JP6272820B2 - Ｈｉｖ特異的ｔ細胞応答のモニタリング方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答をモニタリングし、ＨＩＶ進行を制御することができるかまたはＨＩＶ感染を完全に予防することができる被験体を同定するための方法および診断キットに関する。

ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の配列多様性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける抗ウイルスＴ細胞免疫の高信頼性評価、および有効かつ広範囲に適用可能なＨＩＶワクチンの設計にとって大きな障害である。Ｂｒａｎｄｅｒ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００６；１８（４）：４３０−４３７参照。

ＨＩＶの配列多様性は全ゲノムレベルでは高いにもかかわらず、ウイルスタンパク質の個々の位置における変異は、様々なＨＩＶクレードを通して繰り返されるかまたは「トグルする」限られた数のアミノ酸置換に限定されていることが多い。Ｇａｓｃｈｅｎ Ｂ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２００２；２９６：２３５４−２３６０参照。トグル残基は、アルギニン（Ｒ）およびリジン（Ｋ）またはロイシン（Ｌ）およびバリン（Ｖ）などのアミノ酸対を含むことが多く、これらは生化学的に類似するため、その複製効率に重大な影響はなくウイルスによって許容される可能性がある。注目すべきことに、Ｇａｇ ｐ２４（高度に保存されたタンパク質の代表的なもの）トグルペプチド（ｔｏｇｇｌｅｄ ｐｅｐｔｉｄｅ）混合物のほとんどは、最高レベルの配列包括度でさえも２０種未満の変異体（中央値４）しか必要としないが（すなわち、データベース配列の５％未満に見られるアミノ酸のみがトグル位置から除外される）、この包括度の他のＧａｇサブユニットでは変異体数がより多い。Ｙｕｓｉｍ Ｋ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００２；７６（１７）：８７５７−８７６８参照。ＩＦＮ−γＥｌｉｓｐｏｔアッセイでは、これらの「トグル」ペプチドは、マッチコンセンサスペプチドよりも有意に高い幅（ｂｒｅａｔｈ）および規模のＨＩＶ特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答を検出することが示されている。Ｆｒａｈｍ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；１７９：６６３８−６６５０参照。

ＨＩＶワクチン接種の免疫原候補についての研究のほとんどは、ＥｌｉｓｐｏｔによるＩＦＮ−γ産生の分析に基づくものである。今までに、ＩＦＮ−γの規模または分泌とウイルス負荷との間の直接的な相関関係は見出されていない。この数年間に、ＨＩＶ抗原決定基に対するＴ細胞応答の質は、このウイルスに対する有効な応答の誘発に重要な決定因子であり得ることが示されている。しかしながら、ＨＩＶ感染患者におけるＣＤ８＋Ｔリンパ球の多機能性応答（例えば、様々なサイトカインの分泌およびパーフォレイトエキソサイトーシス（ｐｅｒｆｏｒａｔｅ ｅｘｏｃｙｔｏｓｅ）の分析では、Ｔリンパ球の多機能性とウイルス負荷との間の負の相関関係が示されている。加えて、フローサイトメトリおよびＥｌｉｓｐｏｔベースの分析では、通常は測定されないかおよび予想されるエフェクタ機能プロファイルを示さないサイトカインに関連する応答が検出されない場合がある。したがって、当技術分野では、ＨＩＶに対するＴ細胞応答を評価するためのより高感度かつ包括的な方法が必要である。

第１の態様において、本発明は、被験体における病原体に対して特異的なＴ細胞応答をアッセイするための方法であって、ｉ）被験体由来のＴ細胞を含む試料を、病原体由来の抗原を含む組成物と接触させ、ｉｉ）試料中のＴ細胞によって産生される複数のサイトカインのレベルを決定することを含んでなる方法に関する。

第２の態様において、本発明は、高度に曝露された持続的血清陰性患者を同定するための方法であって、ｉ）前記患者のＴ細胞を含有する試料を、ＨＩＶまたはＥＢＶペプチド組成物と共にインキュベートし、ｉｉ）ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２からなる群から選択される１つ以上のサイトカインのレベルを決定することを含んでなり、前記サイトカインの１つ以上の発現レベルが基準値よりも増加していることが、患者が高度に曝露された持続的血清陰性患者であることを示すとする方法に関する。

第３の態様において、本発明は、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２からなる群から選択される１つ以上のサイトカインを検出するための試薬を含むキットに関する。

第４の態様において、本発明は、高度に曝露された持続的血清陰性患者を同定するための方法であって、ｉ）Ｔ細胞を含む前記患者の試料を、ＨＩＶタンパク質またはＥＢＶタンパク質由来のペプチド組成物と共にインキュベートし、ｉｉ）Ｔｈ１様応答、Ｔｈ２様応答またはＴｈ１７応答を決定することを含んでなり、前記細胞におけるＴｈ１様応答、Ｔｈ２様応答またはＴｈ１７応答が基準値よりも増加していることが、患者が高度に曝露された持続的血清陰性患者であることを示すとする方法に関する。

トグルペプチド刺激のみによる細胞応答。ＨＩＶ患者は、幅および規模の点でＨＥＰＳ個体よりも高い応答を示した。コントローラ群と非コントローラ群との間で統計的有意差は認められなかった。また、ＨＥＰＳ群で検出された応答は、より少なくかつより弱いものであった。 ＩＦＮγＥｌｉｓｐｏｔおよびブーストフローサイトメータ（ｂｏｏｓｔｅｄ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）法を使用してＨＥＰＳおよびＨＩＶ感染患者（コントローラおよび非コントローラ）で検出された異なる応答を示すヒストグラム（上：絶対数および下 相対割合）。また、ＣＤ３リンパ球またはＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞のみによって駆動されたブーストフローの応答（左）はすべて、Ｔｈ１様応答（中央）とＴｈ２／１７応答（右）との間で分けられている。「ブロウ」アッセイとＥＬＩｓｐｏｔＩＦＮ−γアッセイとの間の比較。「ブロウ」アッセイでは、ＩＦＮ−γアッセイと比較して有意に多くの応答が検出された。一般的なＣＤ８応答に加えて、「ブロウ」アッセイは、ＣＤ８およびＣＤ４Ｔ細胞集団におけるトグルペプチドに対する特異的Ｔｈ１およびＴｈ２型応答を認識した。検出率の増加は、ＨＥＰＳ群で特に顕著であった。 ＣＤ８およびＣＤ４「ブロウ」応答。ＨＩＶ感染患者はほとんどがＣＤ８応答を生じたが、ＨＥＰＳ集団はより大きなＣＤ４Ｔ細胞応答をマウントした。ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の両方について、ＨＩＶコントローラ、非コントローラおよびＨＥＰＳ被験体における応答プロファイルは、Ｔｈ１対Ｔｈ２／ＩＬ−１７パターンおよび脱顆粒能が大きく異なっていた。ＨＩＶ感染個体とは対照的に、ＨＥＰＳ被験体におけるＣＤ８Ｔ細胞応答は、多くの場合にサイトカイン産生性であったが（Ｔｈ１＋およびＴｈ２／１７）、脱顆粒性ではなかった（ＣＤ１０７−）。しかしながら、この集団で観察された多くのＴｈ２プロファイルは、ＩＬ−１７が同じパネルに含まれていたことによってバイアスを受けた可能性がある。 図３Ａ参照 フローサイトメトリによって、個々のサイトカイン産生を評価した。ｆｌｏｗ−ｃｙｔｏｍｉｘデコンボリューションにより、ＨＥＰＳ被験体における応答数は、ＨＩＶ＋個体と比較して多いことが示された（すなわち、ントローラ群は、非コントローラ群からも多くの応答を生じた）。また、ＨＥＰＳ被験体では、単一のサイトカインのレベルがＨＩＶ＋個体と比較して上昇している（ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３およびＩＬ−２２については統計的に有意であった）ことも検出された。 図４Ａ参照 図４Ａ参照 図４Ａ参照 「ブースト」フローサイトメトリ（Ｂフロー）のためのゲーティング戦略。トグルペプチド刺激によるＣＤ４ヘルパーＴ細胞およびＣＴＬ応答のためのゲーティング戦略の代表例。（一般的な手順のセクション参照） ３人のＨＥＰＳ（血清不一致カップル：ＥＡＲ２８、ＥＡＲ０５およびＥＡＲ３３）における異なる刺激により生じたＣＤ８Ｔ細胞（上）およびＣＤ４Ｔ細胞（下）応答の割合。刺激：ＰＭＡ＋Ｉｏ（ポリクローナル刺激）、ＥＢＶプール１（ＨＬＡクラスＩ拘束性ペプチド）。ＥＢＶプール４（ＨＬＡクラスＩＩ拘束性ペプチド）。 ２人のＨＥＰＳ（血清不一致カップル：ＥＡＲ０５およびＥＡＲ２８）における異なる刺激により生じたＴ細胞応答の割合。刺激：ＨＩＶ ｐ２４プール１、ＨＩＶ ｐ２４プール３−、ＨＩＶ ｐ１７プール１、−ＨＩＶ ｐ１７プール２、Ｎｅｆプール、ＥＢＶプール１（ＨＬＡクラスＩ拘束性ペプチド）、ＥＢＶプール４（ＨＬＡクラスＩＩ拘束性ペプチド）、ＰＭＡ＋Ｉｏ（ポリクローナル刺激）

本発明は、ＨＩＶに対する細胞応答をアッセイするための新たな方法を開示する。この方法は、「ブースト」フローサイトメトリ（「ブロウ」）およびトグルペプチドの併用に基づくものである。「ブロウ」分析はいくつかのサイトカインを合わせて同じ蛍光チャネルに入れるので、標準的なアッセイよりも非常に多くの一連のエフェクタ機能を対象とすることができる。

トグルペプチドを新規なブロウ分析および上清中の幅広いサイトカインと組み合わせることにより、ＨＩＶ特異的Ｔ細胞免疫をより包括的に評価するための強力なツールが得られ、一般には、感染のコントローラまたは非コントローラのＨＩＶ患者間の機能差を定義することが可能になる。本発明は、例えば、樹状細胞ワクチンでワクチン接種された個体、および高度に曝露された持続的血清陰性被験体（ＨＥＰＳ）における潜在的に「非古典的な」エフェクタ機能および応答を検出するのに特に有用であり得る。

驚くべきことに、Ｇａｇ ｐ２４もしくはＧａｇ ｐ１７もしくはＮｅｆペプチド、またはＥＢＶ抗原、好ましくはトグルペプチドで患者のＰＢＭＣを刺激し、ブーストフローサイトメトリによってサイトカインレベルを決定することは、当技術分野で説明されている他の方法、例えば古典的なＩＦＮ−γＥＬＩｓｐｏｔよりもかなり高感度な特異的リンパ球Ｔ応答の検出方法である。本発明のこの第２の方法は、ＨＥＰＳ集団におけるＴｈ１様応答を検出するのに特に高感度である。

発明者らは、驚くべきことに、Ｇａｇ ｐ２４もしくはＧａｇ ｐ１７もしくはＮｅｆペプチド変異体集団、またはＥＢＶ抗原変異体集団、好ましくはトグルペプチドで患者のＰＢＭＣを刺激し、ブーストフローサイトメトリ（ｂｏｏｓｔｅｄ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）によってサイトカインレベルを決定することは、古典的なＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴよりもかなり高感度な特異的リンパ球Ｔ応答の検出方法であることを観察した。本発明のこの第２の方法は、ＨＥＰＳ集団におけるＴｈ１様応答を検出するのに特に高感度である。

本発明者らはまた、驚くべきことに、Ｇａｇ ｐ２４もしくはＧａｇ ｐ１７もしくはＮｅｆペプチド変異体集団、またはＥＢＶ抗原変異体集団、好ましくはトグルペプチドで患者のＰＢＭＣを刺激し、ブーストフローサイトメトリによって複数のサイトカインのレベルを決定することは、古典的なＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴよりもかなり高感度な特異的リンパ球Ｔ応答の検出方法であることを観察した。

ＰＢＭＣをペプチドで刺激し、続いてブーストフローサイトメトリ法を使用して複数のサイトカインを検出する技術は、ＰＢＭＣにおけるサイトカイン産生を誘発することができる任意の病原体抗原に適用することができるという結論が、本発明の結果から導かれた。

最後に、本発明は、ＣＤ４（ＭＨＣクラスＩＩペプチド）およびＣＤ８（ＭＨＣクラスＩペプチド）における特異的ペプチド応答、ならびにこれまでに観察されなかったＨＥＳＮにおけるＨＩＶに対する捕獲応答を決定することを可能にする。

したがって、第１の態様では、本発明は、被験体における病原体に対して特異的なＴ細胞応答をアッセイするための方法であって、ｉ）被験体由来のＴ細胞を含む試料を、病原体由来の抗原を含む組成物と接触させること、およびｉｉ）試料中のＴ細胞によって産生される複数のサイトカインのレベルを決定することを含む方法に関する。

好ましい実施形態では、抗原を含む組成物は、抗原、より好ましくは単一抗原である。別の実施形態では、抗原を含む組成物は、抗原ライブラリである。

好ましい実施形態では、病原体由来の抗原は、病原体ポリペプチド由来のペプチド変異体である。別の好ましい実施形態では、抗原ライブラリは、ペプチド変異体ライブラリである。より好ましい実施形態では、ペプチド変異体ライブラリは、トグルペプチドである。

本発明の別の好ましい実施形態では、病原体は、ＨＩＶまたはＥＢＶである。

本発明の方法が、ＨＩＶ病原体に対して特異的なＴ細胞応答をアッセイするための方法である場合、ペプチド変異体は、Ｇａｇポリタンパク質またはＮｅｆタンパク質に由来する。好ましい実施形態では、前記ペプチド変異体は、ｐ２４またはｐ１７に由来する。

好ましい実施形態では、本発明は、被験体における病原体に対して特異的なＴ細胞応答をアッセイするための方法であって、ｉ）被験体由来のＴ細胞を含む試料を、病原体ポリペプチド由来のペプチド変異体ライブラリと接触させること、およびｉｉ）試料中のＴ細胞によって産生される複数のサイトカインのレベルを決定することを含む方法について言及する。

本発明の方法の好ましい実施態様では、複数のサイトカインは、Ｔｈ１応答に特徴的なサイトカイン、Ｔｈ２応答に特徴的なサイトカインおよびその両方からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、Ｔｈ１応答に特徴的なサイトカインは、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ１−β、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＬ−１Ｂからなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、Ｔｈ２応答に特徴的なサイトカインは、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群から選択される。別の実施形態では、本発明の方法は、Ｔｈ９、Ｔｈ１７またはＴｈ２２応答に特徴的なサイトカインのレベルを決定することをさらに含む。

本発明の方法の別の好ましい実施形態では、ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞において、Ｔｈ１応答に特徴的なサイトカイン、Ｔｈ２応答に特徴的なサイトカインまたはその両方を決定する。

本発明の方法の好ましい実施形態では、ブーストフローサイトメトリによって、複数のサイトカインのレベルを決定する。ブーストフローサイトメトリでは、いくつかの陽性対照を使用することができる。好ましい実施形態では、ポリクローナル刺激後のＨＥＳＮにおいてブーストフローサイトメトリ技術を使用して、ＰＭＡ（ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート）＋Ｉｏ（イオノマイシン）を陽性対照として使用する。別の実施形態では、モノクローナル刺激後のＨＥＳＮにおいてブーストフローサイトメトリ技術を使用して、ＥＢＶを陽性対照として使用する。ＥＢＶによる刺激はペプチド特異的であるので、ＨＩＶペプチドによる刺激により類似している。加えて、抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８またはＰＭＡ（またはホルボール１２−ミリステート１３アセテート）＋イオノマイシン（Ｉｏ）を陽性対照として使用することができる。ウイルスペプチド刺激のためのさらなる陽性対照として、ＣＤ８Ｔ細胞およびＣＤ４Ｔ細胞刺激のためのＥＢＶ ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドプールおよびＥＢＶ ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドプールをそれぞれ使用することもできる。

好ましい実施形態では、Ｔ細胞を含有する試料はＰＢＭＣ調製物である。

別の態様では、本発明は、高度に曝露された持続的血清陰性患者を同定するための方法であって、ｉ）前記患者のＴ細胞を含有する試料を、ＨＩＶまたはＥＢＶペプチド組成物と共にインキュベートすること、およびｉｉ）ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２からなる群から選択される１つ以上のサイトカインのレベルを決定することを含み、
前記サイトカインの１つ以上の発現レベルが基準値よりも増加していることが、患者が高度に曝露された持続的血清陰性患者であることを示す方法に関する。

好ましい実施形態では、ＨＩＶペプチド組成物は、Ｇａｇ ｐ２４ ＨＩＶまたはＧａｇ ｐ１７ ＨＩＶタンパク質由来のペプチドを含む。より好ましい実施形態では、Ｇａｇ ｐ２４ ＨＩＶまたはＧａｇ ｐ１７ ＨＩＶタンパク質由来のペプチドは、トグルペプチドである。

好ましい実施形態では、Ｔ細胞を含有する試料はＰＢＭＣ調製物である。

別の好ましい実施形態では、各サイトカインの基準値は、ＨＩＶ感染患者由来のＴ細胞を含有する試料中の前記サイトカインの発現レベルである。

別の好ましい実施形態では、フローサイトメトリ分析によって、サイトカインレベルの決定を行う。より好ましい実施形態では、フローサイトメトリ分析は、ブーストフローサイトメトリである。

別の態様では、本発明は、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２からなる群から選択される１つ以上のサイトカインを検出するための試薬を含むキットに関する。別の態様では、本発明は、本発明の方法の特徴にしたがってＨＥＰＳ患者を同定するための本発明のキットの使用に関する。

別の態様では、本発明は、高度に曝露された持続的血清陰性患者を同定するための方法であって、ｉ）Ｔ細胞を含む前記患者の試料を、ＨＩＶまたはＥＢＶタンパク質由来のペプチド組成物と共にインキュベートすること、およびｉｉ）Ｔｈ１様応答、Ｔｈ２様応答またはＴｈ１７応答を決定することを含み、前記細胞におけるＴｈ１様応答、Ｔｈ２様応答またはＴｈ１７応答が基準値よりも増加していることが、患者が高度に曝露された持続的血清陰性患者であることを示す方法に関する。

好ましい実施形態では、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ１−βおよびＩＬ−２からなる群から選択される１つ以上のサイトカインのレベルを測定することによって、Ｔｈ１様応答を決定し；ＩＬ−４およびＩＬ−１０からなる群から選択される１つ以上のサイトカインのレベルを測定することによって、Ｔｈ２様応答を決定し；または、Ｔｈ１７（ＩＬ−１７）のレベルを測定することによって、Ｔｈ１７応答を決定する。より好ましい実施形態では、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔリンパ球において、ブーストフローサイトメトリによって、サイトカインレベルの決定を行う。

高度に曝露された持続的血清陰性患者を同定するための本発明の方法の好ましい実施形態では、ＨＩＶタンパク質はｐ２４またはｐ１７である。別の好ましい実施形態では、ＨＩＶタンパク質はｐ１７である。より好ましい実施形態では、ペプチド組成物はトグルペプチド混合物である。

したがって、別の好ましい実施形態では、本発明は、ＨＥＰＳ患者を同定するための方法であって、前記患者の試料を、Ｇａｇ ｐ２４ ＨＩＶタンパク質またはＧａｇ ｐ１７ ＨＩＶタンパク質由来のペプチドと共にインキュベートすること、およびＣＤ４およびＣＤ８Ｔリンパ球において、ブーストフローサイトメトリによって、Ｔｈ１様（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ１−β、ＩＬ−２）、Ｔｈ２様（ＩＬ−４、−１０）およびＴｈ１７（ＩＬ−１７）サイトカインのレベルを決定することを含み、ＣＤ４Ｔ細胞における前記サイトカインのいずれかの発現レベルが基準値よりも増加していることが、患者がＨＥＰＳであることを示す方法に関する。

高度に曝露された持続的血清陰性患者を同定するための本発明の方法の好ましい実施形態では、Ｔ細胞を含有する試料はＰＢＭＣ調製物である。

高度に曝露された持続的血清陰性患者を同定するための本発明の方法の好ましい実施形態では、基準値は、感染患者由来のＴ細胞を含有する試料におけるＴｈ１様応答、Ｔｈ２様応答またはＴｈ１７応答のレベルである。

１．定義
本明細書で使用される「ＡＩＤＳ」という用語はＨＩＶ感染症の症候性期を指し、後天性免疫不全症候群（一般的にはＡＩＤＳとして公知である）および「ＡＲＣ」または「ＡＩＤＳ関連症候群」の両方を含む。Ａｄｌｅｒ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｒｉｔ．Ｍｅｄ．Ｊ．１９８７；２９４：１１４５−１１４７参照。ＡＩＤＳの免疫学的および臨床的な徴候は当技術分野で周知であり、例えば、免疫不全に起因する日和見感染および癌が挙げられる。

本明細書で使用される「抗原」という用語は、免疫応答を誘発することができる分子を指す。抗原としては、限定されないが、細胞、細胞抽出物、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、多糖、多糖コンジュゲート、多糖類および他の分子のペプチドおよび非ペプチド模倣体、小分子、脂質、糖脂質、炭水化物、ウイルスおよびウイルス抽出物ならびに多細胞生物、例えば寄生生物およびアレルゲンが挙げられる。抗原という用語は、宿主免疫系によって異物として認識される任意の種類の分子を広く含む。

本明細書で使用される「抗レトロウイルス療法」または「ＡＲＴ」という用語は、１つ以上の抗レトロウイルス薬を投与してＨＩＶの複製を阻害することを指す。典型的には、ＡＲＴは、少なくとも１つの抗レトロウイルス剤（または、一般的には抗レトロウイルス薬のカクテル）、例えば、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えば、ジドブジン（ＡＺＴ、ラミブジン（３ＴＣ）およびアバカビル）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（例えば、ネビラピンおよびエファビレンツ）およびプロテアーゼ阻害剤（例えば、インジナビル、リトナビルおよびロピナビル）の投与を含む。高活性抗レトロウイルス療法（「ＨＡＡＲＴ」）という用語は、ウイルス複製およびＨＩＶ疾患の進行を積極的に抑制するために設計された治療計画を指し、通常、３つ以上の異なる薬物、例えば２つのヌクレオシド逆転写酵素阻害剤およびプロテアーゼ阻害剤からなる。

本明細書で使用される「ブーストフローサイトメトリ」または「ブロウ」という用語は、フローサイトメトリによって同じ蛍光チャネル内のいくつかのサイトカインを検出することに基づくアッセイを指し、したがって、標準的なアッセイよりも非常に多くの一連のエフェクタ機能を対象とする。

本明細書で使用される「ＣＤ４（＋）Ｔ細胞」という用語は、共受容体ＣＤ４をその表面に提示するＴ細胞を指す。この用語は、マクロファージおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化（Ｔｈ−Ｉ細胞）、Ｂ細胞による抗体産生（Ｔｈ−２細胞）を調整するか、または自己免疫性疾患において重要な役割を果たす（Ｔｈ−１７細胞）と考えられているヘルパーT細胞を指す。加えて、「ＣＤ４＋Ｔ細胞」という用語はまた、ＣＤ４＋Ｔ細胞の全集団の約１０％に相当する調節性Ｔ細胞を指す。調節性Ｔ細胞は、免疫応答の減衰、自己免疫性疾患の予防および経口寛容において重要な役割を果たす。

「ＣＤ８（＋）Ｔ細胞」という用語は、ＣＤ８糖タンパク質をその表面に発現するＴ細胞を示し、ＣＤ８（分化８のクラスタ）糖タンパク質は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の共受容体として機能する膜貫通糖タンパク質である。ＴＣＲと同様に、ＣＤ８は主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合するが、クラスＩ ＭＨＣタンパク質に対して特異的である。例示的なＣＤ８Ｔ細胞としては、細胞傷害性記憶ＣＤ８Ｔ細胞、調節性ＣＤ８Ｔ細胞、細胞傷害性エフェクタＣＤ８Ｔ細胞および当業者が同定可能なさらなる細胞が挙げられる。

本明細書で使用される「慢性プログレッサ」または「非コントローラ」という用語は、初期感染後に経時的なウイルス負荷の増加を示すＨＩＶ感染個体を指す。

本明細書で使用される「相関する」または「相関している」という用語は２つの事象事例間の統計的関連性を指し、事象としては数字、データセットなどが挙げられ得る。例えば、事象が数字を含む場合、正の相関（本明細書では「直接的な相関」とも称される）は、一方が増加するにつれて他方も増加することを意味する。負の相関（本明細書では「逆相関」とも称される）は、一方が増加するにつれて他方が減少することを意味する。

「サイトカイン」という用語は、細胞によって分泌される可溶性の低分子タンパク質であって、分泌細胞または別の細胞の挙動または特性を変化させることができるものを指す。サイトカインはサイトカイン受容体に結合し、細胞内の挙動または特性、例えば細胞の増殖、死または分化を引き起こす。例示的なサイトカインとしては、限定されないが、インターロイキン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ベータおよびＩＬ−１ＲＡ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、オンコスタチンＭ、エリスロポエチン、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、インターフェロン、Ｂ７．１（ＣＤ８０としても公知である）、Ｂ７．２（Ｂ７０、ＣＤ８６としても公知である）、ＴＮＦファミリーメンバー（ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＬＴ−ベータ、ＣＤ４０リガンド、Ｆａｓリガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ３０リガンド、４−１ＢＢＬ、Ｔｒａｉｌ）およびＭＩＦが挙げられる。サイトカインレベルは、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＳＰＯＴ、ウエスタンブロットおよびフローサイトメトリなどの当技術分野で周知のいくつかの方法によって決定することができる。好ましい実施形態では、フローサイトメトリによって、第１の態様の方法のサイトカインレベルの決定を行う。

本明細書で使用される高度に曝露された持続的血清陰性（ＨＥＰＳ）患者は、無防備な性的接触を通じてＨＩＶ−Ｉに複数回かつ反復して曝露された証拠があるにもかかわらず、ウイルス抗原反応性の血清ＩｇＧを持たない被験体を指す（Ｂｅｙｒｅｒ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，１９９９，ｖｏｌ．７９，ｐｐ．５９−６８）。

本明細書で使用される「変異体」という用語は、ｉ）アミノ酸残基の１つ以上が、保存されたアミノ酸残基または保存されていないアミノ酸残基で置換されているポリペプチド変異体（このような置換されたアミノ酸残基は遺伝コードによってコードされるものでもよいし、または遺伝コードによってコードされるものではなくてもよい）、またはｉｉ）１つ以上のアミノ酸の挿入または欠失を含む変異体を指す。

ヒトヘルペスウイルス４（ＨＨＶ−４）とも称される「ＥＢＶ」という用語は、本明細書全体を通して、バーキットリンパ腫の細胞培養物中に見られるヘルペトウイルスを説明するのに使用される。ＥＢＶは、感染性単核球症および多数の他の関連症状／疾患状態（ＥＢＶ関連リンパ腫を含む）の原因物質である。

本明細書で使用される「Ｇａｇ ｐ２４ ＨＩＶタンパク質」という用語は、加工ポリタンパク質Ｇａｇ由来のＨＩＶカプシドタンパク質を指す。好ましい実施形態では、Ｇａｇ ｐ２４ ＨＩＶタンパク質由来のペプチドはトグルペプチドである。

本明細書で使用される「Ｇａｇ ｐ１７ ＨＩＶタンパク質」という用語は、ＨＩＶビリオン粒子の完全性を保証するカプシドを取り囲むマトリックスを指す。それは、加工ポリタンパク質Ｇａｇに由来する。好ましい実施形態では、Ｇａｇ ｐ１７ ＨＩＶタンパク質由来のペプチドはトグルペプチドである。

「Ｎｅｆタンパク質」という用語は、ＨＩＶの付属調節タンパク質を指す。好ましい実施形態では、Ｎｅｆタンパク質由来のペプチドはトグルペプチドである。

本明細書で使用される「高度に曝露された持続的血清陰性」または「ＨＥＰＳ」または「ＨＥＳＮ」個体という用語は、ＨＩＶに曝露されたウイルス非感染被験体を指す。ＨＩＶ感染の有無は、当業者に公知のＨＩＶ試験（例えば、ＨＩＶ ＥＩＡ、ウエスタンブロット、ＰＣＲ試験）を使用してウイルスの存在を検出することによって実証されるように、ヒト被験体におけるＨＩＶ抗体、ＨＩＶ抗原またはＨＩＶ核酸の存在を実証することによって示すことができる。

本明細書で使用される「ＨＩＶ」という用語は、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２およびＳＩＶを含む。「ＨＩＶ−１」は、１型ヒト免疫不全ウイルスを意味する。ＨＩＶ−１としては、限定されないが、ＨＩＶ−１感染細胞に関連する細胞外ウイルス粒子およびＨＩＶ−１形態が挙げられる。ＨＩＶ−１ウイルスは、公知の主なサブタイプ（クラスＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ）または付随的なサブタイプ（Ｏ群）のいずれかを表し得、実験室株および初代単離株を含む。「ＨＩＶ−２」は、２型ヒト免疫不全ウイルスを意味する。ＨＩＶ−２としては、限定されないが、ＨＩＶ−２感染細胞に関連する細胞外ウイルス粒子およびＨＩＶ−２形態が挙げられる。「ＳＩＶ」という用語は、サル、チンパンジおよび他の非ヒト霊長類に感染するＨＩＶ様ウイルスであるサル免疫不全ウイルスを指す。ＳＩＶとしては、限定されないが、ＳＩＶ感染細胞に関連する細胞外ウイルス粒子およびＳＩＶ形態が挙げられる。

本明細書で使用される「ＨＩＶ曝露」という用語は、ＨＩＶ感染症またはＡＩＤＳを有しない被験体とＨＩＶ感染症またはＡＩＤＳを有する被験体との接触、またはこのようなＨＩＶ感染被験体由来の体液との接触であって、感染被験体由来のこのような体液が、ウイルスが感染被験体または感染被験体の体液から非感染被験体に伝播され得るように非感染被験体の粘膜、組織内の傷口もしくは擦り傷（例えば、注射針、無防備な性交渉）または他の表面に接触することを指す。

本明細書で使用される「ＨＩＶ感染症」は、ＨＩＶウイルスが個体内に存在する適応症を指し、無症候性血清陽性ＡＩＤＳ関連症候群（ａｒｃ）および後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を含む。

本明細書で使用される「病原体」という用語は、宿主において疾患状態（例えば、感染症、癌など）を引き起こす生物学的物質を指す。「病原体」としては、限定されないが、ウイルス、細菌、古細菌、真菌、原生動物、マイコプラズマ、プリオンおよび寄生生物が挙げられる。

本明細書で使用される「長期非プログレッサ」という用語は、約１０年以上にわたってＨＩＶに感染している個体であって、ＣＤ４＋Ｔ細胞のレベルが正常かつ安定であることを特徴とし、抗レトロウイルス療法で治療されていない個体を指す。これらの個体は、慢性ＨＩＶ感染者の５％〜１５％を含む。長期非プログレッサに関連するより最近の用語は「ＨＩＶコントローラ」であり、これは、血漿ＨＩＶ ＲＮＡレベルに基づいて非進行を定義するものである。検出不可能な血漿ＨＩＶ ＲＮＡを示す「エリートコントローラ」、および血漿ＨＩＶ ＲＮＡレベルが検出可能だが低レベルな「ウイルス血症コントローラ」という２種類のコントローラがある。Ｄｅｅｋｓ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ２００７；２７：４０６−４１６およびＦｅｒｒｅ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ２００９；１１３（１７）：３９７８−３９８９参照。

本明細書で使用される「ＰＢＭＣ」という用語は、リンパ球、単球およびマクロファージを含む末梢血単核細胞を指す。血液試料からこのＰＢＭＣを単離する方法は、当技術分野で周知である。

本明細書で使用される「プロテアーゼ阻害剤」という用語は、ウイルスポリタンパク質前駆体（例えば、ウイルスＧＡＧおよびＧＡＧ Ｐｏｌポリタンパク質）を、感染性ＨＩＶ−１に見られる個々の機能的タンパク質にタンパク質分解的切断するのに必要な酵素であるＨＩＶ−１プロテアーゼの阻害剤を指す。

本明細書で使用される「逆転写酵素阻害剤」という用語は、プロウイルスＨＩＶ−１ ＤＮＡへのウイルスゲノムＨＩＶ−１ ＲＮＡの変換を触媒する酵素であるＨＩＶ−１逆転写酵素の活性を阻害する任意の化合物を指す。

本明細書で使用される「Ｔ細胞を含む試料」という用語は、哺乳動物、好ましくはヒトから取り出された組織または体液であって、Ｔ細胞を含有する組織または体液を指す。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ペプチド変異体に曝露する前に哺乳動物試料から単離される。Ｔ細胞に関する「単離された」という用語は、少なくとも７０、８０、９０、９５、９９または１００％のＴ細胞を有する形態の細胞集団調製物を指す。いくつかの態様では、場合により、「混入」し得るかまたは単離細胞の研究を妨げ得る他の細胞型を明確に除外するために、他の細胞成分から所望の細胞集団を単離する。しかしながら、このような「単離された」細胞集団は、細胞生存のために、または本開示によって提供される所望の結果を達成するために必要なさらなる細胞型を組み入れることができることを理解するべきである。例えば、単球（マクロファージ）または樹状細胞などの抗原提示細胞は、Ｔ細胞の「単離された」細胞集団中に存在してもよいし、または調節性Ｔ細胞を作製するための単離されたＴ細胞の集団に追加してもよい。いくつかの態様では、これらの抗原提示細胞は、活性化単球または樹状細胞であり得る。本開示の方法に使用するためのＴ細胞を含む細胞集団は、哺乳動物被験体から採取された生物学的試料から単離することができる。試料は多数の供給源に由来し得、限定されないが、末梢血、白血球アフェレーシス血液製剤、アフェレーシス血液製剤、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、リンパ節組織、腸管関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、肝臓、免疫学的病変部位（例えば、滑液）、膵臓および脳脊髄液が挙げられる。ドナー被験体は好ましくはヒトであり、胎児、新生児、小児、成人でもよく、正常でもよいし、罹患していてもよいし、または目的の疾患にかかりやすくてもよい。

いくつかの実施形態では、Ｔ細胞試料は、血液試料由来の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。「末梢血単核細胞」または「ＰＢＭＣ」は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞などを含む）および単球を意味する。一般に、ＰＢＭＣは、標準的な技術を使用して患者から単離される。いくつかの実施形態では、実質的にすべての赤血球および多形核白血球を残すかまたはこれらをドナーに戻して、ＰＢＭＣのみを採取する。ＰＢＭＣは、白血球フェレーシスなどの当技術分野で公知の方法を使用して単離することができる。一般に、５〜７リットルの白血球フェレーシスを実施して患者からＰＢＭＣを本質的に取り出し、残りの血液成分を戻す。試料の回収は、好ましくは、抗凝固剤（例えば、ヘパリン）の存在下で実施される。

ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞を含むＴ細胞含有試料を様々な方法を使用して前処理してから、ペプチド変異体組成物と接触させることができる。一般に、回収したら、細胞をさらに濃縮することもできるし（回収と同時にこれを行わない場合）、または細胞をさらに精製および／または濃縮することもできる。例えば、（例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ勾配による）密度勾配遠心分離によって、ＰＢＭＣを部分的に精製することができる。通常、当技術分野で周知の技術を使用して、自己抗体、阻害因子などの血清タンパク質および可溶性血液成分を除去するために、ドナー試料から単離された細胞を洗浄する。一般に、これは、生理的培地または緩衝液を追加し、続いて遠心分離することを含む。これは、必要に応じて反復することができる。次いで、細胞を計数することができ、一般には１×１０^９〜２×１０^９個の白血球を５〜７リットルの白血球アフェレーシスから回収する。精製された細胞を適切な培地または緩衝液に再懸濁して、生存を維持することができる。再懸濁に適切な溶液は、一般に、低濃度（一般に、５〜５０ｍＭ）の許容し得る緩衝液と併せてウシ胎児血清、ＢＳＡ、ＨＳＡ、正常ヤギ血清および／または他の天然に存在する因子が場合により補充されていてもよい平衡塩類溶液（例えば、生理食塩水、ＰＢＳ、ハンクス平衡塩類溶液など）である。便利な緩衝液としては、限定されないが、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などが挙げられる。

本明細書で使用される「被験体」という用語は、個体、植物または動物、例えばヒト、非ヒト霊長類（例えば、チンパンジおよび他の類人猿およびサル種）；家畜、例えば鳥、魚、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマ；家庭内哺乳動物、例えばイヌおよびネコ；マウス、ラットおよびモルモットなどの齧歯類を含む実験動物を指す。この用語は、特定の年齢または性別を示すものではない。「被験体」という用語は、胚および胎児を包含する。好ましい実施形態では、被験体はヒトである。

本明細書で使用される「Ｔｈ１様応答」という用語は、マクロファージの殺菌活性を活性化し、Ｂ細胞がオプソニン化（コーティング）抗体を作るのを誘導し、細胞性免疫をもたらすＩＦＮ−γの産生を特徴とする応答に関する。この応答はまた、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ１−βおよびＩＬ−２の産生を特徴とする。Ｔｈ１応答は、細胞内病原体（宿主細胞内のウイルスおよび細菌）に対してより有効である。

本明細書で使用される「Ｔｈ２様応答」という用語は、中和（殺傷）抗体を作るようにＢ細胞を活性化して体液性免疫をもたらすＩＬ−４およびＩＬ−１０の放出を特徴とする応答に関する。Ｔｈ２応答は、細胞外細菌、寄生生物および毒素に対してより有効である。

「Ｔ細胞応答」という用語は、Ｔ細胞が哺乳動物において直接的もしくは間接的に媒介するかまたは別の形で寄与する免疫応答を意味する。Ｔ細胞媒介性免疫応答は、細胞媒介性効果、リンホカイン媒介性効果など、および例えばＴ細胞によって分泌されるリンホカインによってＢ細胞が刺激される場合にはさらにＢ細胞関連効果に関連し得る。ＭＨＣクラスＩ拘束性ＣＴＬの場合、エフェクタ機能は、ペプチドでパルスされた、ペプチド前駆体でパルスされたもしくは天然ペプチドを提示する標的細胞の溶解、ペプチドによって誘導されるサイトカイン、好ましくはインターフェロン−ガンマ、ＴＮＦ−アルファもしくはＩＬ−２の分泌、ペプチドによって誘導されるエフェクタ分子、好ましくはグランザイムもしくはパーフォリンの分泌、または脱顆粒であり得る。ＭＨＣクラスＩＩ拘束性Ｔヘルパー細胞の場合、エフェクタ機能は、サイトカイン、好ましくはＩＦＮ−ガンマもしくはＩＦＮγ、ＴＮＦ−アルファもしくはＴＮＦα、ＩＬ−４、ＩＬ５、ＩＬ−１０もしくはＩＬ−２のペプチド誘導性分泌、またはペプチド誘導性脱顆粒であり得る。ＣＴＬおよびＴヘルパー細胞の可能なエフェクタ機能は、このリストに限定されない。

本明細書で使用される「トグルペプチド」という用語は、ペプチド合成工程中に代替アミノ酸を可変位置に含めることによってＨＩＶ配列包括度の多様性が有意に増加しているペプチドを指す。Ｆｒａｈｍ Ｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００７；１７９：６６３８−６６５０参照。

「血清不一致」という用語は、カップルの２個体が不一致なＨＩＶ血清型を示す場合、すなわち、カップルの一方の個体が感染している（彼の血液中に抗体を有する）のに対して他方は感染していない場合を指す。

「ＥＢＶ」という用語は、感染性単核球症を引き起こすウイルスであるエプスタイン−バーウイルスを指す。

本明細書で使用される「キット」という用語は、本発明の方法を行うのに必要な様々な試薬を含有する製品であって、それらの輸送および保存を可能にするようにパックされている製品を指す。キットの構成要素をパックするのに適切な材料としては、結晶、プラスチック（例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート）、ボトル、バイアル、紙またはエンベロープが挙げられる。

「複数サイトカインの決定」または「複数サイトカインの検出」という用語は、単一の技術（例えば、ブロウ技術）を使用していくつかのサイトカインを同時に検出することを指す。

本明細書で言及されるすべての刊行物は、その全体が参照により本明細書の開示の一部とされる。本発明を一般的に説明してきたが、本発明は、以下の実施例を参照することによってより容易に理解される。以下の実施例は例示のために提供するものであり、特に明記されない限り本発明がこれらに限定されることを意図するものではない。

一般的な手順
１．研究群
単一施設（Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉ Ｇｅｒｍａｎｓ Ｔｒｉａｓ ｉ Ｐｕｊｏｌ，Ｂａｄａｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎ）において、コントローラ群および非コントローラ群を含むＨＩＶ血清陽性患者、ならびに高度に曝露された持続的血清陰性（ＨＥＰＳ）被験体を募集した。ＨＩＶコントローラは、抗レトロウイルス治療を行わない場合のウイルス負荷が２，０００コピー未満／ｍＬであり、少なくとも過去３年間のＣＤ４＋数が細胞４００個超／ｍｍ^３である被験体と定義した。非コントローラは、血漿ＲＮＡが５０，０００ＨＩＶ ＲＮＡコピー超／ｍＬであり、ＣＤ４＋数が細胞３００個未満／ｍｍ^３である未治療個体と定義した。ＨＩＶ感染急性期に同定された高ウイルス負荷の被験体が非コントローラ群に含まれていたことを確認するために、十分に発展したウエスタンブロット分析を実施した。

２．ＰＢＭＣの抽出
密度勾配遠心分離（Ｌｅｕｃｏｓｅｐ ｔｕｂｅｓ）によって、抗凝固処理した新鮮全血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。

３．細胞培養およびペプチド刺激
ＲＰＭＩ培地＋１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）＋抗生物質を含む４８ウェルフラットプレート中で、単離した新鮮ＰＢＭＣ（細胞５００，０００個／ウェル）をサイトカイン細胞内染色の場合には６時間培養し、またはサイトカイン上清検出の場合には５日間培養した。各配列について最終濃度２ｍｇ／ｍＬのｐ２４トグルペプチドで細胞を刺激し、インキュベート（３７℃、５％ＣＯ_２）した。抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８磁気ビーズを陽性対照として使用し、ＲＰＭＩを陰性対照として使用した。

４．フローサイトメトリ
トグルペプチド、抗ＣＤ３／ＣＤ２８磁気ビーズまたはＰＢＳ１×によって新鮮ＰＢＭＣ（細胞５００，０００個／ウェル）を刺激し、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳ）と共にＣＤ４９ｄおよびＣＤ８抗体（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳ）を使用して６時間同時刺激した。この期間中に抗ＣＤ１０７ａも追加した。６時間のインキュベーション後、培養物をサイトカイン細胞内染色まで冷蔵庫内で一晩維持した。ルーチン分析のために、フローサイトメトリによって、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＴｈ１、Ｔｈ２およびＴｈ１７サイトカインの発現について、透過処理した固定細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳ）を評価した。ペプチド刺激したＴ細胞の複数の機能を評価するために、以下の抗体を様々な組み合わせで使用した：ＣＤ３−ＰＥ、ＣＤ４−ＡＰＣ、ＣＤ８−Ｖ５００、ＣＤ１４−Ｖ４５０、ＣＤ１９−Ｖ４５０、ＬｉｖｅＤｅａｄ、ＣＤ１０７ａ−ＰｅＣｙ５、ＩＦＮ−ｃ−ＦＩＴＣ、ＩＬ−２−ＦＩＴＣ、ＴＮＦａ−ＦＩＴＣ、ＭＩＰ１ｂ−ＦＩＴＣ、ＩＬ４−ＰＥＣｙ７、ＩＬ１０−ＰＥＣｙ７およびＩＬ１７−ＰＥＣｙ７（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳ）。８色パラメータを検出するように設定されたＬＳＲ ＩＩ機器（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ Ｉｎｃ．，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ，ＵＳ）で細胞を収集し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用して分析を実施した。ゲーティングした後、あらゆる特定の機能組み合わせについて、陰性対照チューブで検出されたバックグラウンド応答を、刺激した試料で検出された応答から差し引いた。

５．ＩＦＮ−γＥＬＩｓｐｏｔ
以前に記載されているように、ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイを実施した。Ｈａｒｌｏｗ Ｅ，Ｌａｎｅ Ｄ，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，ＵＳ，１９８８）参照。簡潔に言えば、抗ヒトＩＦＮ−γｍＡｂを用いて、ＥＬＩＳｐｏｔプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳ）を４℃で一晩コーティングした。１％ＦＣＳを補充した１００μＬのＰＢＳを用いて、プレートをブロッキングした。ＰＢＭＣ（細胞１００，０００個／１００μＬ／ウェル）を０．２ｍｇ／ｍＬのＳＬ９およびＧＬ９の刺激と共に１６時間インキュベートした。ＰＨＡ（５μｇ／ｍＬ）を陽性対照として含めた。ビオチンコンジュゲート抗ヒトＩＦＮ−γと共に室温で１時間インキュベートすることによって、捕捉ＩＦＮ−γを分泌部位で検出した。ＰＢＳで６回洗浄した後、ＡＬＰコンジュゲートストレプトアビジンを室温で４５分間インキュベートした。ＰＢＳでよく洗浄した後、ＮＢＴおよび基質を含むＴＲＩＳ塩化物を追加した。３０分後、Ｔｗｅｅｎを用いて反応を停止させた。

陽性応答の閾値は、１ウェル当たりのスポットが５個超であり（５０ＳＦＣ／１０^６）、「陰性ウェルの平均＋３標準偏差」および「平均の３倍」のいずれか高い方を超える応答と決定した。

６．患者
Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｉ Ｇｅｒｍａｎｓ Ｔｒｉａｓ ｉ Ｐｕｊｏｌ，ＢａｄａｌｏｎａおよびＢＣＮ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｃｅｎｔｅｒ，Ｂａｒｃｅｌｏｎａ，Ｓｐａｉｎにおいて、コントローラ（ｎ＝１０）および非コントローラ（７）を含むＨＩＶ血清陽性被験体（ｎ＝１７）、高度に曝露された持続的血清陰性（ＨＥＳＮ）被験体（ＭＳＭ、男性と性交渉を持った男性、ｎ＝８；血清不一致パートナを持つ異性愛者、ｎ＝３）およびＨＩＶ非曝露個体（ｎ＝４）を募集した。ＨＩＶコントローラは、抗レトロウイルス治療を行わない場合のウイルス負荷が２，０００コピー未満／ｍＬであり、少なくとも過去３年間のＣＤ４＋数が細胞４００個超／ｍｍ３である被験体と定義した。非コントローラは、血漿ＲＮＡが５０，０００ＨＩＶ ＲＮＡコピー超／ｍｌであり、ＣＤ４＋数が細胞３００個未満／ｍｍ３であるＨＡＡＲＴ未治療個体と定義し、十分に発展したウエスタンブロットによって、これらが、ＨＩＶ感染急性期に同定された高ウイルス負荷の被験体ではないことを確認した（表Ｉ）。男性と性交渉を持った男性（ＭＳＭ）の高リスクコホートからＨＥＳＮを同定し、Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ（バルセロナのＭＳＭコミュニティセンター）で月３回観察した。この研究は地方研究倫理委員会によって承認されており、すべての参加者が書面によるインフォームドコンセントを提出した。

７．細胞培養
すべてのアッセイについて、単離した新鮮ＰＢＭＣを静脈穿刺の４時間以内に使用した。フローサイトメトリ研究およびＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ研究のために、ＲＰＭＩ培地＋１０％ＦＢＳ＋抗生物質を含む４８ウェルフラットプレートに、１ウェル当たり５００，０００個の細胞をサイトカイン細胞内染色（ブーストフローサイトメトリのセクション参照）の場合には６時間にわたって追加し、またはサイトカイン上清検出（ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘのセクション参照）の場合には５日間にわたって追加した。各配列について最終濃度１４ｍｇ／ｍｌの個々のｐ２４トグルペプチドで細胞を刺激し、対応するアッセイに使用するまで３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。抗ＣＤ３＋抗ＣＤ２８磁気ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）またはＰＭＡ（またはホルボール１２−ミリステート１３アセテート）（１０ｎｇ／ｍｌ）＋イオノマイシン（Ｉｏ）（１ｕＭ）を陽性対照として使用した。ウイルスペプチド刺激のためのさらなる陽性対照として、それぞれＣＤ８Ｔ細胞およびＣＤ４Ｔ細胞刺激のためのＥＢＶ ＭＨＣクラスＩ拘束性ペプチドプール（ＥＢＶプール１）およびＥＢＶ ＭＨＣクラスＩＩ拘束性ペプチドプール（ＥＢＶプール４）を最終濃度１０ｕｇ／ｍｌで使用した。

８．ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ分析
５日後に回収した培養上清中で、製造業者の説明書にしたがってフローベースの手法を使用して、１３種のサイトカインを検出した。ヒトＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ９／Ｔｈ１７／Ｔｈ２２ １３−ｐｌｅｘ Ｋｉｔ ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）は、フローサイトメトリによってヒトＩＦＮγ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２およびＴＮＦαを定量的に検出するためのビーズベースの分析物検出系である。簡潔に言えば、検出するべき様々なサイトカインに対して特異的に反応する抗体を用いて、様々なサイズおよびスペクトルアドレスの蛍光ビーズをコーティングする。各サイトカインに対するコーティングビーズミックスを試料と共に室温で２時間インキュベートする。ビオチンコンジュゲート二次抗体を追加し、室温で１時間インキュベートしてから、ストレプトアビジン−フィコエリトリンを追加して、ビーズサイズおよびその発光スペクトルに基づいて様々なサイトカインを検出および定量する。抗原特異的応答のために、全患者にわたる中央レベル（ｐｇ／ｍｌ）の各サイトカイン非刺激培養物を陽性応答のカットオフとして適用した。

９．ブーストフローサイトメトリ
ブーストフローサイトメトリ法は、多機能性研究について以前に記載されている細胞内サイトカインプロトコール（Ｌａｍｏｒｅａｕｘ，Ｌ．２００６．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．１：１５０７−１５１６）をいくつか修正したものに基づいている。簡潔に言えば、ＧｏｌｇｉＳｔｏｐおよび抗ＣＤ１０７ａ抗体（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の存在下で、個々のトグルペプチドならびにＣＤ４９ｄおよびＣＤ２８抗体（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）を用いて、新鮮ＰＢＭＣ（細胞５００，０００個／ウェル）を６時間刺激した。６時間のインキュベーション後、培養物を細胞内サイトカイン染色まで４℃で一晩維持した。細胞を洗浄した後、生存染色用のアミン反応性バイオレット色素（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）を追加してから、それぞれＣＤ１９−Ｖ４５０およびＣＤ１４−Ｖ４５０（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用してＢリンパ球および骨髄細胞を排除するために、Ｔ細胞マーカー（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製のＣＤ３ ＰＥ、ＣＤ４ ＡＰＣおよびＣＤ８ Ｖ５００）について細胞を染色した。細胞内サイトカイン染色のために、固定および透過処理工程（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製のＦｉｘ ａｎｄ Ｐｅｒｍ ｋｉｔ）を行って、続いてＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｔｈ１サイトカイン抗体（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦαおよびＭＩＰ１β）およびＰｅ−Ｃｙ７コンジュゲート抗Ｔｈ２／１７サイトカイン抗体（ＩＬ−４（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、ＩＬ−１０およびＩＬ−１７（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ））を用いて染色した。８色パラメータを検出するように設定されたＬＳＲ ＩＩ機器（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で細胞を収集し、ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアを使用して分析を実施した。一重項のＣＤ１４−およびＣＤ１９−生細胞のうち、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ３＋ＣＤ４＋）およびＣＴＬ（ＣＤ３＋ＣＤ８＋）をゲーティングし、サイトカイン分泌パターン（Ｔｈ１様および／またはＴｈ２／１７様）＋脱顆粒能（ＣＤ１０７ａ＋）を決定した（補足図５）。ゲーティングした後、あらゆる特定の機能組み合わせについて、陰性対照培養物で検出されたバックグラウンド応答を、刺激した試料で検出された応答から差し引いた。いくつかのサイトカインを同じチャネルに含めることによりシグナルだけでなくバックグラウンドも高まることは、非常に限定的なカットオフの適用を示唆している。Ｒｏｅｄｅｒｅｒ ｅｔ ａｌ（Ｒｏｅｄｅｒｅｒ，Ｍ．２０１１．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ．ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｙｔｏ．ａ．２１０１５）によって記載されているように、バックグラウンドを差し引いたデータを閾値化した後に検出され得る応答を陽性シグナルとみなした。

１０．ＩＦＮガンマ（またはＩＦＮ−γ）ＥＬＩＳＰＯＴ
単離した新鮮ＰＢＭＣ（ＰＢＭＣ細胞１００，０００個／ウェル）を１４０ｕｌのＲ１０ ９６ウェルポリビニルプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に追加した。以前に記載されているように（Ｆｒａｈｍ，Ｎ．２００７．Ｊｏｕｒ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌ）製造業者の説明書にしたがって、ＩＦＮ−γＭａｂｔｅｃｈキットを使用した。陽性応答の閾値は、１ウェル当たりのスポットが少なくとも５個であり、「陰性対照ウェルの平均スポット数＋陰性対照ウェルの３標準偏差」および「陰性対照ウェルの平均の３倍」のいずれか高い方を超える応答と定義した。

１１．統計分析
Ｐｒｉｓｍ Ｖｅｒｓｉｏｎ ４，ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して、統計分析を実施した。ブーストフローアッセイのバックグラウンド補正後、以前に記載されている分析手順（Ｒｏｅｄｅｒｅｒ，Ｍ．２０１１．Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ａ．ｄｏｉ：１０．１００２／ｃｙｔｏ．ａ．２１０１５）にしたがってデータを閾値化した。検出された陽性応答の質の間の差異を検出するために、χ二乗検定を適用した。具体的な比較のために、ノンパラメトリックマンホイットニー検定を示されているように適用した。すべての分析において、０．０５未満のｐ値を統計的に有意であるとみなした。マンホイットニー検定を適用した。χ二乗検定を適用した。すべての分析において、０．０５未満のｐ値を統計的に有意であるとみなした。

実施例１
ＨＩＶ血清陽性患者（ｎ＝１８、コントローラおよび非コントローラ）、および高度に曝露された持続的血清陰性被験体（ｎ＝８）を上記一般的な手順にしたがって分析した。

ＩＦＮ−γＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより、ＨＩＶ患者では規模および幅の点で応答がより高いことが示された。コントローラ患者群と非コントローラ患者群との間で統計的有意差は認められなかった。加えて、ＨＥＰＳ群で検出された応答はより少なかった。図１参照。

ＣＤ８＋およびＣＤ４＋Ｔ細胞におけるトグルペプチドに対して生じたさらなる応答（ｐ２４、Ｔｈ１様（ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ１−β、ＩＬ−２）またはＴｈ２様（ＩＬ−４、−１０）およびＴｈ１７（ＩＬ−１７）応答に及ぶ）の発生を「ブロウ」によって研究した。簡潔に言えば、このアッセイは、フローサイトメトリによって同じ蛍光チャネル内のブーストサイトカインを検出することに基づいている。Ｔｈ１ブースト「ブロウ」分析では、ＨＥＰＳ集団における陽性応答の検出に非常に適切なＥＬＩＳｐｏｔアッセイと比較して有意に多くのＴｈ１様応答が検出された。一般に、「ブロウ」分析では、ＩＦＮγＥｌｉｓｐｏｔアッセイと比較して有意に多くの応答が検出された。ＩＦＮγＥｌｉｓｐｏｔによって測定したＩＦＮγＣＤ８応答に加えて、「ブロウ」分析は、ＣＤ８およびＣＤ４Ｔ細胞集団におけるトグルペプチドに対する「Ｔｈ１」および「Ｔｈ２／１７」様応答も区別する。検出率の増加は、ＨＥＰＳで特に顕著であった。図２参照。

生じたすべてのＣＤ４およびＣＤ８応答を測定した後、ＨＩＶ感染患者が主にＣＤ８応答を発生しており、ＨＥＰＳ集団が主にＣＤ４Ｔ細胞応答を生成していることを観察することができた。図３Ａ参照。また、ＨＩＶコントローラ、非コントローラおよびＨＥＰＳ被験体における応答プロファイルは、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞の両方について、Ｔｈ１対Ｔｈ２／ＩＬ−１７パターンおよび脱顆粒能が大きく異なっていた（ＣＤ４Ｔｈ１：χ^２＝１２．５９、ｐ＝０．０１３；ＣＤ４Ｔｈ２：χ^２＝１１．０４、ｐ＝０．０２６；ＣＤ８Ｔｈ１：χ^２＝３３．１６、ｐ＝１．１０７ｅ−０６；ＣＤ８Ｔｈ２：χ^２＝１５．９０、ｐ＝０．００３）。図３Ｂ参照。注目すべきことに、ＨＥＰＳ個体におけるＣＤ８Ｔ細胞応答は、ＨＩＶ患者と比較して多くの場合にサイトカイン産生性であったが（Ｔｈ１は５２％およびＴｈ２／ＩＬ１７は６３％）、脱顆粒性ではなかった（ＣＤ１０７−）。しかしながら、この集団で観察された多くのＴｈ２プロファイルは、ＩＬ−１７が同じパネルに含まれていたことによってバイアスを受けた可能性がある。

比較として、１３種のサイトカインのＦｌｏｗＣｙｔｏｍｉｘおよびＥＬＩＳｐｏｔＩＦＮ−γによって、個々のサイトカイン産生を評価した。実際、この後のｆｌｏｗ−ｃｙｔｏｍｉｘデコンボリューションにより、ＨＥＰＳ被験体におけるサイトカイン（すなわち、ＩＬ−１７、ＩＬ−２２、ＩＬ−９）のレベルは、ＨＩＶ＋個体と比較して上昇していることが示された。図４Ａ〜Ｄ参照。

実施例２
ＰＭＡ＋ＩｏまたはＥＢＶ由来の抗原を陽性対照として使用するか（図６および７参照）、またはｐ１７のような様々なＨＩＶ由来の抗原を使用する以外は実施例１に示されているのと同様の実験を繰り返した。ポリクローナル刺激ＰＭＡ＋Ｉｏを使用することにより、ペプチド特異的刺激よりも高い陽性応答がＨＥＰＳで発生する。しかしながら、ＥＢＶペプチドのプールを使用することにより、陽性応答を検出することもできる。また、ブーストフローサイトメトリ法を使用することによって、本発明者らは、ＥＢＶペプチドのプールで刺激した後に検出された応答と同様に、ＨＩＶペプチドのプールに対する応答をＨＥＳＮ個体（血清不一致カップル）で検出することができた。最後に、本発明は、ＣＤ４（ＭＨＣクラスＩＩペプチド）およびＣＤ８（ＭＨＣクラスＩペプチド）における特異的ペプチド応答、ならびにこれまでに観察されなかったＨＥＳＮにおけるＨＩＶに対する捕獲応答を決定することを可能にする。

Claims (24)

1. 被験体における病原体に対して特異的なＴ細胞応答をアッセイする方法であって、
   ｉ）被験体由来のＴ細胞を含む試料を、病原体由来の抗原を含む組成物と接触させ、
   ｉｉ）当該試料中のＴ細胞によって産生される複数のサイトカインのレベルをブーストフローサイトメトリによって決定すること
   を含んでなり、
   前記ブーストフローサイトメトリが、フローサイトメトリによって同じ蛍光チャネル内のいくつかのサイトカインを同時に検出することを含むものである、方法。
2. 前記抗原を含む組成物が、抗原または抗原ライブラリである、請求項１に記載の方法。
3. 前記病原体由来の抗原または抗原ライブラリが、病原体のポリペプチド由来のペプチド変異体またはペプチド変異体ライブラリである、請求項２に記載の方法。
4. 前記ペプチド変異体ライブラリが、トグルペプチドである、請求項３に記載の方法。
5. 前記病原体がＨＩＶまたはＥＢＶである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ペプチド変異体が、ＧａｇまたはＮｅｆポリタンパク質に由来するものである、請求項５に記載の方法。
7. 前記ペプチド変異体が、ｐ２４またはｐ１７に由来するものである、請求項６に記載の方法。
8. 前記複数のサイトカインが、Ｔｈ１応答に特徴的なサイトカイン、Ｔｈ２応答に特徴的なサイトカイン、およびその両方からなる群から選択されるものである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記Ｔｈ１応答に特徴的なサイトカインが、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ１−β、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＬ−１Ｂからなる群から選択されるものである、請求項８に記載の方法。
10. 前記Ｔｈ２応答に特徴的なサイトカインが、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０およびＩＬ−１３からなる群から選択されるものである、請求項８に記載の方法。
11. ＣＤ４＋細胞および／またはＣＤ８＋細胞において、Ｔｈ１応答に特徴的なサイトカイン、Ｔｈ２応答に特徴的なサイトカインまたはその両方を決定する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. Ｔｈ９、Ｔｈ１７またはＴｈ２２応答に特徴的なサイトカインのレベルを決定することをさらに含んでなる、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. Ｔ細胞を含有する試料がＰＢＭＣ調製物である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 高度に曝露された持続的血清陰性患者を同定するための方法であって、
    ｉ）前記患者のＴ細胞を含有する試料を、ＨＩＶまたはＥＢＶペプチド組成物と共にインキュベートし、
    ｉｉ）ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２ｐ７０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７およびＩＬ−２２からなる群から選択される複数のサイトカインのレベルをブーストフローサイトメトリによって決定することを含んでなり、
    前記ブーストフローサイトメトリが、フローサイトメトリによって同じ蛍光チャネル内のいくつかのサイトカインを同時に検出することを含むものであり、
    前記サイトカインの複数の発現レベルが基準値よりも増加していることが、患者が高度に曝露された持続的血清陰性患者であることを示すとする、方法。
15. 前記ＨＩＶペプチド組成物が、Ｇａｇ ｐ２４ ＨＩＶまたはＧａｇ ｐ１７ ＨＩＶまたはＮｅｆタンパク質由来のペプチドを含むものである、請求項１４に記載の方法。
16. 前記Ｇａｇ ｐ２４ ＨＩＶまたはＧａｇ ｐ１７ ＨＩＶまたはＮｅｆタンパク質由来のペプチドが、トグルペプチドである、請求項１５に記載の方法。
17. 前記Ｔ細胞を含有する試料が、ＰＢＭＣ調製物である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 各サイトカインの基準値が、ＨＩＶ感染患者由来のＴ細胞を含有する試料中の前記サイトカインの発現レベルである、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 高度に曝露された持続的血清陰性患者を同定するための方法であって、
    ｉ）Ｔ細胞を含む前記患者の試料を、ＨＩＶまたはＥＢＶタンパク質由来のペプチド組成物と共にインキュベートし、
    ｉｉ）ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ１−βおよびＩＬ−２からなる群から選択される複数のサイトカインのレベルを測定することによって、Ｔｈ１様応答を決定し、ＩＬ−４およびＩＬ−１０からなる群から選択される複数のサイトカインのレベルを測定することによって、Ｔｈ２様応答を決定し、または、Ｔｈ１７（ＩＬ−１７）のレベルを測定することによって、Ｔｈ１７応答を決定することを含んでなり、
    前記複数のサイトカインのレベルがブーストフローサイトメトリによって測定され、前記ブーストフローサイトメトリが、フローサイトメトリによって同じ蛍光チャネル内のいくつかのサイトカインを同時に検出することを含むものであり、
    前記細胞におけるＴｈ１様応答、Ｔｈ２様応答またはＴｈ１７応答が基準値よりも増加していることが、患者が高度に曝露された持続的血清陰性患者であることを示すとする、方法。
20. ＣＤ４およびＣＤ８Ｔリンパ球において、ブーストフローサイトメトリによって、サイトカインレベルの決定を行う、請求項１９に記載の方法。
21. 前記ＨＩＶタンパク質が、ｐ２４またはｐ１７またはＮｅｆである、請求項１９または２０に記載の方法。
22. 前記ペプチド組成物が、トグルペプチド混合物である、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記Ｔ細胞を含有する試料が、ＰＢＭＣ調製物である、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 前記基準値が、感染患者由来のＴ細胞を含有する試料におけるＴｈ１様応答、Ｔｈ２様応答またはＴｈ１７応答のレベルである、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
    

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