zurückzuführen. Diese
Beobachtung ist ein weiteres Indiz für die Richtigkeit der
Vermutung, daß die biologische Aktivität der Fällungsprodukte auf
deren Protein-Gehalt zurückzuführen ist. Die Möglichkeit, daß die
beobachteten Aktivitätsverluste durch Reagenzien hervorgerufen
wurden, die zur Proteinase-K- oder Aceton-Behandlung eingesetzt
wurden, wurde durch umfangreiche Kontrollmessungen ausgeschlossen
(Abbildung 8).
Durch eine Alkalische Phosphatase Anti-Alkalische Phosphatase
(APAAP) Färbung wurde anschließend die genaue Zellsubpopulation
der durch die Ammoniumsulfatfällungprodukte aktivierten PBL
bestimmt. In diesem Test wurden für CD4-Epitope spezifische
Antikörper eingesetzt, welche für T-Helferzellen charakteristisch
sind. Es wurde eine spezifische Aktivierung von T-Helferzellen
durch die Ammoniumsulfatfällungsprodukte nachgewiesen (Abbildung
10). Hieraus kann geschlossen werden, daß der Wirkungsmechanismus
der erfindungsgemäßen Komponenten aus Thuja-Pflanzen über die
CD-4-Bindung eines Glykoproteins an T-Helferzellen ausgelöst
wird.
Zur Charakterisierung des Proteinanteils der Ammoniumsulfatfäl
lungsaktionen wurden diese einer denaturierenden Polyacryl
amidgelelektrophorese (PAGE) mit diskontinuierlichem Puffersystem
unterworfen (Abbildung 11). Hierbei wurden im Proteinanteil der
10%-Fraktion mehr als 15 verschiedene Proteine im Bereich von
6,5 bis 92,5 kDa nachgewiesen. Eine ähnlich hohe Zahl unter
schiedlicher Einzelproteine wurde bei der gelelektrophoretischen
Auftrennung der 20% Fraktion gefunden. Auffällig ist, daß sich
die Proteine der beiden Fraktionen durch eine große Heterogenität
ihrer Molekulargewichte auszeichnen.
Da sich besonders die bei 10, 20 sowie 70% Ammoniumsulfat
gewonnenen Fällungsprodukte durch eine hohe biologische Aktivität
auszeichneten, wurden diese Proben mittels isoelektrischer
Fokussierung näher untersucht. Auf diese Weise ließen sich in der
10%-Fraktion mindestens 100 verschiedene Proteine in wahrschein
lich unterschiedlichen Konzentrationen nachweisen (Abbildung 12).
Auch in der 20% Fraktion konnte eine große Anzahl unterschiedli
cher Proteine identifiziert werden (Abbildung 13), wobei die in
den beiden Fraktionen gefundenen Proteine nur zu einem geringen
Anteil in ihren Molekulargewichten und ihren isoelektrischen
Punkten übereinstimmen.
Die Untersuchung der 70% Fraktion ergab eine wesentlich
geringere Anzahl von Einzelproteinen (Abbildung 14). Das
Verteilungsmuster hatte mit dem der 10 bzw. 20% Fraktion wenig
Ähnlichkeit und enthielt Proteine die weder in der 10% noch in
der 20% Fraktion vorhanden waren. Bei einzelnen Banden zeigten
sich jedoch Gemeinsamkeiten, was diese Banden für eine weitere
Analyse der biologisch wirksamen Proteine besonders interessant
macht.
Die erfindungsgemäßen Komponenten aus Thuja-Pflanzen, vorzugs
weise aus Thuja der Art Thuja occidental L. eignen sich besonders
zur Verwendung als Wirkstoffe in Arzneimitteln, vorzugsweise in
Kombination mit den üblichen Hilfs- und Trägerstoffen, soweit
letztere für die jeweilige Applikationsform geeignet und pharma
zeutisch unbedenklich ist. Vorzugsweise werden die erfindungs
gemäßen Komponenten in physiologischer Kochsalzlösung parenteral
verabreicht. Bevorzugte Komponenten sind die bei Ammoniumsul
fatkonzentrationen von 10, 20 bzw. 70 Gew.-% ausgefällten
Fraktionen.
Die Arzneimittel eignen sich ihrerseits besonders zur Verwendung
bei der Behandlung von Immun- oder Knochenmarksdepressionen, ins
besondere bei der Behandlung von endogenen oder erworbenen viren-
oder strahleninduzierten Immundefekterkrankungen wie beispiels
weise Granulozytopenien, strahlenbedingten Leukopenien sowie
strahlen- und zytostatika-bedingten Zytopenien beispielsweise
nach einer chemo-strahlentherapeutischen Krebstherapie. Darüber
hinaus eignen sie sich zur Behandlung von erhöhter Infektan
fälligkeit im Kindesalter oder beispielsweise nach oder während
einer Antibiotikatherapie oder Antipyrethikabehandlung sowie bei
erhöhter körperlicher Belastung. Ein weiteres Anwendungsgebiet
liegt in der Behandlung von Infektionen, die durch Retroviren,
insbesondere durch HIV hervorgerufen werden.
Zusätzlich erlaubt die erfindungsgemäße Komponente aus Thuja-
Pflanzen die gezielte Herstellung von Antikörpern, vorzugsweise
von monoklonalen Antikörpern, gegen diese Komponente. Mit Hilfe
dieser Antikörper können die zur Immunstimulierung benutzten
Heilpflanzen auf Wirksubstanzen überprüft werden, und es ist eine
Standardisierung der in der Therapie verwendeten Pflanzenextrakte
anhand ihrer Wirksubstanzen möglich. Darüberhinaus erlauben
solche Antikörper die Konzeption neuer Aufarbeitungsmethoden aus
Thuja, die besonders die wirksamkeitbestimmenden Substanzen
anreichern können. Sie ermöglichen zudem die effiziente Suche nach
ähnlich wirkenden Substanzen in verwandten Pflanzengattungen.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert.
Die getrocknete und zerkleinerte Droge (Thuja occidentale L.)
wurde nacheinander erschöpfenden Soxhlet-Extraktionen mit
Petrolether, Dichlormethan und Methanol unterworfen, um Fette,
Wachse, Polyphenole und Chlorophylle zu entfernen, welche die
weiteren Aufarbeitungsschritte stören könnten. Zwischen den
einzelnen Extraktionsschritten wurden die Pflanzenteile getrock
net. Anschließend wurde die vorextrahierte Probe an der Luft
getrocknet.
Alle Arbeiten wurden, wenn nicht anders vermerkt, bei 4°C
durchgeführt. 200 g der vorextrahierten, getrockneten Droge
wurden mit 2,5 l einer 0,5 N Natronlauge versetzt und 48 Stunden
gerührt. Anschließend wurde der Rückstand abzentrifugiert, mit
1,0 l 0,5 N NaOH-Lösung nachgewaschen und die vereinten Filtrate
langsam unter ständigem Rühren mit dem dreifachen Volumen an
96%-igem unvergälltem Ethanol versetzt. Der nach 24 Stunden
gebildete Niederschlag wurde abzentrifugiert, in 1,0 l destil
liertem Wasser aufgenommen und in einem Eisbad langsam mit 1,0 l
einer 15%-igen Trichloressigsäure-Lösung (TCA) versetzt. Nach
12 Stunden wird der gallertartige Rückstand abzentrifugiert und
der verbleibende Überstand (ca. 2 l) mit dem dreifachen Volumen
Ethanol versetzt. Nach 24 Stunden wurde der entstandene Nieder
schlag abzentrifugiert, in 0,5 l einer 2%-igen Natriumacetatlö
sung aufgenommen und unlösliche Bestandteile abfiltriert. Das
Filtrat wurde erneut mit 2,0 l 96%-igem unvergällten Ethanol
versetzt und für 4 Tage gerührt. Anschließend wurde der Rohpoly
saccharidrückstand abzentrifugiert, in 100 ml destilliertem
Wasser gelöst und in 10 Einzelschritten gegen je 10 l destillier
tes Wasser für jeweils 2 Stunden dialysiert (Visking Dialysis
Tubing 20/30, Durchmesser 16 mm, Serva, Heidelberg). Anschließend
wird die Lösung lyophylisiert, Ausbeute 4 g des Rohpolysac
charids.
Die Verfahrensschritte zur Gewinnung des Rohpolysaccharids sind
in Abbildung 1 zusammengefaßt.
2,0 g des Rohpolysaccharids aus Beispiel 1 wurden in 300 ml
destilliertem Wasser gelöst und gemäß Tabelle 1 stufenweise unter
leichtem Rühren mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung versetzt.
Die Ammoniumsulfatlösung wurde langsam zugetropft. Nach jeder
Ammoniumsulfatzugabe wurde die Mischung zur vollständigen Fällung
für 30 Minuten weitergerührt und anschließend der Niederschlag
durch Zentrifugation in 250 ml verschließbaren Plastikbechern bei
12 000 g abgetrennt.
Der Überstand wurde zügig in ein neues Gefäß dekantiert und gemäß
Tabelle 1 mit weiterer Ammoniumsulfatlösung versetzt. Der
Rückstand in 25 ml Plastikröhrchen transferiert und sofort bei
-20°C bis zur weiteren Verwendung eingefroren. Durch Zugabe
steigender Konzentrationen einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung
wurde ein sukzessives Ausfällen von Proteinen entsprechend der
Anzahl ihrer hydrophilen Aminosäuren erreicht. Das Vorgehen bei
der Ammoniumsulfatfällung ist in Abbildung 2 schematisch
dargestellt.
Nach Erstellung aller Fraktionen wurden diese bei 4°C langsam
aufgetaut, in 20 ml destilliertem Wasser gelöst und anschließend
gegen 10 l destilliertes Wasser dialysiert (Visking Dialysis
Tubing 20/30, Durchmesser 16 mm, Serva, Heidelberg). Während der
Dialyse wurde das Wasser in der Vorlage solange im 2-Stunden
rhythmus gegen frisches Wasser ausgetauscht, bis die Leitfähig
keit unverändert beim Ausgangsleitwert des Wassers blieb (zur
Leitfähigkeitsmessung wurde ein Digital Osmometer der Firma
Schott, Mainz verwendet). Auf diese Weise wurde sichergestellt,
daß die Fällungsprodukte vollständig von Ammoniumsulfat befreit
wurden. Die erforderliche Dialysedauer war von der Ammoniumsul
fatkonzentration abhängig und betrug maximal etwa 8 Stunden.
Analog zu den Fällungsfraktionen wurde ein 20 ml Aliquot des
Überstandes der Fällung mit 80% Ammoniumsulfat (80Ü) dialysiert.
Nach der Dialyse wurden die Proben lyophylisiert und gewogen. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Die eingesetzte
Menge von 2 g Rohpolysaccharid wurde vollständig zurückgewonnen,
wobei die Summe der Massen der Fällungsfraktionen 71,3% der
Gesamtmasse ausmachten. 28,7% der Ausgangsmasse befanden sich
im letzten Überstand. Bei einer Ammoniumsulfatkonzentration von
60% wurde nach Fällung und Zentrifugation kein Rückstand
erhalten.
Die Fraktionen werden mit Phosphat-gepufferter-Saline (PBS, pH
7,5) auf eine Konzentration von 4 mg/ml eingestellt und bei
-20°C aufbewahrt.
Ammoniumsulfatkonzentration (Gew.-%) | |
Masse des Rückstands (mg) | |
10 | |
352,8 | |
20 | 294,4 |
30 | 200,8 |
40 | 78,4 |
50 | 81,0 |
60 | 0 |
70 | 211,2 |
80 | 208,0 |
80 Ü | 575,2 |
Gesamt | 2001,8 |
Alle folgenden Arbeiten wurden wenn nicht anders vermerkt mit
sterilen Einmalartikeln durchgeführt. Alle Lösungen wurden bei
121°C und einem Druck von 2 × 10⁵Pa für 20 Minuten im Autoklaven
sterilisiert und vor Gebrauch auf 37°C temperiert. Das zum
Ansetzen der Lösungen verwendete Wasser stammte aus einer
Millipore Wasseraufbereitungsanlage (Milli-Q-Water-System, Fa.
Millipore, Eschborn).
Die Gewinnung der PBL erfolgte aus heparinisiertem Vollblut
(Vetren 200, Promonta, 1 ml/20 ml Vollblut) durch Dichtegradien
tenzentrifugation über Ficoll-Paque (Pharmacia). Im ersten
Schritt wurde das Vollblut mit einem gleichen Volumen RPMI 1640
Medium verdünnt (77% Kulturmedium des Rosewell Park Memorial
Instituts (RPMI 1640, Fa. Gibco BRL, Eggenstein); 10% fötales
Kälberserum (FCS); 6% einer 5%-ige Humanalbuminlösung; 4%
humanes Serum; 1,0% Penicillin/Streptomycin-Lösung (jeweils
5000 mg/ml); 1% 200 mM α-Glutaminlösung; 1% nicht-essentielle
Aminosäuren (Fa. Gibco BRL, verdünnt nach Herstellerangabe); alle
Angaben (v/v); die Seren wurden vor Gebrauch für 30 Minuten bei
56°C hitzeinaktiviert).
Anschließend wurden jeweils 3 ml Ficoll-Paque in 10 ml-Röhrchen
gefüllt und so mit 7 ml verdünntem Vollblut überschichtet, daß
eine scharfe Phasengrenze entstand. Die Röhrchen wurden bei 626 g
in einer Biofuge-Zentrifuge für 30 Minuten bei Raumtemperatur
ohne Bremse mit geringer Beschleunigung zentrifugiert. Nach der
Zentrifugation wurde das als klarer Überstand vorhandene Serum
vorsichtig mit einer Pasteurpipette entfernt und der in der
nächsten Schicht befindliche "Leukozytenreiche Anteil" (Buffy
coat), welcher die PBL enthielt, in ein 10 ml-Röhrchen pipet
tiert. Die folgenden Schichten aus Ficoll-Paque, Granulozyten und
Erythrozyten wurden verworfen.
Die Zellen des Buffy coats wurden mit RPMI 1640 Medium auf 10 ml
aufgefüllt und bei 264 g für 10 Minuten zentrifugiert. Der
Überstand wurde dekantiert und das Zellpellet erneut mit Medium
gewaschen und zentrifugiert. Das so erhaltene Pellet wurde in
5 ml komplettem RPMI 1640 Medium aufgenommen.
Zur Bestimmung der Anzahl der Lebendzellen wurden 10 µl der
Zellsuspension aus dem vorhergehenden Schritt mit 10 µl einer
0,2%-igen Trypanblaulösung (Sigma, Deisenhofen) versetzt.
Hierbei nehmen tote Zellen eine dunkelblaue Färbung an, während
lebende Zellen farblos bleiben. Die Auswertung erfolgte durch
Auszählen in einer Zählkammer mit definiertem Volumen (Neubauer,
1 : 10⁴ ml). Die Menge der toten Zellen sollte 5% nicht
überschreiten. Für die Gesamtzellzahl wurden die äußeren großen
Quadrate der Kammer ausgezählt und die ermittelte Zellzahl mit
dem Faktor 10 000 multipliziert. Anschließend wurde die Zellzahl
in der Ausgangssuspension mit komplettem RPMI 1640 Medium auf 2,0
× 10⁶/ml eingestellt.
Die Fraktionen aus Beispiel 2 wurden sterilfiltriert (Sarstedt
Sterilfilter, 0,2 µm Porengröße) und von den sterilen Fraktionen
jeweils Verdünnungen von 1 : 2 bis 1 : 32 mit PBS hergestellt.
Zur Bestimmung der mitogenen Aktivität der Ammoniumsulfat-Fäl
lungsfraktionen wurde die DNA-Syntheserate von PBL in Anwesenheit
unterschiedlicher Konzentrationen der Ammoniumsulfatfällungs
fraktionen ermittelt. Als positive Kontrolle diente eine
Phythaemagglutinin-P (PHA-P) Lösung mit einer Konzentration von
10 µg/ml, als Leerwert wurde PBS verwendet. Die DNA-Syntheserate
wurde anhand des Einbaus von ³H-markiertem Thymidin bestimmt.
In 96 Loch-Flachboden-Mikrotiterplatten (Greiner, Frickenhausen)
wurden jeweils 100 µl der Zellsuspension aus Beispiel 3 mit
100 µl der verdünnten Ammoniumsulfat-Fällungsfraktionen versetzt.
Durch das Mischen wurden die Konzentrationen der Fällungsprodukte
halbiert, so daß die Endkonzentratioen 1 : 2 bis 1 : 64 des
Ausgangslösungen (2 mg/ml bis 62,5 µg/ml) betrugen. Pro Ver
dünnung wurden drei Tests durchgeführt und die Ergebnisse
gemittelt.
Die Mikrotiterplatten wurden für 4 Tage in einem Brutschrank bei
37°C in einer 5%-igen CO₂-Atmosphäre bei 100% Luftfeuchtigkeit
inkubiert. Anschließend wurde jede Kultur mit 0,5 µCi radio
aktivem Thymidin (³H-Thymidin, Amersham, TRA 120) in einem
Volumen von 5 µl RPMI 1640 versetzt und für weitere 24 Stunden
inkubiert. Mit der Kontrolle und dem Leerwert wurde analog
verfahren.
Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Zellen mit einem
Skatron Cellharvester (Flow Laboratories, Meckenheim, Deutsch
land) geerntet und in Cellulosefiltern (Skatron) aufgefangen.
Diese wurden in Szintillationsröhrchen überführt und für 60
Minuten in einem Trockenschrank bei 68°C getrocknet. Anschlie
ßend wurden die Ansätze abgekühlt, mit 5 ml Szintillations
flüssigkeit (Szinticocktail, Amersham) versetzt, für 10 Minuten
geschüttelt und in einem β-Szintillationszähler die Radio
aktivität als cpm (counts per minute) bestimmt.
Die Ergebnisse sind in Abbildung 3 graphisch dargestellt. Die
größte Aktivierung der PBL wurde für die 10% Fraktion be
obachtet. Bei einer Verdünnung von 1 : 2 wurde die DNA-Syn
theserate gegenüber dem Leerwert um das 230-fache erhöht. Selbst
für eine Verdünnung von 1 : 8 wurde noch eine 150-fache Zunahme
der Proliferation beobachtet. Die 20, 30 und 70% Fraktionen
führten bei einer Verdünnung von 1 : 2 zu einer 15-fachen
Erhöhung der DNA-Syntheserate in PBL.
Der wachstumsstimulierende Effekt nahm nahezu linear mit der
Konzentration ab. Eine Ausnahme bildet der Übergang von der 1 : 2
auf die 1 : 4 Verdünnung für die 10% Fraktion. Es ist zu
vermuten, daß in diesem Bereich eine Sättigung des Systems vorlag
oder die maximale Stimulierung der Syntheserate erreicht wurde.
Zur Untersuchung der Interleukin-6 und TNF-α Induktion durch die
erfindungsgemäßen Ammoniumsulfat-Fällungsprodukte wurden PBL in
Anwesenheit der Ammoniumsulfat-Fällungsprodukte inkubiert und
anschließend die Zellkulturüberstände mittels eines "Enzym Linked
Immuno Sorbent Assay" (ELISA) auf ihren Gehalt an Interleukin-6
und TNF-α hin untersucht. Als Negativkontrolle diente PBS, als
Positivkontrolle wurde PHA-P in einer Konzentration von 10 µm/ml
eingesetzt.
Zellsuspensionen gemäß Beispiel 3 (2,0 × 10⁶ Zellen/ml) wurden
mit den Ammoniumsulfat-Fällungsprodukten versetzt (Endkonzen
tration 2 mg/ml) und in 5 ml Kulturen nach üblichen Protokoll
inkubiert.
Nach 4 Tagen wurden die Kulturen in 15 ml-Röhrchen überführt und
die Zellen bei Raumtemperatur bei 1400 g abzentrifugiert. Die
Überstände wurden in 500 µl Aliquots bei -70°C eingefroren und
die Zellrückstände verworfen.
Zur Bestimmung von Interleukin-6 und TNF-α wurden Testkits der
Firma Medgenix, Belgien verwendet (Immunoenzymetric assay kit for
interleukin 6 bzw. human tumor necrosis factor alpha in serum,
plasma and culture media; code 40 126 00 bzw. 40 175 00). Die
Proben wurden langsam auf Eis aufgetaut und nach Hersteller
angaben untersucht.
Die Ergebnisse sind in Abbildung 5 graphisch dargestellt. Sie
zeigen, daß das Fällungsprodukt der 10% Fraktion den IL-6-
Spiegel auf den 10-fachen Wert der Negativkontrolle erhöht. Das
20% Fällungsprodukt führte zu einer 6-fachen Zunahme der IL-6
Produktion. Geringe Zunahmen an IL-6 wurden zudem durch das 30%
sowie das 70% Fällungsprodukt hervorgerufen.
Die TNF-α Produktion wurde durch das 10% Fällungsprodukt auf das
4-Fache und durch das 20% Fällungsprodukt auf das 5-Fache der
Negativkontrolle erhöht.
In diesem Versuch fiel die Differenz zwischen der Negativ- und
der Positivkontrolle ungewöhnlich niedrig aus, was vermuten läßt,
daß PHA-P in diesem Versuchsaufbau nicht aktiv war.
Die Bestimmung des Proteingehalts der Fällungsprodukte erfolgte
nach der Amido-Schwarz-Methode, da diese auch in Anwesenheit
höhere Zuckermengen zu verläßlichen Ergebnissen führt.
Um eine ausreichende Proteinmenge in den einzelnen Fraktionen zu
gewährleisten, wurden die Lösungen der Ammoniumsulfatfraktionen
aus Beispiel 2 vorgefällt. Hierzu wurden 2 ml der einzelnen
Ammoniumsulfatfraktionen mit 8 ml eiskaltem Aceton versetzt und
30 Minuten auf Eis aufbewahrt. Anschließend wurden die Proben
30 Minuten bei 1400 g und 4°C zentrifugiert, die Pellets in
einer Speed-Vac (Savant, Farmingdale, New York, USA) getrocknet
und in 258 µl destilliertem Wasser resuspendiert.
Die so gewonnenen Lösungen wurden mit 30 µl Tris-Puffer (1 M
Trizma-Base, pH 7,5; 1% Natriumdodecylsulfat (SDS)) versetzt und
5 Minuten bei 80°C inkubiert. Anschließend wurden die Ansätze
bei 4°C auf höchster Stufe in einer Eppendorf Tischzentrifuge
für Eppendorfgefäße sedimentiert und die Überstände zur Fällung
von Proteinen mit jeweils 75 µl einer 50%-igen Trichloressig
säure (TCA) versetzt. Die Mischungen wurden tropfenweise auf
Nitrocellulosefilter (Schleicher und Schüll, BA 85) aufgebracht,
der Überstand durch eine Glasfritte filtriert und die Filter mit
0,8 ml einer 6%-igen TCA gewaschen.
Anschließend wurden die Filter für 2 bis 3 Minuten in Amido-
Schwarz-Lösung (0,1% Amido-Schwarz; 45% Methanol; 10%
Essigsäure; 45% destilliertes Wasser) gefärbt, zweimal in
Entfärberlösung (90% Methanol; 2% Essigsäure; 8% destilliertes
Wasser) gewaschen, die Spots ausgeschnitten und in 1,5 ml
Elutionslösung (25 mM NaOH; 0,05 mM EDTA; 50% Ethanol) für
10 Minuten geschüttelt. Die Eluate wurden in Reagenzgläser
überführt und die optische Dichte bei 630 nm gegen Elutions
flüssigkeit gemessen. Die Auswertung der Extinktionen erfolgt
anhand einer Eichgeraden mit Rinderserumalbumin (BSA). Der
Korrelationskoeffizient der Regressionsgeraden betrug 0,97.
Sämtliche Meßwerte lagen im Bereich der Geraden.
Die Ergebnisse sind in Abbildung 6 graphisch dargestellt. 60%
der detektierbaren Proteine waren in der 10% Fraktion enthalten,
geringe Mengen an Proteinen fanden sich in der 20% und der 70%
Fraktion. Im Überstand nach der Fällung mit 80% Ammoniumsulfat
konnten mit dieser Methode keine Proteine nachgewiesen werden.
Die Bestimmung des Zuckergehalts der Ammoniumsulfatfraktionen
erfolgte nach der Anthronemethode, welche den Gesamtzuckergehalt
erfaßt.
Jeweils 2,5 ml der in PBS gelösten Ammoniumsulfat-Fällungs
produkte (Konzentration: 4 mg/ml) wurden in hitzebeständige
Röhrchen gegeben und in einem Eisbad gekühlt. Anschließend wurden
die Lösungen mit 5 ml Anthronereagens (0,2% Anthrone, 95%
H₂SO, 4,8% destilliertes Wasser) versetzt, die Ansätze gründ
lich gemischt und mit Glasmurmeln verschlossen. Die Röhrchen
wurden 10 Minuten in einem kochenden Wasserbad erhitzt und dann
schnell abgekühlt. Im Anschluß daran wurde bei 620 nm die
optischen Dichte gegen Wasser gemessen. Die Auswertung der
Meßwerte erfolgte mit Hilfe einer Eichgeraden, die mit Glukose
lösungen bekannter Konzentration erstellt wurde. Der Korrela
tionskoeffizient der Regressionsgeraden betrug 0,998. Alle
Meßwerte lagen im Bereich der Eichgeraden.
Die Ergebnisse sind in Abbildung 7 graphisch dargestellt. Sie
zeigen, daß über 90% der Kohlenhydrate im Überstand nach Fällung
mit 80% Ammoniumsulfat enthalten sind. Die durch Fällung mit
10% Ammoniumsulfat gewonnene Fraktion enthält etwa 4% der
Gesamtpolysaccharidmenge. Die übrigen 6% der Polysaccharide
verteilen sich etwa gleichmäßig auf die anderen Fraktionen.
5 ml Aliquots der Ammoniumsulfat-Fällungsprodukte (Beispiel 2,
4 mg/ml) sowie des Überstands nach Fällung mit 80% Ammoniumsul
fat wurden mit Proteinase K (PK) (Sigma, Deisenhausen; gelöst in
destilliertem Wasser) versetzt und für 24 Stunden bei 37°C
inkubiert. Die Konzentration des Enzyms betrug 0,01% (w/v).
Anschließend wurde das Enzym durch Zugabe des Enzyminhibitors
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und zweistündige Inkubation
bei Raumtemperatur inaktiviert, um negative Effekte der Proteina
se K auf die folgenden Bioassays zu vermeiden. Die Konzentration
des Inhibitors in den Proben betrug 1,0 mmol/l.
Nach der Inkubation wurde PMSF durch Dialyse gegen das 1000-fache
Volumen destillierten Wassers entfernt (Visking Dialysis Tubing
20/30, Durchmesser 16 mm, Serva, Heidelberg), die dialysierten
Proben wie in Beispiel 3 beschrieben sterilfiltriert und auf ihre
Mitogenität getestet. Die Ergebnisse sind in Abbildung 7
graphisch dargestellt. Sie zeigen, daß die mitogene Aktivität der
Ammoniumsulfat-Fällungsprodukte durch die Behandlung mit
Proteinase K vollständig aufgehoben wird.
Als Kontrolle wurden analoge Versuche mit folgenden Lösungen
durchgeführt:
K1: RPMI 1640 Medium
K2: PHA-P (10 µg/ml)
K3: PHA-P (10 µg/ml) + PK, dialysiert (0,01%)
K4: PK, dialysiert (0,01%)
K5: PMSF, dialysiert (1,0 mmol/l)
K6: PHA-P (10 µg/ml) + PK (0,01%) + PMSF, dialysiert (1,0 mmol/l)
K7: PK (0,01%) + PMSF, dialysiert (1,0 mM/l).
K2: PHA-P (10 µg/ml)
K3: PHA-P (10 µg/ml) + PK, dialysiert (0,01%)
K4: PK, dialysiert (0,01%)
K5: PMSF, dialysiert (1,0 mmol/l)
K6: PHA-P (10 µg/ml) + PK (0,01%) + PMSF, dialysiert (1,0 mmol/l)
K7: PK (0,01%) + PMSF, dialysiert (1,0 mM/l).
In Abbildung 8 sind die Ergebnisse der Kontrollexperimente
graphisch darstellt.
RPMI 1640 Medium (K1) diente als Negativkontrolle. Hier ist keine
Stimulierung der PBL zu erkennen.
Die Stimulierung der Zellen durch die Positivkontrolle PHA-P (K2)
zeigt eine hohe ³H-Thymidineinbaurate.
Die Kontrolle bestehend aus mit Proteinase-K behandeltem und
anschließend dialysiertem PHA-P (K3) zeigte, daß nahezu keine
Stimulation der Zellen durch das mit Proteinase behandelte PHA-P
erfolgt.
Die Inkubation mit dialysierter Proteinase-K (K4) allein zeigt,
daß diese Substanz selbst keine stimulierenden Eigenschaften auf
das Wachstum von PBL entfaltet und auch nicht toxisch auf die
Zellen wirkt.
Gleiches gilt für PMSF (K5) sowie die Kombination aus Proteinase-
K und PMSF (K7), die ebenfalls beide vorher dialysiert wurden.
Kontrolle K6 zeigt, daß die Stimulation von Zellen mit PHA-P in
Gegenwart von Proteinase-K, die zuvor mit PMSF inaktiviert und
anschließend dialysiert wurde, möglich ist. Damit kann ausge
schlossen werden, daß es sich bei den beobachteten inhibitori
schen Effekte um Artefakte handelt, die auf die Inkubation der
Proteinase-K mit den Zellen zurückzuführen sind. Die leichte
Verminderung der Aktivität von K6 im Vergleich zu K2 ist
wahrscheinlich auf die Dialyse zurückzuführen. Da PHA-P als
Lektin eine große Affinität zu Zuckern zeigt, kann eine Reaktion
mit den Dialyseschläuchen und damit eine Verminderung der
wirksamen Konzentration nicht ausgeschlossen werden.
Jeweils 2 ml der Lösungen der Ammoniumsulfat-Fällungsprodukte aus
Beispiel 2 wurden mit 8 ml eiskaltem Aceton versetzt und
30 Minuten auf Eis aufbewahrt. Anschließend wurden die Mischungen
für 30 Minuten bei 1400 g (Biofuge, Heraeus Christ) und 4° C
zentrifugiert, das Pellet in der Speed-Vac getrocknet, in 2 ml
destilliertem Wasser resuspendiert und gemäß Beispiel 3 die
Mitoseaktivität bestimmt. Als Kontrolle dienten RPMI 1640 Medium
und 80%-iges Aceton.
Die Ergebnisse sind in Abbildung 7 graphisch dargestellt. Die
Behandlung mit Aceton führt mit Ausnahme der 10% Fraktion in
allen Fällen zu einem völligem Verlust der Mitoseaktivität. Bei
der 10% Fraktion ist eine, im Vergleich zur Kontrolle ver
nachlässigbar kleine, Restaktivität zu bemerken.
Zur Klassifizierung der in Beispiel 3 aktivierten Zellsub
populationen wurden Cytospinpräparate hergestellt und einer
Färbung nach Pappenheim sowie einer Färbung mit spezifischen
Antikörpern gegen T-Zellepitope unterworfen.
Zur Herstellung von Cytospinpräparaten wurden gemäß Beispiel 3
PBL-Zellsuspensionen mit einer Zellzahl von 2,0 × 10⁶ Zellen/ml
hergestellt.
In 96 Loch-Flachboden-Mikrotiterplatten (Greiner, Frickenhausen)
wurden jeweils 100 µl der Zellsuspension aus Beispiel 3 mit
100 µl der verdünnten Ammoniumsulfat-Fällungsfraktionen aus
Beispiel 2 (Konzentration: 4 mg/ml) versetzt und analog Bei
spiel 3 jedoch ohne Zusatz von ³H-Thymidin inkubiert. Als
positive Kontrolle fungierte PHA-P in einer Konzentration von
10 µg/ml, als Negativkontrolle wurde RPMI 1640 Medium verwendet.
Nach 4-tägiger Inkubation wurden die einzelnen Präparationen in
mit Filtermatten versehene Cytospin-Zentrifugationseinheiten
pipettiert und in einer Zytozentrifuge (Wilke und Witzel,
Hamburg) bei 100 g und Raumtemperatur für 10 Minuten auf
Objektträgern (OT) zentrifugiert. Die Objektträger wurden
48 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet, in Aluminiumfolie
gewickelt und bei -20°C bis zur Verwendung eingefroren.
Um sicherzustellen, daß die Cytospinpräparate intakt waren und
eine positive Clusterbildung auftrat, wurden die Objekträger nach
der Pappenheimmethode gefärbt.
Die Pappenheim-Färbung erlaubt einen optischen Nachweis der
Zellproliferation und erfolgte nach Standard-Bedingungen mit
luftgetrockneten Präparaten gemäß Herstellerangaben (Merck, Darm
stadt). Hierzu werden die Objektträger zuerst 5 Minuten in May-
Grünwald-Lösung (Merck, Darmstadt) gefärbt, kurz in Wasser
gespült und dann in einer im Verhältnis 1 : 10 mit Weis′scher
Pufferlösung (490 mg Kaliumdihydrogenphosphat, 1140 mg Natriumdi
hydrogenphosphat, dest. Wasser ad 1000 ml) verdünnten Giemsa-
Lösung (Merck, Darmstadt) für 10 Minuten gegengefärbt. Anschlie
ßend wurden die Objektträger gründlich mit Leitungswasser
gespült, an der Luft getrocknet und mikroskopiert.
Lag eine positive Stimulierung vor, so zeigten die aktivierten
Zellen nach der Färbung eine spezifische Clusterbildung. Bei
nicht-aktivierten Zellen blieb die Clusterbildung aus.
Als positives Anzeichen für die Bildung von Clustern wurde eine
lichtmikroskopisch sichtbare Auflockerung der Kernstruktur, eine
Zusammenlagerung der Zellen, eine Vergrößerung der Kern-Plasma-
Relation als Ausdruck einer erhöhten Mitoserate, sowie eine
Zunahme der Vakuolisierung gewertet. Die Abbildung 9 zeigt
beispielhaft aktivierte Zellen mit der typischen Bildung von
Clustern, sowie Zellen, bei denen dieser Effekt ausblieb.
Die Ergebnisse der Pappenheim-Färbung sind in Tabelle 3 zusammen
gefaßt. Es wird deutlich, daß eine Aktivierung der Clusterbildung
von PBL insbesondere durch die bei Ammoniumsulfatkonzentrationen
von 10 und 20% erhaltenen Fällungsprodukte zu beobachten ist.
Die übrigen Fraktionen, insbesondere auch die aus dem Überstand
gewonnene Fraktion zeigten keine Clusterbildung.
Als Positivkontrolle dienten PHA-P (T-Zellmitogen) und Lipopoly
saccharid aus Zellwänden von E. coli (LPS, B-Zellmitogen). Beide
Kontrollen zeigten die erwartete Clusterbildung.
Ammoniumsulfatkonzentration (Gew.-%) | |
Pappenheim-Färbung | |
10% | |
Clusterbildung | |
20% | Clusterbildung |
30% | keine Clusterbildung |
40% | keine Clusterbildung |
50% | keine Clusterbildung |
70% | keine Clusterbildung |
80% | keine Clusterbildung |
80% Ü | keine Clusterbildung |
RPMI 1640 Medium | keine Clusterbildung |
PHA-P | Clusterbildung |
LPS | Clusterbildung |
Mit Hilfe der APAAP-Färbung lassen sich die Zellen des Immunsy
stems anhand ihrer Oberflächenstrukturen mit monoklonalen
Antikörpern markieren und optisch darstellen. Diese Methode
erlaubt den zuverlässigen Nachweis von T-Helferzellen, die sich
nach APAAP-Behandlung durch eine rötliche Anfärbung der Membran
auszeichnen. "Nicht-T-Helfer-Zellen" besitzen keine CD4-Epitope
und binden daher den CD4-spezifischen Primärantikörper der
Färbung nicht. Somit erscheinen ihre Membranen nach der APAAP-
Behandlung ungefärbt.
In diesen Untersuchungen wurden spezifische Maus-Anti-Mensch
monoklonale Antikörper mit den Zellen der Cytospinpräparate
inkubiert. Mittels eines Brückenantikörpers wurden Antikörper-
Enzymkomplexe (APAAP) an die epitopenerkennenden Primärantikörper
gebunden und anschließend im alkalischen Milieu (pH 8,2) die zur
Farbreaktion führenden Azokopplung zwischen Naphthol-AS-MX-
Phosphat und dem Diazoniumsalz Fast Red durchgeführt (Antikörper
wurden von der Firma Dako und die Detektionsreagenzien von der
Firma Sigma bezogen).
Für diese Färbung ist es besonders wichtig, die angegebenen
Antikörper-Färbezeiten nicht zu unterschreiten. Die Inkubation
in der Fixierlösung und in der Substratlösung darf auf keinen
Fall überschritten werden.
Für die Färbung wurden die Cytospinpräparate bei Raumtemperatur
langsam in der Alufolie über einen Zeitraum von etwa 60 Minuten
aufgetaut und nach folgendem Protokoll behandelt:
1. Fixierung|1 min | |
2. Waschen in TBS | 1 min |
3. Inkubation mit Primärantikörper | 30 min |
4. Waschen in TBS | 1 min |
5. Inkubation mit Brückenantikörper | 30 min |
6. Waschen in TBS | 1 min |
7. Inkubation mit APAAP-Komplex | 30 min |
8. Waschen in TBS | 1 min |
9. Inkubation mit Brückenantikörper | 10 min |
10. Waschen in TBS | 1 min |
11. Inkubation mit APAAP-Komplex | 10 min |
12. Waschen in TBS | 1 min |
13. Substratinkubation | 20 min |
14. Waschen in TBS | 1 min |
15. Hämatoxylinfärbung | 2 min |
16. Spülen in Leitungswasser | 2 min |
17. Waschen in TBS | 2 min |
18. Spülen in Leitungswasser | 2 min |
19. Einbetten in Apathy′s mounting medium (WAK-Chemie, Bad Homburg) | 2 min |
Als Fixierlösung für APAAP wurde eine Mischung aus 95 ml abs.
Aceton, 95 ml abs. Ethanol und 10 ml 37%igem Formalin verwendet.
Zur Herstellung der Hämatoxylinlösung wurden 5 g Hämatoxylin in
50 ml absolutem Ethanol gelöst. Gleichzeitig wurden 100 g
Ammoniumaluminiumsulfat-12-Hydrat in 1000 ml destilliertem Wasser
in der Hitze gelöst. Beide Lösungen wurden vereinigt und unter
dem Abzug zum Sieden erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die
Mischung mit 2,5 g gelbem Quecksilberoxid versetzt, unlösliche
Bestandteile abfiltriert und 100 ml Eisessig zugefügt. Vor
Gebrauch wurde die Färbelösung durch Filtration von Schwebstoffen
befreit.
Die Primärantikörper wurden in einer Verdünnung an 1 : 10 mit TBS
pH 7,6 eingesetzt. Pro Objektträger wurden 100 µl der verdünnten
Lösung verwendet.
Die Brückenantikörper wurden in einer Verdünnung von 1 : 40 mit
TBS, pH 7,6 eingesetzt. Das TBS wurde im Verhältnis von 1 : 4 mit
humanem Serum vorverdünnt, um Kreuzreaktionen auszuschließen. Von
dem gesamten Ansatz wurden 100 µl pro Objektträger eingesetzt.
Der APAAP-Komplex wurde in einer Verdünnung von 1 : 80 mit TBS
pH 7,6 eingesetzt, pro Objektträger wurden 100 µl verwendet.
Nach dem Einbetten wurden die Präparate für mindestens 24 Stunden
in horizontaler Lage getrocknet, bevor sie mit einer Ölemulsions
linse im Mikroskop betrachtet werden konnten. Die vollständige
Durchtrocknung der Präparate dauerte 14 Tage. Die Ergebnisse
dieses Tests sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.
Eine Aktivierung der T-Helferzellen wurde für die 10% und 20%
Fraktion der Ammoniumsulfatfällung in Form einer rötlichen
Anfärbung der Membran beobachtet. Abbildung 10 zeigt beispielhaft
ein Anfärbung von T-Helfer-Zellen durch die APAAP-Reaktion nach
Stimulation mit dem 10% Fällungsprodukt im Vergleich zu nicht
aktivierten PBL, die mit dem Rückstand inkubiert wurden, der aus
dem Überstand nach Fällung mit 80% Ammoniumsulfat gewonnen
wurde.
Ammoniumsulfatkonzentration (Gew.-%) | |
APAAP-Färbung | |
10% | |
T-Helferzell-Aktivierung | |
20% | T-Helferzell-Aktivierung |
30% | keine Aktivierung |
40% | keine Aktivierung |
50% | keine Aktivierung |
70% | keine Aktivierung |
80+ | keine Aktivierung |
80% Ü | keine Aktivierung |
RPMI 1640 Medium | keine Aktivierung |
PHA-P | T-Helferzell-Aktivierung |
LPS | keine Aktivierung |
Als Negativkontrolle diente RPMI 1640 Medium, das erwartungsgemäß
keine T-Zellstimulierung zeigte.
Als positive Kontrolle diente PHA-P als bekanntes T-Zellstimu
lanz, das zu der charakteristischen Anfärbung der T-Helfer-Zell-
Epitope führte. Das Lipopolysaccharid LPS führte als spezifischer
Stimulator der B-Helfer-Zellreihe erwartungsgemäß zu keiner
Aktivierung der T-Zellen und damit zu keiner Anfärbung der
Epitope bei der APAAP-Methode. Unspezifische Anfärbungen sind bei
diesem Versuchsaufbau somit ausgeschlossen.
Die Beispiele 10 und 11 zeigen eindeutig die spezifische Aktivie
rung der T-Helferzeller durch die erfindungsgemäßen Ammoniumsul
fatfällungsprodukte.
Zur weiteren Charakterisierung der Ammoniumsulfat-Fällungs
produkte wurde diese einer SDS-(Natriumdodecylsulfat-)Poly
acrylamid-Gelelektrophorese unterworfen. Mit dieser Methode
können denaturierte Proteine nach ihrem Molekulargewicht getrennt
werden. Das anionische Detergens SDS lagert sich an die Aminosäu
ren an und verleiht den Proteinen so eine negative Ladung, die
ihrer Sequenzlänge proportional ist. Auch wenn dieser Zusammen
hang nur bedingt für Glykoproteine gilt, so ist dennoch eine
Abschätzung der Molekulargewichte und der Anzahl der Proteine in
den verschiedenen Fraktionen möglich.
Zur Gelektrophorese wurde ein diskontinuierliches Puffersystem
eingesetzt, um ein scharfes Bandenmuster zu erhalten (Davis et
al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 121 (1964) 404-427; L. Ornstein, Ann.
N.Y. Acad. Sci. 121 (1964) 321-349). Bei diesem Puffersystem
unterscheiden sich der pH-Wert und die Ionenstärke des Gels von
den Werten des Pufferreservoires.
Es wurde ein dreischichtiges Gel, bestehend aus Fußgel, Trenngel
und Sammelgel gegossen. Das Fußgel diente zum Abdichten der
Gießeinheit und wurde zur Erzielung einer schnellen Polymeri
sation unter Verwendung einer hohen Konzentration an Radikal
starter hergestellt. Als Trenngel diente ein 12 bis 15%-iges
Gradientengel (29,2% (w/v) Acrylamid, 0,8% (w/v) Bisacrylamid)
in 0,4 M Tris-HCl, pH 8,8 mit Zusatz von 0,1% (w/v) SDS. Als
Sammelgel diente ein 4%-iges Acrylamidgel in 0,2 M Tris-HCl,
pH 6,8, ebenfalls mit 0,1% SDS. Die Dicke der verwendeten Gele
betrug 1,5 mm, die Trennstrecke 25 cm.
Die Ammoniumsulfatfällungsprodukte wurden für die Elektrophorese
in 80%-igem Aceton vorgefällt. Hierzu wurden jeweils 1 ml der
Fraktionen aus Beispiel 2 mit 4 ml eiskaltem Aceton versetzt, für
30 Minuten auf Eis aufbewahrt und zentrifugiert. Die erhaltenen
Rückstände wurden in einer Speed-Vac getrocknet und in je 100 µl
Probenpuffer (1000 µl 2,5 M Saccharose, 250 ml 2 M Trizma-Base
pH 8,8, 25 µl 1%-ige Bromphenolblaulösung, 51,2 µl 200 mM EDTA-
KOH pH 8,8, 250 µl 100 mM L-Methionin, 2,5 ml destilliertes
Wasser; vor Gebrauch wurden 500 µl des Probenpuffers mit 50 µl
1 M Dithioerythritol (DTE) und 100 µl 10% (v/w) SDS versetzt)
aufgenommen. Jeweils 25 µl der in Probenpuffer gelösten Proben
wurden auf das Gel aufgetragen. Zur Größenabschätzung wurde mit
einem Protein-Standard in gleicher Weise verfahren.
Die Elektrophorese erfolgte bei 200 V und 15 mA für 20 Stunden
bei 4°C im Kühlraum.
Zur Sichtbarmachung der Proteine wurde die SDS-PAGE anschließend
nach folgendem Protokoll einer Silberfärbung unterzogen. Das Gel
wurde für die angegebenen Zeiten in den aufgeführten Lösungen
aufbewahrt. Die Differenz zu 100% wurde jeweils durch destil
liertes Wasser ausgeglichen.
Die Gel wurden anschließend im destilliertem Wasser aufbewahrt,
photographiert und getrocknet.
Die Photographie des Gels ist in Abbildung 11 gezeigt. Aus der
Abbildung wird deutlich, daß der Bereich der mit diesem Versuchs
system detektierbaren Proteine zwischen 6,5 und 92,5 kDa liegt.
In der 10% Fraktion der Ammoniumsulfatfällung wurden mindestens
15 verschiedene Proteinbanden beobachtet. Eine ähnlich hohe Zahl
verschiedener Einzelproteine zeigt die gelelektrophoretische
Auftrennung der 20% Fraktion. Es ist bemerkenswert, daß sich die
Proteinbanden dieser beiden Fraktionen durch eine große Heteroge
nität ihrer Molekulargewichte auszeichnen. In der 30% Fraktion
und der 80% Fraktion sowie im Überstand nach Fällung mit 80%
Ammoniumsulfat konnten mit dieser Methode keine Proteine
nachgewiesen werden. Bei der für die 40% und die 70% Fraktion
beobachtete Proteinbande mit einem Molekulargewicht von etwa
67 kDa handelt es sich wahrscheinlich um ein Färbeartefakt.
Zur genaueren Auftrennung der Proteine wurden die bei 10%, 20%
und 70% Ammoniumsulfat erhaltenen Fraktionen einer zweidimen
sionalen Gelelektrophorese unterworfen. Hierbei wurden die
Proteine bzw. Glykoproteine im ersten Schritt nach ihrem
isoelektrischen Punkt in einem pH-Gradienten und anschließend in
einer zweiten Dimension durch SDS-PAGE aufgetrennt.
Die isoelektrische Fokussierung wurde in Glasröhrchen mit einem
Durchmesser von 4 mm und einer Länge von 15 cm durchgeführt. Die
Röhrchen wurden mit einer wäßrigen 3,5%-igen Acrylamidlösung
gemäß folgender Zusammensetzung gefüllt:
7,5 M Harnstoff
3,5% Acrylamid/Bisacrylamid
2,5% CHAPS* (10% in Wasser)
8% Ampholyte (20% Ampholyte pH 2-11, 80% Ampholyte 5-7)
3,5% Acrylamid/Bisacrylamid
2,5% CHAPS* (10% in Wasser)
8% Ampholyte (20% Ampholyte pH 2-11, 80% Ampholyte 5-7)
* 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propan
sulfonat Hydrat
Die Mischung wird bei 40 mbar für 40 Minuten entgast und
anschließend mit:
20 µl Ammoniumpersulfat und
10 µl N,N,N′,N′-Tetramethyleethylendiamin (TEMED)
10 µl N,N,N′,N′-Tetramethyleethylendiamin (TEMED)
versetzt. Zur Polymerisation werden die Röhrchen mit einer 6,5 M
Harnstofflösung überschichtet.
Nach ca. 2 Stunden wurde der Harnstoff vorsichtig mit einer
Injektionsspritze entfernt und das Gel zur Equilibrierung mit
Harnstoff-Kaliumcarbonat-SDS-Puffer (UKS) mit der folgenden
Zusammensetzung überschichtet:
9,5 M Harnstoff
5 mM Kaliumcarbonat
1,25% SDS (v/w)
0,5% Dithiothreitol (DTT; v/v)
6,0% CHAPS (v/v)
1,0% Ampholyte 3-10 (v/v)
4,0% Ampholyte 5-7 (v/v) in destilliertem Wasser.
5 mM Kaliumcarbonat
1,25% SDS (v/w)
0,5% Dithiothreitol (DTT; v/v)
6,0% CHAPS (v/v)
1,0% Ampholyte 3-10 (v/v)
4,0% Ampholyte 5-7 (v/v) in destilliertem Wasser.
Nach mindestens 1-stündiger Equilibrierung wurden die Röhrchen
in eine 2D-Elektrophoresekammer eingespannt (Biometra, Göttin
gen). Der pH-Gradient in den Glasröhrchen nach der Equilibrierung
betrug pH 2 bis pH 11. Im Verlauf der isoelektrischen Fokussie
rung stellt sich ein pH-Gradient von 3,4 bis 7,6 in den Röhrchen
ein. Dieser Wert wurde mit einem Teströhrchen ohne Probenmaterial
ermittelt.
Für die isoelektrische Fokussierung wurden je 2 ml der Ammonium
sulfatfällungsprodukte aus Beispiel 2 mit 8 ml Aceton wie in
Beispiel 12 beschrieben gefällt, die Rückstände in je 100 µl UKS
aufgenommen und jeweils auf ein Röhrchen aufgegeben. Danach
wurden die Röhrchen mit 30 µl einer 7,0 M Harnstofflösung mit
einem Gehalt von 1% (v/v) Ampholyte überschichtet. Anschließend
werden die Laufpuffer in die Kammern der Elekrophoreseeinheit
gefüllt. Als Anodenpuffer diente 0,01 M Phosphorsäure und als
Kathodenpuffer 0,02 M Natronlauge.
Die isoelektrische Fokussierung erfolgte nach folgendem Proto
koll:
200 V 0,5 h
500 V 13 h
800 V 2 h.
500 V 13 h
800 V 2 h.
Anschließend wurden die Gradientengele aus den Röhrchen befreit,
für mindestens 1 Stunde bei -20°C eingefroren und danach für
2 × 3 Minuten in einem Puffer mit der folgenden Zusammensetzung
equilibriert:
0,5 M Trizma-Base pH 6,8
2% SDS
65 mM DTE
6 M Harnstoff
30% (w/v) Glycin
260 mM Jodacetamid in destilliertem Wasser.
2% SDS
65 mM DTE
6 M Harnstoff
30% (w/v) Glycin
260 mM Jodacetamid in destilliertem Wasser.
Die equilibrierten Gele wurden in einer zweiten Dimension über
ein 12%-iges SDS-Polyacrylamidgel mit einer Trennstrecke von
25 cm weiter aufgetrennt. Hierzu wurden sie mit Agarose auf dem
4% Sammelgel befestigt. Die Elektrophorese erfolgte bei
konstanter Spannung mit 15 mA für 20 Stunden im Kühlraum bei
4°C. Nach der Elektrophorese wurden die Gele wie in Beispiel 12
beschrieben einer Silberfärbung unterworfen. Die SDS-PAGE
erfolgte in einem Molekulargewichtsbereich von 12,5 bis 92,5 kDa.
Die isoelektrische Fokussierung der 10% Fraktion (Abbildung 12)
ergab, daß sich diese aus mindestens 100 verschiedenen Proteinen
in wahrscheinlich unterschiedlichen Konzentrationen zusammen
setzt.
Die Auftrennung der 20% Fraktion ergab ebenfalls eine große
Anzahl von Proteinen, die gleichermaßen hinsichtlich ihres
Molekulargewichts und ihres isoelektrischen Punkts charak
terisiert wurden.
Abbildung 12 zeigt, daß die Badenmuster der 10 und der 20%
Fraktion nur zu einem geringen Anteil übereinstimmen. Dieser
Anteil ist für eine weitere Analyse der biologisch wirksamen
Proteinen von besonderem Interesse.
Die Auftrennung der 70% Fraktion (Abbildung 14) zeigte einen
wesentlich geringeren Anteil von Einzelproteinen. Das Ver
teilungsmuster hat nur wenig Ähnlichkeit mit dem der 10% oder
der 20% Fraktion. Nur einzelne Banden stimmen mit Banden aus der
10% bzw. 20% Fraktion überein. Darüberhinaus konnten Protein
banden nachgewiesen werden, die weder in der 10%, noch in der
20% Fraktion auftraten.
Bei dem derzeitigen Kenntnisstand, kann davon ausgegangen werden,
daß die in allen drei der untersuchten Fällungsfraktionen
auftretenden Proteine bzw. Glykoproteine maßgeblich für die
biologische Wirksamkeit der Fällungsfraktionen verantwortlich
sind. Die diesen Banden entsprechenden Proteine bzw. Glyko
proteine sind daher ein bevorzugter Gegenstand der vorliegenden
Erfindung.
Claims (9)
1. Proteine enthaltende Komponente aus Thujapflanzen, erhält
lich durch
- (a) Extrahieren der zerkleinerten und mit organischen Lösungsmitteln gereinigten oberirdischen Thujapflan zenteile mit einem alkalischen wäßrigen Lösungsmittel,
- (b) Versetzen des Extrakts mit einem organischen Lösungs mittel, um Polysaccharide und Protein aus dem Extrakt auszufällen,
- (c) Abtrennen des Niederschlags und Lösen des Nieder schlags in Wasser bei Temperaturen unterhalb der Raum temperatur,
- (d) Ansäuern der Lösung, um die Proteine auszufällen,
- (e) Abtrennen des Niederschlags und Versetzen des Über stands mit einem organischen Lösungsmittel,
- (f) Dialysieren des Niederschlags und anschließendes Trocknen,
- (g) Lösen des getrockneten Rückstands in Wasser und Zugabe von Ammoniumsulfat bis die Endkonzentration des Ammoniumsulfates in der Gesamtlösung 10 bis 70 Gew.-% beträgt, um Proteine auszufällen,
- (h) Dialysieren des Niederschlags und anschließendes Trocknen.
2. Komponente nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in
Stufe (g) der getrocknete Rückstand in Wasser gelöst, die
Lösung fraktioniert mit Ammoniumsulfat versetzt wird und die
bei den jeweiligen Ammoniumsulfat-Konzentrationen aus
fallenden Proteine vor der erneuten Zugabe von Ammoniumsul
fat isoliert und getrennt in Stufe (h) eingesetzt werden, um
die einer bestimmten Fraktion entsprechende Komponente zu
gewinnen.
3. Komponente nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die
Ammoniumsulfat-Konzentration in Schritten von 10 Gew.-%
erhöht wird und die bei Ammoniumsulfat-Konzentrationen von
10, 20 und/oder 70 Gew-% ausfallenden Proteine isoliert
werden.
4. Komponente nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge
kennzeichnet, daß in Stufe (a) Thuja occidentale L. ver
wendet wird.
5. Komponente nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß ein Teil der Proteine Glykoproteine
sind.
6. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es die Komponente
aus Thujapflanzen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 als
aktiven Wirkstoff enthält.
7. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es die Komponente
aus Thujapflanzen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 in
Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Hilfs- und
Trägerstoffen, enthält.
8. Verwendung eines Arzneimittels nach den Ansprüchen 6 und 7
zur Behandlung von Immun- oder Knochenmarksdepressionen.
9. Verwendung eines Arzneimittels nach den Ansprüchen 6 und 7
zur Behandlung von endogenen und erworbenen, einschließlich
viren- und strahlungsinduzierten Immundefekterkrankungen.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1995105795 DE19505795C1 (de) | 1995-02-09 | 1995-02-09 | Proteine enthaltende Komponente aus Thujapflanzen sowie diese enthaltende Arzneimittel |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
DE1995105795 DE19505795C1 (de) | 1995-02-09 | 1995-02-09 | Proteine enthaltende Komponente aus Thujapflanzen sowie diese enthaltende Arzneimittel |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
DE19505795C1 true DE19505795C1 (de) | 1996-08-14 |
Family
ID=7754520
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
DE1995105795 Expired - Fee Related DE19505795C1 (de) | 1995-02-09 | 1995-02-09 | Proteine enthaltende Komponente aus Thujapflanzen sowie diese enthaltende Arzneimittel |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
DE (1) | DE19505795C1 (de) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10119597A1 (de) * | 2001-04-21 | 2002-10-31 | Lutz Eichacker | Verfahren zur Erhöhung der Trennschärfe bei der mehrdimensionalen Elektrophorese oder der mehrdimensionalen isoelektrischen Fokussierung |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0315182B1 (de) * | 1987-11-06 | 1991-11-27 | Rolf Dietmar Prof. Dr. Neth | Arzneimittel mit einem Gehalt an einer Polysaccharide enthaltenden Komponente aus Thujapflanzen als aktivem Wirkstoff |
-
1995
- 1995-02-09 DE DE1995105795 patent/DE19505795C1/de not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0315182B1 (de) * | 1987-11-06 | 1991-11-27 | Rolf Dietmar Prof. Dr. Neth | Arzneimittel mit einem Gehalt an einer Polysaccharide enthaltenden Komponente aus Thujapflanzen als aktivem Wirkstoff |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE10119597A1 (de) * | 2001-04-21 | 2002-10-31 | Lutz Eichacker | Verfahren zur Erhöhung der Trennschärfe bei der mehrdimensionalen Elektrophorese oder der mehrdimensionalen isoelektrischen Fokussierung |
DE10119597C2 (de) * | 2001-04-21 | 2003-05-22 | Lutz Eichacker | Verfahren zur Erhöhung der Trennschärfe bei der mehrdimensionalen Elektrophorese oder der mehrdimensionalen isoelektrischen Fokussierung |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0106179B1 (de) | Homogenes Human-Interleukin-2 und Verfahren zu seiner Herstellung | |
DE69737956T2 (de) | CD8 Tuberkulose Impfstoffe | |
DE69524624T2 (de) | Saponinzubereitungen und deren verwendung in iscoms | |
DE68906735T2 (de) | Pharmazeutische zubereitung zur behandlung von viruskrankheiten mit leber-extrakt. | |
CH648330A5 (de) | Tumor-spezifische glykoproteine und verfahren zu deren herstellung. | |
DE2648458A1 (de) | Reagenz zur diagnose von krebs, dessen herstellung und anwendung | |
DE69434407T2 (de) | Kondensationspolymer aus einer aromatischen Sulfonsäure und ein Aledhyd zur Hemmung der HIV-Infektivität | |
EP1124575B1 (de) | Verfahren zur herstellung eines antiviralen mittels | |
EP0101063B1 (de) | Neues Polypeptid mit Wirkung auf das Immunsystem, Verfahren zu seiner Isolierung und Reinigung, seine Verwendung und dieses enthaltende Mittel | |
DE3019847A1 (de) | Verfahren zur herstellung von menschlichem interferon und es enthaltende mittel | |
DE2635065A1 (de) | Verfahren zur halbkontinuierlichen behandlung von gesamtblut | |
DE2518474A1 (de) | Mitogenes mittel, verfahren zu seiner herstellung und diese mittel enthaltende arzneimittel und biologische reagenzien | |
DE19505795C1 (de) | Proteine enthaltende Komponente aus Thujapflanzen sowie diese enthaltende Arzneimittel | |
DE3914354C1 (de) | ||
DE3325131C2 (de) | ||
DE4429735C2 (de) | Pflanzlicher Redoxkatalysator, Mittel zur Behandlung immunbiologischer Zellbelastungsschwächen und Verfahren zu dessen Herstellung | |
DE69526096T2 (de) | Wachstumsregulator | |
DE1076888B (de) | Verfahren zur Gewinnung atmungsfoerdernder Wirkstoffe fuer therapeutische Zwecke | |
DE4221753C2 (de) | Immunologisch und antiphlogistisch wirksame Polysaccharide aus Sedum telephium, Verfahren zu ihrer Gewinnung und diese enthaltende Arzneimittel | |
DE3872235T2 (de) | Allgemeiner krebsverbundener faktor, durch scm erkannt, seine praeparation und sein verwendungsverfahren. | |
CH639667A5 (de) | Verfahren zur herstellung von peptidkomplexen aus dns-haltigen organismen. | |
DE69013134T2 (de) | Extrakte von acanthospermum hispidum-pflanzen. | |
DE69935077T2 (de) | Immunmodulatorische faktoren zur immunsuppressiven und antiallergischen behandlung | |
DE2333740A1 (de) | Antigen, verfahren zu dessen isolierung, bestimmung und dessen verwendung | |
EP0315182B1 (de) | Arzneimittel mit einem Gehalt an einer Polysaccharide enthaltenden Komponente aus Thujapflanzen als aktivem Wirkstoff |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8100 | Publication of the examined application without publication of unexamined application | ||
D1 | Grant (no unexamined application published) patent law 81 | ||
8364 | No opposition during term of opposition | ||
8327 | Change in the person/name/address of the patent owner |
Owner name: GREENOVATION PFLANZENBIOTECHNOLOGIE GMBH, 79108 FR |
|
8339 | Ceased/non-payment of the annual fee |