DE4429735C2

DE4429735C2 - Pflanzlicher Redoxkatalysator, Mittel zur Behandlung immunbiologischer Zellbelastungsschwächen und Verfahren zu dessen Herstellung

Info

Publication number: DE4429735C2
Application number: DE19944429735
Authority: DE
Inventors: Jhr George J Reuchlin
Original assignee: MEPAT Ltd
Current assignee: JENTSCH, GERALD, DR., 82152 PLANEGG, DE
Priority date: 1994-08-22
Filing date: 1994-08-22
Publication date: 1996-10-02
Anticipated expiration: 2014-08-23
Also published as: WO1996005849A1; DE4429735A1; AU3471695A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstel lung eines pflanzlichen Redoxkatalysators (Mittels), das mit tels dieses Verfahrens gewonnene Mittel sowie die Verwendung dieses Mittels zur Behandlung immunbiologischer Zellbela stungsschwächen, wie z. B. AIDS und verschiedene maligne Ent artungen.

Bekannt ist, pflanzliche Präparate verschiedener Herkunft zur Behandlung von Immunschwächen einzusetzen. Abgesehen von Ein zelvorschlägen zur Verwendung von bekannten Pflanzenauszügen (-extrakten) oder von Pflanzeninhaltsstoffen, z. B. von Echina cea, wurden auch bereits Extrakte von Ligninarten zur Behand lung von viralen Infektionskrankheiten (DE-A 40 17 091) vor geschlagen, deren Wirkungsmechanismus auf einem Redoxsystem zu beruhen scheint (Naturheilpraxis 12, 1988, Seiten 1496-1502).

Es wurde nun gefunden, daß ein vermutlich auf einem Redox- Katalysatorsystem beruhender Extrakt aus verschiedenen Pflanzen, nämlich aus Blättern der Geranie (Pelargonium odoratissi mum), des Wacholder (Juniperus communis), der Myrrhe (Commi phora abyssinica, C. molmol, C. schimperi) und/oder der Nelke (Eugenia caryophyllata), Wirkungen aufweist, die wegen der vielfältigen Einwirkungen auf immunbiologische Zellbelastungs schwächen (Zellimmunschwächeerscheinungen) eine große thera peutische Bedeutung hat.

Insbesondere sind positive Einwirkungen auf Herzmuskelnekro sen, auf toxisch induzierten Enzymaustritt aus Leberzellen, auf gewisse Krebsformen und auch auf Immunzellen (und damit speziell auf die durch HIV verursachte Immunschwächekrankheit AIDS) zu beobachten.

Allgemein formuliert stellen Redox-Katalysatoren Wirkstoffe dar, die auf Grund ihrer biochemischen Eigenschaften in der Lage sind, unmittelbar und auf physiologische Weise in die in trazelluläre Stoffwechsel-Regulation einzugreifen. Von diesen Stoffwechsel-Regulatoren am interessantesten sind solche, die die allgemeine Adaptationsleistung der Zelle erhöhen können. Biochemisch gesehen bedeuten Stoffwechseländerungen jedoch Um bauten von Biomolekülen und damit letztlich Elektronenübergän ge zwischen Molekülen und Molekülsystemen. Hierbei steigt die Belastbarkeit der Zelle (Anstieg der Belastungstoleranz), ohne daß belastungsbedingte Mikrotraumen (z. B. Veränderungen an Zellorganellen) resultieren. Ein auf diese Weise wirksames Mittel grenzt sich von verwechselbaren Verbindungen wie Hor monen, unspezifischen Reizkörpern, Chemotherapeutika usw. prinzipiell ab.

Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung eines pflanzlichen Redoxkatalysators bereitzustellen.

Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen nach diesem Verfahren erhältlichen pflanzlichen Redoxka talysator (ROK) bereitzustellen.

Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen, die diesen pflanzlichen Redoxkatalysator als Wirk stoff enthält.

Schließlich besteht eine vierte Aufgabe der vorliegenden Er findung darin, die Verwendung dieses pflanzlichen Redoxkataly sators (Mittels), insbesondere in Kombination mit Zidovudin (AZT), zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von immunbiologischen Zellbelastungsschwächen (z. B. AIDS und ver schiedene Krebsformen) bereitzustellen.

Bei dem erfindungsgemäßen, pflanzlichen Redoxkatalysator (Mit tel) handelt es sich um ein bifunktionelles Molekülsystem, d. h. das erfindungsgemäße Mittel enthält sowohl katabol- wie anabolaktive Systemanteile, die Redoxveränderungen in der Zelle katalysieren. Die besondere Bedeutung des erfindungs gemäßen Mittels besteht nun darin, daß es in der Lage ist, bei Vorhandensein von Streß, traumatischen Veränderungen, Entzün dungen, Infektionen sowie malignen Entgleisungen des Gewebes über Redox-Vorgänge normale, physiologische Zustände zu erzeu gen, was zu einem raschen Abklingen der Stoffwechselentglei sung führt (Heilungsvorgang).

Hierbei erfolgt gleichzeitig eine Stimulierung des Immunsy stems über eine verstärkte Aktivierung der T- und B-Zellen, die sich direkt und durch einen Konzentrationsanstieg von Zy tokinen wie Interleukin 2 (IL-2), Interleukin 3 (IL-3), Inter leukin 6 (IL-6) und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-alpha) nach weisen läßt. Diese Zytokine sind bekannt als induzierbare zel luläre Proteine mit zentraler Bedeutung bei embryonalen Ent wicklungsvorgängen, bei Entzündungsabläufen und bei Immunregu lationsvorgängen.

Für die therapeutische Verwendung des ROK eignen sich i.v. Injektionen ganz besonders, es können jedoch auch eine andere Form der parenteralen (intraperitoneale, s.c. injizierte) oder eine orale Verabreichung erfolgen. Als geeignete Dosis werden je nach Form der Verabreichung 1-30, bevorzugterweise 5-20, besonders bevorzugterweise 10-20, mg ROK/Tag und Patient verwendet. Die zu verabreichende Dosis hängt weiterhin natür lich auch von dem Allgemeinzustand der Patienten ab: bei be reits fortgeschrittenem Zustand der Krankheit wie z. B. AIDS und desolatem Allgemeinzustand des Patienten muß die Dosis gegebenenfalls (auf z. B. 2-5 oder 10 mg) reduziert werden, um eine zu hohe Autointoxikation durch Aktivierung des Stoff wechsels zu vermeiden.

Insbesondere wurden diese oben beschriebenen Wirkungen des ROK an in-vitro-Modellen von Leukozyten- und Fibroblastenkulturen gezeigt. Eine antivirale Wirkung des erfindungsgemäßen Mittels ließ sich an mit FV (Friend-Virus) infizierten Kulturen sowohl ohne als auch in Kombination mit Zidovudin (AZT) nachweisen. Damit ist eine therapeutische Anwendung bei z. B. HIV-infizier ten Patienten mit hoher Wirkung bei gleichzeitig niedriger Toxizität gegeben.

Ausgangsprodukt für den erfindungsgemäßen Redoxkatalysator (ROK) sind Blätter von der Geranie (Pelargonium odoratissi mum), der Nelke (Eugenia caryophyllata), der Myrrhe (Commi phora abyssinica, C. molmol, C. schimperi) und/oder des Wa cholder (Juniperus communis). Die Blätter werden zerkleinert und in Wasser aufgeschlämmt. Die Suspension wird mit Alkali lauge auf einen pH-Wert von 9 bis 11 eingestellt und dann 48 Stunden lang bei 45-50°C, vorteilhafterweise bei ziemlich genau 48°C, gerührt. Dann folgen eine Grobfiltration und eine Dialyse der resultierenden Lösung gegen eine Pufferlösung mit einem pH von 6-7. Ausfallende Partikel werden durch Zentri fugation entfernt. Der erhaltene Überstand wird zunächst mit tels Chromatographie an Kieselgel oder Aluminiumhydroxid ge reinigt, dann zweimal ultrafiltriert, so daß Moleküle mit ei nem Molekulargewicht von weniger als 5000 und mehr als 30 000 abgetrennt werden. Das Filtrat enthält den erfindungs gemäßen Redoxkatalysator (ROK). Es wird gegen 0,9% NaCl dialy siert, auf die gewünschte Konzentration (z. B. 1 mg/ml) an ROK gebracht und steril filtriert.

Beispiele Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels Beispiel 1

1. Zur Verwendung kommen gleiche Gewichtsanteile von frischen oder getrockneten Blättern aller oben genannten Pflanzen (Ge ranie, Nelke und Wacholder). Die in dieser Mischung enthaltene Wirkstoffkonzentration (Konzentration des ROK) variiert von 0,1-2 Gew.%.
2. 100 g des zerkleinerten Blattgemisches werden in ca. 1000 ml entmineralisiertem Wasser aufgeschlämmt. Es erfolgt mit Al kalilauge, NaOH oder KOH, eine Einstellung auf einen pH im Be reich von 9-11. Das Gemisch wird für 48 Std. unter ständigem Rühren bei einer Temperatur von 48°C gehalten. Anschließend werden die verbliebenen Feststoffe durch Grobfiltration ent fernt und verworfen.
3. Die so erhaltene Lösung wird durch Dialyse gegen eine Standard-Phosphat-Pufferlösung auf pH 6,8 eingestellt. Da bei diesem Schritt eine Reihe von unspezifischen Feststoffen (Pflanzenproteine bzw. -proteide) ausfallen, er folgt ein erster Reinigungsschritt durch Klarzentrifugation bei 1000-3000×g.
4. Die weitere Reinigung des klaren Überstandes erfolgt zu nächst mittels Chromatographie an Kieselgel oder Aluminiumhy droxid, dann durch zweistufige, fraktionierte Ultrafiltration mit AMICON®-Membranen; in dem ersten Schritt werden gegen eine 5000 Dalton-Membran alle Biomoleküle kleiner als 5000 abgetrennt und verworfen; Abtrennmedium ist die oben erwähnte Phosphat-Pufferlösung. Der zweite Filtrationsschritt erfolgt durch eine Membran mit Molekulargewichtsabtrennung größer gleich 30 000. Das klare Filtrat enthält das erfin dungsgemäße aktive Mittel als Molekülverbundsystem mit einem Molekulargewichtsspektrum von 5000-30 000.
5. Die so gereinigte Lösung des erfindungsgemäßen Redoxkataly sators wird gegen eine 0,9%ige NaCl-Lösung dialysiert und auf eine Konzentration von 1 mg/ml eingestellt. Zur Ermittlung der Wirkstoffkonzentration finden fluorimetrische Standardverfah ren Anwendung; das Fluoreszenzanregungsspektrum der Wirksub stanz (des ROK) liegt bei einer Wellenlänge von 450 nm.
6. Es erfolgt Sterilfiltration durch ein Membranfilter mit 0,2 µm Porenweite und abschließendes Ampullieren in 1-ml-Ampullen.

Beispiel 2

1. Die Schritte 1-3 werden wie bei Beispiel 1 durchgeführt.
2. Es erfolgt die Abtrennung der Moleküle kleiner als 5000 durch die entsprechende Ultrafiltrationsmembran, wie es im ersten Beispiel in Schritt 4 beschrieben worden ist. Bei der so vorgereinigten Lösung erfolgt nun die Abtrennung der Moleküle größer als 30 000 in einer Ultrazentrifuge für 10-11 Stunden bei 50 000×g.
3. Wie in Beispiel 1 folgen abschließend die Schritte 5 und 6.

Beispiele 3 und 4

Die Schritte 1-6 werden wie bei Beispiel 1 durchgeführt, außer daß in Beispiel 3 nur Geranien-, in Beispiel 4 nur Wacholder- Blätter verwendet werden.

Eigenschaften des erfindungsgemäßen Mittels (ROK) Beispiel 5 Zytotoxizität in vitro und in vivo

In Monolayerkulturen von Mus-dunni-Maus-Fibroblasten konnte die zytotoxische Dosis (CD₅₀) ermittelt werden, bei der 50% der Zellen absterben. Sie beträgt 23 µg/µl.

Tabelle 1

Grundsätzlich steigt die Überlebensrate der Zellen mit sinken der Konzentration des Wirkstoffes stetig an. Bei der Ermitt lung der Überlebensrate treten in der Praxis jedoch methodi sche Schwierigkeiten dahingehend auf, daß eine statistische Zählung (die Zellen aus einem Tropfen Zellkultur werden auf eine Neubauer-Zählkammer aufgetragen, die 4 Quadranten unter einem Mikroskop ausgezählt und so die Zahl der Zellen pro ml bzw. Liter hochgerechnet) der Zellen unter dem Mikroskop er folgt, wobei die Variationsbreite der Zellzahlen in den ver schiedenen Kulturflaschen in der Praxis relativ hoch sein kann. Dies ist eine Erklärung für die in der Tabelle 1 fehlen de Stetigkeit. Allerdings zeigen die Werte in Tabelle 1, daß die Überlebensrate mit der Wirkstoff-Konzentration korreliert, auch wenn sich unter den Werten einzelne "Ausreißer" (z. B. 29% bei 32 µg/µl) befinden.

Die letale Dosis LD₅₀, d. h. die Dosis, bei der 50% der Ver suchstiere sterben, wurde in SCID-Mäusen ermittelt. Sie be trägt bei intraperitonealer Verabreichung 1024 mg/kg Körperge wicht.

Beispiel 6 Immunologische Effekte

Immunologische Wirkungen des erfindungsgemäßen Mittels wurden sowohl in einer definierten Zellinie (L-929, NCTC clone 929 der ATCC) als auch an Kulturen menschlicher, peripherer Lym phozyten von gesunden Probanden ermittelt.

1. L-929-Zellkultur

Eine signifikante Erhöhung der Lipopolisaccharid (LPS)-indu zierten Blastogenese sowie eine leichte Erhöhung der Aktivität der natürlichen Killerzellen (NK) wurde bei einer optimalen Wirkstoffkonzentration von 0,32 mg/ml festgestellt.

Tabelle 2

2. Human-Lymphozytenkulturen

Von Probanden werden 5 ml venöses Vollblut entnommen, mit Hepa rin stabilisiert und die buffy-coat-Fraktion mit Ringer-Lösung pH 7,2 in 5 ml-Einmalplastik-Zellkulturflaschen (FALCON) für 72 Stunden bei 37°C inkubiert. Pro Kultur erfolgt die Zugabe des erfindungsgemäßen Wirkstoffes (ROK) zu einer Endkonzentration von 0,32 mg/ml. Es wird die Konzentrationszunahme (in pg/ml) verschiedener Zytokine (IL-2, IL-3, IL-6 und TNF-alpha, As say-Mikrotiterplatten DIANOVA) im Vergleich zu Probandenkon trollen ohne Wirkstoffzugabe untersucht. Die Ergebnisse (siehe Tabellen 3-6) zeigen eine durch den Wirkstoff bedingte star ke Zytokinexpression als spezifische Immunwirkung.

Tabelle 3

Induktion von IL-2 durch ROK

Tabelle 4

Induktion von IL-3 durch ROK

Tabelle 5

Induktion von IL-6 durch ROK

Tabelle 6

Induktion von TNF-α durch ROK

Beispiel 7

In-Vitro-Effekt der Kombination des Redoxkatalysators ROK mit AZT an mit Friend-Virus (FV) infizierten Maus-Fibroblasten- Kulturen.

Verwendung findet eine Monolayer-Kultur von Mus-dunni- Maus-Fibroblastenzellen nach 18stündiger Kulturdauer, bei der zunächst die Infektion mit Friend-Virus vorgenommen wird. Drei Stunden später werden nachfolgend aufgeführte Substanzkombina tionen in die Kultur eingebracht:

Experiment 1
AZT allein in Konzentrationen von 1, 0.1, 0.01, 0.001 µg/ml Kulturmedium

Experiment 2
ROK allein in Konzentrationen von 320, 100, 32, 10, 3.2, 1.0, 0.32 mg/ml Kulturmedium

Experiment 3
ROK in allen Konzentrationen aus Exp. 2 zusam men mit 1 µg AZT/ml Kulturmedium

Experiment 4
ROK in allen Konzentrationen aus Exp. 2 zusam men mit 0.1 µg AZT/ml Kulturmedium

Experiment 5
ROK in allen Konzentrationen aus Exp. 2 zusam men mit 0.01 µg AZT/ml Kulturmedium

Experiment 6
ROK in allen Konzentrationen aus Exp. 2 zusam men mit 0.001 µg AZT/ml Kulturmedium

Zusammenfassend ergeben sich nachfolgend beschriebene Resul tate, die auf Grund von verschiedenen Versuchsreihen erhalten wurden (Tabellen 7 bis 10). Dabei traten bei den verschiedenen Versuchsreihen Schwankungen der Meßwerte von bis zu ±15% auf.

1. Werden die Zytotoxizitäten, die beide Mittel/Substanzen (ROK, AZT) jeweils allein auf die Zellkultur ausüben, mit der Zytotoxizität verglichen, die durch gemeinsame Verwendung bei der Substanzen (ROK, AZT) an Zellkulturen beobachtet werden kann, läßt sich eine stark antagonistische Wirkung der beiden Substanzen erkennen (AZT allein ist sehr toxisch). Mit anderen Worten, die Kombination von AZT und ROK ergibt eine weit ge ringere Toxizität (optimale Konzentrationen beider Substanzen: 10 µg/µl ROK; 0.01 µg/ml AZT) als bei den allein verwendeten Substanzen in jeglicher Konzentration (bzgl. der genaueren Definition von "Antagonismus" und seiner Quantifizierung wird auf Berenbaum, M.C., J. Infect. Dis. 137, 122 (1978) verwie sen, der den sog. Fraktionellen Inhibitions-Konzentrations index (FIC) wie folgt definiert:

mit
FIC < 0,5: signifikant synergistische Wirkung
0,5 < FIC < 0,9: synergistische Wirkung angedeutet
FIC = 1: additive Wirkung
1,1 < FIC < 1,9: potentiell antagonistische Wirkung
FIC < 2: (stark) antagonistische Wirkung

2. AZT allein hat den höchsten FV-Inhibitionseffekt mit einer die Bildung von Foci zu 50% inhibierenden Dosis (ED₅₀) von 0,0079 µg/ml. ROK allein hat einen geringeren FV-Inhibiti onseffekt (ED₅₀ = 10,8 µg/µl).

3. In Kombination beider Wirksubstanzen werden optimale FV- Hemm-Effekte erzielt bei 0.01 µg/ml AZT zusammen mit 10-32 µg/µl ROK (63-84% Hemmung), die höher sind als bei den Wirk substanzen allein. Gleichzeitig ist die Zytotoxizität bei die sen Konzentrationen niedriger als bei der Verwendung der Ein zelsubstanzen.

Tabelle 7

Zytotoxische Effekte an Mus-dunni-Kulturen durch Kombination von ROK und AZT

Tabelle 8

Friend-Virus-Hemmung in Mus-dunni-Zellen durch Kombination von ROK und AZT

Tabelle 9

Zytotoxische Effekte an Mus-dunni-Kulturen durch Kombination von ROK und AZT

Tabelle 10

Friend-Virus-Hemmung in Mus-dunni-Zellen durch Kombination von ROK und AZT

Die CD₅₀- und ED₅₀-Werte wurden an Hand der Versuchsreihen wie folgt ermittelt (Angaben in µg/ml ROK bzw. µg/pl AZT bei den nachfolgend aufgeführten AZT- bzw. ROK-Konzentrationen):

Tabelle 11

ED₅₀-Werte für ROK in µg/µl bei folgenden AZT- Konzentrationen

Tabelle 12

CD₅₀-Werte für ROK in µg/µl bei folgenden AZT- Konzentrationen

ED₅₀-Werte für AZT in µg/ml bei folgenden ROK-Konzentrationen
ROK-Konzentration (µg/µl)
ED₅₀
0
0,0079
320	<0,001
100	0,000025
32	0,00037
10	0,0032
3,2	0,0085
1,0	0,01
0,32	0,011

CD₅₀-Werte für AZT in µg/ml bei folgenden ROK-Konzentrationen
ROK-Konzentration (µg/µl)
CD₅₀
0
5
320	0,014
100	5
32	0,5
10	0,9
3,2	10
1,0	70
0,32	70

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines pflanzlichen Redoxkatalysators (ROK), gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

(i) Blätter der Geranie (Pelargonium odorantissimum), der Nelke (Eugenia caryophyllata), der Myrrhe (Commiphora abyssinica, C. molmol, C. schimperi) und/oder des Wacholders (Juniperus communis) zu zerkleinern und in Wasser aufzuschlämmen;
(ii) die erhaltene Suspension mit Alkalilauge auf einen pH- Wert von 9-11 einzustellen, bei 45-50°C 48 Stunden zu rühren und anschließend grob zu filtrieren;
(iii) das Filtrat mittels Dialyse auf einen pH-Wert von 6-7 einzustellen und dabei ausfallende Partikel abzuzentrifugieren;
(iv) den so erhaltenen Überstand an Kieselgel oder Aluminiumhydroxid zu chromatographieren;
(v) die Moleküle mit einem Molekulargewicht von kleiner 5000 und größer 30 000 mittels Ultrafiltration zu entfernen; und
(vi) das die Fraktion mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 30 000 enthaltende Filtrat gegen 0,9%ige NaCl-Lösung zu dialysieren und abschließend steril zu filtrieren.

2. Pflanzlicher Redoxkatalysator (ROK), erhältlich nach dem Verfahren gemäß Patentanspruch 1.

3. Der pflanzliche Redoxkatalysator (ROK) gemäß Patent anspruch 2, wobei als Blätter die Blätter der Geranie (Pel argonium odoratissimum), die Blätter der Nelke (Eugenia caryophyllata), die Blätter des Wacholder (Juniperus com munis) und die Blätter der Myrrhe (Commiphora abyssinica, C. schimperi, C. molmol) verwendet werden.

4. Der pflanzliche Redoxkatalysator (ROK) gemäß Patentan spruch 2 oder 3, wobei die Temperatur im Schritt (ii) 48 Stunden lang bei 48°C gehalten wird.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend den pflanzli chen Redoxkatalysator (ROK) gemäß einem der Patentan sprüche 2 bis 4 sowie gegebenenfalls einen geeigneten Träger oder Verdünner.

6. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Patentanspruch 5, zusätzlich enthaltend Zidovudin (AZT).

7. Verwendung des pflanzlichen Redoxkatalysators (ROK) gemäß einem der Patentansprüche 2 bis 4 zur Prophylaxe und/oder Behandlung von immunbiologischen Zellbelastungsschwächen.

8. Die Verwendung des pflanzlichen Redoxkatalysators (ROK) gemäß einem der Patentansprüche 2 bis 4 zur Behandlung der immunbiologischen Zellbelastungsschwäche Krebs.

9. Die Verwendung des pflanzlichen Redoxkatalysators (ROK) gemäß einem der Patentansprüche 2 bis 4 zur Behandlung der immunbiologischen Belastungsschwäche AIDS.

10. Die Verwendung des pflanzlichen Redoxkatalysators (ROK) gemäß einem der Patentansprüche 2 bis 4 zur Behandlung einer immunbiologischen Belastungsschwäche gemäß einem der Patentansprüche 7 bis 9 zusammen mit AZT.

11. Die Verwendung gemäß Patentanspruch 10, wobei der pflanz liche Redoxkatalysator (ROK) und AZT in einem Gewichts verhältnis von 100 000 : 1 bis 5 000 000 : 1 verwendet werden.