DE10085496T5

DE10085496T5 - Extrakte von Betelpfefferblättern als Immunmodulator

Info

Publication number: DE10085496T5
Application number: DE10085496T
Authority: DE
Inventors: Santu Bandyopadhyay; Bikash Pal; Samir Bhattacharya; Mitali Ray; Keshab Chandra Roy
Original assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Current assignee: Council of Scientific and Industrial Research CSIR
Priority date: 2000-12-18
Filing date: 2000-12-18
Publication date: 2004-07-22
Also published as: JP2004517845A; AU2001235975A1; CN1514731A; CN100390274C

Abstract

Ein Verfahren zur Induktion von IFNγ in mononukleären Zellen aus humanem peripherem Blut, wobei das Verfahren die Stufen umfasst:
a) Herstellen eines wässrigen Extrakts von Betelblättern,
b) Präparation von mononukleären Zellen aus humanem peripherem Blut,
c) Inkubation von hPBMC mit Betelblattextrakt während eines Zeitraums von 18-48 h,
d) Extraktion von RNA für eine zytokinspezifische RT-PCR oder für eine Durchflusszytometrie zum Erfassen des intrazellulären Zytokinproteins,
e) Verwendung der RNA für eine RT-PCR unter Verwendung von IFNγ-spezifischen bekannten Primern zum Erhalten von PCR-Produkten, und
f) Erhöhen von IFNγ, das durch eine IFNγ-spezifische Bande widergespiegelt wird.

Description

Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Betelblattextrakt zur Induktion einer IFNγ-Produktion in humanen peripheren Blut-T-Zellen.

Brennesselblätterextrakte sind in Deutschland zur adjuvanten Therapie von rheumatischen Erkrankungen eingetragen. In einem Voll Nesselextrakt IDS 23 (Rheuma-Hek) eine Lipopolysaccharidstimulierte Monocytenzytokinexpression, was eine immunmodulierende Wirkung anzeigte. (Antirheumatische Wirkung von IDS 23, ein Brennesselblattextrakt, auf die In-vitro-Expression von T-Helferzytokinen). Die Anmelder untersuchten die immunomodulierenden Wirkungen von Betelblattextrakten auf Phytohämagglutinin(PHA)-stimulierte mononukleäre Zellen von peripherem Blut (PBMC) in vitro.

Betelblätter besitzen einen starken scharfen aromatischen Geschmack und werden in weitem Umfang als Kaumasse verwendet. Im allgemeinen werden reife oder überreife Blätter, die das Wachstum eingestellt haben, jedoch noch nicht brüchig geworden sind, zum Kauen verwendet. Die Grundzubereitung für Kauzwecke besteht aus einem Betelblatt, auf das gelöschter Kalk und Katechu geschmiert wurde und zu dem Betelnussraspeln gegeben werden; Aromastoffe, wie Kokosnussraspeln, Nelken, Kardamom, Fenchel, pulverisiertes Süßholz, Muskatnuss und auch Tabak, werden nach dem Geschmack des einzelnen verwendet. An einigen Orten ist die Zubereitungsschüssel mit Blattsilber oder -gold überzogen. Als Kaumasse werden ihr viele Eigenschaften zugeschrieben: sie ist aromatisch, verdauungsfördernd, stimulierend und rotfärbend. Medizinisch ist sie für katarrhalische und Lungenerkrankungen verwendbar. Sie wird auch für Breiumschläge verwendet. Die Wirkungen des Kauens von Betel mit Betelnuss und anderen Zusatzstoffen sind die Anregung der Speicheldrüsen und die Reizung der Mundschleimhautmembran. Die erzeugte Rotfärbung beruht auf einem Pigment in der Betelnuss, die sich mit der Zeit unter der Wirkung von Alkali im Kalk und Katechu zeigt. Ein leichter Grad der Stimulierung wird hervorgerufen, was zu einem Gefühl von Wärme und Wohlbefinden führt, und außerdem wird ein angenehmer Duft verliehen. Der wichtigste Faktor, der den Aromanutzwert der Blätter bestimmt, ist die Menge und insbesondere die Natur des vorhandenen ätherischen Öls. Betelblätter aus unterschiedlichen Regionen variieren hinsichtlich Geruch und Geschmack. Die schärfste bzw. am stärksten beißende Art ist Sanchi, während die mildesten und süßesten aus Madras sind. Die Betelblätter enthalten ätherische Öle, wobei der Ölgehalt in Abhängigkeit von den Blattsorten von 0,7 bis 2,6% variiert. Das Öl besteht aus Phenolen und Terpenen. Je höher der Anteil von Phenolöl ist, desto besser ist die Qualität. Ein Isomer von Eugenol mit der Bezeichnung Chavibetol (Betelphenol; 4-Allyl-2-hydroxy-l-methoxybenzol) wird als der charakteristische Bestandteil von Betelöl angesehen. Es fehlt jedoch in indischen Proben. Betelöl indischer Arten enthält als vorwiegenden Bestandteil phenolische Bestandteile. Betelöl wurde bei der Behandlung verschiedener Atemwegskatarrhe mit lokaler Anwendung entweder durch Gurgeln oder durch Inhalieren bei Diphtherie verwendet. Es besitzt rotfärbende Eigenschaften. Es zeigt unterschiedliche Wirkung auf das zentrale Nervensystem von Säugetieren; letale Dosen ergeben eine tiefe Narkose, die innerhalb von wenigen Stunden zum Tod führt. Die ätherischen Öle und Extrakte der Blätter besitzen Wirksamkeit gegenüber mehreren grampositiven und gramnegativen Bakterien, wie Micrococcus pyogenes var. albus und var. aureus, Bacillus subtilis und B. megaterium, Diplococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Salmonella typhosa, Vibrio comma, Shigella dysenteriae, Proteus vulgaris, Pseudomonas solanacaerum, Sarcina lutea und Erwinia carotovora. Es wurde ermittelt, dass das Ö1 gegenüber den Protozoen Paramaedium caudatum innerhalb von etwa 5 min tödlich ist (Wealth of India, Band 8, S. 84-94). Es hemmt das Wachstum von Vibrio cholerae, Salmonella typhosum und Shigella flexneri und Escherichia coli. Das Wasserdampfdestillat der Blätter zeigte Wirksamkeit gegenüber Mycobacterium tuberculosis.

Es ist die Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Induktion von IFNγ in mononukleären Zellen aus humanem peripherem Blut bereitzustellen.

Eine andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Betelblattextrakt zur Induktion der IFNγ-Produktion in humanen peripheren Blut-T-Zellen.

Eine andere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer Zusammensetzung, die Betelblattextrakt umfasst, zur Verwendung als Immunmodulator des Th_l-Typs.

Um die obigen Aufgaben zu lösen, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Induktion von IFN-γ in mononukleären Zellen aus humanem peripherem Blut zur Verfügung. Die Erfindung betrifft ebenso die Verwendung von Betelblattextrakt zur Induktion der IFN-γ-Produktion in humanen peripheren Blut-T-Zellen.

Demgemäß betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Induktion von IFNγ in mononukleären Zellen aus humanem peripherem Blut, wobei das Verfahren ein Herstellen eines wässrigen Extrakts von Betelblättern; die Präparation von mononukleären Zellen aus humanem peripherem Blut; die Inkubation von hPBMC mit Betelblattextrakt während 18-48 h; die Extraktion von RNA für eine zytokinspezifische RT-PCR oder eine Durchflusszytometrie zur Detektion von intrazellulärem Zytokinprotein; das Durchführen einer RT-PCR mit RNA zum Erhalten von PCR-Produkten unter Verwendung von IFNγ-spezifischen bekannten Primern und das Erhöhen von IFNγ, das durch eine IFNγ-spezifische Bande widergespiegelt wird, umfasst.

Alternativ ein weiteres Verfahren zur Induktion von IFNγ, das in mononukleären Zellen aus humanem peripherem Blut produziert wird, wobei das Verfahren das Durchführen einer intrazellulären Anfärbung inkubierter Zellen auf IFNγ; die Analyse der gefärbten Zellen in einem Durchflusszytometer und ein Erhöhen der IFNγ-positiven Zellen auf das mindestens Siebenfache umfasst.

Ein Verfahren zur Verwendung von Betelblattextrakt als Immunmodulator des Thl-Typs, wobei das Verfahren umfasst:

a) Verabreichen von mindestens 5 bis 10 mg/ml/kg Körpergewicht Betelblattextrakt an ein Versuchsobjekt und
b) Verabreichen des Extraktes auf oralem oder intramuskulärem Weg einmal am Tag für eine Dauer von mindestens einem Monat.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung als Immunmodulator des Thl-Typs bereitgestellt, wobei die Zusammensetzung eine effektive Menge von wässrigem Betelblattextrakt oder lyophilisiertem Betelblattextrakt zusammen mit oder in Verbindung mit einem Zusatzstoff umfasst.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Zusatzmittel in einer solchen Weise gewählt, dass es die Aktivität des Betelblattextrakts nicht stört.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Zusatzstoff aus Nährstoffen, wie Proteinen, Kohlehydrate, Zucker, Talkum, Magnesiumstearat, Cellulose, Calciumcarbonat, Stärke-Gelatine-Paste und/oder pharmazeutisch akzeptablen Trägern, Streckmitteln, Verdünnungsmitteln oder Lösemitteln ausgewählt.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der wässrige Extrakt, das lyophilisierte Produkt oder die Zusammensetzung oral oder intramuskulär verabreicht.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der orale Weg in Form einer Kapsel, eines Sirups, Konzentrats, Pulvers oder Granulats beschritten.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung liegt das Verhältnis des Betelblattextraktes zu dem Zusatzmittel im Bereich zwischen 10-1:1-10.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der Betelblattextrakt, lyophilisierte Extrakt oder die Zusammensetzung, die den Betelblattextrakt umfasst, in einer Dosismenge zwischen 5 bis 10 mg/kg Körpergewicht mindestens einmal am Tag für einen Monat verabreicht.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung eines Objekts zum Erreichen einer Immunmodulation des Thl-Typs, wobei das Verfahren ein Verabreichen einer pharmazeutisch effektiven Menge von Betelblattextrakt, lyophilisiertem Extrakt oder einer Zusammensetzung, die den Extrakt enthält, an das Objekt umfasst.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Zusatzmittel so gewählt, dass es die Aktivität des lyophilisierten Betelblatextrakts nicht stört.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Zusatzmittel aus Nährstoffen, wie Proteine, Kohlehydrate, Zucker, Talkum, Magnesiumstearat, Cellulose, Calciumcarbonat, Stärke-Gelatine-Paste, und/oder pharmazeutisch akzeptablen Trägern, Streckmitteln, Verdünnungsmitteln oder Lösemitteln, ausgewählt.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Verhältnis von Betelblattextrakt zu dem Zusatzmittel im Bereich zwischen 10-1:1-10.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der Betelblattextrakt, lyophilisierte Extrakt oder die Zusammensetzung, die den Betelblattextrakt enthält, in einer Dosismenge zwischen 5 und 10 mg/kg Körpergewicht mindestens einmal täglich einen Monat verabreicht.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der Betelblattextrakt in Verbindung mit geeigneten Trägern/Zusatzmitteln als Immunmodulator des Thl-Typs verwendet.

In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden E rfindung wird das Zusatzmittel in einer solchen Weise gewählt, dass es die Aktivität des lyophilisierten Betelblattextrakts nicht stört.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird das Zusatzmittel aus Nährstoffen, wie Proteine, Kohlehydrate, Zucker, Talkum, Magnesiumstearat, Cellulose, Calciumcarbonat, Stärke-Gelatine-Paste, und/oder pharmazeutisch akzeptablen Trägern, Streckmitteln, Verdünnungsmitteln oder Lösemitteln ausgewählt.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Verhältnis von Betelblattextrakt zu Zusatzmittel im Bereich zwischen 10-1:1-10.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der Betelblattextrakt, lyophilisierte Extrakt oder die Zusammensetzung, die den Betelblattextrakt enthält, mit einer Dosismenge zwischen 5 bis 10 mg/kg Körpergewicht mindestens einmal täglich einen Monat verabreicht.

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Herstellung eines Betelblattextrakts, die die folgenden Schritte umfasst:

1) Waschen der frischen Blätter von Betelpfeffer und Homogenisieren in einer Gemischmischvorrichtung;
2) Ultraschallbehandlung in einem Ultraschallbad mit 2 bis 3 Stoßbehandlungen während jeweils 15 min und Filtern des Extrakts, ggf. mindestens einmaliges Wiederholen der Extraktion und Trocknen; und
3) Lyophilisieren des Extrakts unter Bildung einer halbfesten Masse.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird der lyophilisierte Extrakt durch Gefriertrocknung des wässrigen Extrakts mit herkömmlichen Verfahren erhalten.

In einer weiteren Ausführungsform wird der wässrige Extrakt aus folgenden Arten von Betelblättern (Betelpfeffer), nämlich dem Wildtyp, dem Klettertyp, dem Bangla-Typ und dem Sweet-Typ, hergestellt.

Kurze Beschreibungen der Begleitzeichnungen

1: stellt eine RT-PCR dar zur Demonstration, dass Betelblattextrakt die IFNγ-mRNA-Expression in mononukleären Zellen aus peripherem Blut (PBMC) normaler Individuen erhöht.

2: stellt eine Durchflusszytometrie dar, wodurch gezeigt wird, dass Betelblättextrakt die IFNγ-Expression auf dem Proteinniveau in PBMC normaler Individuen erhöht.

Die folgenden Beispiele stellen weiter die Erfindung dar, aber die Erfindung ist nicht darauf beschränkt.

BEISPIEL 1
34,14 g frischer Blätter von Betelpfeffer, die sorgfältig in sterilem Wasser gewaschen wurden, wurden mit 100 ml von glasdestilliertem Wasser in einer Gemischmischvorrichtung homogenisiert. Danach wurde eine Ultraschallbehandlung in einem Ultraschallbad mit 3 Stoßbehandlungen während jeweils 15 min durchgeführt. Der Extrakt wurde über Whatman Nr. 1-Filterpapier filtriert und das Filtrat wurde gewonnen.
Dieses Extraktionsverfahren wurde dreimal wiederholt. Der vereinigte Extrakt wurde lyophilisiert, wobei eine halbfeste Masse eines Gewichts von 1,17 g erhalten wurde. Diese wurde dann auf die biologische Aktivität getestet.
BEISPIEL 2
Frische Blätter von Betelpfeffer mit einem Gewicht von 21,68 g wurden mit destilliertem Wasser (60 ml) in einer Gemischmischvorrichtung homogenisiert und dann in einem Ultraschallbad mit 2 Stoßbehandlungen während jeweils 15 min ultraschallbehandelt. Eine Extraktion wurde über Nacht oder während 16 h durchgeführt. Durch Filtern über Whatman Nr. 1-Filterpapier wurde das in Wasser extrahierte Material abgetrennt. Diese Art der Extraktionsbehandlung wurde dreimal wiederholt. Der vereinigte Extrakt wurde in einer Flashverdampfungsvorrichtung unter vermindertem Druck bei 45°C zur Trockne eingedampft. Die verbliebene Substanz wurde dann in einem Exsikkator unter Hochvakuum getrocknet und die halbfeste Masse mit einem Gewicht von 0,59 g wurde auf biologische Aktivität getestet.
Eigenschaften des Materials:
Das durch die Beispiele 1 und 2 erhaltene biologisch aktive Material weist die folgenden Eigenschaften auf:

1) Das wie im vorhergehenden angegeben hergestellte getrocknete halbfeste Material war ein dunkel gefärbtes Material, das in Wasser und Dimethylsulfoxid löslich ist.
2) Eine Dünnschichtchromatographie des aktiven Materials zeigt fünf Flecken mit Rf-Werten von 0,75, 0,64, 0,50,0,40 bzw. 0,33 in einem Lösemittelsystem aus n-Butanol, Essig säure und Wasser im Verhältnis 9:5:7.
3) Eine HPLC-Analyse des aktiven Materials unter Verwendung einer analytischen Säule Intersil ODS-3 (4,6 × 250 mm), eines Lösemittelsystems aus Methanol und Wasser im Verhältnis 4:1 und einer Flussrate von 1,0 ml/min, Detektion bei 217 nm, trennte das Material in elf Peaks mit einer Retentionszeit von 2,69, 4,27, 5,95, 6,97, 7,49, 9,39, 11,20, 12,40, 15,53, 18,90 und 21,49 min auf.

BEISPIEL 3
1. Herstellung mononukleärer Zellen von humanem peripherem Blut (PBMC)
Heparinisiertes Vollblut (das normalen Personen entnommen wurde) wurde einer Ficoll-Hypaque-Dichtegradientenzentrifugation unterzogen. Die Zellen an der Grenzfläche wurden zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und dann in dem Medium RPMI-1640, dem 10% fetales Rinderserum zugesetzt war, resuspendiert.
2. Inkubation von hPBMC mit Betelblattextrakt:
PBMC (5,0 × 10⁶ Zellen) wurden über Nacht (18 h) bei 37°C in 5% CO₂ in einem Gesamtvolumen von 2,0 ml RPMI + 10 FBS, das 5 μg/ml Phytohämagglutinin (PHA) enthielt, in 24-Vertiefungen-Platten in Anwesenheit oder Abwesenheit von Betelblattextrakten (Endkonzentration 12,5 mg/ml) kultiviert. Am Ende der Inkubationsperiode wurden die PBMC zweimal mit PBS gewaschen und zur Extraktion von Gesamt-RNA für eine zytokinspezifische RT-PCR oder für eine Durchflusszytometrie zum Erfassen intrazellulärer Zytokine auf dem Niveau einzelner Zellen verwendet.
3. RNA-Präparation und RT-PCR: Zelluläre Gesamt-RNA aus kultivierten PBMC wurde mit Trizol
(Gibco BRL) extrahiert. 5 × 10⁶ Zellen wurden 18 h wie oben beschrieben kultiviert und geerntet und in 1 ml Trizol resuspendiert. 2 μg RNA und 10 μm von jedem Primer wurden zur Synthese von cDNA und PCR in einem einzelnen Gefäß unter Verwendung des superscript^TM One step RT-PCR-Systems (Gibco BRL) in einem Gesamtvolumen von 25 μl verwendet – Primersequenzen von humanem IFNγ und humanes IL-4 waren wie folgt:
IFNγ Sense, 5' TCT GCA TCG TTT TGG GTT CT 3', Antisense 5' CAG CTT TCC GAAGTC ATC TC 3': IL-4 Sense 5' CCT CTG TTC TTC CTG CTAGC 3; Antisense 5' CCG TTTCAGGAA TCG GAT CA 3'. Amplifikation und cDNA-Synthese wurden wie in der Vorschrift des Herstellers beschrieben durchgeführt. PCR-Produkte wurden einer Elektrophorese in einem 1,2%-igen Agarosegel in der Gegenwart von Ethidiumbromid unterworfen und auf einem Ultraviolettdurchleuchtungsgerät photographiert. Molekülgewichtsmarker (123 bp Leiter, Gibco BRL) wurden in allen Gelen verwendet.(J. Rheumatol. 1999: 26: 2517-2522)
4. Durchflusszytometrie
Die Zeilen wurden gewaschen, durch Behandlung mit 4%-igem Paraformaldehyd während 10 min permeabilisiert, und anschließend mit 0,1% Saponin 10 min inkubiert. Die Zellen wurden dann mit Waschpuffer gewaschen (PBS, das 1% Albumin, 0,1% Saponin und 0,1% Natriumazid enthielt). Nach dem Waschen wurden die permeabilisierten Zellen mit FITC oder mit PE markiertem Kontroll-monoklonalem-Antikörper (mAb), mit FITC markiertem anti-humanes-IFNγ-Ab oder mit PE markiertem anti-humanes-IL-4-mAb 20 min bei Raumtemperatur im Dunkeln behandelt. Die Zellen wurden dann einmal mit Waschpuffer und einmal mit PBS gewaschen und dann in PBS, das 1% Paraformaldehyd enthielt, für die Durchflusszytometrieanalyse resuspendiert.
Ergebnisse:
Einfluss des Betelblattextrakts auf die Th₁-Zytokinexpression.
Aus der Fig.I ist klar, dass der Betelblattextrakt die IFNγ-mRNA-Expression erhöht, aber keine Wirkung auf die IL-4-mRNA-Expression in mononukleären Zellen aus peripherem Blut normaler humaner Individuen hat, was durch RT-PCR bestimmt wurde. Mit anderen Worten zeigen die Daten der Anmelder in Fig. I, dass der Betelblattextrakt signifikant die Synthese von IFNγ-spezifischer mRNA erhöht und praktisch keine Wirkung auf die IL-4-mRNA-Synthese hat. Eine IFNγ-Synthese durch PBMC war auch auf dem Proteinniveau nachweisbar, wie es aus der Durchflusszytometrie-Dotplotanalyse, die in Fig. II gezeigt ist, offensichtlich ist. Nur 0,9% PBMC waren IFNγ-positiv, wenn PBMC zusammen mit PHA inkubiert wurde (Fig. IIA). Andererseits zeigten 7,1% PBMC intrazelluläres IFNγ (Fig. IIB), wenn PBMC mit PHA plus Betelblattextrakt inkubiert wurde. Im Gegensatz dazu wurden die prozentualen Anteile von IL-4 produzierenden Zellen nicht augenfällig verändert, wenn PBMC zusammen mit Betelblattextrakt inkubiert wurden (Fig. IIC & D)
Diskussion
T-Zellen werden anhand ihrer Zytokinmuster in Th₁- und Th₂-Phänotypen unterteilt (T.R. Mossmann, R.L. Coffman, Th₁ and Th₂ cells: different patterns of lymphokine secretions lead different functional properties. Annual Rev. Immunol. 1989, 7; 145-73), die eine zellvermittelte und eine humorale Immunantwort regulieren. Entzündungsimmunantworten werden primär durch die Th₁-Zellpopulationen durch die Produktion von IL₂ & IFNγ, die die zelluläre Immunität erhöhen, vermittelt (G. Trinchieri Interleukin-12 and its role in generation of Thl cells. Immunol Today 1993; 14: 335-8; T. Germann, J. Szeliga, H. Hess et al. Administration of interleukin-12 in combination with type-II collage induces severe arthritis in DBA/1 mice. Proc Natl Acad Sci. USA 1995; 92: 4823-7).
Demgemäß legen unsere experimentellen Ergebnisse nahe, dass Betelblattextrakte die Antwort des Thl-Typs erhöhen, wodurch die zelluläre Immunität erhöht wird.
Zusammenfassung
Diese Erfindung betrifft die Verwendung von Betelblattextrakt zur Induktion von IFNγ mononukleären Zellen aus humanem peripherem Blut, wobei das Verfahren die Stufe des Herstellens eines wässrigen Extrakts von Betelblättern, die Präparation von mononukleären Zellen von humanem peripherem Blut, der Inkubation von hPBMC mit Betelblattextrakt während 18-48 h, der Extraktion von RNA für eine zytokinspezifische RT-PCR oder für eine Durchflusszytometrie zur Detektion von intrazellulärem Zytokinprotein, des Durchführens einer RT-PCR mit RNA zum Erhalten von PCR-Produkten unter Verwendung von IFNγspezifischen bekannten Primern und des Erhöhens von IFNγ, das durch eine IFNγ-spezifische Bande widergespiegelt wird, umfasst .

Claims

Ein Verfahren zur Induktion von IFNγ in mononukleären Zellen aus humanem peripherem Blut, wobei das Verfahren die Stufen umfasst: a) Herstellen eines wässrigen Extrakts von Betelblättern, b) Präparation von mononukleären Zellen aus humanem peripherem Blut, c) Inkubation von hPBMC mit Betelblattextrakt während eines Zeitraums von 18-48 h, d) Extraktion von RNA für eine zytokinspezifische RT-PCR oder für eine Durchflusszytometrie zum Erfassen des intrazellulären Zytokinproteins, e) Verwendung der RNA für eine RT-PCR unter Verwendung von IFNγ-spezifischen bekannten Primern zum Erhalten von PCR-Produkten, und f) Erhöhen von IFNγ, das durch eine IFNγ-spezifische Bande widergespiegelt wird.
Ein Verfahren zur Induktion von IFNγ, das in humanen mononukleären Zellen aus peripherem Blut produziert wird, wobei das Verfahren ferner die alternativen Schritte umfasst: a) Unterwerfen inkubierter Zellen einer intrazellulären Anfärbung auf IFNγ, b) Analyse von gefärbten Zellen in einem Durchflusszytometer, und c) Erhöhen von IFNγ-positiven Zellen, auf das mindestens Siebenfache.
Ein Verfahren zur Verwendung von Betelblattextrakt als Immunmodulator des Thl-Typs, wobei das Verfahren um fasst: a) Verabreichen von mindestens 5 bis 10 mg/ml/kg Körpergewicht von Betelblattextraktsaft an ein Objekt, b) Verabreichen des Extrakts mindestens einmal täglich während eines Zeitraums von mindestens einem Monat, c) Verabreichen des Extrakts auf oralem oder intramuskulärem Weg.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verwendung als Immunmodulator des Thl-Typs, wobei die Zusammensetzung eine effektive Menge eines wässrigen Betelblattextrakts oder lyophilisierten Betelblattextrakts zusammen mit oder in Verbindung mit einem Zusatzmittel umfasst.
Eine Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der lyo- , philisierte Extrakt durch Gefriertrocknung des wässrigen Extrakts mit herkömmlichen Verfahren erhalten wird.
Eine Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das Zusatzmittel so gewählt wird, dass es die Aktivität des Betelblattextrakts nicht stört.
Eine Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das Zusatzmittel aus Nährstoffen, wie Proteine, Kohlehydrate, Zucker, Talkum, Magnesiumstearat, Cellulose, Calciumcarbonat, Stärke-Gelatine-Paste, und/oder pharmazeutisch akzeptablen Trägern, Streckmitteln, Verdünnungsmitteln oder Lösemitteln ausgewählt wird.
Eine Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der wäss rige Extrakt, das lyophilisierte Produkt oder die Zusammensetzung oral oder intramuskulär verabreicht werden.
Eine Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der orale Weg in Form einer Kapsel, eines Sirups, Konzentrats, Pulvers oder Granulats beschritten wird.
Eine Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei das Verhältnis von Betelblattextrakt zu dem Zusatzmittel im Bereich zwischen 10-1:1-10 liegt.
Eine Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der Betelblattextrakt, lyophilisierte Extrakt oder die Zusammensetzung, die den Betelblattextrakt umfasst, mit einer Dosismenge zwischen 5 und 10 mg/kg Körpergewicht mindestens einmal täglich einen Monat verabreicht werden.
Eine Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der lyophilisierte Betelblattextrakt die folgenden Eigenschaften aufweist: i) die getrocknete Probe ist ein dunkel gefärbtes Material, das in Wasser und Dimethylsulfoxid löslich ist, ii) eine Dünnschichtchromatographie des aktiven Materials zeigt fünf Flecken mit Rf-Werten von 0,75, 0,64, 0,50, 0,40 bzw. 0,33 in einem Lösemittelsystem aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser im Verhältnis von 9:5:7, und iii) eine HPLC-Analyse des aktiven Materials unter Verwendung einer analytischen Säule Intersil ODS-3 (4,6 × 250 mm), eines Lösemittelsystems aus Methanol und Wasser im Verhältnis 4:1 und einer Flussrate von 1,0 ml/min, Detektion bei 217 mm trennte das Material in elf Peaks mit einer Retentionszeit von 2,69, 4,27, 5,95, 6,97, 7,49, 9,39, 11,20, 12,40, 15,53, 18,90 und 21,49 min auf .
Die Verwendung von Betelblattextrakt oder lyophilisiertem Extrakt desselben oder einer Zusammensetzung, die eine effektive Menge Betelblattextrakt enthält, zur Induktion von IFNy in mononukleären Zellen aus humanem pheripherem Blut oder als ein Immunmodulator des Th_l-Typs .
Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Zusammensetzung Betelblattextrakt zusammen mit oder in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Zusatzmittel enthält.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Zusatzmittel in einer solchen Weise gewählt wird, dass es die Aktivität des lyophilisierten Betelblattextrakts nicht stört.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Zusatzmittel aus Nährstoffen, wie Proteine, Kohlehydrate, Zucker, Talkum, Magnesiumstearat, Cellulose, Calciumcarbonat, Stärke-Gelatine-Paste und/oder pharmazeutisch akzeptablen Trägern, Streckmitteln, Verdünnungsmitteln oder Lösemitteln ausgewählt wird.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der wässrige Extrakt, das lyophilisierte Produkt oder die Zusammensetzung oral oder intramuskulär verabreicht werden.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der orale Weg in Form einer Kapsel, eines Sirups, Konzentrats, Pulvers oder Granulats beschritten wird.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei das Verhältnis von Betelblattextrakt zu Zusatzmittel im Bereich zwischen 10-1:1-10 liegt.
Verwendung nach Anspruch 13, wobei der Betelblattextrakt, lyophilisierte Extrakt oder die Zusammensetzung, die den Betelblattextrakt enthält, mit einer Dosismenge zwischen 5 bis 10 mg/kg Körpergewicht mindestens einmal täglich einen Monat verabreicht werden.
Ein Verfahren zur Behandlung eines Objekts zum Erzielen einer Immunmodulation des Thl-Typs, wobei das Verfahren ein Verabreichen einer pharmazeutisch effektiven Menge von Betelblattextrakt, lyophilisiertem Extrakt oder einer Zusammensetzung, die den Extrakt enthält, an das Objekt umfasst.
Ein Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Zusammensetzung Betelblattextrakt zusammen mit oder in Verbindung mit einem pharmazeutisch akzeptablen Zusatzmittel umfasst.
Ein Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Zusatzmittel in einer solchen Weise gewählt wird, dass es die Aktivität des lyophilisierten Betelblattextrakts nicht stört.
Ein Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Zusatzmittel aus Nährstoffen, wie Proteine, Kohlehydrate, Zucker, Talkum, Magnesiumstearat, Cellulose, Calciumcarbonat, Stärke-Gelatine-Paste, und/oder pharmazeutisch akzeptablen Trägern, Streckmitteln, Verdünnungsmitteln oder Lösemitteln ausgewählt wird.
Ein Verfahren nach Anspruch 21, wobei der wässrige Extrakt, das lyophilisierte Produkt oder die Zusammensetzung oral oder intramuskulär verabreicht werden.
Ein Verfahren nach Anspruch 21, wobei der orale Weg in Form einer Kapsel, eines Sirups, Konzentrats, Pulvers oder Granulats beschritten wird.
Ein Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Verhältnis von Betelblattextrakt zu Zusatzmittel im Bereich zwischen 10-1:1-10 liegt.
Ein Verfahren nach Anspruch 21, wobei der Betelblattextrakt, lyophilisierte Extrakt oder die Zusammensetzung, die den Betelblattextrakt enthält, mit einer Dosismenge zwischen 5 bis 10 mg/kg Körpergewicht mindestens einmal täglich einen Monat verabreicht werden.