DE60129322T2

DE60129322T2 - Apoptotische körper zur verwendung in der behandlung von neurodegenerativen und sonstigen nervenerkrankungen

Info

Publication number: DE60129322T2
Application number: DE2001629322
Authority: DE
Inventors: Daniel Toronto SAUDER; Arkady North York MANDEL; Anthony E. Bolton
Original assignee: Vasogen Ireland Ltd
Current assignee: Vasogen Ireland Ltd
Priority date: 2000-05-25
Filing date: 2001-05-25
Publication date: 2008-03-13
Anticipated expiration: 2021-05-26
Also published as: ATE366581T1; AU2001261987A1; US20080131416A1; JP2003534282A; US20020044924A1; CA2309424A1; HK1055080A1; EP1289535A2; PT1289535E; DK1289535T3; US20070087010A1; ES2290134T3; WO2001089537A3; US7132285B2; EP1289535B1; DE60129322D1; TWI239843B; WO2001089537A2

Description

Erfindungsgebiet
Diese Erfindung betrifft biochemische und biologische Zusammensetzungen und deren Verwendung bei der Behandlung und/oder Prophylaxe verschiedener, neurodegenerativer und anderer neurologischer Störungen in einem Säugetierpatienten. Insbesondere betrifft sie die Behandlung und Prophylaxe von neurodegenerativen und anderen neurologischen Störungen durch Verabreichung von Zusammensetzungen, die Säugetierzellen und deren Bruchstücke enthalten, und von Zusammensetzungen, die Säugetierzellen und Bruchstücke selbst enthalten, sowie Verfahren zum Präparieren solcher Zusammensetzungen.
Erfindungshintergrund
Zwei Mechanismen des Zelltods sind bekannt, die Nekrose und die Apoptose. Die Apoptose ist der Prozess des programmierten Zelltods, der durch Kerr et al. im Jahr 1992 (J. F. R. Kerr, A. H. Wyllie, A. R. Currie, 1992, im Artikel „Apotosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implication in tissue kinetics" in der Zeitschrift „British Journal of Cancer", 26, S. 239-257) beschrieben wurde, wonach Sollwertzustände von verschiedenen Organsystemen und Geweben im Körper aufrechterhalten werden, wenn eine fortgesetzte Zellteilung und Zelldifferentation stattfindet. Die der Apoptose unterliegenden Zellen zeigen oft bestimmte, morphologische Änderungen, beispielsweise eine ausgeprägte Abnahme des Zellvolumens, eine Abänderung des Zytoskeletts, die zu einer ausgeprägten Membranpustel führt, eine Kondensation des Chromatins und einen Abbau der DNA in oligonukleosomalen Bruchstücken. Gemäß diesen morphologischen Änderungen kann eine apoptotische Zelle in eine Anzahl von kleinen Bruchstücken aufbrechen, die als apoptotische Körper bekannt sind, die im Wesentlichen aus membrangebundenen Körpern bestehen, die intakte Organellen, Chromatin usw. enthalten. Die apoptotischen Körper werden normalerweise aus dem Körper durch Phagozytose von Makrophagen, dendritischen Zellen und anderen Antigene enthaltenden Zellen entfernt, bevor sie abgebaut werden können und ihren potentiell entzündungshervorrufenden Zellinhalt freigeben.
Einfach ausgedrückt verläuft die Apoptose offenbar folgendermaßen.
Drei Phasen können beim Apoptosemechanismus des programmierten Zelltods unterschieden werden:
Einführungsphase,
Wirkphase und
Abbauphase.
Die Einführungsphase ist teilweise von besonderen Wechselwirkungen von todinduzierenden Signalen auf der Zelloberflächenmembran abhängig. Ein gemeinsames Signal wird durch die Bindung von besonderen Liganden an Rezeptoren der TNF-Rezeptorfamilie veranlasst, die auf der Zellmembran vorhanden ist. Ein solcher wichtiger Rezeptor ist Fas (APO-1, CD95), der mit dem Fas-Liganden zusammenwirkt, um die Apoptose einzuleiten.
Die Wirkphase, die durch die Bindung von Rezeptoren und Liganden der Einführungsphase aktiviert wird, führt zur Aktivierung von Kaspasen, zystinylaspartaterfordernden Proteinasen (proteolytische Enzyme) einschließlich der Kaspasen 1 und 8. Diese Aktivierung kann mit einer Änderung der Durchlässigkeit der Mitochondrien verbunden sein, wobei Zytochrom-c freigegeben werden kann, das bei der Kaspaseaktivierung beteiligt ist. Die aktivierten Kaspasen veranlassen den Aufbau einer Kette von lethalen, proteolitischen Ereignissen, die in Änderungen des Chromatins und von zytoskeletalen Komponenten gipfeln, die in der Apoptose gesehen werden.
Viele der Apoptose unterliegende Zellen können durch eine „Leiterbildung" der DNA identifiziert werden, die bei der Agarosegelelektrophorese erkannt wird und die sich aus der Spaltung der DNA in eine Reihe von Bruchstücken ergibt. Diese Änderungen treten ein paar Stunden vor dem Zelltod auf und sind als Fähigkeit einer Zelle definiert, vitale Einfärbungen auszuschließen. Das Auftreten der DNA-Leiterbildung bei der Agarosegelelektrophorese, das dem Extrahieren der DNA aus den Zellen folgt, ist ein Erkennungsverfahren zur Identifizierung von Apoptose in den Zellen (D. T. Loo und J. R. Rillema, 1998, „Measurement of Cell Death" in „Methods in Cell Biology", 57, S. 251-264), obwohl dieses Erkennungsverfahren nicht immer empfindlich genug ist, um die Apoptose zu erkennen. Ein Markieren an Ort und Stelle des nuklearen DNA-Bruchs beispielsweise, wobei kommerziell verfügbare End-dUTP-Kerbendmarkierungsanalysen (TUNEL) verwendet werden, ist eine alternative und reproduzierbarere Messung zur Bestimmung der Bruchstück-DNA in der Apoptose unterliegenden, apoptotischen Zellen (Y. Gavrieli, Y. Sherman, S. A. Ben-Sasson, 1992, „Identification of programmed cell death in situ via specific labelling of nuclear DNA fragmentation" in „Journal of Cell Biology", 119, S. 493-501).
Während der Apoptose wird Phosphatidyserin außen auf der Zellmembran freigesetzt (V. A. Fadok, D. R. Voelker, P. A. Campbell, J. J. Cohen, D. L. Bratton, P. M. Henson, 1992, im Artikel „Exposure of phosphatidylserine an the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages" in „Journal of Immunology", 148, S. 2207-2216), und dieses freigesetzte Phosphatidyserin bindet sich an besondere Rezeptoren, um die Aufnahme und die Entfernung der apoptotischen Zelen in Säugetieren zu veranlassen (V. A. Fadok, D. L. Bratton, D. M. Rose, A. Pearson, R. A. B. Ezekewitz, P. M. Henson, 2000, „A receptor for phosphatidylserinespecific clearence of apoptotic cells" in „Nature", 405, S. 85-90). Die Oberflächenex pression von Phosphatidyserin auf den Zellen ist ein weiteres Erkennungsverfahren für die Identifizierung von apoptotischen Zellen.
Änderungen in der mitochondrischen Unversehrtheit sind mit der Apoptose wesentlich vebunden und ergeben Durchlässigkeitsänderungen der mitochondrischen Membran und die Freisetzung von Zytochrom-c aus den Mitochondrien in das Zellzytoplasma (S. A. Susin, H. K. Lorenzo, N. Zamzami, I. Marzo, C. Brenner, N. Larochette, M. C. Prevost, P. M. Alzari und G. Kroemer, 1999, „Mitochondrial Release of Caspase-2 and -9 during the Apoptotic Process" in „Journal of Experimental Medicine", 189, S. 381-394). Das Messen der Potentialänderungen der mitochondrischen Membran, die die Durchlässigkeitsänderungen der mitochondrischen Membran widerspiegeln, ist ein weiteres Erkennungsverfahren zum Identifizieren von apoptotischen Zellen.
Eine Anzahl weiterer Verfahren zur Identifizierung von der Apoptose unterliegenden Zellen und apoptotischen Zellen sind ebenfalls in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben worden, wobei viele Verfahren monoklonale Antikörper statt besondere Marker für apoptotische Zellen verwenden.
Im Gegensatz dazu ist die Nekrose ein Zelltod pathologischer Natur, die sich aus einer Verletzung, bakteriellen Giftwirkungen, Entzündungsvermittlern usw. ergeben und eine Membranverletzung und eine Freisetzung des Zellinhalts in das umgebende Gewebe einschließt, oft mit leidvollen Entzündungsfolgen. Daher besteht ein Weg, auf dem Nekrosezellen erkannt und gekennzeichnet werden können, darin, gefährdete Zellmembranen zu erkennen, d.h. durch Einfärbeverfahren mit Propidiumjodid, dem eine Flusszytometrie oder Mikroskopie folgt.
Zusammenfassung der Erfindung
Der Erfindungsgegenstand ist in den Ansprüchen niedergelegt.
Nach einem ersten Gesichtspunkt vorliegender Erfindung ist die Verwendung von apoptotischen Körpern und/oder von apoptotischen Zellen beim Präparieren eines Medikamentes zur Behandlung und Prophylaxe einer neurodegenerativen oder neurologischen Störung in einem Säugetierpatienten vorgesehen, wobei die apoptotischen Körper und/oder apoptotischen Zellen mit den Blutzellen des Patienten verträglich sind.
Nach einem zweiten Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung vorgesehen, die eine flüssige Aufschlämmung von Zellmaterial aufweist, wobei 10% bis 90% des Zellmaterials apoptotische Körper und/oder apoptotische Zellen sind.
Diese Erfindung ist teilweise auf eine neue und unerwartete Entdeckung gerichtet, die apoptotische Zellen in Säugetieren und/oder apoptotische Körper betrifft, die vorher ex vivo präpariert worden sind; sie kann bei der Vorsorge und/oder bei der Behandlung von neurodegenerativen und/oder neurologischen Störungen im behandelten Säugetier verwendet werden.
Demgemäß ist diese Erfindung gemäß einem ihrer Zusammensetzungsaspekte auf eine pharmazeutische Zusammensetzung gerichtet, die ein pharmazeutisch annehmbares Auszugsmittel und eine wirksame Menge an apoptotischen Zellen und/oder apoptotischen Körpern aufweist.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen weisen vorzugsweise ein wässriges, pharmazeutisch annehmbares Auszugsmittel auf, obwohl auch andere Auszugsmittel verwendet werden können.
Wie erwähnt worden ist, sind diese Zusammensetzungen bei der Vorsorge und/oder der Behandlung von neurodegenerativen und/oder neurologischen Störungen in Säugetieren nützlich. Daher ist diese Erfindung gemäß einem ihrer Verfahrensaspekte auf ein Behandlungs- oder Vorsorgeverfahren gegen neurodegenerative und andere neurologische, medizinische Störungen in einem Säugetierpatienten gerichtet, wobei dieses Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge an apoptotischen Körpern und/oder apoptotischen Zellen aufweist.
Diese Verfahren werden vorzugsweise dadurch durchgeführt, dass die hier beschriebenen, pharmazeutischen Zusammensetzungen dem Patienten verabreicht werden.
Kurzbeschreibung der Zeichnung
Das Schaubild in der Figur zeigt einen Vergleich des Anschwellens des Ohrgewebes bei Mäusen, die mit den Zusammensetzungen dieser Erfindung behandelt worden sind, mit Mäusen einer Kontollgruppe.
Beschreibung von bevorzugten Ausführungsbeispielen
Diese Erfindung ist auf die Behandlung und/oder Vorsorge von neurodegenerativen und/oder anderen neurologischen Störungen durch Verabreichung von apoptotischen Zellen und/oder Körpern gerichtet.
Neurodegenerative Störungen, die das Down-Syndrom, die Alzheimer Krankheit und die Parkinson'sche Krankheit umfassen, sind mit ansteigenden Mengen an reaktiven Sauerstoffarten (ROS) und bestimmten entzündlichen Zytokinen verbunden, die Inter leukin-1β (IL-1β) umfassen (s. W. S. T. Griffin, L. C. Stanley, C. Ling, L. White, V. Macleod, L. J. Perrot, C. L. White, C. Araoz, 1989, „Brain interleukin 1 and S-100 immunoreactivity are elevated in Down's syndrome and Alzheimer disease" in „Proceedings of the National Academy of Sciences", USA, 867611-7615; M. Mogi, M. Harada, H. Narabayashi, H. Inagaki, M. Minami, T. Nagatsu, 1996, „Interleukin (IL)-1 beta, IL-1, IL-4, IL-6 and transforming growth factor-alpha levels are elevated in ventricular cerebrospinal fluid in juvenile parkinsonism and Parkinson's disease" in „Neuroscience Letters", 211, S.13-16). Es ist auch gezeigt worden, dass IL-1β den langdauernden, starken Synergismus (gegenseitige Stoffbeeinflussung) im Hippocampus verhindert (s. C. A. Murray, M. A. Lynch, 1998, „Evidence that increase hippocampal expression of the cytokine interleukin-1β is a common trigger for age and stressinduced impairments in long-term potentation" in „Journal of Neuroscience", 18, S. 2974-2981). Der Langzeitsynergismus im Hippocampus ist eine Form der synaptischen Plastizität und wird für ein geeignetes Modell für das Erinnern und Lernen gehalten (T. V. P. Bliss, G. I. Collinridge, 1993, „A synaptic model of memory: long-term potentation in the hippocampus" in „Nature", 361, S. 31-39). Daher glaubt man gegenwärtig, dass eine ungeeignete Zytokinexpression im Gehirn in der Entwicklung und im Fortschritt von neuroentzündlichen Störungen vorkommt.
Neurodegenerative und andere neurologische Störungen, die mit der vorliegenden Erfindung behandelbar sind, umfassen das Down-Syndrom, die Alzheimer-Krankheit, die Parkinson'sche Krankheit, die Altersdemenz, die Depression und dergleichen. Im Wesentlichen kann jede neurodegenerative oder andere neurologische Krankheit mit dieser Erfindung behandelt werden.
"Apoptotische Zellen" und „apoptotische Körper" sind Bezeichnungen, die hier verwendet werden und Zellen und Zellkörper bedeuten, die ein oder mehrere der folgenden, apoptosekennzeichnenden Merkmale verhindern: die Oberflächenbloßlegung von Phosphatidylserin, wie sie durch akzeptierte Standarderkennungsverfahren wie die Annexin-V-Analyse erkannt wird, die Durchlässigkeitsänderungen der mitochondrischen Membran, wie sie durch akzeptierte Standardverfahren gemessen werden (beispielsweise S. Salvioli, A. Ardizzoni, C. Franceschi, A. Cossarizza. 1997, „IC-1, but not DiOC6(3) or Rhodamine 123, is a Reliable Fluorescent Probe to assess Delta Psi Changes in Intact Cells: Impications for Studies an Mitochondrial Functionality during Apoptosis" in „FEBS Letters", 411, S. 77-82), das Auftreten von DNA-Bruchstücken, wie das Auftreten der DNA-Leiterbildung bei der Agarosegelelektrophorese, die der Extraktion der DNA aus den Zellen folgt (E. Teiger, T. V. Dam, L. Richard, C. Wisnewsky, B. S. Tea, L. Gaboury, J. Tremblay, K. Schwartz und P. Hamet, 1996, „Apoptosis in Pressure Overload-induced Heat Hypertrophy in the Rat" in „Journal of Clinical Investigation", 97, S. 2891-2897) oder durch das Markieren an Ort und Stelle (s. Gavrieli et al., 1992, wie oben angegeben).
Die apoptotischen Zellen und/oder apoptotischen Körper zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung weisen vorzugsweise nicht mehr als etwa 35 Gew.-% Nekrosezellen und/oder Nekrosekörper, besser nicht mehr als etwa 20 Gew.-% und noch besser nicht mehr als etwa 10 Gew.-% auf. Bei diesen Mengen wird voraussichtlich das Vorhandensein solcher Nekrosezellen und/oder Nekrosekörper die in-vivo-Prozesse nicht wesentlich ändern. In ihren bevorzugtesten Verkörperungen sind die apoptotischen Zellen bzw. Körper im Wesentlichen frei von Nekrosezellen und/oder -körpern (d.h. weniger als etwa 2 Gew.-% Nekrosezellen bzw. -körper).
Die apoptotischen Zellen und/oder apoptotischen Körper zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung werden ex vivo aus Säugtierzellen präpariert, die mit den Zellen des Säugetierpatienten kompatibel sind. Sie können aus im Wesentlichen jeder Art von Säugetierzellen präpariert werden, die kultivierte Zelllinien aufweisen. Vorzugsweise werden sie aus einer Zellart präpariert, die vom eigenen Körper des Säugetier- Patienten oder von einer bestehenden Zelllinie abgeleitet ist. Besser werden sie von weißen Blutzellen von Blut, das mit dem des Säugetierpatienten kompatibel ist, besser von den eigenen, weißen Blutzellen des Patienten und noch besser von den eigenen T-Lyphozyten des Patienten präpariert. Sogar noch besser ist das Präparieren aus einer bestehenden Zelllinie. Die apoptotischen Zellen und/oder apoptotischen Körper werden außerhalb des Körpers vor der Verabreichung an den Patienten präpariert. So kann bei einer Verkörperung eine Stichprobe des Patientenbluts genommen, beispielsweise durch eine Venenpunktur, und mindestens ein Teil der weißen Zellen dieser Stichprobe außerhalb des Körpers apoptoseinduzierenden Bedingungen ausgesetzt werden.
Eine Vielfalt von Verfahren zur Einführung der Apoptosis in Säugetierzellen sind dem Fachmann bekannt, um apoptotische Zellen und/oder apoptotische Körper zu erzeugen, und im Wesentlichen jedes Verfahren kann für das Präparieren der apoptischen Körper zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung genommen werden. Ein solches Verfahren besteht darin, Zellen einer Ionisationsstrahlung (Y-Strahlen, X-Strahlen usw.) und/oder einer nicht ionisierenden, elektromagnetischen Strahlung, beispielsweise ultraviolettem Licht, auszusetzen. Die Apoptose kann dadurch eingeführt werden, dass die Zellen einem Ultraschall ausgesetzt werden.
Ein weiteres Verfahren ist die Behandlung mit Präparaten, wie nichtspezische Proteinkinasehemmern, beispielsweise Staurosporin (s. Bombeli, Karsan, Tait und Hirlan, 1997, „Apoptotic Vascular Endothelial Cells Become Procoagulant" in „Bond", Vol. 89, S. 2429-2442). Ferner führen bestimmte, chemotherapeutische Wirkmittel, die für die Behandlund von bösartigen Tumoren verwendet werden, die Apoptose ein, beispielsweise Adriamycin oder Statinpräparate (3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Koenzym-A-Reduktase-Hemmer) (s. C. Guijarro, L. M. Blanco-Colio, M. Ortego, C. Alonso, A. Ortiz, J. J. Plaza, C. Diaz, G. Hermandez, J. Edigo, 1998, „3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase and isoprenylation inhibitors induce apoptosis of vascular smooth muscle in culture" in „Circulation Research", 83, S. 490-500) und Colcicin (s. Y. Suzuki, 1998, Cell death, phagocytosis and neurogenesis in mouse olfactory epithelium and vormeronasal organ alter colcine treatment" in „Annals of the New York Academy of Science", 855, S. 252-254). Die Verwendung von Liganden für die Todrezeptoren auf den Zellen, beispielsweise der Fas-Ligand, geht aus der Apoptoseeinführung hervor, wie sie oben erörtert wurde.
Ein weiteres Verfahren ist die Anwendung von oxidativem Stress bei den Zellen außerhalb dieser (s. beispielsweise Buttke und Sandstrom, 1994, „Oxidative Stress as a Mediator of Apoptosis" in „Immunology Today", Vol. 15, S. 7-10). Dies kann dadurch erfolgen, dass aufgeschlämmte Zellen mit chemischen Oxidierungsmitteln, wie Hydrogenperoxid, anderen Peroxiden und Hydroperoxiden, Ozon, Permanganaten, Periodaten und dergleichen, behandelt werden. Solche biologisch akzeptablen Oxidierungsmittel werden vorzugsweise dazu verwendet, die Potentialprobleme zu vermindern, die mit Resten und Kontaminationn der so gebildeten, apoptotischen Zellen und apoptotischen Körper verbunden sind.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf ein besonderes Verfahren zur Erzeugung von apoptotischen Zellen und apoptotischen Körpern beschränkt, und jedes geeignete, bekannte Verfahren kann verwendet werden.
Die Verfahren zur Erkennung und Quantisierung der Apoptose kann dazu verwendet werden, das Vorhandensin und die Größe der Apoptose beim Präparat festzulegen, das dem Patienten gemäß der Erfindung verabreicht wird. Mindestens eines derjenigen Verfahren, die in der Einleitung oben beschrieben worden sind, sollte dazu verwendet werden, die vor der Verabreichung erreichte Apoptosegröße zu bestätigen. Die Wirkmittel werden vor der Benutzung in geeigneter Weise durch bekannte Verfahren gereinigt, beispielsweise durch Differentialzentrifugieren.
Beim Präparieren der apoptotischen Zellen und/oder apoptotischen Körper sollte dafür gesorgt werden, dass nicht exzessive Größen an oxidativem Stress, an Strahlung, an Präparatbehandlung usw. angewandt werden, weil sonst ein bedeutendes Risiko der Verursachung von Nekrose bei mindestens einigen der behandelten Zellen auftritt. Die Nekrose verursacht Zellmembranbruch und die Freigabe von Zellinhalten oft mit biologisch leidvollen Folgen, insbesondere Entzündungsfällen, so dass das Auftreten von Nekrosezellen und deren Komponenten zusammen mit den apoptotischen Körpern besser vermieden wird. Geeignete Behandlungsgrößen der Zellen zur Schaffung von apoptotischen Körpern zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung hängen zu einem gewissen Grad von der Natur der gewählten Zellen und Zellzusammensetzung und von der für die Apoptoseeinführung gewählten Behandlungsart ab. Solche geeignete Apoptosegrößen können vom Fachmann leicht bestimmt werden, der Kenntnis von der verfügbaren Wissenschaftsliteratur auf dem entsprechenden Gebiet einschließlich der oben erwähnten Artikel hat.
Ein bevorzugtes Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Kultivieren von Zellen des Patienten oder einer kompatiblen Säugetierzelllinie. Die kultivierten Zellen können dann derart behandelt werden, dass die Apoptose induziert wird und apoptotische Zellen und/oder apoptotische Körper darin erzeugt werden. Die Zellen, die im Patientenplasma oder einem anderen, geeigneten Aufschlämmungsmittel, beispielsweise Salzlösung oder ein ausgeglichenes Säugetierzellkulturmittel, können dann verabreicht werden, wie es im Folgenden erläutert wird. Die Anzahl der apoptotischen Zellen und/oder apoptotischen Körper können durch bekannte Verfahren bestimmt werden, die in der wissenschaftlichen Literatur auf diesem Gebiet einschließlich der oben genannten Artikel beschrieben worden sind. Die Anzahl der apoptotischen Zellen und/oder apoptotischen Körper, die zur Verabreichung an den Patienten erforderlich ist, um den erforderlichen, klinischen Erfolg zu erhalten, ändert sich abhängig von den Zellquellen, dem Zustand des Patienten, dem Alter und dem Gewicht des Patienten und von anderen, relevanten Faktoren, die von dem behandelnden Arzt leicht bestimmbar sind.
Ein Beispiel für ein bevorzugtes Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst die Extraktion einer Blutprobe vom zu behandelnden Patienten, die Abtrennung der weißen Zellen aus dieser Blutprobe und die Behandlung der weißen Zellen unter apoptoseverursachenden Bedingungen, so dass eine Zellzusammensetzung geschaffen wird, in der bedeutende Anzahlen von weißen Zellen die Apoptose aufweisen, so dass also bedeutende Anzahlen von apoptotischen Zellen und/oder apoptotischen Körpern darin geschaffen werden. Noch besser können T-Lymphozyten, die aus dem Blut durch bekannte Mittel isoliert und wie oben aufgeschlämmt werden, als Quelle für die apoptotischen Zellen und/oder apoptotischen Körper verwendet werden.
Eine geeignete Anzahl der lebensfähigen Zellen, die für die Behandlung ausgewählt werden, um apoptotische Zellen und/oder apoptotische Körper zu erzeugen, beträgt etwa 4 × 10⁹, vorzugsweise etwa 10⁶ bis etwa 10⁹ und besser noch 5 × 10⁷ bis etwa 15 × 10⁷ für jede Verabreichung an einen menschlichen Patienten. In etwa 10-90%, vorzugsweise etwa 30-70%, der Zellzusammensetzung zur Verabreichung sind apoptotische Zellen und/oder apoptotische Körper enthalten, wobei der Rest aus lebensfähige Zellen und Nekrosezellen besteht. Daher sind die bevorzugten Mengen an apoptotischen Zellen und/oder apoptotischen Körpern zur Verabreichung solche, die erzeugt werden, wenn diese Zellanzahlen den Apoptosebedingungen unterworfen werden. Wenn das ganze Blut als Zellquelle verwendet wird, die den apoptoseinduzierenden Bedingungen unterworfen wird, werden diese Anzahlen an weißen Zellen in Blutproben mit einem Volumen von bis zu etwa 400ml, vorzugsweise bis zu 100ml, gewinnbar. Besser noch sollen 5 × 10⁷ bis 15 × 10⁷ weiße Zellen in einem Blutprobenvolumen von 10-30ml enthalten sein.
Das dem Patienten zur Behandlung zur Schaffung von apoptotischen Zellen und/oder apoptotischen Körpern entnommene Blutprobenvolumen beträgt in geeigneter Weise bis zu etwa 400ml, vorzugsweise etwa 0,1 bis etwa 100ml und noch besser etwa 5 bis etwa 15ml. Daher sind bevorzugte Mengen an apoptotischen Zellen und/oder apoptotischen Körpern zur Verabreichung solche, die den Anzahlen entsprechen, die von den weißen Blutzellen ableitbar oder von T-Lymphozyten isoliert sind, die in diesen Mengen des ganzen Bluts enthalten sind, wobei diese bevorzugten Mengen aus der Unterwerfung unter die apoptoseinduzierenden Bedingungen hervorgehen.
Die Aufschlämmung der behandelten, apoptotischen Zellen und/oder apoptotischen Körper zur Verabreichung an den Patienten wird in einem biologisch annehmbaren, flüssigen Aufschlämmungsmittel, beispielsweise das Patientenserum oder -plasma, einer Salzlösung oder einem ausgeglichenen Säugetierzellkulturmedium, präpariert. Das Zufügen weiterer Faktoren, beispielsweise von Zytokinen, Hormonen, Produkten aus Stresszellen oder von anderem, biologisch aktiven Material kann die Vorzüge des verabreichten, apoptotischen Zellmaterials erhöhen. Die Probe kann in den Patientenkörper durch jedes geeignete Verfahren eingeführt werden, am besten durch eine intramuskuläre Injektion, doch sind auch eine subkutane Injektion, eine Minitransplantation, eine intraperitoneale Injektion, eine intraarterielle Injektion, eine intravenöse Injektion und eine orale Verabreichung möglich. Die apoptotischen Einheiten können an das besondere Körperorgan und/oder an die besondere Körperstelle unter Verwendung jedes geeigneten, bekannten Abgabesystems abgegeben werden.
Die Zusammensetzungen gemäß dieser Erfindung können wahlfrei ein pharmazeutisch annehmbares Auszugsmittel aufweisen. Einige Beispiele für ein solches Auszugsmittel umfassen steriles Wasser, sterile Salzlösung, phosphatgepufferte Salzlösung und dergleichen.
Wenn die pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden, weisen sie eine wirksame Menge an apoptotischen Zellen bzw. Körpern auf, um eine geeignete, prophylaktische und/oder therapeutische Wirkung im Patienten zu erzielen, der Gefahr läuft, an einer neurodegenrativen Störung zu leiden, oder der an dieser Störung leidet. Vorzugsweise weist die dem Säugetierpatienten verabreichte Zusammensetzung etwa 10⁴-10⁷ apoptotische Zellen oder Körper je Kilogramm Körpergewicht, besser etwa 5 × 10⁵-5 × 10⁶ und noch besser etwa 15 × 10⁵ bis etwa 4 × 10⁶ apoptotische Zellen und/oder Körper je Kilogramm Körpergewicht auf. Die besondere, verwendete Dosis hängt tatsächlich vom Alter, Gewicht und der Schwere der Störung im behandelten Patienten ab, wobei all diese Abhängigkeiten dem behandelnden Arzt bekannt sind.
Für die wirksamste Behandlung und/oder Vorsorge der Säugetierstörungen, die eine neurodegenerative oder neurologische Krankheit umfassen, kann dem Patienten eine Reihe von Behandlungen mit apoptotischen Zellen und/oder apoptotischen Körpern gemäß der vorliegenden Erfindung verordnet werden. Jede Behandlungsreihe kann die Verabreichung von 1-6 Proben aus aufgeschlämmten Zellmaterial umfassen, wie sie oben beschrieben wurden. Nicht mehr als eine solche Probe sollte pro Tag verabreicht werden, und die maximale Restperiode zwischen beliebigen zwei aufeinander folgenden Verabreichungen sollte nicht größer als etwa 21 Tage sein. Zusatzbehandlungen, wie sie unten beschrieben werden, können vorteilhaft verwendet werden. Um die gewünschten Wirkungen zu erzielen, kann der Patient Zusatzbehandlungen unterzogen werden, wobei eine Verabreichungsreihe mit Proben aus aufgeschlämmten, apoptotischen Zellen und/oder apoptotischen Körpern in Intervallen von drei bis vier Monaten durchgeführt wird.
Wie erwähnt worden ist, ist die vorliegende Erfindung bei der Behandlung und Vorsorge von einer großen Vielfalt von neurodegenerativen und anderen neurologischen Säugetierstörungen anwendbar. Diese Störungen umfassen das Down-Syndrom, die Alzheimer Krankheit, die Parkinson-Krankheit, die Altersdemenz, die Depression, die multiple Sklerose, die Huntington-Krankheit, periphere Neuropathien, Rückenmarkskrankheiten, neuropathische Verbindungskrankheit, chronische, entzündliche, demyelinierende Krankheit (CIPD) und Neuropathien, die die Mononeuropathie, die Polyneuropathie, die symmetrische, ferne Sensorneuropathie, die zystische Fibrose, neuromuskuläre Verbindungsstörungen und die Myasthenien betreffen. Die Erfindung ist jedoch nicht auf die Behandlung dieser Krankheiten beschränkt. Insgesamt kann im Wesentlichen jede neurodegenerative oder andere neurologische Störung behandelt werden.
Die Erfindung wird nun anhand der folgenden, besonderen Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1
Experimente zur Demonstration der Erfindung wurden mit Laboratoriumsmäusen unter geprüften Bedingungen für die Durchführung solcher Experimente durchgeführt.
Die Wirksamkeit der Behandlung gemäß einer bevorzugten Ausführung der vorliegenden Erfindung bei Kontakthypersensivität (CHS), ein Beispiel für eine Th-1-Zellentzündungsstörung, die bekanntlich durch Entzündungszytokine verursacht wird, wurde mit Laboratoriumsmäusen gemäß geprüften Tierexperimentverfahren bewertet, wobei ein Verfahren verwendet wurde, das von Kondo et al. im Artikel „Lymphocyte function associated antigen-1 (LFA-1) is required for maximum elicitation of allergic contact dermatitis" in „Br. J. Dermatol.", 131, S. 354-359, 1994, mit wenigen Variationen beschrieben wurde. Die Offenbarung in diesem Artikel soll hier eingeschlossen sein. Kurz gesagt, um CHS einzuführen, wurde die Bauchhaut jeder Maus abgeschabt und mit Dinitrodifluorobenzen (DNFB), einer Sensibilisierungschemikalie, eingepinselt, wobei 25µl aus 0,5%-igem DNFB in einer 4:1-Azeton-Olivenöllösung ver wendet wurde. Diese Sensibilisierungschemikalie wurde zwei Gruppen Balb/c-Mäusen, insgesamt 10 Mäusen, verabreicht.
Apoptotische Körper wurden aus Murinfibroblasten präpariert. Die Murinfibroblasten wurden mit 50mM Natriumbutyrat in einem RPMI-Medium bei einem Zufluss von einem Tag behandelt, und dann wurde das Natriumbutyrat-Medium ausgetauscht. Um die Anzahl der apoptotischen Zellen und Körper zu erhöhen, können die Zellen zusätzlich mit UV-Licht (beispielsweise 75mj) bestrahlt werden. Die Schwimmzellen enthaltende, überstehende Flüssigkeit wird 24 Stunden nach der Bestrahlung entfernt.
Die apoptotischen Körper wurden durch Zentrifugieren der überstehenden Flüssigkeit quantisiert (12000/min, 5 Minuten), wobei diese Flüssigkeit aufgesaugt wurde, die sich ergebenden Zellkügelchen mit PBS gewaschen und wie oben wieder zentrifugiert wurden. Die die apoptotischen Körper enthaltenden Kügelchen wurden in PBS wieder aufgeschlämmt. Die Zellen wurden in PBS bei einer Temperatur von 4°C für die Dauer des Experiments gespeichert. Die für die Quantisierung zu färbenden Zellen wurden wieder in einem 1X-Bindungspuffer bei einer Konzentration von 1 × 10⁶ Zellen/ml aufgeschlämmt. 100µl der Zellen wurden in ein 5ml-Rohr übertragen, und 10µl fluoreszeinkonjugiertes Annexin V und 10µl Propidiumjodid-Reagenzmittel wurden zugefügt. Die Zellen wurden gründlich verwirbelt, und die Zellmischung wurden 15 Minuten lang bei einer Temperatur von 25°C in Dunkelheit bebrütet. Nach der Bebrütung wurden 400µl des 1X-Bindungspuffers zu jedem Rohr zugegeben. Die Probe wurde mit einem Flusszytometer über eine Stunde lang analysiert.
Von den zwei Gruppen der sensilibierten Mäuse erhielt die Kontrollgruppe A keine Behandlung. Die zweite Gruppe, die Prüfgruppe B, wurde mit einer Injektion von aufgeschlämmten, apoptotischen Körpern präpariert, wie es oben beschrieben wurde, wobei 50µl-Volumen mindestens 150000 Körper je Blutinjektion enthielt und das Blut Stressverursachern unterworfen wurde, wie es oben beschrieben wurde. Jede Behandlung umfasste eine intramuskuläre Injektion von 50µl der entsprechenden Flüssigkeit, die am Tag der Sensilibierung begonnen wurde, und wurde jeden Tag für insgesamt sechs Tage wiederholt. Am letzten Tag der Behandlung, aber nach dem Behandlungsende, wurden die Tiere mit DNFB behandelt, wobei 10µl aus einer 0,2%igen Lösung von DNFB in Azeton und Olivenöl am rechten Ohr jedes Tiers angewendet wurden. Am linken Ohr jedes Tiers wurde das Azeton-Olivenöl-Lösungsmittel ohne DNFB angewendet. Die aufgrund von CHS auftretende Entzündung selbst ist eine Anschwellung der rechten Ohren. Die Ohrdicke wurde 24 Stunden nach der DNFB-Behandlung mit einem federbelasteten Peacock-Mikrometer (Ozaki Co. Tokio, Japan) gemessen. Die Ergebnisse wurden als Dicke und Dickendifferenz der rechten Ohren und der linken Ohren jedes Tiers 24 Stunden nach der DNFB-Behandlung ausgedrückt.

Die Experimente wurden ausreichend oft wiederholt, um den statistischen Wert der Ergebnisse zu gewährleisten, wobei mehr Sätze aus zwei Gruppen verwendet wurden. Eine bemerkendwerte und bedeutende Verminderung der Ohrdicke (Entzündung) wurde bei Tieren beobachtet, die mit apoptotischen Zellen und apoptotischen Körpern in der Aufschlämmung gemäß der Erfindung im Vergleich mit der unbehandelten Gruppe behandelt wurden, wobei eine bedeutende Verminderung der Entzündung auftrat. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle und in der beigefügten Figur wiedergegeben, in der ein Balkendiagramm des Ohrgewebeanschwellens (Differenz zwischen der Dicke des rechten Ohrs und des linken Ohrs) für jede Gruppe mit einer „Standardabweichung" dargestellt ist, die durch eine vertikale Linie am oberen Ende jedes Balkens gezeigt ist. Tabelle 1

Gruppe	Linkes Ohr	Rechtes Ohr	Differenz
A	17	31	14
A	18	39	21
A	17	30	13
A	18	32	14
A	18	31	13
			Mittelwert: 15 S.D: 3.391165
B	21	31	10
B	18	18	0
B	17	30	13
B	20	24	4
B	18	22	4
			Mittelwert: 6,2 S.D: 5.215362

Eine Analyse der Aufschlämmung der apoptotischen Zellen und Körper, die den Tieren der Prüfgruppe B verabreicht wurden, zeigte, dass darin etwa 40% apoptotische Zellen und Körper vorhanden waren, wobei der Rest aus lebensfähigen Zellen und aus geringen Mengen von Nekrosezellen (nicht mehr als 20%) bestand, deren Vorhandensein für unbedeutend im in-vivo-Prozess gehalten werden.
Beispiel 2
Das obige Prüfverfahren wurde mit ähnlichen Tiergruppen, nämlich einer Kontrollgruppe und einer Prüfgruppe, durchgeführt, doch wurde eine Aufschlämmung aus apoptotischen Zellen und apoptotischen Körpern bei der Prüfgruppe verwendet, wobei diese Aufschlämmung etwa 60% apoptotische Zellen und Körper und der Rest lebensfähige Zellen und eine geringe Menge (nicht mehr als 20%) von Nekrosezellen enthielt. Im Wesentlichen wurden ähnliche Ergebnisse erzielt.
Die Wirksamkeit der Prozesse und Zusammensetzungen gemäß der vorliegenden Erfindung bei der Verhinderung und Linderung der aufgrund der CHS entstehenden Entzündung zeigt, dass die Verabreichung der beschriebenen, apoptotischen Zellen und Körper die in-vivo-Erzeugung von antientzündlichen, von Th-2 abgeleiteten Zytokinen, beispielsweise IL-10 (von dem bekannt ist, dass es im Zusammenhang mit CHS steht, siehe Kondo, McKenzie und Sauder in der Zeitschrift „The Journal of Investigative Dermatology", Vol. 103, 1994, S. 811-814), erhöht und/oder die Th-2-Entzündungszytokine, beispielsweise TNFα und IL-6, vermindert. Diese Entzündungszytokine stehen im Zusammenhang mit entzündungsbezogenen Störungen des Gehirns, nämlich mit neuroentzündlichen, neu rodegenerativen und neurologischen Störungen wie die Alzheimer Krankheit, die Altersdemenz, die multiple Sklerose, die Depression, das Down-Syndrom, die Huntington-Krankheit, die peripheren Neuropathien, die Rückenmarkskrankheiten, die neuropathischen Verbindungskrankheiten, die chronische, entzündungsdemyelinierende Krankheit (CIPD), die Neuropathien einschließlich der Mononeuropathie, Polyneuropathie, symmetrischen, distalen Sensorneuropathie, Zystenfibrose, neuromuskulären Verbindungsstörungen, Myasthenien und Parkinson'schen Krankheit.
Neurodegenerative Krankheiten einschließlich Down-Syndrom, Alzheimer Krankheit und Parkinson-Krankheit sind mit erhöhten Werten gewisser Entzündungszytokine verbunden, die Interleukin-1β (IL-1β) enthalten (s. W. S. T. Griffin, L. C. Stanley, C. Ling, L. White, V. Macleod, L. J. Perrot, C. L. White, C. Araoz im Artikel „Brain interleukin 1 and S-100 immunoreactivity are elevated in Down syndrome and Alzheimer disease" in „Proceedings of the National Academy of Sciences", USA 867611-7615; M. Mogi, M. Harada, H. Narabayashi, H. Inagaki, M. Minami, T. Nagatsu, 1996, im Artikel „Interleukin IL-1β, IL-1, IL-4, IL-6 and transforming growth factor-alpha levels are elevated in ventricular cerebrospinal fluid in juvenile parkinsonism and Parkinsons disease" in „Neuroscience Letters", 211, S. 13-16). Es ist auch gezeigt worden, dass IL-1β die Langzeitentwicklung im Hippocampus verhindert (C. A. Murray, M. A. Lynch, 1998, im Artikel „Evidence that increase hippocampal expression of the cytokine interleukin-1β is a common trigger for age and stress-induced impairments in long-term potentiation" in „Journal of Neuroscience", 18, S. 2974-2981). Die Langzeitentwicklung im Hippocampus ist eine Form der synaptischen Plastizität und wird generell als ein geeignetes Modell für das Erinnern und Lernen angesehen (T. V. P. Bliss, G. L. Collinridge, 1993, im Artikel „A synaptic model of memory: long-term potentiation in the hippocampus", in „Nature", 361, S. 31-39). Daher wird eine ungeeignete Zytokinexpression im Gehirn als mit der Entwicklung und dem Fortschreiten von neurodegenerativen Krankheiten verwickelt angesehen. Daher ist das bei den obigen Beispielen auftretende Erfolgsergebnis bei der CHS-Behandlung mit deren verbundener Abnahme der Th-1-Entzündungszytokine ein Anzeichen für eine erfolgreiche Verwendung des Verfahrens und der Zusammensetzungen bei der Behandlung und Vorsorge einer breiten Vielfalt von neurologischen Störungen, die die oben erwähnten Krankheiten einschließen.

Claims

Verwendung von apoptotischen Körpern und/oder von apoptotischen Zellen beim Präparieren eines Medikaments zur Behandlung und Prophylaxe einer neurodegenerativen oder neurologischen Störung in einem Säugetierpatienten, wobei die apoptotischen Körper und/oder apoptotischen Zellen mit den Blutzellen des Patienten kompatibel sind.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament eine flüssige Aufschlämmung ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die apoptotischen Körper und/oder apoptotischen Zellen 10-90% des zellulären Teils des Medikaments bilden.
Verwendung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die apoptotischen Körper und/oder apoptotischen Zellen 30-70% des zellulären Teils des Medikaments bilden.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die apoptotischen Körper und/oder apoptotischen Zellen von einer außerkörperlichen Behandlung der Blutzellen abgeleitet sind, die mit denen des Säugetierpatienten kompatibel sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die apoptotischen Körper und/oder apoptotischen Zellen von hergestellten, gezüchteten Zelllinien abgeleitet sind.
Verwendung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Blutzellen weiße Zellen sind.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die weißen Blutzellen die eigenen, weißen Blutzellen des Patienten sind.
Verwendung nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die weißen Blutzellen die eigenen T-Lymphozyten des Patienten sind.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Störung aus der Gruppe ausgewählt ist, die die Alzheimer-Erkrankung, senile Demenz, multiple Sklerose, Parkinson-Krankheit, Depression, das Down-Syndrom, die Huntington-Krankheit, periphere Neuropathien, Rückenmarkerkrankungen, Erkrankungen neuropathischer Verbindungen, die chronische, demyelenierende Erkrankung (CIPD) und Neuropathien umfasst, die die Mononeuropathie, Polyneuropathie, symmetrische, distale, sensorische Neuropathie, zystische Fibrose, neuromuskuläre Verbindungskrankheit und Myastenien einschließen.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass eine Einheitsdosis des Medikaments zur Verabreichung in einen menschlichen Patienten präpariert wird und diese Einheitsdosis 10000 bis 10000000 apoptotische Körper und/oder apoptotische Zellen je Kilogramm des Körpergewichts des Patienten enthält.
Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Einheitsdosis 500000 bis 5000000 apoptotische Körper und/oder apoptotische Zellen je Kilogramm des Körpergewichts des Patienten enthält.
Verwendung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Einheitsdosis 1500000 bis 4000000 apoptotische Körper und/oder apoptotische Zellen je Kilogramm des Körpergewichts des Patienten enthält.
Verwendung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament für die Verabreichung durch eine intramuskuläre Injektion geeignet ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung mit einer flüssigen Aufschlämmung von Zellmaterial, wobei 10-90% des Zellmaterials durch apoptotische Körper und/oder apoptotische Zellen gebildet sind.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die apoptotischen Körper und/oder apoptotischen Zellen 30-70% des Zellmaterials enthalten.