DE19505795C1 - Proteine enthaltende Komponente aus Thujapflanzen sowie diese enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Proteine enthaltende Komponenten aus Thujapflanzen, insbesondere aus Thuja occidentale L., welche immun-modulierende Wirkungen insbesondere auf das spezifische Immunsystem von Säugetieren und Menschen besitzt. Als Immunmodu­ lation wird die gezielte Stimulation immunkompetenter Zellen und immunologischer Funktionen bezeichnet.

Derzeit sind etwa 200 verschiedene Präparate zur Immunstimulie­ rung bei Abwehrschwäche bekannt, von denen etwa 60% aus Pflanzenextrakten hergestellt werden.

Im Gegensatz zu Impfstoffen und Immunglobulinen stimulieren diese Präparate den unspezifischen Anteil des Abwehrsystems, eine spezifische Therapie ist bisher von keinem dieser Pflanzen­ präparate bekannt.

Wissenschaftliche Untersuchungen über den Wirkungsmechanismus von Pflanzenextrakten auf das Abwehrsystem liegen bisher kaum vor.

Nur bei wenigen Phytopräparaten ist etwas über ihre Wirkungs­ mechanismen bekannt und nur in Einzelfällen konnten immunologisch wirksame Komplexe isoliert werden.

Wagner et al. isolierten beispielsweise aus Echinacea purpurea Polysaccharide, die eine Steigerung der Phagozytoseaktivität von Granulocyten bewirken und eine Anregung der Cytokin-Produktion in Knochenmark-Makrophagen sowie eine Stimulierung der B- und T- Lymphozyten hervorrufen (H. Wagner et al., Arzneim.-Forsch. 35 (II) (1985) 1069).

Aus der EP-PS 0 315 182 ist eine proteinfreie polysaccharidhalti­ ge Komponente aus Thujapflanzen bekannt (Thuja Polysaccharid Gesamtfraktion, TPSg), die einen selektiven mitogenen Effekt auf T-Helfer-Lymphozyten besitzt und sowohl das unspezifische Abwehr­ system als auch das spezifische B-Lymphozytensystem aktiviert.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Isolation weiterer aktiver Komponenten aus Thujapflanzen, die eine immunmodulierende Wirkung zeigen.

Überraschenderweise wurde diese Aufgabe dadurch gelöst, daß man den durch Alkoholfällung aus einem alkalischen Extrakt aus Thuja- Pflanzen gewonnenen Rückstand einer fraktionierten Ammoniumsul­ fatfällung unterwirft.

Zur Gewinnung der erfindungsgemäßen Komponenten aus Thujapflanzen wurden zunächst die oberirdischen Pflanzenteile von Thuja- Pflanzen, vorzugsweise von Thuja occidentale L, zerkleinert und durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln wie beispiels­ weise Petrolether, Dichlormethan und Methanol aufgeschlossen und gereinigt. Nach dem Trocknen wurde der Rückstand mit einer wäßrigen alkalischen Lösung, vorzugsweise mit einer 0,1 bis 1,0 N, insbesondere 0,5 N wäßrigen NaOH-Lösung, extrahiert und das Extrakt mit einem organischen Lösungsmittel, vorzugsweise mit einem Alkohol und besonders bevorzugt mit Ethanol versetzt.

Sowohl die Extraktion als auch die Alkoholfällung erfolgt vorzugsweise bei 1 bis 10°C, besonders bevorzugt bei 2 bis 6°C.

Nach der Alkoholzugabe wurde der sich bildende Niederschlag beispielsweise durch Ultrazentrifugation abgetrennt, in Wasser gelöst und die Lösung zur Fällung eines Großteils der Proteine mit Säure, vorzugsweise mit Trichloressigsäure versetzt. Der sich bildende Niederschlag wurde abgetrennt und verworfen, der klare Überstand wurde erneut mit Alkohol, vorzugsweise Ethanol, versetzt. Der sich bildende Niederschlag wurde abgetrennt, zur Reinigung in 2%-iger Natriumacetatlösung gelöst, durch Zugabe von Alkohol, vorzugsweise Ethanol gefällt, in destilliertem Wasser aufgenommen und gegen Wasser dialysiert. Zur Dialyse wird vorzugsweise ein Dialyseschlauch mit einer Ausschlußgrenze von 10 000 Da, besonders bevorzugt von 12 000 Da verwendet.

Nach der Dialyse wurde die Lösung lyophilisiert und der Rückstand einer Ammoniumsulfatfällung unterworfen. Hierzu wurde das Dialyseprodukt in Wasser gelöst und mit Ammoniumsulfat, vorzugs­ weise in Form einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung, versetzt, so daß die Endkonzentration des Ammoniumsulfats in der Gesamt­ lösung vorzugsweise 10 bis 70 Gew.-% betrug.

Als besonders vorteilhaft erwies sich die fraktionierte Ammonium­ sulfatfällung des Rückstands. Hierzu wurde die Lösung des Rückstands schrittweise mit Ammoniumsulfat versetzt und dabei vorzugsweise Ammoniumsulfatkonzentrationen von 10 bis 80 Gew.-% in Abstufungen von 10% eingestellt.

Nach jeder Ammoniumsulfatzugabe wurde der gebildete Niederschlag abgetrennt und sofort bei -20°C eingefroren. Nach dem letzten Fällungsschritt wurden die Fällungsfraktionen getrennt in destil­ liertem Wasser gelöst und durch Dialyse vom Ammoniumsulfat befreit, um so die einer bestimmten Fraktion entsprechende Kom­ ponente zu gewinnen. Ebenso wurde ein Teil des Überstandes nach dem letzten Fällungsschritt (80Ü) dialysiert. Die gereinigten Fällungsprodukte wurden getrocknet, vorzugsweise gefrierge­ trocknet, und bei -20°C aufbewahrt.

Zur Ermittlung der mitogenen Aktivität der einzelnen Fraktionen wurde die DNA-Syntheserate von humanen peripheren mononuklearen Blutleukozyten (PBL) nach Aktivierung mit den Ammoniumsulfatfäl­ lungsprodukten anhand des Einbaus von ³H-markiertem Thymidin bestimmt. Insbesondere die 10%-Fraktion führte zu einer starken Steigerung der Syntheserate. Bei einer Konzentration von 2 mg/ml wurde eine 230-fache Steigerung gegenüber dem Leerwert gemessen. Selbst eine Konzentration von 0,5 mg/ml des Rückstands der 10%- Fraktion bewirkte noch eine 150-fachen Zunahme der Proliferation. Für die bei 20, 30 und 70% Ammoniumsulfat erhaltenen Fraktionen wurde bei Konzentrationen von 2 mg/ml in allen drei Fällen eine etwa 15-fache Steigerung der Syntheserate registriert (Ab­ bildung 3). Die aus dem 80%-Überstand gewonnene Fraktion zeigte in diesem Test keinerlei biologische Aktivität.

Durch Verdünnungsreihen wurde festgestellt, daß der wachstum­ stimulierende Effekt in nahezu linearer Weise mit der Konzen­ tration abfällt. Eine Ausnahme bildet die 10%-Fraktion beim Übergang von einer Konzentration von 2 mg/ml auf 1 mg/ml. Dies ist vermutlich darauf zurückzuführen, daß in diesem Bereich eine Sättigung des verwendeten Systems vorlag und die maximal mögliche Aktivitätssteigerung erreicht wurde.

Zur Untersuchung des Einflusses der Fällungsprodukte auf die Cytokininduktion wurden PBL in Gegenwart der Ammoniumsulfatfäll­ produkte kultiviert. Nach 4-tägiger Inkubation unter den üblichen Bedingungen wurden die Zellen abzentrifugiert und die Probenüber­ stände mittels eines Enzym Linked Immuno Sorbent-Assays (ELISA) auf das Vorhandensein von Interleukin-6 (IL-6) und TNF-α untersucht.

Die in Abbildung 4 graphisch dargestellten Ergebnisse zeigen, daß die Zugabe von 2 mg/ml der 10% Fraktion zu einer 10-fachen Erhöhung des IL-6-Spiegels gegenüber der Kontrolle bewirkt. Das 20%-Fällungsprodukt führt bei gleicher Konzentration zu einer etwa 6-fachen Steigerung der IL-6-Konzentration. Darüber hinaus wurden geringe Steigerungen der IL-6-Produktion für die 30% und 70% Fraktion beobachtet. Die Verteilung der Aktivitäten entsprach weitgehend der des Mitogenitätstests.

Für TNF-α wurde nach Zugabe der 10% Fraktion eine vierfache und nach Zugabe der 20% Fraktion eine 5-fache Steigerung der Konzentration des Cytokins beobachtet. Interessant ist, daß in diesem Fall die Interleukinexpression durch die 20% Fraktion stärker stimuliert wurde als durch die 10% Fraktion.

Die erfindungsgemäßen Produkte zeigen darüber hinaus eine Stimulation der Interleukine 1 bis 4, CFU, GMCFU, GM-CSF, CFU-S- 8, GCSF, GMCSF, α-IFN und CFU-S-11 sowie von Interferonen und anderen Tumornekrosisfaktoren (TNF). Auch eine Aktivierung der makrophagenabhängigen Proliferation und der spezifischen Antwort der B-Lymphozyten wurde nachgewiesen.

Zur näheren Charakterisierung der Ammoniumsulfatfällungsprodukte wurden diese hinsichtlich ihrer Protein- und Zuckergehalte hin analysiert. Etwa 60% der Gesamtproteinmasse der Fällungsprodukte waren in der 10% Fraktion enthalten (Abbildung 5), während sich in der 20%- und 70% Fraktion etwa 15 bzw. etwa 7% der Gesamt­ proteinmasse wiederfanden. Im Überstand nach Fällung mit 80% Ammoniumsulfat konnte mit dieser Methode kein Protein nach­ gewiesen werden. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Aktivität der Fällungsprodukte eng mit dem Proteingehalten korreliert ist. Während ein hoher Proteingehalt eine hohe biologische Aktivität bedingt, sind Proben ohne Protein in den verwendeten Testsystemen praktisch wirkungslos.

Im Gegensatz zum Protein wurden über 90% der Gesamtkohlenhy­ dratmasse im Überstand nach Fällung mit 80% Ammoniumsulfat nach­ gewiesen, während die 10% Fraktion lediglich etwa 4% der Gesamtmasse der Polysaccharide enthielt (Abbildung 6). Die übrigen 6% der Gesamtkohlenhydratmasse verteilten sich gleichmä­ ßig auf die restlichen Fraktionen. Eine eindeutige Korrelation der biologischen Aktivität mit dem Kohlenhydratgehalt ist nicht möglich. Die Möglichkeit, daß Polysaccharide die oben geschilder­ te biologische Aktivitäten vermitteln, kann daher ausgeschlossen werden.

Auffallend ist jedoch, daß die 10%-Fraktion im Vergleich zu den übrigen Fällungsfraktionen einen relativ hohen Polysaccharidge­ halt aufweist. Im Zusammenhang mit dem Proteingehalt deutet dieser Sachverhalt darauf hin, daß es sich bei den in dieser Fraktion nachgewiesenen Polysacchariden mit großer Wahrschein­ lichkeit um den Zuckeranteil von Glycoproteinen handelt, so daß es sich bei den erfindungsgemäßen Fällungsfraktionen höchstwahr­ scheinlich zumindest teilweise um Glykoproteine handelt. Der Begriff "Protein" wird im Rahmen dieser Erfindung sowohl zur Bezeichnung von Proteinen als auch von Glykoproteine sowie Mischungen aus Proteinen und Glykoproteinen verwendet.

In weiteren Untersuchungen wurden die Fällungsfraktionen mit Proteinase K und mit Aceton behandelt. Durch Proteinase K werden Proteine vollständig abgebaut und damit zerstört, die Behandlung mit Aceton bewirkt eine Zerstörung der Sekundärstruktur von Proteinen. Nach der Behandlung mit Proteinase K bzw. Aceton wurde erneut die mitogene Aktivität der Fällungsfraktionen im PBL-Test bestimmt (Abbildung 7).

Die Ergebnisse dieser Untersuchungen zeigen, daß die Aktivierung der DNA-Syntheserate sowohl durch die Proteinase K Behandlung als auch durch die Behandlung mit Aceton aufgehoben werden. Während jedoch die Behandlung mit Proteinase K zu einem vollständigen Aktivitätsverlust führt, ist bei der 10%-Fraktion nach Denaturie­ rung mit Aceton noch eine geringe Restaktivität zu beobachten.

Die unvollständige Desaktivierung der biologischen Aktivität nach der Acetonbehandlung ist vermutlich auf eine unvollständige Zer­ störung der Sekundärstruktur der Proteine zurückzuführen. Diese Beobachtung ist ein weiteres Indiz für die Richtigkeit der Vermutung, daß die biologische Aktivität der Fällungsprodukte auf deren Protein-Gehalt zurückzuführen ist. Die Möglichkeit, daß die beobachteten Aktivitätsverluste durch Reagenzien hervorgerufen wurden, die zur Proteinase-K- oder Aceton-Behandlung eingesetzt wurden, wurde durch umfangreiche Kontrollmessungen ausgeschlossen (Abbildung 8).

Durch eine Alkalische Phosphatase Anti-Alkalische Phosphatase (APAAP) Färbung wurde anschließend die genaue Zellsubpopulation der durch die Ammoniumsulfatfällungprodukte aktivierten PBL bestimmt. In diesem Test wurden für CD4-Epitope spezifische Antikörper eingesetzt, welche für T-Helferzellen charakteristisch sind. Es wurde eine spezifische Aktivierung von T-Helferzellen durch die Ammoniumsulfatfällungsprodukte nachgewiesen (Abbildung 10). Hieraus kann geschlossen werden, daß der Wirkungsmechanismus der erfindungsgemäßen Komponenten aus Thuja-Pflanzen über die CD-4-Bindung eines Glykoproteins an T-Helferzellen ausgelöst wird.

Zur Charakterisierung des Proteinanteils der Ammoniumsulfatfäl­ lungsaktionen wurden diese einer denaturierenden Polyacryl­ amidgelelektrophorese (PAGE) mit diskontinuierlichem Puffersystem unterworfen (Abbildung 11). Hierbei wurden im Proteinanteil der 10%-Fraktion mehr als 15 verschiedene Proteine im Bereich von 6,5 bis 92,5 kDa nachgewiesen. Eine ähnlich hohe Zahl unter­ schiedlicher Einzelproteine wurde bei der gelelektrophoretischen Auftrennung der 20% Fraktion gefunden. Auffällig ist, daß sich die Proteine der beiden Fraktionen durch eine große Heterogenität ihrer Molekulargewichte auszeichnen.

Da sich besonders die bei 10, 20 sowie 70% Ammoniumsulfat gewonnenen Fällungsprodukte durch eine hohe biologische Aktivität auszeichneten, wurden diese Proben mittels isoelektrischer Fokussierung näher untersucht. Auf diese Weise ließen sich in der 10%-Fraktion mindestens 100 verschiedene Proteine in wahrschein­ lich unterschiedlichen Konzentrationen nachweisen (Abbildung 12). Auch in der 20% Fraktion konnte eine große Anzahl unterschiedli­ cher Proteine identifiziert werden (Abbildung 13), wobei die in den beiden Fraktionen gefundenen Proteine nur zu einem geringen Anteil in ihren Molekulargewichten und ihren isoelektrischen Punkten übereinstimmen.

Die Untersuchung der 70% Fraktion ergab eine wesentlich geringere Anzahl von Einzelproteinen (Abbildung 14). Das Verteilungsmuster hatte mit dem der 10 bzw. 20% Fraktion wenig Ähnlichkeit und enthielt Proteine die weder in der 10% noch in der 20% Fraktion vorhanden waren. Bei einzelnen Banden zeigten sich jedoch Gemeinsamkeiten, was diese Banden für eine weitere Analyse der biologisch wirksamen Proteine besonders interessant macht.

Die erfindungsgemäßen Komponenten aus Thuja-Pflanzen, vorzugs­ weise aus Thuja der Art Thuja occidental L. eignen sich besonders zur Verwendung als Wirkstoffe in Arzneimitteln, vorzugsweise in Kombination mit den üblichen Hilfs- und Trägerstoffen, soweit letztere für die jeweilige Applikationsform geeignet und pharma­ zeutisch unbedenklich ist. Vorzugsweise werden die erfindungs­ gemäßen Komponenten in physiologischer Kochsalzlösung parenteral verabreicht. Bevorzugte Komponenten sind die bei Ammoniumsul­ fatkonzentrationen von 10, 20 bzw. 70 Gew.-% ausgefällten Fraktionen.

Die Arzneimittel eignen sich ihrerseits besonders zur Verwendung bei der Behandlung von Immun- oder Knochenmarksdepressionen, ins­ besondere bei der Behandlung von endogenen oder erworbenen viren- oder strahleninduzierten Immundefekterkrankungen wie beispiels­ weise Granulozytopenien, strahlenbedingten Leukopenien sowie strahlen- und zytostatika-bedingten Zytopenien beispielsweise nach einer chemo-strahlentherapeutischen Krebstherapie. Darüber hinaus eignen sie sich zur Behandlung von erhöhter Infektan­ fälligkeit im Kindesalter oder beispielsweise nach oder während einer Antibiotikatherapie oder Antipyrethikabehandlung sowie bei erhöhter körperlicher Belastung. Ein weiteres Anwendungsgebiet liegt in der Behandlung von Infektionen, die durch Retroviren, insbesondere durch HIV hervorgerufen werden.

Zusätzlich erlaubt die erfindungsgemäße Komponente aus Thuja- Pflanzen die gezielte Herstellung von Antikörpern, vorzugsweise von monoklonalen Antikörpern, gegen diese Komponente. Mit Hilfe dieser Antikörper können die zur Immunstimulierung benutzten Heilpflanzen auf Wirksubstanzen überprüft werden, und es ist eine Standardisierung der in der Therapie verwendeten Pflanzenextrakte anhand ihrer Wirksubstanzen möglich. Darüberhinaus erlauben solche Antikörper die Konzeption neuer Aufarbeitungsmethoden aus Thuja, die besonders die wirksamkeitbestimmenden Substanzen anreichern können. Sie ermöglichen zudem die effiziente Suche nach ähnlich wirkenden Substanzen in verwandten Pflanzengattungen.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert.

Ausführungsbeispiele Beispiel 1 1. Aufarbeitung von Thuja-Pflanzen (Wagner et al., Drug Research 35 (1985) 1069-1075)

Die getrocknete und zerkleinerte Droge (Thuja occidentale L.) wurde nacheinander erschöpfenden Soxhlet-Extraktionen mit Petrolether, Dichlormethan und Methanol unterworfen, um Fette, Wachse, Polyphenole und Chlorophylle zu entfernen, welche die weiteren Aufarbeitungsschritte stören könnten. Zwischen den einzelnen Extraktionsschritten wurden die Pflanzenteile getrock­ net. Anschließend wurde die vorextrahierte Probe an der Luft getrocknet.

2. Gewinnung der Rohpolysaccharide aus einem wäßrigen, alkali­ schen Extrakt (Caldes et al., J. Gen. Appl. Microbiol. 27 (1981) 157-161)

Alle Arbeiten wurden, wenn nicht anders vermerkt, bei 4°C durchgeführt. 200 g der vorextrahierten, getrockneten Droge wurden mit 2,5 l einer 0,5 N Natronlauge versetzt und 48 Stunden gerührt. Anschließend wurde der Rückstand abzentrifugiert, mit 1,0 l 0,5 N NaOH-Lösung nachgewaschen und die vereinten Filtrate langsam unter ständigem Rühren mit dem dreifachen Volumen an 96%-igem unvergälltem Ethanol versetzt. Der nach 24 Stunden gebildete Niederschlag wurde abzentrifugiert, in 1,0 l destil­ liertem Wasser aufgenommen und in einem Eisbad langsam mit 1,0 l einer 15%-igen Trichloressigsäure-Lösung (TCA) versetzt. Nach 12 Stunden wird der gallertartige Rückstand abzentrifugiert und der verbleibende Überstand (ca. 2 l) mit dem dreifachen Volumen Ethanol versetzt. Nach 24 Stunden wurde der entstandene Nieder­ schlag abzentrifugiert, in 0,5 l einer 2%-igen Natriumacetatlö­ sung aufgenommen und unlösliche Bestandteile abfiltriert. Das Filtrat wurde erneut mit 2,0 l 96%-igem unvergällten Ethanol versetzt und für 4 Tage gerührt. Anschließend wurde der Rohpoly­ saccharidrückstand abzentrifugiert, in 100 ml destilliertem Wasser gelöst und in 10 Einzelschritten gegen je 10 l destillier­ tes Wasser für jeweils 2 Stunden dialysiert (Visking Dialysis Tubing 20/30, Durchmesser 16 mm, Serva, Heidelberg). Anschließend wird die Lösung lyophylisiert, Ausbeute 4 g des Rohpolysac­ charids.

Die Verfahrensschritte zur Gewinnung des Rohpolysaccharids sind in Abbildung 1 zusammengefaßt.

Beispiel 2 Ammoniumsulfatfällung (Dixon et al., Advances in Protein Chemistry 16 (1961) 197-219)

2,0 g des Rohpolysaccharids aus Beispiel 1 wurden in 300 ml destilliertem Wasser gelöst und gemäß Tabelle 1 stufenweise unter leichtem Rühren mit gesättigter Ammoniumsulfatlösung versetzt. Die Ammoniumsulfatlösung wurde langsam zugetropft. Nach jeder Ammoniumsulfatzugabe wurde die Mischung zur vollständigen Fällung für 30 Minuten weitergerührt und anschließend der Niederschlag durch Zentrifugation in 250 ml verschließbaren Plastikbechern bei 12 000 g abgetrennt.

Der Überstand wurde zügig in ein neues Gefäß dekantiert und gemäß Tabelle 1 mit weiterer Ammoniumsulfatlösung versetzt. Der Rückstand in 25 ml Plastikröhrchen transferiert und sofort bei -20°C bis zur weiteren Verwendung eingefroren. Durch Zugabe steigender Konzentrationen einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung wurde ein sukzessives Ausfällen von Proteinen entsprechend der Anzahl ihrer hydrophilen Aminosäuren erreicht. Das Vorgehen bei der Ammoniumsulfatfällung ist in Abbildung 2 schematisch dargestellt.

Tabelle 1

Nach Erstellung aller Fraktionen wurden diese bei 4°C langsam aufgetaut, in 20 ml destilliertem Wasser gelöst und anschließend gegen 10 l destilliertes Wasser dialysiert (Visking Dialysis Tubing 20/30, Durchmesser 16 mm, Serva, Heidelberg). Während der Dialyse wurde das Wasser in der Vorlage solange im 2-Stunden­ rhythmus gegen frisches Wasser ausgetauscht, bis die Leitfähig­ keit unverändert beim Ausgangsleitwert des Wassers blieb (zur Leitfähigkeitsmessung wurde ein Digital Osmometer der Firma Schott, Mainz verwendet). Auf diese Weise wurde sichergestellt, daß die Fällungsprodukte vollständig von Ammoniumsulfat befreit wurden. Die erforderliche Dialysedauer war von der Ammoniumsul­ fatkonzentration abhängig und betrug maximal etwa 8 Stunden.

Analog zu den Fällungsfraktionen wurde ein 20 ml Aliquot des Überstandes der Fällung mit 80% Ammoniumsulfat (80Ü) dialysiert.

Nach der Dialyse wurden die Proben lyophylisiert und gewogen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefaßt. Die eingesetzte Menge von 2 g Rohpolysaccharid wurde vollständig zurückgewonnen, wobei die Summe der Massen der Fällungsfraktionen 71,3% der Gesamtmasse ausmachten. 28,7% der Ausgangsmasse befanden sich im letzten Überstand. Bei einer Ammoniumsulfatkonzentration von 60% wurde nach Fällung und Zentrifugation kein Rückstand erhalten.

Die Fraktionen werden mit Phosphat-gepufferter-Saline (PBS, pH 7,5) auf eine Konzentration von 4 mg/ml eingestellt und bei -20°C aufbewahrt.

Ammoniumsulfatkonzentration (Gew.-%)
Masse des Rückstands (mg)
10
352,8
20	294,4
30	200,8
40	78,4
50	81,0
60	0
70	211,2
80	208,0
80 Ü	575,2
Gesamt	2001,8

Beispiel 3 Gewinnung humaner peripherer mononuklearer Blutleukozyten (PBL) (Ayad et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 37 (1959) 551-555; Arakaki et al., Cytogenetics 2 (1963) 57-61)

Alle folgenden Arbeiten wurden wenn nicht anders vermerkt mit sterilen Einmalartikeln durchgeführt. Alle Lösungen wurden bei 121°C und einem Druck von 2 × 10⁵Pa für 20 Minuten im Autoklaven sterilisiert und vor Gebrauch auf 37°C temperiert. Das zum Ansetzen der Lösungen verwendete Wasser stammte aus einer Millipore Wasseraufbereitungsanlage (Milli-Q-Water-System, Fa. Millipore, Eschborn).

Die Gewinnung der PBL erfolgte aus heparinisiertem Vollblut (Vetren 200, Promonta, 1 ml/20 ml Vollblut) durch Dichtegradien­ tenzentrifugation über Ficoll-Paque (Pharmacia). Im ersten Schritt wurde das Vollblut mit einem gleichen Volumen RPMI 1640 Medium verdünnt (77% Kulturmedium des Rosewell Park Memorial Instituts (RPMI 1640, Fa. Gibco BRL, Eggenstein); 10% fötales Kälberserum (FCS); 6% einer 5%-ige Humanalbuminlösung; 4% humanes Serum; 1,0% Penicillin/Streptomycin-Lösung (jeweils 5000 mg/ml); 1% 200 mM α-Glutaminlösung; 1% nicht-essentielle Aminosäuren (Fa. Gibco BRL, verdünnt nach Herstellerangabe); alle Angaben (v/v); die Seren wurden vor Gebrauch für 30 Minuten bei 56°C hitzeinaktiviert).

Anschließend wurden jeweils 3 ml Ficoll-Paque in 10 ml-Röhrchen gefüllt und so mit 7 ml verdünntem Vollblut überschichtet, daß eine scharfe Phasengrenze entstand. Die Röhrchen wurden bei 626 g in einer Biofuge-Zentrifuge für 30 Minuten bei Raumtemperatur ohne Bremse mit geringer Beschleunigung zentrifugiert. Nach der Zentrifugation wurde das als klarer Überstand vorhandene Serum vorsichtig mit einer Pasteurpipette entfernt und der in der nächsten Schicht befindliche "Leukozytenreiche Anteil" (Buffy coat), welcher die PBL enthielt, in ein 10 ml-Röhrchen pipet­ tiert. Die folgenden Schichten aus Ficoll-Paque, Granulozyten und Erythrozyten wurden verworfen.

Die Zellen des Buffy coats wurden mit RPMI 1640 Medium auf 10 ml aufgefüllt und bei 264 g für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde dekantiert und das Zellpellet erneut mit Medium gewaschen und zentrifugiert. Das so erhaltene Pellet wurde in 5 ml komplettem RPMI 1640 Medium aufgenommen.

Bestimmung der Lebenszahl mit Trypanblau (Hanks et al., Proc. Soc. Exp. Biol. 99 (1958) 188-193)

Zur Bestimmung der Anzahl der Lebendzellen wurden 10 µl der Zellsuspension aus dem vorhergehenden Schritt mit 10 µl einer 0,2%-igen Trypanblaulösung (Sigma, Deisenhofen) versetzt. Hierbei nehmen tote Zellen eine dunkelblaue Färbung an, während lebende Zellen farblos bleiben. Die Auswertung erfolgte durch Auszählen in einer Zählkammer mit definiertem Volumen (Neubauer, 1 : 10⁴ ml). Die Menge der toten Zellen sollte 5% nicht überschreiten. Für die Gesamtzellzahl wurden die äußeren großen Quadrate der Kammer ausgezählt und die ermittelte Zellzahl mit dem Faktor 10 000 multipliziert. Anschließend wurde die Zellzahl in der Ausgangssuspension mit komplettem RPMI 1640 Medium auf 2,0 × 10⁶/ml eingestellt.

Beispiel 4 Untersuchung der mitogenen Wirkung der Fällungsfraktionen (Kaplan et al., J. Immunol. 132(1) (1984) 9-11)

Die Fraktionen aus Beispiel 2 wurden sterilfiltriert (Sarstedt Sterilfilter, 0,2 µm Porengröße) und von den sterilen Fraktionen jeweils Verdünnungen von 1 : 2 bis 1 : 32 mit PBS hergestellt.

Zur Bestimmung der mitogenen Aktivität der Ammoniumsulfat-Fäl­ lungsfraktionen wurde die DNA-Syntheserate von PBL in Anwesenheit unterschiedlicher Konzentrationen der Ammoniumsulfatfällungs­ fraktionen ermittelt. Als positive Kontrolle diente eine Phythaemagglutinin-P (PHA-P) Lösung mit einer Konzentration von 10 µg/ml, als Leerwert wurde PBS verwendet. Die DNA-Syntheserate wurde anhand des Einbaus von ³H-markiertem Thymidin bestimmt.

In 96 Loch-Flachboden-Mikrotiterplatten (Greiner, Frickenhausen) wurden jeweils 100 µl der Zellsuspension aus Beispiel 3 mit 100 µl der verdünnten Ammoniumsulfat-Fällungsfraktionen versetzt. Durch das Mischen wurden die Konzentrationen der Fällungsprodukte halbiert, so daß die Endkonzentratioen 1 : 2 bis 1 : 64 des Ausgangslösungen (2 mg/ml bis 62,5 µg/ml) betrugen. Pro Ver­ dünnung wurden drei Tests durchgeführt und die Ergebnisse gemittelt.

Die Mikrotiterplatten wurden für 4 Tage in einem Brutschrank bei 37°C in einer 5%-igen CO₂-Atmosphäre bei 100% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Anschließend wurde jede Kultur mit 0,5 µCi radio­ aktivem Thymidin (³H-Thymidin, Amersham, TRA 120) in einem Volumen von 5 µl RPMI 1640 versetzt und für weitere 24 Stunden inkubiert. Mit der Kontrolle und dem Leerwert wurde analog verfahren.

Nach Ablauf der Inkubationszeit wurden die Zellen mit einem Skatron Cellharvester (Flow Laboratories, Meckenheim, Deutsch­ land) geerntet und in Cellulosefiltern (Skatron) aufgefangen. Diese wurden in Szintillationsröhrchen überführt und für 60 Minuten in einem Trockenschrank bei 68°C getrocknet. Anschlie­ ßend wurden die Ansätze abgekühlt, mit 5 ml Szintillations­ flüssigkeit (Szinticocktail, Amersham) versetzt, für 10 Minuten geschüttelt und in einem β-Szintillationszähler die Radio­ aktivität als cpm (counts per minute) bestimmt.

Die Ergebnisse sind in Abbildung 3 graphisch dargestellt. Die größte Aktivierung der PBL wurde für die 10% Fraktion be­ obachtet. Bei einer Verdünnung von 1 : 2 wurde die DNA-Syn­ theserate gegenüber dem Leerwert um das 230-fache erhöht. Selbst für eine Verdünnung von 1 : 8 wurde noch eine 150-fache Zunahme der Proliferation beobachtet. Die 20, 30 und 70% Fraktionen führten bei einer Verdünnung von 1 : 2 zu einer 15-fachen Erhöhung der DNA-Syntheserate in PBL.

Der wachstumsstimulierende Effekt nahm nahezu linear mit der Konzentration ab. Eine Ausnahme bildet der Übergang von der 1 : 2 auf die 1 : 4 Verdünnung für die 10% Fraktion. Es ist zu vermuten, daß in diesem Bereich eine Sättigung des Systems vorlag oder die maximale Stimulierung der Syntheserate erreicht wurde.

Beispiel 5 Untersuchung der Zytokininduktion

Zur Untersuchung der Interleukin-6 und TNF-α Induktion durch die erfindungsgemäßen Ammoniumsulfat-Fällungsprodukte wurden PBL in Anwesenheit der Ammoniumsulfat-Fällungsprodukte inkubiert und anschließend die Zellkulturüberstände mittels eines "Enzym Linked Immuno Sorbent Assay" (ELISA) auf ihren Gehalt an Interleukin-6 und TNF-α hin untersucht. Als Negativkontrolle diente PBS, als Positivkontrolle wurde PHA-P in einer Konzentration von 10 µm/ml eingesetzt.

Zellsuspensionen gemäß Beispiel 3 (2,0 × 10⁶ Zellen/ml) wurden mit den Ammoniumsulfat-Fällungsprodukten versetzt (Endkonzen­ tration 2 mg/ml) und in 5 ml Kulturen nach üblichen Protokoll inkubiert.

Nach 4 Tagen wurden die Kulturen in 15 ml-Röhrchen überführt und die Zellen bei Raumtemperatur bei 1400 g abzentrifugiert. Die Überstände wurden in 500 µl Aliquots bei -70°C eingefroren und die Zellrückstände verworfen.

Zur Bestimmung von Interleukin-6 und TNF-α wurden Testkits der Firma Medgenix, Belgien verwendet (Immunoenzymetric assay kit for interleukin 6 bzw. human tumor necrosis factor alpha in serum, plasma and culture media; code 40 126 00 bzw. 40 175 00). Die Proben wurden langsam auf Eis aufgetaut und nach Hersteller­ angaben untersucht.

Die Ergebnisse sind in Abbildung 5 graphisch dargestellt. Sie zeigen, daß das Fällungsprodukt der 10% Fraktion den IL-6- Spiegel auf den 10-fachen Wert der Negativkontrolle erhöht. Das 20% Fällungsprodukt führte zu einer 6-fachen Zunahme der IL-6 Produktion. Geringe Zunahmen an IL-6 wurden zudem durch das 30% sowie das 70% Fällungsprodukt hervorgerufen.

Die TNF-α Produktion wurde durch das 10% Fällungsprodukt auf das 4-Fache und durch das 20% Fällungsprodukt auf das 5-Fache der Negativkontrolle erhöht.

In diesem Versuch fiel die Differenz zwischen der Negativ- und der Positivkontrolle ungewöhnlich niedrig aus, was vermuten läßt, daß PHA-P in diesem Versuchsaufbau nicht aktiv war.

Beispiel 6 Bestimmung des Proteingehalts der Fällungsprodukts (Schaffner et al., Anal. Biochem. 56 (1973) 502-514)

Die Bestimmung des Proteingehalts der Fällungsprodukte erfolgte nach der Amido-Schwarz-Methode, da diese auch in Anwesenheit höhere Zuckermengen zu verläßlichen Ergebnissen führt.

Um eine ausreichende Proteinmenge in den einzelnen Fraktionen zu gewährleisten, wurden die Lösungen der Ammoniumsulfatfraktionen aus Beispiel 2 vorgefällt. Hierzu wurden 2 ml der einzelnen Ammoniumsulfatfraktionen mit 8 ml eiskaltem Aceton versetzt und 30 Minuten auf Eis aufbewahrt. Anschließend wurden die Proben 30 Minuten bei 1400 g und 4°C zentrifugiert, die Pellets in einer Speed-Vac (Savant, Farmingdale, New York, USA) getrocknet und in 258 µl destilliertem Wasser resuspendiert.

Die so gewonnenen Lösungen wurden mit 30 µl Tris-Puffer (1 M Trizma-Base, pH 7,5; 1% Natriumdodecylsulfat (SDS)) versetzt und 5 Minuten bei 80°C inkubiert. Anschließend wurden die Ansätze bei 4°C auf höchster Stufe in einer Eppendorf Tischzentrifuge für Eppendorfgefäße sedimentiert und die Überstände zur Fällung von Proteinen mit jeweils 75 µl einer 50%-igen Trichloressig­ säure (TCA) versetzt. Die Mischungen wurden tropfenweise auf Nitrocellulosefilter (Schleicher und Schüll, BA 85) aufgebracht, der Überstand durch eine Glasfritte filtriert und die Filter mit 0,8 ml einer 6%-igen TCA gewaschen.

Anschließend wurden die Filter für 2 bis 3 Minuten in Amido- Schwarz-Lösung (0,1% Amido-Schwarz; 45% Methanol; 10% Essigsäure; 45% destilliertes Wasser) gefärbt, zweimal in Entfärberlösung (90% Methanol; 2% Essigsäure; 8% destilliertes Wasser) gewaschen, die Spots ausgeschnitten und in 1,5 ml Elutionslösung (25 mM NaOH; 0,05 mM EDTA; 50% Ethanol) für 10 Minuten geschüttelt. Die Eluate wurden in Reagenzgläser überführt und die optische Dichte bei 630 nm gegen Elutions­ flüssigkeit gemessen. Die Auswertung der Extinktionen erfolgt anhand einer Eichgeraden mit Rinderserumalbumin (BSA). Der Korrelationskoeffizient der Regressionsgeraden betrug 0,97. Sämtliche Meßwerte lagen im Bereich der Geraden.

Die Ergebnisse sind in Abbildung 6 graphisch dargestellt. 60% der detektierbaren Proteine waren in der 10% Fraktion enthalten, geringe Mengen an Proteinen fanden sich in der 20% und der 70% Fraktion. Im Überstand nach der Fällung mit 80% Ammoniumsulfat konnten mit dieser Methode keine Proteine nachgewiesen werden.

Beispiel 7 Bestimmung des Zuckergehalts der Ammoniumsulfat-Fällungsprodukte (Seifert et al., Arch. Biochem. 25 (1950) 191-200)

Die Bestimmung des Zuckergehalts der Ammoniumsulfatfraktionen erfolgte nach der Anthronemethode, welche den Gesamtzuckergehalt erfaßt.

Jeweils 2,5 ml der in PBS gelösten Ammoniumsulfat-Fällungs­ produkte (Konzentration: 4 mg/ml) wurden in hitzebeständige Röhrchen gegeben und in einem Eisbad gekühlt. Anschließend wurden die Lösungen mit 5 ml Anthronereagens (0,2% Anthrone, 95% H₂SO, 4,8% destilliertes Wasser) versetzt, die Ansätze gründ­ lich gemischt und mit Glasmurmeln verschlossen. Die Röhrchen wurden 10 Minuten in einem kochenden Wasserbad erhitzt und dann schnell abgekühlt. Im Anschluß daran wurde bei 620 nm die optischen Dichte gegen Wasser gemessen. Die Auswertung der Meßwerte erfolgte mit Hilfe einer Eichgeraden, die mit Glukose­ lösungen bekannter Konzentration erstellt wurde. Der Korrela­ tionskoeffizient der Regressionsgeraden betrug 0,998. Alle Meßwerte lagen im Bereich der Eichgeraden.

Die Ergebnisse sind in Abbildung 7 graphisch dargestellt. Sie zeigen, daß über 90% der Kohlenhydrate im Überstand nach Fällung mit 80% Ammoniumsulfat enthalten sind. Die durch Fällung mit 10% Ammoniumsulfat gewonnene Fraktion enthält etwa 4% der Gesamtpolysaccharidmenge. Die übrigen 6% der Polysaccharide verteilen sich etwa gleichmäßig auf die anderen Fraktionen.

Beispiel 8 Proteinabbau mit Proteinase K (W. Ebeling, Eur. J. Biochem. 47 (1974) 91-97)

5 ml Aliquots der Ammoniumsulfat-Fällungsprodukte (Beispiel 2, 4 mg/ml) sowie des Überstands nach Fällung mit 80% Ammoniumsul­ fat wurden mit Proteinase K (PK) (Sigma, Deisenhausen; gelöst in destilliertem Wasser) versetzt und für 24 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Konzentration des Enzyms betrug 0,01% (w/v).

Anschließend wurde das Enzym durch Zugabe des Enzyminhibitors Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) und zweistündige Inkubation bei Raumtemperatur inaktiviert, um negative Effekte der Proteina­ se K auf die folgenden Bioassays zu vermeiden. Die Konzentration des Inhibitors in den Proben betrug 1,0 mmol/l.

Nach der Inkubation wurde PMSF durch Dialyse gegen das 1000-fache Volumen destillierten Wassers entfernt (Visking Dialysis Tubing 20/30, Durchmesser 16 mm, Serva, Heidelberg), die dialysierten Proben wie in Beispiel 3 beschrieben sterilfiltriert und auf ihre Mitogenität getestet. Die Ergebnisse sind in Abbildung 7 graphisch dargestellt. Sie zeigen, daß die mitogene Aktivität der Ammoniumsulfat-Fällungsprodukte durch die Behandlung mit Proteinase K vollständig aufgehoben wird.

Als Kontrolle wurden analoge Versuche mit folgenden Lösungen durchgeführt:

K1: RPMI 1640 Medium
K2: PHA-P (10 µg/ml)
K3: PHA-P (10 µg/ml) + PK, dialysiert (0,01%)
K4: PK, dialysiert (0,01%)
K5: PMSF, dialysiert (1,0 mmol/l)
K6: PHA-P (10 µg/ml) + PK (0,01%) + PMSF, dialysiert (1,0 mmol/l)
K7: PK (0,01%) + PMSF, dialysiert (1,0 mM/l).

In Abbildung 8 sind die Ergebnisse der Kontrollexperimente graphisch darstellt.

RPMI 1640 Medium (K1) diente als Negativkontrolle. Hier ist keine Stimulierung der PBL zu erkennen.

Die Stimulierung der Zellen durch die Positivkontrolle PHA-P (K2) zeigt eine hohe ³H-Thymidineinbaurate.

Die Kontrolle bestehend aus mit Proteinase-K behandeltem und anschließend dialysiertem PHA-P (K3) zeigte, daß nahezu keine Stimulation der Zellen durch das mit Proteinase behandelte PHA-P erfolgt.

Die Inkubation mit dialysierter Proteinase-K (K4) allein zeigt, daß diese Substanz selbst keine stimulierenden Eigenschaften auf das Wachstum von PBL entfaltet und auch nicht toxisch auf die Zellen wirkt.

Gleiches gilt für PMSF (K5) sowie die Kombination aus Proteinase- K und PMSF (K7), die ebenfalls beide vorher dialysiert wurden.

Kontrolle K6 zeigt, daß die Stimulation von Zellen mit PHA-P in Gegenwart von Proteinase-K, die zuvor mit PMSF inaktiviert und anschließend dialysiert wurde, möglich ist. Damit kann ausge­ schlossen werden, daß es sich bei den beobachteten inhibitori­ schen Effekte um Artefakte handelt, die auf die Inkubation der Proteinase-K mit den Zellen zurückzuführen sind. Die leichte Verminderung der Aktivität von K6 im Vergleich zu K2 ist wahrscheinlich auf die Dialyse zurückzuführen. Da PHA-P als Lektin eine große Affinität zu Zuckern zeigt, kann eine Reaktion mit den Dialyseschläuchen und damit eine Verminderung der wirksamen Konzentration nicht ausgeschlossen werden.

Beispiel 9 Proteindenaturierung mit Aceton

Jeweils 2 ml der Lösungen der Ammoniumsulfat-Fällungsprodukte aus Beispiel 2 wurden mit 8 ml eiskaltem Aceton versetzt und 30 Minuten auf Eis aufbewahrt. Anschließend wurden die Mischungen für 30 Minuten bei 1400 g (Biofuge, Heraeus Christ) und 4° C zentrifugiert, das Pellet in der Speed-Vac getrocknet, in 2 ml destilliertem Wasser resuspendiert und gemäß Beispiel 3 die Mitoseaktivität bestimmt. Als Kontrolle dienten RPMI 1640 Medium und 80%-iges Aceton.

Die Ergebnisse sind in Abbildung 7 graphisch dargestellt. Die Behandlung mit Aceton führt mit Ausnahme der 10% Fraktion in allen Fällen zu einem völligem Verlust der Mitoseaktivität. Bei der 10% Fraktion ist eine, im Vergleich zur Kontrolle ver­ nachlässigbar kleine, Restaktivität zu bemerken.

Beispiel 10 Cytospinpräparationen

Zur Klassifizierung der in Beispiel 3 aktivierten Zellsub­ populationen wurden Cytospinpräparate hergestellt und einer Färbung nach Pappenheim sowie einer Färbung mit spezifischen Antikörpern gegen T-Zellepitope unterworfen.

Herstellung der Cytospinpräparate

Zur Herstellung von Cytospinpräparaten wurden gemäß Beispiel 3 PBL-Zellsuspensionen mit einer Zellzahl von 2,0 × 10⁶ Zellen/ml hergestellt.

In 96 Loch-Flachboden-Mikrotiterplatten (Greiner, Frickenhausen) wurden jeweils 100 µl der Zellsuspension aus Beispiel 3 mit 100 µl der verdünnten Ammoniumsulfat-Fällungsfraktionen aus Beispiel 2 (Konzentration: 4 mg/ml) versetzt und analog Bei­ spiel 3 jedoch ohne Zusatz von ³H-Thymidin inkubiert. Als positive Kontrolle fungierte PHA-P in einer Konzentration von 10 µg/ml, als Negativkontrolle wurde RPMI 1640 Medium verwendet.

Nach 4-tägiger Inkubation wurden die einzelnen Präparationen in mit Filtermatten versehene Cytospin-Zentrifugationseinheiten pipettiert und in einer Zytozentrifuge (Wilke und Witzel, Hamburg) bei 100 g und Raumtemperatur für 10 Minuten auf Objektträgern (OT) zentrifugiert. Die Objektträger wurden 48 Stunden bei Raumtemperatur getrocknet, in Aluminiumfolie gewickelt und bei -20°C bis zur Verwendung eingefroren.

Pappenheimfärbung

Um sicherzustellen, daß die Cytospinpräparate intakt waren und eine positive Clusterbildung auftrat, wurden die Objekträger nach der Pappenheimmethode gefärbt.

Die Pappenheim-Färbung erlaubt einen optischen Nachweis der Zellproliferation und erfolgte nach Standard-Bedingungen mit luftgetrockneten Präparaten gemäß Herstellerangaben (Merck, Darm­ stadt). Hierzu werden die Objektträger zuerst 5 Minuten in May- Grünwald-Lösung (Merck, Darmstadt) gefärbt, kurz in Wasser gespült und dann in einer im Verhältnis 1 : 10 mit Weis′scher Pufferlösung (490 mg Kaliumdihydrogenphosphat, 1140 mg Natriumdi­ hydrogenphosphat, dest. Wasser ad 1000 ml) verdünnten Giemsa- Lösung (Merck, Darmstadt) für 10 Minuten gegengefärbt. Anschlie­ ßend wurden die Objektträger gründlich mit Leitungswasser gespült, an der Luft getrocknet und mikroskopiert.

Lag eine positive Stimulierung vor, so zeigten die aktivierten Zellen nach der Färbung eine spezifische Clusterbildung. Bei nicht-aktivierten Zellen blieb die Clusterbildung aus.

Als positives Anzeichen für die Bildung von Clustern wurde eine lichtmikroskopisch sichtbare Auflockerung der Kernstruktur, eine Zusammenlagerung der Zellen, eine Vergrößerung der Kern-Plasma- Relation als Ausdruck einer erhöhten Mitoserate, sowie eine Zunahme der Vakuolisierung gewertet. Die Abbildung 9 zeigt beispielhaft aktivierte Zellen mit der typischen Bildung von Clustern, sowie Zellen, bei denen dieser Effekt ausblieb.

Die Ergebnisse der Pappenheim-Färbung sind in Tabelle 3 zusammen­ gefaßt. Es wird deutlich, daß eine Aktivierung der Clusterbildung von PBL insbesondere durch die bei Ammoniumsulfatkonzentrationen von 10 und 20% erhaltenen Fällungsprodukte zu beobachten ist. Die übrigen Fraktionen, insbesondere auch die aus dem Überstand gewonnene Fraktion zeigten keine Clusterbildung.

Als Positivkontrolle dienten PHA-P (T-Zellmitogen) und Lipopoly­ saccharid aus Zellwänden von E. coli (LPS, B-Zellmitogen). Beide Kontrollen zeigten die erwartete Clusterbildung.

Ammoniumsulfatkonzentration (Gew.-%)
Pappenheim-Färbung
10%
Clusterbildung
20%	Clusterbildung
30%	keine Clusterbildung
40%	keine Clusterbildung
50%	keine Clusterbildung
70%	keine Clusterbildung
80%	keine Clusterbildung
80% Ü	keine Clusterbildung
RPMI 1640 Medium	keine Clusterbildung
PHA-P	Clusterbildung
LPS	Clusterbildung

Beispiel 11 Alkalische Phosphatase Anti-Alkalische Phosphatase (APAAP) Färbung (Erber et al., Lancet 1(8385) (1984) 1042-1046)

Mit Hilfe der APAAP-Färbung lassen sich die Zellen des Immunsy­ stems anhand ihrer Oberflächenstrukturen mit monoklonalen Antikörpern markieren und optisch darstellen. Diese Methode erlaubt den zuverlässigen Nachweis von T-Helferzellen, die sich nach APAAP-Behandlung durch eine rötliche Anfärbung der Membran auszeichnen. "Nicht-T-Helfer-Zellen" besitzen keine CD4-Epitope und binden daher den CD4-spezifischen Primärantikörper der Färbung nicht. Somit erscheinen ihre Membranen nach der APAAP- Behandlung ungefärbt.

In diesen Untersuchungen wurden spezifische Maus-Anti-Mensch monoklonale Antikörper mit den Zellen der Cytospinpräparate inkubiert. Mittels eines Brückenantikörpers wurden Antikörper- Enzymkomplexe (APAAP) an die epitopenerkennenden Primärantikörper gebunden und anschließend im alkalischen Milieu (pH 8,2) die zur Farbreaktion führenden Azokopplung zwischen Naphthol-AS-MX- Phosphat und dem Diazoniumsalz Fast Red durchgeführt (Antikörper wurden von der Firma Dako und die Detektionsreagenzien von der Firma Sigma bezogen).

Für diese Färbung ist es besonders wichtig, die angegebenen Antikörper-Färbezeiten nicht zu unterschreiten. Die Inkubation in der Fixierlösung und in der Substratlösung darf auf keinen Fall überschritten werden.

Für die Färbung wurden die Cytospinpräparate bei Raumtemperatur langsam in der Alufolie über einen Zeitraum von etwa 60 Minuten aufgetaut und nach folgendem Protokoll behandelt:

1. Fixierung|1 min
2. Waschen in TBS	1 min
3. Inkubation mit Primärantikörper	30 min
4. Waschen in TBS	1 min
5. Inkubation mit Brückenantikörper	30 min
6. Waschen in TBS	1 min
7. Inkubation mit APAAP-Komplex	30 min
8. Waschen in TBS	1 min
9. Inkubation mit Brückenantikörper	10 min
10. Waschen in TBS	1 min
11. Inkubation mit APAAP-Komplex	10 min
12. Waschen in TBS	1 min
13. Substratinkubation	20 min
14. Waschen in TBS	1 min
15. Hämatoxylinfärbung	2 min
16. Spülen in Leitungswasser	2 min
17. Waschen in TBS	2 min
18. Spülen in Leitungswasser	2 min
19. Einbetten in Apathy′s mounting medium (WAK-Chemie, Bad Homburg)	2 min

Als Fixierlösung für APAAP wurde eine Mischung aus 95 ml abs. Aceton, 95 ml abs. Ethanol und 10 ml 37%igem Formalin verwendet.

Zur Herstellung der Hämatoxylinlösung wurden 5 g Hämatoxylin in 50 ml absolutem Ethanol gelöst. Gleichzeitig wurden 100 g Ammoniumaluminiumsulfat-12-Hydrat in 1000 ml destilliertem Wasser in der Hitze gelöst. Beide Lösungen wurden vereinigt und unter dem Abzug zum Sieden erhitzt. Nach dem Abkühlen wurde die Mischung mit 2,5 g gelbem Quecksilberoxid versetzt, unlösliche Bestandteile abfiltriert und 100 ml Eisessig zugefügt. Vor Gebrauch wurde die Färbelösung durch Filtration von Schwebstoffen befreit.

Die Primärantikörper wurden in einer Verdünnung an 1 : 10 mit TBS pH 7,6 eingesetzt. Pro Objektträger wurden 100 µl der verdünnten Lösung verwendet.

Die Brückenantikörper wurden in einer Verdünnung von 1 : 40 mit TBS, pH 7,6 eingesetzt. Das TBS wurde im Verhältnis von 1 : 4 mit humanem Serum vorverdünnt, um Kreuzreaktionen auszuschließen. Von dem gesamten Ansatz wurden 100 µl pro Objektträger eingesetzt.

Der APAAP-Komplex wurde in einer Verdünnung von 1 : 80 mit TBS pH 7,6 eingesetzt, pro Objektträger wurden 100 µl verwendet.

Nach dem Einbetten wurden die Präparate für mindestens 24 Stunden in horizontaler Lage getrocknet, bevor sie mit einer Ölemulsions­ linse im Mikroskop betrachtet werden konnten. Die vollständige Durchtrocknung der Präparate dauerte 14 Tage. Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 4 zusammengefaßt.

Eine Aktivierung der T-Helferzellen wurde für die 10% und 20% Fraktion der Ammoniumsulfatfällung in Form einer rötlichen Anfärbung der Membran beobachtet. Abbildung 10 zeigt beispielhaft ein Anfärbung von T-Helfer-Zellen durch die APAAP-Reaktion nach Stimulation mit dem 10% Fällungsprodukt im Vergleich zu nicht­ aktivierten PBL, die mit dem Rückstand inkubiert wurden, der aus dem Überstand nach Fällung mit 80% Ammoniumsulfat gewonnen wurde.

Ammoniumsulfatkonzentration (Gew.-%)
APAAP-Färbung
10%
T-Helferzell-Aktivierung
20%	T-Helferzell-Aktivierung
30%	keine Aktivierung
40%	keine Aktivierung
50%	keine Aktivierung
70%	keine Aktivierung
80+	keine Aktivierung
80% Ü	keine Aktivierung
RPMI 1640 Medium	keine Aktivierung
PHA-P	T-Helferzell-Aktivierung
LPS	keine Aktivierung

Als Negativkontrolle diente RPMI 1640 Medium, das erwartungsgemäß keine T-Zellstimulierung zeigte.

Als positive Kontrolle diente PHA-P als bekanntes T-Zellstimu­ lanz, das zu der charakteristischen Anfärbung der T-Helfer-Zell- Epitope führte. Das Lipopolysaccharid LPS führte als spezifischer Stimulator der B-Helfer-Zellreihe erwartungsgemäß zu keiner Aktivierung der T-Zellen und damit zu keiner Anfärbung der Epitope bei der APAAP-Methode. Unspezifische Anfärbungen sind bei diesem Versuchsaufbau somit ausgeschlossen.

Die Beispiele 10 und 11 zeigen eindeutig die spezifische Aktivie­ rung der T-Helferzeller durch die erfindungsgemäßen Ammoniumsul­ fatfällungsprodukte.

Beispiel 12 Charakterisierung der Proteine durch eindimensionale Gelelek­ trophorese (U. K. Laemmli et al., Nature 272 (1970) 680-685)

Zur weiteren Charakterisierung der Ammoniumsulfat-Fällungs­ produkte wurde diese einer SDS-(Natriumdodecylsulfat-)Poly­ acrylamid-Gelelektrophorese unterworfen. Mit dieser Methode können denaturierte Proteine nach ihrem Molekulargewicht getrennt werden. Das anionische Detergens SDS lagert sich an die Aminosäu­ ren an und verleiht den Proteinen so eine negative Ladung, die ihrer Sequenzlänge proportional ist. Auch wenn dieser Zusammen­ hang nur bedingt für Glykoproteine gilt, so ist dennoch eine Abschätzung der Molekulargewichte und der Anzahl der Proteine in den verschiedenen Fraktionen möglich.

Zur Gelektrophorese wurde ein diskontinuierliches Puffersystem eingesetzt, um ein scharfes Bandenmuster zu erhalten (Davis et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 121 (1964) 404-427; L. Ornstein, Ann. N.Y. Acad. Sci. 121 (1964) 321-349). Bei diesem Puffersystem unterscheiden sich der pH-Wert und die Ionenstärke des Gels von den Werten des Pufferreservoires.

Es wurde ein dreischichtiges Gel, bestehend aus Fußgel, Trenngel und Sammelgel gegossen. Das Fußgel diente zum Abdichten der Gießeinheit und wurde zur Erzielung einer schnellen Polymeri­ sation unter Verwendung einer hohen Konzentration an Radikal­ starter hergestellt. Als Trenngel diente ein 12 bis 15%-iges Gradientengel (29,2% (w/v) Acrylamid, 0,8% (w/v) Bisacrylamid) in 0,4 M Tris-HCl, pH 8,8 mit Zusatz von 0,1% (w/v) SDS. Als Sammelgel diente ein 4%-iges Acrylamidgel in 0,2 M Tris-HCl, pH 6,8, ebenfalls mit 0,1% SDS. Die Dicke der verwendeten Gele betrug 1,5 mm, die Trennstrecke 25 cm.

Die Ammoniumsulfatfällungsprodukte wurden für die Elektrophorese in 80%-igem Aceton vorgefällt. Hierzu wurden jeweils 1 ml der Fraktionen aus Beispiel 2 mit 4 ml eiskaltem Aceton versetzt, für 30 Minuten auf Eis aufbewahrt und zentrifugiert. Die erhaltenen Rückstände wurden in einer Speed-Vac getrocknet und in je 100 µl Probenpuffer (1000 µl 2,5 M Saccharose, 250 ml 2 M Trizma-Base pH 8,8, 25 µl 1%-ige Bromphenolblaulösung, 51,2 µl 200 mM EDTA- KOH pH 8,8, 250 µl 100 mM L-Methionin, 2,5 ml destilliertes Wasser; vor Gebrauch wurden 500 µl des Probenpuffers mit 50 µl 1 M Dithioerythritol (DTE) und 100 µl 10% (v/w) SDS versetzt) aufgenommen. Jeweils 25 µl der in Probenpuffer gelösten Proben wurden auf das Gel aufgetragen. Zur Größenabschätzung wurde mit einem Protein-Standard in gleicher Weise verfahren.

Die Elektrophorese erfolgte bei 200 V und 15 mA für 20 Stunden bei 4°C im Kühlraum.

Zur Sichtbarmachung der Proteine wurde die SDS-PAGE anschließend nach folgendem Protokoll einer Silberfärbung unterzogen. Das Gel wurde für die angegebenen Zeiten in den aufgeführten Lösungen aufbewahrt. Die Differenz zu 100% wurde jeweils durch destil­ liertes Wasser ausgeglichen.

Die Gel wurden anschließend im destilliertem Wasser aufbewahrt, photographiert und getrocknet.

Die Photographie des Gels ist in Abbildung 11 gezeigt. Aus der Abbildung wird deutlich, daß der Bereich der mit diesem Versuchs­ system detektierbaren Proteine zwischen 6,5 und 92,5 kDa liegt. In der 10% Fraktion der Ammoniumsulfatfällung wurden mindestens 15 verschiedene Proteinbanden beobachtet. Eine ähnlich hohe Zahl verschiedener Einzelproteine zeigt die gelelektrophoretische Auftrennung der 20% Fraktion. Es ist bemerkenswert, daß sich die Proteinbanden dieser beiden Fraktionen durch eine große Heteroge­ nität ihrer Molekulargewichte auszeichnen. In der 30% Fraktion und der 80% Fraktion sowie im Überstand nach Fällung mit 80% Ammoniumsulfat konnten mit dieser Methode keine Proteine nachgewiesen werden. Bei der für die 40% und die 70% Fraktion beobachtete Proteinbande mit einem Molekulargewicht von etwa 67 kDa handelt es sich wahrscheinlich um ein Färbeartefakt.

Beispiel 13 Zweidimensionale Gelelektrophorese

Zur genaueren Auftrennung der Proteine wurden die bei 10%, 20% und 70% Ammoniumsulfat erhaltenen Fraktionen einer zweidimen­ sionalen Gelelektrophorese unterworfen. Hierbei wurden die Proteine bzw. Glykoproteine im ersten Schritt nach ihrem isoelektrischen Punkt in einem pH-Gradienten und anschließend in einer zweiten Dimension durch SDS-PAGE aufgetrennt.

Die isoelektrische Fokussierung wurde in Glasröhrchen mit einem Durchmesser von 4 mm und einer Länge von 15 cm durchgeführt. Die Röhrchen wurden mit einer wäßrigen 3,5%-igen Acrylamidlösung gemäß folgender Zusammensetzung gefüllt:

7,5 M Harnstoff
3,5% Acrylamid/Bisacrylamid
2,5% CHAPS* (10% in Wasser)
8% Ampholyte (20% Ampholyte pH 2-11, 80% Ampholyte 5-7)

* 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propan­ sulfonat Hydrat

Die Mischung wird bei 40 mbar für 40 Minuten entgast und anschließend mit:

20 µl Ammoniumpersulfat und
10 µl N,N,N′,N′-Tetramethyleethylendiamin (TEMED)

versetzt. Zur Polymerisation werden die Röhrchen mit einer 6,5 M Harnstofflösung überschichtet.

Nach ca. 2 Stunden wurde der Harnstoff vorsichtig mit einer Injektionsspritze entfernt und das Gel zur Equilibrierung mit Harnstoff-Kaliumcarbonat-SDS-Puffer (UKS) mit der folgenden Zusammensetzung überschichtet:

9,5 M Harnstoff
5 mM Kaliumcarbonat
1,25% SDS (v/w)
0,5% Dithiothreitol (DTT; v/v)
6,0% CHAPS (v/v)
1,0% Ampholyte 3-10 (v/v)
4,0% Ampholyte 5-7 (v/v) in destilliertem Wasser.

Nach mindestens 1-stündiger Equilibrierung wurden die Röhrchen in eine 2D-Elektrophoresekammer eingespannt (Biometra, Göttin­ gen). Der pH-Gradient in den Glasröhrchen nach der Equilibrierung betrug pH 2 bis pH 11. Im Verlauf der isoelektrischen Fokussie­ rung stellt sich ein pH-Gradient von 3,4 bis 7,6 in den Röhrchen ein. Dieser Wert wurde mit einem Teströhrchen ohne Probenmaterial ermittelt.

Für die isoelektrische Fokussierung wurden je 2 ml der Ammonium­ sulfatfällungsprodukte aus Beispiel 2 mit 8 ml Aceton wie in Beispiel 12 beschrieben gefällt, die Rückstände in je 100 µl UKS aufgenommen und jeweils auf ein Röhrchen aufgegeben. Danach wurden die Röhrchen mit 30 µl einer 7,0 M Harnstofflösung mit einem Gehalt von 1% (v/v) Ampholyte überschichtet. Anschließend werden die Laufpuffer in die Kammern der Elekrophoreseeinheit gefüllt. Als Anodenpuffer diente 0,01 M Phosphorsäure und als Kathodenpuffer 0,02 M Natronlauge.

Die isoelektrische Fokussierung erfolgte nach folgendem Proto­ koll:

200 V  0,5 h
500 V 13 h
800 V  2 h.

Anschließend wurden die Gradientengele aus den Röhrchen befreit, für mindestens 1 Stunde bei -20°C eingefroren und danach für 2 × 3 Minuten in einem Puffer mit der folgenden Zusammensetzung equilibriert:

0,5 M Trizma-Base pH 6,8
2% SDS
65 mM DTE
6 M Harnstoff
30% (w/v) Glycin
260 mM Jodacetamid in destilliertem Wasser.

Die equilibrierten Gele wurden in einer zweiten Dimension über ein 12%-iges SDS-Polyacrylamidgel mit einer Trennstrecke von 25 cm weiter aufgetrennt. Hierzu wurden sie mit Agarose auf dem 4% Sammelgel befestigt. Die Elektrophorese erfolgte bei konstanter Spannung mit 15 mA für 20 Stunden im Kühlraum bei 4°C. Nach der Elektrophorese wurden die Gele wie in Beispiel 12 beschrieben einer Silberfärbung unterworfen. Die SDS-PAGE erfolgte in einem Molekulargewichtsbereich von 12,5 bis 92,5 kDa.

Die isoelektrische Fokussierung der 10% Fraktion (Abbildung 12) ergab, daß sich diese aus mindestens 100 verschiedenen Proteinen in wahrscheinlich unterschiedlichen Konzentrationen zusammen­ setzt.

Die Auftrennung der 20% Fraktion ergab ebenfalls eine große Anzahl von Proteinen, die gleichermaßen hinsichtlich ihres Molekulargewichts und ihres isoelektrischen Punkts charak­ terisiert wurden.

Abbildung 12 zeigt, daß die Badenmuster der 10 und der 20% Fraktion nur zu einem geringen Anteil übereinstimmen. Dieser Anteil ist für eine weitere Analyse der biologisch wirksamen Proteinen von besonderem Interesse.

Die Auftrennung der 70% Fraktion (Abbildung 14) zeigte einen wesentlich geringeren Anteil von Einzelproteinen. Das Ver­ teilungsmuster hat nur wenig Ähnlichkeit mit dem der 10% oder der 20% Fraktion. Nur einzelne Banden stimmen mit Banden aus der 10% bzw. 20% Fraktion überein. Darüberhinaus konnten Protein­ banden nachgewiesen werden, die weder in der 10%, noch in der 20% Fraktion auftraten.

Bei dem derzeitigen Kenntnisstand, kann davon ausgegangen werden, daß die in allen drei der untersuchten Fällungsfraktionen auftretenden Proteine bzw. Glykoproteine maßgeblich für die biologische Wirksamkeit der Fällungsfraktionen verantwortlich sind. Die diesen Banden entsprechenden Proteine bzw. Glyko­ proteine sind daher ein bevorzugter Gegenstand der vorliegenden Erfindung.

Claims (9)

1. Proteine enthaltende Komponente aus Thujapflanzen, erhält­ lich durch

• (a) Extrahieren der zerkleinerten und mit organischen Lösungsmitteln gereinigten oberirdischen Thujapflan­ zenteile mit einem alkalischen wäßrigen Lösungsmittel,
• (b) Versetzen des Extrakts mit einem organischen Lösungs­ mittel, um Polysaccharide und Protein aus dem Extrakt auszufällen,
• (c) Abtrennen des Niederschlags und Lösen des Nieder­ schlags in Wasser bei Temperaturen unterhalb der Raum­ temperatur,
• (d) Ansäuern der Lösung, um die Proteine auszufällen,
• (e) Abtrennen des Niederschlags und Versetzen des Über­ stands mit einem organischen Lösungsmittel,
• (f) Dialysieren des Niederschlags und anschließendes Trocknen,
• (g) Lösen des getrockneten Rückstands in Wasser und Zugabe von Ammoniumsulfat bis die Endkonzentration des Ammoniumsulfates in der Gesamtlösung 10 bis 70 Gew.-% beträgt, um Proteine auszufällen,
• (h) Dialysieren des Niederschlags und anschließendes Trocknen.

2. Komponente nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in Stufe (g) der getrocknete Rückstand in Wasser gelöst, die Lösung fraktioniert mit Ammoniumsulfat versetzt wird und die bei den jeweiligen Ammoniumsulfat-Konzentrationen aus­ fallenden Proteine vor der erneuten Zugabe von Ammoniumsul­ fat isoliert und getrennt in Stufe (h) eingesetzt werden, um die einer bestimmten Fraktion entsprechende Komponente zu gewinnen.

3. Komponente nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Ammoniumsulfat-Konzentration in Schritten von 10 Gew.-% erhöht wird und die bei Ammoniumsulfat-Konzentrationen von 10, 20 und/oder 70 Gew-% ausfallenden Proteine isoliert werden.

4. Komponente nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge­ kennzeichnet, daß in Stufe (a) Thuja occidentale L. ver­ wendet wird.

5. Komponente nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein Teil der Proteine Glykoproteine sind.

6. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es die Komponente aus Thujapflanzen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 als aktiven Wirkstoff enthält.

7. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß es die Komponente aus Thujapflanzen gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5 in Kombination mit pharmazeutisch verträglichen Hilfs- und Trägerstoffen, enthält.

8. Verwendung eines Arzneimittels nach den Ansprüchen 6 und 7 zur Behandlung von Immun- oder Knochenmarksdepressionen.

9. Verwendung eines Arzneimittels nach den Ansprüchen 6 und 7 zur Behandlung von endogenen und erworbenen, einschließlich viren- und strahlungsinduzierten Immundefekterkrankungen.