DE68926743T2

DE68926743T2 - Die freisetzung des histamin hemmenden faktors sowie diesen enthaltende präparate

Info

Publication number: DE68926743T2
Application number: DE68926743T
Authority: DE
Inventors: Rafeul Alam; J Grant; Michael Lett-Brown
Original assignee: University of Texas System
Current assignee: University of Texas System
Priority date: 1988-01-12
Filing date: 1989-01-11
Publication date: 1997-01-09
Anticipated expiration: 2009-01-12
Also published as: CA1334652C; ATE139702T1; EP0398924B1; DE68926743D1; WO1989006545A1; EP0398924A1; AU2947889A

Description

Hintergrund der Erfindung

A. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen Inhibitor für allergische Reaktionen, der als Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor (HRIF) bezeichnet wird. Dieser Faktor hemmt die Freisetzung von allergischen Mediatoren aus Basophilen und Mastzellen, die durch Histamin-Freisetzungsfaktoren (HRF), von denen nunmehr angenommen wird, daß sie eine Schlüsselrolle bei der Entstehung von Asthma und anderen allergischen Störungen spielen, ausgelöst werden. Es ist wahrscheinlich, daß sich dieser Faktor auch als wertvoller Inhibitor für allergische Störungen und andere menschliche Krankheiten, bei denen Basophile und Mastzellen möglicherweise eine pathologische Rolle spielen, eignet.

B. Beschreibung des Stands der Technik

Basophile und Mastzellen sind, seitdem sie erstmals von Paul Ehrlich ab 1870 beschrieben worden sind, Gegenstand von wissenschaftlichen Untersuchungen. Mastzellen finden sich allgemein im Bindegewebe, Basophile im Blut. Die beiden Zelltypen weisen zahlreiche Ähnlichkeiten auf. Beide enthalten zahlreiche metachromatisch färbende Granula, beide weisen Oberflächenrezeptoren auf, die IgE mit hoher Affinität binden und beide enthalten Unmengen unterschiedlicher allergischer Mediatoren, die verschiedene Symptome hervorrufen können, die von einem Juckreiz der Haut bis zu der am stärksten lebensbedrohenden klinischen Situation, der Anaphylaxie, gehen können. Basophile und Mastzellen sind gemeinsam für praktisch das gesamte Körperhistamin verantwortlich und werden gemeinsam als Histamin enthaltende, proallergische Zellen bezeichnet.
Es gibt überzeugende Beweise dafür, daß Mastzellen und Basophile für die Induktion von allergischen überempfindlichkeitsreaktionen wesentlich sind. Beispielsweise sprechen starke Beweise dafür, daß Mastzellen die primären Effektorzellen von allergischen Erkrankungen, wie Asthma, allergische Rhinitis, Konjunktivitis, Nesselsucht und Anaphylaxie sind. Eine erhöhte Anzahl an Mastzellen wird in der bronchoalveolaren Spülflüssigkeit, in Atmungsschleimhäuten, in Nasenschleimhäuten und Biopsieproben von Nesselsuchtläsionen bei diesen Störungen gefunden. Ferner wurden Mastzell-Mediatoren, wie Histamin und Prostaglandin (PG) D&sub2;, aus Serum, bronchoaleovarer Spülflüssigkeit, Nasenspülungen und Hautblasenflüssigkeit bei natürlichen und künstlich erzeugten allergischen Reaktionen gefunden. In letzter Zeit wurde im Serum von Patienten mit allergischen und anaphylaktoiden Reaktionen das für Mastzellen-Granula spezifische Enzym Tryptase (das in Basophilen nicht auftritt) nachgewiesen. Schließlich können die meisten, von Mastzellen abgeleiteten Mediatoren allein oder in Kombination typische allergische Symptome, wie Bronchospasmen, Angioödeme, Husten, Schleimabsonderungen, Rhinorrhoe, Niesen und Quaddel- und Erythem-Hautreaktionen, hervorrufen, und Mastzellen-spezifische Degranulierungsmittel können in vivo allergische Reaktionen hervorrufen.
Ferner lassen histologische Anzeichen darauf schließen, daß Mastzellen bei der Pathogenese einer Anzahl von chronischen Entzündungskrankheiten beteiligt sind. Eine erhöhte Anzahl an Mastzellen wurde in Biopsieproben von Patienten mit rheumatoider Arthritis, ulzerativer Kolitis, Crohn-Krankheit, Sarkoidose, Hypersensitivitätspneumonie, pulmonarer Fibrose, Nasenpolypen, atopischer Dermatitis, allergischer Kontaktdermatitis, bullösem Pemphigus, Keloidbildung, Sklerodermie, progressiver systemischer Sklerose, akuter und chronischer Graft-versus- Host-Krankheit und parasitären Erscheinungen nachgewiesen. Mastzellen sind auch an der Regulierung des Nervenwachstums beteiligt, und es wurde gezeigt, daß eine Regulierung der Mastzellen-Degranulierung bei Neurofibromatose wertvoll ist. Ferner wurden erhöhte Histaminspiegel in der bronchoalveolaren Spülflüssigkeit von Patienten mit Sarcoidose, Hypersensitivitätspneumonie und idiopathischer pulmonaler Fibrose nachgewiesen. Cromolyn-natrium, ein mutmaßlicher Mastzellen-Stabilisator, hat sich als wertvoll für eine Untergruppe von Patienten mit ulzerativer Kolitis, insbesondere solchen mit Proktitis, erwiesen.
Basophile scheinen insbesondere an einigen Formen von allergischer Kontaktdermatitis, insbesondere gegen Giftsumach und experimentell gegen Dinitrochlorbenzol, beteiligt zu sein. Diese Zellen stellen 5 bis 15% der gesamten infiltrierenden Zellen dar und sind innerhalb von 8 Stunden nach dem Auftragen des Allergens auf die Haut vorhanden. Angesichts der Anzahl von inflammatorischen Mediatoren, die von Mastzellen und Basophilen freigesetzt werden, ist es denkbar, daß eine verzögerte, allmähliche Degranulation dieser Zellen zur chronischen entzündlichen Natur der vorerwähnten Störungen beiträgt.
Unglücklicherweise versteht man trotz der überzeugenden Beweise, die Mastzellen und Basophile mit diesen und anderen Krankheitszuständen in Verbindung bringen, die genaue Pathogenese der von Mastzellen und Basophilen abhängigen Störungen, einschließlich der allergischen Erkrankungen, nur unvollständig. Beispielsweise ist es bekannt, daß Mastzellen und Basophile unter Freisetzung von Histamin, Leukotrienen und anderen inflammatorischen Mediatoren durch Überbrückung der an die Zelloberfläche gebundenen IgE-Antikörper durch entsprechende Allergene (oder anti-IgE- Antikörper) stimuliert werden, jedoch korreliert die Schwere einer Anzahl von allergischen Erkrankungen, beispielsweise Bronchialasthma, Rhinitis und Konjunktivitis, nicht mit dem IgE-Spiegel eines Patienten. Außerdem wird zwar angenommen, daß Mastzellen eine Rolle bei verschiedenen anderen Erkrankungen, wie Darmentzündungen, rheumatoider Arthritis, pulmonaler Fibrose und Sarkoidose, spielen, jedoch lassen sich in der Mehrzahl dieser Krankheiten keine IgE-Antikörper finden.
Somit spielen anscheinend andere Mechanismen der allergischen Mediator-Freisetzung eine kritische Rolle bei der Pathogenese der vorstehend erwähnten allergischen Erkrankungen und anderer Störungen, bei denen Basophile und Mastzellen beteiligt sind. Eine Aufklärung dieser Mechanismen ist und bleibt das Ziel von zahlreichen medizinischen Wissenschaftlern.
Eine der erregendsten Entwicklungen auf diesem Gebiet war die Entdeckung der Histamin-Freisetzungsaktivität (HRA) (wobei Cytokine hier als Histamin-Freisetzungsfaktoren (HRF) bezeichnet werden) durch Wissenschaftler in den Laboratorien der Erfinder der vorliegenden Anmeldung. Thueson et al. (J. Immunol., Bd. 123 (1979), S. 626; J. Immunol., Bd. 123 (1979) S. 633) und Lett-Brown et al. (Cell. Immunol., Bd. 87 (1984), S. 434; Cell Immunol., Bd. 87 (1984) S. 445) berichteten als erste, daß durch Antigen oder Mitogen stimulierte humane mononukleare Zellen einen proteinartigen Faktor sezernieren, der die Freisetzung von Histamin aus Basophilen und Mastzellen induziert. Andere Laboratorien bestätigten dann die Synthese von HRF durch mononukleare Zellen. Es wurde nunmehr gezeigt, daß HRF auch durch B-Lymphozyten und T-Lymphozyten, alveoläre Makrophagen, Blutplättchen, Neutrophile und Blutmonozyten bei in vitro-Züchtung synthetisiert wird. Die große Vielfalt von Zelltypen, für die eine Sekretion von HRF berichtet wird, legt es nahe, daß HRF von erheblicher biologischer Bedeutung ist. Neben der Vermittlerrolle bei der Histamin-Freisetzung wurde für HRF gezeigt, daß es die Sekretion von Leukotrienen induziert und für Basophile und Monozyten chemotaktisch ist (bezüglich einer zusammenfassenden Darstellung wird verwiesen auf Grant et al., Fed. Proc., Bd. 45 (1986), S. 2653, J. Allergy Clin. Immunol., Bd. 77 (1986), S. 407 und Alam, Insights in Allergy, Bd. 2, Nr. 6, (1987), CV Mosby, St.Louis, wobei alle diese Druckschriften durch Verweis zum Gegenstand der Beschreibung gemacht werden).
Zahlreiche Untersuchungen liefern Daten, die in direkter Weise die Bedeutung von HRF als Mediator von humanen allergischen Erkrankungen stützen. Beispielsweise wurde ein HRF-ähnliches Material aus Hautblasenflüssigkeit, die während der späten allergischen Reaktion gewonnen wurde, erhalten, wobei man nunmehr annimmt, daß es einen wichtigen Faktor bei der Pathogenese von chronischem Asthma und anderen allergischen Zuständen darstellt. HRF wurde auch aus nasalen Spülungen gewonnen. Ferner induziert HRF die Bronchokonstriktion bei der Inhalation von asthmatischen Personen und eine Quaddel- und Erythem-Reaktion bei Menschen und nichthumanen Primaten. Von mononuklearen Zellen asthmatischer Patienten wurde gezeigt, daß sie spontan relativ große Mengen an HRF bilden und daß die HRF-Bildung bei in vitro-Inkubation mit einem spezifischen Allergen verstärkt wird. Außerdem korreliert die Größe der spontanen HRF-Bildung mit der Schwere der bronchialen Hyperreaktivität bei asthmatischen Patienten (Alam et al., J. Allergy Clin. Immunol., Bd. 79 (1987), S. 103). Diese Befunde lassen darauf schließen, daß bei asthmatischen Patienten eine erhöhte spontane HRF-Bildung eine verzögerte Freisetzung von allergischen Mediatoren aus Mastzellen oder Basophilen hervorrufen kann, was zu einer chronischen Entzündung und letztlich zur Entwicklung von bronchialer Hyperreaktivität führt.
Obgleich eine Immunotherapie eine anerkannte Möglichkeit zur Behandlung von allergischen Erkrankungen darstellt, ist ihr Wirkungsmechanismus immer noch unklar. Veränderungen der Serum-IgE-Antikörper korrelieren nicht gut mit der Wirksamkeit der Immunotherapie. Nach längerer Behandlung entsteht üblicherweise Serum-IgE-blockierender Antikörper. Obgleich einige Forscher eine Korrelation zwischen der Wirksamkeit der Immunotherapie und dem IgE-Antikörperspiegel nachgewiesen haben, ist die Korrelation häufig zu dürftig, als daß eine kausale Beziehung angenommen werden könnte. In letzter Zeit hat jedoch einer der vorliegenden Erfinder festgestellt, daß die Immunotherapie bei Patienten mit klinischer Besserung den saisonalen Anstieg der HRF-Bildung beseitigt und die spontane HRF- Bildung verringert. Dabei gibt es eine starke Korrelation zwischen der Symptom-Medikation-Bewertung und der spontanen HRF-Bildung (r = 0,92, p = 0,0002).
Aufgrund der wichtigen Rolle, die HRF bei der Pathogenese von allergischen Erkrankungen und anderen Störungen, einschließlich der Freisetzung von Mediatoren aus Basophilen und Mastzellen, spielt, ist es wahrscheinlich, daß ein Mittel, das zur Hemmung der HRF-induzierten Mediator- Freisetzung befähigt ist, ein wertvolles Werkzeug bei der Behandlung von von Mastzellen/Basophilen abhängigen Störungen, zu denen die allergischen Erkrankungen gehören, darstellen würde. Über einen Meerschweinchen-Inhibitor der Histamin-Freisetzung wurde berichtet (Alam et al., Fed. Proc., Bd. 46 (1987), S. 928). Jedoch wurde trotz des Bedarfs nach einem solchen Mittel, bisher keine endogene Substanz beschrieben, die dazu befähigt ist, die durch HRF induzierte Histamin-Freisetzung aus humanen Mastzellen und Basophilen zu hemmen. Glücklicherweise haben die Erfinder nunmehr einen Inhibitorfaktor der Histamin-Freisetzung mit den gewünschten Eigenschaften aufgefunden. Dieser Faktor, seine Herstellung und seine Eigenschaften werden in der vorliegenden Beschreibung erörtert.

Zusamenfassende Darstellung der Erfindung

Eine allgemeine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Inhibitor des Histamin-Freisetzungsfaktors bereitzustellen. Aufgabe der Erfindung ist es ferner, einen spezifischen Faktor bereitzustellen, der zur Hemmung der Freisetzung von Histamin aus Mastzellen oder Basophilen, die durch den Histamin-Freisetzungsfaktor ausgelöst (getriggert) wird, befähigt ist. Aufgabe der Erfindung ist es ferner, Verfahren zur Herstellung derartiger Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktoren sowie zur Erzeugung derartiger Faktoren befähigte Zellinien bereitzustellen und die wesentliche Reinigung dieses Faktors zu beschreiben.
Somit ist die Erfindung auf eine therapeutische Zusammensetzung abgestellt, die einen pharmazeutisch verträglichen Träger und einen in wesentlichem Umfang gereinigten Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor enthält, wobei der Faktor einen in wesentlichem Umfang gereinigten humanen Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor (HRIF) mit folgenden Eigenschaften umfaßt. Molekulargewicht von etwa 8000-10 000 Dalton, bestimmt durch Gelausschlußchromatographie; Labilität bei Behandlung mit Trypsin oder Chymotrypsin; Stabilität bei 1-stündigem Erwärmen auf 60ºC; und Stabilität bei Behandlung mit Neuraminidase.
Erfindungsgemäß wird ferner eine Zusammensetzung bereitgestellt, die einen in wesentlichem Umfang gereinigten proteinartigen Faktor enthält, wobei der Faktor biologische Eigenschaften aufweist, die die Hemmung der allergischen Mediator-Freisetzung aus humanen Basophilen oder humanen Mastzellen, die durch den Histamin-Freisetzungsfaktor getriggert wird, einschließen. Eine Zusammensetzung, die diesen Faktor enthält, läßt sich ferner durch physikochemische und biologische Eigenschaften charakterisieren. Beispielsweise läßt sich zur Definition des Faktors ferner angeben, daß er ein Molekulargewicht von etwa 8000-10 000 Dalton bei Bestimmung durch Gelausschlußchromatographie aufweist oder daß er an DEAE-Cellulose, die mit etwa 1 mM Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,4 äquilibriert ist, bindet und mit etwa 100 mM bis 200 mM NaCl vom pH-Wert etwa 7,4 eluiert wird. Ferner läßt sich der Faktor durch seine Stabilität oder Labilität gegen verschiedene Behandlungen charakterisieren. Beispielsweise wird in verschiedenen Ausführungsformen der Faktor aufgrund seiner biologischen Eigenschaften definiert, wozu die Labilität der allergischen Mediator-Freisetzungs-Hemmwirkung bei Behandlung mit Trypsin oder Chymotrypsin oder die Stabilität der allergischen Mediator-Freisetzungs-Hemmwirkung bei Behandlung mit Neuraminidase oder bei Erwärmen auf 60ºC für 1 Stunde gehören. Schließlich läßt sich der Faktor auch dadurch definieren, daß er in einem Spectrapor-3-Dialyseschlauch mit einer Molekulargewichtsausschlußgrenze von etwa 3500 Dalton zurückgehalten wird.
Schließlich läßt sich der Faktor durch sein Muster oder seine Spezifität der Hemmwirkung definieren, wenn Basophile oder Mastzellen mit speziellen Agonisten oder sekretionsanregenden Mitteln, von denen bekannt ist, daß sie die allergische Mediator-Freisetzung unter für den Fachmann bekannten Bedingungen induzieren, auslösen. Selbstverständlich ist der Faktor allgemein durch seine Fähigkeit definiert, die Mediator-Freisetzung aus mit HRF getriggerten Zellen zu hemmen. Ferner kann der Faktor insbesondere so definiert werden, daß er nicht die allergische Mediator- Freisetzung aus Zellen hemmt, die durch Allergen für IgE- spezifische Antikörper, Concanavalin A, Phorbol-myristat-acetat oder das Anaphylatoxin C5a getriggert wird.
Eine weitere spezielle Ausführungsform ist auf die Hemmung der Freisetzung eines speziellen allergischen Mediators, nämlich Histamin, abgestellt. Der Fachmann weiß, daß Basophile und Mastzellen eine Anzahl von weiteren allergischen Mediatoren, wie Leukotriene, enthalten. Der Ausdruck "allergische Mediatoren" soll diese Verbindungen umfassen. Die hier beschriebenen Versuche wurden jedoch unter Verwendung von Histamin als Prototyp-Mediator durchgeführt. Somit ist eine spezielle Ausführungsform auf eine Zusammensetzung abgestellt, die speziell durch ihre Hemmung der Histamin-Freisetzung charakterisiert ist.
Die Erfindung umfaßt auch einen in wesentlichem Umfang gereingten humanen Proteinfaktor, der zur Hemmung der Histamin-Freisetzung aus humanen proallergischen Zellen, die durch den Histamin-Freisetzungsfaktor getriggert wird, befähigt ist, wobei der Proteinfaktor ein Molekulargewicht von 20 000 bis 30 000 Da aufweist.
Die Erfindung umfaßt auch einen in wesentlichem Umfang gereinigten proteinartigen Faktor, dessen biologische Eigenschaften die Hemmung der allergischen Mediator-Freisetzung aus humanen Basophilen oder humanen Mastzellen, die durch den Histamin-Freisetzungsfaktor getriggert wird, einschließt, wobei der Faktor durch ein Verfahren gewonnen wird, bei dem ein konditionierter Überstand aus humanen mononuklearen Zellen hergestellt wird, der Überstand unter Bildung einer Fraktion, die den Faktor in in wesentlichem Umfang gereinigter Form enthält, fraktioniert wird und die Fraktion gewonnen wird. In einer spezielleren Ausführungsform wird der konditionierte Zellüberstand hergestellt, indem man eine mononukleare Zellfraktion von Leukozyten einer Person gewinnt, die mononukleare Zellfraktion in einem geeigneten Medium unter Bildung eines konditionierten Überstands züchtet und den Überstand von den gezüchteten Zellen abtrennt. In einer noch spezielleren Ausführungsform werden die Leukozyten aus peripherem Blut gewonnen. Es wird jedoch angenommen, daß Leukozyten aus anderen Quellen, wie Milzzellen, Milchbrustgangzellen oder Lymphknotenzellen, einschließlich Zellen aus tonsillaren Lymphknoten, verwendet werden können. Selbstverständlich kann bei Verwendung von peripherem Blut als Leukozytenquelle eine Fraktionierung, beispielsweise durch Zentrifugation über einem Ficoll-Hypaque-Gradienten, erforderlich sein, um die mononukleare Fraktion zu erhalten.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der konditionierte Überstand zu Proteinfraktionen von ausgewählten Molekulargewichtsbereichen fraktioniert, um eine Fraktion bereitzustellen, die das Protein in in wesentlichem Umfang gereinigter Form enthält. Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird die Fraktion durch Testen verschiedener Fraktionen auf die Fähigkeit zur Hemmung der Histamin-Freisetzung aus humanen Basophilen oder humanen Mastzellen, die durch den Histamin-Freisetzungsfaktor getriggert wird, ausgewählt. Schließlich werden gemäß besonders bevorzugten Ausführungsformen die mononuklearen Zellen in einem Gewebekulturmedium mit einem Gehalt an Histamin gezüchtet, wobei der Faktor als ein humaner Faktor definiert wird. Außerdem wird der Faktor auch durch humane mononukleare Zellen synthetisiert, die mit Mitogenen, wie Concanavalin A, oder mit Antigenen, die eine humane allergische Empfindlichkeit hervorrufen, wie Ambrosia-Pollen- (ragweed pollen) oder Staubmilben-Allergenextrakte, gezüchtet werden.
Die Erfindung umfaßt auch Zusammensetzungen, die in wesentlichem Umfang gereinigte proteinartige Faktoren enthalten, die biologisch dem durch die Zellinie JW-RW gebildeten Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor entsprechen. Selbstverständlich ist es für den Fachmann ersichtlich, daß ein Faktor, der in biologischer Hinsicht dem durch eine bestimmte Zellinie gebildeten Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor entspricht, nicht tatsächlich von dieser Zellinie gebildet sein muß; er muß vielmehr nur die relevanten biologischen Eigenschaften des von dieser Linie gebildeten Faktors aufweisen. Somit umfaßt in einer weiteren Ausführungsform die Zusammensetzung einen in wesentlichem Umfang gereinigten proteinartigen Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor, der tatsächlich durch die Zellinie JW-RW gebildet wird. Außerdem umfaßt die Erfindung Zellinien, die den Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor entsprechend dem von der Zellinie JW-RW gebildeten Faktor bilden, sowie die humane Zellinie JW-RW.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Hemmung der Freisetzung eines allergischen Mediators aus humanen, Histamin enthaltenden proallergischen Zellen bereit, indem man diese Zellen dem vorstehend beschriebenen proteinartigen Faktor aussetzt. In einer spezielleren Ausführungsform ist der allergische Mediator spezifisch als Histamin definiert.
Ferner werden erfindungsgemäß auch antiallergische Präparate und Präparate bereitgestellt, die sich zur Behandlung von anderen Störungen, bei denen die Freisetzung von Mediatoren aus Basophilen und Mastzellen für die pathologische Symptomatologie kausal ist, eignen. Im allgemeinen enthalten diese Präparate einen pharmazeutisch verträglichen Träger und einen in wesentlichem Umfang gereinigten Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor. Als spezielle Ausführungsformen werden auch Verfahren zur Behandlung von allergischen Personen und anderen Personen mit Krankheiten, die durch eine Aktivierung von Basophilen und Mastzellen hervorgerufen werden, bereitgestellt, wobei die Behandlungsverfahren die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Dosierung des Präparats an diese Personen umfassen.
Die Erfindung umfaßt auch Verfahren, zur Herstellung des Histamin- Freisetzungs-Inhibitorfaktors und zur Herstellung von humanen Zellinien, die den Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor bilden. Im allgemeinen umfaßt das erstgenannte Verfahren die Herstellung eines humanen, konditionierten, mononuklearen Zellüberstands und dessen Test auf die Histamin- Freisetzungs-Hemmwirkung. Selbstverständlich enthält gemäß einer besonders bevorzugten Ausführungsform das Kulturmedium Histamin, vorzugsweise in einer Konzentration von etwa 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;¹&sup0; M, wobei Histamin vor dem Test in wesentlichem Umfang aus dem konditionierten Überstand entfernt worden ist. Gemäß einer weiteren Ausführungsform wird der fraktionierte Überstand an einer Zellsuspension mit einem Gehalt an humanen Basophilen oder humanen Mastzellen, die dem Histamin-Freisetzungsfaktor ausgesetzt worden sind, getestet.
Das zweite Verfahren, das auf die Bildung von Zellinien, die den Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor erzeugen, abgestellt ist, umfaßt die Gewinnung von Leukozyten aus einer Person, die Züchtung der Zellen in einem geeigneten Gewebekulturmedium mit einem Gehalt an einem Antigen, die Aufrechterhaltung der Zellen in einem Kulturmedium mit einem Gehalt an Interleukin-2 und Feeder-Zellen und das Testen der gezüchteten Zellen auf ihre Fähigkeit zur Bildung eines Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktors. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Person, die als Leukozytenquelle dient, um eine Person, die einer Immunotherapie gegen eine allergische Störung unterliegt, wobei das der Kultur zugesetzte Allergen einer antigenen Komponente des für die Immunotherapie verwendeten Präparats entspricht. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden die zum Start der Zellinie eingesetzten Zellen vor dem Züchten in bezug auf Antigen-bindende T-Zellen angereichert.
Schließlich umfaßt die Erfindung auch klinische Tests, die sich zur Überwachung oder zur Diagnose von Personen eignen. Ein derartiger Test umfaßt die Bereitstellung einer mononuklearen Zellfraktion von Leukozyten eines Patienten und die Züchtung der mononuklearen Zellfraktion in einem geeigneten Kulturmedium unter Bildung eines konditionierten Überstands. Der konditionierte Überstand wird sodann auf seine Histamin-Freisetzungs- Hemmwirkung getestet. Selbstverständlich ist es bei der klinischen Einstellung häufig erwünscht, die Menge des von den Patientenzellen gebildeten Histamin-Freisetzungsinhibitors mit einem Standardpräparat, das eine bekannte Menge an Histamin-Freisetzungs-Inhibitoraktivität enthält, zu vergleichen. Im allgemeinen wird angenommen, daß dieser Test besonders wertvoll bei der Überwachung von Patienten mit allergischen Erkrankungen, insbesondere bei Patienten, die sich einer Immunotherapie unterziehen, ist. Jedoch ist es wahrscheinlich, daß dieser Test auch in erheblichem Umfang bei der Überwachung sämtlicher Krankheitszustände Anwendung finden kann, wo eine allergische Mediatorfreisetzung aus Basophilen oder Mastzellen mit der Pathogenese der Krankheit verbunden ist.
Die Erfindung stellt auch einen klinischen Test bereit, bei dem biologische Flüssigkeiten, wie Vollblut oder Bestandteile davon, Sekrete oder Waschflüssigkeiten der Atemwege, Urin, Gelenkflüssigkeit und andere Körperflüssigkeiten, auf die Anwesenheit von Histamin-Freisetzungs-Inhibitoraktivität getestet werden. Es wird angenommen, daß die absoluten Konzentrationen des Faktors in diesen Flüssigkeiten mit der Krankheitsaktivität korrelieren.
Die vorstehend erwähnten sowie weitere Aufgaben und Vorteile der vorliegen Erfindung ergeben sich für den Fachmann aus der nachstehenden ausführlichen Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1: Einfluß der Züchtung von mononuklearen Zellen mit Histamin auf die HRF-Aktivität der Überstände. Mononukleare Zellen von 15 gesunden Spendern wurden allein oder in Gegenwart von Histamin (10&supmin;&sup6; M) 24 Stunden gezüchtet. Die Überstände wurden gründlich dialysiert, um Histamin zu entfernen, und auf ihre Histamin-Freisetzungsaktivität im Basophilen- Histamin-Freisetzungstest getestet. Unstimulierte mononukleare Zellüberstände zeigten HRF-Aktivität. Diese Aktivität war in 12 Überständen unterdrückt, wenn die Zellen mit Histamin gezüchtet worden waren. Dies läßt darauf schließen, daß Histamin die HRF-Synthese verringert oder bevorzugt die Bildung eines Inhibitors stimuliert.
Fig. 2: Bildung von HRIF durch humane mononukleare Zellen (MNC). MNC von sechs gesunden Spendern wurden in RPMI entweder allein ( ---- ) oder in Gegenwart von Histamin (10&supmin;&sup8; M) (o----o) 24 Stunden gezüchtet. Der Kulturüberstand wurde durch Zentrifugation geerntet, zweimal gegen 1000 Volumenteile Wasser und 100 Volumenteile HCM-Puffer dialysiert, um Histamin zu entfernen, und sodann auf die Hemmung der HRF-induzierten Histamin-Freisetzung aus Basophilen, die von drei allergischen Spendern erhalten worden waren, getestet. Die HRF-induzierte Histamin-Freisetzung betrug 25-44%. Die Daten werden als X ± SEM (Standardfehler des Mittelwerts) angegeben. Unstimulierte mononukleare Zellen, die in RPMI gezüchtet wurden, bildeten spontan eine gewisse Menge an HRIF. Diese Bildung wurde signifikant in Gegenwart von Histamin verstärkt (*: p < 0,001, t- Test). Eine Züchtung von Histamin ohne MNC ( ---- ) zeigte keine Inhibitoraktivität. Dieses Experiment wurde mit mononuklearen Zellen von 10 Spendern, jedoch unter Anwendung eines engeren Bereichs von Verdünnungen wiederholt. Es wurden ähnliche Ergebnisse erhalten. Die Hemmung der Histamin-Freisetzung durch Histamin-stimulierte Überstände betrug 40-80%.
Fig. 3: Dosisabhängige Bildung von HRIF durch mononukleare Zellen von fünf gesunden Spendern unter Stimulation von verschiedenen Konzentrationen von Histamin. Dialysierte Überstände (Endverdünnung 1:6) wurden auf ihre Hemmung der HRF-induzierten Histamin-Freisetzung von Basophilen von zwei allergischen Spendern getestet. Die HRF-induzierte Histamin- Freisetzung betrug 33-40%.
Fig. 4: Einfluß der Vorinkubationsdauer von Zellen auf die HRIF-Aktivität. Basophile Leukozyten wurden mit HRIF vorinkubiert (15-fach konzentrierter, Histamin-stimulierter Überstand), und zwar (o----o) 40-60 Sekunden, 3, 5 und 10 Minuten bei Raumtemperatur, wonach die Anregung mit HRF folgte. Puffer ( ---- ) wurde in den Kontrollexperimenten verwendet. Eine maximale Hemmung war ersichtlich, wenn die Zellen mit HRIF 5 Minuten oder mehr vorinkubiert wurden. Die Ergebnisse sind als X ± SEM von sechs Versuchen aufgeführt. Die Kontroll-Histamin-Freisetzung betrug 18-30%.
Fig. 5: Einfluß der Entfernung von HRIF nach Vorinkubation auf die HRF-induzierte Histamin-Freisetzung aus Basophilen. Leukozyten wurden 10 Minuten mit HRIF vorinkubiert, sodann zentrifugiert und zweimal gegen 40 Volumenteile Puffer gewaschen und hierauf mit HRF angeregt. Die Hemmung der Histamin-Freisetzung wurde mit HRIF-behandelten Zellen, die vor der Zugabe von HRF nicht gewaschen worden waren, verglichen. Kontrollen (nicht abgebildet) umfaßten die Vorinkubation von Zellen in Puffer unter anschließendem Waschen und HRF-Reizung. Der prozentuale Anteil der Histamin-Freisetzung war mit ungewaschenen Zellen identisch.
In einem weiteren Satz von Versuchen wurde HRIF mit HRF 10 Minuten vorinkubiert, und sodann wurden Zellen zugesetzt. Es erfolgte keine Hemmung der Histamin-Freisetzung bei diesen Versuchen. Die Ergebnisse (X ± SEM) von sechs Versuchen sind aufgeführt. Die Kontroll-Histamin-Freisetzung durch HRF lag im Bereich von 20-38%.
Fig. 6A: Histamin-Freisetzungs-Hemmwirkung von rekombinanten Interleukinen 1, 2 und 4 und gamma-Interferon. Leukozyten wurden getrennt mit HRIF, Interleukinen und Interferon (50, 250 und 500 Einheiten pro ml) 5 Minuten vorinkubiert und sodann mit HRF angeregt. Die Ergebnisse (x ± SEM) von sechs Versuchen (für gamma-Interferon n = 4) sind aufgeführt. Keines dieser Cytokine hemmte die HRF-induzierte Histamin-Freisetzung von Basophilen. Die Kontroll-Histamin-Freisetzung durch HRF lag im Bereich von 20-34%.
Fig. 6B: Leukozyten wurden aus venösem Blut von 6 normalen Personen isoliert und mit 5 logarithmischen Konzentrationen von IL 1, 2, 3 und 4, Tumornekrose faktor, GM-Kolonienstimulationsfaktor und gamma-Interferon 5 Minuten vorinkubiert. Sodann wurden die Zellen durch HRF-Zugabe angeregt und weitere 30 Minuten inkubiert. Sodann erfolgte eine Analyse auf Histamin-Freisetzung. In den Kontrollversuchen wurden Leukozyten mit HRIF enthaltendem MNC-Überstand oder Puffer vorinkubiert. Die Kontroll- Histamin-Freisetzung durch HRF in Gegenwart von Puffer lag im Bereich von 25-55%.
Fig. 7: Sephadex G-50-Superfine-Gelchromatographie von durch Histamin (7A) und Concanavalin A (7B und C) stimulierte MNC-Überstände. Für Fig. 7A und 7B wurden 15-fach konzentrierte Überstände (2 ml) auf eine Säule (90 cm x 1,5 cm), die mit Markerproteinen vorgeeicht worden war, aufgesetzt. Fraktionen von 1 ml wurden gesammelt. Jede dritte Fraktion wurde bei einer Verdünnung von 1:3 auf die Hemmung der HRF-induzierten HR aus Basophilen getestet. Die HRIF-Aktivität ( ---- ) von Histamin-stimulierten Überständen trat in den Fraktionen auf, die dem MG- Bereich von 8K-10K entsprachen. Ein kleiner Peak von HRF (o----o) wurde im 15K-30K-Bereich gefunden. Dieser Versuch wurde zweimal wiederholt, wobei ein ähnliches Elutionsprofil von HRIF festgestellt wurde. Die Erfinder führten auch eine Gelfiltration von mit Concanavalin A-stimulierten mononuklearen Zellüberständen von gesunden Spendern durch. Die HRIF-Aktivität wurde in dem einem MG-Wert von 8K-10K entsprechenden Bereich festgestellt, während die HRF-Aktivität im Hohlraumvolumen (MG > 30K) und im MG-Bereich von 15K-30K auftrat. Dieser Versuch wurde zweimal wiederholt, wobei ähnliche Ergebnisse erhalten wurden. Die Kontroll-Histamin-Freisetzung lag im Bereich von 26-48%.
Fig. 7C: Ein 20-fach konzentrierter Überstand (2 ml) wurde auf eine Säule (90 cm x 1,5 cm), die mit Markerproteinen vorgeeicht worden war, aufgesetzt. Fraktionen von 1 ml wurden gewonnen. Jede zweite Fraktion wurde auf die direkte Histamin-Freisetzung (o) und auf die Hemmung der HRF-induzierten Histamin-Freisetzung ( ) von Basophilen getestet. Dieses Profil der HRIF-Aktivität wurde bei einem von 3 MNC-Spendern beobachtet.
Fig. 8: chromatographie eines mit Concanavalin A stimulierten MNC- Überstands an DEAE (DE-52)-Cellulose. Die überstehende Flüssigkeit wurde gegen 1 mM Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,4 dialysiert. Etwa 1,0 g trockenes Gel wurden mit 10 ml dialysiertem Überstand vereinigt und mäßig 15 Stunden bei 4ºC geschwenkt. Eine mit dem Gel gepackte Säule und 2 Volumenteile des gleichen Puffers wurden über die Säule gegeben. Anschließend wurde die Säule mit einem linearen Gradienten von 1 mM bis 500 mM NaCl in 1 mM Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,4 eluiert. Das Gesamtvolumen des Gradienten betrug etwa 40 ml. Fraktionen von 2 ml wurden gewonnen. Die Fraktionen wurden gegen HCM-Puffer dialysiert und auf HRIF getestet. HRIF wurde von der Säule bei etwa 100 mM NaCl eluiert.
Fig. 8 A: Anionenaustausch-Hochleistungsflüssigchromatographie von HRIF.
Fig. 8 B: Größenausschluß-HPLC von MNC-abgeleitetem HRIF.
Fig. 9: Einfluß von durch Histamin stimulierten mononuklearen Zellüberständen auf die Histamin-Freisetzung durch HRF, Ambrosia-Allergen (10&supmin;&sup6; Gew/Vol.), anti-IgE (1:10 000), Concanavalin A (Con A, 10 µg pro ml) und Phorbol-myristat-acetat (PMA, 10 ng pro ml) sowie C5a (1:100). Basophile von Ambrosia-empfindlichen Spendern wurden mit HRIF enthaltendem Überstand (Endverdünnung 1:6) 5 Minuten vorinkubiert und sodann mit verschiedenen Agonisten gereizt. Die Ergebnisse (X ± SEM) von sechs Versuchen sind in der Figur dargestellt. HRIF hemmte in signifikanter Weise die HRF-induzierte Histamin-Freisetzung, war aber nicht in der Lage, die Histamin-Freisetzung durch Allergen, anti-IgE, Concanavalin A, PMA und C5A zu beeinflussen.
Fig. 10: Bildung von HRIF durch MNC von allergischen Patienten ohne (10A) oder mit (10B) Immunotherapie. Fünf symptomatische allergische Patienten, die sich nie einer Immunotherapie unterzogen hatten, und acht allergische Patienten, die einer Immunotherapie mit Aufrechterhaltungsdosen unterzogen wurden, wurden untersucht. MNC wurden isoliert und mit Histamin (10&supmin;&sup8; M) gemäß den Angaben in Fig. 2 gezüchtet. Die HRIF-Aktivität wurde bei einer Verdünnung von 1:6 unter Anwendung der HRF-induzierten Histamin-Freisetzung bestimmt. Die Kontroll-Histamin-Freisetzung lag im Bereich von 20 bis 44%. Zellen von drei der fünf Personen der unbehandelten Gruppen ergaben keine HRIF-Freisetzung, während die behandelte Gruppe HRIF im Bereich von normalen Personen (dargestellt in Fig. 2) synthetisierte. Für Fig. 10C, die einen Vergleich der HRIF-Bildung von Zellen gesunder Personen, allergischer Patienten und allergischer Patienten mit Immunotherapie darstellt, wurden die in Beispiel III beschriebenen Versuche durchgeführt.
Fig. 11: HRIF-induzierte Hemmung der Histamin-Freisetzung aus bronchoalveolaren Mastzellen, die aus Spülflüssigkeit isoliert wurden. Zellen aus der Spülung wurden gewaschen und mit Histamin-stimuliertem MNC-Überstand vorinkubiert und sodann mit HRF angeregt. Die Ergebnisse sind als prozentuale Hemmung der Histamin-Freisetzung angegeben. Die HRF-induzierte Histamin-Freisetzung betrug im Versuch 1 18% und im Versuch 2 38%.
Fig. 12: Proben von nicht-konzentrierter bronchoalveolarer Spülung (BAL) wurden auf die Hemmung der HRF-induzierten Histamin-Freisetzung unter Verwendung von Basophilen von zwei allergischen Spendern und einer gesunden Person getestet. Die Kontroll-Histamin-Freisetzung durch HRF beim Hemmtest lag im Bereich von 20-40%.
Fig. 13: Einfluß von Dialyse auf die Hemmung der Histamin-Freisetzung durch BAL-Flüssigkeiten. Proben von BAL-Flüssigkeiten von normalen Personen und asthmatischen Patienten wurden über Nacht gegen Puffer unter Verwendung von Spectrapor-Dialysemembranen (MG-Ausschlußgrenze 3500) dialysiert und sodann erneut auf die Hemmung der HRF-induzierten Histamin- Freisetzung aus Basophilen einer gesunden Person getestet. Die Kontroll- Histamin-Freisetzung lag im Bereich von 25-40%.
Fig. 14: Dosisabhängige Hemmung von HRF-induzierter Histamin-Freisetzung durch Proben von dialysierten BAL-Flüssigkeiten. Basophile einer gesunden Person wurden mit Verdünnungen von drei unterschiedlichen dialysierten BAL-Proben vorinkubiert und sodann mit HRF angeregt.
Die Kontroll-Histamin-Freisetzung in diesem Versuch betrug 25%.
Fig. 15: Einfluß von undialysierten (U) und dialysierten (D) BAL- Flüssigkeiten auf die Histamin-Freisetzung durch FMLP, anti-IgE und Con A.
Basophile einer normalen Person wurden mit Proben von BAL-Flüssigkeiten vorinkubiert und sodann mit anti-IgE (Verdünnung 10&supmin;&sup4;), Con A (15 µg/ml) und FMLP (10&supmin;&sup5; M) angeregt. Die Kontroll-Histamin-Freisetzung durch sekretionsanregende Mittel lag im Bereich von 20-50%.
Fig. 16: Gelfiltrationsprofil einer konzentrierten BAL-Probe. BAL- Flüssigkeit einer normalen Person wurde 33-fach konzentriert. Eine 3 ml- Probe wurde auf eine Sephadex G-50 enthaltende Säule aufgesetzt. Die Proben wurden auf ihre HRIF-Aktivität unter Verwendung von Basophilen einer normalen Person abgesucht. Ein ähnliches Elutionsprofil ergab sich in drei getrennten Versuchen.
Fig. 17: Einfluß von Milchsäurebehandlung von Basophilen auf BAL- HRF-induzierte Histamin-Freisetzung. Von einem allergischen Asthmapatienten isolierte Basophile (Gruppe A und Gruppe B) wurden 3,5 min mit Milchsäure behandelt und sodann gewaschen und entweder mit Serum eines weiteren allergischen Asthmapatienten (BW) oder einer normalen Person (RA) resensibilisiert. Die Zellen wurden sodann mit konzentrierten Proben von BAL (Gruppe A) oder anti-IgE (Gruppe B) angeregt.
In einem weiteren Satz von Versuchen wurden Basophile einer atopischen asymptomatischen Person in ähnlicher Weise wie oben behandelt und sodann mit dem allergischen oder normalen Serum (Gruppe C) resensibilisiert. Die Zellen wurden anschließend mit einer Probe von konzentrierter BAL angeregt.
Fig. 18: Dosisabhängige Reaktion der Hemmung von Basophilen- Histamin-Freisetzung durch den Überstand von zwei Zellinien (A-MLB und A- RA). Beide Zellinien stammten von mononuklearen Zellen, die mit einem spezifischen Antigen (Staubmilbe) stimuliert waren, und wurden in einem definierten Medium (20% konditioniertes Medium mit einem Gehalt an T- Zellwachstumsfaktor, erhalten von der Fa. Cellular Products, Inc. und 10% fötales Kälberserum in RPMI) gehalten. Der dialysierte Kulturüberstand wurde in verschiedenen Verdünnungen auf die Hemmung der HRF-induzierten Histamin-Freisetzung aus Basophilen gemäß den vorstehenden Angaben getestet. Die Kontroll-Histamin-Freisetzung betrug 20%. Die mäßige Hemmwirkung von konditioniertem Medium und 10% fötalem Kälberserum ist ebenfalls angegeben. Unglücklicherweise gingen diese beiden Zellinien durch Kontamination verloren.
Fig. 19: Zeitlicher Verlauf der Bildung von HRIF ( ---- ) und HRF (o----o) durch die Zellinie JW-RW. Mononukleare Zellen eines der Immunotherapie mit Ambrosia-Pollen unterliegenden Patienten wurden an einem Ficoll-Hypaque-Gradienten isoliert, in RPMI-1640 plus Glutamin, Penicillin, Streptomycin plus 15% hitzeinaktiviertes fötales Kälberserum resuspendiert und 2 Wochen bei 37ºC mit Ambrosia-Antigen in Corning-25 cm²-Gewebekulturkolben stimuliert. Anschließend wurden die Zellen erneut in frischem Medium mit einem Gehalt an 10 Einheiten pro ml humanem rekombinantem Interleukin 2 (rIL-2) und mit Mitomycin C behandelten heterologen Feeder-Zellen gezüchtet. Während der dritten und sechsten Züchtungswoche wurden die Zellen mit Ambrosia-Pollen restimuliert.
Fig. 20: Zeitlicher Verlauf der Bildung von HRIF ( ---- ) und HRF (o----o) durch die Zellinie WP-RW. Mononukleare Zellen eines der Immunotherapie mit Ambrosia-Pollenextrakten unterliegenden Patienten wurden gemäß Fig. 13 isoliert, mit der Ausnahme, daß Antigen-bindende T-Zellen durch Rosettenbildung mit AET-behandelten Schaferythrozyten und Schwenken auf einer mit Ambrosia beschichteten Petri-Schale angereichert wurden.

Äusführliche Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform

Die vorliegende Erfindung beschreibt die Identifizierung eines humanen Cytokins, das als Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor (HRIF) bezeichnet wird. Wie nachstehend näher erörtert, handelt es sich bei diesem antiallergischen Cytokin um einen proteinartigen Faktor, der zur Hemmung der durch HRF vermittelten Freisetzung von allergischen Mediatoren aus humanen, Histamin enthaltenden, proallergischen Zellen befähigt ist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann eine Histamin enthaltende, proallergische Zelle als eine Zelle des Immunsystems, die Histamin enthält, definiert werden.
Die Untersuchungen, die zur vorliegenden Erfindung führten, waren auf die Feststellung gerichtet, ob Leukozyten aktive Substanzen, die allergische Reaktionen hemmen, bilden. In früheren Versuchen haben einige der vorliegenden Erfinder einen Faktor (bezeichnet als "HRF") aufgefunden, der die Freisetzung von Histamin und Leukotrienen aus Basophilen und Mastzellen bewirkt. In der vorliegenden Beschreibung berichten die Erfinder nunmehr über das Auffinden eines neuen antiallergischen Cytokins (HRIF), das zur Hemmung der Wirkungen von HRF befähigt ist. Von einer spezifischen Hemmung von HRF durch HRIF wird angenommen, daß sie einen wichtigen physiologischen Mechanismus zur Regulierung der Freisetzung von allergischen Mediatoren aus Basophilen und Mastzellen darstellt. In vivo gebildetes HRIF kann einen kritischen endogenen Inhibitor der allergischen Empfindlichkeit darstellen. Es wird erwartet, daß sich die Verabreichung von exogenem HRIF als wertvoll bei der Behandlung von Asthma, anderen allergischen Erkrankungen und Störungen, an deren Pathogenese vermutlich Mastzellen und Basophile beteiligt sind, erweist. HRIF kann besonders wertvoll sein, da es durch humane Zellen gebildet werden kann und für Menschen besser verträglich ist als nicht-humane Arzneistoffe und Substanzen. Ferner ist es wahrscheinlich, daß die Konzentrationen dieses Cytokins in Blut, Serum und anderen biologischen Flüssigkeiten oder die in vitro-Synthese von HRIF durch Blutzellen mit dem klinischen Zustand korreliert und die Basis zur Entwicklung von klinischen Tests (wie Immunoassays) bietet, die sich zur Überwachung von Patienten vor und nach der Immunotherapie eignen.
Daher wird gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein in wesentlichem Umfang gereinigter, humaner Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor bereitgestellt. Dieser Faktor kann allgemein als ein Antagonist von HRF definiert werden, d. h. der Faktor ist befähigt, die Wirkungen von HRF zu hemmen, beispielsweise die durch HRF induzierte Histamin-Freisetzung.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die einen in wesentlichem Umfang gereinigten proteinartigen Faktor enthält, der biologische Eigenschaften aufweist, zu denen die Hemmung der allergischen Mediator-Freisetzung aus humanen Mastzellen oder Basophilen, die durch HRF getriggert wird, gehört.
Obgleich der gemäß dieser Ausführungsform beanspruchte Faktor als ein proteinartiger Faktor beschrieben wird, weiß der Fachmann auf dem Gebiet der Biologie natürlich, daß diese Ausdrucksweise nicht notwendigerweise bedeutet, daß der Faktor vollständig aus Protein besteht. Tatsächlich enthalten zahlreiche biologisch aktive Substanzen ein Protein, das chemisch an einen anderen Verbindungstyp, beispielsweise an einen Kohlenhydrat- oder Lipidrest, gebunden ist. Für den Fachmann ist es ersichtlich, daß der Ausdruck "proteinartig" Verbindungen, wie Glycoproteine, Lipoproteine und dergl., umfassen soll.
Außerdem ist es für den Fachmann ersichtlich, daß Mastzellen und Basophile eine Anzahl von Enzymen und pharmakologischen Wirkstoffen, einschließlich Histamin und Leukotriene, enthalten, die allgemein als allergische Mediatoren bezeichnet werden. Von HRF wurde früher gezeigt, daß es die Freisetzung von mindestens zwei dieser Mediatoren, nämlich von Histamin und Leukotrienen, vermittelt (vgl. Ezeamuzie und Assem, Agents Actions, Bd. 13 (1983) , S. 222; auf diese Druckschrift wird durch Verweis Bezug genommen). Obgleich der genaue biologische Mechanismus, nach dem HRIF seine Aktivität ausübt, nicht vollständig geklärt ist, wird angenommen, daß er eine Gegenwirkung gegen die durch HRF induzierten Wirkungen ausübt. Obgleich die Erfinder einen Histamin-Freisetzungstest gewählt haben, um die antiallergische Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindung nachzuweisen, ist es daher wahrscheinlich, daß die Verbindung auch die Freisetzung von anderen Mediatoren, z. B. von Leukotrienen, deren Freisetzung ebenfalls durch HRF-Auslösung in den entsprechenden Zellen induziert wird, hemmt. Selbstverständlich ist darauf hinzuweisen, daß aufgrund der Tatsache, daß Histamin selbst ein starker allergischer Mediator ist, die Fähigkeit zur Hemmung der HRF-induzierten Histamin-Freisetzung vollkommen ausreicht, um einen proteinartigen Faktor unter die Ansprüche der vorliegenden Erfindung fallen zu lassen.
Schließlich ist der proteinartige Faktor in der Weise charakterisiert, daß er die allergische Mediator-Freisetzung aus humanen Mastzellen und Basophilen, die durch den Histamin-Freisetzungsfaktor "getriggert" wird, hemmt. Obgleich angenommen wird, daß der Ausdruck "getriggert durch" für den Fachmann selbsterklärend ist, kann eine kurze Definition dieses Ausdrucks einer mit diesem Gebiet nicht so gut vertrauten Person das Verständnis der Erfindung erleichtern. "Triggern" ist ein auf diesem Gebiet gebrauchter Ausdruck, um eine Behandlung von Basophilen oder Mastzellen zu beschreiben, mit der die Freisetzung von allergischen Mediatoren induziert wird. Allgemein ausgedrückt wird eine Zelle mit einem Mittel "getriggert", wenn sie mit diesem Mittel unter solchen Bedingungen behandelt wird, die normalerweise Mastzellen oder Basophile zur Freisetzung von allergischen Mediatoren, wie Histamin, veranlassen. Diese Freisetzung kann mit einer explosiven Degranulierung oder durch nicht-zytotoxische Sekretion von bestimmten Mediatoren erfolgen. Es ist lediglich erforderlich, daß die Zellen einen allergischen Mediator freisetzen, wenn sie mit dem speziellen, in Frage stehenden Mittel "getriggert" werden (diesem Mittel ausgesetzt werden). Es ist darauf hinzuweisen, daß das Triggern experimentell im Laboratorium oder klinisch in vivo erfolgen kann. Selbstverständlich stellt die vorliegende Erfindung einen Faktor bereit, der die allergische Mediator-Freisetzung hemmt. Die Ausdrucksweise, daß Zellen mit einem Mittel "getriggert" werden, wenn die allergische Mediator-Freisetzung tatsächlich gehemmt wird, könnte somit als paradox angesehen werden. Für die Zwecke der Erfindung wird der Ausdruck "getriggert mit" einem Mittel so definiert, daß er die Exposition mit dem Mittel in der Weise betrifft, daß die Freisetzung von Histamin oder einem allergischen Mediator unter solchen Bedingungen induziert wird, bei denen sich in Abwesenheit einer wirksamen Menge eines derartigen Inhibitors eine Freisetzung ergibt.
Die Erfinder haben gezeigt, daß der erfindungsgemäße Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor folgendermaßen charakterisiert werden kann: Molekulargewicht etwa 8000-10 000 Dalton, bestimmt durch Gelausschlußchromatographie. Außerdem wurde in einigen Versuchen eine zweite Spezies mit einem Molekulargewicht von etwa 20 000 bis 30 000 Dalton beobachtet. Jede dieser Spezies wird als Ausführungsform im Rahmen der vorliegenden Erfindung angesehen. Selbstverständlich ist es für den Fachmann ersichtlich, daß eine Gelfiltrationschromatographie keine exakte Molekulargewichtsbestimmung liefert, sondern vielmehr ein Molekulargewicht auf der Basis der Position ergibt, mit der die entsprechende Inhibitoraktivität von einem Gel zur Größenbestimmung relativ zur Position von Markern bekannten Molekulargewichts eluiert wird. Daher wird zwar angenommen, daß diese Molekulargewichtsbestimmung einen vernünftigen Genauigkeitsgrad aufweist, daß aber das Molekulargewicht des erfindungsgemäßen tatsächlichen proteinartigen Faktors je nach den angewandten experimentellen Bedingungen in gewissem Umfang variieren kann, beispielsweise in Abhängigkeit von der Ausschlußgrenze des Gels, der Säulengröße und der eingesetzten speziellen Gelfiltrationsmethode. Selbstverständlich gibt es andere Verfahren zur Bestimmung des Molekulargewichts, beispielsweise die Gelelektrophorese oder die Hochdruck-Flüssigchromatographie. Es ist daher darauf hinzuweisen, daß bei Anwendung unterschiedlicher Meßbedingungen das Molekulargewicht von HRIF in gewissem Umfang variieren kann. Der Faktor ist ferner dadurch definiert, daß er durch eine Dialysemembran mit einer Molekulargewichts-Ausschlußgrenze von etwa 3500 zurückgehalten wird. (Dies bedeutet, daß die Dialysemembran im allgemeinen für Moleküle mit einem Molekulargewicht von mehr als etwa 3500 Dalton undurchlässig ist).
Ferner wurde festgestellt, daß der Faktor in wesentlichem Umfang durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt werden kann. Beispielsweise haben die Erfinder gezeigt, daß HRIF im Gegensatz zu HRF an DEAE-Cellulose (DE-52) (ein Ionenaustauscherharz), die mit 1 mM Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,4 äquilibriert ist, bindet. Die Aktivität kann aus dem Gel mit etwa 100 mM bis 200 mM NaCl im gleichen Puffer eluiert werden.
Ferner wurden verschiedene andere charakteristische Eigenschaften des Faktors identifiziert. Beispielsweise wird die Hemmung der allergischen Mediator-Freisetzung signifikant verringert, wenn Präparate mit einem Gehalt an dem antiallergischen Faktor mit Trypsin oder Chymotrypsin, Enzyme, von denen bekannt ist, daß sie Proteinmoleküle an speziellen Stellen spalten, behandelt werden. Daher besteht eine charakteristische Eigenschaft des Faktors in der Labilität der antiallergischen Aktivität gegenüber einer Behandlung durch Chymotrypsin oder Trypsin. Der hier verwendete Ausdruck "Labilität" wird als der Verlust von wesentlicher biologischer Aktivität im Anschluß an die angegebene Behandlung gemäß der Definition in der vorliegenden Beschreibung definiert, während der hier verwendete Ausdruck "Stabilität" als Beibehaltung einer erheblichen biologischen Aktivität im Anschluß an die angegebene Behandlung definiert ist. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann ferner durch ihre biologische Stabilität im Anschluß an eine Behandlung mit Neuraminidase oder an eine 1-stündige Wärmebehandlung bei 60ºC oder einen 4-fachen Einfrier- und Auftauzyklus definiert werden.
Der Faktor wurde mit verschiedenen anderen humanen, biologischen Faktoren, die allgemein als "Cytokine" bezeichnet werden, verglichen. Bei direktem Vergleich mit handelsüblichen Präparaten von rekombinanten Interleukinen 1, 2 und 4 sowie von gamma-Interferon 3, Tumor-Necrosefaktor und GM-Kolonienstimulationsfaktor, wurde festgestellt, daß nur der Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor die Freisetzung von Histamin aus Basophilen, die durch den Histamin-Freisetzungsfaktor getriggert worden sind, blockieren kann. Der erfindungsgemäß beschriebene Faktor unterscheidet sich ferner von den vorerwähnten Cytokinen (Interleukine 1, 2 und 4 und gamma-Interferon) insofern, daß eine Spezies ein geringeres scheinbares Molekulargewicht, nämlich 8000 bis 10 000 Dalton, bei Bestimmung durch Gelausschlußchromatographie aufweist.
Es wurde betont, daß der erfindungsgemäße Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor offensichtlich recht spezifisch ist. Bei Behandlung von Basophilen oder Mastzellen mit einer diesen Faktor enthaltenden Zusammensetzung und bei anschließendem Triggern mit dem Histamin-Freisetzungsfaktor wird die Histamin-Freisetzung signifikant gehemmt. Dies bedeutet, daß die Histamin-Freisetzung aus mit dem Faktor behandelten Zellen signifikant niedriger ist als die Histamin-Freisetzung, die beobachtet wird, wenn die Zellen nur mit HRF allein behandelt werden. Jedoch haben die Erfinder festgestellt, daß dann, wenn Zellen mit HRIF behandelt und anschließend mit anderen Mitteln, von denen bekannt ist, daß sie allergische Mediatoren freisetzen, wie Allergen, anti-IgE (wobei IgE an Fc-Rezeptoren an der Zelloberfläche gebunden ist), Concanavalin A, Phorbol-myristat-acetat oder C5a, getriggert werden, keine Hemmung der Histamin- Freisetzung beobachtet wird. Daher wird der erfindungsgemäße proteinartige Faktor allgemein durch seine Hemmung der Histamin-Freisetzung, die ansonsten durch Triggern der Zellen mit dem Histamin-Freisetzungsfaktor induziert würde, definiert. Speziellere Ausführungsformen beziehen sich auf die mangelnde Fähigkeit des Faktors, die durch andere getestete, spezifische, sekretionsanregende Mittel induzierte Histamin-Freisetzung zu hemmen.
Wie es jedoch für den Fachmann ersichtlich ist, gibt es eine Anzahl von Mitteln, die für ihre Vermittlung der Histamin-Freisetzung bekannt sind, aber von den Erfindern noch nicht getestet worden sind, beispielsweise Verbindung 48/80, Calcium-ionophor A23187, Eosinophilen-abgeleitetes, überwiegendes basisches Protein, Neurotransmitter, wie Substanz P, Glycosylierungsverstärkungsfaktor und dergl., und es ist gut möglich, daß der erfindungsgemäße Faktor die durch diese Mittel induzierte Histamin- Freisetzung hemmt. Daher sollte die Erörterung der Anmelderin bezüglich der Spezifität des antiallergischen Faktors nicht so interpretiert werden, daß damit eine absolute Spezifität gemeint ist, da der erfindungsgemäße Faktor noch nicht mit sämtlichen möglichen Mitteln, die die Histamin-Freisetzung auslösen, getestet worden ist. Auf jeden Fall fällt eine Verbindung mit den charakteristischen Eigenschaften der erfindungsgemäßen Verbindung, von der gezeigt wird, daß sie die Histamin-Freisetzung, die durch ein weiteres, von den Erfindern noch nicht getestetes Mittel induziert wird, hemmt, unter den Umfang der vorliegenden Erfindung. Ferner ist zu betonen, daß für eine Anzahl von Cytokinen das Vorliegen von mehrfachen biologischen Funktionen gezeigt worden ist. Somit werden andere biologische Aktivitäten von HRIF, die möglicherweise später identifiziert werden, von der vorliegenden Erfindung umfaßt.
Die erfindungsgemäße Zusammensetzung kann durch Züchtung von mononuklearen Zellen unter bestimmten Bedingungen oder durch Entwicklung einer speziellen Zellinie, von der gezeigt werden kann, daß sie den Faktor bildet, hergestellt werden. Die Erfinder haben den Faktor auf beiden Wegen hergestellt.
Im allgemeinen erscheint eine Herstellung aus Kurzzeitkulturen von mononuklearen Zellen derzeit die beste Möglichkeit zu sein. Dieses Verfahren umfaßt allgemein die Isolierung von Leukozyten einer Person, die Herstellung einer mononuklearen Zellfraktion aus dem Leukozytenpräparat und die Züchtung der Zellen in einem geeigneten Medium unter Bildung eines konditionierten Überstands. Dieser konditionierte Überstand kann sodann selbst als Quelle für HRIF eingesetzt werden oder er kann anschließend fraktioniert werden, um ein im wesentlichem Umfang gereinigtes Präparat zu bilden.
Aufgrund ihrer leichten Zugänglichkeit werden periphere Blutleukozyten als Leukozytenquelle bevorzugt. Der Fachmann erkennt jedoch, daß auch verschiedene andere Leukozytenpräparate verwendet werden können. Beispielsweise ist es ebenso wahrscheinlich, daß humane Splenozyten eine annehmbare Quelle für Leukozyten darstellen, sowie humane mononukleare Zellen, die sich durch eine Drainage des Milchbrustgangs, durch Lymphknotenbiopsie, Biopsie der tonsillaren Lymphknoten und dergl. ergeben. Im allgemeinen ist es bei Verwendung von peripherem Blut als Leukozytenquelle wünschenswert, das periphere Blut vor der Züchtung zu fraktionieren, um eine mononukleare Zellfraktion zu erhalten, die hier als Zellsuspension mit eine Gehalt an vorwiegend mononuklearen Zellen definiert wird. Dies wird besonders leicht erreicht, indem man die Zellen durch einen Ficoll- Hypaque-Gradienten gemäß dem Verfahren von Boyum, Scand J. Clin. Lab. Invest., Bd. 21, Suppl. Nr. 97 (1968), S. 77 zentrifugiert.
Selbstverständlich können weitere, dem Fachmann geläufige Verfahren, z. B. die Zellsortierung durch Durchflußzytometrie, die zentrifugale Gegenstromaufschlämmung, die positive oder negative Auswahl unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen Zelloberflächenmarker oder die Percoll-Gradientenzentrifugation, ebenfalls zur Herstellung einer mononuklearen Zellfraktion verwendet werden. Ferner können einige Quellen für humane Leukozyten, wie Lymphknoten, von Natur aus eine überwiegend mononukleare Zellfraktion enthalten, so daß Verfahren entsprechend den vorstehenden Ausführungen nicht erforderlich sind. Beispielsweise können Lymphknotenzellen vom Lymphknoten abgestreift, in einem geeigneten Puffer gewaschen und direkt in die Kultur eingeführt werden, während Splenozyten in einfacher Weise zur weitgehenden Entfernung von Erythrozyten behandelt, in einem geeigneten Puffer gewaschen und sodann direkt in die Kultur eingeführt werden können. Jedoch ist es bei Verwendung von peripheren Blutzellen als Quelle für die Leukozyten bevorzugt, daß die mononukleare Zellfraktion durch Ficoll-Hypaque-Zentrifugation gemäß den vorstehenden Angaben hergestellt wird.
Nachdem eine mononukleare Zellfraktion erhalten worden ist, wird sie in einem geeigneten Medium gezüchtet, um einen konditionierten Überstand zu bilden. Ein bevorzugtes Medium ist RPMI-1640 unter Ergänzung mit 10 mM Hepes-Puffer, 4 mM Glutamin, 5 x 10&supmin;&sup6; M 2-Mercaptoethanol und verschiedenen Antibiotika, wie Penicillin und Streptomycin. Selbstverständlich ist es für den Fachmann ersichtlich, daß es eine Anzahl von Gewebekulturmedien gibt, die sich für die Züchtung von humanen Lymphoidzellen eignen (beispielsweise Eagle-Minimal-Essentiell-Medium, modifiziertes Dulbecco- Medium oder modifiziertes Iscove-Medium und dergl.). Ein Ersatz eines Gewebekulturmediums durch ein anderes gehört zum Wissen des Fachmanns. Im allgemeinen werden besonders günstige Ergebnisse erzielt, wenn die Zellen 24 Stunden bei 37ºC in einem angefeuchteten Inkubator mit einem Gehalt an 5% CO&sub2; gezüchtet werden. Die Erfinder haben festgestellt, daß die optimale Zelldichte der in die Kultur eingeführten Zellen 3 x 10&sup6; pro ml beträgt. Selbstverständlich kann der Fachmann feststellen, daß bestimmte Kulturbedingungen in gewissem Umfang modifiziert werden können, ohne die Faktorherstellung in signifikanter Weise zu beeinträchtigen. Beispielsweise kann es möglich sein, die Zellen bei einer höheren Dichte für eine kürzere Zeitspanne oder umgekehrt bei einer geringeren Dichte für eine längere Zeitspanne zu züchten. Derartige Modifikationen fallen unter den Umfang der vorliegenden Erfindung.
Die Erfinder haben jedoch klar festgestellt, daß die Zugabe von Histamin zum Kulturmedium in signifikanter Weise die allergische Mediator-Freisetzungs-Inhibitoraktivität des konditionierten Überstands erhöht. Aus diesem Grund ist es besonders bevorzugt, daß Histamin vorzugsweise in einer Konzentration von 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;¹&sup0; M dem Kulturmedium zugesetzt wird. Obgleich der genaue Mechanismus, nach dem Histamin die HRIF- Bildung erhöht, nicht vollständig bekannt ist, ist es möglich, daß Histamin bevorzugt die Synthese von HRIF induziert, während es die Synthese von HRF verringert. Die Synthese von HRIF wird auch gesteigert, wenn MNC in Gegenwart von Mitogenen (speziell Concanavalin A) oder von Allergenen (beispielsweise Staubmilben oder Ambrosia-Pollen-Allergenextrakte) gezüchtet werden. Im letztgenannten Fall sollten die mit Allergenen gezüchteten Zellen von allergischen Spendern stammen. Es wird angenommen, daß sich die Synthese von HRIF auch ergibt, wenn Zellen mit anderen Mitogenen und Allergenen gezüchtet werden.
Nachdem die Zellen für die erforderliche Zeitspanne gezüchtet worden sind, wird aus der Zellkultur ein konditionierter Überstand hergestellt. Die Herstellung des konditionierten Überstands ist recht einfach und kann auf zahlreichen Wegen erfolgen. Ein besonders einfaches Verfahren zur Herstellung des konditionierten Überstands besteht darin, die gezüchteten Zellen auf den Boden des Züchtungsgefäßes absetzen zu lassen und sodann die oberhalb der Zellen verbleibende Flüssigkeit zu entfernen. Alternativ besteht die Möglichkeit, die Zellsuspension zu zentrifugieren, die Zellen zu pelletisieren und den konditionierten Überstand zu dekantieren.
Obgleich für den auf die vorstehende Weise gebildeten konditionierten Überstand in konsistenter Weise gezeigt worden ist, daß er eine HRIF- Aktivität enthält, kann es in einigen Fällen wünschenswert sein, den Überstand zu fraktionieren, um eine Fraktion zu erhalten, in der der Faktor in einer stärker gereinigten Form vorliegt. Selbstverständlich ist es dann, wenn der Überstand von einer Zellkultur mit einem Gehalt an zugesetztem Histamin stammt, wichtig, die Histaminkonzentration im Überstand in wesentlichem Umfang zu verringern, so daß sie den zum Nachweis des Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktors eingesetzten Histamin-Freisetzungstest nicht stört. Daher ist es häufig wünschenswert, ein Verfahren zur weitgehenden Entfernung von Histamin aus dem Kulturüberstand anzuwenden, insbesondere wenn ein derartiger Kulturüberstand nicht durch Verfahren fraktioniert wird, die selbst zu einer Trennung des antiallergischen Faktors vom Histamin führen. Dies wird auf besonders einfache Weise erreicht, indem man den Kulturüberstand gemäß den Angaben im nachstehenden Beispiel I dialysiert.
Der Überstand kann sodann fraktioniert werden, um ein in wesentlichem Umfang gereinigtes Präparat von HRIF zu bilden. Ein bevorzugtes Verfahren zum Fraktionieren des Überstands umfaßt die Fraktionierung auf der Basis des Molekulargewichts. Dem Fachmann sind zahlreiche Techniken zur Fraktionierung von Proteinen auf der Basis des Molekulargewichts bekannt, die in einigen Fällen angewandt werden können. Jedoch kann es in zahlreichen Fällen wünschenswert sein, daß die isolierte Proteinfraktion ihre biologische Aktivität behält. Daher ist es allgemein bevorzugt, daß bei dem Fraktionierungsverfahren keine Denaturierung des proteinartigen Faktors erforderlich ist. Aus diesem Grund wird die Gelausschlußchromatographie allgemein als Reinigungsverfahren bevorzugt. Selbstverständlich weiß der Fachmann, daß zahlreiche geeignete Gele zur Reinigung von proteinartigen Molekülen verwendet werden können. Die Erfinder haben festgestellt, daß die Chromatographie an Sephadex G-50-Superfine-Gel ein geeignetes Verfahren zur Fraktionierung des Überstands unter Bereitstellung einer an HRIF angereicherten Fraktion darstellt.
Alternativ kann der Überstand durch Ionenaustauschchromatographie fraktioniert werden. Unter den angewandten experimentellen Bedingungen (1 mM Phosphatpuffer, pH-Wert 7,4) wurde HRIF an DEAE (DE-52)-Cellulose gebunden und vom Harz mit etwa 100 mM bis 200 mM NaCl im gleichen Puffer eluiert. Selbstverständlich ist ersichtlich, daß unter Berücksichtigung der Erkenntnisse der Erfinder auch andere Harze, bindende Puffer und Elutionspuffer verwendet werden können, um einen konditionierten Überstand mit einem Gehalt an HRIF zu fraktionieren und somit eine Fraktion mit einem Gehalt an HRIF zu bilden, das im wesentlichen von anderen Faktoren, die vermutlich im Überstand vorhanden sind, gereinigt worden ist. Beispielsweise haben die Erfinder gezeigt, daß die HPLC-Ionenaustauschchromatographie ebenfalls zur Reinigung des Faktors geeignet ist.
Der ausgewählte Zellüberstand oder Fraktionen davon werden sodann auf die Histamin-Freisetzungs-Inhibitor-Aktivität getestet. Im allgemeinen werden bei diesem Verfahren in bezug auf Basophile oder Mastzellen angereicherte Zellpräparate von menschlichen Spendern verwendet. Diese Zellen können gemäß bekannten Verfahrensweisen isoliert werden. Wenn beispielsweise Basophile als Testzellen verwendet werden, können die in bezug auf Basophile angereicherten Präparate aus peripherem Blut durch Sedimentation mit Hydroxyethylstärke gemäß dem Verfahren von Thueson et al., J. Immunol., Bd. 123 (1979), S. 626 hergestellt werden. Mastzellen lassen sich durch bronchoalveolare Spülung von Personen mit Bronchialasthma im wesentlichen gemäß den Angaben von Bernstein et al., J. Allergy Clin. Immunol., Bd. 76 (1985), S. 145 erhalten. Die Erfinder haben auch festgestellt, daß HRIF in bronchoalveolarer Spülflüssigkeit gewonnen werden kann und leichter in Flüssigkeiten von normalen Personen als von solchen mit Bronchialasthma nachgewiesen werden kann. Dieser Befund stützt die physiologische Rolle von HRIF bei der Verhinderung der Entwicklung von allergischen Störungen, wie Bronchialasthma.
Der tatsächliche Test für den Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor wird nachstehend beschrieben. Im allgemeinen werden Zellen entweder einem Aliquotanteil eines Kontrollpuffers oder einem Aliquotanteil des zu testenden Überstands oder der zu testenden Überstandsfraktion ausgesetzt. Die Zellen werden sodann mit HRF unter standardisierten experimentellen Bedingungen, von denen vorher gezeigt worden ist, daß sie sich zur Messung der durch HRF induzierten Histamin-Freisetzung eignen, getriggert; vgl. z. B. Thueson et al., J. Immunol., Bd. 123 (1979), S. 626 und 633. Die Menge des durch die beiden Sätze von Proben freigesetzten Histamins wird sodann gemäß bekannten Verfahrensweisen bestimmt (vgl. Siraganian, J. Immunol. Methods, Bd. 7 (1975), S. 283 und Verburg et al., Life Sciences, Bd. 32 (1983), S. 2855), und die Hemmung der Histamin-Freisetzung wird gemäß den Angaben in Beispiel I berechnet.
Selbstverständlich ist, wie vorstehend angegeben, die Isolierung von HRF aus einer Anzahl von Quellen bereits früher beschrieben worden. Obgleich es wahrscheinlich ist, daß diese anderen Quellen für HRF in erfolgreicher Weise im vorstehenden Test unter möglichen routinemäßigen Modifikationen der experimentellen Bedingungen eingesetzt werden können, haben die Erfinder in erfolgreicher Weise HRF gemäß den Angaben in Beispiel I hergestellt. Demgemäß wird dieses HRF-Präparat zur Verwendung im Test bevorzugt.
Zusätzlich zur Beschreibung der Isolierung von HRIF aus humanen mononuklearen Zellkulturen haben die Erfinder auch mehrere humane Zellinien erzeugt, die den Faktor bilden. Mehrere Verfahrensweisen wurden zur Erzeugung dieser Zellinien herangezogen. Beispielsweise wurden in einem Fall zwei HRIF bildende Zellinien erzeugt, indem man mononukleare Zellen von unter Immunotherapie mit speziellen Allergenen stehenden allergischen Patienten stimulierte und die Zellen in einem definierten Medium mit einem Gehalt an dem T-Zellwachstumsfaktor sowie an mit Mitomycin behandelten heterologen Feeder-Zellen hielt. Gemäß einer besonders bevorzugten Verfahrensweise werden die mononuklearen Zellen von unter Immunotherapie stehenden Patienten isoliert und in vitro mit mindestens einer antigenen Komponente der zur Behandlung des speziellen Patienten eingesetzten immunotherapeutischen Suspension restimuliert. Diese in vitro-Stimulation wird etwa 2 Wochen fortgesetzt. Anschließend können die Zellen durch Züchtung mit humanem rekombinantem Interleukin-2 und mit Mitomycin behandelten Feeder-Zellen gehalten werden. Bei einer bevorzugten Vorgehensweise werden die Zellen weitere 2 mal durch Antigen restimuliert. Bei einer dritten Vorgehensweise werden antigenbindende T-Zellen aus mononuklearen Zellen durch Rosettenbildung mit AET-behandelten Schaferythrozyten und Schwenken der Zellen in mit Allergen beschichteten Petri-Schalen im wesentlichen gemäß den Angaben von Pellegrino et al., Clin. Immunol. Immunopath., Bd. 3 (1975), S. 324 und Taniguchi und Miller, J. Exp. Med., Bd. 146 (1977), S. 1450, isoliert. Anschließend werden die Zellen in periodischen Abständen mit einem spezifischen Allergen stimuliert und mit Interleukin-2 und Feeder-Zellen gehalten. Diese Verfahrensweisen sind in Beispiel V ausführlicher beschrieben.
Da es wahrscheinlich ist, daß der erfindungsgemäße antiallergische Faktor vorwiegend als therapeutisches Mittel zur Behandlung von allergischen Erkrankungen verwendet wird, umfaßt die Erfindung auch Verfahren zur Hemmung der Freisetzung von allergischen Mediatoren aus humanen Basophilen oder humanen Mastzellen, indem man die Zellen einer Zusammensetzung mit einem Gehalt an einer wirksamen Menge des Faktors aussetzt. Die Menge läßt sich empirisch im Laboratorium durch ähnliche Verfahrensweisen wie in Beispiel I, durch klinische Versuche und durch andere, dem Fachmann geläufige Maßnahmen bestimmen.
Selbstverständlich kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung auch mit einem geeigneten pharmazeutischen Verdünnungsmittel oder Träger zur Herstellung eines antiallergischen Präparats formuliert werden. Zu geeigneten Trägern gehören (ohne Beschränkung hierauf) Humanserumalbumin und Mannit sowie andere dem Fachmann auf dem Gebiet der Pharmazie bekannte Träger. Die zusammensetzung kann auch Konservierungsmittel, wie Phenol und Thimerosal enthalten. Schließlich umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer Person, das die Verabreichung einer therapeutisch verträglichen Dosis eines antiallergischen Präparats mit einem Gehalt an in wesentlichem Umfang gereinigtem HRIF an die Person umfaßt. Im allgemeinen sind empirische Vorgehensweisen erforderlich, um die optimale Dosis zur Behandlung eines speziellen allergischen Zustands festzulegen. Diese Verfahrensweisen sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Pharmazie geläufig und werden unter Angaben von weiteren Einzelheiten in Beispiel VI erläutert.
Ferner kann zukünftig HRIF durch rekombinante DNA-Technik hergestellt werden. Die Klonierung des Gens für HRIF kann auf verschiedenen Wegen vorgenommen werden. Eines der bevorzugten Verfahren besteht in der Isolierung von RNA aus mit Histamin stimulierten MNC. mRNA kann aus der RNA unter Verwendung von oligo-(dT)-Cellulose isoliert und in Frosch- Oozyten übertragen werden. Nachdem die mRNA für HRIF erfaßt worden ist, kann eine cDNA-Bibliothek konstruiert und in Bakterien oder Hefe unter Verwendung eines geeigneten Vektors (z. B. pUC9) übertragen werden. Die Spezifität der cDNA kann durch Hybridisierung mit mRNA aus MNC getestet werden. Nachdem die Spezifität festgestellt worden ist, kann die cDNA sequenziert werden. Obgleich diese Verfahrensweise bevorzugt ist, können andere Verfahren, z. B. die Synthese eines Oligonucleotids aus einer partiellen Aminosäuresequenz, ebenfalls eingesetzt werden.
Die folgenden Beispiele dienen der näheren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

Verfahren zur Herstellung von HRIF

Erzeugung von HRIF durch normale humane mononukleare Zellen

Das folgende Beispiel dient der Erläuterung der Bildung des anitallergischen Cytokins durch normale humane mononukleare Zellen.

A. Reagenzien

Bezugsquellen: RPMI-1640 von GIBCO Laboratories, Grand Island, NY; fötales Kälberserum von HyClone Laboratories, Inc., Logan, UT; Glutamin, 2-Mercaptoethanol, Histamin, Ficoll-Hypaque, Humanserumalbumin (HSA), Phorbol-myristat-acetat, Concanavalin A (Con A), Penicillin, Streptomycin und an Agarose gekuppeltes Trypsin, Chymotrypsin und Neuraminidase von Sigma Chemicals Co., St. Louis, MO; Hepes von Research Organics, Inc., Cleveland, OH; Gewebekulturkolben von Corning Glass Works, Corning, NY; Sephadex G-50-Superfine von Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ; Hydroxyethylstärke (HetaStarch) von American McGaw, Irvine, CA; Spectrapor-Dialyseschläuche von Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA; humanes rekombinantes Interleukin 1, 2 und 4 von Genzyme, Boston, MA; und humanes rekombinantes gamma-Interferon von Collaborative Research, Inc., Bedford, MA; DEAE (DE-52)-Gel von Whatman, Ltd., England; Ambrosia-Pollen-Allergenextrakt von Greer Laboratories, Lenoir, NC; Hausstaubmilben-Allergenextrakt von Hollister-Stier Laboratories, Spokane, WA; Kaninchen-anti-human-IgE-Serum von Behring Diagnostics, Somerville, NY. C5a wurde gemäß den Angaben von Farnam et al., J. Immunol., Bd. 134 (1985), S. 541 hergestellt.

B. Isolierung von mononuklearen Zellen (MNC) aue peripherem Blut

Peripheres venöses Blut wurde gesunden Spendern nach Einholung von deren schriftlichem Einverständnis entnommen. Heparinisiertes Blut wurde mit 2 Volumenteilen Hanks-ausgewogener Salzlösung (HBSS) verdünnt und auf einem Ficoll-Hypaque-Kissen (spezifisches Gewicht 1,077) zentrifugiert. Mononukleare Zellen wurden abgetrennt und 3 mal mit HBSS gewaschen und in einer Konzentration von 5 x 10&sup6; pro ml in RPMI-1640-Medium mit einem Gehalt an 100 Einheiten Penicillin pro ml, 100 µg Streptomycin pro ml, 4 mM Glutamin und 5 x 10&supmin;&sup6; M 2-Mercaptoethanol suspendiert.

C. Isolierung von basophil angereicherten peripheren Blutleukozyten

Basophil angereicherte Leukozyten wurden aus peripherem Blut von normalen oder allergischen Spendern gemäß der folgenden Verfahrensweise isoliert. Venöses Blut von Spendern wurde einer Antikoagulationsbehandlung mit 10 mM EDTA unterworfen und 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 1,5% Hydroxyethylstärke sedimentiert. Der an Leukozyten reiche, lederfarbene Überzug wurde gewonnen und 3 mal in HA-Puffer (10 mM Hepes, pH-Wert 7,4, plus 137 mM NaCl, 5 mM KCl und 0,03% Humanserumalbumin) gewaschen. Die Zellen wurden in einer Kühlzentrifuge (4ºC) 10 Minuten bei 300 x g pelletisiert Die gewaschenen Leukozyten wurden in HACM-Puffer (Hepes- Puffer, pH-Wert 7,4, 0,03% Humanserumalbumin, 2 mM CaCl&sub2; und 1 mM MgCl&sub2;) suspendiert. Das Präparat enthielt etwa 0,5% Basophile. Routinemäßig war es nicht erforderlich, die Basophilen weiter zu reinigen, da diese Zellen praktisch das gesamte Bluthistamin enthalten. Leukozyten aus 1 ml Blut wurden üblicherweise für einen Wiederholungsversuch verwendet.

D. Bildung eines HRF enthaltenden Überstands und Test auf HRF

MNC wurden mit Concanavalin A (25 µg pro ml) 4 Stunden in RPMI-Medium geschüttelt, 2 mal mit HBSS gewaschen, in RPMI-Medium resuspendiert und sodann 72 Stunden gezüchtet. Der Überstand wurde geerntet und unter Verwendung einer Amicon-Ultrafiltrationskammer mit YM-5-Filtern (MG-Ausschlußgrenze 5000) 50-fach eingeengt. Üblicherweise wurden die Überstände aus gezüchteten mononuklearen Zellen, die aus 10-15 Liter Blut erhalten worden waren, vereinigt und sodann auf Gelfiltrationssäulen (Sephadex G- 75) aufgesetzt. Fraktionen mit einem Gehalt an der Histamin-Freisetzungsaktivität (15K-30K-Fraktionen), gemessen durch den Leukozyten-Histamin- Freisetzungstest, wurden vereinigt, in Aliquotanteile unterteilt, auf -70ºC eingefroren und als Quelle für HRF verwendet.
Für den Test wurden Aliquotanteile von 100 µl des Testüberstands mit 100 µl Leukozytensuspension 45 Minuten in einem geschüttelten Wasserbad bei 37ºC inkubiert. Die einzelnen Versuche wurden als Doppelversuche durchgeführt. 400 µl HA-Puffer wurden am Ende der Inkubationsdauer zu jedem Röhrchen gegeben. Die Überstände wurden von den Zellen durch 5-minütige Zentrifugation bei 4ºC und 600 x g abgetrennt. Der Histaminanteil der Überstände wurde unter Verwendung eines automatischen Fluorimetrie- Analysators (Siraganian, J. Immunol., Methods, Bd. 7 (1975), S. 283) gemessen. Eine spontane Histamin-Freisetzung wurde durch Inkubieren der Zellen in HACM-Puffer allein bestimmt. Der gesamte Histamingehalt der Zellen wurde durch Lysieren der Zellen mit 3% Perchlorsäure gemessen. Der prozentuale Anteil der Histamin-Freisetzung wurde gemäß folgender Formel berechnet:
Histamin im Überstand/Gesamthistamin in den Zellen x 100
Die spontane Histamin-Freisetzung aus den Zellen betrug üblicherweise weniger als 5% und wurde von der berechneten Histamin-Freisetzung subtrahiert.
Gemäß einer Modifikation dieser Vorgehensweise wurden mononukleare Zellen von 15 gesunden Spendern allein oder in Gegenwart von Histamin (10&supmin;&sup6; M) 24 Stunden gezüchtet. Die Überstände wurden dialysiert und auf die Histamin-Freisetzungsaktivität im wesentlichen auf die vorstehend angegebene Weise getestet. Die Ergebnisse dieses Versuchs (dargestellt in Fig. 1) zeigten, daß ein signifikant geringerer Histamin-Freisetzungsgrad erhalten wurde, wenn Histamin den Kulturen zugesetzt wurde. Dieser Befund konnte die Folge einer durch Histamin vermittelten Unterdrückung der HRF- Bildung, die Folge einer durch Histamin vermittelten Stimulierung der Synthese eines Inhibitors oder die Folge einer Kombination dieser beiden Vorgänge sein.

E. Erzeugung eines HRIF enthaltenden Überstands und Test auf HRIF

Mononukleare Zellen (3 x 10&sup6; Zellen pro ml) wurden allein in RPMI- 1640 (mit Zusatz von 4 mM Glutamin, 5 x 10&supmin;&sup6; M 2-Mercaptoethanol, 100 Einheiten Penicillin pro ml und 100 µg Streptomycin pro ml) oder in Gegenwart von unterschiedlichen Konzentrationen an Histamin im gleichen Medium 24 Stunden gezüchtet. In weiteren Versuchen wurden mononukleare Zellen mit Concanavalin A und mit Pollenallergenen stimuliert. Der Kulturüberstand wurde durch 10-minütige Zentrifugation bei 48ºC und etwa 450 x g geerntet, in Spectrapor-3-Schläuchen (Molekulargewichtausschlußgrenze = 3500 Dalton) 2 mal gegen 1000 Volumenteile destilliertes Wasser bei 4ºC 12 Stunden und gegen 100 Volumenteile 100 mM Hepes-Puffer, pH-Wert 7,4 (mit einem Gehalt an 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl&sub2; und 1 mM MgCl&sub2;) 4 Stunden dialysiert, um Histamin zu entfernen. Die dialysierten Überstände wurden sofort verwendet oder bei -70ºC aufbewahrt. Dieser Überstand wurde auf die Hemmung der durch HRF induzierten Histamin-Freisetzung aus gemäß der in Beispiel I C beschriebenen Verfahrensweise isolierten Basophilen getestet.
Aliquotanteile von 100 µl verdünnten Testüberständen wurden mit 100 µl Leukozytensuspension (2-5 x 10&sup6; Zellen pro ml) 5 Minuten bei 37ºC vorinkubiert und sodann mit 100 µl HRF enthaltendem Überstand weitere 45 Minuten bei 37ºC angeregt. Drei Sätze von Kontrollen wurden gleichzeitig durchgeführt: 1) mit Puffer vorinkubierte und anschließend mit HRF angeregte Zellen; 2) mit dem Testüberstand vorinkubierte und anschließend mit Puffer angeregte Zellen; und 3) mit Puffer vorinkubierte und mit Puffer angeregte Zellen. Die einzelnen Versuche wurden als Doppelversuche durchgeführt. Am Ende der Inkubation wurden die einzelnen Röhrchen mit 300 µl HACM-Puffer versetzt, und die überstände wurden von den Zellen durch 5- minütige Zentrifugation bei 4ºC und 600 x g abgetrennt. Der Histamingehalt der Überstände wurde spektrofluorimetrisch gemessen. Die prozentuale Histamin-Freisetzung wurde auf die vorstehend beschriebene Weise berechnet.
Ein typischer Versuch wurde auf folgende Weise durchgeführt:
Die prozentuale Hemmung der Histamin-Freisetzung wurde gemäß folgender Formel berechnet:
[(b-a) - (d-c)] x 100/(b-a)
Wie vorstehend ausgeführt, zeigten frühe Versuche, daß die Züchtung von mononuklearen Zellen in Gegenwart von Histamin zu einer verringerten Histamin-Freisetzung führte. Dieser Befund konnte die Folge einer durch Histamin vermittelten Unterdrückung der HRF-Bildung, die Folge einer durch Histamin vermittelten Stimulation der Synthese eines Inhibitors oder die Folge einer Kombination der beiden Vorgänge sein.
Um somit zu bestimmen, ob ein Inhibitor gebildet worden war, wurde die überstehende Flüssigkeit von normalen humanen MNC nach Züchtung mit 10&supmin;&sup8; M Histamin auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der Freisetzung von Mediatoren von Basophilen aus peripherem Blut, die mit HRF getriggert waren, getestet. Wie in Fig. 2 gezeigt ist, hemmte der mit Histamin stimulierte MNC-Überstand die Histamin-Freisetzung aus mit HRF getriggerten Basophilen. Die Wirkung dieses Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktors (HRIF) von sechs aufeinanderfolgenden Zellspendern war über einen weiten Verdünnungsbereich hinweg dosisabhängig. Konditionierte Überstände, die durch MNC nach Züchtung ohne Histamin gebildet worden waren, zeigten eine mäßige Inhibitoraktivität. Histamin, das mit dem Medium allein inkubiert und sodann dialysiert worden war, zeigte keine Inhibitoraktivität. Histamin war in allen diesen dialysierten Überständen nicht nachweisbar (weniger als 10&supmin;&sup9; M; bestimmt durch einen empfindlichen radioenzymatischen Test gemäß Verburg et al., Life Sciences, Bd. 32 (1983), S. 2855).
Bei Prüfung der Gewinnung von HRIF aus mit Histamin stimulierten MNC wurde eine signifikante Aktivität bei MNC von zehn zusätzlichen normalen Spendern erzielt.
Sodann wurde der folgende Versuch durchgeführt, um festzustellen, ob die bei Züchtung von mononuklearen Zellen in Gegenwart von Histamin beobachtete verstärkte HRIF-Bildung von der Histaminkonzentration im Kulturmedium abhängig war, und um die optimale Histaminkonzentration zur Erzielung der verstärkten HRIF-Bildung festzustellen. MNC wurden geerntet und auf die vorstehend beschriebene Weise gezüchtet, mit der Ausnahme, daß die Konzentration des der Kultur zugesetzten Histamins von 10&supmin;¹² M bis 10&supmin;&sup6; M variierte. Sodann wurden dialysierte Überstände auf die Hemmung der HRF-induzierten Histamin-Freisetzung aus Basophilen auf die vorstehend beschriebene Weise getestet. Die Ergebnisse dieses Versuchs (in Fig. 3 dargestellt) zeigen, daß die HRIF-Bildung von der Menge des in der Kultur vorhandenen Histamins abhängig war. Eine optimale HRIF-Bildung wurde erreicht, wenn die Histaminkonzentration im Kulturmedium etwa 10&supmin;&sup6; bis 10&supmin;¹&sup0; M betrug. Bei diesen Versuchen lag die als Kontrolle dienende, HRF- induzierte Histamin-Freisetzung im Bereich von 33-40%. Obgleich berichtet wird, daß Histamin eine antigeninduzierte Histamin-Freisetzung aus Basophilen in Konzentrationen von 3 x 10&supmin;&sup7; bis 10&supmin;&sup6; M hemmt, ist es äußerst unwahrscheinlich, daß die Hemmung der HRF-induzierten Histamin-Freisetzung auf die Gegenwart von Histamin als Verunreinigung im Überstand zurückzuführen war, da Histamin in den dialysierten Überständen nicht nachweisbar war (weniger als 10&supmin;&sup9; M) . Ferner hemmt HRIF offensichtlich nicht die antigeninduzierte Histamin-Freisetzung.
Außerdem wurden die folgenden Versuche durchgeführt, um die HRIF- vermittelte Hemmung einer allergischen Mediator-Freisetzung weiter zu charakterisieren. Basophil angereicherte Lymphozyten wurden bei Raumtemperatur 40 bis 60 Sekunden, 3, 5 oder 10 Minuten mit HRIF vorinkubiert und sodann mit HRF angeregt. Die Ergebnisse dieses Vorgangs (in Fig. 4 dargestellt) zeigten, daß eine Vorinkubationsdauer von 5 bis 10 Minuten mit Basophilen für eine vollständige Inhibitoraktivität erforderlich ist. Eine Vorinkubation von Basophilen mit HRIF und weniger als 5 Minuten ergab eine geringere Hemmung der Histamin-Freisetzung. Außerdem wurde in zusätzlichen Versuchen (Fig. 5) gezeigt, daß die Entfernung von HRIF im Anschluß an die Inkubationsperiode durch wiederholte Waschvorgänge nicht die Hemmung der Histamin-Freisetzung aus Basophilen beeinflußte. Wenn HRF und HRIF vor der Zugabe von Basophilen vorinkubiert wurden, kam es zu keiner Veränderung in der Freisetzung von Histamin, was darauf schließen läßt, daß die beiden Faktoren in der flüssigen Phase nicht aneinander binden. Die Ergebnisse sind repräsentativ für drei ähnliche Versuche.
Eine Stimulation der HRIF-Bildung durch Histamin legt es nahe, daß ein negativer Feedback-Mechanismus zwischen Lymphozyten und Histamin bildenden Zellen vorliegen kann, der folgendermaßen abläuft: Lymphozyten bilden HRF, das Mastzellen und Basophile zur Freisetzung von Histamin aktiviert; dieses Histamin stimuliert sodann Lymphozyten zur Bildung von HRIF, das wiederum die weitere Histamin-Freisetzung hemmt, wodurch die immunologische Homöostase wiederhergestellt wird. Somit gibt es in vivo offensichtlich ein feines Gleichgewicht zwischen der Bildung von HRF und HRIF. Ein Verlust dieses Gleichgewichts kann zur Entwicklung einer allergischen Erkrankung beitragen. Diese Hypothese wird ferner durch die Ergebnisse einer im nachstehenden Beispiel III beschriebenen Untersuchung gestützt.

Beispiel II

Charakterisierung von HRIF

Das folgende Beispiel beschreibt die Charakterisierung und wesentliche Reinigung von HRIF.

A. Physikochemische Charakterisierung von HRIF

Es wurde ein konditionierter Überstand aus mit Histamin stimulierten mononuklearen Zellen gemäß den Angaben im vorstehenden Beispiel I hergestellt und als Quelle für HRIF verwendet. Der Überstand der mit Histamin stimulierten mononuklearen Zellen wurde sodann auf die Hemmung der HRF- induzierten Histamin-Freisetzung im Anschluß an folgende Behandlungen getestet: a) 1-stündiges Erwärmen auf 60ºC; und b) wiederholtes Einfrieren und Auftauen (4 x). Die Ergebnisse dieser Versuche (in Tabelle I aufgeführt) zeigten, daß HRIF gegen eine 1-stündige Wärmebehandlung bei 60ºC beständig ist und relativ beständig gegen ein wiederholtes Einfrieren und Auftauen ist.
Ferner wurde HRIF einer Verdauung mit verschiedenen Enzymen unterworfen. Zu diesem Zweck wurden an Agarose gekuppeltes Trypsin und Chymotrypsin 2 mal mit HCM vom pH-Wert 7,8 gewaschen und im gleichen Puffer suspendiert. Aliquotanteile der HRIF enthaltenden Überstände der mit Histamin stimulierten MNC-Kulturen wurden mit Trypsin (2 Einheiten pro ml) oder Chymotrypsin (2 Einheiten pro ml) 2 Stunden bei 30ºC inkubiert. An Agarose gekuppelte Neuraminidase wurde mit Acetatpuffer vom pH-Wert 5,0 gewaschen und sodann 2 Stunden bei 37ºC in einer Konzentration von 2 Einheiten pro ml mit gegen den gleichen Puffer dialysiertem HRIF inkubiert. Als Kontrollen wurden Überstände, die mit den gleichen Puffern behandelt worden waren (positive Kontrolle) und an Agarose gekuppelte Enzyme, die mit Puffer inkubiert worden waren (negative Kontrolle), mitgeführt. Die Überstände wurden von den Enzymen durch Zentrifugation abgetrennt, gegen HACM-Puffer dialysiert und auf HRIF getestet.
Eine enzymatische Behandlung der HRIF enthaltenden Überstände mit Trypsin und Chymotrypsin beseitigte fast vollständig deren Aktivität (Tabelle I). Dies ließ darauf schließen, daß die intakte Proteinstruktur für die Inhibitoraktivität von HRIF erforderlich ist. Eine Behandlung von HRIF enthaltendem Überstand mit Neuraminidase beeinträchtigte nicht in signifikanter Weise dessen Aktivität, was darauf schließen läßt, daß HRIF keine für seine Funktion erforderlichen Sialinsäurereste aufweist. Tabelle I
ND: Nicht durchgeführt
a: Unbehandelte Kontrollen von HRIF für Versuche mit Enzymbehandlung wurden gegen HCM vom pH-Wert 7,8 dialysiert und sodann für Trypsin- und Chymotrypsin-Versuche bei 30ºC inkubiert oder für Neuraminidase-Versuche gegen Acetatpuffer vom pH-Wert 5 dialysiert und sodann bei 37ºC inkubiert, wobei die Inkubationsdauer jeweils 2 Stunden betrug. Diese Behandlungen beeinträchtigten nicht die Aktivität der Überstände.
b: HRIF wurden gegen HCM vom pH-Wert 7,8 dialysiert und sodann 2 Stunden bei 30ºC inkubiert.
c: HRIF wurde gegen Acetatpuffer vom pH-Wert 5,0 dialysiert und sodann mit Neuraminidase im gleichen Puffer 2 Stunden bei 37ºC inkubiert.
Schließlich wurden Versuche durchgeführt, um HRIF von verschiedenen bekannten Cytokinen zu unterscheiden. Für diese Versuche wurden Basophile mit verschiedenen Konzentrationen an humanem rekombinantem Interleukin 1 (IL-1) beta, IL-2, IL-4 und gamma-Interferon vorinkubiert und sodann mit HRF angeregt. Keines dieser Cytokine hemmte bei einer Konzentration bis zu 500 Einheiten pro ml die HRF-induzierte Histamin-Freisetzung (Fig. 6A) . In ähnlicher Weise wurde für HRIF gezeigt, daß es sich vom Tumor- Necrosefaktor, von IL-3 und vom G. M.-Kolonienstimulationsfaktor unterscheidet (Fig. 6B).

B. Reinigung der HRIF-Aktivitit

HRIF wurde durch Gelausschlußchromatographie von Histamin-stimuliertem MNC-Überstand gereinigt. Im allgemeinen wurden etwa 2 ml konzentrierter Überstand (10-15 x) auf eine mit Sephadex G-50 gepackte und mit HCM- Puffer äquilibrierte Säule (90 cm x 1,5 cm) aufgesetzt. Die Säule wurde mit Dextranblau, Kohlensäure-anhydratase, Cytochrom C und Insulin geeicht. Die Strömungsgeschwindigkeit wurde bei 4ºC auf 12 ml pro Stunde gehalten. Fraktionen von 1 ml wurden gesammelt und auf die Hemmung der durch HRF induzierten Histamin-Freisetzung aus Basophilen gemäß den Angaben in Beispiel I getestet. Die Ergebnisse dieses Versuchs (in Fig. 7A dargestellt) belegen, daß die HRIF-Aktivität in einem Bereich eluiert wurde, der einem Molekulargewicht von 8000-10 000 entspricht. In diesem Versuch betrug die Kontroll-Histamin-Freisetzung 26%. Der Versuch wurde mit zwei verschiedenen HRIF-Chargen wiederholt und ergab jeweils ein ähnliches Elutionsprofil für HRIF.
Um festzustellen, ob ein mit Concanavalin A stimulierter Überstand sowohl HRF- als auch HRIF-Aktivität aufwies, wurde eine Gelchromatographie eines mit Concanavalin A geschüttelten MNC-Überstands durchgeführt. Die Fraktionen wurden getrennt auf HRF- und HRIF-Aktivität getestet. Wie in Fig. 7B gezeigt ist, wurde HRF aus Fraktionen gewonnen, die den MG-Bereichen von 15K-30K entsprachen, sowie in einer größeren MG-Fraktion (früher wurde hierfür ein Wert von etwa 50K gezeigt), während HRIF im MG- Bereich von 8K-10K auftrat. Ein mit Histamin stimulierter Überstand von MNC von einigen normalen Spendern zeigte ebenfalls einen kleinen HRF-Peak im MG-Bereich von 15K-30K (vgl. Fig. 7A).
Jedoch wurde bei anderen Versuchen ein geringfügig unterschiedliches Profil beobachtet (7C). Bei diesen Versuchen wurde ein 20-fach konzentrierter Überstand (2 ml) auf eine Säule (90 cm x 1,5 cm), die mit Markerproteinen vorgeeicht war, aufgesetzt. 1 ml-Fraktionen wurden gewonnen. Jede zweite Fraktion wurde auf direkte Histamin-Freisetzung (o) und auf die Hemmung der durch HRF induzierten Histamin-Freisetzung ( ) aus Basophilen getestet. Dieses Profil der HRIF-Aktivität, das einen zusätzlichen Aktivitätspeak bei etwa 20 000 bis etwa 30 000 Dalton zeigt, wurde bei einem von drei MNC-Spendern beobachtet. Es ist möglich, daß die Spezies mit dem höheren Molekulargewicht ein Multimeres der Form mit geringerem Molekulargewicht darstellt.
HRIF wurde auch durch Ionenaustauschchromatographie gereinigt. Für diesen Vorgang wurde der Concanavalin A-Überstand gegen 1 mM Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,4 dialysiert und über Nacht mit DEAE-Cellulose inkubiert. Die DEAE-Cellulose wurde sodann in eine kleine Säule gepackt, mit dem gleichen Puffer gewaschen und anschließend mit einem linearen Gradienten von 1 bis 500 mM NaCl in 1 mM Phosphatpuffer vom pH-Wert 7,4 eluiert. Die Fraktionen wurden gewonnen. Wie in Fig. 8 gezeigt ist, wurde HRIF unter den Startbedingungen an das Gel gebunden, und der Großteil der Aktivität wurde bei etwa 100 mM NaCl eluiert. Dieser Versuch wurde mit einem mit Histamin stimulierten MNC-Überstand wiederholt. Auch hier wurde HRIF unter ähnlichen Bedingungen an DEAE-Cellulose gebunden und konnte mit 100 mM NaCl eluiert werden.
Bei einer Abänderung dieser Vorgehensweise wurde an DEAE-Cellulose gereinigter HRIF in 1 mM Phosphatpuffer vom pH-Wert 6,9 auf eine Synchropak AX 300-Anionenaustauscher-HPLC-Säule, die mit dem gleichen Phosphatpuffer äquilibriert worden war, aufgesetzt. Nach 20-minütigem Waschen der Säule mit dem Puffer wurde ein linearer Gradient von 0-0,5 M NaCl 60 Minuten angewandt. Sodann wurde weitere 20 Minuten eine Elution mit 0,5 M NaCl in Phosphatpuffer durchgeführt. 1 ml-Fraktionen wurden gesammelt, dialysiert und sodann auf HRIF-Aktivität unter Verwendung von Basophilen einer gesunden Person getestet. Die Ergebnisse dieses Vorgangs sind in Fig. 8A dargestellt.
In einer weiteren Reinigung unter Anwendung von HPLC-Gelfiltration wurden 250 µl eines 50-fach konzentrierten, mit Con A-stimulierten MNC- Überstands auf eine TSK-2000-Gelfiltrations-SW-Säule, die mit HCM-Puffer vom pH-Wert 7,3 voräquilibriert worden war, aufgesetzt. Die Säule wurde mit dem Puffer mit einer Geschwindigkeit von 0,3 ml/min eluiert. 0,6 ml- Fraktionen wurden gewonnen und auf HRIF-Aktivität getestet. Für diesen Zweck wurden Leukozyten von normalen Personen 5 Minuten mit den einzelnen Fraktionen inkubiert und sodann mit einem Ansatz von HRF gereizt. Die Kontroll-Histamin-Freisetzung betrug 55%. Die optische Dichte bei 280 nm wurde überwacht. Ein ähnliches Ergebnis wurde mit fünf verschiedenen MNC- Überständen erhalten. Die Ergebnisse dieses Versuchs zeigten, daß die Aktivität bei einem scheinbaren Molekulargewicht von 15 000 bis 25 000 Dalton eluiert wurde. Die zwischen den Ergebnissen, die in dieser Figur und in Fig. 7A und 7B dargestellt sind, beobachteten Unterschiede können auf Variationen der speziellen angewandten experimentellen Bedingungen zurückzuführen sein.
In weiteren Experimenten versuchten die Erfinder HRF und HRIF durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Concanavalin A-Sepharose, Linsen-Lectin-Sepharose und Erdnuß-Agglutinin-Agarose zu trennen. Keines der Moleküle ging eine Bindung an diese Lectin-gekuppelten Gele ein (Daten nicht dargestellt), was es nahelegt, daß sowohl HRF als auch HRIF möglicherweise keine Mannose-, Glucose- oder Galactose-reichen Kohlenhydrate enthalten.

C. Spezifität der durch HRIF induzierten Hemmung

Von einer Anzahl von Verbindungen ist es bekannt, daß sie die Freisetzung von allergischen Mediatoren aus Mastzellen und Basophilen stimulieren. Das folgende Beispiel dient zum Nachweis der Spezifität der Inhibitoraktivität von HRIF. In diesem Beispiel wird für HRIF gezeigt, daß es die Histamin-Freisetzung, die durch Triggern von Basophilen mit HRF induziert wird, hemmt, jedoch nicht die Histamin-Freisetzung, die durch Triggern von Basophilen mit beliebigen der übrigen getesteten Verbindungen (nämlich Ambrosia-Antigen, Concanavalin A, anti-IgE, Phorbol-myristatacetat und C5A (Fig. 9)) induziert wird, hemmt. Basophile von Ambrosiaallergischen Spendern wurden mit einem gemäß den Angaben von Beispiel I hergestellten, HRIF enthaltenden Überstand 5 Minuten inkubiert und sodann mit verschiedenen sekretionsanregenden Mitteln im wesentlichen gemäß den Angaben in Beispiel I angeregt. Die Zellen wurden mit HRF, Ambrosia-Allergen (10&supmin;&sup6;, Gew./Vol.), anti-IgE (1:10 000 Verdünnung des Antiserums), Concanavalin A (10 µg pro ml), Phorbol-myristat-acetat (10 ng pro ml) und C5a (1:100 Verdünnung von partiell gereinigtem Anaphylatoxin, hergestellt gemäß Farnam et al., J. Immunol., Bd. 134 (1985), S. 541, angeregt.

Beispiel III

Synthese von HRIF durch mononukleare Zellen von allergischen Personen

Das folgende Beispiel belegt, daß HRIF durch mononukleare Zellen von einigen allergischen Patienten in unzureichenden Mengen gebildet wird. Zellen einer weiteren Gruppe von allergischen Patienten, die einer herkömmlichen Allergen- Immunotherapie in Aufrechterhaltungsdosen unterlagen, zeigten normale Synthesespiegel.
Mononukleare Zellen von allergischen Spendern wurden isoliert und mit Histamin (10&supmin;&sup8; M) 24 Stunden im wesentlichen gemäß den Angaben in Beispiel I und in Fig. 2 gezüchtet. Im Anschluß an eine gründliche Dialyse wurde HRIF aufgrund der Hemmung eines HRF-Standards, der eine Kontroll-Histamin-Freisetzung von 20-44% ergab, getestet. Für drei von fünf Personen, die keiner Immunotherapie unterlagen, wurde keine signifikante Synthese durch mononukleare Zellen nachgewiesen (Fig. 10A). Acht weitere Personen, die Aufrechterhaltungsdosen einer wirksamen Allergen-Immunotherapie erhielten, wurden ebenfalls untersucht (Fig. 10B). Der aus der überstehenden Flüssigkeit ihrer mit Histamin stimulierten Zellen gewonnene HRIF-Spiegel unterschied sich nicht von den in Fig. 2 wiedergegebenen Werten für nicht-allergische freiwillige Versuchspersonen.
In zusätzlichen Untersuchungen wurden MNC von sieben gesunden Personen, 10 Patienten mit allergischer Rhinitis/Asthma und acht allergischen, asthmatischen Patienten, die einer Immunotherapie unterlagen, isoliert und mit Histamin (10&supmin;&sup8; M) 24 h gezüchtet. Die Kulturüberstände wurden zur Entfernung von Histamin dialysiert und sodann auf die Hemmung der durch HRF induzierten Histamin-Freisetzung aus Basophilen getestet. Für diesen Zweck wurden Leukozyten einer asymptomatischen, atopischen (Hauttest-positiven) Person isoliert, mit MNC-Überstand vorinkubiert und sodann mit einem Vorratsansatz von HRF angeregt. Die Kontroll-Histamin-Freisetzung in diesem Versuch betrug 50%. Diese Ergebnisse sind in Fig. 10C aufgeführt.

Beispiel IV

A. Nachweis der HRIF-Aktivität an humanen Mastzellen

Das folgende Beispiel zeigt, daß HRIF die allergische Mediator-Freisetzung aus humanen Mastzellen hemmt.
Mastzellen wurden durch bronchoalveolare Spülung aus humanen Bronchoalveolen gemäß dem Verfahren von Bernstein et al., J. Allergy Clin. Immunol., Bd. 76 (1985), S. 145, gewonnen. Asthmatische Personen, die relativ stabil waren, wurden leicht sediert, und in eine segmentale Bronchie des rechten mittleren Lappens oder Lingula wurde ein Bronchoskop eingeführt. Erwärmte Salzlösung wurde in 20 bis 50 ml-Aliquotmengen in das Segment eingeträufelt und sofort abgesaugt. Eine Gesamtmenge von 300 ml Salzlösung wurde verwendet. Nach Durchleitung durch Gase wurden die Zellen 10 Minuten bei 300 x g in einer Kühlzentrifuge zentrifugiert und 2 mal mit HA-Puffer gemäß den Angaben in Beispiel I C gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit HRIF oder Kontrollpuffer 10 Minuten bei 37ºC vorinkubiert und sodann mit HRF im wesentlichen gemäß den Angaben in Beispiel I angeregt, mit der Ausnahme, daß das Histamin radioenzymatisch gemäß dem Verfahren von Verburg et al., Life Sciences, Bd. 32 (1983), S. 2855 bestimmt wurde. Die Ergebnisse dieses Versuchs (dargestellt in Fig. 11) belegten, daß HRIF die allergische Mediator-Freisetzung aus humanen Mastzellen sowie aus Basophilen hemmte. Die durch HRF induzierte Histamin-Freisetzung betrug in Versuch 1 18% und in Versuch 2 38%.

B. HRIF in bronchoalveolarer spülflüssigkeit

Die Erfinder stellten auch fest, daß HRIF sowie ein dialysierbarer niedermolekularer Inhibitor der Histamin-Freisetzung in von mehreren Personen gewonnenen bronchoalveolarer Spülflüssigkeit vorhanden war. Diese Untersuchungen sind nachstehend beschrieben.
Reagenzien: Bezugsquellen: RPMI-1640 von GIBCO Laboratories, Grand Island, NY; Humanserumalbumin, Glutamin, Histamin, f-Mehtylpeptid (FMLP), Ficoll-Hypaque, Concanavalin A (Con A), Penicillin, Streptomycin und an Agarose gekuppeltes Trypsin und Chymotrypsin von Sigma Chemicals Co., St.Louis, MO; Hepes von Research Organics, Inc., Cleveland, OH; Gewebekulturkolben von Corning Glass Works, Corning, NY; Sephadex G-50 und G-75- Superfine von Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ; Hydroxyethylstärke (HetaStarch) von American McGaw, Irvine, CA; Spectrapor-Dialyseschläuche von Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA; und Kaninchen-anti-human-IgE-Serum von Behring Diagnostics, Somerville, NY.
Eine bronchoalveolare Spülung wurde an 20 normalen Personen und 30 freiwilligen Personen mit leichtem bis mäßigem Asthma durchgeführt. Vor der Versuchsdurchführung wurde von den einzelnen Personen jeweils das schriftliche Einverständnis eingeholt. Die Auswahl der asthmatischen Patienten erfolgte auf der Grundlage des NIH-ATS (R.A. Goldstein, S. S. Hurd, NHLBI Workshop Summaries: Summary and Recommendations of a Workshop on the Investigative Use of Fiberoptic Bronchoscopy and Bronchoalveolar Lavage in Asthmatics, Am. Rev. Respir. Dis., Bd. 132 (1985) , S. 180-182). Die Spülung wurde mit 200 ml steriler Salzlösung durchgeführt. Die Ausbeute betrug im Durchschnitt 60%. Die BAL-Flüssigkeit wurde 15 Minuten bei 450 g zentrifugiert. Die zellfreie Flüssigkeit wurde gewonnen und in Aliquotanteile mit kleinen Volumina unterteilt und bis zur Verwendung auf -70ºC eingefroren.
Die HRF- und HRIF-Aktivität wurde unter Verwendung von undialysierten und dialysierten (MG-Ausschlußgrenze 3500) BAL-Flüssigkeiten getestet. Ferner wurden Proben von BAL-Flüssigkeit unter Verwendung einer Amicon Ultrafiltration Cell mit einer Membran mit einer MG-Ausschlußgrenze von 5000 15- bis 20-fach eingeengt. Proben der einzelnen BAL-Flüssigkeiten wurden auf HRF- und HRIF-Aktivitäten unter Verwendung von Basophilen von mindestens drei verschiedenen Spendern getestet. HRIF wurde an Basophilen von zwei allergischen Spendern und einer normalen Person getestet. HRF wurde unter Verwendung von Basophilen von allergischen und/oder asthmatischen Patienten gemessen.
Erzeugung von HRF: Leukozyten wurden aus lederfarbenen Überzügen, die von normalen Blutbankspendern erhalten worden waren, isoliert. MNC wurden gemäß den früheren Angaben isoliert (D. O. Thueson, L. S. Speck, M. A. Lett-Brown und J. A. Grant, Histamine Releasing Activity (HHA). I. Production by Mitogen- or Antigen-stimulated Human Mononuclear Cells, J. Immunol., Bd. 123 (1979), S. 626-632) und mit Con A (25 µg/ml) 4 h in RPMI-Medium geschüttelt, 2 mal mit HBSS gewaschen, in RPMI-Medium resuspendiert und 72 h gezüchtet. Die Überstände wurden geerntet und unter Verwendung einer Amicon-Ultrafiltrationskammer mit YM-5-Filtern (MG-Ausschlußgrenze 5000) 10- bis 20-fach eingeengt.
Die eingeengten Überstände wurden auf Gelfiltrationssäulen (5 x 100 cm) mit einem Gehalt an Sephadex G-75 aufgesetzt. Die Fraktionen mit der Histamin-Freisetzungsaktivität (15 kD- bis 30 kD-Fraktionen) (gemessen auf die nachstehend beschriebene Weise) wurden vereinigt, 10-fach eingeengt, in Aliquotanteile unterteilt, auf -70ºC eingefroren und als Quelle für HRF verwendet.
Isolierung von peripheren Blutleukozyten: Venöses Blut von Spendern wurde mit 10 mM EDTA einer Antikoagulationsbehandlung unterzogen und 30 Minuten bei Raumtemperatur mit 1,5% Hydroxyethylstärke sedimentiert (M. A. Lett-Brown, D. O. Thueson, D. E. Plank, M. E. Langford, J. A. Grant, Histamine Releasing Activity. IV. Molecular Heterogeneity of the Activity from Stimulated Human Thoracic Duct Lymphocytes, Cell. Immunol., Bd. 87 (1984), S. 434-444). Der an Leukozyten reiche, lederfarbene Überzug wurde gewonnen und 3 mal in HA-Puffer (Hepes-Puffer, pH-Wert 7,4 und 0,03% Humanserumalbumin) in einer Kühlzentrifuge (4ºC) bei 3000 x g gewaschen. Die gewaschenen Leukozyten (0,1-1% Basophile) wurden in HACM-Puffer (Hepes-Puffer, pH-Wert 7,4, 0,03% Humanserumalbumin, 2 mM CaCl&sub2; und 1 mM MgCl&sub2;) suspendiert. Leukozyten aus 1 ml Blut wurden üblicherweise für eine Zweifachbestimmung von HRF und HRIF verwendet.
HRF-Test: Aliquotanteile von 100 µl BAL-Flüssigkeit wurden mit 100 µl Leukozytensuspension 45 Minuten bei 37ºC in einem geschüttelten Wasserbad inkubiert. Die einzelnen Versuche wurden als Doppelbestimmungen durchgeführt. Am Ende der Inkubationsdauer wurden die einzelnen Röhrchen mit 400 µl HA-Puffer versetzt. Die Überstände wurden von den Zellen durch 5-minütige Zentrifugation bei 4ºC und 600xg abgetrennt. Der Histamingehalt der Überstände wurde unter Verwendung eines automatisierten fluorimetrischen Analysengeräts gemessen (R. P. Siraganian, Refinements in the Automated Fluorometric Histamine Analysis System, J. Immunol. Methods, Bd. 7 (1975), S.233-290). Die spontane Histamin-Freisetzung wurde durch Inkubation der Zellen in HACM-Puffer allein getestet. Der Gesamthistamingehalt der Zellen wurde durch Lysis der Zellen mit 3% Perchlorsäure gemessen. Die prozentuale Histamin-Freisetzung wurde gemäß folgender Formel berechnet:
[(Histamin im Überstand) x 100]/Gesamthistamin in den Zellen
Die spontane Histamin-Freisetzung aus den Zellen betrug üblicherweise < 5% und wurde von der berechneten Histamin-Freisetzung subtrahiert.
HRIF-Test: Aliquotanteile von 100 µl BAL-Flüssigkeit (dialysiert oder undialysiert) wurden mit 100 µl Leukozyten-Suspension 5 Minuten bei 37ºC vorinkubiert und sodann mit 100 µl HRF-enthaltendem Überstand (oder anderen sekretionsanregenden Mitteln) weitere 45 Minuten bei 37ºC angeregt. Drei Sätze von Kontrollversuchen wurden gleichzeitig durchgeführt.
1) Mit Puffer vorinkubierte und sodann mit HRF angeregte Zellen,
2) mit BAL-Flüssigkeit vorinkubierte und sodann mit Puffer angeregte Zellen und
3) mit Puffer vorinkubierte und mit Puffer angeregte Zellen.
Die einzelnen Versuche wurden als Doppelbestimmungen durchgeführt. Am Ende der Inkubationsdauer wurden die Röhrchen mit jeweils 300 µl HACM- Puffer versetzt. Die Überstände wurden aus den Zellen durch 5-minütige Zentrifugation bei 4ºC und 600xg abgetrennt. Der Histamingehalt der Überstände wurde spektrofluorimetrisch gemessen. Die prozentuale Histamin- Freisetzung wurde auf die vorstehend beschriebene Weise berechnet. Ein typischer Versuch wurde gemäß der folgenden Vorschrift durchgeführt:
Die prozentuale Hemmung der Histamin-Freisetzung wurde gemäß der folgenden Formel berechnet:
[(b-a) - (d-c)] x 100/(b-a)
Die Verdünnung von HRF bei diesen Versuchen wurde so gewählt, daß sich eine Histamin-Freisetzung im Bereich von 20 bis 50% ergab.
Hemmung der Histamin-Freisetzung durch anti-IgE, Allergen, Con A und FMLP: Diese Versuche wurden gemäß den vorstehenden Angaben durchgeführt, mit der Ausnahme, daß anti-IgE, Ambrosia-Allergen, Con A und FMLP als Agonisten verwendet wurden. Die Konzentrationen der Agonisten wurden individuell für die einzelnen Basophilen-Spender so eingestellt, daß sich eine 20-50% Histamin-Freisetzung ergab. Die genaue Konzentration ist im Text angegeben.
Gelfiltration von BAL-Flüssigkeit: Eine Chromatographie wurde mit einer mit Sephadex G-50 gepackten und mit HCM-Puffer äquilibrierten Säule (90 x 1,5 cm) durchgeführt. Die Säule wurde mit Dextranblau, Kohlensäureanhydratase, Cytochrom C und Insulin geeicht. Die Strömungsgeschwindigkeit wurde bei 4ºC auf 12 ml/h gehalten. Üblicherweise wurden 3-4 ml konzentrierte (20-40 x) BAL-Flüssigkeiten auf die Säule aufgesetzt. Fraktionen von 1 ml wurden gewonnen und auf HRF- und HRIF-Aktivität getestet.
Behandlung von Basophilen mit Milchsäure und Resensibilisierung mit Serum: Die Entfernung von Oberflächen-IgE aus den Basophilen wurde durch 3,5-minütige Behandlung der Zellen mit Milchsäure (pH-Wert 3,9) gemäß den Angaben von Pruzansky et al., (J. J. Pruzansky, L. C. Grammer, R. Patterson, M. Roberts, Dissociation of IgE from Receptors on Human Basophils, I. Enhanced Passive Sensitization for Histamine Release, J. Immunol., Bd. 131 (1983), S. 1949) durchgeführt. Die Zellen wurden sodann 3 mal gewaschen und mit Seren eines allergischen asthmatischen Patienten und einer gesunden Person 45 Minuten resensibilisiert. Nach zwei weiteren Waschvorgängen wurden die Zellen im Histamin-Freisetzungstest eingesetzt.
Statistische Analyse: Die Ergebnisse werden als Mittelwerte ± SEM (Standardabweichung des Mittelwerts) angegeben. Die Daten wurden unter Verwendung des Computerprogramms Epistat auf Differenzen analysiert.
HRIF-Aktivität: Basophile von zwei allergischen Spendern und einer normalen Person wurden zum Test der HRIF-Aktivität verwendet. Von 43 untersuchten Personen zeigten unkonzentrierte BAL-Flüssigkeiten von 10 normalen Personen und von 22 asthmatischen Patienten eine mäßige bis starke Inhibitoraktivität gegen die durch HRF induzierte Histamin-Freisetzung aus Basophilen von sämtlichen drei Spendern (Fig. 12). Wie nachstehend beschrieben, zeigten BAL-Flüssigkeiten, die eine signifikante Inhibitoraktivität (> 15%) aufwiesen, keinerlei HRF-Aktivität bei Test in unkonzentrierter Form.
In einer nächsten Stufe wurden 25 BAL-Flüssigkeiten (13 asthmatische Patienten und 12 normale Personen) gegen HCM-Puffer über Nacht unter Verwendung von Spectrapor-Dialysemembranen (MG-Ausschlußgrenze 3500) dialysiert. Nach der Dialyse blieb die Inhibitor-Aktivität gegen HRF in 10 Proben von normalen Personen (83%) und 2 Proben von asthmatischen Patienten (15%) erhalten (Fig. 13). Eine Dialyse der dialysierten BAL-Flüssigkeiten für kürzere Zeiträume (4-8 h) hatte die gleiche Wirkung. Die Inhibitor-Aktivität der BAL-Flüssigkeit ist dosisabhängig, wie in Fig. 14 gezeigt ist.
Die Inhibitor-Aktivität der BAL-Flüssigkeiten gegen andere Agonisten wurde ebenfalls bewertet. Basophile wurde mit Proben von BAL-Flüssigkeiten vorinkubiert und sodann mit anti-IgE, Concanavalin A und FMLP angeregt. Wie in Fig. 15 gezeigt ist, hemmten die undialysierten BAL-Flüssigkeiten die durch diese Agonisten hervorgerufene Histamin-Freisetzung. Die Inhibitor-Aktivität gegen anti-IgE, Con A und FMLP ging jedoch in sämtlichen Proben nach der Dialyse vollständig verloren. Dies läßt darauf schließen, daß BAL-Flüssigkeiten mindestens zwei Inhibitoren der Histamin-Freisetzung enthalten, einen dialysierbaren Inhibitor, der die durch die meisten sekretionsanregenden Mittel verursachte Histamin-Freisetzung blockiert und einen nicht dialysierbaren (MG> 3500) Antagonisten von HRF. Der letztgenannte Antagonist ist in der BAL-Flüssigkeit der meisten normalen Personen vorhanden.
Das ungefähre Molekulargewicht des nicht-dialysierbaren Inhibitors wurde durch Gelfiltrationschromatographie ermittelt (Fig. 16). Nach 10- bis 20-fachem Einengen wurden Proben von BAL-Flüssigkeiten auf eine Sephadex G-50 enthaltende Säule aufgesetzt. Die Inhibitor-Aktivität wurde von der Säule in den Fraktionen, die einem MG von 8 kD entsprachen, eluiert. Somit gleicht dieser Inhibitor in seinem Molekulargewicht und seiner Spezifität (antagonistische Wirkung nur gegen HRF) dem von MNC abgeleiteten HRIF.
HRF-Aktivität: Sämtliche unkonzentrierten BAL-Flüssigkeiten wurden zu Beginn auf ihre HRF-Aktivität unter Verwendung von Basophilen von zwei allergischen Patienten und einer normalen Person getestet. Nur drei BAL- Flüssigkeiten von asthmatischen Patienten (32%, 10% und 8% Histamin-Freisetzung) und keine Flüssigkeit von den normalen Personen setzten geringe Mengen an Histamin frei. Diese Aktivität ging nach Dialyse über Nacht nicht verloren (MG> 3500). In einer nächsten Stufe engten die Erfinder die BAL-Flüssigkeiten von 7 Spendern auf das 10- bis 40-fache unter Verwendung von Amicon-Ultrafiltrationszellen und Membranen (MG-Ausschlußgrenze 5000) ein und suchten sie dann auf Basophile von asthmatischen Donoren ab. Sämtliche eingeengten Proben zeigten eine signifikante Histamin-Freisetzung wie in der nachstehenden Tabelle aufgeführt ist.
Proben von BAL-Flüssigkeiten wurden eingeengt (MG-Ausschlußgrenze 500) und dialysiert (MG-Ausschlußgrenze 3500) und sodann auf die Histamin-Freisetzungsaktivität unter Verwendung von Basophilen eines allergischen asthmatischen Spenders getestet. Sämtliche BAL-Proben wurden von normalen Personen erhalten.
Einfluß der Milchsäurebehandlung auf die durch HRF induzierte Histamin-Freisetzung: Frühere Untersuchungen zeigten, daß an der Oberfläche gebundenes IgE von Basophilen durch 3,5-minütige Behandlung mit Milchsäure entfernt werden kann (J. J. Pruzansky, L. C. Grammer, R. Patterson, M. Roberts, Dissociation of IgE from Receptors on Human Basophils, I. Enhanced Passive Sensitization for Histamine Release, J. Immunol., Bd. 131 (1983), S. 1949). Von BAL-HRF wurde gezeigt, daß er von der Anwesenheit eines speziellen Subtyps von IgE abhängig ist (S. M. MacDonald, L. M. Lichtenstein, D. Proud, M. Plaut, R. M. Naclerio, D. W. MacGlashan, A. Kagey-Sobotka, Studies of IgE Dependent Histamine Releasing Factors: Heterogeneity of IgE, J. Immunol., Bd. 139 (1987), S. 506-521). Um diesen Wirkungsmechanismus von HRF zu untersuchen, behandelten die Erfinder Basophile eines allergischen asthmatischen Patienten mit Milchsäure und resensibilisierten sie dann mit Serum eines allergischen asthmatischen oder normalen Patienten. Wie in Fig. 17 gezeigt, nahm die HRF-induzierte Histamin-Freisetzung nach Behandlung mit Milchsäure signifikant ab. Es erfolgte nur eine partielle Wiederherstellung nach Resensibilisierung mit Serum eines asthmatischen Patienten, aber nicht mit Serum eines gesunden Patienten. In anschließenden Versuchen wurden Basophile einer Hauttest-positiven, asymptomatischen Person nach Resensibilisierung mit Serum eines allergischen asthmatischen Patienten erhöht reaktiv gemacht (Fig. 7C).
Diese Ergebnisse belegen, daß BAL-Flüssigkeiten zwei Inhibitoren der Histamin-Freisetzung aus Basophilen enthalten, einen nicht-spezifischen Inhibitor, der die Histamin-Freisetzung durch die meisten sekretionsanregenden Mittel blockiert, und HRIF, einen spezifischen Antagonisten für HRF. HRIF wurde wie vorstehend beschrieben charakterisiert. Der nichtspezifische Inhibitor weist ein Molekulargewicht von weniger als 3500 auf und geht nach Dialyse verloren. Obgleich der Inhibitor in den meisten BAL-Flüssigkeiten vorhanden ist, ist dessen physiologische Bedeutung derzeit nicht vollständig erklärbar.
Die Anwesenheit von HRF- und HRIF-ähnlichen Aktivitäten in Körperflüssigkeiten läßt darauf schließen, daß diese Cytokine eine wichtige Rolle bei der lokalen Regulierung von Basophilen und möglicherweise Mastzellen spielen. Der Nachweis von HRIF-ähnlicher Aktivität in BAL-Flüssigkeit läßt darauf schließen, daß dieser Inhibitor einen lokalen Kontrollmechanismus von allergischen Entzündungen repräsentiert. Ein feines Gleichgewicht zwischen HRF und HRIF kann in Körperflüssigkeiten unter Normalbedingungen vorliegen. Ein Verlust dieses Gleichgewichts zu Gunsten von HRF kann eine Prädisposition für Asthma und andere allergische Krankheiten bedeuten.

Beispiel V

Entwicklung von HRIF bildenden Zellinien

Das folgende Beispiel dient der Erläuterung verschiedener Verfahrensweisen, die von den Erfindern zur Erzeugung von HRIF bildenden Zellinien angewandt wurden.

A. Erzeugung der HRIF bildenden Zellinien mit der Bezeichnung A-MLB und A-RA

Humane mononukleare Zellen wurden von allergischen Spendern, die einer herkömmlichen Immunotherapie mit Allergenextrakten unterlagen, gewonnen. Bei diesen Patienten lag nach Beurteilung ihrer Ärzte eine günstige Reaktion auf diese Therapie vor, wobei es zu einer gewissen Verringerung der klinischen Allergiesymptome kam. Etwa 50 ml Blut wurden entnommen und einer Antikoagulationsbehandlung mit 10 Einheiten Heparin pro ml unterzogen. Die mononukleare Zellfraktion wurde durch Zentrifugation über Ficoll-Hypaque (spezifisches Gewicht 1,077) erhalten. Etwa 60 x 10&sup6; Zellen wurden gewonnen, 3 mal in Hanks-ausgewogener Salzlösung (HBSS) gewaschen und in einer Konzentration von 1 x 10&sup6;/ml in RPMI 1640 mit 5% wärmeinaktiviertem, fötalem Kälberserum (FCS, Hyclone, Inc., Logan, UT), 10 mM Hepes-Puffer, pH-Wert 7,4, 4 mM Glutamin, 5 x 10&supmin;&sup6; M 2-Mercaptoethanol, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin suspendiert. MNC wurden in Corning 25 cm²-Gewebekulturkolben in Gegenwart von Staubmilben-Antigen (Dermatophagoides farinae, 10&supmin;&sup5; Gew./Vol., Hollister, Stier Laboratories, Spokane, WA) 3 Tage gezüchtet. Die Überstände wurden gewonnen, und bei 4ºC und 400 x g zentrifugiert. Die Zellen wurden im gleichen Medium unter Zugabe von 20% T-Zellwachstumsfaktor (Cellular Products, Inc., Buffalo, NY) resuspendiert und in den Gewebekulturkolben zurückgegeben. Nach der zweiten Woche wurde die Hälfte des Kulturvolumens entfernt, und die Zellen wurden durch Zentrifugation pelletisiert und in frischem Kulturmedium unter Zugabe von Staubmilben-Antigen (10&supmin;&sup5; Gew./Vol.) und T-Zellwachstumsfaktor (20% Endkonzentration) resuspendiert und für eine weitere Woche in den Kolben zurückgegeben.
Anschließend wurden die Zellen in komplettem Medium (RPMI mit 5% FCS, 10 mM Hepes-Puffer, pH-Wert 7,4, 4 mM Glutamin, 5 x 10&supmin;&sup6; M 2-Mercaptoethanol, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin, 20% T- Zellwachstumsfaktor und 10&sup4;/ml mit Mitomycin behandelte heterologe Feeder-Zellen) gehalten. Jede Woche wurde die Hälfte des Kulturvolumens entfernt, und die Zellen wurden in Komplettmedium resuspendiert und in den Kolben zurückgegeben.
Heterologe Feeder-Zellen wurden durch Isolieren von MNC eines normalen Spenders und durch Behandlung von 5 x 10&sup6; Zellen/ml mit 50 µg/ml Mitomycin für eine Zeitspanne von 30 Minuten bei 37ºC hergestellt. Die Zellen wurden sodann 4 mal in HBSS gewaschen, in RPMI 1640 mit einem Gehalt an 25% FCS und 5% Dimethylsulfoxid resuspendiert. Die Zellen wurden in Aliquotanteile unterteilt und bei -80ºC eingefroren. Vor der Verwendung wurden die Zellen 4 mal in HBSS gewaschen und sodann in RPMI 1640 suspendiert.
Kulturüberstände wurden nach 27 und 21 Tagen für die Linien A-MLB bzw. A-RA entnommen, auf die vorstehend beschriebene Weise dialysiert und auf die Hemmung der durch HRF induzierten Histamin-Freisetzung auf die vorstehend beschriebene Weise getestet. Die Ergebnisse dieses Versuchs (in Fig. 18 dargestellt) belegen, daß die beiden Zellinien durch diese Vorgehensweise eine signifikante Menge an HRIF entwickelten. Die mäßige Inhibitorwirkung von konditioniertem Medium (RPMI mit 5% fötalem Kälberserum, 10 mM Hepes-Puffer, pH-Wert 7,4, 4 mM Glutamin, 5 x 10&supmin;&sup6; M 2-Mercaptoethanol, 100 Einheiten/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin, 20% T-Zellwachstumsfaktor) ist ebenfalls dargestellt. Die Kontroll-Histamin- Freisetzung betrug 20%. Unglücklicherweise gingen diese Zellinien durch Kontamination verloren. Jedoch schufen diese Versuche die Basis für das nachstehend beschriebene bevorzugte Verfahren.

B. Erzeugung der HRIF-bildenden Zellinie mit der Bezeichnung JW-RW

Mononukleare Zellen eines unter Immunotherapie mit Ambrosia-Pollen stehenden Patienten wurden auf die vorstehend beschriebene Weise isoliert und in einer Konzentration von 5 x 10&sup7; pro 10 ml in RPMI plus Hepes, Glutamin, 2-Mercaptoethanol, Penicillin und Streptomycin (wie vorstehend beschrieben) plus 15% FCS resuspendiert und mit Ambrosia-Pollen (gemischt aus Riesen-Ambrosia, kurzem Ambrosia und Western Ambrosia (mixed giant, short and western ragweed) plus Sumpfhollunder-Pollen von Greer Laboratories, Lenoir, NC, mit 10&supmin;&sup7; Gew./Vol.) 4 Wochen bei 37ºC in Corning 25 cm²-Gewebekulturkolben stimuliert. Anschließend wurde die Hälfte des Mediums entfernt und 10 Minuten bei Raumtemperatur und 300 x g zentrifugiert. Die Zellen wurden im gleichen Volumen an frischem RPMI-1640-Medium mit rekombinantem Interleukin 2 in einer Menge von 10 Einheiten pro ml (rIL-2 von Cellular Products, Inc.) resuspendiert. Ferner wurden 10&sup5; mit Mitomycin behandelte heterologe Zellen (hergestellt auf die vorstehend beschriebene Weise, mit der Ausnahme, daß sie eingefroren in 50% FCS aufbewahrt wurden) als Feeder-Zellen zugegeben. Die Zellsuspension wurde in den gleichen Kolben zurückgegeben.
Nach der dritten Züchtungswoche wurde erneut die Hälfte des Mediums entfernt, die Zellen wurden zentrifugiert, in frischem RPMI plus Hepes, Glutamin, 2-Mercaptoethanol, Penicillin, Streptomycin, Ambrosia-Pollen 10&supmin;&sup7; Gew./Vol., rIL-2, 10 Einheiten pro ml, 15% FCS und 10&sup4; Feeder-Zellen pro ml resuspendiert, in den Kolben zurückgegeben und für die vierte Woche gezüchtet. Anschließend wurden die Zellen in RPMI plus Hepes, Glutamin, 2-Mercaptoethanol, Penicillin, Streptomycin, FCS, rIL-2 und Feeder- Zellen auf die vorstehend beschriebene Weise gehalten, wobei die frische Zugabe wöchentlich erfolgte, mit der Ausnahme, daß während der 6. Woche Ambrosia-Pollen für eine dritte Exposition zugesetzt wurde.
Diese Zellinie bildete signifikante Mengen an HRIF, aber kein HRF bei Test gemäß dem vorstehend in Beispiel I E beschriebenen Verfahren (Fig. 19). Obgleich die Vermehrung dieser Zellen mäßig ist, konnte ihre Lebensfähigkeit sowie ihre Fähigkeit zur Synthese von HRIF für 110 Tage festgestellt werden. Die Überstände wurden in einer Endverdünnung von 1:6 getestet. Eine typische Dosis-Reaktions-Kurve für den Überstand ist auf der rechten Seite von Fig. 19 dargestellt.

C. Erzeugung von HRIF bildenden Zellinien mit der Bezeichnung WP-RW

Mononukleare Zellen eines weiteren allergischen Patienten, der unter einer Ambrosia-Immunotherapie unter Aufrechterhaltungsdosis stand, wurden aus 50 ml Blut auf die vorstehend beschriebene Weise gewonnen. Eine T-angereicherte Population wurde durch Rosettenbehandlung mit AET-behandelten Schaferythrozyten gemäß dem Verfahren von Pellegrino et al., Clin. Immunol. Immunopath., Bd. 3 (1975), S. 324 erhalten. Isolierte T-Zellen wurden in einer Konzentration von 5 x 10&sup6;/ml in einer mit Ambrosia-Antigen beschichteten Petri-Schale 2 Stunden inkubiert, um Antigen bindende T- Zellen gemäß dem Verfahren von Taniguchi und Miller, J. Exp. Med., Bd. 146 (1977), S. 1450, abzutrennen. Die ungebundenen Zellen wurden sorgfältig aus der Schale entfernt, und die antigengebundenen Zellen wurden durch wiederholtes Pipettieren isoliert. Antigenbindende Zellen wurden in einer Konzentration von 1 x 10&sup6;/ml in RPMI 1640 mit einem Gehalt an 10% FCS und Ambrosia-Pollen 10&supmin;&sup7; Gew./Vol. 7 Tage gezüchtet. Von der zweiten Woche an wurde die gleiche Verfahrensweise, wie sie vorstehend für JW-RW beschrieben wurde, eingehalten.
Dieses Verfahren, das sich angereicherter antigenbindender T-Zellen bedient, lieferte ebenfalls erhebliche Mengen an HRIF, aber kein HRF, wie in Fig. 20 dargestellt ist. Diese Versuche belegen, daß HRIF durch Züchtung von antigenbindenden T-Zellen synthetisiert wird.

Beispiel VI

Klinische Anwendungen

Aufgrund der Vorsichtsmaßnahmen, die notwendigerweise bei der Entwicklung von jedem neuen Arzneimittel eingehalten werden müssen, wurde der erfindungsgemäße Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor bisher noch nicht klinisch am Menschen getestet. Daher wurde die in vitro-Aktivität dieses Faktors bei der Hemmung der Histamin-Freisetzung dazu herangezogen, die Eignung der vorliegenden Erfindung als pharmakologisches Mittel zu belegen, da der Histamin-Freisetzungstest von den Fachleuten als eine zuverlässige Maßnahme, die in Korrelation mit der in vivo-Histamin-Freisetzung steht, angesehen wird. Die folgenden vorhergesagten Ausführungsformen stellen die bestmögliche, von den Erfindern in Betracht gezogene Art und Weise zur praktischen Durchführung der Erfindung in verschiedenen klinischen Einsätzen dar.
Zunächst wird angenommen, daß sich der Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor als wertvoll bei der Behandlung von zahlreichen Erkrankungen, bei denen Mastzellen und Basophile beteiligt sind, insbesondere bei allergischen Störungen, erweist. Insbesondere gehören hierzu (ohne Beschränkung hierauf) Bronchialasthma, allergische Rhinitis, Konjunktivitis und Nesselsucht. Obgleich die beste Ausführungsform zur Verabreichung des Faktors von der speziellen klinischen Situation abhängt, wird angenommen, daß der Faktor in besonders einfacher Weise verabreicht werden kann, indem man ihn zusammen mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger formuliert und das Präparat topisch verabreicht. Beispielsweise kann der Faktor als ein Bestandteil eines Aerosols zur intranasalen oder intrabronchialen Verabreichung formuliert werden. Diese Verabreichungsvorrichtungen können so modifiziert werden, daß ein Betrieb durch Freon erfolgt. Diese Verabreichungsart kann sich als besonders wertvoll bei der Behandlung bestimmter allergischer Erkrankungen, beispielsweise von allergischer Rhinitis und Bronchialasthma, erweisen. Der Faktor kann auch topisch auf Haut oder Auge verabreicht werden. Diese Formulierung kann sich als wirksam für allergische Störungen an diesen Stellen erweisen. Alternativ kann der Faktor für ein intravenöses, intramuskuläres, subkutanes, intradermales oder intraartikuläres Injektionspräparat formuliert werden. Derartige Injektionspräparate können zur Behandlung von entzündlichen Reaktionen an diesen Stellen, an denen das Triggern der Mediator-Freisetzung aus Basophilen und Mastzellen an der Pathogenese der Krankheit beteiligt ist, verwendet werden. Bei allen diesen Präparaten sind geeignete Verdünnungsmittel, beispielsweise Kochsalzlösung oder physiologische Puffer, dem Fachmann bekannt und können dementsprechend eingesetzt werden. Selbstverständlich kann es in einigen Fällen erwünscht sein, dem Träger ein Konservierungsmittel einzuverleiben. Verfahren zur Einverleibung von therapeutischen Mitteln in pharmazeutische Träger liegen im Wissen des Fachmanns.
Wie vorstehend erwähnt, wurde die Erfindung bisher noch nicht klinisch eingesetzt. Die Erfinder haben sich auf die veröffentlichten Ergebnisse über andere Cytokine in bezug auf die Vorhersage der verträglichen pharmazeutischen Dosierung für HRIF gestützt. Besonders aussagekräftige Untersuchungen über ein Aerosol betrafen die intranasale Anwendung von alpha-2-Interferon zur Prophylaxe von viralen Infektionen der oberen Atemwege. Douglas et al. (New Engl. J. Med., Bd. 314 (1986), S. 65) und Hayden et al. (New Engl. J. Med., Bd. 314 (1986), S. 71) verabreichten 5 x 10&sup6; Internationale Einheiten (IU) pro Tag für eine wirksame Reaktion. Dieses Cytokin ist derzeit zur Behandlung von Haarzell-Leukämie in einer Dosis von 3 x 10&sup6; IU pro Tag durch intramuskuläre oder subkutane Verabreichung zugelassen. Nathan et al. (New Engl. J. Med., Bd. 315 (1986), S. 6) verabreichten 20 000 bis 200 000 U Interferon-gamma auf intradermalem Wege an Personen mit lepromatöser Leprosie zur Erzielung einer therapeutischen Reaktion. Über die Entwicklung und klinische Anwendung von Interferonen erschien kürzlich ein Übersichtsartikel von Baron et al., The Interferon System: A Current Review zu 1987, University of Texas Press, Austin. Wie in New Engl. J. Med., Bd. 313 (1985), S. 1485 berichtet wird, wurde Interleukin-2 intravenös an Patienten mit Krebs in Dosen von 10&sup4; bis 10&sup5; Einheiten pro kg innerhalb von 8 Stunden und in einer maximalen Dosis bis zu 3,3 x 10&sup6; pro kg verabreicht. Schließlich injizierten kürzlich Vakhan-Raj et al. (New Engl. J. Med., Bd. 317 (1987), S. 1545 G/M- CSF durch kontinuierliche Infusion in Dosen von 1,5 bis 25 x 10&sup6; Einheiten/m² Körperoberfläche zur Erzielung einer wirksamen Reaktion bei Patienten mit Myelodysplasie. Daher schlagen die Erfinder vor, daß die wirksame Dosis für HRIF etwa 10&sup4; bis etwa 10&sup7; Einheiten beträgt. Ferner definieren die Erfinder 1 Einheit auf herkömmliche Weise: 1 Einheit bewirkt 50% Hemmung der nahezu maximalen Histamin-Freisetzung aus HRF-stimulierten Basophilen. Die exakten Dosen für HRIF, die sich in einer speziellen klinischen Anwendung ergeben, müssen nach anerkannten pharmazeutischen Verfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet der Pharmazie bekannt sind, festgelegt werden.
Ferner kommt es in Betracht, daß der erfindungsgemäße Faktor zur Überwachung des Fortschritts von einer Immunotherapie unterliegenden Patienten herangezogen wird. Wie vorstehend erwähnt, haben die Erfinder auch Hinweise vorgelegt, die dafür sprechen, daß eine Immunotherapie bevorzugt die Synthese des Faktors induzieren kann und daß eine klinische Besserung von allergischen Symptomen mit einer verstärkten Synthese des Faktors korreliert. Daher können zur Überwachung der HRIF-Synthese durch Patientenzellen derartige Patientenzellen entnommen und zur Bildung von HRIF auf die vorstehend beschriebene Weise gezüchtet werden. Die von den Patientenzellen erzeugte HRIF-Aktivität kann sodann mit einem Standardpräparat des Faktors verglichen werden, um festzustellen, ob die Patientenzellen unter Bildung des Inhibitorfaktors aktiviert worden sind.
Die vorstehende Beschreibung ist auf spezielle bevorzugte Ausführungsformen gemäß den Anforderungen der patentrechtlichen Bestimmungen und für Erläuterungs- und Darstellungszwecke ausgelegt. Für den Fachmann ist es jedoch ersichtlich, daß zahlreiche Modifikationen und Abänderungen vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang und vom Geist der Erfindung abzuweichen.
Beispielsweise können zahlreiche Verfahren zur Reinigung des Faktors herangezogen werden. Ferner kann zukünftig das für das antiallergische Cytokin kodierende Gen identifiziert, in einen rekombinanten Vektor geklont und zur Bildung eines rekombinanten Cytokins mit der gewünschten Aktivität exprimiert werden. Außerdem können die strukturellen Determinanten, die für die HRIF-Aktivität kritisch sind, bestimmt und synthetische Peptide mit HRIF-Funktion hergestellt werden. Außerdem ist es wahrscheinlich, daß weitere Verfahren zur Erzeugung von Zellinien, die das Cytokin bilden, angegeben werden können. Beispielsweise können die vorstehend beschriebenen Zellinien mit einer kontinuierlich wachsenden, transformierten Zellinie, beispielsweise mit der Zellinie CEM, fusioniert werden, um eine kontinuierlich wachsende hybride Zellinie zu bilden.

Claims

1. Therapeutische Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger und einen in wesentlichem Umfang gereinigten humanen Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor mit folgenden Eigenschaften:

(a) Molekulargewicht von etwa 8000-10 000 Dalton, bestimmt durch Gelausschlußchromatographie;

(b) Labilität bei Behandlung mit Trypsin oder Chymotrypsin;

(c) Stabilität bei 1-stündiger Wärmebehandlung bei 60ºC; und

(d) Stabilität bei Behandlung mit Neuraminidase.

2. Therapeutische Zusammensetzung, umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger und einen in wesentlichem Umfang gereinigten, proteinartigen, humanen Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor, wobei dieser Faktor biologische Eigenschaften aufweist, die eine Hemmung der allergischen Mediator-Freisetzung aus mit Histamin-Freisetzungsfaktor getriggerten, humanen Basophilen oder Mastzellen umfaßt.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei es sich beim allergischen Mediator um Histamin handelt.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Faktor durch ein Verfahren erhalten worden ist, das folgendes umfaßt:

(a) Herstellen eines konditionierten Überstands von humanen mononuklearen Zellen;

(b) Fraktionieren des konditionierten Überstands zur Bereitstellung einer Fraktion, die den Faktor in in wesentlichem Umfang gereinigter Form enthält; und

(c) Gewinnen der Fraktion.

5. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Stufe (a) folgendes umfaßt:

(a) Gewinnen einer mononuklearen Fraktion von Leukozyten einer Person;

(b) Züchten der mononuklearen Zellfraktion in einem geeigneten Medium unter Bildung eines konditionierten Überstands; und

(c) Abtrennen des Uberstands von den gezüchteten Zellen.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei der Überstand in Proteinfraktionen von ausgewählten Molekulargewichtsbereichen fraktioniert wird, um eine Fraktion bereitzustellen, die den Faktor in einer in wesentlichem Umfang gereinigten Form enthält.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die Fraktion ausgewählt wird, indem man die Fraktionen auf den Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor unter Verwendung von mit Histamin-Freisetzungsfaktor getriggerten humanen Mastzellen oder humanen Basophilen testet.

8. Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die mononuklearen Zellen in einem Gewebekulturmedium mit einem Gehalt an Histamin gezüchtet werden.

9. Therapeutische Zusammensetzung, enthaltend einen pharmazeutisch verträglichen Träger und einen in wesentlichem Umfang gereinigten proteinartigen humanen Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor, wobei der Faktor biologische Eigenschaften aufweist, zu denen folgende Eigenschaften gehören:

(a) Fähigkeit zur Hemmung der Histamin-Freisetzung aus humanen, Histamin enthaltenden, proallergischen Zellen;

(b) Molekulargewicht von etwa 8000-10 000 Dalton, bestimmt durch Gelausschlußchromatographie;

(c) Labilität der Histamin-Freisetzungs-Inhibitoraktivität bei Behandlung mit Trypsin oder Chymotrypsin;

(d) Stabilität der Histamin-Freisetzungs-Inhibitoraktivität bei 1- stündiger Wärmebehandlung bei 60ºC; und

(e) Stabilität der Histamin-Freisetzungs-Inhibitoraktivität bei Behandlung mit Neuraminidase.

10. Therapeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 1, 2 und 9 zur Verwendung in einem Verfahren zur Hemmung der Freisetzung eines allergischen Mediators aus humanen, Histamin enthaltenden, proallergischen Zellen, bei dem derartige Zellen einer Exposition mit dieser Zusammensetzung unterzogen werden.

11. Therapeutisches Präparat nach Anspruch 10, wobei es sich beim allergischen Mediator um Histamin handelt.

12. Therapeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 1, 2 und 9 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von allergischen Personen, umfassend die Verabreichung des Präparats an die Personen.

13. Therapeutisches Präparat nach einem der Ansprüche 1, 2 und 9 zur Verwendung in einem Verfahren zur Behandlung von Personen, die an von Mastzellen oder Basophilen abhängigen Störungen leiden, umfassend die Verabreichung des Präparats an die Personen.

14. Humaner Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1, 2 oder 9 zur Verwendung in einem Verfahren zur Hemmung der Freisetzung von allergischen Mediatoren aus humanen Basophilen oder humanen Mastzellen, bei dem derartige Zellen einer Exposition mit diesem Faktor unterzogen werden.

15. Verfahren zur Herstellung des humanen Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktors, der in der therapeutischen Zusammensetzung enthalten ist, nach einem der Ansprüche 1, 2 oder 9, umfassend:

a) Gewinnen einer mononuklearen Zellfraktion von Leukozyten einer Person;

(b) Züchten der mononuklearen Zellfraktion in einem geeigneten Kulturmedium unter Bildung eines konditionierten Überstands; und

(c) Testen des Überstands auf die Histamin-Freisetzungs-Inhibitoraktivität;

(d) Auswählen eines Überstands mit einem Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktor; und

(e) Reinigen des Faktors aus dem Überstand

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die mononukleare Zellfraktion in einem geeigneten Kulturmedium mit einem Gehalt an Histamin unter Bildung eines konditionierten Überstands gezüchtet wird und wobei der Histamingehalt vor dem Testen des Überstands erheblich vermindert wird.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Leukozyten aus peripherem Blut erhalten werden.

18. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das Histamin in einer Konzentration von 10&supmin;&sup6; M bis 10&supmin;¹&sup0; M enthalten ist.

19. Verfahren zur Herstellung einer humanen, den Histamin-Inhibitorfaktor bildenden Zellinie, umfassend:

(a) Gewinnen einer mononuklearen Zellfraktion von Leukozyten einer Person;

(b) Züchten der mononuklearen Zellfraktion in einem geeigneten Gewebekulturmedium, das ein Antigen enthält;

(c) Halten der gezüchteten Zellen in einem Kulturmedium mit Interleukin-2 und Feeder-Zellen; und

(d) Testen der gezüchteten Zellen auf ihre Fähigkeit zur Erzeugung des Histamin-Freisetzungs-Inhibitorfaktors.

20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Leukozyten aus peripherem Blut erhalten werden.

21. Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Leukozyten von einer Person, die einer Immunotherapie unterliegt, erhalten werden und das Antigen einer antigenen Komponente des immunotherapeutischen Präparats entspricht.

22. Klinischer Test, der zur Überwachung oder Diagnose von Personen, bei denen ein Verdacht auf eine allergische Erkrankung besteht, geeignet ist, umfassend:

(a) Gewinnen einer mononuklearen Zellfraktion von Leukozyten einer Person;

(c) Testen des Überstands auf die humane Histamin-Freisetzungs-Inhibitoraktivität.

23. Test nach Anspruch 22, wobei die Stufe (c) ferner folgendes umfaßt:

(a) Unterteilen einer Zellsuspension mit einem Gehalt an humanen Mastzellen oder humanen Basophilen in mindestens zwei Teile;

(b) Durchführen einer Exposition der Zellen im ersten Teil mit dem konditionierten Überstand;

(c) Durchführen einer Exposition der Zellen in beiden Teilen mit einer den Histamin-Freisetzungsfaktor enthaltenden Zusammensetzung;

(d) Messen der von den Zellen in jedem Teil freigesetzten Histaminmenge; und

(e) Vergleichen der von den Zellen im ersten Teil freigesetzten Histaminmenge mit der von den Zellen im zweiten Teil freigesetzten Histaminmenge.

24. Klinischer Test, der sich zur Überwachung oder Diagnose von Personen, bei denen ein Verdacht auf eine allergische Erkrankung besteht, eignet, umfassend:

(a) Gewinnen einer biologischen Flüssigkeit von einer Person; und

(b) Testen der Flüssigkeit auf die humane Histamin-Freisetzungs-Inhibitoraktivität.

25. Test nach Anspruch 24, wobei die Stufe (b) ferner folgendes umfaßt:

(b) Durchführen einer Exposition der Zellen im ersten Teil mit der biologischen Flüssigkeit;

(d) Messen der von den Zellen in jedem Teil freigesetzten Histaminmenge; und

26. In wesentlichem Umfang gereinigter humaner Proteinfaktor, der zur Hemmung der Histamin-Freisetzung aus humanen proallergischen Zellen, die mit dem Histamin-Freisetzungsfaktor getriggert sind, befähigt ist, wobei der Proteinfaktor ein Molekulargewicht von 20 000 bis 30 000, bestimmt durch Gelausschlußchromatographie, aufweist.