DE69434407T2

DE69434407T2 - Kondensationspolymer aus einer aromatischen Sulfonsäure und ein Aledhyd zur Hemmung der HIV-Infektivität

Info

Publication number: DE69434407T2
Application number: DE69434407T
Authority: DE
Inventors: K. Shyam SINGH; J. Raymond PATCH; V. Peter PALLAI; A. Edith NEIDHARDT; P. Gerard PALACE; J. Kevin WILLIS; M. Theresa SAMPO; W. Kevin MCDONALD; Zhan Shi
Original assignee: Indevus Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Indevus Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1993-11-23
Filing date: 1994-11-17
Publication date: 2006-03-16
Anticipated expiration: 2014-11-18
Also published as: EP0730462A1; EP0730462B1; DK0730462T3; ATE297743T1; CA2177257C; US6365625B1; US5614559A; JP3866280B2; JPH09510687A; CA2177257A1; US6075050A; WO1995014479A1; AU1181795A; PT730462E; DE69434407D1; US5677343A; ES2244961T3

Description

Hintergrund der Erfindung
CD4, ein Oberflächenglycoprotein-Rezeptor, der auf einer Untergruppe von als CD4+-Zellen bekannten T-Lymphozyten vorkommt, ist an der Erkennung des Klasse-II-Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) beteiligt und scheint der physiologische Rezeptor für Klasse-II-MHC zu sein. Menschliches CD4 ist demnach der Rezeptor für das gp120-Hüllglycoprotein des humanen Immunschwächevirus (HIV) und ist von wesentlicher Bedeutung für das Eintreten des Virus in die Wirtszelle sowie für die Membranfusion, die beide zu der Übertragung des Virus von Zelle zu Zelle und zu dessen zytopathischen Wirkungen beitragen. Es ist bekannt, dass HIV AIDS verursacht, indem es das Immunsystem angreift und CD4+-Zellen zerstört und somit den Körper gegen den Angriff bakterieller und anderer viraler Pathogene hilflos macht. Es konnte gezeigt werden, dass der Haupteintrittsweg des HIV in die CD4+-Zellen in der Bindung an CD4 besteht.
Mit erheblichem Aufwand wurde die CD4/gp120-Wechselwirkung untersucht und der Versuch unternommen, auf diese Wechselwirkung einzuwirken oder sie zu hemmen, um ein Mittel zu finden, mit welchem die lebensbedrohlichen Wirkungen einer HIV-Infektion verlangsamt oder rückgängig gemacht werden können. Bisher wurde ein geringe Anzahl von antiviralen Wirkstoffen entwickelt, die in die Infektion von Zellen durch HIV und in deren Folgewirkungen eingreifen, so z.B. Zidovudin (auch bekannt als AZT) oder Dideoxyinosin (ddl). Ein Mittel, mit dem die HIV-Infektion von CD4 aufweisenden Lymphozyten, welche etwa 60–80 der gesamten zirkulierenden T-Lymphozytenpopulation ausmachen, verhindert werden kann, wäre von großem Wert, insbesondere unter Berücksichtung der Tatsache, dass eine HIV-Infektion solcher Zellen einen vollständigen Zusammenbruch des Immunsystems verursachen kann und mit großer Wahrscheinlichkeit die Entwicklung einer viralen Resistenz gegen die Therapie verhindert. Es wurde entdeckt, das eine Verbindung, nämlich Dextransulfat, in die CD4/gp120-Wechselwirkung eingreift. Jedoch führte diese Verbindung zu einer koagulationshemmenden Aktivität von nicht akzeptablem Ausmaß. Es wäre weiterhin von Nutzen, Mittel zu entwickeln, die zur Behandlung von CD4-bezogenen Erkrankungen wie z.B. AIDS-bezogener Krankheitszustände (ARC), AIDS-bezogener Demenz und nicht symptomatischer HIV-Infektion geeignet sind und die ein signifikantes Ausmaß der koagulationshemmenden Aktivität verhindern.
Es wurde bereits eine Vielzahl von Kondensationspolymeren aus Formaldehyd und aromatischen Sulfonsäuren beschrieben. In dem US-Patent Nr. 4,604,404 ist die Verwendung einiger solcher Polymere als antivirale Mittel gegen das Herpes-simplex-Virus offenbart. Jedoch wird die Verwendung solcher Verbindungen in der Behandlung von HIV-Infektionen und verwandter Erkrankungen und Zustände in diesem Dokument nicht gelehrt oder nahe gelegt.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Erkenntnis, dass Kondensationspolymere aus aromatischen Sulfonsäuren und einem Aldehyd und Fraktionen davon, insbesondere Naphthalinsulfonsäureformaldehydpolymere (wie beispielsweise PRO 1041 und PIC 024,4 und die unten definierten Fraktionen davon) in der Lage sind, die HIV-gp120-Bindung an CD4, wie in CD4/gp120-Bindungsassays gezeigt, zu unterbinden. Es konnte gezeigt werden, das die Verbindungen der vorliegenden Erfindung keine rytotoxische und keine inhibierende Wirkung auf die antigeninduzierte T-Lymphozytenproliferation haben und dass sie Spezifizität zeigen, was sich in mangelnder Inhibierung in CD2/LFA-3-Bindungsassays (CD58) (LFA = lymphozytenfunktionsassoziiertes Antigen) niederschlägt. Basierund auf diesen Erkenntnissen lassen sich Kondensationspolymere aus aromatischen Sulfonsäuren und einem Aldehyd und Fraktionen davon als therapeutische Wirkstoffe zur Behandlung des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) sowie AIDS-bezogener Krankheitszustände (ARC), AIDS-bezogener Demenz und asymptomatischer HIV-Infektion verwenden. Die Verbindung kann auch zur Behandlung einer Blutzubereitung in vitro verwendet werden, um eine HIV-Infektion von in der Blutzubereitung vorhandenen CD4+-Zellen zu verhindern.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Graph der Inhibierung der gp120-Bindung an immobilisiertes lösliches CD4 (sCD4) durch PIC 024,4 (gekennzeichnet durch ein leeres Quadrat) und durch PRO 1041 (gekennzeichnet durch einen gefüllten Kreis).
2 ist ein Graph einer In-vitro-anti-HIV-Aktivität von PIC 024,4 (gekennzeichnet durch ein leeres Quadrat) und von AZT (gekennzeichnet durch einen gefüllten Rhombus) gegen HIV (JR-CSF-Stamm).
3 ist ein Graph der In-vitro-anti-HIV-Aktivität (Stamm ADA) an den Tagen 7 und 14 von PIC 024,4 (gekennzeichnet durch ein leeres Quadrat für Tag 7 und ein gefülltes Quadrat für Tag 14) und von AZT (gekennzeichnet durch einen leeren Kreis für Tag 7 und einen geschlossenen Kreis für Tag 14).
4 ist eine graphische Darstellung der Beziehung von Größe zu Aktivität von Fraktionen von PRO 1135, die ein maximales Molekulargewicht von 5,6 kDa (leeres Quadrat), 10 kDa (gefülltes Quadrat), 16 kDa (leerer Kreis) und 31 kDa (gefüllter Kreis) aufweisen, bei der Hemmung der gp120-Bindung an sCD4 (ELISA).
5 ist ein Graph der Größe/Aktivität-Beziehung von Fraktionen von PRO 1135, die ein maximales Molekulargewicht von 5,6 kDa (leeres Quadrat), 10 kDa (gefülltes Quadrat), 16 kDa (offener Kreis) und 31 kDa (gefüllter Kreis) aufweisen, bei der Hemmung der gp120-Bindung im zellulären CD4/gp120-Bindungsassay.
6 ist eine graphische Darstellung der koagulationshemmenden Wirkung der Fraktionen von PRO 1135 mit 31 kDa (leeres Quadrat), 10 kDa (geschlossenes Quadrat) und 5,6 kDa (geschlossener Rhombus).
7 ist eine graphische Darstellung der Hemmung der Bindung von gp120 an CD4 in einem zellulären Assay für PRO 1191 (Oktamer, leeres Quadrat) und für PRO 1072 (Tetramer, offener Rhombus) des Formaldehyd-2-naphthalinsulfonsäure-Kondensationsoligomers. PRO 1191 und PRO 1072 zeigten einen IC₅₀-Wert von 52 bzw. 78.
8 ist eine graphische Darstellung des ELISA-Assays für die Hemmung der CD4-gp120-Bindung für PRO 1191 (Oktamer, leeres Quadrat), PRO 1072 (Tetramer, leerer Rhombus) und PRO 1073 (Hexamer, leerer Kreis) des Formaldehyd-2-naphthalinsulfonsäure-Kondensationsoligomers.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Herstellung von Aldehyd-Kondensationspolymeren aromatischer Sulfonsäuren ist in der Fachwelt wohl bekannt. In der vorliegenden Anmeldung bezeichnet der Begriff "aromatische Sulfonsäuren" aromatische carbocyclische und heterocyclische Ringe, die mit einem oder mehreren Sulfonsäureresten substituiert sind. Aromatische carbocyclische Ringe umfassen beispielsweise Phenyl, Naphthyl, Tetrahydronaphthyl, Biphenyl, Phenylalkylphenyl, Phenylalkenylphenyl, Phenoxyphenyl, Phenylthiophenyl und Phenoxyalkoxyphenyl. Aromatische heterocyclische Ringe umfassen beispielsweise Pyridinyl, Pyrimidinyl, Chinolinyl, Thiophenyl, Furanyl, Pyrazolyl, Imidazolyl, Pyrrolyl und Thiazolyl. Für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen geeignete Aldehyde umfassen beispielsweise Formaldehyd, Acetaldehyd, Propionaldehyd und Benzaldehyd. Bei dem Aldehyd handelt es sich vorzugsweise um Formaldehyd. In der vorliegenden Anmeldung bezeichnet der Begriff "Polymer" jede Verbindung, die durch die Verknüpfung von zwei oder von mehr Monomeren oder sich wiederholender Einheiten gebildet wird. In dem US-Patent 4,604,404, dessen Inhalt durch Be zugnahme in die vorliegende Beschreibung aufgenommen wird, sind für die vorliegende Erfindung geeignete Polymere und Verfahren zu deren Herstellung beispielhaft aufgeführt.
Eine solche Verbindung, nämlich ein Kondensationspolymer aus Formaldehyd und Naphthalinsulfonsäure, kann als Alternative auch aus Farbstoffzusammensetzungen wie Direct Yellow 29, einem eine Mischung mehrerer Verbindungen enthaltenden, handelsüblichen Farbstoff, in welchen die interessierende Verbindung als Dispersionsmittel zugegeben wurde, isoliert werden. Vor der Formulierung in einem physiologisch akzeptablen Träger kann die Zubereitung mittels bekannter Reinigungsverfahren wie Ausfällung, Kristallisation, Extraktion und/oder Chromatographie gereinigt werden, um PIC 024,4 zu isolieren. Ein Beispiel für letztere ist im Beispielteil näher erläutert.
Die hier verwendeten Kondensationspolymere können wahlweise fraktioniert werden, um Kondensationspolymere mit einem engen oder monodispersen Molekulargewicht zu erhalten.
Im Allgemeinen steigt mit zunehmendem Molekulargewicht des Polymers die therapeutische Wirkung der Verbindung. Jedoch nimmt auch die koagulationshemmende Wirkung der Verbindung mit steigendem Molekulargewicht zu. Dementsprechend wählt man das Molekulargewicht vorteilhaft so, dass eine optimale antivirale Wirkung erzielt wird, während die koagulationshemmende Wirkung auf ein Minimum reduziert wird.
Es besteht die Möglichkeit, diejenige Verbindung zu wählen, mit welcher ein bevorzugtes therapeutisches Verhältnis erzielt wird. "Therapeutisches Verhältnis" ist in der vorliegenden Anmeldung definiert als diejenige Dosierung (μg/ml), die zur Erreichung einer durchschnittlichen Antikoagulationsverdopplungszeit der oberen regulären partiellen Thromboplastin-Zeit unter Verwendung des unten beschriebenen Antikoagulationsassays, erforderlich ist, dividiert durch die Dosierung (μg/ml), die zur Erzielung einer 50%igen Hemmung der CD4-gp120-Bindung in dem unten beschriebenen zellulären Assay erforderlich ist. Das bevorzugte therapeutische Verhältnis beträgt wenigstens etwa 7, besonders bevorzugt wenigstens etwa 20.
Vorzugsweise beträgt das maximale Molekulargewicht (M_P) weniger als etwa 50 kDa und/oder mehr als etwa 0,7 kDa. Besonders bevorzugt sind Polymere mit einem maximalen Molekulargewicht von etwa 1,3 bis etwa 30 kDa, ganz besonders bevorzugt von etwa 4 bis etwa 12 kDA. Vorzugsweise beträgt die durchschnittliche Anzahl der Sulfonsäuren pro aromatische Gruppe etwa 0,5 bis etwa 2,0, ganz besonders bevorzugt etwa 1.0.
Die ein enges oder monodisperses Molekulargewicht aufweisenden Polymere können durch dem Fachmann bekannte Fraktionierungsverfahren (siehe beispielsweise Polymer Fractionation, Herausgeber, Cantow und Manfred, Jr., (Acad. Press) 1967), z.B. Ausfällen mittels Lösemittel, Gelpermeationschromatographie, Salzfällung und Difiltration, hergestellt werden. Alternativ hierzu können die Polymere durch schrittweise oder gesteuerte Kondensation von Naphthalinsulfonsäure und Formaldehyd hergestellt werden.
PIC 024,4 unterband die CD4/gp120-Bindung in einem primären Bindungsassay. Die Verbindung zeigte antivirale Aktivität gegen die HIV-Stämme HTLV-IIIB, JR-CSF und ADA in in-vitro-Assays. Weiterhin erwies sich die Verbindung als spezifisch und nicht zytotoxisch, da sie keine Aktivität gegen die CD2/LFA-3-Wechselwirkung und T-Zell-Proliferation und keine Toxizität gegenüber einer Mehrzahl getesteter Zelllinien zeigte. Diese Daten, welche weiter unten im Einzelnen aufgeführt werden, führen zu dem Schluss, dass die Kondensationspolymere des hier beschriebenen Typs als antivirale Mittel gegen den HIV-Virus wirken.
Basierend auf den hier besprochenen Ergebnissen ist eine Zubereitung, die Kondensationspolymere aus Formaldehyd und aromatischen Sulfonsäuren, wie beispielsweise PRO 1041 und PIC 024,4, enthält, in der Lage, alle CD4-vermittelten Stadien der HIV-Infektion zu blockieren. Als solche können sie zur In-vivo-Behandlung von mit HIV infizierten Individuen (z.B. durch Verabreichung an infizierte Individuen) verwendet werden. Die Verbindungen sind gegen CD4-vermittelte Infektion durch nicht synzytieninduzierende (NSI) und synzytieninduzierende (SI) Phänotypen des HIV-Virus wirksam. Sie können auch prophylaktisch bei nicht infizierten Individuen (z.B. versehentliche Nadelstiche und Übertragung von der Mutter auf das Neugeborene) und bei Individuen, die zwar HIV-positiv sind, jedoch keine Symptome zeigen, angewandt werden. Die Zubereitung kann zur Hemmung der Bindung von HIV an CD4-Lymphozyten verwendet werden sowie zur Hemmung der Übertragung des Virus von einer infizierten Zelle auf eine nicht infizierte Zelle, einschließlich der durch Synzytienbildung vermittelten HIV-Infektion. Da die Verbindung die Bindung von HIV an CD4 inhibiert und es sich um eine immunsystemspezifische Intervention handelt, wird davon ausgegangen, dass sie nicht zu viraler Resistenz führt.
Das Kondensationspolymer kann wahlweise als pharmazeutisch akzeptables Salz verabreicht werden. Beispiele geeigneter Salze sind Alkali-, Alkalimetall- und Ammoniumsalze wie Calcium, Natrium und Ammoniumsalze.
Die erfindungsgemäße Zubereitung kann intravaginal oder rektal (z.B. empfängnisverhütende Formulierung oder Zäpfchen), oral (z.B. Kapseln, Tabletten oder flüssige Formulierungen), parenteral (z.B. intramuskulär, intravenös, subkutan), topisch, nasal oder über langsam freisetzende Mikroträger in Dosisformulierungen, die einen physiologisch akzeptablen Träger und optional Hilfsstoffe und Konservierungsmittel enthalten. Zu den geeigneten physiologisch akzeptablen Trägern gehören Satzlösung in sterilem Wasser, Ringer-Lösung und isotonische Natriumchloridlösungen. Insbesondere können beispielsweise Natriumchloridinjektion USP (0,9 %), Ringer-Injektion USP, mit Laktat versehene Ringer-Injektion USP, Natriumlaktat-Injektion USP, Dextrose-Injektion USP (5 % oder 10 %), bakteriostatisches Wasser für die Injektion USP und steriles Wasser für die Injektion USP verwendet werden. Vorteilhafterweise können die Verbindungen in einer empfängnisverhütenden Formulierung, wie beispiels weise empfängnisverhütendes Gel, Creme oder Schaum, verwendet werden. Die spezifische Dosierungshöhe eines Wirkstoffs hängt von einer Reihe von Faktoren, u. a. der biologischen Wirkung der jeweiligen Zubereitung, dem Alter, dem Körpergewicht, dem Geschlecht, dem allgemeinen Gesundheitszustand und dem klinischen Stadium der AIDS-Erkrankung ab.
Auch andere antivirale Mittel, die auf die virale Replikation des HIV einwirken, können in Verbindung mit dieser Zubereitung in Übereinstimmung mit den erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden. Durch gemeinsame Verabreichung antiviraler Mittel können unterschiedliche Stadien des Lebenszyklus des Virus wirksam gehemmt und somit der therapeutische Nutzen der erfindungsgemäßen Zubereitung optimiert werden, um die virale Infektiosität und die damit verbundenen Symptome zu vermindern oder zu eliminieren. So kann beispielsweise ein die reverse Transkriptase des HIV hemmendes Mittel, wie Zidovudin (AZT) oder Dideoxyinosin (ddl), oder eine HIV-Protease oder ein Nicht-Nukleosid-Inhibitor, wie Nevirapin, gemeinsam mit dem Kondensationspolymer verabreicht werden, entweder separat oder als Einzeldosisformulierung, die das Kondensationspolymer und ein anderes antivirales Mittel bzw. andere antivirale Mittel enthält.
Weiterhin kann die Zubereitung in vitro zu einer Blutzubereitung gegeben werden. Bei dieser Ausführungsform wird durch die Verbindung die virale Bindung und der Eintritt in CD4+-Zellen wirksam blockiert und somit die Infektion von T-Zellen verhindert. Die Verbindung kann entweder alleine zu der Blutzubereitung gegeben werden oder kombiniert mit einem geeigneten Träger wie einer Salzlösung in sterilem Wasser, einer Ringer-Lösung oder isotonischen Natriumchloridlösungen. Die erforderliche wirksame Menge hängt von einer Reihe von Faktoren ab, unter anderem der jeweiligen Blutzubereitung und dem gewählten Träger.
Die Erfindung wird im Folgenden anhand nicht einschränkender Beispiele näher erläutert.
Isolierung und Charakterisierung von PIC 024,4
Eine Lösung von Direct Yellow 29 (Aldrich Chemical Company, Charge #0033187; Sigma Chemical Company, Charge # 17F3484) wurde durch Lösen von 10,0 g in 200 ml Wasser hergestellt; die Lösung wurde angesäuert mit Trifluoressigsäure (Endkonzentration: 0,1 % Trifluoressigsäure) und eine Stunde bei 4 °C gerührt. Der Niederschlag wurde durch Filtration abgetrennt und das Filtrat einer präparativen Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung eines Waters-600E-Systems, ausgestattet mit einer PrePak^®-RCM-Kartuschensäulenanordnung (Waters Chromatography, Unternehmensbereich von Millipore, Milford, MA), unterzogen. Die mobile Phase bestand aus 0,1 % Trifluoressigsäure in Wasser (Lösemittel A) und 0,1 % Trifluoressigsäure in Acetonitril/Wasser (60:40) (Lösemittel B). Mit einer anfänglichen Lösemittelmischung aus 70 Lösemittel A und 30 % Lösemittel B bei einem Fluss von 25 ml/min wurde die Stammlösung (5 ml) auf eine 40 × 300 mm DeltaPak^TM-C₁₈-Säule (Partikelgröße = 15 μm, mittlerer Porendurchmesser = 300 A) geladen. Die Konzentration des Lösemittels B wurde mit einem Gradienten von 1,2 %/min auf 70 % und anschließend mit einem Gradienten von 15 %/min auf 100 % erhöht. Detektion bei 280 nm; das zwischen 10,0 und 21,8 Minuten eluierende Material wurde gesammelt und eingeengt, dies lieferte PIC 024,4.
PIC 024,4 wurde durch verschiedene Verfahren wie HPLC-, NMR-, IR-, UV- und Fluoreszenzbestimmungen charakterisiert.
¹H-NMR-Spektren (250 MHz Bruker, DMSO-d₆) von PIC 024,4 umfasste die folgenden Signale: d 6,5–8,6 (br m), 4,8–5,0 (br s), 4,2–5,0 ppm (br s).
Im IR-Spektrum von PIC 024,4 (FT, Perkin Elmer, KBr) waren 3448, 1630, 1400, 1186, 1122, 1030 und 680 cm^–1 die Hauptbanden.
Synthese von Kondensaten: Polymerisation
Eine Mischung von 2-Naphthalinsulfonsäurenatriumsalz (1,15 g, 5 mmol), 37 % wässrigem Formaldehyd (0,65 ml, ~6 mmol) und Schwefelsäure (0,7 g konzentrierte Schwefelsäure in 0,5 ml Wasser) wurde über 43 Stunden auf 98 °C bis 100 °C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde anschließend mit Wasser (30 ml) verdünnt, mit Calciumcarbonat auf pH 7 neutralisiert und filtriert, das Filtrat wurde zur Trockne eingeengt, was 1,22 g des Kondensats PRO 1041 lieferte.
¹H NMR und IR dieses Produktes waren ähnlich wie bei PIC 024,4, siehe oben.
Der obige Versuch wurde unter Modifizierung der Reaktionsbedingungen, wie in Tabelle 1 beispielhaft angegeben, wiederholt.
TABELLE 1

* Reaktion in offenem Gefäß; Mp = maximales Molekulargewicht; MWd = molekulare Gewichtsverteilung; MW = mittleres Molekulargewicht

Synthese von Kondensaten: Schrittweise
5-Brom-2-naphthalinsulfonsäure
5-Amino-2-naphthalinsulfonsäure (1 1,15 g, 50 mmol) wurden unter Rühren in 100 ml 0,5 N NaOH-Lösung gelöst. Die dunkelrote Lösung wurde auf 0 °C durch Zugabe von Eis (~100g) heruntergekühlt. Bevor das Eis vollständig geschmolzen war, wurden 20 ml wässrige 40%ige HBr-Lösung tropfenweise hinzugegeben und die resultierende Suspension bei einer Temperatur von –5 °C bis 0 °C gehalten, dann wurden während 30 Minuten 10 ml einer wässrigen NaNO₂ (3,65 g)-Lösung hinzugegeben. Die Mischung wurde über 30 Minuten bei –5 °C ~ 0 °C kontinuierlich gerührt. Das nicht umgesetzte NaNO₂ wurde am Ende der Reaktion durch Zugabe von 350 mg Harnstoff zersetzt. Die resultierende dunkle Diazonium-Suspension wurde bei einer Temperatur von weniger als 0 °C gehalten und über einen Zeitraum von 1 h tropfenweise zu einer CuBr(7,15 g)-Lösung in 40 ml 40%igem HBr bei 70 °C unter kräftigem Rühren hinzugegeben (die CUBr-Lösung befand sich in einem 1000ml-Gefäß. Die dunkle Mischung wurde 40 Minuten bei 80 °C gerührt, dann wurde auf Raumtemperatur gekühlt und 200 ml Wasser hinzugegeben. Das Präzipitat wurde in einem Büchner-Trichter gesammelt und mit etwa 50 ml Wasser gewaschen. Nach Trocknung unter Vakuum wurden 13,9 g Rohprodukt erhalten. Die rohe Verbindung wurde in 500 ml Wasser über 2 Stunden gekocht, auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert. Das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft und der Feststoff im Vakuum getrocknet, was 8,23 g (57 % Ausbeute) eines reinen Produktes ergab.
Die Reinheit des Produktes wurde durch "reverse phase"-HPLC und ¹H-NMR (250 MHz) überprüft.
8,8'-Methylen-bis-5-brom-2-naphthalinsulfonsäure (Natriumsalz)
Eine Mischung aus 5-Brom-2-naphthalinsulfonsäure (17,22 g), TFA (200 ml), Amberlyst-15-Harz (17 g, Aldrich), Paraformaldehyd (4,5 g) und H₂O (50 ml) wurde in einem geschlossenen, dickwandigen Bombenrohr 14 h auf 130 °C erwärmt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur wurde die Mischung in einem Büchner-Trichter filtriert und der gesammelte Feststoff mit etwa 10 ml TFA gewaschen und in 250 ml Methanol/Wasser (4/1) gelöst und filtriert. Das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft und der Feststoff in 80 ml Wasser suspendiert und mit 10 M NaOH auf pH ~8 neutralisiert. Der Feststoff wurde filtriert, mit 60 ml Aceton gewaschen und im Vakuum über Nacht getrocknet. 15,03 g (80 % Ausbeute) reines Produkt wurden erhalten.
8,8'-Methylen-bis-2-naphthalinsulfonsäure
Pd-C (10 %, 5,0 g) wurde unter Argon-Atmosphäre langsam zu einer Suspension von 8,8'-Methylen-bis-5-brom-2-naphthalinsulfonsäure (Natriumsalz, 6,30 g) und NaOH (0,32 g) in 300 ml MeOH gegeben. Die Suspension wurde unter einem H₂-Druck von 50 psi über 18 h geschüttelt. Anschließend wurde die Mischung filtriert und das Filtrat durch eine mit ~20 g IR-120-Harz gepackte Säule filtriert. Das Lösemittel wurde am Rotationsverdampfer abgezogen und der Rückstand in 200 ml Wasser gelöst und anschließend wieder filtriert. Das Filtrat wurde mit 5 M NaOH auf pH ~7 neutralisiert und auf ein Volumen von ~50 ml eingeengt, dann wurden 300 ml Aceton langsam unter Schütteln hinzugegeben. Das resultierende, weiße Präzipitat wurde in einem Büchner-Trichter gesammelt, mit 20 ml Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet, was 3,51 g eines trockenen Produktes (Natriumsalz) ergab.
Oligomerisation des Tetramers und Hexamers
5,11 g Natriumsalz des Dimers wurde durch Filtrieren über eine IR-120-Harz-Säule in Wasser in die freie Säure überführt. Das Wasser wurde am Rotationsverdampfer abgezogen und der Rückstand erneut in 10 ml Wasser gelöst und in 50 ml TFA in einem dickwandigen Bombenrohr transferiert, anschließend wurde Paraformaldehyd (0,195 g) hinzugegeben und das Bombenrohr verschlossen. Die Lösung wurde bei 60 °C – 65 °C über 15 Stunden gerührt. Das Lösemittel wurde abgezogen und der Rückstand in Methanol gelöst, auf Kieselgel aufgezogen und einer Flash-Kieselgelsäulenchromatographie (EM Science, silica gel 60 F-254, 230–400 mesh der Säule) unterzogen, wobei die Elution mit 16:1:1 THF:MeOH:H₂O gestartet wurde, bis zu einem Endverhältnis von 5:1:1.
Der Feststoff aus der Tetramer-Fraktion wurde mit 5 M NaOH in 5 ml Wasser auf einen pH von etwa 7 neutralisiert, es wurden 5 ml MeOH und 125 ml Aceton hinzugegeben, was 0,94 g Präzipitat ergab. Das Salz wurde durch Filtrieren durch IR-120-Harz in die freie Säure überführt und 0,73 g trockenes Tetramer erhalten.
Aus der Hexamer-Fraktion wurden mit dem gleichen Verfahren wie dem oben für das Tetramer beschriebenen 0,21 g Hexamer erhalten.
3,5 g Edukt (Dimer) wurden aus der ersten Fraktion gewonnen.
Oktamer
Eine Mischung aus Tetramer (130 mg), Amberlyst-15-Harz (150 mg), Wasser (0,4 ml) und 2 ml einer Lösung von Paraformaldehyd in TFA (1 mg/ml) wurde bei 85 °C 15 Stunden in einem Probenröhrchen mit Teflonverschluss gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt, verdünnt mit 5 ml Wasser und filtriert. Das Filtrat wurde zur Trockne eingedampft, in Methanol gelöst und auf Kieselgel aufgezogen, anschließend wurde durch eine Flash-Säule filtriert, wobei das Tetramer mit 6:1:1 TNF:Isopropanol:H₂O eluiert wurde und das Oktamer mit MeOH:H₂O (85/15) eluiert wurde. Aus einer späteren Fraktion wurden 50 mg Rohoktamer erhalten.
Das Rohoktamer wurde durch IR-120-Harz geleitet, durch "reverse phase" präparative HPLC gereinigt, und es wurden 15 mg Oktamer (96,6 rein durch analytische HPLC) erhalten.
"Reverse-Phase"-Nochdruckflüssigchromatographie (RPHPLC):
PIC 024.4 und PRO 1041 wurden einer analytischen HPLC mit einem Waters-625-Pumpen-/490-Detector/Satellite WISP-System, ausgestattet mit einer Zorbax-RX-C18-Säule (4,6 mal 150 mm, 5 μM Partikelgröße, 90 Å Porengröße) (MAC-MOD Analytical, Chadds Ford, Pennsylvania), unterzogen. Die mobile Phase bestand aus 0,1 % Trifluoressigsäure in Wasser als Lösemittel A und 0,1 % Trifluoressigsäure in Acetonitril/Wasser (60:40) als Lösemittel B. Die Proben wurden bei einer anfänglichen Lösemittelzusammensetzung von 90 % Lösemittel A:10 % Lösemittel B und einem Fluss von 1 ml/min aufgegeben. Die Konzentration des Lösemittels B wurde auf 100 % mit einem Gradienten von 2,5 %/min erhöht und die Elution bei 233 nm überwacht. PIC 024,4 und PRO 1041 zeigten ähnliche chromatographische Profile.
UV Absorptionsspektren
UV-Spektren wurden aufgenommen bei 20 °C im Wellenlängenbereich von 200 to 350 nm, mit einer spektralen Auflösung von 1 nm für beide Proben PRO 1041 und PIC 024,4 bei Konzentrationen von etwa 2 μg/ml in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), pH 7,4. Das Spektrophotometer war ein Perkin Elmer Lambda 6 und eine Küvette mit einer Dicke von 1 cm wurde verwendet.
Sowohl das Spektrum für PRO 1041 als auch das für PIC 024,4 wies ein Maximum bei 228 nm auf. Kleinere Banden bei 296 nm mit Schultern bei 330 nm waren ebenfalls in den Spektren beider Verbindungen vorhanden.
Fluoreszenzspektroskopie
Fluoreszenzemissionsspektren wurden aufgenommen bei 20 °C in dem Wellenlängenbereich 320 nm bis 500 nm mit einer spektralen Auflösung von 2 nm für beide Proben PRO 1041 und PIC 024,4 in PBS bei einer Konzentration von etwa 2 μg/ml. Das Spektrofluorimeter war ein SLM-Aminco SPF500C, und die Anregungswellenlänge betrug 300 nm mit einem Bandpass von 4 nm. Es wurde eine Küvettendicke von 0.5 cm verwendet; das Volumen betrug 500 μl.
PRO 1041 und PIC 024,4 wiesen sehr ähnliche Emissionsspektren auf, mit einer maximalen Intensität bei –355 nm.
Größenausschlusschromatographie
Aliquots von synthetischen Polymerlösungen wurden nach Größe unter Verwendung einer Waters-M625-Pumpe, eines M996-Diodenarraydetektors, eines Millenium-Softwaresystems und entweder zweier 6μm-250-Ångström-Waters-Ultrahydrogelsäulen (7,8 × 300 mm; Fluss der mobilen Phase 1 ml/min) oder einer 17μm-TosoHaas-G3000PW-Säule (21,5 × 600 mm), die mit einer TSK-Gel-Guard-PWH-Säule (21,5 × 75 mm; Fluss 3 ml/min) verbunden war, fraktioniert. Die mobile Phase bestand aus 0,2 M Ammoniumacetat (pH 6,2), hergestellt aus Eisessig (Baker Analyzed HPLC Reagent) und Ammoniumhydroxid (25 %, Mallinckrodt) und 35 % Acetonitril (B&J Brand). Vor der Verwendung wurde die mobile Phase durch eine 0,45μm-Nylonmembran filtriert und Grad-5-Helium wurde eingeleitet. Eine Lösung der synthetischen Proben von 2,2–10 mg in bis zu 200 μl MilliQ-Wasser wurde auf die Ultrahydrogele aufgegeben, oder es wurden 40–300 mg in bis zu 2 ml MilliQ wässrige mobile Phase (50:50, v/v) auf die TosoHaas-Säulen aufgegeben, nach Ultraschallbehandlung (Branson 2200), Aufschütteln und Filtrieren (0.45 μm Acrodisc, Gelman Sciences). Die gesammelten Fraktionen wurden gemäß Elutionszeit vereinigt. Übereinanderlegbare chromatographische Profile wurden durch Absorptionsmessungen mit Replikaten gezeigt, und das Lösemittel wurde unter Verwendung von Savant-Vakuumzentrifugen bei hoher Temperatur (entweder SC200 und Vapornet VN 100 oder Plus SC210A) abgezogen. Der Rückstand wurde erneut in Wasser gelöst und erneut getrocknet, um eingeschlossenes Lösemittel abzuziehen. Das Material wurde gewogen, in Wasser gelöst und, durch Absorptionsmessungen bei 290 nm gegen Standards, auf Stammkonzentrationen normalisiert.
PRO1135 wurde in dieser Weise fraktioniert, um Polymerfraktionen mit einem maximalen Molekulargewicht (Mp) von 31 kDa (mittleres Molekulargewicht (MW) – 38 kDa), einem Mp von 16 kDa (MW – 22 kDa), ei nem Mp von 10 kDa (MW – 15 kDa) und einem Mp von 5,6 kDa (MW – 10 kDa) zu erhalten.
Lichtstreuungsmethodik
Die Proben wurden mittels HPLC analysiert, wobei ein Waters-625-Pumpe/modifizierter 410-RI-Detektor, der einen PD2000-Laserlichtstreuung-Intensitätsdetektor (Precision Detectors, Inc., Amherst, MA) enthielt, verwendet wurde. Dieses System war mit einer Waters-Ultrahydrogel-250-wässrigen-GPC-Säule (7,8 mm Innendurchmesser × 300 mm, 250 Å Porengröße, 8 × 10⁴ Ausschlussgrenze, PEO) ausgestattet. Die mobile Phase bestand aus 65 % 0,2 M Ammoniumacetat pH = 6,5/35 % Acetonitril in einem isokratischen Modus mit einem Fluss von 1 ml/min. Die Elution wurde durch RI überwacht, die niederwinklige (15°) und hochwinklige (90°) Lichtstreuung sowie die absoluten Molekulargewichtsbereiche wurden aus dieser Information erhalten.
Demonstration der Bindung an CD4
Fluoreszenzemissionsspektren für PRO 1041, PIC 024,4 und Fraktionierungsprodukte wurden unter Verwendung einer Anregungswellenlänge von 315 nm wie oben beschrieben aufgenommen. Wildtyp-2-Domänen-rekombinantes-CD4 (20 μl einer 130μM-Stammlösung in PBS) wurde anschließend bis zu einer Endkonzentration von 5 μM hinzugegeben und die Messungen wurden wiederholt. Durch eine Anregungswellenlänge von 315 nm wurde sichergestellt, dass das hinzu gegebene Protein nicht zu einem inneren Filtereffekt oder einem Fluoreszenzsignal beiträgt. Weiterhin wurde durch die niedrigen Konzentrationen der verwendeten Reagenzien eine signifikante kollidierende Fluoreszenzlöschung ausgeschlossen. Daher wurde durch die Beobachtung einer 60–70%igen Löschung der Fluoreszenzsignale sowohl für PRO 1041 als auch für PIC 024,4 in Gegenwart von CD4-Protein die Bindung an den Rezeptor nachgewiesen.
Auf Basis der in diesen Beispielen beschriebenen Untersuchungen wurde PIC 024,4 als Naphthalinsulfonsäureformaldehyd-Kondensat, einem polymeren Dispersionszusatz des Farbstoffs, das die identifizierenden Charakteristika von PRO1041 aufweist, identifiziert.
CD4/gp120-Bindungsassay: Zellulär
CEM-Zellen (eine humane T-Zell-Leukämielinie erhältlich von American Type Culture Collection, Rockville, MD; 3 × 106 Zellen pro ml) wurden in RPMI 1640 (Whittaker-Bioproducts, Walkersville, MD) mit 10 % fötalem bovinen Serum (FBS)(JRH Biosciences, Lenexa, KS) plus 0,1 % Natriumazid suspendiert. Zu jedem Reaktionsgefäß wurden 100 μl der Suspension hinzugegeben. Im Allgemeinen wurden die Testverbindungen in Wasser bis zu einer Endkonzentration von 4 mg/ml gelöst. Verschiedene Verdünnungen (1:40, 1:100, 1:200) von PIC 024,4, PRO 1041 oder fraktioniertem PRO 1 135 wurden zu den Reaktionsgefäßen gegeben und 2 Stunden bei 25 °C inkubiert. Nachfolgend wurde gp120 (American Bio-Technologies, Inc., Cambridge, Mass.), verdünnt in RPMI-1640-Puffer bis zu einer Endkonzentration of 10 nM hinzugegeben. Die Lösung wurde anschließend über Nacht (etwa 16 Stunden) bei 37 °C inkubiert.
Die Zellen wurden gründlich mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS), die 10 % FBS und 0,1 % Natriumazid enthielt, gewaschen. Um gebundenes gp120 nachzuweisen, wurde anschließend für gp120 spezifischer monoklonaler Antikörper (NEN-Dupont, NEA-9284) mit den Zellen für 30 Minuten bei einer Konzentration von 1 μg/ml (100 μl pro Reaktionsgefäß) auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden gründlich gewaschen, wie oben beschrieben, und mit Ziege-anti-Maus-Immunoglobulin (Boehringer Mannhein Biochemicals, Indianapolis, IN), das mit Fluorescein markiert worden war, über 30 Minuten auf Eis markiert (50 μl pro Reaktionsgefäß). Die gewaschenen Zellen wurden auf einem FACScan^TM (Becton Dickinson) auf Fluoreszenz analysiert.
CD4/gp120-Bindunasassay: ELISA
Für ELISA (Dupont NEN, Boston, Mass.) wurde ein lösliches 4-Domänen-CD4 (sCD4), gereinigt aus Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters, welches auf einer 96-well-Mikrotiterplatte immobilisiert wurde, verwendet. In doppelter Ausfertigung wurden 50 μl gp120 (1 ng bei 20 ng/ml) und 50 μl des Wirkstoffs in geeigneten Konzentrationen zu der Mikrotiterplatte hinzugegeben und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Die Platte wurde 6 Mal mit Waschpuffer (2 mg/ml BSA/PBS) gewaschen und 100 μl Anti-gp120-monoklonaler-Antikörper-Meerrettich-Peroxidase(HRP)-Konjugat wurden hinzugefügt. Die Platte wurde über 2 Stunden bei 4 °C inkubiert, 6 Mal mit Waschpuffer gewaschen und mit 100 μl ortho-Phenylendiamin(OPD)-Substratlösung über 30 min bei 25 °C entwickelt. Es wurde eine Dosis-Antwort-Kurve mit steigenden Konzentrationen des löslichen, durch Baculovirus gewonnenen gp120 (HIV-1-IIIB-Stamm) erstellt, die zeigte, dass eine semimaximale Bindung bei einer Konzentration von 20 ng/ml auftrat, wie durch einen für die Reste 308–322 des gp120 spezifischen, HRP-konjugierten Anti-gp120-monoklonalen Antikörper bestimmt wurde. Daher wurden unterschiedliche Konzentrationen der Polymere in Gegenwart einer konstanten Menge gp120 (1 ng bei 20 ng/ml) inkubiert, um die Inhibierung der CD4/gp120-Wechselwirkungen zu bewerten.
Die IC₅₀-Werte für die getesteten Polymere sind in Tabelle 2 zusammengefasst.
TABELLE 2
Rosetten-Inhibierungsassay: CD2/LFA-3(CD58)
Schafserythrozyten (SRBC) (Whittaker-Bioproducts, Walkersville, MD) wurden mit 2-Aminoethylisothiouroniumbromid (AET, 40 μg/ml) 15 Minuten bei 37 °C vorbehandelt, dann in HANK'S Balanced Salt Solution (HBSS Mediatech) + 2,5 % FCS gewaschen, und auf 1,5 × 10⁹ Zellen/ml resuspendiert. Jurkat-Zellen wurden in HBSS + 2,5 % FCS gewaschen und darin bei einer Konzentration von 1,25 × 10⁷ Zellen/ml resuspendiert. 20 μl Jurkat-Zellen wurden mit 20 μl PIC 024,4 mit unterschiedlichen Konzentrationen über 30 Minuten bei 4 °C gewaschen. SRBC (1,5 × 10⁷ in 10 μl) wurden zu den Jurkat-Zellen hinzugegeben, und die Zellen wurden zusammen für 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, bei 300 U/min über 5 Minuten zentrifugiert und anschließend auf Eis über 1 Stunde in kubiert. Die Zellen wurden sanft resuspendiert, mit HBSS + 2,5 % FCS verdünnt und in einem Hämazytometer beobachtet.
T-Zell-Proliferationsassays
1. Zellen
Mononukleäre Zellen (MNC) wurden von peripherem Blut von Spendern getrennt, die als Responder auf Herpes-simplex-Virus(HSV)-1, Rubella und/oder Tetanus-Toxoid bekannt waren. Vollblut wurde 1:4 mit HBSS verdünnt; Ficoll-Paque (Pharmacia LKB Biotechnology Inc., Piscataway, NJ) wurde mit dem verdünnten Vollblut überschichtet und bei 1600 U/min über 30 Minuten zentrifugiert. MNC wurde dreimal mit HBSS gewaschen und anschließend in einem Medium kultiviert, das RPMI 1640, ergänzt durch 5% humanes AB-Serum (Flow Labs, McLean, VA), Glutamin (2 mM), Penicillin/Streptomycin, Natriumpyruvat und HEPES, enthielt. Für die Proliferationsassays wurden die Zellen in 96-well-Rundboden-Mikrotiterplatten in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO₂ bei 37 °C kultiviert. Jurkat-Zellen wurden in RPMI 1640 plus 10 % FCS mit den oben beschriebenen Ergänzungen gehalten.
2. Proliferationsassays
Um T-Zellen mit viralen Antigenen zu stimulieren, wurden 105 MNC/Vertiefung mit und ohne Inhibitoren mit Verdünnungen konzentrierter Kulturflüssigkeiten aus mit HSV-1 oder Rubella infizierten Zellen gegen Kontrollüberstand (SN) aus uninfizierten Zellen (Microbix Biosystems Inc., Toronto, Ontario) kultiviert. SN enthielt durch Gammastrahlung inaktivierten Virus. An Tag 3 wurden die HSV-1-Kulturen mit ³H-Thymidin (TdR) gepulst und an Tag 4 geerntet. Rubella-Kulturen wurden an Tag 5 gepulst und an Tag 6 geerntet. MNC von gegen Tetanus-Toxoid immunisierten Spendern wurden bei 10⁵/Vertiefung über 5 Tage mit Verdünnungen von Tetanus-Toxoid kultiviert (0,4–4 LF/ml; Massachusetts Department of Public Health, Boston, Mass.).
Die Zellen wurden über Nacht mit 1 μCi/Vertiefung ³H-TdR (ICN, Irvine, Calif.) gepulst und auf Glasfaserfilter unter Verwendung eines PHD-Harvesters (Cambridge Technology, Inc., Watertown, Mass.) geerntet. Der Thymidin-Einbau wurde durch Flüssigszintillationszählung unter Verwendung eines Pharmacia-Beta-Zählers (Pharmacia LKB Nuclear, Inc., Gaithersburg, MD) gemessen.
In einigen Versuchen wurden mit Mitomycin behandelte MNC- oder Stimulator-Zellen verwendet. Die Zellen wurden in HBSS mit 10⁷/ml suspendiert und mit 50 μg/ml Mitomycin C (Sigma, St. Louis, Mo.) während 30 Minuten bei 37 °C behandelt.
Zur Messung der T-Zell-Antwort auf die Alloantigene wurden PBL von zwei bezüglich MHC unterschiedlichen Spendern erhalten. Ein Satz Zellen wurde mit Mitomycin c behandelt; diese Zellen dienten anschließend als Stimulator-Zellen. Der andere Satz Zellen diente als Responder-Zellpopulation. Die Zellen (2 × 105 pro Vertiefung) wurden zu Mikrokulturvertiefungen gegeben und 4–5 Tage später mit tritiiertem Thymidin, wie oben beschrieben, gepulst, geerntet und die Radioaktivität gemessen.
Für den Assay der CD8-aufweisenden Zellen wurde eine T-Zelllinie verwendet, die für Epstein-Barr-Virus(EBV)-transformierte B-Zellen spezifisch war. Diese Linie wurde generiert aus einem normalen menschlichen Spender durch wiederholte Stimulationsrunden mit EBV-transformierten B-Zellen und anschließenden Expansions-/Ruhephasen in Interleukin 2 (IL-2). Wie durch Immunofluoreszenz beurteilt weisen über 80 % der T-Zellen CD8 auf. In diesen Versuchen wurde die EBV-Linie mit Mitomycin c behandelt, um die Proliferation zu verhindern. Die T-Zellen (1 × 105) wurden zu den Mikrokultur-Vertiefungen zugegeben und die Proliferation wie oben beschrieben gemessen.
Untersuchung der Toxizität
Um festzustellen, ob die Verbindungen allgemeine antiproliferative Wirkungen (Anzeichen für Toxizität) zeigten, wurden diese mit unterschied lichen Zell-Linien, nämlich Jurkat (T-Leukämie), K562 (Erythroleukämie), U937 (Histiozyt), CEM (T-Lymphoblast) und RS-EBV (EBV-transformierte Linie), untersucht. Zellen (5 × 105 ml) wurden in Mikrokultur-Vertiefungen mit unterschiedlichen Verdünnungen von PIC 024,4 inkubiert. Normalerweise proliferieren die Zellen spontan, dies kann durch Evaluieren der ³H-Thymidin-Aufnahme gemessen werden. Nach 24 Stunden wurden die Zellen 1 μCi Thymidin pro Vertiefung ausgesetzt, 16 Stunden später wurden die Platten abgeerntet und die Filter auf Radioaktivität untersucht. Zum Vergleich wurden Standardvertiefungen eingerichtet, in die lediglich Kulturmedium gegeben wurde; diese Vertiefungen dienten als Basis für die Bestimmung der Inhibierung der Thymidinaufnahme. PIC 024,4 inhibierte die CEM-Zellproliferation um 14 % bei 100 μg/ml, und die RS-EBV-Zellproliferation um 27 % bei 100 μg/ml.
Die Ergebnisse des PIC 024,4-Screenings der obigen Assays sind in Tabelle 3, unten, dargestellt. 1 zeigt die Ergebnisse des CD4/gp120-ELISA-Assays mit PIC 024,4 und PRO 1041. PIC 024,4 und PRO 1041 inhibieren die Bindung von gp120 an CD4 in dosisabhängiger Weise mit einem IC₅₀-Wert von etwa 0,2 μg/ml. Die Resultate des Rosetten-Inhibierungsassays zeigen bei Dosen von bis zu 100 μg/ml keine Wirkung von PIC 024,4 auf die CD2/LFA-3-Wechselwirkungen. Der T-Zell-Proliferationsassay zeigt bei diesen Dosen einen ähnlichen Wirkungsmangel. Wie durch die Toxizitätsuntersuchung in vitro gezeigt, ist PIC 024,4 in solchen Konzentrationen, bei denen es auf die CD4/gp120-Wechselwirkung inhibierend wirkt, nicht toxisch.
TABELLE 3
Antivirale Aktivität und Zytotoxizitätsassay unter Verwendung von HTLV-IIIB:
PIC 024,4 wurde in einer Konzentration von 4 mg/ml in sterilem Wasser gelöst. Verdünnungen wurden in Kulturmedium hergestellt, und die Verbindung wurde bei Konzentrationen im Bereich von 100 μg/ml bis 0,003 μg/ml in halb-logo-Verdünnungen untersucht.
Der Assay wurde in 96-well-Gewebekulturplatten unter Verwendung der CEM-T4-humanen-T-Lymphozyten-Zelllinie durchgeführt. Als Kulturmedium wurde RPMI-1640 verwendet, welches 25 mM N-[2-Hydroxyethyl]piperazin-n¹-[2-ethansulfonsäure] (HEPES, Sigma Chemical Co.) und 2 mM L-Glutamin enthielt und mit 10 % fötalem bovinen Serum, 2 mM L-Glutamin, 50 Einheiten Penicillin G pro ml und 50 μg Streptomycinsulfat pro ml ergänzt wurde. CEM-T4-Zellen wurden mit Polybren in einer Konzentration von 2 μg/ml behandelt, und ein 130 μl-Volumen von Zellen (1 × 104 Zellen) wurde in jede Vertiefung dispensiert. Zu einer Assay-Platte für jeden Wirkstoff wurde ein 50μl-Volumen jeder Wirkstoffverdünnung (hergestellt als eine 4-fache Konzentration) zu fünf mit Zellen versehenen Vertiefungen hinzugegeben, dann wurden die Zellen bei 37 °C über 2 Stunden inkubiert. Dies resultierte in einer Vorbehandlung der Zellen mit Wirkstoffen bei 1,1-facher Konzentration. Parallel dazu wurde für jeden Wirkstoff eine zweite Assay-Platte, welche lediglich die dispensierten Zellen enthielt, inkubiert.
Für alle Assay-Platten wurde eine gefrorene Kultur des HIV-1, Stamm HTLV-III_B, in Kulturmedium bis zu einer Konzentration von 2,5 mal 104 TCID₅₀ pro ml verdünnt, und ein 20μl-Volumen (enthaltend 500 TCID₅₀ Virus) wurde zu drei Vertiefungen pro Wirkstoffkonzentration zugegeben. Dies ergab eine Vielfachheit der Infektion von 0,05 bei den mit HIV-1 infizierten Proben. Pro Wirkstoffkonzentration wurde ein 20μl-Volumen eines normalen Kulturmediums zu zwei Vertiefungen zugegeben, um die Evaluierung der Wirkstoff-Zytotoxizität zu ermöglichen.
Nach zweistündiger Inkubation mit Virus bei 37 °C wurde ein 50μl-Volumen jeder Wirkstoffverdünnung (hergestellt als eine 4-fache Konzentration) zu drei Vertiefungen mit infizierten Zellen sowie zu zwei Vertiefungen mit nicht infizierten Zellen für die zweite Assay-Platte jedes Wirkstoffs zugegeben.
Jede Assay-Platte enthielt 5 Vertiefungen mit unbehandelten, nicht infizierten Zell-Kontrollproben und fünf Vertiefungen mit unbehandelten, infizierten Virus-Kontrollproben. 2',3'-Dideoxyinosin (DDI) wurde parallel, unter Anwendung beider Protokolle für die Wirkstoffzugabe, untersucht.
Die Gewebekulturplatten wurden bei 37 °C in einer angefeuchteten Atmosphäre mit 5 % CO₂ inkubiert und mikroskopisch auf Toxizität und/oder zytopathogene Wirkungen untersucht. Am achten Tag nach Infektion wurden die Zellen in jeder Vertiefung suspendiert und eine 50μl-Probe jeder Zell-Suspension wurde in eine neue 96-well-Platte zur Verwendung im nachfolgenden Assay transferiert. Ein 100μl-Volumen frisches RPMI-1640-Medium und ein 30μl-Volumen einer 5 mg/ml-Lösung von 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) wurde zu jeder 50μl-Zell-Suspension zugegeben und die Zellen bei 37 °C in 5 % CO₂ zwei Stunden lang inkubiert. Während dieser Inkubation wird MTT durch lebende Zellen metabolisch reduziert, was zu der Produktion eines gefärbten Formazan-Produktes führt. Ein 50μl-Volumen einer Lösung von 20 % Natriumdodecylsulfat in 0,02 N Salzsäure wurde zu jeder Probe hinzu gegeben und die Proben wurden über Nacht inkubiert. Die Absorption bei 590 nm wurde für jede Probe unter Verwendung eines Molecular-Devices-V_max-Mikroplatten-Reader bestimmt. Dieser Assay bestimmt die wirkstoffinduzierte Suppression der viralen zytopathischen Wirkung sowie die Wirkstoff-Zytotoxizität durch Messung der Generierung von MTT-Formazan durch überlebende Zellen. Wurde eine dosisabhängige Wirkung in Bezug auf die CPE-Inhibierung oder die Toxizität beobachtet, so wurden die Werte für die halbmaximal-wirksame Dosis unter Verwendung der Dosis-Wirkung-Analysensoftware von Chou und Chou (ElsevierBiosoft) berechnet.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefasst.
In-vitro-anti-HIV-Assay und Zytotoxizitätsassay unter Verwendung des JR-CSF-Stamms:
Ziel dieses Verfahrens ist die Untersuchung der Toxizität und der Wirkung einer Verbindung auf die Infektion von humanen Phytohämagglutinin(PEA)-Blasten mit freiem HIV-Virus in vitro, wobei es sich bei dem freien HIV-Virus um ein Virusisolat (JR-CSF) handelt, welches sich als resistent gegenüber einer Therapie mit rekombinantem löslichem CD4 (sCD4) gezeigt hat. Am Tag vor der Durchführung eines Assays wurden humane PHA-aktivierte T-Zell-Blasten aus Flüssigstickstoff aufgetaut und über Nacht in Iscove's Modified Dulbecco-Medium (IMDM) plus 7 % FCS und 50 Einheiten/ml IL-2 bei einer Dichte von 10⁶/ml kultiviert.
PHA-aktivierte T-Zell-Blasten wurden pelletiert und mit 4 × 106 pro ml in Medium, das 7 % FCS und 50 Einheiten/ml IL-2 enthielt, resuspendiert. 25 μl der Zellsuspension wurden pro Vertiefung in 96-well-Rundboden- Mikrotiterplatten (10⁵/Vertiefung) ausplattiert und in einen Inkubator bei 37 °C gestellt. 25 μl der zu testenden Verbindung wurden in geeigneten Verdünnungen in 7 % FCS/IMDM, das 50 Einheiten/ml IL-2 (das Zweifache der Endkonzentration) enthielt, oder in Gewebekulturmedium alleine (als Negativkontrolle) zu den Zellen zugegeben und über 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. 200 μl Medium wurden hinzu gegeben, und die Testverbindung wurde durch Zentrifugieren der 96-well-Platten über 2 Minuten bei 1000 U/min und Absaugen von 250 μl ausgewaschen. Die Zellen wurden in 50 μl Medium, das 7 % FCS und 50 Einheiten/ml IL-2 enthielt, resuspendiert. HIV (JR-CSF, Koyanagi et al., Science, 236:819–821 (1987)) wurde auf 50 TCID₅₀ (in 25 μl) in IMDM, das 7 % FCS und 50 Einheiten/ml IL-2 plus Polybren (10 μg/ml) enthielt, in 24-well-Platten verdünnt. 25 ml Virus wurden zu den Zellen pro Vertiefung zugegeben. Man ließ die HIV-Infizierung 2 Stunden lang bei 37 °C ablaufen, danach wurden 200 μl Medium zugegeben. Der Virus wurde durch Zentrifugieren der 96-well-Platten über 2 Minuten bei 1000 U/min, Absaugen von 250 μl und Zugabe von 200 μl frischem Medium, das 7 % FCS und 50 Einheiten/ml IL-2 und die geeignete Menge der Testverbindung enthielt, ausgewaschen (1 ×).
Am Tag 4 wurde das Medium entfernt und durch frisches Medium, das 7 % FCS und 50 Einheiten/ml IL-2 plus Testverbindung enthielt, ersetzt (1 ×). Am 7. Tag wurden die Platten bei 1000 U/min 5 min lang zentrifugiert und die Überstände sorgfältig aus jeder Vertiefung entfernt. Die Zellen wurden lysiert und bei einer 1:35-Verdünnung auf p24-Antigen untersucht.
Die prozentuale Inhibierung wurde relativ zu den unbehandelten infizierten Kontrollzellen bestimmt. Ist beispielsweise die Menge des p24-Antigens in der Kontroll-Vertiefung A und ist die Menge p24 in einer Vertiefung mit einer Testverbindung B, so erzielt die Verbindung (A–B/A) (100) % Inhibierung dieser Konzentration.
Zur Bestimmung der Toxizität wurden PHA-aktivierte T-Zell-Blasten pelletiert und mit 2 × 10⁶/ml suspendiert und in 96-well-Rundboden- Mikrotiterplatten mit 105 pro Vertiefung (50 μl) in IMDM plus 7 % FCS und 50 Einheiten/ml IL-2 ausplattiert. 25 μl der zu testenden Verbindung wurden in geeigneten Verdünnungen in 7 % FCS/IMDM, das 50 Einheiten/ml IL-2 (das Dreifache der Endkonzentration) enthielt, oder in Gewebekulturmedien alleine (Kontrollen) zu der 96-well-Platte zugegeben. Diese Mischung wurde über 2 Stunden bei 37 °C inkubiert, danach wurden 200 μl Medium hinzu gegeben. Die Testverbindung wurde durch Zentrifugieren der 96-well-Platte(n) über 2 Minuten bei 1000 U/min, Absaugen von 250 μl und Zugabe von 200 μl frischem Medium, das IL-2 und die geeignete Menge Testverbindung enthielt, ausgewaschen (1 ×). Am vierten Tag wurde das Medium entfernt und durch frisches, die Testverbindung enthaltendes Medium ersetzt.
Am siebten Tag wurde die geeignete Anzahl Zellen (100 μl) auf eine andere Platte transferiert. Die Toxizität der Testverbindungen wurde mittels MTT-Assay, im Wesentlichen wie oben beschrieben, untersucht.
Die Analyse von AZT zeigte keine Zytotoxizität in den Konzentrationsbereichen von 0,0004–50 μM. Der p24-Gehalt war in dem Anti-HIV-Assay mit JR-CSF bei Konzentrationen von 0,004–50 μM, wobei der Wirkstoff 2 Stunden vor der Infektion zugegeben wurde, erheblich reduziert. Für diese Verbindung konnte eindeutig eine Anti-HIV-Wirkung gezeigt werden. Die Ergebnisse bewegten sich in dem Bereich, der aufgrund der aus früheren Assays erhaltenen Werfe zu erwarten war.
Die Analyse von PIC 024,4 zeigte nur bei der höchsten getesteten Konzentration 100 μg/ml, eine geringe Zytotoxizität. Die p24-Spiegel waren im Anti-HIV-Assay mit JR-CSF und Konzentrationen von PIC 024,4 entsprechend 100, 20 und 4 μg/ml, wobei der Wirkstoff 2 h vor der Infektion zugesetzt wurde, erheblich reduziert. Für diese Verbindung konnte eindeutig eine Anti-HIV-Wirkung gezeigt werden, wobei eine Wirkung bei einer Konzentration beobachtet wurde, die 25fach unterhalb derjenigen Konzentration lag, bei der Toxizität beobachtet wurde.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle 4 zusammengefasst und in 2 dargestellt.
Menschliche Monozyten-Macrophagen-Untersuchungen mit HiV-1 (ADA): Untersuchung der HIV-Infektion von Monozyten-Zielen.
Menschliche Leukozyten aus peripherem Blut wurden durch zentrifugale Elutriation gewonnen, und die Monozyten ließ man an der Oberfläche von Gewebekulturflaschen anhaften. Die Monozyten wurden in DMEM, ergänzt mit 10 % hitzeinaktiviertem humanen AB⁺-Serum 50 μg/ml Gentamycin und 1.000 Einheiten/ml Makrophagenkolonie-stimulierendem Faktor (mCSF, Cetus), über 7 Tage als anhaftender Monolayer kultiviert. Vorinkubation in mCSF wurde durchgeführt, da sie die HIV-1-Expression in vitro deutlich erhöht (7- bis 10-fach). Nach der Vorinkubation wurde durch Anwendung der Zell-Morphologie auf mit Wright-Farbstoff gefärbten Zellabstrichen sowie histochemischer Färbung auf granulare Peroxidase und unspezifische Esterase gezeigt, dass die durch Abkratzen geerntete Zellpopulation >98 % Monozyten enthielt. Die Monozyten wurden mit einer Konzentration von 1 × 10⁶ ml zu den Vertiefungen von 24-well-Platten zugegeben und man ließ sie anhaftende Monolayer bilden. Vor der Infektion mit HIV-1 wurde das Medium sorgfältig aus jeder Vertiefung abgesaugt. Die Platten wurden dreimal sorgfältig mit 37 °C warmem PBS gewaschen, um restliches Serum vollständig zu entfernen. 30 bis 50 μl/Vertiefung HIV_ADA-Stamm (D. Chester Kalter et al., J. Immunol. J46:298–306 (1992)) in 70–50 μl RPMI (dies entspricht 3,9 log₁₀ TCID₅₀/10⁵ Zellen) wurden zugegeben und über wenigstens 2 Stunden bei 37 °C inkubiert. Die Verbindungen wurden in 10 % FCS RPMI mit mCSF (C-34) bei 1.000 Einheiten/ml den Platten zugegeben. Die Kontrollen umfassten: +Zellen +Virus; +Zellen –Virus; und –Zellen +Virus. An Tag 7 wurde der Überstand wie folgt entfernt: 1 ml für reverse Transkriptase, 0,5 ml für p24-Assay, und das Medium wurde mit frischem Wirkstoff aufgefüllt. Die letzte Ernte erfolgte an Tag 14.
Die Ergebnisse sind in den Tabellen 4 und 5 zusammengefasst und in 3 dargestellt.
TABELLE 4

*(Science, 240:646–649, 1988)

TABELLE 5
Antikoagulationsassay: Aktivierter partielle-Thromboplastin-Zeit-Assay
Venenblut (9,0 ml) wurde zu 1 ml 3,9%igem Natriumcitrat (Verhältnis 1:10) in einem Vacutainer-Röhrchen mit Deckel hinzugegeben und sofort zentrifugiert. Durch diesen Schritt wurde Calcium entfernt, welches einen für die Koagulation erforderlichen Faktor darstellt. Die Probe war frei von Hämolyse und Klumpen.
Ein Röhrchen mit 0,02 M Calciumchloridlösung wurde in den hinteren Bereich eines Fibrometer-Heizblocks gestellt, wo man es auf etwa 37 °C erwärmen ließ. Aktiviertes Cephaloplastin (0,1 ml, Dade) wurde gut gemischt und in drei Koagulationsbecher pipettiert. Die Becher wurden etwa 1 Minute lang bei 37 °C erwärmt.
1 ml des oben erwähnten, mit Citrat versetzten Plasmas wurde mit der Testverbindung während etwa 60 Minuten bei etwa 37 °C inkubiert. Das inkubierte Plasma (0,1 ml) wurde zu dem ersten Cephaloplastin enthaltenden Becher zugegeben. Am Ende der zweiten Minute wurden 0,1 ml Plasma zu dem zweiten Becher zugegeben. Am Ende der dritten Minute wurden 0,1 ml Plasma zu dem dritten Becher zugegeben. Nach Zugabe von Plasma zu jedem Becher wurde der Inhalt gut gemischt und bei etwa 37 °C während etwa 3 Minuten inkubiert.
Die Becher mit der Plasma-Cephaloplastin-Mischung wurden anschließend unter die Fibrometersonde gestellt, und es wurden 0,02 M Calciumchlorid hinzugefügt. Anschließend wurde die Zeit (die partielle Thromboplastin-Zeit, PTT), die es dauert, bis die Koagulation eintritt, gemessen. Normale PTT-Werte liegen im Allgemeinen bei etwa 30 bis 45 Sekunden.
ÄQUIVALENTE
Für den Fachmann ist eine Vielzahl von Äquivalenten der hier ausdrücklich beschriebenen Ausführungsformen der Erfindung ersichtlich, oder der Fachmann ist in der Lage, diese durch Anwendung routinemäßiger Versuche zu ermitteln. Derartige Äquivalente fallen unter den Schutzumfang der nachfolgend aufgeführten Ansprüche.

Claims

Verwendung einer Zusammensetzung, die ein Kondensationspolymer aus einer aromatischen Sulfonsäure und einem Aldehyd in einem physiologisch akzeptablen Träger enthält, zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der HIV-Infektiosität von CD4+-Zellen bei HIV-infizierten Individuen oder zur Hemmung der HIV-induzierten Synzytienbildung bei HIV-infizierten Individuen oder zur Hemmung der HIV-Infektiosität von CD4+-Zellen bei HIV-infizierten Individuen.
Verwendung gemäß Anspruch 1, bei der das Medikament parenteral verabreicht wird oder in einer für die intravaginale oder rektale Applikation geeigneten Form vorliegt.
Verfahren zur Hemmung der HIV-Infektion oder der CD4/gp120-Bindung in einer Blutzubereitung, umfassend die Zugabe zur Blutzubereitung einer wirksamen Menge einer Zusammensetzung, die ein Kondensationspolymer aus einer aromatischen Sulfonsäure und einem Aldehyd in einem physiologisch akzeptablen Träger enthält.
Enges oder monodisperses Kondensationspolymer aus einer aromatischen Sulfonsäure und einem Aldehyd oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz oder Prodrug davon, wobei die aromatische Sulfonsäure eine Naphthalinsulfonsäure ist.
Polymer gemäß Anspruch 4, wobei das maximale Molekulargewicht unter etwa 50 kDa liegt, beispielsweise zwischen 0,7 kDa und 50 kDa, vorzugsweise zwischen 4 kDa und 50 kDa, weiter be vorzugt zwischen 4 kDa und 12 kDa oder zwischen 1,3 und 30 kDa.
Kondensationspolymer gemäß Anspruch 4 oder Anspruch 5 zur Therapieverwendung.
Verwendung des Kondensationspolymers gemäß Anspruch 4 oder Anspruch 5 zur Herstellung eines Medikaments zur Hemmung der HIV-Infektiosität.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 3, 6 oder 7, wobei das Kondensationspolymer ein Kondensationspolymer aus einer Naphthalinsulfonsäure und Formaldehyd ist und das Kondensationspolymer vorzugsweise eine Verbindung ist, die die identifizierenden Eigenschaften von PIC 024,4 oder PRO 1041 aufweist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1, 2 oder 3, wobei das Kondensationspolymer ein maximales Molekulargewicht von weniger als 50 kDa aufweist und das Kondensationspolymer beispielsweise ein maximales Molekulargewicht von (a) zwischen 0,7 kDa und 50 kDa, (b) zwischen 1,3 kDa und 30 dDa oder (c) zwischen 4 kDa und 12 kDa aufweist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das Kondensationspolymer im Durchschnitt 0,5 bis 2,0 Sulfonsäuregruppen pro aromatische Gruppe, beispielsweise im Durchschnitt etwa 1 Sulfonsäuregruppe pro aromatische Gruppe, aufweist.
Verwendung gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2 oder Verbindung gemäß Anspruch 4, wobei das Kondensationspolymer ein therapeutisches Verhältnis von mindestens etwa 7 oder ein therapeutisches Verhältnis von mindestens etwa 20 aufweist.
Verwendung gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 6 oder 7, wobei der physiologisch akzeptable Träger eine empfängnisverhütende Formulierung wie empfängnisverhütendes Gel, Creme oder Schaum ist.