WO1996005849A1 - Mittel zur behandlung immunbiologischer zellbelastungsschwächen und verfahren zu dessen herstellung - Google Patents

Mittel zur behandlung immunbiologischer zellbelastungsschwächen und verfahren zu dessen herstellung Download PDF

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WO1996005849A1
WO1996005849A1 PCT/EP1995/003319 EP9503319W WO9605849A1 WO 1996005849 A1 WO1996005849 A1 WO 1996005849A1 EP 9503319 W EP9503319 W EP 9503319W WO 9605849 A1 WO9605849 A1 WO 9605849A1
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rok
redox catalyst
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leaves
plant
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PCT/EP1995/003319
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George J. Reuchlin
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Mepat Ltd.
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    • A61K36/185—Magnoliopsida (dicotyledons)
    • A61K36/61—Myrtaceae (Myrtle family), e.g. teatree or eucalyptus

Definitions

  • the present invention relates to a process for the production of a vegetable redox catalyst (agent), the agent obtained by this process and the use of this agent for the treatment of immunobiological cell weaknesses such as e.g. AIDS and various malignancies.
  • an agent against AIDS is to be provided.
  • 2-methoxyallylphenol (eugen oil) compounds which can be isolated from clove pulp or clove oil and its isomer 2-methoxyprophenylphenol (isoeugenol) is disclosed.
  • This remedy is made up of eugenol and isoeugenol and its use is obviously limited to AIDS.
  • this combination of substances can also be provided with the synthetically produced compounds eugenol and isoeugenol.
  • ROK is a complex molecular system based exclusively on plants. There are no indications of a process for producing a vegetable redox catalyst which forms the base material for a pharmaceutically active composition.
  • redox catalysts are active substances which, because of their biochemical properties, are able to intervene directly and in a physiological manner in the intracellular metabolism regulation.
  • the most interesting of these metabolic regulators are those that can increase the overall adaptation capacity of the cell. From a biochemical point of view, however, changes in metabolism mean conversions of biomolecules and thus ultimately electron transitions between molecules and molecular systems. This increases the resilience of the cell (increase in exercise tolerance) without resulting in exposure-related microtraumas (e.g. changes in cell organelles).
  • An effective agent in this way is limited to confusable compounds such as hormones, non-specific irritants, chemotherapeutics, etc. in principle.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a vegetable redox catalyst. Another object of the present invention is to provide a plant redox catalyst (ROK) obtainable by this process.
  • ROK plant redox catalyst
  • a further object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition which contains this vegetable redox catalyst as active ingredient.
  • a fourth object of the present invention is the use of this plant redox catalyst (agent), in particular in combination with zidovudine (AZT), for the manufacture of a medicament for the treatment of immunobiological cell load weaknesses (eg AIDS and various forms of cancer) to provide.
  • the vegetable redox catalyst (agent) according to the invention is a bifunctional molecular system, i.e. the agent according to the invention contains both catabolic and anabolically active system components which catalyze redox changes in the cell.
  • the particular importance of the agent according to the invention is that it is able to produce normal physiological conditions in the presence of stress, traumatic changes, inflammations, infections and malignant derailment of the tissue via redox processes, which leads to a rapid subsiding of the metabolic depletion (healing process).
  • the immune system is stimulated by an increased activation of the T and B cells, which is directly and through an increase in the concentration of cytokines such as interleukin 2 (IL-2), interleukin 3 (IL-3), interleukin 6 (IL-6) and tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha).
  • cytokines such as interleukin 2 (IL-2), interleukin 3 (IL-3), interleukin 6 (IL-6) and tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha).
  • IL-2 interleukin 2
  • IL-3 interleukin 3
  • IL-6 interleukin 6
  • TNF-alpha tumor necrosis factor alpha
  • I.v. are suitable for the therapeutic use of ROK. Injections are very special, but another form of parenteral (intraperitoneal, SC injected) or oral administration can also be used. Depending on the form of administration, 1-30, preferably 5-20, particularly preferably 10-20, mg ROK / day and patient are used as a suitable dose.
  • the dose to be administered naturally also depends on the general condition of the patient: if the disease is already advanced, e.g. AIDS and desolate general condition of the patient, the dose may have to be reduced (e.g. to 2 - 5 or 10 mg) in order to avoid excessive autointoxication by activating the metabolism.
  • the starting product for the redox catalyst (ROK) according to the invention are leaves of geranium (Pelargonium odoratissi ⁇ mum), clove (Eugenia caryophyllata), myrrh (Commo ⁇ phora abyssinica, C. molmol, C. schimperi) and / or waxcholder (Juniperus communis).
  • the leaves are crushed and slurried in water.
  • the suspension is adjusted to a pH of 9 to 11 with alkali solution and then stirred for 48 hours at 45-50 ° C., advantageously at almost exactly 48 ° C. This is followed by coarse filtration and dialysis of the resulting solution against a buffer solution with a pH of 6-7.
  • the supernatant obtained is initially Purified by chromatography on silica gel or aluminum hydroxide, then ultrafiltered twice, so that molecules with a molecular weight of less than 5000 and more than 30,000 Daltons are separated.
  • the filtrate contains the redox catalyst (ROK) according to the invention. It is dialyzed against 0.9% NaCl, brought to the desired concentration (for example 1 mg / ml) of ROK and sterile filtered.
  • ROK redox catalyst
  • 100 g of the shredded leaf mixture are slurried in about 1000 ml of demineralized water. It is adjusted to a pH in the range from 9-11 with alkali metal hydroxide solution, NaOH or KOH. The mixture is kept at 48 ° C. for 48 hours with constant stirring. The remaining solids are then removed by coarse filtration and discarded.
  • the clear supernatant is further purified first by means of chromatography on silica gel or aluminum hydroxide, then by means of two-stage, fractional ultrafiltration with AMICON * membranes; In the first step, all biomolecules smaller than 5000 Daltons are separated against a 5000 Dalton membrane and discarded.
  • the separation medium is the phosphate buffer solution mentioned above.
  • the second filtration step takes place through a membrane with molecular weight separation greater than or equal to 30,000 daltons.
  • the clear filtrate contains the active agent according to the invention as a molecular composite system with a molecular weight spectrum of 5000-30,000 daltons.
  • the solution of the redox catalyst according to the invention thus purified is dialyzed against a 0.9% NaCl solution and adjusted to a concentration of 1 mg / ml. Fluorimetric standard methods are used to determine the active substance concentration; the fluorescence excitation spectrum of the active substance (ROK) is at a wavelength of 450 nm.
  • Steps 1-3 are carried out as in Example 1.
  • Steps 1-6 are carried out as in Example 1, except that only geranium leaves are used in Example 3 and only juniper leaves in Example 4.
  • Active ingredient - 320 100 32 10 3.2 1.0 0.32 0 conc. ( ⁇ g / ⁇ l)
  • the survival rate of the cells rises steadily as the concentration of the active ingredient decreases.
  • methodological difficulties arise in determining the survival rate in that a statistical count (the cells from a drop of cell culture are applied to a Neubauer counting chamber, the 4 quadrants are counted under a microscope, and so the number of Cells per ml or liter extrapolated) of the cells under the microscope, the range of variation of the cell numbers in the different culture bottles can be relatively high in practice.
  • the values in Table 1 show that the survival rate correlates with the drug concentration, even if there are individual "outliers" below the values (e.g. 29% at 32 ⁇ g / ⁇ l).
  • the lethal dose LD 50 ie the dose at which 50% of the test animals die, was determined in SCID mice. With intraperitoneal administration, it amounts to 1024 mg / kg of body weight.
  • LPS lipopolisaccharide
  • NK natural killer cells
  • LPS lipopolysaccharide
  • NK natural killer cells
  • a monolayer culture of mouse and mouse mouse fibroblast cells is used after a culture period of l hours, in which the infection with friend virus is carried out first. Three hours later, the following combinations of substances are introduced into the culture:
  • FIC CD v. Substance 1 in comb. + CD -n v. Substance 2 in Ko b. CD 50 v. Substance 1 alone CD 50 v. Substance 2 alone
  • AZT alone has the highest FV inhibition effect with a dose of 50% inhibiting Foci formation (ED 50 ) of 0.0079 ⁇ g / ml.
  • ROK concentration AZT concentration ( ⁇ g / ml ( ⁇ g / ⁇ l)
  • Table 8 Friend virus inhibition in Mus dunni cells by combination of ROK and AZT
  • ROK concentration AZT concentration ( ⁇ g / ml) ( ⁇ g / ⁇ l)
  • ROK concentration AZT concentration ( ⁇ g / ml ( ⁇ g / ⁇ l )
  • Table 10 Friend virus inhibition in Mus dunni cells by combination of ROK and AZT
  • ROK concentration AZT concentration ( ⁇ g / ml) ( ⁇ g / ⁇ l) 1.0 0.1 0.01 0.001
  • CD 50 and ED 50 values were determined on the basis of the test series as follows (data in ⁇ g / ml ROK or ⁇ g / ⁇ l AZT at the AZT or ROK concentrations listed below):
  • Table 11 ED 5C values for ROK in ⁇ g / ⁇ l for the following AZT
  • AZT concentration ( ⁇ g / ml) 0 1.0 0.1 0.01 0.001 ED 50 10.8 ⁇ 0.32 ⁇ 0.32 7.5 23
  • Table 12 CD 5C values for ROK in ⁇ g / ⁇ l for the following AZT
  • AZT concentration ( ⁇ g / ml) 0 1.0 0.1 0.01 0.001 CD 50 23 31 110 480 3.5
  • the term "immunobiological weakness” means a dysfunction of regulation and adaptation of the cell metabolism, which is responsible for the immune balance. This also includes - as is generally known - that e.g. Virus infections, rheumatic diseases, autoimmune diseases, malignancies, leukaemias, lymphomas, carcinomas and AIDS syndromes, the immunological parameters of the immune system change significantly compared to a healthy person.
  • This change which is recorded in an unscreening by measuring the immunoglobulins, the lymphocyte subpopulations, the macrophage phagocytosis, etc., can often even be an indication of the presence of a specific change qualitatively and quantitatively by suppression the immune cells or by defects in the immune cell itself, which is summarized, for example, with "immunological weakness".
  • CD ⁇ helper cells absolute CD "abs.)
  • CD 4 helper cells% CD 4 -%) are used as markers. Initial values are CD.-abs. at 20, CD ..-% at 5.

Abstract

Nach der Erfindung wird ein Verfahren zur Herstellung eines pflanzlichen Redoxkatalysators (ROK) angegeben, welches die folgenden Schritte aufweist: (i) Blätter der Geranie (Pelargonium odoratissimum), der Nelke (Eugenia caryophyllata), der Myrrhe (Commophora abyssinica, C. molmol, C. schimperi) und/oder des Wacholders (Juniperus communis) zu zerkleinern und in Wasser aufzuschlämmen; (ii) die erhaltene Suspension mit Alkalilauge auf einen pH-Wert von 9-11 einzustellen, bei 45-50 °C 48 Stunden zu rühren und anschließend grob zu filtrieren; (iii) das Filtrat mittels Dialyse auf einen pH-Wert von 6-7 einzustellen und dabei ausfallende Partikel abzuzentrifugieren; (iv) den so erhaltenen Überstand an Kieselgel oder Aluminumhydroxid zu chromatographieren; (v) die Moleküle mit einem Molekulargewicht von kleiner 5000 und größer 30000 Dalton mittels Ultrazentrifugation zu entfernen; und (vi) das die Fraktion mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 30000 Dalton enthaltende Filtrat gegen 0,9 %ige NaCl-Lösung zu dialysieren und abschließend steril zu filtrieren. Ferner werden ein pflanzlicher Redoxkatalysator (ROK), eine pharmazeutische Zusammensetzung und die Verwendung des pflanzlichen Redoxkatalysators zur Prophylaxe und/oder Behandlung von immunbiologischen Zellbelastungsschwächen beschrieben.

Description

MITTEL ZUR BEHANDLUNG IMMUNBIOLOGISCHER ZELLBELASTUNGSSCHWÄ- CHEN UND VERFAHREN ZU DESSEN HERSTELLUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstel¬ lung eines pflanzlichen Redoxkatalysators (Mittels), das mit¬ tels dieses Verfahrens gewonnene Mittel sowie die Verwendung dieses Mittels zur Behandlung immunbiologischer Zeilbela¬ stungsschwächen wie z.B. AIDS und verschiedene maligne Ent¬ artungen.
Nach DE 38 29 200 AI soll ein Mittel gegen AIDS bereitgestellt werden. Dazu wird die Verwendung von aus Nelkenfruchtfleisch bzw. Nelkenöl isolierbaren Verbindungen 2-Methoxyallylphenol (Eugenöl ) und sein Isomere 2-Methoxyprophenylphenol ( Isoeuge- nol ) offenbart. Dieses Mittel setzt sich also aus Eugenol und Isoeugenol zusammen und die Anwendung ist offensichtlich auf AIDS beschränkt. Diese Substanzkombination kann aber auch mit den synthetisch hergestellten Verbindungen Eugenol und Isoeu¬ genol bereitgestellt werden. Demgegenüber handelt es sich bei ROK um ein komplexes Molekülverbundsystem ausschließlich auf pflanzlicher Basis. Es sind keine Hinweise auf ein Verfahren zur Herstellung eines pflanzlichen Redoxkatalysators hieraus zu entnehmen, der den Grundstoff für eine pharmazeutisch wirk¬ same Zusammensetzung bildet.
Bekannt ist, pflanzliche Präparate verschiedener Herkunft zur Behandlung von Immunschwächen einzusetzen. Abgesehen von Ein¬ zelvorschlägen zur Verwendung von bekannten Pflanzenauszügen (-extrakten) oder von Planzeninhaltsstoffen, z.B. von Echina- cea, wurden auch bereits Extrakte von Ligninarten zur Behand¬ lung von viralen Infektionskrankheiten (DE-A 40 17 091) vor¬ geschlagen, deren Wirkungsmechanismus auf einem Redoxsystem zu beruhen scheint (Naturheilpraxis 12, 1988, Seiten 1496-1502).
Es wurde nun gefunden, daß ein vermutlich auf einem Redox- Katalysatorsystem beruhender Extrakt aus verschiedenen Pflan¬ zen, nämlich aus Blättern der Geranie (Pelargonium odoratissi¬ mum), des Wacholder (Juniperus communis), der Myrrhe (Commo¬ phora abyssinica, C. molmol, C. schimperi) und/oder der Nelke (Eugenia caryophyllata), Wirkungen aufweist, die wegen der vielfältigen Einwirkungen auf immunbiologische Zellbelastungs- schwächen (Zeilimmunschwächeerscheinungen) eine große thera¬ peutische Bedeutung hat.
Insbesondere sind positive Einwirkungen auf Herzmuskelnekro- sen, auf toxisch induzierten Enzymaustritt aus Leberzellen, auf gewisse Krebsformen und auch auf Immunzellen (und damit speziell auf die durch HIV verursachte Immunschwächekrankheit AIDS) zu beobachten.
Allgemein formuliert stellen Redox-Katalysatoren Wirkstoffe dar, die auf Grund ihrer biochemischen Eigenschaften in der Lage sind, unmittelbar und auf physiologische Weise in die in¬ trazelluläre Stoff echsel-Regulation einzugreifen. Von diesen Stoffwechsel-Regulatoren am interessantesten sind solche, die die allgemeine Adaptationsleistung der Zelle erhöhen können. Biochemisch gesehen bedeuten Stoffwechseländerungen jedoch Um¬ bauten von Biomolekülen und damit letztlich Elektronenübergän¬ ge zwischen Molekülen und Molekülsystemen. Hierbei steigt die Belastbarkeit der Zelle (Anstieg der Belastungstoleranz), ohne daß belastungsbedingte Mikrotraumen (z.B. Veränderungen an Zellorganellen) resultieren. Ein auf diese Weise wirksames Mittel grenzt sich von verwechselbaren Verbindungen wie Hormo¬ nen, unspezifischen Reizkörpern, Chemotherapeutika u.s.w. prinzipiell ab.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Herstellung eines pflanzlichen Redoxkatalysators bereitzustellen. Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, einen nach diesem Verfahren erhältlichen pflanzlichen Redoxka¬ talysators (ROK) bereitzustellen.
Noch eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verfügung zu stellen, die diesen pflanzlichen Redoxkatalysator als Wirk¬ stoff enthält.
Schließlich besteht eine vierte Aufgabe der vorliegenden Er¬ findung darin, die Verwendung dieses pflanzlichen Redoxkataly¬ sators (Mittels), insbesondere in Kombination mit Zidovudin (AZT), zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von immunbiologischen Zellbelastungsschwächen (z.B. AIDS und ver¬ schiedene Krebsformen) bereitzustellen.
Bei dem erfindungsgemäßen, pflanzlichen Redoxkatalysator (Mit¬ tel) handelt es sich um ein bifunktionelles Molekülsystem, d.h. das erfindungsgemäße Mittel enthält sowohl katabol- wie anabolaktive Systemanteile, die Redoxveränderungen in der Zelle katalysieren. Die besondere Bedeutung des erfindungs¬ gemäßen Mittels besteht nun darin, daß es in der Lage ist, bei Vorhandensein von Streß, traumatischen Veränderungen, Entzün¬ dungen, Infektionen sowie malignen Entgleisungen des Gewebes über Redox-Vorgänge normale, physiologische Zustände zu erzeu¬ gen, was zu einem raschen Abklingen der Stoffwechselentglei¬ sung führt (Heilungsvorgang).
Hierbei erfolgt gleichzeitig eine Stimulierung des Immunsy¬ stems über eine verstärkte Aktivierung der T- und B-Zellen, die sich direkt und durch einen Konzentrationsanstieg von Zytokinen wie Interleukin 2 (IL-2), Interleukin 3 (IL-3), Interleukin 6 (IL-6) und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-alpha) nachweisen läßt. Diese Zytokine sind bekannt als induzierbare zelluläre Proteine mit zentraler Bedeutung bei embryonalen Entwicklungsvorgängen, bei Entzündungsabläufen und bei Immun- regulationsvorgängen.
Für die therapeutische Verwendung des ROK eignen sich i.v. Injektionen ganz besonders, es können jedoch auch eine andere Form der parenteralen ( intraperitoneale, s.c. injizierte) oder eine orale Verabreichung erfolgen. Als geeignete Dosis werden je nach Form der Verabreichung 1 - 30, bevorzugterweise 5 - 20, besonders bevorzugterweise 10 - 20, mg ROK/Tag und Patient verwendet. Die zu verabreichende Dosis hängt weiterhin natür¬ lich auch von dem Allgemeinzustand der Patienten ab: bei be¬ reits fortgeschrittenem Zustand der Krankheit wie z.B. AIDS und desolatem Allgemeinzustand des Patienten muß die Dosis gegebenenfalls (auf z.B. 2 - 5 oder 10 mg) reduziert werden, um eine zu hohe Autointoxikation durch Aktivierung des Stoff¬ wechsels zu vermeiden.
Insbesondere wurden diese oben beschriebenen Wirkungen des ROK an in-vitro-Modellen von Leukozyten- und Fibroblastenkulturen gezeigt. Eine antivirale Wirkung des erfindungsgemäßen Mittels ließ sich an mit FV (Friend-Virus ) infizierten Kulturen sowohl ohne als auch in Kombination mit Zidovudin (AZT) nachweisen. Damit ist eine therapeutische Anwendung bei z.B. HlV-infizier¬ ten Patienten mit hoher Wirkung bei gleichzeitig niedriger Toxizität gegeben.
Ausgangsprodukt für den erfindungsgemäßen Redoxkatalysator (ROK) sind Blätter von der Geranie (Pelargonium odoratissi¬ mum), der Nelke (Eugenia caryophyllata), der Myrrhe (Commo¬ phora abyssinica, C. molmol, C. schimperi) und/oder des Wa¬ cholder (Juniperus communis). Die Blätter werden zerkleinert und in Wasser aufgeschlämmt. Die Suspension wird mit Alkali¬ lauge auf einen pH-Wert von 9 bis 11 eingestellt und dann 48 Stunden lang bei 45 - 50°C, vorteilhafterweise bei ziemlich genau 48°C, gerührt. Dann folgen eine Grobfiltration und eine Dialyse der resultierenden Lösung gegen eine Pufferlösung mit einem pH von 6 - 7. Ausfallende Partikel werden durch Zentri- fugation entfernt. Der erhaltene Überstand wird zunächst mit- tels Chromatographie an Kieselgel oder Aluminiumhydroxid ge¬ reinigt, dann zweimal ultrafiltriert, so daß Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 und mehr als 30.000 Dalton abgetrennt werden. Das Filtrat enthält den er¬ findungsgemäßen Redoxkatalysator (ROK). Es wird gegen 0,9% NaCl dialysiert, auf die gewünschte Konzentration (z.B. 1 mg/ml) an ROK gebracht und steril filtriert.
Beispiele:
Herstellung des erfindungsgemäßen Mittels
Beispiel 1
1. Zur Verwendung kommen gleiche Gewichtsanteile von frischen oder getrockneten Blättern aller oben genannten Pflanzen (Ge¬ ranie, Nelke und Wacholder). Die in dieser Mischung enthaltene Wirkstoffkonzentration (Konzentration des ROK) variiert von 0,1 - 2 Gew.%.
2. 100 g des zerkleinerten Blattgemisches werden in ca. 1000 ml entmineralisiertem Wasser aufgeschlämmt. Es erfolgt mit Al¬ kalilauge, NaOH oder KOH, eine Einstellung auf einen pH im Be¬ reich von 9-11. Das Gemisch wird für 48 Std. unter ständigem Rühren bei einer Temperatur von 48°C gehalten. Anschließend werden die verbliebenen Feststoffe durch Grobfiltration ent¬ fernt und verworfen.
3. Die so erhaltene Lösung wird durch Dialyse gegen eine Standard-Phosphat-Pufferlösung (Soerensen) auf pH 6,8 einge¬ stellt. Da bei diesem Schritt eine Reihe von unspezifischen Feststoffen (Pflanzenproteine bzw. -proteide) ausfallen, er¬ folgt ein erster Reinigungsschritt durch Klarzentrifugation bei 1000-3000 x g.
4. Die weitere Reinigung des klaren Überstandes erfolgt zu¬ nächst mittels Chromatographie an Kieselgel oder Aluminiumhy¬ droxid, dann durch zweistufige, fraktionierte Ultrafiltration mit AMICON*-Membranen; in dem ersten Schritt werden gegen eine 5000 Dalton-Membran alle Biomoleküle kleiner als 5000 Dalton abgetrennt und verworfen, Abtrennmedium ist die oben erwähnte Phosphat-Pufferlösung. Der zweite Filtrationsschritt erfolgt durch eine Membran mit Molekulargewichtsabtrennung größer gleich 30.000 Dalton. Das klare Filtrat enthält das erfin¬ dungsgemäße aktive Mittel als Molekülverbundsystem mit einem Molekulargewichtsspektrum von 5000 - 30.000 Dalton.
5. Die so gereinigte Lösung des erfindungsgemäßen Redoxkataly¬ sators wird gegen eine 0,9%ige NaCl-Lösung dialysiert und auf eine Konzentration von lmg/ml eingestellt. Zur Ermittlung der Wirkstoffkonzentration finden fluorimetrische Standardverfah¬ ren Anwendung; das Fluoreszenzanregungsspektrum der Wirksub¬ stanz (des ROK) liegt bei einer Wellenlänge von 450 nm.
6. Es erfolgt Sterilfiltration durch ein Membranfilter mit 0,2 μm Porenweite und abschließendes Ampullieren in lml-Ampullen.
Beispiel 2
1. Die Schritte 1-3 werden wie bei Beispiel 1 durchgeführt.
2. Es erfolgt die Abtrennung der Moleküle kleiner als 5000 Dalton durch die entsprechende Ultrafiltrationsmembran, wie es im ersten Beispiel in Schritt 4 beschrieben worden ist. Bei der so vorgereinigten Lösung erfolgt nun die Abtrennung der Moleküle größer als 30.000 Dalton in einer Ultrazentrifuge für 10-11 Stunden bei 50.000 x g.
3. Wie in Beispiel 1 folgen abschließend die Schritte 5 und 6.
Beispiele 3 und 4
Die Schritte 1-6 werden wie bei Beispiel 1 durchgeführt, außer daß in Beispiel 3 nur Geranien-, in Beispiel 4 nur Wacholder- Blätter verwendet werden.
Eigenschaften des erfindungsgemäßen Mittels (ROK)
Beispiel .5
Zytotoxizität in vitro und in vivo
In Monolayerkulturen von u s d ü n n i-Maus-Fibroblasten konnte die zytotoxische Dosis (CD50) ermittelt werden, bei der
50% der Zellen absterben. Sie beträgt 23μg/μl. Tabel le 1
Wirkstoff- 320 100 32 10 3,2 1,0 0,32 0 Konz. (μg/μl)
Überlebensrate 17 43 29 62 73 90 82 100 Zellkultur %
Grundsätzlich steigt die Überlebensrate der Zellen mit sinken¬ der Konzentration des Wirkstoffes stetig an. Bei der Ermitt¬ lung der Überlebensrate treten in der Praxis jedoch methodi¬ sche Schwierigkeiten dahingehend auf, daß eine statistische Zählung (die Zellen aus einem Tropfen Zellkultur werden auf eine Neubauer-Zählkammer aufgetragen, die 4 Quadranten unter einem Mikroskop ausgezählt und so die Zahl der Zellen pro ml bzw. Liter hochgerechnet) der Zellen unter dem Mikroskop er¬ folgt, wobei die Variationsbreite der Zellzahlen in den ver¬ schiedenen Kulturflaschen in der Praxis relativ hoch sein kann. Dies ist eine Erklärung für die in der Tabelle 1 fehlen¬ de Stetigkeit. Allerdings zeigen die Werte in Tabelle 1, daß die Überlebensrate mit der Wirkstoff-Konzentration korreliert, auch wenn sich unter den Werten einzelne "Ausreißer" (z.B. 29% bei 32 μg/μl) befinden.
Die letale Dosis LD50, d.h. die Dosis, bei der 50% der Ver¬ suchstiere sterben, wurde in SCID-Mäusen ermittelt. Sie be¬ trägt bei intraperitonealer Verabreichung 1024mg/kg Körperge¬ wicht.
Beispiel 6
Immunologische Effekte
Immunologische Wirkungen des erfindungsgemäßen Mittels wurden sowohl in einer definierten Zellinie (L-929, NCTC clone 929 der ATCC) als auch an Kulturen menschlicher, peripherer Lym- phozyten von gesunden Probanden ermittelt. 1. L-929-Zellkultur
Eine signifikante Erhöhung der Lipopolisaccharid (LPS)-indu- zierten Blastogenese sowie eine leichte Erhöhung der Aktivität der natürlichen Killerzellen (NK) wurde bei einer optimalen Wirkstoffkonzentration von 0,32 mg/ml festgestellt.
Tabelle 2
Dosis (mg/ml) LPS (cpm) Zytotoxizität der NK ( % )
3.2 4092 9,4
1,6 10895 11,3
0,32 17062 42,7
0,16 14971 39,6
0,08 14368 35,8
cpm: gezählte Zerfälle pro Minute (counts per minute)
LPS: Lipopolysaccharid
NK : natürliche Killerzellen (natural killer cells)
2. Human-Lymphozytenkulturen
Von Probanden werden 5ml venöses Vollblut entnommen, mit Hepa- rin stabilisiert und die buffy-coat-Fraktion mit Ringer-Lösung pH 7,2 in 5ml-Einmalplastik-Zellkulturflaschen (FALCON) für 72 Stunden bei 37°C inkubiert. Pro Kultur erfolgt die Zugabe des erfindungsgemäßen Wirkstoffes (ROK) zu einer Endkonzentration von 0,32 mg/ml. Es wird die Konzentrationszunahme (in pg/ml ) verschiedener Zytokine (IL-2, IL-3, IL-6 und TNF-alpha, As- say-Mikrotiterplatten DIANOVA) im Vergleich zu Probandenkon¬ trollen ohne Wirkstoffzugäbe untersucht. Die Ergebnisse (siehe Tabellen 3 - 6) zeigen eine durch den Wirkstoff bedingte star¬ ke Zytokinexpression als spezifische Immunwirkung. Tabelle 3: Induktion von IL-2 durch ROK
Proband Nr. IL-2-Konzentration (pg/ l
I II
1 22,2 50,8
2 4,1 11,9
3 5,5 22, 1
4 6,8 12,0
5 4, 1 13,2
6 2,0 9,4
7 1,2 1,4
8 10,0 62, 5
9 9,9 56, 5 10 9,8 67,3 11 4,5 19,9 12 2,1 72,5 13 14,0 69,0 14 9,9 84,5 15 13,1 55,5
I bezeichnet Probandenblut unbehandelt
II bezeichnet Probandenblut behandelt mit Wirksubstanz
Tabelle 4: Induktion von IL-3 durch ROK
Proband Nr. IL-3-Konzentration (pg/ml)
I II
1 7,1 78,8
2 0,3 4,4
3 4,6 29,9
4 0,2 24,5
5 3,4 63,6
6 0,1 3,7
7 2,7 21,8
8 2,3 3,6
9 7,4 19,8 10 8,0 24, 5 11 0,0 0,0 12 0,1 7,8 13 6,2 0,3 14 3,0 7,1 15 0,1 7,3
I bezeichnet Probandenblut unbehandelt
II bezeichnet Probandenblut behandelt mit Wirksubstanz Tabelle 5: Induktion von IL-6 durch ROK
Proband Nr. IL-6-Konzentration (pg/ml)
I II
1 37, 1 28,0
2 66,6 32,0
3 8,0 7,0
4 17,1 17,1
5 21,7 39,0
6 45,2 61,9
7 3,0 20, 6
8 12,2 28,7
9 15, 5 60,7 10 14, 5 84, 5 11 3,7 21,0 12 18,2 47, 5 13 0, 5 36, 5 14 9,0 15,0 15 14,6 79,0
I bezeichnet Probandenblut unbehandelt
II bezeichnet Probandenblut behandelt mit Wirksubstanz
Tabelle 6: Induktion von TNF-α durch ROK
Proband Nr. TNF-α-Konzentration (pg/ml)
I II
1 3,0 9,6
2 1,5 0,2
3 0,7 0,1
4 3,3 7,4
5 3,3 0,0
6 9,1 0,0
7 0,5 2,1
8 1,8 0,0
9 1,6 0,3 10 3,7 7,3 11 2,5 0,9 12 12,8 15,5 13 2,3 9,0 14 4,3 5,2 15 6,8 9,5
I bezeichnet Probandenblut unbehandelt
II bezeichnet Probandenblut behandelt mit Wirksubstanz Beispiel 7
In-Vitro-Effekt der Kombination des Redoxkatalysators ROK mit
AZT an mit Friend-Virus ( FV ) infizierten Maus-Fibroblasten-
Kulturen
Verwendung findet eine Monolayer-Kultur von M u s d u n n i- Maus-Fibroblastenzellen nach lδstündiger Kulturdauer, bei der zunächst die Infektion mit Friend-Virus vorgenommen wird. Drei Stunden später werden nachfolgend aufgeführte Substanzkombina¬ tionen in die Kultur eingebracht:
Experiment 1 AZT allein in Konzentrationen von 1, 0.1, 0.01, O.OOlμg/ml Kulturmedium Experiment 2 ROK allein in Konzentrationen von 320, 100, 32, 10, 3.2, 1.0, 0.32mg/ml Kulturme¬ dium
Experiment 3 ROK in allen Konzentrationen aus Exp. 2 zusam¬ men mit lμg AZT/ml Kulturmedium Experiment 4 ROK in allen Konzentrationen aus Exp. 2 zusam¬ men mit O.lμg AZT/ml Kulturmedium Experiment 5 ROK in allen Konzentrationen aus Exp. 2 zusam¬ men mit O.Olμg AZT/ml Kulturmedium Experiment 6 ROK in allen Konzentrationen aus Exp. 2 zusam¬ men mit O.OOlμg AZT/ml Kulturmedium
Zusammenfassend ergeben sich nachfolgend beschriebene Resulta¬ te, die auf Grund von verschiedenen Versuchsreihen erhalten wurden (Tabellen 7 bis 10). Dabei traten bei den verschiedenen Versuchsreihen Schwankungen der Meßwerte von bis zu ±15% auf.
1. Werden die Zytotoxizitäten, die beide Mittel/Substanzen (ROK, AZT) jeweils allein auf die Zellkultur ausüben, mit der Zytotoxizität verglichen, die durch gemeinsame Verwendung bei¬ der Substanzen (ROK, AZT) an Zellkulturen beobachtet werden kann, läßt sich eine stark antagonistische Wirkung der beiden Substanzen erkennen (AZT allein ist sehr toxisch). Mit anderen Worten, die Kombination von AZT und ROK ergibt eine weit ge- ringere Toxizität (optimale Konzentrationen beider Substanzen: lOμg/μl ROK; O.Olμg/ml AZT) als bei den allein verwendeten Substanzen in jeglicher Konzentration (bzgl. der genaueren Definition von "Antagonismus" und seiner Quantifizierung wird auf Berenbaum, M.C., J. Infect. Dis. 137, 122 (1978) verwie¬ sen, der den sog. Fraktionellen Inhibitions-Konzentrations- index (FIC) wie folgt definiert:
FIC = CD v. Substanz 1 in Komb. + CD-n v. Substanz 2 in Ko b. CD50 v. Substanz 1 allein CD50 v. Substanz 2 allein
mit
FIC <0 , 5 signifikant synergistische Wirkung
0 , 5 < FIC < 0 , 9 synergistische Wirkung angedeutet
FIC = 1 additive Wirkung
1 , 1 < FIC < 1 , 9 potentiell antagonistische Wirkung
FIC > 2 (stark) antagonistische Wirkung
2. AZT allein hat den höchsten FV-Inhibitionseffekt mit einer die Bildung von Foci zu 50% inhibierenden Dosis (ED50) von 0,0079 μg/ml. ROK allein hat einen geringeren FV-Inhibiti¬ onseffekt (ED50 = 10,8 μg/μl).
3. In Kombination beider Wirksubstanzen werden optimale FV- Hemm-Effekte erzielt bei O.Olμg/ml AZT zusammen mit 10-32 μg/μl ROK (63-84% Hemmung), die höher sind als bei den Wirk¬ substanzen allein. Gleichzeitig ist die Zytotoxizität bei die¬ sen Konzentrationen niedriger als bei der Verwendung der Ein¬ zelsubstanzen. Tabelle 7: Zytotoxische Effekte an Mus dunni-Kulturen durch Kombination von ROK und AZT
Überleben der Kulturen (
ROK-Kon- zentra- tion AZT-Konzentration (μg/ml (μg/μl)
1.0 0.1 0.01 0.001
0 100 55 56 80 70
320 17 19 30 55 73
100 43 63 59 94
32 29 38 67 76 90
10 62 49 75 100 82
3.2 73 65 66 94 85
1.0 90 100 75 100 97
0.32 82 100 84 85 8
Tabelle 8: Friend-Virus-Hemmung in Mus dunni-Zellen durch Kombination von ROK und AZT
% Hemmung
ROK-Kon- zentra- tion AZT- Konzentration (μg/ml ) (μg/μl)
0 1.0 0.1 0.01 0.001
0 0 100 100 56 3
320 100 100 100 100 100
100 100 100 100 100 89
32 70 100 100 84 58
10 35 100 100 63 35
3.2 33 100 100 47 9
1.0 0 100 100 42 11
0.32 3 100 100 40 2 Tabelle 9: Zytotoxische Effekte an Mus dunni-Kulturen durch Kombination von ROK und AZT
Überleben der Kulturen (%)
ROK-Kon- zentra- tion AZT-Konzentration (μg/ml (μg/μl)
0 1.0 0.1 0.01 0.001
0 100 54 57 81 71
320 18 18 31 54 74
100 44 62 58 95 94
32 28 39 68 77 90
10 63 48 76 100 83
3.2 73 65 66 94 85
1.0 90 99 76 100 98
.32 83 100 83 86 7
Tabelle 10: Friend-Virus-Hemmung in Mus dunni-Zellen durch Kombination von ROK und AZT
% Hemmung
ROK-Kon- zentra- tion AZT-Konzentration (μg/ml) (μg/μl) 1.0 0.1 0.01 0.001
0 0 100 100 56 3
320 100 100 100 100 100
100 100 100 100 100 88
32 70 100 100 83 59
10 35 100 100 64 36
3.2 33 100 100 48 9
1.0 0 100 100 43 12
0.32 3 100 100 39 2 Die CD50- und ED50-Werte wurden an Hand der Versuchsreihen wie folgt ermittelt (Angaben in μg/ml ROK bzw. μg/μl AZT bei den nachfolgend aufgeführten AZT- bzw. ROK-Konzentrationen):
Tabelle 11: ED5C-Werte für ROK in μg/μl bei folgenden AZT-
Konzentrationen
AZT-Konzentration (μg/ml) 0 1.0 0.1 0.01 0.001 ED50 10.8 <0.32 <0.32 7.5 23
Tabelle 12: CD5C-Werte für ROK in μg/μl bei folgenden AZT-
Konzentrationen
AZT-Konzentration (μg/ml) 0 1.0 0.1 0.01 0.001 CD50 23 31 110 480 3,5
Tabelle 13: ED50-Werte für AZT in μg/ml bei folgenden ROK- Konzentrationen
ROK-Konzentration ED50 (μg/μl)
0 0 , 0079
320 <0. 001
100 0. 000025
32 0 , 00037
10 0 , 0032
3,2 0 , 0085
1,0 0 , 01 0.32 0 , 011 Tabelle 14: CDr.0-Werte für AZT in μg/ml bei folgenden ROK- Konzentrationen
ROK-Konzentration CD50 (μg/μl)
0 5
320 0 . 014
100 5
32 0 , 5
10 0 , 9
3,2 10
1,0 70 0.32 70
In der Anmeldung ist unter dem Begriff "Immunbiologische Bela¬ stungsschwäche" eine Dysfunktion der Regulierung und Adaption des Zellstoffwechsels zu verstehen, welcher für den Immunhaus¬ halt verantwortlich ist. Ferner fällt hierunter - wie allge¬ mein bekannt - daß z.B. Virusinfektionen, rheumatische Erkran¬ kungen, Autoimmunerkrankungen, Malignomen, Leukämien, Lympho¬ men, Carcinomen und AIDS-Syndromen sich die immunologischen Parameter des Immunsystems im Vergleich zu einem Gesunden stark verändern. Diese Veränderung, die in einem Im unscreen- ing durch die Messung der I munglobuline, der Lymphozyten- Subpopulationen, der Makrophagen-Phagozytose etc. erfaßt wird, kann oftmals sogar als Hinweis auf das Vorliegen einer spezi¬ fischen Veränderung qualitativ wie quantitativ durch eine Suppression der Immunzellen oder durch Defekte an der Immun¬ zelle selbst gekennzeichnet sein, was beispielsweise mit "Im¬ munbiologische Belastungsschwäche" zusammengefaßt wird.
Als weitere Beispiele für die Verdeutlichung der Indikationen werden nachstehend Patientenbehandlungen beschrieben. Bei spiel I
Eine 1926 geborene Patientin, Diagnose Januar 1992 metastasie- rendes Rektum-Carcinom mit Operation. Oktober 1993 Rezidiv in der Sakralhöhle, Exzision des Tumors und Anlegen eines Anus praeter, nachfolgend 2 Zyklen Chemotherapie. Dezember 1993 nach allgemeinem schlechten subjektiven Zustand Erhöhung des CEA-Wertes auf 70 (Normalwert <5), Erhöhung der Alkalischen Phosphatase, Erhöhung von SGOT- und SGPT-Wert. Auftreten einer Lebermetastase, die durch CT-Werte gesichert ist.
Therapie: Seit dem 17.1.1994 erhalt die Patientin vierwochige Zyklen von ROK mit 5 x wöchentlich 2 Ampullen i.m., anschlie¬ ßend zwei Tage Injektionspause. Nach vier Wochen Injektions- zyklus zwei Wochen Injektionspause. Kontrolle des CEA-Wertes (Rückgang auf CEA bei 15, Normalisierung der Alkalischen Phos¬ phatase und der Leberwerte ) . Starke Besserung des subjektiven Wohlbefindens. Nach vier vierwochigen Injektionszyklen Reduk¬ tion der Ampullenfrequenz auf 5 x wöchentlich 1 Ampulle, nach weiteren vier vierwochigen Zyklen Reduktion auf die bleibende Erhaltungsdosis von 3 x wöchentlich 1 Ampulle. Derzeitiger CEA-Wert bei 7,5.
Beispiel II
Ein 1919 geborener Patient, Diagnose Makroglobulinamie (Mb. Waidenstrom), Zustand nach drei Zyklen Chemotherapie, Leucozy- ten (Leu) 1600, Erythrozyten ( Ery) 2560, Thrombozyten ( Thr) 55000, Blutsenkung ( BSG) 55/150, Hämoglobin ( Hb) 8,1.
Therapie Oktober 1993: Vierwochige Zyklen von ROK mit 5 x wöchentlich 2 Ampullen i. ., anschließend zwei Tage Injek¬ tionspause. Nach einem vierwochigen Zyklus zwei Wochen Injek¬ tionspause. Reduktion der wöchentlichen Ampullenfrequenz nach zwei vierwochigen Zyklen auf 3 x wöchentlich 2 Ampullen. Wäh¬ rend dieser Zeit keine Fremdtherapie, keine Chemotherapie. Nach je zwei vierwochigen Zyklen Kontrolle der Blutwerte. Im Juli 1994 Leu 4190, Ery 3390, Thr 81000, BSG 25/60, Hb 11,1. Guter subjektiver Allgemeinzustand des Patienten, der trotz des relativ stark ausgeprägten anämischen Zustandsbildes sich sportlich betätigt (Radfahren 70 km Tagestour, Bergwandern).
Beispiel III
Eine 1944 geborene Patientin, Diagnose HIV pos. seit 1992, Zustand nach fünfmonatiger Einnahme von AZT subjektiv desolat, keine Lebensqualität. Als Marker werden CD^-Helferzellen ab¬ solut (CD„-abs. ) und CD4-Helferzellen % (CD4-%) verwendet. Ausgangswerte sind CD.-abs. bei 20, CD..-% bei 5.
Therapie seit Juli 1993: Vierwochige Zyklen von ROK mit 5 x wöchentlich 2 Ampullen i.m., anschließend 2 Tage Injektions¬ pause. Nach einem vierwochigen Zyklus eine Woche Injektions¬ pause. Reduktion der wöchentlichen Ampullenfrequenz nach vier vierwochigen Zyklen auf 3 x wöchentlich 2 Ampullen, Fortfüh¬ rung dieser Frequenz als Erhaltungsdosis.
Blutwertkontrolle alle 4 Wochen. Kontinuierlicher Anstieg der T4-abs. auf 40 nach 12 Wochen (T4-% auf 10), nach 24 Wochen Anstieg der T4-abs. auf 80 (T<-% auf 14). Subjektiv guter All- gemeinzustand der Patientin, Lebensqualität deutlich gestie¬ gen. Geplante Reduktion der Ampullenfrequenz auf 2 x wöchent¬ lich 2 Ampullen bei weiterem Anstieg der CD4-Helferzellen.
Beispiel IV
Ein 1961 geborener Patient, Diagnose Multiple Sklerose, gesi¬ chert durch Kernspinresonanz- und Liquordiagnostik. Symptome: taubes Gefühl in den Beinen, der linke Fuß kann beim Gehen nicht richtig gehoben werden, so daß Unsicherheitsgefühl und Stolperverhalten resultieren. Allgemeine Kraftlosigkeit in den Armen, Hände sind pelzig.
Therapie: Seit drei Monaten Injektionen 2 x wöchentlich 2 20
Mittel zur Behandlung immunbiologischer Zellbelastungsschwächen und Verfahren zu dessen Herstellung
Patentansprüche
Verfahren zur Herstellung eines pflanzlichen Redoxykata- lysators (ROK), gekennzeichnet durch die folgenden
Schritte:
(i) Blätter der Geranie (Pelargonium odoratissimum), der Nelke (Eugenia caryophyllata), der Myrrhe (Commopho¬ ra abyssinica, C. molmol, C. schimperi) und/oder des Wacholders ( Juniperus communis ) zu zerkleinern und in Wasser aufzuschläm en;
( ii ) die erhaltene Suspension mit Alkalilauge auf einen pH-Wert von 9-11 einzustellen, bei 45-50°C 48 Stun¬ den zu rühren und anschließend grob zu filtrieren;
(iii) das Filtrat mittels Dialyse auf einen pH-Wert von 6-7 einzustellen und dabei ausfallende Partikel abzuzentrifugieren;
( iv) den so erhaltenen Überstand an Kieselgel oder Alu i- numhydroxid zu Chromatographieren;
(v) die Moleküle mit einem Molekulargewicht von kleiner 5000 und größer 30000 Dalton mittels Ultrazentrifu- gation zu entfernen; und
(vi) das die Fraktion mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 3000 Dalton enthaltende Filtrat gegen 0,9 %ige NaCl-Lösung zu dialysieren und abschließend steril zu filtrieren.

Claims

19
Ampullen i.m.. Deutliche subjektive Zunahme des Kraftgefühls in den Armen, Taubheits- und Pelzigkeitsgefühl in den Extremi¬ täten subjektiv fast verschwunden. Unsicherheitsgefühl und Stolpertendenz im linken Bein beim Gehen zwar graduell noch vorhanden, jedoch rückläufige Tendenz. Geplante Reduktion der Injektionen auf 1 x wöchentlich 2 Ampullen als Erhaltungsdo- sis.
Die nach obigen Beispielen I bis IV gemessenen Verbesserungen des Allgemeinzustandes der Patienten, die in den verbesserten Meßwerten bezogen auf die jeweiligen immunbiologische Zell- belastungsschwäche nachgewiesen wurden, zeigen die überra¬ schenden VJirkungen des erfindungsgemäßen pflanzlichen Redox¬ katalysators (ROK) im Hinblick auf einen positiven Einfluß auf den Krankheitsverlauf.
2. Pflanzlicher Redoxkatalysators (ROK), erhältlich nach dem Verfahren gemäß Patentanspruch 1.
3. Der pflanzliche Redoxkatalysators (ROK) gemäß Patentan¬ spruch 2, wobei als Blätter die Blätter der Geranie (Pel¬ argonium odoratissimum), die Blätter der Nelke (Eugenia caryophyllata), die Blätter des Wacholder (Juniperus com¬ munis) und die Blätter der Myrrhe (Commophora abyssinica, C. schimperi, C. molmol) verwendet werden.
4. Der pflanzliche Redoxkatalysators (ROK) gemäß Patentan¬ spruch 2 oder 3, wobei die Temperatur in Schritt ( ii ) 48 Stunden lang bei 48°C gehalten wird.
5. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend den pflanzli¬ chen Redoxkatalysators (ROK) gemäß einem der Patentan¬ sprüche 2 bis 4. sowie gegebenenfalls einen geeigneten Träger oder Verdünner.
6. Die pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Patentanspruch 5, zusätzlich enthaltend Zidovudin (AZT).
7. Verwendung des pflanzlichen Redoxkatalysators (ROK) gemäß einem der Patentansprüche 2 bis 4 zur Prophylaxe und/oder Behandlung von immunbiologischen Zellbelastungsschwächen.
8. Die Verwendung des pflanzlichen Redoxkatalysators (ROK) gemäß einem der Patentansprüche 2 bis 4 zur Behandlung der immunbiologischen Zellbelastungsschwäche Krebs.
9. Die Verwendung des pflanzlichen Redoxkatalysators (ROK) gemäß einem der Patentansprüche 2 bis 4 zur Behandlung der immunbiologischen Belastungsschwäche AIDS.
10. Die Verwendung des pflanzlichen Redoxkatalysators (ROK) gemäß einem der Patentansprüche 2 bis 4 zur Behandlung einer immunbiologischen Belastungsschwäche gemäß einem der Patentansprüche 7 bis 9 zusammen mit AZT.
11. Die Verwendung gemäß Patentanspruch 10, wobei der pflanz¬ liche Redoxkatalysator (ROK) und AZT in einem Gewichts- verhältnis von 100 000 : 1 bis 5 000 000 : 1 verwendet werden.
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