DE60011039T2

DE60011039T2 - Pro-apoptotische stoffe

Info

Publication number: DE60011039T2
Application number: DE60011039T
Authority: DE
Inventors: Chuen Sek CHOW; Idris David PRITCHARD
Original assignee: University of Nottingham
Current assignee: Secretary Of State For Defence As Represented
Priority date: 1999-01-15
Filing date: 2000-01-14
Publication date: 2004-09-30
Anticipated expiration: 2020-01-15
Also published as: ATE267603T1; DE60011039D1; ES2216849T3; EP1140122A1; AU1995000A; WO2000041706A1; EP1140122B1

Description

Gegenstand der Erfindung
Die Erfindung betrifft pro-apoptotische Wirkstoffe, die aus Necator americanus isolierbar sind.
Hintergrund der Erfindung
Die beim Menschen vorkommenden Nematoden (Rundwürmer) schließen die Nematoden-Spezies des Hakenwurms, Necator americanus, ein. Die erwachsenen Weibchen des N. americanus sind üblicherweise 9 bis 11 mm lang, die erwachsenen Männchen üblicherweise 7 bis 9 mm. Die ausgewachsenen Würmer besiedeln für gewöhnlich das Lumen des Dünndarms und heften sich an die Dünndarmwand an, was zu Blutverlust des Wirts führt. Die Eier werden in den Stuhl abgegeben und sind unter günstigen Bedingungen gewöhnlich nach ein bis zwei Tagen ausgebrütet. Die Larven schlüpfen dann und setzen ihr Wachstum im Stuhl und/oder im Erdreich fort. Nach bis zu 10 Tagen sind die Larven infektiös und können in diesem Zustand drei bis vier Wochen überleben. Kommt es in dieser Zeit zum Kontakt mit einem menschlichen Wirt, können die Larven die Haut penetrieren und anschließend durch die Gefäße und das Herz in die Lungen transportiert werden. Hier durchdringen sie die Lungenbläschen und steigen im Bronchialbaum bis zur Rachenhöhle auf, wo sie hinuntergeschluckt und an den Dünndarm abgegeben werden können. Sie entwickeln sich dann zu ausgewachsenen Würmern. Es dauert normalerweise sechs Wochen oder mehr von Beginn der Infektion bis zur Eiablage durch die erwachsenen Weibchen.
Der N. americanus ist in tropischen und subtropischen Gebieten zu finden, wo er die Ursache einer Hakenwurm-Erkrankung mit einer Vielzahl klinischer Symptome darstellt. Eisenmangelanämie aufgrund des Blutverlustes an der Stelle des intestinalen Anhaftens des ausgewachsenen Wurms ist das häufigste Symptom einer Hakenwurminfektion, die auch von kardialen Komplikationen begleitet werden kann. Ebenso finden sich Symptome im gastrointestinalen Bereich sowie im Bereich Ernährung/Stoffwechsel. Zusätzlich kann Juckreiz zu Beginn der Infektion auftreten, und es können respiratorische Symptome während der Phase der Lungendurchwanderung beobachtet werden.
Die Apoptose stellt einen in allen Säugetierzellen angelegten suizidalen Prozess dar, während dem eine Zelle einen kontrollierten Zelltod erfährt. Zellen in Apoptose weisen ausgeprägte morphologische Veränderungen auf wie zum Beispiel Kondensation des Zellkerns und Bildung apoptotischer Körperchen. Das biochemische Kennzeichen der Apoptose ist die Spaltung von Chromatin in nucleosomale Fragmente.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung gründet auf der Erkenntnis, dass sich Rundwürmer vor immunologischem Angriff mittels der Erzeugung eines Faktors schützen, der über die Fähigkeit zur Reduktion der Lebensfähigkeit von reaktiven T-Zellen verfügt. Dieser Faktor kann infolgedessen eine Wirkung ausüben, der zur Zellapoptose führt und wertvolle therapeutische Anwendungsmöglichkeiten bieten kann.
Daher stellt die Erfindung ein im Wesentlichen reines exkretorischsekretorisches Produkt (ES) zur Verfügung, das aus N. americanus isolierbar ist, sowie funktionelle Derivate hiervon, die über die Fähigkeit zur Reduktion der Lebensfähigkeit von Zellen verfügen. Die Lebensfähigkeit der Zellen kann durch Induzieren von Apoptose reduziert werden.
Das erfindungsgemäße Produkt ist ein Protein von weniger als 12 kDa oder ein funktionales Fragment hiervon.
Des Weiteren stellt die Erfindung die Verwendung dieses Proteins bei der Herstellung einer pro-apoptotischen Zusammensetzung bereit.
Des Weiteren stellt die Erfindung eine pro-apoptotische Zusammensetzung bereit, umfassend einen) pharmazeutisch annehmbares(n) Verdünnungsmittel oder Träger sowie dieses Protein.
Des Weiteren stellt die Erfindung die Verwendung dieses Proteins bei der Herstellung eines Medikaments mit einer anti-tumorösen und/oder antiinflammatorischen Wirkung bereit, d. h. für die Behandlung von Krebs oder einer entzündlichen Erkrankung.
Kurzbeschreibung der Abbildungen
Es zeigen:
1 die Wirkung exkretorisch-sekretorischer Produkte von N. americanus auf die Lebensfähigkeit von Zellen der humanen leukämischen T-Zelllinie (Jurkat), wobei (X) die Proteinkonzentration (μg/ml) und (Y) den Prozentsatz der Zellviabilität darstellt; und
2 die Wirkung teilweise aufgereinigter exkretorisch-sekretorischer Produkte auf die Zellviabilität der humanen leukämischen T-Zelllinie (Jurkat), wobei (X) die Zellfraktionen und (Y) den Index der Zellviabilität darstellt.
Beschreibung der Erfindung
Man kann man die exkretorisch-sekretorischen Produkte (ES) von N. americanus – nur anhand eines Beispiels gezeigt – wie folgt gewinnen.
DSN-Hamster werden mit Necator americanus infiziert: Die Stuhlkultur der infizierten Tiere stellen infektiöse Larven bereit, die anschließend verwendet werden, um Neonaten perkutan zu infizieren. Fünf Wochen nach Infektion können in der Regel die ausgewachsenen Würmer aus dem Dünndarm der infizierten Hamster gewonnen werden. Das lleum der infizierten Hamster wird entfernt, längs geöffnet und bei 37°C in Salzlösung nach Hank gegeben. Sobald die Würmer ihren Halt an der Schleimhaut lösen, werden sie vorsichtig entfernt, gründlich gewaschen und in 100 IU/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin gesäubert. Die gesäuberten Würmer werden unter einem Seziermikroskop untersucht und die unbeschädigten Würmer ausgewählt.
Die Würmer werden unter sterilen Bedingungen wie oben in Penicillin- und Streptomycin-haltiges RPMI 1640 gegeben. Die Würmer werden anschließend 16 Stunden kultiviert und die Überstände zur Messung der pro-apoptotischen Aktivitäten entfernt.
Die Kulturüberstände werden durch 0,2 μm Filter steril filtriert, wobei zugleich Eier entfernt werden, die während der Kultivierungsdauer gelegt worden sein könnten.
Die Proteinkonzentration der Überstände wird unter Verwendung von Coomassie Brillantblau mit BSA als Standard untersucht.
Um die Wirkung der ES des Hakenwurms auf die Lebensfähigkeit der Jurkat-Zellen zu bewerten, wurden 2 × 10⁵ Zellen mit unterschiedlicher Konzentration der ES-Produkte 16 Stunden lang bei 37°C in einem Endvolumen von 200 μl in flachbödigen 96-Well-Platten in einem Inkubator bei 5% CO₂ kultiviert. Anschließend folgte die Zugabe von 20 μl Thiazolblau-Lösung (5 mg/ml) zu den Zellen und die Inkubation der Platten für weitere 4 Stunden. Nach der Inkubation wurde den Wells vorsichtig 150 μl Medium entnommen, anschließend 150 μl Isopropanol zugegeben und gründlich durchmischt. Die OD wurde bei 590 nm und 650 nm mittels eines ELISA-Readers bestimmt. Die Zellviabilität wurde als Prozent des Absorptionsvermögens in unbehandelten Zellen nach Abzug der Absorption von geeigneten Blanks angegeben.
Die Induktion der Apoptose in Jurkat-T-Zellen mittels ES-Produkten wurde durch Anfärben fixierter Zellen mit Hoechst Dye 33358 (50 μg/ml in PBS) und Untersuchung der morphologischen Veränderungen unter Verwendung konfokaler Lasermikroskopie sowie der Analyse der oligonucleosomalen DNA-Fragmente in den Jurkat-Zellen unter Verwendung von Agarose-Gelelektrophorese kontrolliert.
1 zeigt die Wirkung der ES-Produkte von Necator americanus auf die Lebensfähigkeit von Jurkat-Zellen. Die Zellviabilität wurde abhängig von der Dosis reduziert (d. h. die Zellen wurde abgetötet). Es wurde die Reduzierung der Zellviabilität mittels Induktion von Apoptose gezeigt. Die charakteristische Teilung von Chromatin in nucleosomale Fragmente als Indikation für Apoptose wurde beobachtet. Ein weiteres charakteristisches Merkmal von Apoptose ist die Veränderung in der Kernmorphologie, die ebenfalls in den Zellen nach der Behandlung mit ES-Produkten beobachtet wurde.
Nach Fraktionierung über eine Sephacryl-S-300-Säule wurde der fraktionierte Ansatz von N. americanus auf seine pro-apoptotische Aktivität untersucht. Jede Fraktion wurde anschließend mit Jurkat-Zellen angesetzt und der Index der Zellviabilität bestimmt. Werte von unter 1,0 weisen auf apoptotische Zellen hin. 2 stellt den Index der Zellviabilität der Fraktionen 1 bis 45 dar. Die Fraktionen 27–33 wiesen signifikant niedrigere Indizes der Zellviabilität (< 1,9) auf und zeigten damit Zelltötungsaktivitäten. Die anschließende Inkubation der Jurkat-Zellen mit diesen Fraktionen induzierte Apoptose in diesen Zellen. Die Fraktionen 27–33 wurden aufkonzentriert und über 15% SDS-Page getrennt. Das Gel wies sehr wenige Proteinbanden auf, zeigte jedoch, dass das pro-apoptotische Agens kleiner als 12 kDa sein kann.
Das Produkt der Erfindung kann zu einer Zusammensetzung für die therapeutische Anwendung formuliert werden. Entsprechende Formulierungen einschließlich annehmbarer Arzneistoffträger und Verdünnungsmittel sind dem Fachmann offensichtlich. Das Produkt kann auch mit einem Träger formuliert werden, der eine besondere Stelle in vivo, beispielsweise einen Tumor, zum Ziel hat.

Claims

Protein von weniger als 12 kDa oder ein funktionales Fragment hiervon, und mit der Fähigkeit Apoptose in reaktiven T-Zellen zu induzieren, wobei das Protein erhältlich ist durch Fraktionieren eines Überstandes, der sekretorischexkretorische Produkte von Necatoramericanus enthält.
Protein nach Anspruch 1 für die Verwendung in der Therapie.
Pro-apoptotische Zusammensetzung, umfassend einen) pharmazeutisch annehmbares(n) Verdünnungsmittel oder Träger, und ein Protein, wie in einem der vorangehenden Ansprüche definiert.
Verwendung eines Proteins, wie in irgendeinem der vorangehenden Ansprüche definiert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Krebsbehandlung.
Verwendung eines Proteins, wie in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, bei der Herstellung eines Medikaments für die Behandlung einer entzündlichen Erkrankung.