DE69709691T2

DE69709691T2 - Pharmazeutische zusammenstellungen mit parthenium integrifolium oder mit einem extrakt oder einer komponente davon, verwendung dieses pflanzenmaterials zur herstellung von medizin und ein verfahren zur extraktherstellung von parthenium integrifolium

Info

Publication number: DE69709691T2
Application number: DE69709691T
Authority: DE
Inventors: Morten Sloth Weidner
Original assignee: Individual
Current assignee: Ferrosan ApS
Priority date: 1996-10-21
Filing date: 1997-10-20
Publication date: 2002-08-22
Anticipated expiration: 2017-10-21
Also published as: EP1007067B1; ES2172006T3; WO1998017292A1; US6217877B1; DE69709691D1; JP2001501919A; AU711019B2; AU4615897A; JP4346685B2; PT1007067E; EP1007067A1; ATE211918T1; DK1007067T3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Pflanze Parthenium integrifolium und genauer gesagt auf davon abgeleitete pharmazeutische Zusammensetzungen sowie auf die Verwendung von Parthenium integrifolium oder Teilen davon oder einem Extrakt oder Bestandteil davon zum Herstellen von Arzneimitteln für die Linderung von Schmerzen oder für die Behandlung oder Verhinderung von entzündlichen oder Autoimmunerkrankungen. Die Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Herstellen eines Extrakts aus Parthenium integrifolium und auf die durch das Verfahren hergestellten Extrakte.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Partheniunn integrifolium (L.) (Familie Asteraceae), allgemein auch als "Missouri snake root" bezeichnet, wächst wild in den Wäldern und Prärien von Nordamerika. Die Pflanze ist 30-130 cm hoch und weist zahlreiche weiße Blüten auf, die einen flachen Blütenstand bilden, der bis zu 25 cm breit ist. Die Wurzel besteht aus e6nem kurzen, konischen oder zwiebelförmigen Hauptstamm, der einen Durchmesser von bis zu 4 cm hat; und länglichen sekundären, verschlungenen Zweigen, die von dem Hauptstamm wegführen.
Es wurde eine Reihe von Chemikalien als Hauptbestandteille von Parthenium integrifolium-Extrakten identifiziert. Eine Gruppe sind die Sesquiterpenlactone wie z. B. Tetraneurin E und Tetraneurin C. Eine weitere Gruppe sind die Sesquiterpenester wie z. B. Echinadiolcinnamat, Epoxyechinadiolcinnamat, Echinaxantholcinnamat und Dihydroxynardolcinnamat. Noch eine weitere Gruppe sind die Flavonoide wie z. B. Quercetagetinmethylether und ihre O-Glycoside. Ein weiterer charakteristischer Bestandteil von Parthenium integrifolium ist Pyromeconsäure. Weitere in der Pflanze vorhandene Chemikalien sind Cumarine und verschiedene Phenolglycoside.
Die deutsche Patentanmeldung Veröffentlichungs-Nr. 36 38 715 A1 beschreibt die vorstehend erwähnten Sesquiterpenester, die aus Partheniurn integrifolium gewonnen werden. Gemäß dem Experimentalteil dieser Anmeldung haben Tests der immunologischen Aktivität der Sesquiterpenester gezeigt, dass sie die Granulozyten-Phagozytose in vitro bis zu 30 1Yo erhöhten. Dieser Effekt muss als proentzündliche Wirkung in Verbindung mit dem unspezifischen Teil des Immunsystems (dem retikuloendothelialen phagozytischen System) angesehen werden.
Derzeit sind die nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAID) die am häufigsten angewendeten therapeutischen Mittel zur Behandlung von Zuständen, die mit einer Entzündung und Schmerzen verbunden sind. Die NSAID üben ihre Wirkung durch Hemmen des Prostaglandin erzeugenden Enzyms Cyclooxygenase (CQX) aus. Es gibt zwei biochemische Subtypen von Cyclooxygenase, die als COX-1 und COX-2 bezeichnet werden. COX-1 wird in den meisten Zellen konstitutiv exprimiert und ist für die Bildung von Prostaglandinen verantwortlich, welche wichtige grundlegende physiologische Funktionen vermitteln, z. B. eine intakte Schleimhaut im Magen bereitstellen. COX-2 ist normalerweise nicht vorhanden, kann aber durch bestimmte Serumfaktoren, Zytokine und, Wachstumsfaktoren induziert werden und ist für die Bildung von entzündlichen Prostaglandinen verantwortlich, welche viele Symptome einer Entzündung vermitteln. Die NSAID sind im Allgemeinen nicht selektiv, was bedeutet, dass sie sowohl COX-2 als auch COX-1 hemmen, was zu einer entzündungshemmenden und schmerzlindernden Wirkung aufgrund der Hemmung von COX-2 und einer Reihe von Nebenwirkungen aufgrund der Hemmung von COX-1 führt, von denen die Bildung von Magengeschwüren eine der wichtigsten Nebenwirkungen ist.
Autoimmunerkrankungen wie Multiple Sklerose, Morbus Crohn, rheumatoide Arthritis, Diabetes mellitus usw. sind mit einer Überaktivierung des entzündlichen Arms des Immunsystems (TH1-Weg) verbunden, welche zu bekannten Symptomen und einer ernsthaften Gewebeschädigung führt. Die gängigste Behandlung für diese Erkrankungen ist die Anwendung von Corticosteroiden, welche ihre Wirkung dlurch nicht selektives Inhibieren der Funktion und Proliferation von verschiedenen Arten von Immunzellen ausüben. Leider sind die Corticosteroide mit einer Reihe von ernsten Nebenwirkungen, z. B. einer Immunsuppression und Osteoporose verbunden.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Ich habe herausgefunden, dass Parthenium integrifolium oder Teile davon oder ein Extrakt oder Bestandteil davon die folgenden pharmakologischen Wirkungen ausüben: Verstärkung des TH2-Wegs des Immunsystems, Erhöhung der Spiegel von lnterleukin-4 und Interleukin-10, Suppression der Cyclooxygenase-2 (COX-2), Verringerung von chronischen und akuten Schmerzen und Verringerung einer Entzündung. Im Vergleich zu den NSAID weisen Parthenium integrifolium oder Teile clavon oder ein Extrakt oder Bestandteil davon den Vorteil auf, dass sie nicht mit gastrointestinalen und renalen Nebenwirkungen verbunden sind. Außerdem haben sie durch Verstärken der Bildung von interleukin-4 und Interleukin-10 eine herunterregulierende Wirkung auf den TH1-Weg des Immunsystems, ohne die ernsten Nebenwirkungen hervorzurufen, die für die Corticosteroide charakteristisch sind. Aufgrund dieser Wirkungen kann Parthenium integrifolium oder Teile davon oder ein Extrakt oder Bestandteil davon für die folgenden therapeutisdhen Anwendungen eingesetzt werden:
- Linderung von Schmerzen.
- Behandlung oder Verhinderung von entzündlichen oder Autoimmunerkrankungen.
Insbesondere werden diese Wirkungen mit einem Extrakt von Parthenium integrifolium erhalten, der durch Extraktion der Pflanze oder von Teilen davon mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch davon mit Wasser erhalten wird. Das mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel kann z. B. aus der Gruppe bestehend aus Aceton, Methylethylketon, Ethylacetat oder niederen Alkanolen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ausgewählt werden.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die einen solchen Extrakt von Parthenium integrifolium oder Teilen davon und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst.
Somit können Parthenium integrifolium oder Teile davon oder ein Extrakt oder Bestandteil davon in einem Verfahren zum Lindem der Schmerzen bei einer Person verwendet werden, welches das Verabreichen von solchem Pflanzenmaterial oder einer dieses Material enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzung an die Person umfasst; und die Erfindung umfasst die Verwendung von Parthenium integrifolium oder Teilen davon oder einem Extrakt oder Bestandteil davon zum Herstellen eines Arzneimittels für die Linderung von Schmerzen.
Außerdem kann ein Extrakt von Parthenium integrifolium oder Teilen davon, wie er vorstehend beschrieben ist, in einem Verfahren zum Behandeln oder Verhindern einer entzündlichen oder Autoimmunerkrankung bei einer Person verwendet werden, welches das Verabreichen eines solchen Extrakts oder einer diesen Extrakt enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzung an die Person umfasst; und die Erfindung umfasst die Verwendung eines solchen Extrakts von Parthenium integrifolium oder Teilen davon zum Herstellen eines Arzneimittels für die Behandlung oder Verhinderung von entzündlichen oder Autoimmunerkrankungen.
Außerdem stellt die Erfindung ein Verfahren zum Herstellen eines Extrakts aus Parthenium integrifolium bereit, welches das Extrahieren der Pflanze oder von Teilen davon, vorzugsweise der Wurzel, mit einem Extraktionsmittel, umfassend ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel oder ein Gemisch davon mit Wasser, und anschließend, sofern erforderlich, das Entfernen des Extraktionsmittels zum Erhalten eines für den Gebrauch geeigneten Extrakts umfasst.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Überraschenderweise wurde herausgefunden, dass Parthenium integrifolium oder Teile davon oder ein Extrakt oder Bestandteil davon pharmakologische Wirkungen ausüben, die für die therapeutische Behandlung von Zuständen relevant sind, die mit Schmerzen, einer Entzündung und einer Autoimmunität verbunden sind.
Genauer gesagt stellt Parthenium integrifolium oder Teile davon oder ein Extrakt oder ein Bestandteil davon die folgenden pharmakologischen Wirkungen bei der Verabreichung an den lebenden Organismus bereit:
- Verstärkung des TH2-Wegs des Immunsystems.
- Erhöhung der Spiegel von Interleukin-4 und Interleukin-10.
- Suppression von COX-2 ohne Beeinträchtigung von COX-1.
- Verringerung von Schmerzen.
- Verringerung einer Entzündung.
Diese Wirkungen stellen einen Teil des Grundprinzips für die folgenden therapeutischen Anwendungen von Parthenium integrifolium oder Teilen davon oder Extrakten oder Bestandteilen davon dar:
- Behandlung eines beliebigen Zustandes, der mit Schmerzen oder einer Entzündung verbunden ist, durch die Verabreichung von Parthenium integrifolium oder Teilen davon oder einem Extrakt oder Bestandteil davon. Der Anmelder stellt die Hypothese auf, dass die entzündungshemmende und schmerzlindernde Wirkung auf erhöhte Spiegel von Interleukin-4 und -10 zurückzuführen ist, welche einerseits den entzündlichen Teil des Immunsystems (TH1-Weg) herunterregulieren und andererseits die Expression von COX-2 verringern, was zu einem niedrigeren Spiegel von entzündlichen Prostaglandinen führt. Dieser Wirkungsmechanismus weist im Vergleich zu herkömmlichen nichtsteroidalen Antirheumatika (NSAID) den Vorteil auf, dass COX-1 nicht gehemmt wird, wodurch eine Bildung von Magengeschwüren und renale Nebenwirkungen vermieden werden. In einer vorläufigen klinischen Beobachtung stellte ein Patient mit Schmerzen und einer Entzündung aufgrund von Osteoarthritis im unteren Rückenbereich eine signifikante Verbesserung nach einer Behandlung mit 250 mg pro Tag des in Beispiel 1 beschriebenen Extrakts von Parthenium integrifolium fest. Der Patient erhielt zweimal täglich eine orale Dosis von 125 mg des Extrakts, die in einer Hartgelatinekapsel verabreicht wurde. Die Verbesserung; welche in einer völligen Beseitigung der Schmerzen und einer erhöhten Mobilität der betroffenen Gelenke bestand, war am Tag 2 der Behandlung offensichtlich und hielt über den gesamten Behandlungszeitraum während 3 Vochen an. Nach der Beendigung der Behandlung traten die Schmerzen nach 2 Tagen wieder auf. Die klinische Verbesserung wird auf die vorstehend erwähnten Wirkungen von Parthenium integrifolium zurückgeführt. In der klinischen Pilotstudie, die in Beispiel 4 beschrieben ist, erhielten Patienten (n = 16), die an Migränekopfschmerzen litten, eine tägliche Dosis eines Extrakts von Parthenium integrifolium. Der Zeitplan der Studie bestand aus vier Zeiträumen von 4 Wochen. Der erste Zeitraum diente als Basislinie, worin keine Behandlung erfolgte. In dem zweiten Zeitraum wurde eine tägliche Dosis von 200 mg Parthenium integrifolium-Extrakt eingesetzt.
In dem dritten Zeitraum wurde eine tägliche Dosis von 100 mg Parthenium integrifolium-Extrakt eingesetzt. In dem vierten Zeitraum wurde eine tägliche Dosis von 200 mg Parthenium integrifolium-Extrakt eingesetzt. Während der vier Zeiträume wurde jedes Auftreten von Migränekopfschmerzen aufgezeichnet. Das Auftreten von Migränekopfschmerzen wurde im Vergleich zu dem Basiszeitraum in allen Behandlunigszeiträumen verringert. In dem letzten Behandllungszeitraum war das Auftreten von Migränekopfschmerzen um 57% verringert, was statistisch signifikant war (p < 0,05; Wilcoxon). Die beobachtete klinische Verbesserung wird auf die vorstehend erwähnten Wirkungen von Parthenium integrifolium zurückgeführt.
Behandlung von entzündlichen und Autoimmunerkrankungen durch die Verabreichung eines Extrakts von Parthenium integrifolium oder Teilen davon wie vorstehend beschrieben. Der Anmelder stellt die Hypothese auf, dass die therapeutische Wirkung auf erhöhte Spiegel von Interleukin-4 und -10 zurückzuführen ist, welche den TH1-Weg des Immunsystems herunterregulieren, welcher eine signifikante Rolle bei der Pathogenese von entzündlichen und Autoimmunerkrankungen spielt. Außerdem regeln Interleukin-4 und -10 die Expression von COX-2 nach unten, was zu einer verminderten Bildung von entzündlichen Prostaglandinen und einer Verringerung der Symptome einer akuten Entzündung führt. Die therapeutische Wirkung kann für alle bekannten Autoimmunerkrankungen oder entzündlichen Erkrankungen relevant sein, und die folgenden Beispiele sind in dieser Hinsicht nicht beschränkend: Autoimmunhepatitis, primär biliäre Zirrhose, primär sklerosierende Cholangitis, autoimmunhämolytische Anämien, Morbus Basedow, Myasthenia gravis, Diabetes Mellitus Typ 1, entzündliche Myopathien, Multiple Sklerose, Hashimoto- Thyreoiditis, Autoimmunadrenalitis, Morbus Crohn, ulcerierende Colitis, Glomerulonephritis, progressive systemische Sklerose (Sklerodermie), Sjögren-Syndrom, Lupus erythematodes, primäre Vaskulitis, rheumatoide Arthritis, juvenile Arthritis, gemischte Bindegewebserkrankung, atopische Dermatitis, Psoriasis, Pemphigus, Pemphigoid, Dermatitis herpetiformis, usw.
Die bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist ein Extrakt aus Parthenium integrifolium. Erfindungsgemäße Extrakte werden durch Extraktion von frischem oder getrocknetem Parthenium integrifolium oder Teilen davon, vorzugsweise der Wurzel, mit einem Extraktionsmittel erhalten, das ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel oder ein Gemisch davon mit Wasser umfasst. Die Extraktion kann mit einer Reihe von verschiedenen mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln und Gemischen davon milL Wasser durchgeführt werden. Die bevorzugten Extraktionslösungsmittel sind Aceton, Methylethylketon, Ethylacetat, niedere Alkanole mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und Gemische davon mit Wasser. Die Extraktion kann heiß oder kalt durch den Einsatz einer beliebigen Extraktionstechnologie, z. B. Mazeration, Perkolation oder überkritische Extraktion erfolgen. Die bevorzugte Extraktionstemperatur liegt aufgrund des Wirkungsgrades der Extraktion nahe bei dem Siedepunkt des eingesetzten Lösungsmittels, niedrigere Temperaturen sind aber ebenfalls anwendbar, was einen längeren Extraktionszeitraum erfordert.
Durch Veränderung der Zusammensetzung des angewandten Lösungsmittels kann die Extraktion für bestimmte Bestandteile von Parthenium integrifolium selektiver gemacht werden, wobei somit ihr Gehalt in dem fertigen Extrakt erhöht oder verringert wird. Zum Beispiel kann der Gehalt an Phenolglycosiden durch Einsatz eines hydrophileren Lösungsmittels erhöht werden, während der Gehalt an Sesquiterpenen in dem fertigen Produkt durch Einsatz eines lipophileren Lösungsmittels erhöht werden kann.
Nach dem primären Extraktionsprozess kann ein zweiter Schritt der Verarbeitung wie etwa eine Flüssig-Flüssig-Extraktion, Säulenchromatographie; Wasserdampfdestillation oder Vakuumdestillation eingesetzt werden, um einen beliebigen Bestandteil des Extraktes zu entfernen oder zu konzentrieren und möglicherweise zu isolieren. Hierbei kann ein beliebiger Bestandteil von Parthenium integrifolium in dem fertigen Extrakt vermieden oder konzentriert werden, z. B. Pyromeconsäure, Sesquiterpenlactone wie Tetraneurin E und Tetraneurin C; Sesquiterpenester wie Echinadiolcinnamat, Epoxyechinadiolcinnamat, Echinaxantholcinnamat und Dihydroxynardolcinnamat, Flavonoide wie Quercetagetinmethylether und ihre O-Glycoside, Cumarine oder verschiedene Phenolglycoside. So kann der Gehalt eines belielbigen Bestandteils von Parthenium integrifolium in dem fertigen Extrakt eingestellt werden, um eine pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen.
Gemäß der Erfindung kann Parthenium integrifolium oder Teile davon oder ein Extrakt oder Bestandteil davon mit einem beliebigen anderen Wirkstoff oder Pflanzenextrakt kombiniert werden, um die therapeutische Wirkung zu verstärken. Folglich schlagen wir vor, Parthenium integrifolium oder Teile davon oder Extrakte oder Bestandteile davon mit Eicosapentaensäure aus Fischölen oder γ-Linolensäure für die Behandlung von entzündlichen oder Autoimmunerkrankungen zu kombinieren. Parallel dazu schlagen wir vor, Parthenium integrifolium oder Teile davon oder Extrakte oder Bestandteile davon mit Zingiber officinale oder Teilen davon oder Extrakten oder Bestandteilen davon für die Behandlung von Schmerzen und Entzündungen zu kombinieren.
Außerdem ist offensichtlich, dass bei der erfindungsgemäßen Verwendung zum Herstellen von Arzneimitteln Parthenium integrifolium oder Teile davon oder ein Extrakt oder Bestandteil davon mit Additiven wie oberflächenaktiven Stoffen, Lösungsmitteln, Verdickungsmitteln, Stabilisatoren, Konservierungsmitteln, Antioxidanzien, Aromastoffen usw. vermischt werden können, um eine wünschenswerte Produktformulierung zu erfialten. Entsprechend können die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen zusätzlich solche Additive enthalten. Es gibt keine Beschränkungen im Hinblick auf die Dosienungsform der Formulierung, aber Tabletten, Gelatinekapseln, Fluide oder Granulate werden für möglich gehalten. Wahlweise kann die Zusammensetzung auch oberflächenaktive Stoffe wie Gallensalze oder Polyoxyethylen-Sorbitan-Fettsäureester zum Verbessern der Dispergierbarkeit der Zusammensetzung in den Verdauungsflüssigkeiten, was zu einer verbesserten Bioverfügbarkeit führt, oder zum Erhalten der endgültigen Dosierungsform der Zusammensetzung enthalten.

BEISPIELE

Beispiel 1

Ein erfindungsgemäßer Extrakt aus Parthenium integrifolium wurde wie folgt hergestellt:
100 g getrocknete Wurzel von Parthenium integrifolium wurden mit 1500 ml siedendem 90%igen Ethanol 4 Stunden lang extrahiert. Danach wurde der Extrakt filtriert und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. So wurden 22 g eines bemsteinfarbenen kristallinen Extrakts erhalten, der für die Herstellung von Tabletten oder Hartgelatinekapseln geeignet war.

Beispiel 2

Ein erfindungsgemäßer Extrakt aus Parthenium integrifolium wurde wie folgt hergestellt:
100 g getrocknete Wurzel von Parthenium integrifolium wurden mit 1500 ml siedendem 96%igen Ethanol 5 Stunden lang extrahiert. Danach wurde der Extrakt filtriert und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Es wurden 15 g eines bemsteinfarbenen kristallinen Extrakts erhalten. Dieser Parthenium integrifolium-Extrakt wurde in 30 ml 80%igem Ethanol verdünnt und dazu wurden 15 g acetyliertes Monoglycerid und 5 g Polyoxyethylen-Sorbitan-Monooleat (Tween 80) zugegeben. So wurde ein flüssiger Extrakt erhalten, der für die Herstellung von Weichgelatinekapseln geeignet war.

Beispiel 3

Materialien und Methoden

Mäuse

BALB/c Mäuse, die 5-6 Wochen alt waren, wurden GI: Bomholtgaard, Ry, Dänemark, erworben. Sofern nichts anderes angegeben ist, wurden sie mit normalen Futterpellets und Wasser ad libitum gefüttert.

Testverbindung (Extrakt aus Parthenium integrifolium)

Ein erfindungsgemäßer Extrakt aus Parthenium integrifolium wurde wie folgt hergestellt:

100 g getrocknete Wurzel von Parthenium integrifolium wurden mit 1500 ml siedendem 80%igen Ethanol 3 Stunden lang extrahiert. Danach wurde der Extrakt filtriert und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. So wurden 24 g eines bemsteinfarbenen kristallinen Extrakts erhalten. Dieser Parthenium integrifolium-Extrakt wird in dem übrigen Teil dieses Beispiels mit PI abgekürzt.

Futterungsplan

Den Mäusen wurden zerkleinerte gewöhnliche Mäusefutterpellets und Wasser ad libitum verfüttert. Zerkleinerte Mäusefutterpellets wurden mit PI oder Plazebo versetzt: Es wurde eine ethanolische Lösung von PI hergestellt und mit zerkleinerten normalen Mäusefutterpellets vermischt. Nach dem Trocknen betrug der Gehalt von PI 6 mg/kg Mäusefutterpellet. Es wurde angenommen, dass eine Maus 5 g normales Mäusefutterpellet pro Tag verzehrt, was zu einer täglichen Aufnahme von 0,30 mg Pl führt, die einer täglichen Dosis von 110 mg/kg bei einem mittleren Körpergewicht von 30 g/Maus entspricht. Die Kontrollldiät wurde durch Ersetzen der ethanolischen PI-Lösung durch reines Ethanol in dem vorstelhend beschriebenen Verfahren hergestellt.

Reagenzien

Rote Blutzellen von Schafen (SRBC) wurden von Statens Seruminstitut, Kopenhagen, Dänemark, erwororben. Antikörper für den Elisa-Test wurden Pharn'iingen, San Diego, Kalifornien, USA (siehe unten) erworben. Die SRBC wurden vor der Verwendung dreimal in physiologischer Salzlösung gewaschen.

SRBC Plaque bildende Zellen (SRBC-PFC)

Vier Tage nach der intravenösen Injektion von 0,2 ml 10% SRBC in physiologischer Salzlösung wurden die Mäuse getötet und ihre Milzen entfernt und homogenisiert, indem die Organe vorsichtig durch ein Metallnetz gedrückt wurden. Die Zellen wurden gezählt und mit SRE3C und Kaninchenkomplement vermischt und das Zellgemisch wurde in eine Reaktionskammer (Cunningham und Stzenberg) überführt, um SRBC-PFC quantitativ · zu bestimmen. Für jedes Splenozytenpräparat wurden vier einzelne Testkammem ausgezählt. Die Anzahl der PFC wurden als Anzahl pro 106 Splenozyten berechnet.

Anti-SRBC-Antikörper-Titer

Mäusen wurde 10% SRBC in physiologischer Salzlösung in einem Volumen von 0,5 ml intraperitoneal injiziert. Am Tag 3, 6 und 9 nach der Immunisierung wurden 100 ml Blut aus dem retroorbitalen Venengeflecht gesammelt und in Glasfläschchen überführt, die 100 ml Salzlösung mit zwei Einheiten Heparin enthielten. Plasma (50% Verdünnung) wurde durch Zentrifugation gewonnen, und es wurden Reihenverdünnungen in Mikrotiterplatten nnit rundem Boden hergestellt (Nung, Roskilde, Dänemark). 0,1% SRBC und frisch verdünntes Kaninchenkomplement (Glapco, Jylland, Dänemark) wurde zugegeben, und düe Platten wurden bei 37ºC 2 Stunden lang inkubiert. Die Hämolysin-Titer von einzelnen Plasmaproben wurden mit bloßem Auge abgelesen als die höchste Plasmaverdünnung, welche eine vollständige Lyse des zugegebenen SRBC ergab.

Gemischte Lymphozytenkuitur (MLC)

Milzzellen, die aus Pools von 5 Milzen erhalten wurden, wurden in Volumina von 10 ml (2 · 1 Os) pro ml in 25 ml T-Kolben kultiviert und mit bestrahlten C57BL6 Splenozyten (106/ml) stimuliert. 1 ml-Kulturüberstände wurden an Tag 3 und 4 der Kultivierung für eine Zytokinbestimmung entnommen.

Zytokine, die von MLC-Responderzelien sezerniert werden

Elisa-Tests für IL-2, IL-4 und IL-10 wurden eingerichtet, wobei Reagenzien von Pharmingen verwendet wurden: IL-2 Standard 192111 J, IL-4 Standard 19231 W und LL-10 Standard 12281 V. Antikörper Anti-IL-2 18161D, Anti-IL-4 18031 D und Anti-IL-10 18141D (Einfang-Antikörper), Anti-IL-2 18172D, Anti-IL-4 18042D und Anti-IL-10 18152D (biotinylierte Nachweis-Antikörper). Es wurden Dosis-Response-Zytokin-Eichkurven erzeugt. Die drei verschiedenen Zytokine, die von den MLC-Responderzellen am Tag 3 und 4 der Kulltivierung sezemiert wurden, wurden anhand von Wiederholungsverdünnungen der MLC-Kulturüberstände bestimmt. Der lineare Teil der Zytokin-Eichkurven wurde verwendet, um die Mengen der einzelnen Zytokine zu bestimmen.

Statistik

Ein Wilcoxon-Rangsummentest für gepaarte Differenzen und Fischer Exakt Test wurden zum Vergleich von Anti-SRBC-Antikörper-Titem bzw. SRBC-PFC-Anzahlen in mit PI und mit Plazebo gefütterten Mäusen verwendet.

Ergebnisse

Sowohl die mit PI als auch die mit Plazebo gefütterten Tiere vertrugen zerkleinerte Mäusefutterpellets gut, und es wurde bei keiner der experimentell oder mit Plazebo behandelten Mäuse ein Gewichtsverlust registriert.

SRBC-PFC

Die einzelnen Anzahlen von SRBC-PFC pro 106 Splenozyten von zwei Gruppen von 21 Mäusen wurden aus drei getrennten Experimenten ermittelt. Den Mäusen wurde an 10 aufeinanderfolgenden Tagen PI oder Plazebo verfüttert, und sie wurden mit SRBC am Tag 6 immunisiert und am Tag 10 des Fütterungsplans getötet. Die mittleren Anzahlen von SRBC-PFC pro 106 Splenozyten in den zwei Gruppen betrugen 400 bzw. 220. Diese Anzahlen waren jedoch nicht statistisch verschieden (p> 0,05, Wilcoxon). Es wurden jedoch einige Unterschiede zwischen den zwei Gruppen von Mäusen festgestellt So produzierten sechs der 21 Mäuse in der mit PI gefütterten Gruppe und nur eine von 21 Mäusen in der Plazebogruppe mehr als 500 PFC pro 106 Splenozyten, wobei dieser Unterschied zwischen den zwei Gruppen signifikant ist (p< 0,02, Fischer Exakt Test). Außerdem war beim Vergleich der zehn Mäuse, welche die höchste Anzahl von SRBC-PFC in jeder von diesen zwei Gruppen erzeugten, der Unterschied zwischen diesen zwei stark ansprechenden "Untergruppen" signifikant (p< 0,05, Wilcoxon).

Anti-SRBC-Hämolysine

Die Ergebnisse aus der SRBC-PFC-Studie veranlassten uns, den Spiegel an Anti- SRBC-Antikörper-Titem von einzelnen Mäusen zu untersuchen, die 14 Tage lang entweder mit PI oder mit Plazebo gefüttert wurden. Die Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse. Die mit PI gefütterte Mäusegruppe wies im Vergleich zu der mit Plazebo gefütterten Mäusegruppe signifikant höhere (p < 0,005) Anti-SRBC-Titerwerte am Tag 6 nach der Immunisierung auf.

Tabelle 1

Anti-SRBC-Hämolysin-Titer in Mäusen, die 12 Tage lang mit EPC-10 oder mit Plazebo gefüttert wurden. Die Mäuse wurden am Tag 3 immunisiert und die Antikörper an den Tagen 3, 6 und 9 nach der Immunisierung bestimmt.
* Die Zahlen in Klammem geben den Bereich der Titer in fünf einzelnen Mäusen wieder.
# Signifikant verschieden von der mit Plazebo gefütterten Gruppe, p < 0,005 (Wilcoxon). Zytokine
Die Überstände der vorstehend beschriebenen MLC-Kulturen wurden auf ihren Zytokingehalt am Tag 3 und 4 der Kultivierung getestet. Die Mengen an IL-2, IL-4 bzw. IL-10 wurden in den MLC-Überständen durch eine empfindliche ELISA-Methode gemessen. Wie in Tabelle 2 gezeigt ist, enthielten am Tag 3 der Kultivierung die MLC-Überstände von mit PI gefütterten Mäusen zweimal mehr IL-2 und IL-10 und siebenmal mehr IL-4. Am Tag 4 der Kultivierung enthielten die Überstände von den mit PI gefütterten Mäusen im Vergleich zu MLC-Überständen von mit Plazebo gefütterten Tieren dreimal mehr IL-10 und zweimal soviel IL-4.

Tabelle 2

Mengen* von IL-2, IL-4 und IL-10, die durch allo-stimulierte Splenozyten sezemiert wurden, die von mit PI oder Plazebo gefütterten Mäusen erhalten wurden.
* Mengen an Zytokin pro ml Kulturüberstand, die von MLC-Responderzellen aus einem Pool von fünf Milzen erzeugt wurden, die Zahlen geben die Mittelwerte von zwei wiederholten Zytokinmessungen wieder.

Beispiel4 4

Studiengegensfand

Ein erfindungsgemäßer Extrakt von Parthenium integrifoliurn wurde wie folgt hergestellt: 1000 g getrocknete Wurzel von Parthenium integrifolium wurde mit 10000 ml siedendem 90%igen Ethanol 4 Stunden lang extrahiert. Danach wurde der Extrakt filtriert und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. So wurden 216 g eines bernsteinfarbenen kristallinen Extrakts erhalten. Es wurden Tabletten hergestellt, die 50 mg des Extrakts enthielten.

Zusammenfassung der Studie

Hintergrund

Die Aufgabe der Studie war, die prophylaktische Wirkung des Extrakts von Parthenium integrifoliurn auf Migränekopfschmerzen in einer offenen klinischen Studie zu bewerten.

Methoden

16 Migränepatienten mit einer Vorgeschichte von mindestens vier Migränekopfschmerzanfällen pro Monat während der letzten sechs Monate wurden in die Studie aufgenommen.
Der Zeitplan der Studie bestand aus vier Zeiträumen von 4 Wochen. Der erste Zeitraum diente als E3asislinie, worin keine Behandlung erfolgte. In dem zweiten Zeitraum wurde eine tägliche Dosis von 4 Tabletten eingesetzt. In dem dritten Zeitraum wurde eine tägliche Dosis von 2 Tabletten eingesetzt. In dem vierten Zeitraum wurde eine tägliche Dosis von 4 Tabletten eingesetzt. Während der vier Zeiträume wurde jedes Auftreten von Migränekopfsclhmerzen aufgezeichnet.

Statistik

Es wurde ein Wilcoxon-Rangsummentest fürgepaarte Differenzen verwendet, um das Auftreten von Migränekopfschmerzen in jedem der drei Behandlungszeiträume mit dem Auftreten in dem Basiszeitraum zu vergleichen.

Befunde

Das mittlere Auftreten von Migränekopfschmerzen betrug im Zeitraum 1 (Basislinie) 5,75. Das mittlere Auftreten von Migränekopfschmerzen war in Zeitraum 2 30% niedriger, in Zeitraum 3 43% niedriger und in Zeitraum 4 57% niedriger, jeweils verglichen mit der Basislinie. Zeitraum 4 war signifikant verschieden von der Basislinie (p< 0,05; Wilcoxon).

Inferpretation

In dieser Studie wurde festgestellt, dass der untersuchte Extrakt von Parthenium integrifolium ein starkes Heilmittel für die Prophylaxe von Migränekopfschmerzen ist.

Claims

1. Extrakt aus Parthenium integrifolium, erhalten durch Extraktion der Pflanze oder von Teilen davon mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel oder einem Gemisch davon mit Wasser.

2. Extrakt nach Anspruch 1, erhalten durch Extraktion mit einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Aceton, Methylethylketon, Ethylacetat oder niederen Alkanolen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend einen Extrakt aus Parthenium integrifolium nach Anspruch 1 oder 2 und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

4. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Parthenium integrifolium oder Teile davon oder einen Extrakt oder Bestandteil davon zusammen mit y-Linolensäure oder Eicosapentaensäure und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger.

5. Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend Parthenium integrifolium oder Teile davon oder einen Extrakt oder Bestandteil davon zusammen mit Zingiber officinalle oder Teilen davon oder einem Extrakt oder Bestandteil davon und einen pharnnazeutisch annehmbaren Träger.

6. Verwendung eines Extrakts aus Parthenium integrifolium nach Anspruch 1 oder 2 zum Herstellen eines Arzneimittels für die Behandlung oder Verhinderung von entzündlichen oder Autoimmunerkrankungen.

7. Verwendung von Parthenium integrifolium oder Teilen davon oder einem Extrakt oder Bestandteil davon zum Herstellen eines Arzneimittels für die Linderung von Schmerzen.

8. Verwendung von Parthenium integrifolium oder Teilen davon oder einem Extrakt oder Bestandteil davon zum Herstellen eines Arzneirnittels für die Behandlung oder Verhinderung von Migräne oder Kopfschmerzen.

9. Verfahren zum Herstellen eines Extrakts aus Parthemum integrifolium, welches das Extrahieren der Pflanze oder von Teilen davon, vorzugsweise der Wurzel, mit einem Extraktionsmittel, umfassend ein mit Wasser mischbares organisches Lösungsmittel oder ein Gemisch davon mit Wasser, und anschließend, sofern erforderlich, das Entfernen des Extraktionsmittels zum Erhalten eines für den Gebrauch geeigneten Extrakts umfasst.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin das mit Wasser mischbare organische Fösungsmittei ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Aceton, Methylethylketon, Ethylacetat und niederen Alkanolen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.

11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, worin der Extrakt außerdem einer Flüssig- Flüssig-Extraktion, Säulenchromatografie, Wasserdarnpfdestillation oder Vakuumdestillation zur Entfernung oder Konzentrierung bestimmter Bestandteile unterworfen wird.