DE60319840T2

DE60319840T2 - Poria-Extrakt frei von Secolanostanderivaten, enthaltend Lanostanderivate zur Immunsteigerung

Info

Publication number: DE60319840T2
Application number: DE60319840T
Authority: DE
Inventors: Hang-Ching Lin; Jerming Tseng; Hsiou Yu Ding; Wen-Liang Chang; Chien-Lian Chao; Hsin-Wen Huang
Original assignee: Sinphar Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Sinphar Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2003-11-25
Filing date: 2003-11-25
Publication date: 2009-04-09
Anticipated expiration: 2023-11-26
Also published as: DE60319840D1; EP1535619A1; EP1535619B1; ATE389410T1

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Poria-Extrakt gemäß den beigefügten Patentansprüchen, der Lanostan als eine wirksame Komponente davon zum Steigern der Immunität enthält. Die vorliegende Erfindung bezieht sich insbesondere auf einen Extrakt von Poria cocos (Schw) Wolf zum Zweck der Immunitätssteigerung.
Der Poria-Extrakt hat sowohl eine tonische Wirkung als eine beruhigende Wirkung bei Magenstörungen. Gemäß der chinesischen Medizin wird der Poria-Extrakt als Tranquilizer und als diuretisches Mittel klassifiziert. Zusätzlich wird der Poria-Extrakt als einer der wesentlichen Bestandteile der chinesischen Medizinverschreibung für vitale Aktivität verwendet. Auf der Grundlage von Forschungen und Versuchen, die in den letzten Jahren bezüglich der pharmakologischen Wirkung des Poria-Extrakts durchgeführt worden sind, ist geschlossen worden, dass der Poria-Extrakt eine vorteilhafte Wirkung auf die Tumorverhinderung hat und dass der Poria-Extrakt vorteilhaft ist für die Immunitätssteigerung und das gastrointestinale System einer Person, die an einer chronischen Erkrankung leidet.
Als Beispiel beschreiben die japanischen Patentveröffentlichungen Nr.55-111791 und 57-38794 einen Extrakt, der aus dem kultivierten Myzel von Poria cocos (Schw) Wolf erhalten wird und bei der Tumorverhinderung wirksam ist. Die japanische Patentveröffentlichung Nr. 55-111422 beschreibt einen Extrakt, der direkt aus Poria cocos (Schw) Wolf zur Verwendung bei der Tumorverhinderung erhalten wird. Die japanische Patentveröffentlichung Nr. 8-119864 beschreibt einen Extrakt, der durch Extrahieren von Poria cocos (Schw) Wolf mit Methanol erhalten wird. Durch Abtrennung werden Triterpenverbindungen, wie Lanostane und Secolanostane, aus dem Extrakt erhalten und als antiemetische Mittel verwendet. Die japanische Patentveröffentlichung Nr. 9-025232 beschreibt Triterpenverbindungen, die durch Extrahieren von Poria cocos (Schw) Wolf mit Methanol erhalten werden. Die Verbindungen sind als Hemmungsmittel der Tumorförderung verwendbar. Die japanische Patentveröffentlichung Nr. 9-176184 beschreibt einen Extrakt von Poria cocos (Schw) Wolf, der dann raffiniert wird zur Herstellung von Triterpenverbindungen zur Verwendung als Mittel zur Hemmung von Entzündung und Tumorförderung.
Die chinesische Patentveröffentlichung Nr. 1008183 beschreibt ein Verfahren zum Herstellen eines Poria-Extrakts, der Triterpenverbindungen enthält. Das Verfahren umfasst das Extrahieren von Poria-Pulver mit einem sauren Alkohol, das Neutralisieren des Extrakts mit einer basischen Lösung, das Konzentrieren der neutralisierten Lösung, das Einstellen ihres pH auf etwa 10 und das Filtrieren der Lösung, das Ansäuern des Filtrats zur Bildung einer Ausfällung, das Waschen der Ausfällung nach der Filtration und das Trocknen der gewaschenen Ausfällung. Es wird festgestellt, dass der so erhaltene Poria-Extrakt eine tumorverhindernde Wirkung und eine Immunitätsaktivierungswirkung hat.
CN 1146915 beschreibt eine Antikrebszusammensetzung, die Coixsamenpolyose, Yamspolyose, Pachyman, Coixenolid, Pachymsäure und Polystictin enthält und dazu dienen kann, die Immunität zu verbessern und die Leukozyten für Patienten nach einer Chemotherapie zu erhöhen.
JP 2001 206830 beschreibt eine Zusammensetzung für die Mundhöhle, die eine hohe Hemmungswirkung auf die Zahnplaquebildung hat. Diese Zusammensetzung verwendet sowohl ein wasserlösliches oder kaum wasserlösliches β-D-Glucan und eine oder mehrere Arten, ausgewählt aus Verbindungen, die zu Monoterpen, Sesquiterpen, Diterpen und Triterpen gehören.
Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, einen neuen Poria-Extrakt zur Steigerung der Immunität eines Säugers bereitzustellen.
Diese Aufgabe ist gelöst durch einen Poria-Extrakt, der zur Immunsteigerung eines Säugers befähigt ist, enthaltend 5 bis 60%, bezogen auf das Gewicht des Extrakts, eines Lanostans mit der folgenden chemischen Formel (I) und der im Wesentlichen frei von Secolanostan ist:
worin R₁ entweder H oder CH₃ ist, R₂OCOCH₃, =O oder OH ist, R₃ H oder OH ist, R₄ -C(=CH₂)-C(CH₃)₂R_a ist, worin R_a H oder OH oder -CH=C(CH₃)-R_b ist, worin R_b CH₃ oder CH₂OH ist, R₅ H oder OH ist und R₆ CH₃ oder CH₂OH ist.
Die vorliegende Erfindung verwendet die Immunitätsversuche, um die pharmakologischen Eigenschaften der wirksamen Komponente des Poria-Extrakts zu verifizieren. Die wirksame Komponente ist ein Teil mit niedriger Polarität (PCM), der Hauptkomponenten K1, K2, K3, K4 und Spuren von K4a, K4b, K5, K6a und K6b enthält, die alle Lanostanverbindungen sind. Die Verbindungen K1, K2, K3 und K4 haben eine immunitätssteigernde Wirkung.
Der Poria-Extrakt der vorliegenden Erfindung wird durch ein Verfahren hergestellt, welches das übliche Extraktionsverfahren verwendet, mittels welchem ein Rohextrakt erhalten wird. Eine chromatografische Trennung wird verwendet, um Bestandteile des Rohextrakts zu trennen, der eine Lanostanfraktion und eine Secolanostanfraktion enthält. Die Lanostanfraktion hat eine relativ geringere Polarität als die Secolanostanfraktion. Die Lanostanfraktion wird erhalten unter Verwendung eines Eluiermittels, hergestellt aus Dichlormethan:Methanol = 96:4, während die Secolanostanfraktion erhalten wird durch Verwendung eines Eluiermittels, hergestellt aus Dichlormethan:Methanol = 90:10 oder 0:100. Die Position der Lanostanfraktion wird durch Dünnschichtchromatografie identifiziert, die einen chromatografischen Rf-Wert von 0,1 hat, wenn eine Entwicklungslösung von Dichlormethan:Methanol = 96:4 verwendet wird. Der chromatografische Wert der Secolanostanfraktion ist kleiner als 0,1. Durch eine Silicagelsäulenchromatografie wird die Lanostanfraktion in verschiedene Lanostanverbindungen mit einem Eluiermittel aufgetrennt, das aus Dichlormethan:Methanol = 97:3 bis 95:5 hergestellt ist.
Gemäß dem Verfahren werden 2,6 Gramm PCM aus einem Kilogramm Poria cocos (Schw) Wolf erhalten. Gemäß dem Verfahren der chinesischen Patentveröffentlichung Nr. 1008183 werden drei Gramm eines Rohextrakts aus einem Kilogramm Poria cocos (Schw) Wolf erhalten. Wenn dieser Rohextrakt durch das Verfahren der vorliegenden Erfindung gereinigt wird, wird nur ein Gramm PCM erhalten.
Die Merkmale der vorliegenden Erfindung werden einfacher verstanden nach einer aufmerksamen Überlegung der folgenden ausführlichen Beschreibung der Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung mit Bezug auf die beigefügten Zeichnungen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein Fließdiagramm eines Verfahrens zum Herstellen von Lanostanverbindungen aus Poria cocos (Schw) Wolf.
2 zeigt ein Fließdiagramm der Herstellung eines Poria-Extrakts gemäß einem in der chinesischen Patentveröffentlichung Nr. 1008183 beschriebenen Verfahren und einen Teil mit niedriger Polarität des Poria-Extrakts gemäß der vorliegenden Erfindung.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung wiederholten das Beispiel, das in der chinesischen Patentveröffentlichung Nr. 1008183 beschrieben wurde, unter Verwendung von Poria cocos (Schw) Wolf, das in China angebaut war. Durch eine Säureextraktion und alkalische/saure Behandlungen wurden 3 Gramm eines rohen Poria-Extrakts aus einem Kilogramm Poria cocos (Schw) Wolf erhalten. Dies ist in Übereinstimmung mit dem Bereich von 2,5 g ± 0,5 g, der in der vorstehend genannten chinesischen Patentveröffentlichung beschrieben ist. Als Ergebnis einer weiteren Trennung wurden 400 mg gereinigte Lanostanverbindungen erhalten. Mit anderen Worten enthält der Extrakt, der gemäß der in der vorstehend genannten chinesischen Patentveröffentlichung beschriebenen Verfahren erhalten wird, etwa 13% Lanostanfraktion, wobei 87% des Extrakts die Secolanostanfraktion und andere nicht identifizierte Bestandteile sind.
Als Ergebnis von weiteren Versuchen, die von den Erfindern der vorliegenden Erfindung durchgeführt wurden, hat die Lanostanfraktion keine toxische Wirkung auf Milzzellen von Ratten und ist pharmakologisch wirksam. Die Secolanostanfraktion hat eine toxische Wirkung auf Milzzellen von Ratten.
Die vorliegende Erfindung beschreibt einen Poria-Extrakt, der zur Immunitätssteigerung eines Säugers, wie eines Menschen, befähigt ist. Der Poria-Extrakt enthält 5 bis 60% eines Lanostans der folgenden chemischen Formel (I), bezogen auf das Gewicht des Extrakts, und ist im Wesentlichen frei von Secolanostan:
worin R₁ entweder H oder CH₃ ist, R₂ OCOCH₃, =O oder OH ist, R₃ H oder OH ist, R₄ -C(=CH₂)-C(CH₃)₂R_a ist, worin R_a H oder OH oder -CH=C(CH₃)-R_b ist, worin R_b CH₃ oder CH₂OH ist, R₅ H oder OH ist und R₆ CH₃ oder CH₂OH ist.
Der Poria-Extrakt enthält 5 bis 60%, bevorzugt 10 bis 20%, des Lanostans (I), bezogen auf das Gewicht des Extrakts.
Ein Verfahren zur Herstellung des Poria-Extrakts wird beschrieben. Das Verfahren umfasst einen ersten Schritt, in welchem die Metabolite, die Fermentationsprodukte und das Sklerotium von Poria cocos (Schw) Wolf mit einem Lösemittel, wie Wasser, Methanol, Ethanol oder einer Mischung davon, extrahiert werden, wodurch ein flüssiger Extrakt erhalten wird, der dann zur Bildung einer konzentrierten Substanz konzentriert wird. Die konzentrierte Substanz wird in eine Silicagelsäule eingeführt und wird mit einem Eluierungsmittel mit einer niedrigen Polarität eluiert. Als Ergebnis wird ein Eluat erhalten und gesammelt. Das Eluat wird zum Bilden eines konzentrierten Eluats konzentriert, das einen chromatografischen Rf-Wert von 0,1 entsprechend einer Dünnschichtchromatografie hat, die mit einem gemischten Lösemittel von Dichlormethan:Methanol = 96:4 entwickelt wird und durch eine Ultraviolettlampe und Ioddampf nachgewiesen wird.
Es wird vorgeschlagen, dass die Extraktion unter Verwendung von 95% Ethanol durchgeführt wird.
Bevorzugt wird die konzentrierte Substanz weiter mit einem Zweiphasen-Lösemittel extrahiert, das Methanol und n-Hexan in einem volumetrischen Verhältnis von 1:1 enthält. Die Methanolschicht wird abgetrennt und wird zur Bildung eines Konzentrats konzentriert, das als Zufuhrmaterial für die Silicagelsäule verwendet wird.
Es wird empfohlen, dass das Eluiermittel mit niedriger Polarität ein gemischtes Lösemittel ist, das Dichlormethan und Methanol in einem volumetrischen Verhältnis von 96,5:3,5 enthält.
Bevorzugt hat das Lanostan (I) die folgenden Strukturen:
Die vorliegende Erfindung beschreibt auch die Verwendung des Poria-Extrakts der vorliegenden Erfindung bei der Herstellung eines Medikaments zur Immunitätssteigerung eines Säugers.
Beispiel 1
Wie in 1 erläutert, wurde ein Poria-Pulver aus 30 Kilogramm von in China gewachsenem Poria cocos (Schw) Wolf hergestellt. Das Poria-Pulver wurde 24 Stunden mit 120 Liter 95%igem Alkohol extrahiert. Die Mischung wurde zum Erhalt eines Filtrats filtriert. Der Rückstand wurde extrahiert und für weitere drei Zyklen filtriert. Die Filtrate wurden vereinigt und konzentriert zum Erhalt eines getrockneten Extrakts in einer Menge von 265,2 Gramm. Der trockene Extrakt wurde einer Verteilungsextraktion mit einem Zweiphasen-Extraktionsmittel (n-Hexan:95%iges Methanol = 1:1) unterworfen, und die Methanolschicht wurde daraus entfernt, die dann zum Erhalt eines trockenen Feststoffs in einer Menge von 246,9 Gramm konzentriert wird. Eine Abtrennung des trockenen Feststoffs wurde mittels einer Silicagelsäule durchgeführt, die mit dem 10- bis 40-fachen des Gewichts des trockenen Feststoffs mit Silicagel gefüllt war. Das Silicagel mit einer Maschenzahl von 70 bis 230 (Durchmesser) war von Merck Corporation mit einem Code von Silica Gel 60 hergestellt. Die Säule wurde durch die folgenden Eluate aufeinanderfolgend eluiert: ein gemischtes Lösemittel aus Dichlormethan:Methanol = 96:4, ein gemischtes Lösemittel aus Dichlormethan:Methanol = 90:10 und reines Methanol. Die Eluate wurden durch Dünnschichtchromatografie (TLC) geprüft, worin eine Ultraviolettlampe und Ioddampf für den Nachweis verwendet wurden, und ein gemischtes Lösemittel aus Dichlormethan:Methanol = 96:4 wurde als Entwicklungsflüssigkeit verwendet. Die Eluate mit ähnlichen Bestandteilen in der TLC wurden vereinigt.
Die mit dem gemischten Lösemittel aus Dichlormethan:Methanol = 96:4 durchgeführte Flution führte zu einem PCM-Teil in einer Menge von 78 Gramm. Das PCM zeigte 6 Spurenpunkte in der Dünnschichtchromatografie. Die erhaltenen Eluate aus den Flutionen, die mit den Eluiermitteln aus Dichlormethan:Methanol = 90:10 und reinem Methanol durchgeführt wurden, wurden zum Erhalt eines PCW-Teils in einer Menge von 168 Gramm vereinigt.
Der PCM-Teil wurde weiter mittels eines Eluiermittels aus Dichlormethan:Methanol = 96,5:3,5 und der Silicagelsäule aufgetrennt. Mit der Dünnschichtchromatografie wurden die Eluate als drei Fraktionen gesammelt, die K1 (Rf = 0,64), PCM-1 (enthaltend Spuren von K1, K3 (Rf = 0,55), K5 (Rf = 0,49)) und PCM-2 (enthaltend K2 (Rf = 0,30), K4 (Rf = 0,24), K6 (Rf = 0,19)) waren. Die K1-Fraktion (3,5 g) wurde weiter einer Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC) unter Verwendung einer Kohlenstoff-l8-Säule und einer mobilen Phase aus Methanol-Wasser (90:10) unterworfen. Es wurden 3,0 Gramm der K1-Komponente erhalten.
Die PCM-1-Fraktion wurde mit der gleichen HPLC und einer mobilen Phase aus Methanol-Wasser (87:13) in die Komponenten K3, K5 und eine Spur K1 aufgetrennt. Die K3-Komponente wurde weiter zum Erhalt von K3 (1,93 g) mittels der gleichen HPLC und einer mobilen Phase aus Methanol-Wasser (84:16) gereinigt. Die K5-Komponente wurde mit der gleichen HPLC und zwei mobilen Phasen aus Methanol-Wasser (93:7) und (91:9) aufeinanderfolgend zum Erhalt von K5 (47,6 mg) gereinigt.
Mit der gleichen HPLC und einer mobilen Phase aus Methanol-Wasser (87:13) wurde die PCM-2-Fraktion in die K6-Spurenkomponente (K6a + K6b), die K4-Spurenkomponente (K4a + K4b), die K2-Komponente und die K4-Komponente aufgetrennt. Unter Verwendung der gleichen HPLC und einer mobilen Phase aus Methanol-Wasser (84:16) wurden die K2-Komponente und die K4-Komponente weiter zum Erhalt von K2 (6,2 g) und K4 (0,55 g) gereinigt.
Mit der gleichen HPLC und einer mobilen Phase aus CH₃CN-Wasser (68:32) wurde die K6-Spurenkomponente zum Erhalt von K6a (21,4 mg) und K6b (90,7 mg) gereinigt. Die K4-Spurenkomponente wurde der gleichen HPLC und einer mobilen Phase aus Methanol-Wasser (76:24) zum Erhalt von K4a (66,0 mg) und K4b (86,8 mg) unterworfen.
Die vorstehend genannten K1- bis K6-Verbindungen haben folgende analytische Daten:
K1: Mischung, EI-MS: Hauptkomponente, 528[M]⁺; Spurenkomponente, 526[M]⁺ K1 (Hauptkomponente): ¹³C-NMR (δc):35,4 (c-1), 24,5 (c-2), 80,6 (c-3), 38,0 (c-4), 50,7 (c-5), 18,4 (c-6), 26,8 (c-7), 135,0 (c-8), 134,4 (c-9), 37,2 (c-10), 20,9 (c-11), 29,7 (c-12), 48,8 (c-13), 46,3 (c-14), 43,6 (c-15), 26,6 (c-16), 57,3 (c-17), 17,8 (c-18), 19,2 (c-19), 48,6 (c-20); 178,6 (c-21), 31,6 (c-22), 33,2 (c-23), 156,1 (c-24), 34,1 (c-25), 22,0 (c-26), 21,9 (c-27), 28,0 (c-28), 16,8 (c-29), 25,4 (c-30), 107,0 (c-31), 21,1 (CH₃COO-), 170,5 (CH₃ COO-).
K1 (Spurenkomponente): ¹³C-NMR (δc): 35,6 (c-1), 24,5 (c-2), 80,6 (c-3), 37,8 (c-4), 49,7 (c-5), 23,1 (c-6), 120,6 (c-7), 142,8 (c-8), 145,8 (c-9), 37,6 (c-10), 117,0 (c-11), 36,3 (c-12), 49,4 (c-13), 45,1 (c-14), 44,4 (c-15), 76,4 (c-16), 57,6 (c-17), 17,6 (c-18), 22,8 (c-19), 48,4 (c-20), 178,5 (c-21), 31,4 (c-22), 33,2 (c-25), 156,0 (c-24), 34,1 (c-25), 22,0 (c-26), 21,9 (c-27), 28,2 (c-28), 17,1 (c-29), 26,5 (c-30), 107,0 (c-31), 21,1 (CH₃COO-), 170,4 (CH₃ COO-).
K2: Mischung, EI-MS: Hauptkomponente, 486[M]⁺; Spurenkomponente, 484[M]⁺ K2 (Hauptkomponente): ¹³C-NMR (δc): 36,6 (c-1), 29,1 (c-2), 78,5 (c-3), 40,0 (c-4), 51,4 (c-5), 19,2 (c-6), 27,4 (c-7), 135,4 (c-8), 135,3 (c-9), 37,9 (c-10), 21,4 (c-11), 30,2 (c-12), 49,3 (c-13), 46,7 (c-14), 44,2 (c-15), 77,1 (c-16), 57,8 (c-17), 18,2 (c-18), 19,8 (c-19), 49,2 (c-20), 179,4 (c-21), 32,1 (c-22), 33,7 (c-23), 156,5 (c-24), 34,6 (c-25), 22,5 (c-26), 22,4 (c-27), 29,1 (c-28), 16,8 (c-29), 25,9 (c-30), 107,5 (c-31).
K2 (Spurenkomponente): ¹³C-NMR (δc): 36,7 (c-1), 29,1 (c-2), 78,5 (c-3), 40,0 (c-4), 49,8 (c-5), 24,3 (c-6), 121,2 (c-7), 143,3 (c-8), 145,2 (c-9), 38,0 (c-10), 118,1, (c-11), 37,2 (c-12), 45,5 (c-13), 49,1 (c-14), 44,8 (c-15), 76,8 (c-16), 58,0 (c-17), 18,1 (c-18), 22,9 (c-19), 48,0 (c-20), 179,4 (c-21), 31,9 (c-22), 33,7 (c-23), 156,5 (c-24), 34,6 (c-25), 22,9 (c-26), 22,4 (c-27), 29,1 (c-28), 16,8 (c-29), 26,8 (c-30), 107,5 (c-31).
K3: Fp: 278–280°C
[α]_D ²⁴ + 3° (c 0,6, Pyridin)
EI-MS m/z: 482[M]⁺, ¹³C-NMR (δc): 37,5 (c-1), 35,7 (c-2), 216,7 (c-3), 48,3 (c-4), 51,8 (c-5), 24,6 (c-6), 121,4 (c-7), 143,5 (c-8), 145,4 (c-9), 38,2 (c-10), 118,3 (c-11), 36,9 (c-12), 45,7 (c-13), 50,0 (c-14), 44,9 (c-15), 77,2 (c-16), 58,1 (c-17), 18,3 (c-18), 22,7 (c-19), 49,2 (c-20), 179,6 (c-21), 32,0 (c-22), 33,8 (c-23), 156,7 (c-24), 34,8 (c-25), 22,7 (c-26), 22,6 (c-27), 26,3 (c-28), 23,1 (c-29), 27,1 (c-30), 107,8 (c-31).
K4: Fp: >300°C
[α]_D ²⁴ + 18° (c 0,5, Pyridin)
EI-MS m/z: 484[M]⁺, ¹³C-NMR (δc): 31,4 (c-1), 27,4 (c-2), 76,0 (c-3), 38,6 (c-4), 44,5 (c-5), 24,2 (c-6), 122,0 (c-7), 143,5 (c-8), 147,4 (c-9), 38,6 (c-10), 116,9 (c-11), 37,0 (c-12), 45,9 (c-13), 50,2 (c-14), 45,1 (c-15), 77,3 (c-16), 58,2 (c-17), 18,4 (c-18), 23,7 (c-19), 49,3 (c-20), 179,8 (c-21) 32,1 (c-22), 33,9 (c-23), 156,7 (c-24), 34,9 (c-25), 22,8 (c-26), 22,6 (c-27), 29,9 (c-28), 23,9 (c-29), 27,3 (c-30), 107,9 (c-31).
K4a: Fp: 284–287°C
[α]_D ²⁴ + 44° (c 0,5, Pyridin)
EI-MS m/z: 498[M]⁺, ¹³C-NMR (δc): 35,9 (c-1), 37,1 (c-2), 217,3 (c-3), 53,5 (c-4), 43,9 (c-5), 24,5 (c-6), 121,5 (c-7), 143,7 (c-8), 144,9 (c-9), 37,9 (c-10), 119,0 (c-11), 36,9 (c-12), 45,9 (c-13), 50,0 (c-14), 45,0 (c-15), 77,3 (c-16), 58,2 (c-17), 18,5 (c-18), 23,3 (c-19), 49,4 (c-20), 179,9 (c-21), 32,2 (c-22), 34,1 (c-23), 157,0 (c-24), 34,9 (c-25), 22,8 (c-26), 22,7 (c-27), 19,4 (c-28), 67,5 (c-29), 26,9 (c-30), 107,8 (c-31).
K4b: Fp: 230–232°C
[α]_D ²⁴ + 38° (c 0,5, Pyridin)
EI-MS m/z: 542[M]⁺, ¹³C-NMR (δc): 36,6 (c-1), 25,0 (c-2), 82,1 (c-3), 39,4 (c-4), 56,7 (c-5), 68,9 (c-6), 129,2 (c-7), 142,1 (c-8), 145,8 (c-9), 39,2 (c-10), 117,9 (c-11), 36,9 (c-12), 45,8 (c-13), 49,9 (c-14), 44,9 (c-15), 77,3 (c-16), 58,1 (c-17), 18,4 (c-18), 24,8 (c-19), 49,3 (c-20), 179,9 (c-21), 32,1 (c-22), 33,9 (c-23) 156,7 (c-24), 34,9 (c-25), 22,8 (c-26), 22,7 (c-27), 31,9 (c-28), 18,1 (c-29), 27,1 (c-30), 107,9 (c-31), 22,0 (CH₃COO-), 172,0 (CH₃ COO-)
K5: Fp: 274–275°C
[α]_D ²⁴ + 10° (c 0,5, Pyridin)
EI-MS m/z: 454[M]⁺, ¹³C-NMR (δc): 36,8 (c-1), 29,6 (c-2), 79,0 (c-3), 38,6 (c-4), 50,6 (c-5), 24,3 (c-6), 122,1 (c-7), 143,6 (c-8), 147,3 (c-9), 37,2 (c-10), 117,5 (c-11), 34,1 (c-12), 45,0 (c-13), 51,3 (c-14), 30,8 (c-15), 28,1 (c-16), 48,9 (c-17), 17,4 (c-18), 23,7 (c-19), 49,9 (c-20), 179,9 (c-21), 32,4 (c-22), 27,5 (c-23), 124,3 (c-24), 132,7 (c-25), 26,6 (c-26), 18,6 (c-27), 29,2 (c-28), 17,1 (c-29), 26,7 (c-30).
K6a: Fp: 248 – 250°C
[α]_D ²⁴ + 63° (c 0,4, Pyridin)
EI-MS m/z: 498[M]⁺, ¹³C-NMR (δc): 37,1 (c-1), 35,0 (c-2), 219,0 (c-3), 48,4 (c-4), 57,0 (c-5), 68,0 (c-6), 128,6 (c-7), 141,8 (c-8), 144,2 (c-9), 38,3 (c-10), 120,2 (c-11), 36,6 (c-12), 45,8 (c-13), 49,7 (c-14), 44,8 (c-15), 77,2 (c-16), 58,1 (c-17), 18,4 (c-18), 22,7 (c-19), 49,4 (c-20), 179,6 (c-21), 32,1 (c-22), 33,9 (c-23), 156,8 (c-24), 34,9 (c-25), 22,8 (c-26), 22,7 (c-27), 31,5 (c-28), 24,5 (c-29), 26,6 (c-30), 107,9 (c-31).
K6b: Fp: 267 – 270°C
[α]_D ²⁴ + 68° (c 0,3, Pyridin)
EI-MS m/z: 516[M]⁺, ¹³C-NMR (δc): 34,4 (c-1), 29,4 (c-2), 74,1 (c-3), 42,6 (c-4), 87,7 (c-5), 133,1 (c-6), 134,7 (c-7), 79,6 (c-8), 145,8 (c-9), 42,1 (c-10), 120,7 (c-11), 36,8 (c-12), 49,1 (c-13), 48,7 (c-14), 42,7 (c-15), 76,8 (c-16), 57,6 (c-17), 19,0 (c-18), 29,3 (c-19), 49,1 (c-20), 179,6 (c-21), 32,2 (c-22), 33,9 (c-23), 156,8 (c-24), 34,9 (c-25), 22,9 (c-26), 22,7 (c-27), 25,1 (c-28), 20,3 (c-29), 20,8 (c-30), 107,9 (c-31).
Die Strukturen der Verbindungen K1 bis K6 sind nachstehend wie folgt aufgeführt:
Beispiel 2
Ein Pulver wurde aus zwei Kilogramm von in China gewachsenem Poria cocos (Schw) Wolf hergestellt. Unter Verwendung des Verfahrens, das in der chinesischen Patentveröffentlichung Nr. 1008183 beschrieben ist, wurde ein Rohextrakt in einer Menge von 6,0 g erhalten, wie in 2 gezeigt. Unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Schritte wurde der Rohextrakt einer Silicagelsäulenchromatografie unterworfen und mit einem gemischten Lösemittel aus Dichlormethan:Methanol = 96:4 zum Erhalt eines PCM-E-Teils (2,0 g) eluiert und mit Dichlormethan:Methanol = 90:10 und reinem Methanol aufeinanderfolgend zum Erhalt eines PCW-E-Teils (2,3 g) eluiert.
PCM-E und PCW-E, hergestellt in Beispiel 2, wurden oral Tieren in einer Dosis von 40 mg/kg pro Tag zur Prüfung der Wirkung dieser zwei Teile auf das Wachstum von Milzzellen (Immunitätszellen) der Tiere verabreicht. Das Immunsystem der Tiere wird gestärkt, wenn das Wachstum ihrer Milzzellen stimuliert wird, und wird nachteilig beeinflusst, wenn das Wachstum von Milzzellen gehemmt wird, d. h. die Milzzellen aufgrund von Toxizität abgetötet werden.
Die Milzzellen wurden fünf Tage in vitro kultiviert, bevor sie bezüglich des Zellwachstums mittels des MTT-Assays geprüft wurden, der durch ein hierin nachstehend beschriebenes immunologisches Untersuchungsverfahren bestimmt wurde. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 aufgeführt. Das Zellwachstum der Milz der Mäuse wurde offensichtlich am dritten Tag und am vierten Tag in der Woche der oralen Verabreichung von PCM-E gefördert. Auf der Grundlage der Statistik besteht kein Unterschied des Zellwachstums der Kontrollgruppe und der Versuchsgruppe. Die Anzahl von lebenden Milzzellen der Mäuse war jedoch offensichtlich niedriger als diejenige der Kontrollgruppe am dritten Tag und am vierten Tag in der Woche der oralen Verabreichung von PCW-E. Mit anderen Worten wird das Zellwachstum der Milz der Versuchsgruppe offensichtlich im Vergleich zu der Kontrollgruppe geschwächt. Dies bedeutet, dass PCW-E zytotoxisch ist.

Die Folgerung ist, dass der Lanostan enthaltende Teil mit niedriger Polarität PCM keine Hemmwirkung auf das Zellwachstum der Milz hat. Zusätzlich hat der PCM-Teil eine fördernde Wirkung auf das Zellwachstum der Milz. Der Secolanostan enthaltende Teil mit hoher Polarität (Rf < 0,1) hat eine Hemmwirkung auf das Zellwachstum der Milz. Der Poria-Extrakt der vorliegenden Erfindung ist frei von der Secolanostanfraktion (PCW-E). Im Gegensatz dazu enthält der Poria-Extrakt, der durch Verfahren des Standes der Technik erhalten wurde, PCW-E, das zur Hemmung des Zellwachstums der Milz befähigt ist. TABELLE 1: Wirkungen von PCM-E und PCW-E auf das Zellwachstum der Milz

Komponente	Dosis (mg/kg/Tag)	in vitro-Wachstum
Komponente	Dosis (mg/kg/Tag)	3. Tag	4. Tag	5. Tag
Kontrollgruppe		0,608 ± 0,042^a	0,777 ± 0,141	0,515 ± 0,055
PCM-E	40	0,890 ± 0,195	0,857 ± 0,137	0,449 ± 0,083
PCW-E	40	0,245 ± 0,072*	0,451 ± 0,020**	0,344 ± 0,132

^a Die Daten sind Mittelwerte ± S. E. M. von fünf Versuchen
* zeigt P < 0,05;
** zeigt P < 0,01

Auf der Grundlage der vorstehenden beiden Beispiele und der Vergleichsergebnisse sind die folgenden Tatsachen etabliert.
Die wirksame Komponente von Poria cocos (Schw) Wolf ist ein Lanostan enthaltender Teil mit niedriger Polarität, der befähigt ist, die Immunität des menschlichen Körpers zu steigern.
Eine Silicagel-Dünnschichtchromatografie und eine Silicagelsäulenchromatografie kann verwendet werden, um die fördernden Komponenten von den hemmenden Komponenten von Poria cocos (Schw) Wolf abzutrennen.
Der durch das vorstehend genannte Verfahren erhaltene Poria-Extrakt ist frei von den hemmenden Komponenten, die Secolanostane und hoch polare Moleküle sind, die in dem Teil mit hoher Polarität PCW-E enthalten sind
Die Tierversuche der vorliegenden Erfindung werden durch orale Verabreichung von PCM-E und PCW-E an Tiere durchgeführt. Mit anderen Worten werden die Verabreichungen von PCM-E und PCW-E in vivo und nicht in vitro vorgenommen, da eine in vitro-Studie der pharmazeutischen Verbindung auf Milzzellen nicht die tatsächlichen Wirkungen der pharmazeutischen Verbindung auf das Zellwachstum der Tiermilz widerspiegelt aufgrund des Fehlens von Wechselwirkungen zwischen dem Zellmetabolismus und der pharmazeutischen Verbindung. Es ist daher rasch ersichtlich, dass die vorliegende Erfindung verlässlich und aussagekräftig ist.
Der Poria-Extrakt und die durch Chromatografie gereinigten Verbindungen aus dem Poria-Extrakt, hergestellt gemäß dem vorstehend genannten Verfahren, wurden durch verschiedene Immunitätsreaktionsversuche geprüft, die im Folgenden aufgeführt sind. Die PCM-Fraktion des Poria-Extraktes und die daraus in Beispiel 1 gereinigten Lanostanverbindungen K1, K2, K3 und K4 zeigen immunitätssteigernde Wirkungen in Immunzellen (T-Zellen/B-Zellen) in den folgenden Immunitätsreaktionsprüfungen, und, wie in Tabelle 2 bis Tabelle 10 gezeigt, sind die Verbindungen K1, K2, K3 und K4 wirksam bei einer Dosierung so niedrig wie 2,5 oder 5,0 mg/kg.
Versuche
Versuchsgere
Durch den ganzen Versuch hindurch wurden 6 bis 8 Wochen alte männliche BALG/c-Mäuse verwendet. Die Tiere wurden von dem National Laborstory Animal Center, Taipei, Taiwan erworben. Die Mäuse wurden in dem individuellen Ventilationskäfigsystem untergebracht, das eine spezielle pyrogenfreie Umgebung bereitstellte. Die Einrichtungen hatten einen 12 Stunden-Tag/Nacht-Rhythmus, 24 bis 26°C und 30 bis 70% Feuchtigkeit in der Luft. Die Mäuse wurden mit autoklaviertem Wasser und Nagerfutter gefüttert, und die Streu wurde ebenfalls durch einen Autoklav sterilisiert. Das von dem Tierzentrum der National Taiwan University erworbene Futter bestand aus rohen Proteinen (> 23,0%), rohem Fett (> 4,5%), roher Faser (< 6,0%), Asche (< 8,0%), zugesetzten Mineralien (< 3,0%) und Wasser (< 12%). Nach dem Transport wurden die Mäuse zwei Wochen ausruhen gelassen, bevor die Versuche begonnen wurden.
Tierbehandlung
Für die Wirkstoffbehandlung wurden die Tiere in vier Gruppen und orale Verabreichung mit 1 ml PCM in dem Bereich von 10, 40 bis 80 mg/kg/Tag für vier Tage aufgeteilt. Für die Studien mit gereinigtem PCM K1, K2, K3 und K4 hatte die Dosierung der oralen Verabreichung einen Bereich von 2,5, 5, 10 und 20 mg/kg/Tag, was ein Viertel der Dosierung war, die für die PCM-Studie verwendet wurde. Die Kontrollgruppe waren die Mäuse, die mit einem gleichen Volumen Kochsalzlösung (0,85% NaCl) gefüttert wurden. Die Mäuse wurden am Tag fünf getötet, und sowohl das Serum als auch die Milzzellen wurden gesammelt. Die Seren wurden anschließend verwendet, um die Konzentration von IgG, IgM und IgA zu messen. Die Milzzellen wurden auf eine Kulturplatte mit einem Durchmesser von 100 mm plattiert und drei Stunden bei 37°C inkubiert. Die nicht anhaftenden Zellen, die T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und NK-Zellen enthielten, wurden gesammelt und in geeigneter Weise verdünnt, wie in jedem Assay beschrieben.
Wirkstoffpräparation
Das trockene Pulver von PCM, PCM K1, K2, K3 und K4 wurden in sterilem Wasser suspendiert, gefolgt von einer Ultraschallbehandlung, um die großen Teilchen aufzubrechen. Die Suspension von feinen Teilchen wurde zur Fütterung der Tiere verwendet.
Isolierung von Milzlymphozyten
Der zu tötenden Maus wurde der Hals verrenkt und mit 70% Ethanol sterilisiert. Zuerst wurde eine Herzpunktion durchgeführt, um das Blut abzuziehen. Nach der Hämagglutination wurde die Blutprobe einer Zentrifugation unterworfen, und das Serum wurde gesammelt. Zur Isolierung von Milzzellen wurde das Peritoneum geöffnet, um die Milz zu entfernen. Die frische Milz wurde auf eine Kulturplatte überführt, die 10 ml RPMI 1640-Kulturmedium enthielt. Die MHz wurde dann über einem feinen Sieb gemahlen, um die Milzzellen freizusetzen. Die in dem Medium suspendierten Milzzellen wurden dann entfernt und in ein 50 ml konisches Zentrifugenrohr überführt. Das Rohr wurde 10 Minuten einer Zentrifugation bei 1300 Upm unterworfen. Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde in 1 ml kaltem lysierendem RBC-Puffer, der EDTA-NH₄Cl enthielt, wieder suspendiert. Die Zellen wurden 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von dreimaligem Waschen der Zellen mit Kulturmedium durch Zentrifugation. Die Milzzellen wurden auf eine Kulturplatte mit einem Durchmesser von 100 mm plattiert und drei Stunden bei 37°C inkubiert. Die nicht anhaftenden Zellen, die T-Lymphozyten, B-Lymphozyten und NK-Zellen enthielten, wurden gesammelt und in geeigneter Weise verdünnt, wie in jedem Assay beschrieben.
MTT-Assay
Der MTT-Assay ist das Verfahren, das routinemäßig zum Abschätzen der Anzahl lebender Zellen und der Lebensfähigkeit der kultivierten Zellen verwendet wird. Das Grundprinzip ist, dass nur Mitochondrien in lebenden Zellen biologisch aktivierte oxido-reduktive Enzyme enthalten. Die Enzyme Wechselwirken mit MTT-Reagenzien und wandeln die Chemikalie in einen relativ unlöslichen blauen Kristall um. Der Kristall wird dann in saurem Isopropanol solubilisiert, und die Extinktion bei 570 nm in jeder Vertiefung wird unter Verwendung eines ELISA-Ablesegeräts (EL311, BioTek, VT) abgelesen. Kurz gesagt, wurden die in einem Medium suspendierten Milzzellen, das RPMI 1640, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, Antibiotika und 1 μg/ml Concanavalin A (Con A), enthielt, in der Platte mit flachem Boden und 96 Vertiefungen (5 × 10⁵ Zellen/100 μl/Vertiefung) 5 Tage kultiviert. Der MTT-Assay wurde am Tag 3, 4 und 5 durchgeführt. MTT-Tetrazolium (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)(5 mg/ml in phosphatgepufferter Kochsalzlösung)(Sigma Chemical, St. Louis, MO) wurde zu den Milzzellen (20 μl MTT pro 100 μl Zellen) zugesetzt, und die Platten wurden 4 Stunden bei 37°C inkubiert. Saures Isopropanol (100 μl 0,04 N HCl in Isopropanol) wurden sämtlichen Vertiefungen zugesetzt und vollständig vermischt, um die dunkelblauen Kristalle aufzulösen. Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur, um sicherzustellen, dass sämtliche Kristalle aufgelöst waren, wurden die Platten auf einem EIA-Lesegerät bei 570 nm abgelesen.
ELISA zum Messen der Konzentration von Immunoglobulinen
Ein ELISA wurde in unserer Studie durchgeführt, um die Immunoglobulinkonzentration zu messen. Kurz gesagt, wurden die Milzzellen (5 × 10⁵ Zellen/ml) 5 Tage in einem Medium kultiviert, das RPMI 1640, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, Antibiotika und 5 μg/ml Lipopolysaccharid (LPS; 1 μg/10⁵ Zellen) enthielt. LPS ist ein polyklonaler Aktivator von B-Lymphozyten. Die Kulturüberstände der Milzzellen wurden am Tag 3, 4 und 5 gesammelt. Die IgA-, IgG- und IgM-Konzentrationen wurden unter Verwendung einer ELISA-Sandwichtechnik gemessen.
1. IgG-Assay:
Eine Mikrotiterplatte (Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp, Nunc, Dänemark) wurde mit 100 ng Einfangantikörpern pro Vertiefung bei 4°C über Nacht vorbeschichtet. Der Einfangantikörper war ein Kaninchen-Antimaus-IgG + IgA + IgM-Antikörper (Zymed Laborstory, CA). Die Platte wurde mit einer PBS-0,05% Tween 20-Lösung gewaschen und mit PBS-1% Gelatine blockiert. Nach dem Blockieren wurden die in geeigneter Weise verdünnten Proben (1/10⁵ verdünnt) und Standard-IgG in dem Bereich von 0,25 μg/ml bis 0,039 μg/ml wurde zugesetzt (100 μl/Vertiefung). Die Platte wurde dann 2 Stunden bei 37°C inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde HRP-konjugiertes Ziege-Antimaus-IgG (1:2000 verdünnt, Antigesamt-IgG-Molekül; Zymed Laborstory, CA) zugesetzt (100 μl/Vertiefung). Nach einstündiger Inkubation bei 37°C war die Farbe unter Verwendung einer Substratlösung entwickelt, die 0,1 M Citratpuffer, pH 4,5, 0,03% H₂O₂ und 0,1% o-Phenylendiamin enthielt. Die Extinktion bei 490 nm in jeder Vertiefung wurde unter Verwendung eines ELISA-Lesegeräts (EL311, Bio-Tek, VT) abgelesen, und die Daten wurden unter Verwendung eines log-logit-Modells analysiert.
2. IgM-Assay:
Das Verfahren für den IgM-Assay war ähnlich zu demjenigen für den IgG-Assay mit der Ausnahme, dass die Proben 1/10⁴ verdünnt wurden und dass Standard-IgM in dem Bereich von 1 μg/ml bis 0,0156 μg/ml zugesetzt wurde (100 μl/Vertiefung). Der sekundäre Antikörper für den Assay war HRP-konjugierter Ziege-Antimaus-IgM (1:1000 verdünnt, schwere Kettespezifisch, Zymed Laborstory, CA).
3. IgA-Assay:
Das Verfahren für den IgA-Assay war ähnlich zu demjenigen für den IgG-Assay mit der Ausnahme, dass die Proben 1/10⁴ verdünnt wurden und dass Standard-IgA in dem Bereich von 1 μg/ml bis 0,0156 μg/ml zugesetzt wurde (100 μl/Vertiefung). Der sekundäre Antikörper für den Assay war HRP-konjugierter Ziege-Antimaus-IgA (1:1000 verdünnt, Zymed Laborstory, CA).
ELISA zum Messen der Konzentration von Zytokin
Für die quantitative Analyse von IFN-γ und IL-10 wurden die Milzzellen (1 × 10⁶ Zellen/ml) 3 Tage in einem Medium kultiviert, das RPMI 1640, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 2 mM L-Glutamin, Antibiotika und 1 μg/ml Concanavalin A (Con A), enthielt. Con A ist einer der polyklonalen Aktivatoren für T-Lymphozyten. Die Kulturüberstände der Milzzellen wurden gesammelt. Die Konzentrationen von IFNγ und IL-10 wurden unter Verwendung eines Zytokin-ELISA-Sets (Cyto Set ELISA-Kit), erworben von R&D Systems (MN, USA), gemessen.
1. IL-10-Assay:
Cyto Set ELISA wurde wie folgt durchgeführt: Eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Nunc-Immuno Plate, MaxiSorp, Nunc, Dänemark) wurde mit Einfangantikörpern bei 4°C über Nacht vorbeschichtet. Der Einfangantikörper war ein monoklonaler Rattenantikörper gegen Maus-IL-10. Die zu prüfenden Proben und Standard-IL-10 in dem Bereich von 500 pg/ml bis 15,6 pg/ml wurden zugesetzt (100 μl/Vertiefung). Die Platte wurde dann 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Am Ende der Inkubation wurde die Platte fünfmal gewaschen, gefolgt von der Zugabe des biotinylierten polyklonalen Ziege-Anti-IL-10-Antikörpers. Die Farbe wurde durch Inkubieren der Platte mit einem HRP-konjugierten Streptoavidin (Zymed, CA, USA) entwickelt, gefolgt von einer Substratlösung, die Wasserstoffperoxid und Tetramethylbenzidin (TMB) enthielt. Die Reaktion wurde 30 Minuten bei Raumtemperatur fortgesetzt und wurde durch Zugabe von 100 μl 2N Schwefelsäure abgestoppt. Die Extinktion bei 450 nm in jeder Vertiefung wurde unter Verwendung eines ELISA-Lesegeräts (EL311, BioTek, Winooski, VT) abgelesen, und die Daten wurden unter Verwendung des log-logit-Modells analysiert.
2. IFN-γ-Assay:
Cyto Set ELISA für IFN-γ war ähnlich zu demjenigen für IL-10 mit der Ausnahme, dass der Einfangantikörper ein monoklonaler Rattenantikörper gegen Maus-IFN-γ war, und der sekundäre Antikörper war ein biotinylierter polyklonaler Ziege-Anti-IFN-γ-Antikorper.
Fließzytometrischer Assay zum Analysieren von T-Zellenpopulationen
Die in vivo Wirkung von PCM auf die CD3 (pan-T-Marker), CD4 (Helfer-T-Zellen-Marker) und CD8 (zytotoxischer T-Zellen-Marker) Molekülexpression auf T-Lymphozyten wurde durch Fließzytometrie gemessen. CD3-, CD4- und CD8-Expressionen wurden unter Verwendung eines konjugierten CY-Chrome-Hamster-Antimaus-CD3-Antikörpers (Becton Dickinson, San Jose, CA), eines PE-konjugierten Hamster-Antimaus-CD4-Antikörpers (Becton Dikinson, San Jose, CA) und eines FITC-konjugierten Hamster-Antimaus-CD8-Antikörpers (Becton Dikinson, San Jose, CA) kontrolliert. Kurz gesagt, wurden die nicht anhaftenden Milzzellen dreimal mit sterilem kaltem PBS gewaschen, gefolgt von Einstellen der Zellen auf 1 × 10⁶ Zellen/ml. Jeweils 1 × 10⁶ Zellen wurden mit 1 μl eines angegebenen fluoreszenzkonjugierten Antikörpers vermischt und 15 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Zellen mit kaltem PBS gewaschen und wurden 10 Minuten durch Zentrifugation bei 200 × g pelletisiert. Das Pellet wurde dispergiert und mit 500 μl 1,0%igem Paraformaldehyd vermischt. Der Prozentsatz der CD3⁺-Zellen in Milzlymphozyten und der Prozentsatz von CD4⁺8^–- und CD4^–8⁺-Zellen in der CD3⁺-Zeltpopulation wurden durch Fließzytometrie analysiert.
Assay für die NK-Zytotoxizität
Zum Messen der durch NK-Zellen vermittelten Zytotoxizität wurde ein durch LEBEND/TOT-Zellen vermittelter Zytotoxizitätskit (Molecular Probes, Eugene, OR) für den Assay verwendet. Dieser Zweifarben-Fluoreszenzassay erlaubt die direkte Bestimmung der durch Zellen vermittelten Zytotoxizität und ergibt Zytotoxizitätsmessungen, die mit dem ⁵¹Cr-Freisetzungsassay gut korrelieren. Die in unserem Assaysystem verwendeten Targetzellen waren YAC-1-Zellen (ATCC, TIB-160). Kurz gesagt wurden die YAC-1-Zellen im exponenziellen Wachstum geerntet und mit vollständigem Kulturmedium (RPMI 1640, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM L-Glutamin und Antibiotika) gewaschen. Die Zellen wurden auf 1 × 10⁶ Zellen/ml eingestellt, und 20 μl DiOC₁₈ (3,3'-Dioctadecyloxacarbocyanin) wurden zu jedem ml der Targetzellen zugesetzt. Die Zellen wurden 20 Minuten bei 37°C inkubiert. Das DiOC₁₈-Reagens erzeugte eine grüne Fluoreszenzmembranfärbung auf den Targetzellen. Die Zellen wurden dann zweimal mit PBS gewaschen und in vollständigem Kulturmedium auf eine Konzentration von 2 × 10⁵ Zellen/ml suspendiert. Die nicht anhaftenden Milzzellen (Effektorzellen) wurden mit Hanks Ausgleichssalzlösung dreimal gewaschen und in komplettem Kulturmedium auf eine Konzentration von 1 × 10 Zellen/ml suspendiert. Die Effektorzellen wurden dann zweifach auf 5 × 10⁶ Zellen/ml und 2,5 × 10⁶ Zellen/ml verdünnt. Um den Assay zu initiieren, wurde das gleiche Volumen (z. B. 200 μl) Effektorzellen und Targetzellen vermischt zum Herstellen des Endverhältnisses von Effektor:Target (E:T-Verhältnis) von 50:1, 25:1 und 12,5:1. Die Zellmischung wurde zwei Stunden bei 37°C inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 50 μl Propidiumiodid. Das Propidiumiodid kann in die Zellen mit geschädigten Plasmamembranen eindringen und den Kern mit roter Fluoreszenz färben. Die Zellen wurden 30 Sekunden durch Zentrifugation bei 1000 × g pelletisiert und weitere 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde das Rohr sanft geklopft, um die Pellets abzulösen, und dann verwirbelt, um sie vollständig wieder zu suspendieren. Die Proben waren zur Analyse in der Fließzytometrie bereit. Die toten Targetzellen hatten eine übereinstimmende grüne Färbung der Membran und eine rote Färbung des Kerns. Die lebenden Targetzellen waren grün auf der Membran. Die toten Effektorzellen hatten jedoch nur eine rote Färbung des Kerns.
Assay für Phagozytose
Die phagozytische Funktion von peritonealen Makrophagen wurde unter Verwendung eines Vybrant Phagocytosis Assay Kits, erworben von Molecular Probes Co. (Eugene, OR), ge prüft. BALB/c-Mäuse wurden in vier Gruppen und orale Verabreichung von 1 ml PCM K1 in dem Bereich von 2,5 mg/kg/Tag bis 20 mg/kg/Tag für vier aufeinanderfolgende Tage aufgeteilt. Die Kontrollgruppe bestand aus Mäusen, denen ein äquivalentes Volumen Kochsalzlösung (0,85% NaCl) injiziert war. Die Tiere wurden i. p. mit 2,5 ml 10%igem Proteosepepton am Tag zwei injiziert und am Tag fünf durch Halsverrenkung getötet. In die Bauchhöhle wurden 2 ml des zweiwertigen kationenfreien, serumfreien DMEM injiziert. Die Höhle wurde 30 Sekunden sanft massiert, und dann wurde die Peritonealflüssigkeit zusammen mit Medium und Peritonealexudatzellen unter Verwendung einer 25G-Spritze abgezogen. Die Zellen wurden mit vollständigem DMEM-Kulturmedium gewaschen und auf 1 × 10 Zellen/ml eingestellt. Die Zellen wurden 10 Minuten auf Eis inkubiert, gefolgt von Vermischen von 1 × 10⁶ Zellen mit 5 × 10⁶ fluoresziert markierten Teilchen. Die Teilchen für den Phagozytoseassay waren fluoresceinmarkierte Escherichia coli (K-12-Stamm)-BioTeilchen (Molecular Probes, Eugene, OR). Die Zellen wurden in eine Versuchsgruppe und eine Kontrollgruppe unterteilt. Die Versuchsgruppe wurde 15 Minuten bei 37°C inkubiert, gefolgt von der Zugabe von 100 μl eiskalter Quenchlösung (1,25 mg/ml Trypanblau). Die Kontrollgruppe wurde dagegen bei 0°C inkubiert. Die Zellen aus beiden Gruppen wurden zweimal mit PBS gewaschen und 5 Minuten durch Zentrifugation bei 150 × g pelletisiert. Die kontaminierten Erythrozyten wurden durch Zusetzen von lysierender ACK-Lösung entfernt. Die Zellen wurden dann wieder 5 Minuten durch Zentrifugation bei 150 × g pelletisiert, und das Pellet wurde dispergiert und mit 500 μl 1,0%igem Paraformaldehyd vermischt. Die Menge der Teilchen, die durch die Peritonealmakrophagen phagozytiert waren, wurde durch Fließzytometrie analysiert.
Statistik
Daten aus der Kontrollgruppe oder der mit Wirkstoff behandelten Gruppe wurden durch ANOVA geprüft. Der Unterschied zwischen den beiden Gruppen wurde unter Verwendung des Mann-Whitneys-Rangsummentests bewertet. Wahrscheinlichkeitswerte von < 0,01 wurden als signifikant angesehen.
ERGEBNISSE
(1) Wachstum von Milzzellen – Wirkungen von PCM und PCM K1, K2, K3 und K4

Wie in den Tabellen 2.1 und 2.2 gezeigt, zeigten Milzzellen, die aus Mäusen isoliert waren, die mit 40 mg/kg/Tag PCM, 5 mg/kg/Tag oder einer höheren Dosis von PCM K1, K3 und K4 oder 10 mg/kg/Tag oder einer höheren Dosis von PCM K2 behandelt waren, am Tag 3 in einer in vitro-Kultur eine signifikant erhöhte Wirkung auf das Zellwachstum. Das Ergebnis legte nahe, dass eine orale Verabreichung von PCM oder von gereinigten Komponenten, wie PCM K1, K2, K3 oder K4 im Allgemeinen das Wachstum von Immunzellen in einem Lymphoidorgan beeinflussten. TABELLE 2.1 Wachstum von Milzzellen – Wirkungen von PCM und PCM K1, K2

Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	Inkubationszeit (Tag)
Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	3	4	5
Kontrolle		0,359 ± 0,076^a	0,481 ± 0,044	0,414 ± 0,067
PCM	10	0,453 ± 0,028	0,398 ± 0,057	0,301 ± 0,059
PCM	40	0,551 ± 0,040*	0,401 ± 0,031	0,445 ± 0,055
PCM	80	0,475 ± 0,083	0,410 ± 0,083	0,447 ± 0,075
K1	2,5	0,497 ± 0,080	0,533 ± 0,070	0,584 ± 0,060*
K1	5	0,642 ± 0,078**	0,652 ± 0,077	0,469 ± 0,054
K1	10	0,743 ± 0,083**	0,733 ± 0,035***	0,562 ± 0,025*
K1	20	0,634 ± 0,048**	0,571 ± 0,091	0,452 ± 0,049
K2	2,5	0,533 ± 0,069*	0,460 ± 0,052	0,414 ± 0,054
K2	5	0,489 ± 0,087	0,480 ± 0,072	0,527 ± 0,062
K2	10	0,928 ± 0,078***	0,931 ± 0,065***	0,585 ± 0,041*
K2	20	0,655 ± 0,075**	0,605 ± 0,072	0,530 ± 0,057

^a Die Daten sind die Extinktion bei 570 nm aus dem Ergebnis des MTT-Assays; Daten sind Mittelwerte ± S. E. M. von zehn ähnlichen Versuchen:
* zeigt p < 0,05,
** zeigt p < 0,01,
*** zeigt p < 0,001 von der Kontrollgruppe.

Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	Inkubationszeit (Tag)
Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	3	4	5
Kontrolle		0,373 ± 0,070^a	0,404 ± 0,033	0,431 ± 0,044
K3	5	1,154 ± 0,172***	0,841 ± 0,160*	0,864 ± 0,194
K3	10	1,020 ± 0,090***	0,900 ± 0,193**	0,957 ± 0,200*
K3	20	1,103 ± 0,081***	1,068 ± 0,132***	0,943 ± 0,159**
K4	5	0,949 ± 0,101**	0,981 ± 0,087***	0,862 ± 0,085**
K4	10	1,198 ± 0,101 ***	1,273 ± 0,147***	1,177 ± 0,078***
K4	20	1,233 ± 0,040***	1,263 ± 0,041***	1,061 ± 0,124***

^a Die Daten sind die Extinktion bei 570 nm aus dem Ergebnis des MTT-Assays; Daten sind Mittelwerte ± S. E. M. von sechs ähnlichen Versuchen:
* zeigt p < 0,05,
** zeigt p < 0,01,
*** zeigt p < 0,001 von der Kontrollgruppe.

(2) Serumwerte von Immunoglobulinen – Wirkungen von PCM und PCM K1, K2, K3 und K4
Die Daten in den Tabellen 3.1 und 3.2 zeigten, dass oral mit 40 mg/kg/Tag PCM behandelte Mäuse den Serumwert von IgG signifikant erhöhten. Mit 5 mg/kg/Tag oder höherer Dosierung von PCM K1, K2 und K4 behandelte Mäuse erhöhten ebenfalls signifikant den Serumwert von IgG. Im Gegensatz dazu zeigten mit 5 mg/kg/Tag oder einer höheren Dosierung von PCM K3 behandelte Mäuse eine signifikante Verringerung des Serumwerts von IgG.

Oral mit 40 mg/kg/Tag PCM, 10 mg/kg/Tag PCM K1, 2,5 mg/kg/Tag PCM K2, 5 mg/kg/Tag PCM K3 und 5 mg/kg/Tag PCM K4 behandelte Mäuse zeigten einen signifikanten Anstieg des Serumwerts von IgM. Die orale Verabreichung von 80 mg/kg/Tag von PCM verringerte signifikant den IgA-Wert im Mausserum. Mit 10 mg/kg/Tag PCM K1 behandelte Mäuse erhöhten jedoch signifikant den Serumwert von IgA. Das Ergebnis aus unserem Versuchssystem zeigte keine Wirkung von PCM K2, K3 und K4 auf die Serumkonzentrationen von IgA. TABELLE 3.1 Serumwert von Immunoglobulinen – Wirkungen von PCM K1 und PCM K2

Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	Immunoglobulinkonzentrationen (mg/ml)
Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	IgG	IgM	IgA
Kontrolle		1,81 ± 0,19^a	0,90 ± 0,18	3,67 ± 0,54
PCM	10	2,38 ± 0,28	1,31 ± 0,13	3,40 ± 0,25
PCM	40	4,36 ± 0,88*	1,96 ± 0,18***	2,54 ± 0,28
PCM	80	4,53 ± 0,92	2,07 ± 0,21***	2,26 ± 0,26*
K1	2,5	1,57 ± 0,32	1,27 ± 0,22	3,51 ± 0,33
K1	5	2,83 ± 0,41*	1,38 ± 0,24	4,03 ± 0,47
K1	10	3,00 ± 0,53**	3,27 ± 0,47***	6,57 ± 0,71**
K1	20	3,74 ± 0,62**	1,46 ± 0,27	3,79 ± 0,35
K2	2,5	1,69 ± 0,24	2,82 ± 0,41***	2,85 ± 0,36
K2	5	2,95 ± 0,17**	3,46 ± 0,61***	2,81 ± 0,28
K2	10	3,75 ± 0,54***	2,58 ± 0,38***	4,33 ± 0,33
K2	20	5,11 ± 0,72***	5,13 ± 0,95***	5,02 ± 0,65

^a Die Daten sind Mittelwerte ± S. E. M. von zehn ähnlichen Versuchen;
* zeigt p < 0,05,
** zeigt p < 0,01,
*** zeigt p < 0,001 von der Kontrollgruppe.

Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	Immunoglobulinkonzentrationen (mg/ml)
Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	IgG	IgM	IgA
Kontrolle		1,80 ± 0,11	1,11 ± 0,13	3,15 ± 0,48
K3	5	1,32 ± 0,09**	1,63 ± 0,11**	3,65 ± 0,26
K3	10	1,28 ± 0,13**	1,53 ± 0,14*	3,81 ± 0,46
K3	20	1,14 ± 0,11**	1,53 ± 0,13*	3,55 ± 0,37
K4	5	3,75 ± 0,18***	2,65 ± 0,21**	3,33 ± 0,13
K4	10	4,33 ± 0,29***	2,86 ± 0,16**	3,39 ± 0,25
K4	20	4,18 ± 0,25***	2,36 ± 0,16**	3,54 ± 0,12

^a Die Daten sind Mittelwerte ± S. E. M. von sechs ähnlichen Versuchen;
* zeigt p < 0,05,
** zeigt p < 0,01,
*** zeigt p < 0,001 von der Kontrollgruppe.

(3) Von Milz-B-Lymphozyten sezerniertes Immunoglobulin – Wirkung von PCM und PCM K1, K2, K3 und K4
3.1 IgG-Sekretion durch Milzzellen in vitro

Wie in den Tabellen 4.1 und 4.2 gezeigt, zeigten Milzzellen, die aus Mäusen isoliert waren, die mit 40 mg/kg/Tag PCM, 5 mg/kg/Tag oder einer höheren Dosis von PCM K1 und 10 mg/kg/Tag oder einer höheren Dosis von PCM K2 behandelt waren, nach drei Tagen von in vitro-Kultur einen signifikanten Anstieg der IgG-Sekretion. Im Gegensatz dazu unterdrückte PCM K3 signifikant die IgG-Sekretion. Milzzellen, die aus den Mäusen isoliert waren, die mit 5 mg/kg/Tag oder einer höheren Dosis von PCM K4 behandelt waren, zeigten eine signifikant erhöhte Wirkung der IgG-Sekretion am Tag 5. Das Ergebnis dieses Versuchs legte nahe, dass die orale Verabreichung von PCM oder von gereinigten Komponenten, wie PCM K1, K2 oder K4, im Allgemeinen das Potenzial von Milz-B-Zellen erhöhte, IgG zu sezernieren. TABELLE 4.1 IgG-Sekretion durch Milzzellen – Wirkungen von PCM und PCM K1 und K2

Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	Inkubationszeit (Tag)
Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	3	4	5
Kontrolle		7,40 ± 1,07^a	10,00 ± 1,42	11,21 ± 1,31
PCM	10	4,24 ± 0,69	6,00 ± 0,97*	6,46 ± 0,94*
PCM	40	16,37 ± 3,11*	17,42 ± 3,41	13,67 ± 3,73
PCM	80	10,84 ± 3,42	8,67 ± 3,33	9,20 ± 3,18
K1	2,5	19,65 ± 5,73	19,88 ± 5,26	13,34 ± 3,66
K1	5	41,53 ± 8,68***	32,94 ± 8,84***	33,27 ± 6,14**
K1	10	38,4 ± 11,09***	30,01 ± 7,40***	34,4 ± 8,27***
K1	20	59,5 ± 13,04***	65,55 ± 17,30***	70,58 ± 20,47***
K2	2,5	8,32 ± 2,53	15,32 ± 3,67	9,02 ± 2,34
K2	5	5,97 ± 2,70*	10,48 ± 3,77	13,34 ± 3,83
K2	10	12,95 ± 2,17*	11,94 ± 2,24	17,97 ± 2,07**
K2	20	25,93 ± 10,15*	27,41 ± 10,98*	22,82 ± 5,96*

Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	Inkubationszeit (Tag)
Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	3	4	5
Kontrolle		7,17 ± 0,89	12,04 ± 0,46	9,55 ± 0,77
K3	5	3,85 ± 0,73**	3,43 ± 0,40**	4,46 ± 0,95**
K3	10	3,18 ± 0,55**	3,16 ± 0,62**	3,48 ± 0,43**
K3	20	6,12 ± 0,70	7,10 ± 1,39*	8,56 ± 1,34
K4	5	12,55 ± 3,08	12,99 ± 0,86	18,29 ± 0,92**
K4	10	6,54 ± 1,43	15,15 ± 5,16	22,59 ± 5,35*
K4	20	21,23 ± 3,19**	19,11 ± 4,23	22,56 ± 3,84*

3.2 IgM-Sekretion durch Milzzellen in vitro

Daten in den Tabellen 5.1 und 5.2 zeigten, dass nach drei Tagen von in vitro-Kultur, Milzzellen, die aus Mäusen isoliert waren, die mit 40 mg/kg/Tag PCM, 10 mg/kg/Tag oder einer höheren Dosis von PCM K1, 2,5 mg/kg/Tag oder einer höheren Dosis von PCM K2, 10 mg/kg/Tag PCM K3 und 5 mg/kg/Tag oder einer höheren Dosis von PCM K4 behandelt waren, einen signifikanten Anstieg der IgM-Sekretion zeigten. Das Ergebnis aus diesem Versuch legte nahe, dass die orale Verabreichung von PCM oder gereinigten Komponenten, wie PCM K1, K2, K3 oder K4, das Potenzial von Milz-B-Zellen erhöhte, IgM zu sezernieren. TABELLE 5.1 IgM-Sekretion durch Milzzellen – Wirkungen von PCM und PCM K1, K2

Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	Inkubationszeit (Tag)
Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	3	4	5
Kontrolle		138,27 ± 42,55^a	171,10 ± 39,90	184,29 ± 30,97
PCM	10	184,37 ± 36,35	251,78 ± 37,64	273,91 ± 33,30
PCM	40	375,07 ± 13,6***	352,16 ± 7,6***	323,52 ± 13,7***
PCM	80	328,96 ± 24,46***	322,79 ± 23,76*	296,89 ± 12,42**
K1	2,5	181,30 ± 34,26	201,03 ± 33,98	190,20 ± 38,67
K1	5	223,32 ± 51,46	233,67 ± 31,32	249,35 ± 38,32
K1	10	356,52 ± 28,8***	362,17 ± 31,1**	527,33 ± 41,0***
K1	20	267,18 ± 58,97	280,79 ± 32,08*	320,44 ± 41,39*
K2	2,5	378,0 ± 55,5***	479,8 ± 60,9***	254,4 ± 30,8
K2	5	457,81 ± 87,3**	507,68 ± 91,9**	334,75 ± 48,7*
K2	10	54023 ± 688***	512,47 ± 42***	55054 ± 50,1***
K2	20	837,1 ± 114,5***	⁶⁹⁵ ^, ^{2 ± 144} ^, ^7**	591,5 ± 108,4***

Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	Inkubationszeit (Tag)
Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	3	4	5
Kontrolle		121,91 ± 34,35	200,75 ± 32,77	219,30 ± 18,60
K3	5	222,42 ± 42,83	214,45 ± 28,51	277,52 ± 101,63
K3	10	287,66 ± 44,44*	294,30 ± 30,68*	309,51 ± 30,88
K3	20	372,14 ± 69,48*	519,53 ± 52,63***	606,44 ± 88,10**
K4	5	463,65 ± 76,41***	688,17 ± 85,78***	649,89 ± 70,09***
K4	10	514,45 ± 70,30***	733,58 ± 95,70***	807,32 ± 104,21***
K4	20	747,6 ± 128,42***	746,50 ± 157,76***	857,49 ± 92,19***

3.3 IgA-Sekretion von Milzzellen in vitro

Die in den Tabellen 6.1 und 6.2 gezeigten Ergebnisse zeigten, dass nach drei Tagen von in vitro-Kultur Milzzellen, die aus Mäusen isoliert waren, die mit 40 mg/kg/Tag PCM, 5 mg/kg/Tag behandelt waren, eine signifikante Verringerung der IgA-Sekretion im Vergleich mit der Kontrollgruppe hatten. Mäuse, die mit den gereinigten Komponenten behandelt wurden, zeigten jedoch ein ziemlich anderes Ergebnis. Die orale Verabreichung von 10 mg/kg/Tag oder einer höheren Dosis von PCM K1 führte zu einem Anstieg der IgA-Sekretion von Milzzellen in vitro am Tag 3 und am Tag 5. Milzzellen, die aus den Mäusen isoliert waren, die mit 10 mg/kg/Tag oder einer höheren Dosis von PCM K2 und mit 5 mg/kg/Tag oder einer höheren Dosis von PCM K4 behandelt waren, zeigten einen signifikanten Anstieg der IgA-Sekretion. Im Gegensatz dazu unterdrückte PCM K3 signifikant die IgA-Sekretion. Das Ergebnis aus diesem Versuch legte nahe, dass die orale Verabreichung von PCM eine gegenteilige Wirkung zwischen dem Serumwert von IgA und der Sekretion von IgA von Milzzellen hatte. Die gereinigten Komponenten, wie PCM K1, K2 oder K4 erhöhten jedoch im Allgemeinen das Potenzial von Milz-B-Zellen, IgA zu sezernieren. TABELLE 6.1 IgA-Sekretion von Milzzellen – Wirkungen von PCM und PCM K1 und K2

Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	Inkubationszeit (Tag)
Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	3	4	5
Kontrolle		130,48 ± 30,76^a	144,72 ± 31,06	128,56 ± 35,52
PCM	10	50,67 ± 13,28**	66,09 ± 8,68*	74,73 ± 15,17
PCM	40	84,31 ± 8,09	94,72 ± 10,64	125,41 ± 8,51
PCM	80	36,03 ± 4,10**	46,16 ± 5,09**	56,05 ± 7,71*
K1	2,5	118,64 ± 19,79	94,65 ± 53,54	108,37 ± 16,01
K1	5	148,60 ± 24,55	127,93 ± 66,0	148,81 ± 22,97
K1	10	32,11 ± 48,1***	378,5 ± 196,2***	422,74 ± 6,67**
K1	20	145,93 ± 26,52	144,08 ± 84,36	179,0 ± 18,86
K2	2,5	133,90 ± 33,39	181,00 ± 47,98	277,13 ± 101,1
K2	5	155,67 ± 18,66	142,89 ± 26,86	94,91 ± 12,07
K2	10	239,64 ± 43,1*	258,20 ± 46,4*	260,00 ± 0,93*
K2	20	273,20 ± 54,87*	211,48 ± 57,82	324,7 ± 153,4**

Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	Inkubationszeit (Tag)
Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	3	4	5
Kontrolle		58,21 ± 12,63	66,92 ± 17,16	73,41 ± 14,64
K3	5	32,83 ± 7,00	27,37 ± 5,83*	21,96 ± 4,17**
K3	10	26,57 ± 3,68*	28,97 ± 5,95*	18,87 ± 2,66**
K3	20	43,08 ± 4,05	43,45 ± 5,92	30,50 ± 3,60*
K4	5	55,56 ± 4,71	79,51 ± 3,74	106,69 ± 7,29*
K4	10	66,43 ± 5,26	95,39 ± 10,08	121,97 ± 12,69*
K4	20	119,59 ± 15,08**	101,53 ± 25,08	133,16 ± 20,09*

(4) T_H1-Typ- und T_H2-Typ-Zytokine, sezerniert durch Milz-T-Lymphozyten – Wirkungen von PCM und PCM K1, K2, K3 und K4

T_H1-Typ-Zytokine, wie Interleukin 2 (IL-2), Interferon-γ (IFN-γ), induzieren die Zellimmunreaktion, während T_H2-Typ-Zytokine, wie Interleukin-4 (IL-4), Interleukin-5 (IL-5) und Interleukin-6 (IL-6) die durch B-Lymphozyten vermittelte humorale Immunreaktion stimulieren. Um die Rolle von PCM und seiner gereinigten Komponenten bei der immunologischen Regulation zu demonstrieren, wurde das Potenzial von T_H1-Typ- und T_H2-Typ-Zytokinen untersucht, die von Milz-T-Lymphozyten sezerniert wurden. Milzzellen, die aus Mäusen isoliert wurden, die mit PCM und seinen gereinigten Komponenten behandelt wurden, wie PCM K1, K2, K3 und K4, wurden fünf Tage in Gegenwart von ConA kultiviert. Die Menge von Interferon-γ (IFN-γ; T_H1-Typ-Zytokin) und Interleukin-10 (IL-10; T_H2-Typ-Zytokin), sezerniert durch die Milz-T-Lymphozyten, wurde gemessen (Tabelle 7.1 und Tabelle 7.2). Nachdem die Mäuse mit 10 mg und 80 mg/kg/Tag PCM, 2,5 mg/kg/Tag oder einer höheren Dosis von PCM K1, 2,5 mg/kg/Tag oder einer höheren Dosis von PCM K2, 5 mg und 10 mg/kg/Tag PCM K3, und 20 mg/kg/Tag PCM K4 gefüttert waren, war die IFN-γ-Sekretion von durch ConA stimulierten Milz-T-Zellen signifikant erhöht. Die Milzzellen, die aus den Mäusen isoliert waren, die mit 40 mg/kg/Tag oder einer höheren Dosis behandelt wurden, hatten keine Wirkung auf die IL-10-Sekretion. Mäuse, die mit 2,5 mg/kg/Tag oder einer höheren Dosis von PCM K1, 2,5 mg und 20 mg/kg/Tag PCM K2 behandelt wurden, erhöhten signifikant die Sekretion von IL-10 von Milzzellen. Zusammengenommen war PCM befähigt, T_H1-Typ-Zytokin bei einer relativ niedrigeren Dosis positiv zu regulieren, versagte aber bei der Regulierung der T_H2-Typ-Zytokinsekretion. Die gereinigten Komponenten, wie PCM K1 und K2, waren befähigt, sowohl die sezernierten Zytokine vom T_H1-Typ und T_H2-Typ zu erhöhen. TABELLE 7.1 Sekretion von IFN-γ und IL-10 von Milzzellen – Wirkungen von PCM und PCM K1 und K2

Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	Zytokine (pg/ml)
Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	IFN-γ	IL-10
Kontrolle		254,14 ± 55,68^a	103,91 ± 20,36
PCM	10	465,11 ± 26,6**	115,90 ± 17,29
PCM	40	264,79 ± 48,36	77,31 ± 9,31
PCM	80	433,44 ± 31,10**	181,97 ± 33,26
K1	2,5	428,7 ± 38,9*	170,28 ± 13,0*
K1	5	673,33 ± 96,73**	178,76 ± 24,56*
K1	10	682,28 ± 73,78**	176,17 ± 45,24
K1	20	783,97 ± 76,1***	334,7 ± 45,8***
K2	2,5	414,80 ± 31,3*	135,71 ± 19,89
K2	5	432,70 ± 50,22*	226,48 ± 55,67*
K2	10	348,45 ± 72,56*	135,62 ± 48,15
K2	20	457,48 ± 57,60**	195,27 ± 40,0*

Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	Zytokine (pg/ml)
Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	IFN-γ	IL-10
Kontrolle		124,25 ± 28,15^a	107,80 ± 20,79
K3	5	917,07 ± 130,41*	262,09 ± 108,41
K3	10	449,74 ± 100,67*	86,48 ± 33,26
K3	20	176,20 ± 45,96	98,74 ± 27,05
K4	5	240,45 ± 107,83	128,91 ± 45,46
K4	10	252,26 ± 103,76	197,39 ± 68,73
K4	20	292,00 ± 77,77*	155,91 ± 26,16

(5) Milz-T-Lymphozytenpopulation – Wirkungen von PCM

CD4⁺8^–-T-Zellen sind hauptsächlich Helfer-T-Zellen (T_H) und CD4^–8⁺-T-Zellen sind hauptsächlich zytotoxische T-Lymphozyten (CTL). Um die Rolle von PCM und seiner gereinigten Komponenten bei der Modulation einer T-Lymphozyten-Subpopulation zu demonstrieren, wurden die Prozentsätze von CD4⁺- und CD8⁺-Zellen in nicht anhaftenden Milzzellen durch FASC analysiert. Mäuse wurden mit PCM in dem Bereich von 10 mg/kg/Tag bis 80 mg/kg/Tag während vier aufeinanderfolgenden Tagen gefüttert. Die Tiere wurden am Tag 5 getötet, und nicht anhaftende Milzzellen wurden isoliert. Die mit PCM behandelten Mäuse zeigten keine signifikante Wirkung auf den Prozentsatz von CD4⁺8^–-Zellen (Tabelle 8), obwohl eine Tendenz zur Erhöhung bestand, wenn die Dosis auf 80 mg/kg/Tag erhöht wurde. Die mit PCM behandelten Mäuse zeigten jedoch einen signifikanten Anstieg des CD4^–8⁺-Zellen-Subsets (Tabelle 8). Mit anderen Worten war die zytotoxische T-Lymphozytenpopulation erhöht, nachdem die Mäuse mit PCM gefüttert waren. Die Differentiation von CTL wird hauptsächlich durch T_H1-Typ-Zytokine induziert. Daher ist diese Feststellung gut korreliert mit der erhöhten Wirkung von PCM auf die IFN-γ-Sekretion. Da der CD4⁺8^–-Zellen-Subset auch eine Neigung zum Anstieg zeigte, untersuchten wir nicht einen Anstieg des CD4/CD8-Verhältnisses in einer Milz-Lymphozytenpopulation. TABELLE 8. Regulierung der T-Lymphozyten-Subpopulation – Wirkung von PCM

Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	fluoreszenzpositive Zellen (%)
Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	CD4	CD8	CD4/CD8
Kontrolle		23,40 ± 2,31a	12,50 ± 0,82	1,87
PCM	10	28,67 ± 2,54	15,31 ± 0,72*	1,87
PCM	40	27,72 ± 0,66	16,67 ± 1,08	1,66
PCM	80	29,95 ± 2,75	16,76 ± 1,29**	1,79

a Die Daten sind Mittelwerte ± S. E. M. von fünf ähnlichen Versuchen;
* zeigt p < 0,05,
** zeigt p < 0,01 von der Kontrollgruppe.

(6) Zytotoxische Aktivität von NK-Zellen – Wirkungen von PCM
NK-Zellen spielen eine zentrale Rolle bei der angeborenen Immunität. NK-Zellen töten in nicht spezifischer Weise die Tumorzellen (transformierte Zellen) und viral infizierte Zellen.

Nicht anhaftende Milzzellen, die aus mit PCM behandelten Mäusen isoliert waren, wurden unmittelbar für den durch NK vermittelten Zytotoxizitätsassay verwendet. Das Ergebnis zeigte, dass PCM einen Anstieg der durch NK vermittelten Zytotoxizität bei 10 mg/kg/Tag induzierte (Tabelle 9). Wenn die Dosis von PCM erhöht wurde, kehrte die Aktivität der NK-Zellen auf ihren Basalwert zurück. Die Aktivierung von NK-Zellen wird hauptsächlich durch T_H1-Typ Zytokine stimuliert. Daher ist diese Feststellung gut mit der erhöhten Wirkung von PCM auf die IFN-γ-Sekretion korreliert. TABELLE 9. Natürliche Killerzellenaktivität – Wirkung von PCM

Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	Target:Effektor
Komponenten	Dosierung (mg/kg/Tag)	1:12,5	1:25	1:50
Kontrolle		16,57 ± 0,61^a	17,04 ± 1,06	16,57 ± 0,61
PCM	10	14,24 ± 2,18	20,78 ± 1,25	23,12 ± 2,86*
PCM	40	18,62 ± 2,62	18,20 ± 2,02	20,99 ± 3,59
PCM	80	15,54 ± 3,49	18,27 ± 2,05	16,35 ± 0,90

^a Die Daten sind Prozentsätze von Targetzellen (YAC-1-Zellen), die durch die NK-Zellen in der Milzzellpopulation abgetötet werden. Die toten Zellen reagieren positiv auf Propediumiodid; die Daten sind Mittelwerte ± S. E. M. von fünf ähnlichen Versuchen;
* zeigt p < 0,05 von der Kontrollgruppe.

(7) Phagozytische Aktivität von Makrophagen – Wirkungen von PCM
Phagozytische Zellen sind in der ersten Verteidigungslinie gegen einen Angriff von Pathogenen beteiligt. Die vorherrschenden phagozytischen Zellen bei angeborener Immunität sind Neutrophile und Makrophagen. In dieser Studie wurden die peritoneal exudierten Makrophagen mit fluoreszenzmarkiertem E. coli gefüttert und auf die phagozytische Aktivität von hervorgebrachten Makrophagen untersucht. Ein Mittelwert von 20,88% Makrophagen, isoliert aus der Kontrollgruppe, zeigte phagozytische Aktivität. Der Prozentsatz von Zellen, die phagozytische Aktivität zeigten, betrug jedoch 27,49% und 38,22%, nachdem die Mäuse mit 40 mg/kg/Tag und 80 mg/kg/Tag PCM gefüttert waren, was nahelegt, dass PCM die phagozytische Aktivität von peritonealen Makrophagen signifikant erhöht. TABELLE 10. Phagozytose von peritonealen Exudaten-Makrophagen – Wirkung von PCM

Komponenten Dosis (mg/kg/Tag) Phagozytose

Kontrolle 20,88 ± 3,90a

PCM 10 17,08 ± 1,82

PCM 40 27,49 ± 3,99*

PCM 80 38,22 ± 2,20**

^a Die Daten sind Prozentsätze von Makrophagen, die fluoreszenzmarkierte E. coli aufgenommen haben; die Daten sind Mittelwerte ± S. E. M. von zehn ähnlichen Versuchen;
* zeigt p < 0,05,
** zeigt p < 0,01 von der Kontrollgruppe.

Claims

Poria-Extrakt, der zur Immunsteigerung eines Säugers befähigt ist, enthaltend 5 bis 60%, bezogen auf das Gewicht des Extrakts, eines Lanostans mit der folgenden chemischen Formel (I) und der im Wesentlichen frei von Secolanostan ist:
worin R₁ entweder H oder CH₃ ist, R₂ OCOCH₃, =O oder OH ist, R₃ H oder OH ist, R₄-C(=CH₂)-C(CH₃)₂R_a ist, worin R_a H oder OH oder -CH=C(CH₃)-R_b ist, wobei R_b CH₃ oder CH₂OH ist, R₅ H oder OH ist und R₆ CH₃ oder CH₂OH ist.
Poria-Extrakt gemäß Anspruch 1, der durch ein Verfahren hergestellt ist, das die folgenden Schritte umfasst: a) Extrahieren von Metaboliten, Fermentationsprodukten oder Sklerotium von Poria cocos (Schw) Wolf mit Wasser, Methanol, Ethanol oder einem gemischten Lösemittel davon, b) Konzentrieren des erhaltenen Flüssigkeitsextrakts aus Schritt a), c) Einführen der erhaltenen konzentrierten Substanz aus Schritt b) in eine Silicagelsäule, d) Eluieren der Silicagelsäule mit einem Eluiermittel mit einer niedrigen Polarität und Sammeln des erhaltenen Eluats, e) Konzentrieren des Eluats zur Bildung eines konzentrierten Eluats.
Poria-Extrakt gemäß Anspruch 2, worin das konzentrierte Eluat aus Schritt e) einen chromatografischen Wert Rf von nicht weniger als 0,1 bei einer Dünnschicht chromatografie hat, die mit einem gemischten Lösemittel aus Dichlormethan:Methanol = 96:4 entwickelt wird und durch eine Ultraviolett-Lampe und Ioddampf nachgewiesen wird.
Poria-Extrakt gemäß Anspruch 2, worin die Extraktion in Schritt a) unter Verwendung von 95% Ethanol durchgeführt wird.
Poria-Extrakt gemäß Anspruch 2, worin die aus Schritt b) erhaltene konzentrierte Substanz weiter mit einem Zweiphasen-Lösemittel extrahiert wird, das Methanol und n-Hexan in einem volumetrischen Verhältnis von 1:1 enthält, eine Methanolschicht aus der Zweiphasen-Lösemittel-Extraktionsmischung abgetrennt wird, und die Methanolschicht zur Bildung eines Konzentrats konzentriert wird, das als Beschickung für die Silicagelsäule in Schritt c) verwendet wird.
Poria-Extrakt gemäß Anspruch 2, worin das Eluiermittel mit niedriger Polarität ein gemischtes Lösemittel ist, das Dichlormethan und Methanol in einem volumetrischen Verhältnis von 96,5:3,5 enthält.
Poria-Extrakt gemäß Anspruch 1, das 10 bis 20% des Lanostans (I) enthält.
Poria-Extrakt gemäß Anspruch 1, worin das Lanostan (I)
Verwendung des Poria-Extrakts wie in einem der Ansprüche 1 bis 8 beansprucht zur Herstellung eines Medikaments zur Immunitätssteigerung eines Säugers.