DE3638715A1 - Sesquiterpenverbindungen, verfahren zu ihrer isolierung und arzneimittel, enthaltend diese verbindungen - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft die in Pflanzen der Compositen-Familie im besonderen in Parthenium integrifolium (Linn´) und anderen Parthenium-Arten vorkommenden Sesquiterpenverbindungen sowie pharmazeutische Zubereitungen, welche diese Verbindungen in angereicherter oder standardisierter Form enthalten. Diese Verbindungen weisen immunmodulierende Wirkungen auf.

Von WADA et al. in Agr. Biol. Chem., Vol. 34, Nr. 6, S. 946-953 (1) wurden bereits aus Parabenzoin trilobum (Lauraceae) eine als Shiromodiol bezeichnete Verbindung

isoliert. Die absolute Konfiguration von Shiromodiol, das in der Pflanze als 8-Monoacetat und 6,8-Diacetat vorliegt, wurde durch Röntgenstrukturanalyse gesichert (Mc Clure et al., Chem. Communications 128 (1970)). Die relative Konfiguration von Shiromodiol an der Epoxidgruppe (C4, C5) wurde als zweimal β-ständig interpretiert. Durch Betrachtung der Röntgenstrukturdaten und Vergleich mit anderen Verbindungen, welche diese Epoxygruppe ebenso tragen, muß man sie als 4-β- und 5-α-ständig einordnen.

Eine mit Ugamdiol bezeichnete Verbindung wurde von russischen Arbeitsgruppen aus verschiedenen Ferula-Arten isoliert und als identisch mit Shiromodiol bezeichnet, ohne daß genauere Angaben bezüglich der Stereochemie gemacht wurden.

Ugamdiol kommt in der Pflanze ebenfalls verestert vor, und zwar mit Essigsäure, Angelicasäure, 3′,4′,5′-Trimethoxybenzoesäure, 4′-Hydroxy-3′-methoxy-benzoesäure und 4′-Methoxybenzoesäure (Kadyrov et al. Khim. Prir. Soedin. 11, 152 (1975); ref. C. A. 83, 111106 (1975)).

Es existierten eine Reihe von Germacranverbindungen mit ähnlichen Partialstrukturen wie Shiromodiol bzw. wie die des nachstehend beschriebenen, erfindungsgemäßen Esters 1. Die meisten dieser Verbindungen gehören dem Germacranolid- Typ an, d. h. sie besitzen eine Lactonstruktur im Molekül (oft mit exocyclischer Doppelbindung). Als Beispiele seien die nachstehenden Verbindungen angeführt:

Germacranolide mit ähnlicher Partialstruktur wie Shiromodiol

Parthenolid aus Ambrosia confertifolia, Compositae, Tanacetum parthenium, Michelia lanuginosa, Magnolaceae,

Eupahyssopin aus Eupatorium hyssopifolium, Compositae

Verbindung 15 aus Montanoa dumicola, Compositae

Linderan aus Lindera strychnifolia, Lauraceae

Zeylanan aus Neolitsea aciculata, Lauraceae

Baileyin aus Baileya sp., Compositae

Litseaculan aus Neolitsea aciculata, Lauraceae

11,13-Dehydrolanuginolid aus Michelia Lanuginosa Magnoliaceae

Lipiferolid aus Liriodendron tulipifera, Magnoliaceae

Simsiolid aus Simsia dombeyana, Compositae

Marginatin aus Vernonia marginata, Compositae

4β,5α-Epoxy-4,5-H-cis-inunolid aus Inula heleni Indula royleana, Compositae

Speciformin aus Artemisia tridentata und A. arbuscula, Compositae

Eriolin aus Eriophyllum confertifolium, Compositae

Erioflorin aus Eriophyllum confertifolium, Compositae

Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen handelt es sich um Inhaltsstoffe von Parthenium integrifolium und anderen Parthenium- Arten, die gemäß dieser Erfindung erstmalig aus Wurzeln verschiedener Provenienz dieser Pflanze isoliert wurden. Die Sesquiterpenverbindungen dieses Typs liegen in der Pflanze vorwiegend in Form ihrer Zimtsäureester vor.

Die Extraktion der Sesquiterpenester erfolgt mit lipophilen Lösungsmitteln (z. B. Chloroform). Zur Anreicherung kann die Säulenchromatographie an Kieselgel mit Toluol-Ethylacetat als Elutionsmittel angewandt werden. Die endgültige Reinigung erfolgt durch präparative Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel und präparative HPLC unter Verwendung von Umkehrphasensystemen.

Die Isolierung der erfindungsgemäßen Sesquiterpenester sowie ihre Analytik und ihre Konstitution werden in den nachfolgenden Beispielen näher erläutert.

Beispiel 1 Extraktion, Reinigung und Analyse der Sesquiterpenester aus Parthenium integrifolium radix 1. Drogenextraktion

Die Extraktion der Sesquiterpenester aus Parthenium integrifolium radix wird mit Chloroform in einem Soxhlet-Extraktor durchgeführt. Bei Einsatz von 200 g pulverisierter Droge wird 9 h lang extrahiert. Man erhält nach dem Abdampfen des Chloroforms ca. 6 g eines zähflüssigen, braungefärbten Extrakts, der die erfindungsgemäßen Ester in angereicherter Form enthält.

2. Säulenchromatographie

Die Auftrennung der Ester erfolgt mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von Kieselgel 60 (Korngröße 63-200 µm) und Toluol-Ethylacetat (8 : 2) als Elutionsmittel.

Auf die naß gepackte Säule (Durchmesser 4 cm; Füllhöhe 40 cm) wird der in wenig Elutionsmittel gelöste Extrakt mit einer Pipette kreisförmig aufgetragen und erst nach vollständigem Einziehen mit Elutionsmittel überschichtet.

Es wird in Schritten von ca. 7 ml fraktioniert. Die ersten 54 Fraktionen werden verworfen. Nach Überprüfung mittels DC werden die Fraktionen 55 bis 60 (I), 61 bis 66 (II), 67 bis 72 (III), 73 bis 75 (IV), 76 bis 82 (V), 83 bis 90 (VI) und 91 bis 98 (VII), vereinigt. Die Sammelfraktionen I bis IV enthalten den Ester 1 in angereicherter Form, während die Sammelfraktionen V bis VIII hauptsächlich die Ester 2 enthalten. Die Ausbeute der Sammelfraktionen I bis IV liegt bei 470 mg, die von V bis VII bei 300 mg, bezogen auf 6 g eingesetzten Chloroformextrakt.

3. Präparative DC

Die endgültige Reinigung der Ester erfolgt mittels präparativer Dünnschichtchromatographie auf Kieselgelplatten mit dem Fließmittel Toluol-Ethylacetat (19 : 4) und mit präparativer HPLC (LiChrosorb RP 18, 7 µm, 250-4 mm; Acetonitril-Wasser 8 : 2).

4. Analytik (a) Dünnschichtchromatographie DC

Die DC der Sesquiterpenverbindungen aus Parthenium erfolgt auf HPLC-Kieselgel 60 F 254-Fertigplatten mit dem Laufmittel Toluol-Ethylacetat (7 : 3). Die Zimtsäureester erscheinen im UV 254 nm als blaue Zonen auf grünem Grund. Der R_f-Wert des Esters 1 beträgt 0,57, der von Ester 2a/b 0,48.

Nach Besprühen mit Vanillin/Schwefelsäure-Reagenz und Erhitzen auf 120°C (ca. 3 min) erscheint Ester 1 als blaue Zone, die Ester 2a und 2b als gelbe Zone.

Die Detektion kann auch mit dem EP-Reagenz nach STAHL (Dtsch. Apotheker Ztg. 93, 197 (1953) erfolgen, das Proazulene erfaßt. Ester 1 reagiert mit diesem Reagenz violett, die Ester 2 türkisfarben.

Die Ester reagieren auch mit Phosphormolybdänsäure (blau), Antimon(III)-chlorid-Reagenz (violett, rot im UV 366 nm), Komarowsky-Reagenz (blau bzw. gelb).

(b) Hochleistungsflüssigchromatographie HPLC

Die HPLC-Trennung der Sesquiterpenester erfolgt mit einem Umkehrphasensystem. Es wurde speziell eine C18-Umkehrphase mit 5 µm Teilchendurchmesser verwendet. Als Fließmittel dient ein Gradient aus Acetonitril/Wasser (20% Acetonitril - 80% Acetonitril in 30 Min.). Die Trennung der Ester wird am besten bei 280 nm detektiert.

Die drei Hauptkomponenten (Ester 1, 2a, 2b) besitzen folgende relative Retention:

Ester 1:17,3 Ester 2a:16,0 Ester 2b:13,0

5. Chemische Konstitution der erfindungsgemäßen Ester

Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen handelt es sich um Zimtsäureester von Sesquiterpenalkoholen. Die Sesquiterpene sind vom Germacran- und Xanthan-Typ und besitzen zwei Hydroxylgruppen, die sich in 6- und 8-Stellung befinden. Das C-Atom 7 trägt eine Isopropylgruppe. An den Atomen C4 und C5 bzw. C10 und C1 kann eine Epoxygruppe gebunden sein oder eine Doppelbindung vorliegen. Die Veresterung erfolgt an der OH-Gruppe in C8-Stellung.

Im einzelnen wurden aus Parthenium integrifolium die nachfolgend beschriebenen Verbindungen isoliert.

(a) Ester 1

Ester 1 besitzt folgende relative Konfiguration:

Es handelt sich um eine ölige, harzige Substanz mit dem Molekulargewicht 384.

Sie wurde strukturell durch IR-Spektrum, UV-Spektrum, PMR-Spektrum ¹³C-NMR-Spektrum und Röntgenstrukturanalyse des Alkohols charakterisiert und war als solche bisher in der Literatur nicht bekannt. Es handelt sich um die erste nichtflüchtige, aus Parthenium integrifolium isolierte Sesquiterpenverbindung.

Der diesem Ester zugrundeliegende Alkohol ist in dieser relativen Konfiguration bisher nicht bekannt gewesen. Von Wada et al. (1) wurde Shiromodiol, eine an C-8 epimere Verbindung beschrieben. Obwohl die relative Konfiguration von Shiromodiol von WADA et al. (1) an der Epoxidgruppe (C4, C5) als zweimal β-ständig angegeben wurde, ergibt sich durch Betrachtung der Röntgenstrukturdaten und Vergleich mit anderen Verbindungen, welche diese Epoxidgruppe ebenfalls aufweisen, daß sie als 4-β- und 5-α-ständig einzuordnen ist, wie dies auch für den erfindungsgemäßen Ester 1 zutrifft. Der Vergleich der Röntgenstrukturdaten von Shiromodiol und Ester 1 ergab im Bereich der Epoxidgruppe bezüglich der relativen Konfiguration absolute Übereinstimmung. Ein Unterschied zu Shiromodiol betrifft auch die Stellung der Methylgruppen. Bei Shiromodiol sind beide auf derselben Ringseite, während sie bei Ester 1 α- und β-gerichtet sind.

(b) Ester 2b

Ester 2b, dessen zugrundeliegender Sesquiterpenalkohol durch Röntgenstrukturanalyse charakterisiert wurde, besitzt folgende Struktur (relative Konfiguration):

Es handelt sich um eine harzig-ölige Substanz. Sie besitzt das Molekulargewicht 400.

Sie ist strukturell durch IR-Spektroskopie, UV-Spektroskopie, PMR- und ¹³C-NMR-Spektroskopie charakterisiert.

Die Struktur ist bisher in der Literatur nicht bekannt, auch nicht die des entsprechenden Alkohols. Für verwandte Verbindungen gilt das gleiche, wie für Ester 1 bereits dargelegt wurde.

Ester 2a

Ester 2a, dessen zugrundeliegender Alkohol durch spektroskopische Methoden (NMR, MS, IR) aufgeklärt wurde, besitzt folgende relative Konfiguration:

Die veresterte Verbindung ist bisher nicht beschrieben worden. Auch der zugrundeliegende Alkohol ist genuin in einer Pflanze bisher nicht gefunden worden.

Von Wada et al. (Tetrahedron Letters 3357 (1969)) wurde eine vermutlich diastereomere Verbindung zu Alkohol 2a durch thermische Umwandlung aus Shiromodiol hergestellt.

Ein Sesquiterpen mit Lactongruppe und ähnlicher Partialstruktur wie Alkohol 2a liegt im Carabron vor, das aus verschiedenen Compositen (Carpesium-, Arnica-, Inula- und Helenium-Arten) isoliert werden konnte.

Beispiel 2 Vorschrift zur Herstellung einer auf Sesquiterpenester standardisierten pharmazeutischen Zubereitung aus Parthenium integrifolium I. Extraktion der Droge

Die Extraktion der Droge erfolgt durch Chloroform (bzw. andere Lösungsmittel, in denen sich die Sesquiterpenester lösen) in einer Soxhlet-Apparatur. Dadurch ist eine quantitative Extraktion der Sesquiterpenester gewährleistet.

II. Gehaltsbestimmung mittels HPLC 1. Herstellung der Analysenlösung

100,0 mg Extrakt werden in 10,0 ml Ethanol p. a. gelöst

2. HPLC-Analyse

Die quantitative Bestimmung der Sesquiterpenester erfolgt nach der Methode des Externen Standard (Eichgerade) mit Hilfe der HPLC.

Für die HPLC-Trennung wird eine Trennsäule mit einer Umkehrphase (LiChrospher RP18) verwendet. Als Fließmittel dient ein Gradient aus Acetonitril-Wassermischungen. Die Detektion kann bei 280 nm erfolgen.
Im speziellen wurden folgende Parameter verwendet:
Säule: LiChrospher RP18 5 µ; Hibar 125-4 (Merck)
Fließmittel:
A: Wasser, B: Acetonitril
von 20% B linear auf 50% B in 30 Min.
1,0 ml/Min.
Detektion: 280 nm

Die Eichung erfolgte mit einer Stammlösung von Ester 1. Da sich alle gefundenen Sesquiterpenester im Molekulargewicht nur sehr unwesentlich unterscheiden und die Zimtsäure als Chromophor bei allen Estern enthalten ist, kann eine Berechnung des Gehaltes aller Ester unter Bezug auf den Korrekturfaktor von Ester 1 erfolgen.

Der Korrekturfaktor wurde in dem verwendeten System mit etwa 6×10^-7 Flächeneinheiten/mg bestimmt.

Bei der Gehaltsbestimmung mit Hilfe der beschriebenen Methode fanden wir bei verschiedenen handelsüblichen Parthenium radix Drogen die folgenden Mengen Sesquiterpenester:

%
Ester 1Ester 2a/b

0,130,19/0,17 0,150,07/0,08 0,390,05/0,07 0,580,08/0,07 0,470,04/0,06 0,540,02/0,06

Pharmakologie der Ester aus Parthenium integrifolium I. Bisher gefundene pharmakologische Daten der Sesquiterpenester aus E. purpurea

• 1. Im Granulozytentest (nach Brandt) steigerten die Ester die Phagozytoseleistung um ca. 30% (Konzentration: 0,1-0,0001 mg/ml).
• 2. Ester 1 und Ester 2 führen in relativ hoher Konzentration zu einer Suppression der Natural Killer Zellen.
• 3. Ester 1 zeigt eine signifikante Wirkung gegen Herpes- Viren.
• 4. Ester 1 zeigt eine positive Wirkung im Lymphozytentransformationstest.

II. Verwandte Verbindungen mit vergleichbaren Wirkungen

Untersuchungen von HALL und Mitarb. (J. Pharm. Sci 68, 537 (1979) und 69, 537 (1980)) ergaben:
Euphahyssopin zeigt eine 57%ige Hemmwirkung im "Rattenpfotenödem-Test", eine 68%ige Hemmwirkung im "Krümm-Test" (writhing reflex), eine 66%ige Hemmwirkung im Adjuvans- Arthritis-Test, eine 36%ige Hemmung im "Antipleurisy-Screen" und eine 47%ige Hemmung der "T-zellabhängigen Hypersensitivität".
Eupatolid zeigt eine 30%ige Hemmwirkung im Rattenpfotenödem-Test und eine 36%ige Hemmung im Krümmtest.
Molephantin: 33%ige Hemmung im Rattenpfotenödemtest, 54%ige Hemmung im Krümmtest und 60%ige in Adjuvans Arthritis-Test.
Molephantinin: 32%ige Hemmung im Rattenpfotenödemtest, 47%ige Hemmung im Krümmtest.
Alle Verbindungen weisen eine α-Methylen-γ-lacton-Gruppierung auf; die freie 6-OH-Gruppe ist für die Wirkung wichtig; das Epoxid verstärkt die Wirkung.

Claims (3)

1. Sesquiterpenverbindungen und ihre Enantiomere der Formeln in welchen R den Rest einer aromatischen Säure, im besonderen Cinnamoyl bedeutet, erhalten durch Extraktion aus Parthenium integrifolium radix oder anderen Pflanzen der Compositen-Familie.

2. Verfahren zur Gewinnung von Sesquiterpenverbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man

• (a) die pulverisierte Droge (Parthenium integrifolium-Wurzel) oder anderen Pflanzen aus der Compositen-Familie mit Chloroform oder Lösungsmitteln ähnlicher Extraktionskraft extrahiert,
• (b) den erhaltenen Extrakt mittels Säulenchromatographie unter Verwendung von Kieselgel und Toluol-Ethylacetat (8 : 2) oder Fließmittel mit ähnlichem eluotropen Verhalten als Elutionsmittel chromatographiert und die einzelnen Fraktionen mittels DC auf ihren Gehalt an Sesquiterpenverbindungen überprüft,
• (c) die nacheinander gewonnenen Fraktionen mit Gehalten an Ester 1 bzw. Ester 2a/b zu Sammelfraktionen der einzelnen Esterverbindungen vereinigt und
• (d) die erhaltenen Sammelfraktionen, jede für sich, mittels präparativer Dünnschichtchromatographie auf Kieselgelplatten mit Toluol-Ethylacetat als Fließmittel oder mittels präparativer Hochleistungs-Flüssigchromatographie auf einer Umkehrphase reinigt.

3. Pharmazeutische Zubereitungen, enthaltend eine oder mehrere Sesquiterpenverbindungen nach Anspruch 1 und übliche Hilfs- und Trägerstoffe.