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Gebiet der Erfindung
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Diese
Erfindung betrifft immunmodulatorische Faktoren zur Verwendung in
der immunsuppressiven und antiallergischen Behandlung.
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Hintergrund der Erfindung
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Allergische
Rhinitis (z. B. Heuschnupfen und Asthma) sind typische Resultate
der Antwort des Immunsystems auf eingeatmete Moleküle wie Allergene
und Antigene. Man hat erkannt, dass die Quervernetzung von Antikörpern eine
Reihe biochemischer und pharmakologischer Ereignisse, einschließlich der
Freisetzung hochwirksamer Entzündungsmediatoren,
einleitet, was zu allergischen Reaktionen einschließlich Atemproblemen,
Juckreiz, übermäßiger Schleimhautsekretion
usw. bis in einigen wenigen Situationen zu einschließlich lebensbedrohlichen
allergischen Reaktionen führt.
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Therapeutisch
werden viele Wirkstoffe bei dem Versuch verwendet, die Freisetzung
von Mediatoren zu verhindern und/oder die nachfolgenden Ereignisse
durch Blockierung oder Verminderung der Wirkungen der Mediatoren
auf Zielgewebe zu behandeln. Keine der derzeit verfügbaren Behandlungen
ist optimal, und jede weißt
Probleme wie Nebenwirkungen und Durchbrüche auf.
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Immunsupprimierende
Verbindungen induzieren eine Inhibition des Immunsystems. Der immunsystemvermittelte
Abstoßungsprozess
ist der Hauptgrund für
den Transplantatverlust bei der Organtransplantation. Durch Verwendung
immunsuppressiver Verbindungen wurden dramatische Verbesserungen
bei der Immunsuppression und in dessen Folge bei der Organtransplantatüberlebensrate
und der Patientenüberlebensrate
erreicht.
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Autoimmunerkrankungen
sind Funktionsstörungen,
bei denen die Unterscheidung des Wirtes zwischen „selbst" und „nicht-selbst" zusammenbricht und
das Immunsystem der Person (sowohl erworbene als auch angeborene
Komponenten) das eigene Gewebe angreift. Es bestehen Hinweise darauf,
dass der hauptsächliche
und grundlegende Fehler, der für
die Induktion und Persistenz der meisten Autoimmunkrankheiten verantwortlich
ist, bei den autoreaktiven, proliferierenden T-Lymphozyten zu finden
ist.
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Die
derzeit verfügbaren
immunsuppressiven Wirkstoffe haben den Vorteil eines engen therapeutischen
Bereichs. Es ist bekannt, dass die Verbindungen nephrotoxisch, neurotoxisch
und potentiell diabetogen sind und daher eine begrenzte Anwendbarkeit
aufweisen. Es bestehen ebenfalls Probleme hinsichtlich der Verabreichung
dieser Verbindungen, ihrer Bioverfügbarkeit und der Überwachung
ihrer Spiegel sowohl klinisch als auch im Labor.
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Der
Maus-Trichostrongylus-Nematode Heligmosomoides polygyrus widersteht
dem Immunsystem und bewohnt das Duodenum der Maus für acht Monate
oder länger
während
der Primärinfektion.
Wenn gegen diesen Parasiten unter künstlichen experimentellen Bedingungen
eine Immunität
erzeugt wird, scheint sie durch Th2-Zellen und ihre assoziierten
Cytokine vermittelt zu werden. Der Parasit hat jedoch anscheinend
Mechanismen entwickelt, um einer potentiell schutzwirksamen Th2-Antwort
entgegenzuwirken, wie die Chronizität natürlicher Infektionen zeigt.
Gleichzeitig unterdrückt
eine Infektion mit Heligmosomoides polygyrus Immunantworten gegen
verschiedene heterologe Antigene wie ovine Erythrocyten und andere
Nematodenparasiten, die von den als Th2-vermittelte Immunität bekannten
Mechanismen abgestoßen
werden. Die suppressive Aktivität
ist auch in vivo und in vitro unter Verwendung parasitärer Extrakte
oder exkretorisch-sekretorischer (ES)-Produkte nachweisbar (Pritchard
et al, Immunology (1984); 51:633–642 und Pritchard et al, Int.
J. Para (1994); 24:495–500).
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Isolierung eines immunmodulatorischen
Faktors (IMF) aus dem Nematoden Heligmosomoides polygyrus, der die
T-Zellfunktion möglicherweise
durch Erhöhung
der Produktion von CD8+ bei gleichzeitiger
Verminderung der CD4+-Zellen stört. Daher
wird erfindungsgemäß ein immunsuppressives
Mittel offenbart, wobei das Mittel aus den exkretorisch-sekretorischen
(ES)-Produkten des Nematoden Heligmosomoides polygyrus erhältlich ist,
die auf einer Sephacryl S-200SF-Säule, äquilibriert
mit 100 mM Ammoniumacetat, isokratisches Elutionsprofil, fraktioniert
werden und dadurch gekennzeichnet ist, dass das Mittel ein entweder
durch Gelfiltration auf Sephacryl S-200SF oder durch SDS-PAGE geschätztes Molekulargewicht
von weniger als 12 kDa aufweist und im Wesentlichen frei von gebundenen
Polypeptiden ist. Das Mittel kann nicht-proteinartig sein.
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Das
Mittel kann zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung allergischer
oder Autoimmunerkrankungen verwendet werden. Insbesondere kann das
Mittel zur Herstellung eines Medikaments zur Verhinderung der Transplantatabstoßung bei
einer Organ- oder Gewebstransplantation verwendet werden. Das Mittel
kann auch bei der Behandlung anderer Autoimmunerkrankungen, beispielsweise
der rheumatoiden Arthritis und der Multiplen Sklerose, verwendet
werden.
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Beschreibung der Zeichnungen
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Die 1a
zeigt das Elutionsprofil des wirksamen immunsuppressiven Mittels
(IMF) bei einer Gelfiltrationschromatographie unter Verwendung von
Sephacryl S-200SF;
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Die 2 veranschaulicht
die Wirkung des immunsuppressiven Mittels auf die Anti-KLH-Antikörperproduktion
im KAP-Test.
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Die 3 veranschaulicht
die Wirkung des Mittels auf die IgE-Produktion.
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Die 4 veranschaulicht
die Wirkung des Mittels auf die IgG1-Produktion.
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Die 5 veranschaulicht
die Wirkung des Mittels auf die IgG4-Produktion.
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Die 6 veranschaulicht
die Wirkung des Mittels auf verschiedene Mauszelluntergruppen.
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Beschreibung der Erfindung
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Die
Mittel der vorliegenden Erfindung können aus dem Nematoden Heligmosomoides
polygyrus erhalten werden. Die Mittel vermindern die Th2-vermittelte
Immunantwort. Ohne an eine Theorie gebunden zu sein, kann die Wirksamkeit
der Mittel auf eine Stimulierung der Produktion von CD8+-Zellen
und gleichzeitige Verminderung von CD4+-Zellen
beruhen. CD8+-Zellen wurden mit der Unterdrückung der
IgE-Produktion, möglicherweise
durch die Produktion oder Induktion von Interferon-γ, in Zusammenhang
gebracht.
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Die
Erfindung wird nachstehend lediglich durch Beispiele unter Bezugnahme
auf die beigefügten Zeichnungen
weiter veranschaulicht.
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Infektion von Tieren und
Gewinnung von Würmern.
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Intern
gezüchtete
CFLP-Mäuse
wurden oral mit 400I3-Larven von H. polygyrus
infiziert und bei einem Hell/dunkel-Zyklus von 12 Stunden gehalten.
Adulte Würmer
wurden zehn Tage später
unter Verwendung einer modifizierten Baermann-Technik (Pritchard
et al, 1994, supra) gewonnen.
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Gewinnung exkretorisch/sekretorischer
(ES-) Produkte.
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Adulte
H. polygyrus wurden durch Waschen für vier Stunden unter mehreren
Wechseln mit steriler Salzlösung
(0,9% w/v NaCl), enthaltend 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin,
desinfiziert. Sie wurden in eine Hanksche Gleichgewichtssalzlösung überführt und
für 24
Stunden bei 37°C
kultiviert. Die resultierenden ES-Produkte wurden unter Verwendung
eines 0,22 μm-Filters
steril filtriert und gefroren bei –20°C gelagert. Die Proteinkonzentrationen
wurden unter Verwendung des Lowry-Tests abgeschätzt.
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Fraktionierung von ES-Produkten.
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Das
immunsuppressive Mittel (IMF) verbleibt während einer Ionenaustauschchromatographie
nicht im aktiven Zustand, weshalb die ES-Produkte auf einer Sephacryl
S-200SF (Pharmacia Biotech)-Säule, äquilibriert
mit 100 mM Ammoniumacetat bei isokratischem Elutionsprofil fraktioniert
wurden. Es wurden Fraktionen von 5 ml gesammelt, gefriergetrocknet
und in 1 ml steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) wieder aufgelöst, dann
hinsichtlich der immunsuppressiven Wirksamkeit unter Verwendung
des Maus-Napfschnecken-Haemocyanin-Antikörperproduktions-(KAP)-Tests (Pritchard
et al, 1994, supra) und dem Proteingehalt unter Verwendung des Tests
nach dem Lowry-Verfahren getestet. Aktive Fraktionen wurden gesammelt,
mit IMF markiert und gefroren gelagert.
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Napfschnecken-Haemocyanin-(KLH)-Antikörperproduktions-(KAP)-Test
zur Detektion der immunmodulatorischen Wirksamkeit.
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Der
KAP-Test beruht auf Lymphozyten, die große Mengen von Interleukin-4
(IL-4) nach Stimulation durch antigenpräsentierende B-Lymphozyten erzeugen,
und er ist daher ein gutes In-vitro-Modell der Th2-getriebenen Immunantwort.
100 μl Milzzellen
aus mit KLH in viviostimulierten Tieren (2,5 × 107 Zellen/ml
in RPMI 1640 +10 % fötales
Kälberserum
(FCS) + L-Glutamin + 2-Mercaptoethanol + Penicillin + Streptomycin),
50 μl Testmaterial
und 100 μl
KLH bei 16.7 μg/ml
wurden bei 37°C
für 6 Tage
in 5 % CO2/Luft kultiviert. Die Zellen wurden
durch Zentrifugation bei 300 × g
in einer Centra-7R-Zentrifuge und durch Entfernen und Ersetzen von 175 μl Medium,
wobei das Verfahren zweimal wiederholt wurde, gewaschen. Nach einer
weiteren Inkubation für
24 h wurden die Überstände gewonnen
und die Kopieansätze
gesammelt und bei –20°C gefroren
gelagert. Später wurden
die Proben hinsichtlich Anti-KLH-Antikörpern durch ELISA getestet.
Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen wurden über Nacht bei 4°C mit 150 μl KLH bei
10 ↔g
in 50 mM Carbonat/Bicarbonat-Puffer, pH 9,6, beschichtet. Die Platten
wurden dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung, pH 7,2, enthaltend 0,05
% Tween-20 (PBS/Tween), gewaschen. 150 μl Probe, 1 zu 4 in PBS/Tween
verdünnt,
wurden zugegeben und für 2
h bei Raumtemperatur (RT) inkubiert. Nach dem Waschen der Platte
wurden 150 μl
Anti-Maus-IgG(Gesamtmolekül)-alkalische
Phosphatase-Konjugat bei 1 zu 500 in PBS/Tween zugegeben und bei
RT für
2 h inkubiert. Die Platten wurden gewaschen, und es wurden 150 μl p-Nitrophenyl-phosphat
bei 1 mg/ml in 50 mM Carbonatpuffer, pH 9,8, + 1 mM MgCl2 zugegeben. Nach der Farbentwicklung für 30 Minuten
wurde die optische Dichte mit einem Plattenlesegerät bei einer
Wellenlänge
von 450 nm gemessen. Zur Untersuchung der Proteineigenschaften von
IMF wurden die ES-Produkte mit Proteinase K (500 μl ES + 100 μl Proteinase-K-Agarose als
Aufschlämmung
in PBS) für
2 h bei 37°C
behandelt. Als Kontrolle diente Agarose bzw. hitzebehandelte Proteinase-K-Agarose
(100°C,
5 min).
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Herstellung des immunmodulatorischen
Faktors (IMF) aus ES-Produkten
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Die
Fraktionierung von ES-Produkten durch Gelfiltration über Sephacryl
S-200SF ergab gemäß der Aktivität im KAP-Test
ein IMF enthaltendes Maximum. Die Kurve ist in 1 dargestellt.
Die Kalibrierung der Säule
mit Proteinstandards mit bekannten Molekulargewichten zeigte, dass
die Aktivität
mit einem Material mit weniger als 12 kDa assoziiert war. Standards
mit niedrigerem Molekulargewicht wurden sämtlich mit der IMF-Fraktion zusammen
eluiert. Die SDS-PAGE zeigte ebenfalls ein Material mit einer Masse < 12 kDa.
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Unterdrückung der
Antikörperproduktion
durch IMF.
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Die 2 zeigt,
dass IMF eine dosisabhängige
Unterdrückung
der spezifischen Anti-KLH-Antikörperproduktion
im KAP-Test erzeugte. Eine bedeutsame biologische Aktivität wurde
bei einer IMF-Konzentration von 0,5 μg/ml (p<0,001) festgestellt, und eine deutliche
Suppression lag immer noch bei 0,093 μg/ml (p<0,05) vor. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass
IMF die IgE-Produktion durch IL-4 stimulierte proliferierende Blutmononukleozyten
(PBMC) bei 2 μg/ml
(p<0,01) inhibierte
(3). IMF inhibierte ebenfalls die Produktion von IgG1
und IgG4 durch humane PBMC in vitro deutlich. Eine signifikante
Inhibition trat bei bis zu 2 μg/ml
(p<0,05) bei beiden
Isotypen, wie in 4 bzw. 5 gezeigt,
auf.
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Untersuchungen zum Wirkort:
IMF erfordert die Gegenwart von T-Lymphozyten zur Ausübung seiner
Wirkungen auf die Antikörperproduktion.
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Eine
IMF-induzierte Suppression der IgE-Produktion war in einem IL-4/CD-40-stimulierten,
an T-Zellen abgereicherten IgE-Kultursystem nicht nachweisbar.
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Der
Effekt der Vorstimulation verschiedener muriner Zelluntergruppen
mit ES-Produkten ist in der 6 gezeigt.
Die spezifischen Antikörperspiegel,
ausgedrückt
als Mengen im Vergleich zu denjenigen, die von den nicht-vorstimulierten
Zellen hergestellt werden, zeigen, dass die Vorstimulation beider
T-Lymphozytenuntergruppen (CD4+ und CD8+) eine signifikante Verminderung der Antikörperproduktion
hervorriefen, wobei die größere Verminderung
bei der CD4+-Untergruppe beobachtet wurde
(–70 %,
p < 0,001). Die
Vorstimulation von B-Lymphozyten zeigte keine signifikante Wirkung
auf die Antikörperproduktion,
während
die Vorstimulation der adhärenten
Zellpopulation einen Anstieg der Antikörperproduktion hervorbrachte
(+75 %, p < 0,01).
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Die
durchflusszytometrische Analyse muriner Kulturzellen aus dem KAP-Test
ist in der Tabelle 1 gezeigt. Tabelle
1
und zeigt einen signifikanten Anstieg der absoluten
Zahlen der CD8
+-Zellen nach einer Zeitspanne
von nur 24 Stunden in der Kultur an.
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Die
Behandlung der ES-Fraktionen mit Proteinase K zeigte keine Wirkung
auf die inhibitorische Aktivität
des Mittels und zeigt, dass das Mittel kein Protein ist.
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Das
Mittel kann durch im Fachgebiet bekannte Techniken weiter aufgereinigt
werden. Insbesondere können
auf Antikörpern
basierende Aufreinigungstechniken und eine Gelelektrophorese verwendet
werden.
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Ein
Fachmann erkennt ebenfalls, dass das gereinigte Mittel in bekannter
Weise zur Bereitstellung eines Therapeutikums, insbesondere zur
Behandlung einer Autoimmunerkrankung, z. B. Asthma, Arthritis oder allergische
Rhinitis, formuliert werden kann. Geeignete Formulierungen können zur
oralen oder systemischen Verabreichung entwickelt werden. Geeignete
Hilfsmittel, Verdünnungsmittel
und Verabreichungsmittel sind einem Fachmann anhand üblicher
Formulierungstechniken ersichtlich.
