CN104272108A - 用于监测hiv特异性t细胞应答的方法 - Google Patents

用于监测hiv特异性t细胞应答的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104272108A
CN104272108A CN201380022862.8A CN201380022862A CN104272108A CN 104272108 A CN104272108 A CN 104272108A CN 201380022862 A CN201380022862 A CN 201380022862A CN 104272108 A CN104272108 A CN 104272108A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
response
sample
peptide
hiv
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201380022862.8A
Other languages
English (en)
Inventor
玛尔塔·鲁伊斯里奥尔
克里斯蒂安·布兰德
哈维尔·伊瓦龙多
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IrsiCaixa Institut de Recerca de la Sida
Original Assignee
Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA
IrsiCaixa Institut de Recerca de la Sida
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA, IrsiCaixa Institut de Recerca de la Sida filed Critical Institucio Catalana de Recerca i Estudis Avancats ICREA
Publication of CN104272108A publication Critical patent/CN104272108A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6863—Cytokines, i.e. immune system proteins modifying a biological response such as cell growth proliferation or differentiation, e.g. TNF, CNF, GM-CSF, lymphotoxin, MIF or their receptors
    • G01N33/6866—Interferon
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5047—Cells of the immune system
    • G01N33/505—Cells of the immune system involving T-cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56983—Viruses
    • G01N33/56988—HIV or HTLV
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
    • G01N2333/08—RNA viruses
    • G01N2333/15—Retroviridae, e.g. bovine leukaemia virus, feline leukaemia virus, feline leukaemia virus, human T-cell leukaemia-lymphoma virus
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/525—Tumor necrosis factor [TNF]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/54—Interleukins [IL]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/52—Assays involving cytokines
    • G01N2333/555—Interferons [IFN]
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/56—Staging of a disease; Further complications associated with the disease
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/60—Complex ways of combining multiple protein biomarkers for diagnosis

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明总体涉及用于监测HIV特异性T细胞应答和鉴定能够控制HIV发展或预防HIV感染之对象的方法和诊断试剂盒。所述方法以组合使用加强的流式细胞术和切换肽为基础并且可覆盖比标准测定大得多的效应功能组。所述方法还适于检测对任何病原体的任何期望细胞因子或细胞因子之组合的T细胞应答。

Description

用于监测HIV特异性T细胞应答的方法
技术领域
本发明总体涉及用于监测HIV特异性T细胞应答和鉴定能够控制HIV发展或预防HIV感染之对象的方法和诊断试剂盒。
背景技术
人免疫缺陷病毒(HIV)序列多样性是在体外可靠评估抗病毒T细胞免疫和设计有效且广泛适用的HIV疫苗的主要障碍。参见Brander C等，Curr.Opin.Immunol.2006；18(4)：430-437。
尽管在全基因组水平上具有广泛的HIV序列多样性，但是病毒蛋白质在个别位置的变化通常局限于在不同HIV进化枝中重现或“切换(toggle)”的有限数量的氨基酸替换。参见Gaschen B等，Science 2002；296：2354-2360。切换残基(toggling residue)通常包括氨基酸对例如精氨酸(R)和赖氨酸(K)或者亮氨酸(L)和缬氨酸(V)，这些氨基酸对在生物化学上类似，因此可能被病毒耐受而不严重影响其复制效率。显著地，大部分Gag p24(高保守蛋白质的代表)切换肽(toggled peptide)混合物仅需要不到20种变体(中值为4)，即使在最高水平的序列覆盖率(即，仅从切换位置排除存在于＜5％的数据库序列中的氨基酸)下也是如此，而在该覆盖率下在其他Gag亚基中变体数目更高。参见Yusim K等，J.Virol.2002；76(17)：8757-8768。在IFN-γElispot测定中，已经表明，与匹配的共有序列肽相比，这些“切换”肽检测HIV特异性CD4+和CD8+T细胞应答的幅度(breath)和量级(magnitude)显著更高。参见FrahmN等，J.Immunol.2007；179：6638-6650。
用于HIV疫苗接种的免疫原候选物的大部分研究以通过Elispot分析IFN-γ产量为基础。迄今，没有发现IFN-γ的量级或分泌与病毒载量之间的直接相关性。在过去的数年，已经发现针对HIV抗原决定簇的T细胞应答的质量可能是引起针对病毒的有效应答的关键决定性因素。然而，对HIV感染患者中CD8+T淋巴细胞的多功能应答(例如，分泌不同细胞因子和穿孔胞吐)的分析已经表明T淋巴细胞的多功能能力与病毒载量之间的负相关性。另外，流式细胞术和基于Elispot的分析可能无法检测与非定期测量或未表现出预期的一种或更多种效应功能谱之细胞因子相关的应答。因此，本领域需要更灵敏和综合的方法以评估针对HIV的T细胞应答。
发明内容
在第一个方面，本发明涉及一种用于测定对象中特异性针对病原体的T细胞应答的方法，其包括：i)使包含来自所述对象之T细胞的样品与包含来自所述病原体之抗原的组合物接触，以及ii)测定由所述样品中的T细胞产生的多种细胞因子的水平。
在第二个方面，本发明涉及一种用于鉴定高度暴露的持续血清反应阴性患者的方法，其包括：i)用HIV或EBV肽组合物孵育含有所述患者之T细胞的样品，以及ii)测定选自IL-1b、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17和IL-22的一种或更多种细胞因子的水平，其中一种或更多种所述细胞因子的表达水平相对于参考值升高表明所述患者是高度暴露的持续血清反应阴性患者。
在第三个方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含用于检测选自IL-1b、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17和IL-22的一种或更多种细胞因子的试剂。
在第四个方面，本发明涉及一种用于鉴定高度暴露的持续血清反应阴性患者的方法，其包括：i)用来源于HIV蛋白或EBV蛋白的肽组合物孵育所述患者的含有T细胞的样品，以及ii)测定Th1样应答、Th2样应答或Th17应答，其中所述细胞中Th1样应答、Th2样应答或Th17应答相对于参考值升高表明所述患者是高度暴露的持续血清反应阴性患者。
附图简述
图1.仅由切换肽刺激引起的细胞应答。HIV患者在幅度和量级方面均比HEPS个体表现出更高的应答。在控制者组和非控制者组之间未观察到显著统计学差异。在HEPS组还检测到了较少和较弱的应答。
图2.直方图(上：绝对数量，下，相对百分比)示出了当使用IFNγElispot和加强的流式细胞术方法时，在HEPS和HIV感染患者(控制者和非控制者)中检测到的不同的应答。另外，所有加强的流式细胞术应答(左)中，通过CD3淋巴细胞或仅通过CD4和CD8T细胞驱动的那些，还被分成Th1样应答(中)和Th2/17应答(右)。对“Blow”和ELISpot IFN-γ测定进行比较。与IFN-γ测定相比，用“Blow”测定检测出了显著更多的应答。除通常的CD8应答之外，“Blow”测定识别CD8和CD4T细胞群中针对切换肽的特异性Th1和Th2型应答。在HEPS组中，增加的检测率尤其突出。
图3.A-B：CD8和CD4“Blow”应答。HIV感染患者主要产生CD8应答，而HEPS群体产生更多的CD4T细胞应答。对于CD4和CD8T细胞二者，HIV控制者、非控制者和HEPS对象的应答谱在其Th1和Th2/IL-17模式以及其脱粒能力方面变化极大。与HIV感染的个体相比，HEPS对象中的CD8T细胞应答通常产生细胞因子(Th1+和Th2/17)但是不脱粒(CD107-)。然而，在该群体中观察到常见的Th2谱可能由于同一组中包含IL-17而有所偏离。
图4.A-D：通过流式细胞术评估了单独细胞因子的产生。flow-cytomix去卷积(deconvolution)表明与HIV+个体相比，HEPS对象中应答数更高(即，控制者组比非控制者组产生更多应答)。此外，与HIV+个体相比，在HEPS对象中还检测到单种细胞因子(对于IL-1b、IL-10、IL-13和IL-22有统计学显著性)的水平升高。
图5.对于“加强的”流式细胞术的选通策略(B-flow)。在切换肽刺激(参见一般方法部分)之后，用于CD4辅助T细胞和CTL应答的选通策略的代表性实例。
图6.3为HEPS(血清不一致(serodiscordant)夫妻：EAR28、EAR05和EAR33)在不同刺激之后产生的CD8T细胞(上)和CD4T细胞(下)应答的百分比。刺激：PMA+Io(多克隆刺激)、EBV库1(HLA I类限制性肽)、EBV库4(HLA II类限制性肽)。
图7.2为HEPS(血清不一致夫妻：EAR05和EAR28)在不同刺激之后产生的T细胞应答的百分比。刺激：HIV p24库1、HIV p24库3-、HIV p17库1、-HIV p17库2、Nef库、EBV库1(HLA I类限制性肽)、EBV库4(HLA II类限制性肽)、PMA+Io(多克隆刺激)。
具体实施方式
本发明公开了用于测定针对HIV的细胞应答的新方法。所述方法以组合使用“加强的”流式细胞术(“boosted”flow cytometry，“Blow”)和切换肽为基础。“Blow”分析使数种细胞因子组合进入同一荧光通道，从而可比标准测定覆盖大得多的效应功能组。
一般来说，切换肽与新的blow分析和上清液中广谱细胞因子的组合提供了用于更加综合评估HIV特异性T细胞免疫的有力工具，并且使得限定HIV患者(感染的控制者或非控制者)之间的功能差异成为可能。本发明特别地可用于检测接种疫苗(例如接种树突细胞疫苗)的个体和高度暴露的持续血清反应阴性对象(highly-exposed，persistentlyseronegative subject，HEPS)中潜在的“非典型”效应功能和应答。
出人意料地，用Gag p24或Gag p17或Nef肽或者用EBV抗原(优选切换肽)刺激患者PBMC，结合通过加强的流式细胞术确定细胞因子水平，在检测特异性T淋巴细胞应答方面是比本领域中描述的其他方法(如IFNγ的经典ELIspot)灵敏得多的方法。本发明的第二种方法在检测HEPS群体中的Th1样应答方面特别灵敏。
出乎意料地，本发明人已经观察到，用Gag p24或Gag p17或Nef肽变体群或者用EBV抗原变体群(优选切换肽)刺激患者的PBMC并且通过加强的流式细胞术测定细胞因子水平，在检测特异性T淋巴细胞应答方面是比IFNγ的经典ELISPOT灵敏得多的方法。本发明的第二种方法在检测HEPS群体中的Th1样应答方面特别灵敏。
出乎意料地，本发明人还观察到，用Gag p24或Gag p17或Nef肽变体群或者用EBV抗原变体群(优选切换肽)刺激患者的PBMC并且通过加强的流式细胞术测定多种细胞因子的水平，在检测特异性T淋巴细胞应答方面是比IFNγ的经典ELISPOT灵敏得多的方法。
由本发明的结果得到以下结论：用肽刺激PBMC，然后使用加强的流式细胞术方法进行多细胞因子检测的技术可应用于任何能够在PBMC中诱发细胞因子产生的病原体抗原。
最后，本发明允许测定CD4中的特异性肽应答(MHC II类肽)以及CD8中的特异性肽应答(MHC I类肽)并且在HESN中捕获迄今未观察到的针对HIV的应答。
因此，在第一个方面，本发明涉及一种用于测定对象中特异性针对病原体之T细胞应答的方法，其包括：i)使来含有自所述对象之T细胞的样品与包含来自所述病原体之抗原的组合物接触，以及ii)测定由所述样品中的T细胞产生的多种细胞因子的水平。
在一个优选实施方案中，包含抗原的组合物是抗原，更优选单一抗原。在另一个实施方案中，所述包含抗原的组合物是抗原文库。
在一个优选实施方案中，来自病原体的抗原是来源于病原体之多肽的肽变体。在另一个优选实施方案中，抗原文库是肽变体文库。在一个更优选的实施方案中，所述肽变体文库是切换肽。
在本发明的另一个优选实施方案中，病原体是HIV或EBV。
在本发明的方法是用于测定特异性针对HIV病原体的T细胞应答之方法的情况下，肽变体来源于Gag多蛋白或Nef蛋白。在一个优选的实施方案中，所述肽变体来源于p24或p17。
在一个优选实施方案中，本发明涉及一种用于测定对象中特异性针对病原体的T细胞应答的方法，其包括：i)使包含来自所述对象之T细胞的样品与来源于所述病原体之多肽的肽变体文库接触，以及ii)测定由所述样品中的所述T细胞产生的多种细胞因子的水平。
在本发明方法的一个优选实施方案中，所述多种细胞因子选自：表征Th1应答的细胞因子、表征Th2应答的细胞因子或二者皆有。在一个更优选实施方案中，表征Th1应答的细胞因子选自IFN-γ、TNF-α、MIP1-β、IL-2、IL-12和IL-1B。在另一个优选实施方案中，表征Th2应答的细胞因子选自IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。在另一个实施方案中，本发明的方法还包括测定表征Th9、Th17或Th22应答的细胞因子的水平。
在本发明方法的另一个优选实施方案中，在CD4+细胞和/或CD8+细胞中测定表征Th1应答的细胞因子、表征Th2应答的细胞因子或二者皆有。
在本发明方法的一个优选实施方案中，通过加强的流式细胞术测定多种细胞因子的水平。在加强的流式细胞术中可使用多个阳性对照。在一个优选实施方案中，在多克隆刺激后，在HESN中使用加强的流式细胞术技术并使用PMA(12-豆蔻酸13-乙酸佛波醇酯(phorbol 12-myristate13-acetate))+Io(离子霉素(ionomycine))作为阳性对照。在另一个实施方案中，在单克隆刺激后，在HESN中使用加强的流式细胞术技术并使用EBV作为阳性对照。通过EBV的刺激是肽特异性的，因此其更加类似于利用HIV肽的刺激。另外，可使用抗CD3加抗CD28或PMA(12-豆蔻酸13-乙酸佛波醇酯)加离子霉素(Io)作为阳性对照。作为用于病毒肽刺激的另外的阳性对照，也可分别使用EBV MHC I类限制性肽库和EBV MHC II类限制性肽库用于CD8T细胞刺激和CD4T细胞刺激。
在一个优选实施方案中，含有T细胞的样品是PBMC制备物。
在另一个方面，本发明涉及用于鉴定高度暴露的持续血清反应阴性患者的方法，其包括：i)用HIV或EBV肽组合物孵育含有所述患者之T细胞的样品，以及ii)测定选自IL-1b、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17和IL-22的一种或更多种细胞因子的水平，
其中一种或更多种所述细胞因子的表达水平相对于参考值升高表明所述患者是高度暴露的持续血清反应阴性患者。
在一个优选实施方案中，HIV肽组合物包含来源于Gag p24HIV蛋白或Gag p17HIV蛋白的肽。在一个更优选实施方案中，来源于Gag p24HIV蛋白或Gag p17HIV蛋白的所述肽是切换肽。
在一个优选实施方案中，含有T细胞的样品是PBMC制备物。
在另一个优选实施方案中，用于每种细胞因子的参考值是来自HIV感染患者的含有T细胞的样品中所述细胞因子的表达水平。
在另一个优选实施方案中，通过流式细胞术分析来进行细胞因子水平的测定。在一个更优选实施方案中，流式细胞术分析是加强的流式细胞术。
在另一个方面，本发明涉及一种试剂盒，其包含用于检测选自IL-1b、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17和IL-22的一种或更多种细胞因子的试剂。在另一个方面，本发明涉及本发明试剂盒用于根据本发明方法的特征来鉴定HEPS患者的用途。
在另一个方面，本发明涉及用于鉴定高度暴露的持续血清反应阴性患者的方法，其包括：i)用来源于HIV或EBV蛋白的肽组合物孵育所述患者的含有T细胞的样品，以及ii)测定Th1样应答、Th2样应答或Th17应答，其中所述细胞中Th1样应答、Th2样应答或Th17应答相对于参考值升高表明所述患者是高度暴露的持续血清反应阴性患者。
在一个优选实施方案中，通过测量选自IFN-γ、TNF-α、MIP1-β和IL-2的一种或更多种细胞因子的水平来测定Th1样应答；通过测量选自IL-4和IL-10的一种或更多种细胞因子的水平来测定Th2样应答；或者通过测量Th17(IL-17)的水平来测定Th17应答。在一个更优选实施方案中，通过加强的流式细胞术来测定CD4和CD8T淋巴细胞中的细胞因子水平。
在用于鉴定高度暴露的持续血清反应阴性患者的本发明方法的一个优选实施方案中，所述HIV蛋白质是p24或p17。在另一个优选实施方案中，所述HIV蛋白质是p17。在一个更优选的实施方案中，所述肽组合物是切换肽混合物。
因此，在另一个优选实施方案中，本发明涉及一种用于鉴定HEPS患者的方法，其包括：用来源于Gag p24HIV蛋白或Gag p17HIV蛋白的肽孵育所述患者的样品并且通过加强的流式细胞术测定CD4和CD8T淋巴细胞中Th1样细胞因子(IFN-γ、TNF-α、MIP1-β、IL-2)、Th2样细胞因子(IL-4、IL-10)和Th17细胞因子(IL-17)的水平，其中CD4T淋巴细胞中任意所述细胞因子的表达水平相对于参考值升高表明所述患者是HEPS。
在本发明的用于鉴定高度暴露的持续血清反应阴性患者的方法的一个优选实施方案中，含有T细胞的样品是PBMC制备物。
在本发明的用于鉴定高度暴露的持续血清反应阴性患者的方法的一个优选实施方案中，所述参考值是来自被感染患者的含有T细胞的样品中Th1样应答、Th2样应答或Th17应答的水平。
1.定义
本文使用的术语“AIDS”是指HIV感染的症状阶段，并且包括获得性免疫缺陷综合征(通常称为AIDS)和“ARC”或“AIDS-相关综合征”二者。参见Adler M等，Brit.Med.J.1987；294：1145-1147。AIDS的免疫学和临床表现是本领域中公知的，包括例如免疫缺陷导致的机会性感染和癌症。
本文使用的术语“抗原”是指能够引起免疫应答的分子。抗原包括但不限于：细胞、细胞提取物、蛋白质、多肽、肽、多糖、多糖辍合物、多糖和其他分子的肽和非肽类似物、小分子、脂质、糖脂、碳水化合物、病毒和病毒提取物以及多细胞生物体如寄生物和过敏原。术语抗原在广义上包括被宿主免疫系统识别为外来物的任意类型的分子。
本文使用的术语“抗逆转录病毒治疗”或“ART”是指施用一种或更多种抗逆转录病毒药物以抑制HIV的复制。通常，ART包括施用至少一种抗逆转录病毒剂(或通常地，抗逆转录病毒剂的混合物)，例如核苷逆转录酶抑制剂(例如，齐多夫定(AZT)、拉米夫定(3TC)和阿波卡韦)、非核苷逆转录酶抑制剂(例如，奈韦拉平和依非韦仑)和蛋白酶抑制剂(例如，吲哚那韦、利托那韦和洛匹那韦)。术语高效抗逆转录病毒治疗(“HAART”)是指设计成强力抑制病毒复制和HIV疾病之发展的治疗方案，通常由三种或更多种不同药物组成，例如，两种核苷逆转录酶抑制剂和一种蛋白酶抑制剂。
本文使用的术语“加强的流式细胞术”或“blow”是指基于通过流式细胞术在同一荧光通道中检测数种细胞因子的测定，因此比标准测定覆盖大得多的效应功能组。
本文使用的术语“CD4(+)T细胞”是指在其表面呈递共受体CD4的T细胞。该术语指T辅助细胞，其协调巨噬细胞和CD8+T细胞的活化(Th-1细胞)、通过B细胞(Th-2细胞)产生抗体或其被认为在自身免疫疾病中发挥重要作用(Th-17细胞)。另外，术语“CD4+T细胞”还指调节性T细胞，其代表了CD4+T总细胞群体中的约10％。调节性T细胞在抑制免疫应答、预防自身免疫疾病和口服耐受中发挥重要作用。
术语“CD8(+)T细胞”指示在其表面表达CD8糖蛋白的T细胞，其中CD8(分化簇8)糖蛋白是一种充当T细胞受体(TCR)之共受体的跨膜糖蛋白。与TCR类似，CD8与主要组织相容性复合体(MHC)分子结合，但是对于I类MHC蛋白是特异的。示例性CD8T细胞包括细胞毒性记忆CD8T细胞、调节性CD8T细胞、细胞毒性效应CD8T细胞和本领域技术人员可鉴定的另外的细胞。
本文使用的术语“慢性进展者”或“非控制者”是指被HIV感染并且在初始感染后表现出病毒载量随时间增加的个体。
本文使用数术语“相关性”或“相关”是指两个事件的事件之间的统计学联系，其中事件可包括数值、数据组等。例如，当所述事件涉及数值时，正相关(本文也称为“直接相关”)意味着当一个增加时，另一个也增加。负相关(本文也称为“逆相关”)意味着当一个的增加时，另一个减小。
术语“细胞因子”是指由细胞分泌的可改变分泌细胞或另一种细胞的行为或特性的小的可溶性蛋白质。细胞因子与细胞因子受体结合并引发细胞内的行为或特性，例如，细胞增殖、死亡或分化。示例性细胞因子包括但不限于：白细胞介素(例如，IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-1a、IL-1β和IL-1RA)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、制癌蛋白M、促红细胞生成素、白血病抑制因子(LIF)、干扰素、B7.1(也称为CD80)、B7.2(也称为B70、CD86)、TNF家族成员(TNF-α、TNF-β、LT-β、CD40配体、Fas配体、CD27配体、CD30配体、4-1BBL、Trail)和MIF。可通过数种本领域中公知的方法测定细胞因子的水平，例如ELISA、ELISPOT、Western Blot和流式细胞术。在一个优选实施方案中，通过流式细胞术进行用于第一个方面之方法的细胞因子水平的测定。
本文使用的高度暴露的持续血清反应阴性(HEPS)患者是指尽管有证据表明其通过无保护措施的性接触多次重复地暴露于HIV-1但依然不具有对病毒抗原反应的血清IgG的对象(Beyrer，C.等，J.Infect.Dis.，1999，第79卷，第59-68页)。
本文使用的术语“变体”是指i)其中的一个或更多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基替换的多肽的变体，其中这种经替换的氨基酸残基可以是或不是由遗传密码编码的氨基酸，或者ii)包含一个或更多个氨基酸的插入或缺失的变体。
术语“EBV”也称为人疱疹病毒4(HHV-4)，在整个说明书中用于描述伯基特淋巴瘤(Burkitts lymphoma)的细胞培养物中发现的疱疹病毒。EBV是传染性单核细胞增多症和若干种其他相关病症/疾病状态(包括EBV相关淋巴瘤)的病原体。
本文使用的术语“Gag p24HIV蛋白”是指HIV的衣壳蛋白，其来源于经加工的多蛋白Gag。在一个优选实施方案中，来源于Gag p24HIV蛋白的肽是切换肽。
本文使用的术语“Gag p17HIV蛋白”是指包围衣壳以确保HIV病毒体颗粒的完整性的基质。其来源于经加工的多蛋白Gag。在一个优选实施方案中，来源于Gag p17HIV蛋白的肽是切换肽。
术语“Nef蛋白”是指HIV的附属调节性蛋白(accessory regulatoryprotein)。在一个优选实施方案中，来源于Nef蛋白质的肽是切换肽。
本文使用的术语“高度暴露的持续血清反应阴性”或“HEPS”或“HESN”个体是指暴露于HIV并且未被所述病毒感染的对象。HIV感染的存在与否可通过证明人对象中HIV抗体、HIV抗原或HIV核酸的存在来表示，如通过使用本领域技术人员已知的HIV测试(例如，HIV EIA、Western印记、PCR测试)检测病毒的存在来证明。
本文使用的术语“HIV”包括HIV-1、HIV-2和SIV。“HIV-1”是指人免疫缺陷病毒1型。HIV-1包括但不限于细胞外病毒颗粒和与被HIV-1感染的细胞结合的HIV-1的形式。HIV-1病毒可代表任意已知的主要亚型(A、B、C、D、E、F、G和H类)或包括实验室毒株和原代分离株的的外围亚型(outlying subtype)(O群)。“HIV-2”是指人免疫缺陷病毒2型。HIV-2包括但不限于细胞外病毒颗粒和与被HIV-2感染的细胞结合的HIV-2的形式。术语“SIV”是指猿猴免疫缺陷病毒，其为感染猴、黑猩猩和其他非人灵长类动物的HIV-样病毒。SIV包括但不限于细胞外病毒颗粒和与被SIV感染的细胞结合的SIV的形式。
本文使用的术语“HIV暴露”是指未被HIV感染的对象或非AIDS对象与被HIV感染的对象或AIDS对象接触，或者与这种被HIV感染的对象的体液接触，其中这样的来自被感染对象的体液以病毒可从被感染对象或被感染对象的体液向未被感染的对象传播的方式与未被感染对象的黏膜、组织的切口或擦伤(例如，针刺、无保护措施的性交)或其他表面接触。
本文使用的“HIV感染”是指在个体中存在HIV病毒的适应症，包括无症状的血清阳性、AIDS-相关综合征(arc)和获得性免疫缺陷综合症(AIDS)。
本文使用的术语“病原体”是指在宿主中造成疾病状态(例如，感染、癌症等)的生物剂。“病原体”包括但不限于病毒、细菌、古细菌(archaea)、真菌、原生动物、支原体、朊病毒和寄生生物。
本文使用的术语“长期无进展者”是指已被HIV感染约10年或更久的个体，其特征在于正常和稳定的CD4+T细胞水平并且其未进行抗逆转录病毒疗法的治疗。这些个体占慢性HIV感染者的5％至15％。与长期无进展者有关的一个更近期的术语是“HIV控制者”，其基于血浆HIV RNA水平定义无进展。存在两种类型的控制者，“精英控制者(elite controller)”表现为检测不到血浆HIV RNA，和“病毒血症控制者(viremiccontrollers)”，具有可检测的但是非常低水平的血浆HIV RNA。参见Deeks S等，Immunity 2007；27：406-416以及Ferre A等，Blood 2009；113(17)：3978-3989。
本文使用的术语“PBMC”是指外周血单核细胞，包括淋巴细胞、单核细胞和巨噬细胞。从血样中分离这种PBMC的方法是本领域中公知的。
本文使用的术语“蛋白酶抑制剂”是指HIV-1蛋白酶的抑制剂，该酶是将病毒多蛋白前体(例如，病毒GAG和GAG Pol多蛋白)通过蛋白酶剪切成感染性HIV中发现之单个功能性蛋白质所需要的酶。
本文使用的术语“逆转录酶抑制剂”是指任何抑制HIV-1逆转录酶活性的化合物，该酶催化将病毒基因组HIV-1RNA转变成原病毒HIV-1DNA。
本文使用的术语“含有T细胞的样品”是指从哺乳动物(优选人)中取出的并且含有T细胞的组织或体液。
在一些实施方案中，T细胞分离自暴露于肽变体之前的哺乳动物样品。关于T细胞的术语“经分离的”是指具有至少70、80、90、95、99或100百分比的T细胞形式的细胞群制备物。在一些方面，期望的细胞群分离自其他细胞组分，在一些情况下，特别地排除在分离中可能“污染”或干扰细胞之研究的其他细胞类型。但是，应理解的是，这样的“经分离的”细胞群可包含细胞生存或取得本公开内容所提供的期望结果所必需的另外的细胞类型。例如，抗原呈递细胞(如单核细胞(巨噬细胞)或树突细胞)可存在于T细胞的“经分离的”细胞群中或被添加到经分离的T细胞群中以产生调节性T细胞。在一些方面，这些抗原呈递细胞可以是活化的单核细胞或树突细胞。用于本公开方法的含有T细胞的细胞群可分离自从哺乳动物对象取得的生物样品。所述样品可来源于若干来源，包括但不限于外周血、单采白细胞的血液产品(leukapheresis blood product)、单采血液成分术的血液产品(apheresis blood product)、骨髓、胸腺、组织活检、肿瘤、淋巴结组织、消化道相关淋巴组织、黏膜相关淋巴组织、肝脏、免疫病变部位(例如，滑液)、胰腺和脑脊髓液。供体对象优选人，可以是胎儿、新生儿、儿童、成人，并且可以是正常的、患病的或被怀疑患有目标疾病的。
在一些实施方案中，T细胞样品包含来自血液样品的外周血单核细胞(PBMC)。“外周血单核细胞”或“PBMC”是指淋巴细胞(包括T细胞、B细胞、NK细胞等)和单核细胞。通常，使用标准技术从患者分离PBMC。在一些实施方案中，仅采集PBMC，将几乎全部的红细胞和多形核白细胞留给或返回给供体。可使用本领域中已知的方法(例如白细胞分离置换法(leukophoresis))分离PBMC。通常，实施5至7升白血球分离置换步骤，其主要移出来自患者的PBMC，而返还其余的血液组分。优选在抗凝剂(例如，肝素)的存在下进行样品采集。
在与肽变体组合物接触之前，可使用多种方法对包含PBMC或经分离之T细胞的含有T细胞的样品进行预处理。通常，一旦采集，可对细胞进行额外的浓缩(如果其未在采集的同时进行的话)或者进一步纯化和/或浓缩细胞。例如，可通过密度梯度离心(例如通过Ficoll-Hypaque梯度)对PBMC进行部分纯化。通常可使用本领域公知的技术对分离自供体样品的细胞进行洗涤以除去血清蛋白和可溶性血液组分，例如，自身抗体、抑制剂等。通常，这包括添加生理介质或缓冲液，然后离心。这在必要时可以重复。然后可对细胞计数，通常从5升至7升白细胞单采法收集1×109至2×109白细胞。可将纯化细胞重悬在合适的介质或缓冲液中以保持生存力。用于重悬的合适溶液通常是平衡盐溶液(例如，生理盐水、PBS、Hank平衡盐溶液等)，任选地增补胎牛血清、BSA、HSA、标准山羊血清和/或其他天然因子，连同低浓度(通常为5mM至50mM)的可接受的缓冲液。方便的缓冲液包括但不限于HEPES、磷酸盐缓冲液、乳酸盐缓冲液等。
本文使用的术语“对象”是指植物或动物个体，例如人，非人灵长类动物(例如，黑猩猩和其他猿类和猴类)；农场动物，例如鸟、鱼、牛、绵羊、猪、山羊和马；家养哺乳动物，例如狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠。该术语并不表示特定的年龄或性别。术语“对象”涵盖胚胎和胎儿。在一个优选实施方案中，对象是人。
本文使用的术语“Th1样应答”涉及以产生IFN-γ为特征的应答，其激活巨噬细胞的杀菌活性，诱导B-细胞制造调理(包被(coating))抗体并诱导细胞介导的免疫。这种应答也以产生TNF-α、MIP1-β和IL-2为特征。Th1应答对于细胞内病原体(宿主细胞内的病毒和细菌)更有效。
本文使用的术语“Th2样应答”涉及以释放IL-4和IL-10为特征的应答，IL4导致激活B细胞以制造中和(杀伤)抗体，导致体液免疫。Th2应答对细胞外细菌、寄生物和毒素更有效。
术语“T细胞应答”意指这样的免疫应答，其中T细胞直接或间接介导或者以其他方式有助于哺乳动物中的免疫应答。T细胞介导的免疫应答可与细胞介导的效应、淋巴因子介导的效应等有关，甚至如果通过例如T细胞分泌的淋巴因子刺激B细胞时效应与B细胞有关。对于MHC I类限制性CTL，效应功能可以是：肽脉冲的裂解、肽前体脉冲的裂解或天然肽呈递靶细胞的裂解，分泌细胞因子(优选肽诱导的干扰素-γ、TNF-α或IL-2)，分泌效应分子(优选肽诱导的粒酶或穿孔素)，或者脱粒。对于MHC II类限制性的T辅助细胞，效应功能可以是：肽诱导的细胞因子分泌，优选IFNγ、TNFα、IL-4、IL5、IL-10或IL-2，或者肽诱导的脱粒。CTL和T辅助细胞的可能的效应功能不限于上列。
本文使用的术语“切换肽”是指在肽合成步骤中通过在可变位置包含替代氨基酸而具有显著增加的HIV序列多样性覆盖率的肽。参见FrahmN等，J.Immunol.2007；179：6638-6650。
术语“血清不一致”是指一对夫妻中的两个个体呈现不一致的HIV血清型时，即当一对夫妻中的一个个体被感染(在其血液中具有抗体)而另一个个体未被感染时的情况。
术语“EBV”是指埃巴(Epstein-Barr)病毒，这是造成传染性单核细胞增多症的病毒。
本文使用的术语“试剂盒”是指包含包装了用于实施本发明方法所必需的不同试剂从而允许其运输和储存的产品。适于包装试剂盒组分的材料包括晶体、塑料(例如，聚乙烯、聚丙烯、聚碳酸酯)、瓶子、小瓶、纸或膜(envelope)。
术语“多种细胞因子的测定”或“多细胞因子检测”是指使用单一技术(例如，blow技术)同时检测数种细胞因子。
＊＊＊＊＊
本文提到的所有出版物均通过引用整体并入本文。现在已经一般性描述了本发明，通过参照以下的实施例，其将更被容易理解，所述实施例仅以举例说明的方式提供，而不旨在限制本发明，除非明确指出。
一般方法
1.研究组
将HIV血清反应阳性患者(包括控制者组和非控制者组)和高度暴露的持续血清反应阴性(HEPS)对象征募到单个中心(HospitalUniversitari Germans Trias i Pujol，Badalona，Spain)。HIV控制者定义为至少在最近3年中，在不存在抗逆转录病毒治疗的情况下病毒载量低于2,000拷贝/mL并且CD4+计数＞400细胞/mm3的对象。非控制者定义为血浆RNA＞50,000HIV RNA拷贝/mL并且CD4+计数＜300细胞/mm3的未治疗个体。进行充分显色的Western印记分析以确保非控制者组包含在HIV感染的急性阶段鉴定出的具有高病毒载量的对象。
2.PBMC提取
通过密度梯度离心(Leucosep管)从抗凝的新鲜全血中分离外周血单核细胞(PBMC)。
3.细胞培养和肽刺激
将新鲜分离的PBMC(500,000细胞/孔)在48-孔平板中在加10％胎牛血清(FBS)加抗生素的RPMI培养基中培养6小时用于细胞因子细胞内染色或培养5天用于细胞因子上清液检测。用每一种序列的终浓度为2mg/mL的p24切换肽刺激细胞并孵育(37℃、5％CO2)。使用抗CD3加抗CD28磁珠作为阳性对照，以及RPMI作为阴性对照。
4.流式细胞术
用切换肽、抗CD3/CD28磁珠或PBS1x刺激新鲜的PBMC(500,000个细胞每孔)并使用CD49d和CD8抗体(Becton-Dickinson Labware Inc.，Franklin Lakes，NJ，US)与GolgiStop(Becton-Dickinson Labware Inc.，Franklin Lakes，NJ，US)共刺激6小时。在这一段时间还添加抗CD107a。在6小时孵育后，将培养物在冰箱中保持过夜直到细胞因子细胞内染色。为了进行常规分析，通过流式细胞术评估透化的经固定细胞(InvitrogenCorp.，Carlsbad，CA，US)中CD3、CD4、CD8和Th1、Th2和Th17细胞因子的表达。以各种组合使用以下抗体来评估经肽刺激的T细胞的多种功能：CD3-PE、CD4-APC、CD8-V500、CD14-V450、CD19-V450、LiveDead、CD107a-PeCy5、IFN-c-FITC、IL-2-FITC、TNFa-FITC、MIP1b-FITC、IL4-PECy7、IL10-PECy7和IL17-PECy7(Becton-Dickinson Labware Inc.，Franklin Lakes，NJ，US)。在配置成检测8色参数的LSR II仪器(Becton-Dickinson Labware Inc.，FranklinLakes，NJ，US)上收集细胞并使用FACSDiva软件进行分析。在选通之后，对于每一种特定功能组合，用在经刺激的样品中检测的应答减去在阴性对照管中检测的背景应答。
5.IFN-γELISpot
如前所述，进行IFN-γELISpot测定。参见Harlow E，Lane D，“Antibodies：A Laboratory Manual”(Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY， US，1988)。简言之，将ELISpot板(Millipore Corp.，Bedford，MA，US)用抗人IFN-γmAb在4℃包被过夜。用100μL补充有1％FCS的PBS封闭所述板。期间，用0.2mg/mL的SL9和GL9的刺激孵育PBMC(100,000个细胞/100μL每孔)16小时。包括PHA(5μg/mL)作为阳性对照。通过用与生物素辍合的抗人IFN-γ在室温孵育1小时在分泌部位检测捕获的IFN-γ。在用PBS洗涤6次后，用与ALP辍合的链霉亲和素在室温孵育45分钟。在用PBS充分洗涤后，添加带有NBT的TRIS氯化物和底物。30分钟后用Tween终止反应。
阳性应答的阈值测定为每孔超过5个斑点(50SFC/106)并且应答超过“阴性孔的平均值加3倍标准差”和“三倍平均值”中的较高者。
6.患者
将HIV血清反应阳性对象(n＝17)(包括控制者(n＝10)和非控制者(7))、高度暴露的持续血清反应阴性(HESN)对象(MSM，与男人有性行为的男性，n＝8；异性血清不一致伴侣n＝3)和HIV未暴露个体(n＝4)招募到西班牙巴达洛纳的Hospital Universitari Germans Trias iPujol和巴塞罗那的BCN Checkpoint社区中心。HIV控制者定义为至少在最近3年在不存在抗逆转录病毒治疗的情况下，病毒载量低于2,000拷贝/mL并且CD4+计数＞400细胞/mm3的对象。非控制者定义为血浆RNA＞50,000HIV RNA拷贝/mL并且CD4+计数＜300细胞/mm3的未进行HAART治疗的个体，进行充分显色的Western印记以确保其不是在HIV感染的急性阶段鉴定出来的高病毒载量的对象(表I)。在Checkpoint(巴塞罗那的MSM社区中心)三个月的基础上，从与男人有性行为的男人(MSM)的高风险群中鉴定出HESN。研究经地方研究伦理委员会批准，并且向所有参与者都提供了书面知情同意书。
7.细胞培养
对于所有测定，使用静脉穿刺4小时内的新鲜分离的PBMC。为了流式细胞术和FlowCytomix研究，将500,000细胞/孔添加到48-孔平板中，在加10％FCS、加抗生素的RPMI培养基中6小时用于细胞因子细胞内染色(参见加强的流式细胞术部分)或5天用于细胞因子上清液检测(参见FlowCytomix部分)。用每一种序列的终浓度为14ug/ml的单独p24切换肽刺激细胞并在37℃、5％CO2下孵育，直到用于相应测定。使用抗CD3加抗CD28磁珠(Invitrogene)或PMA(12-豆蔻酸13-乙酸佛波醇酯)(10ng/ml)加离子霉素(Io)(1uM)作为阳性对照。作为用于病毒肽刺激的另外的阳性对照，可以以10ug/ml的终浓度使用分别用于CD8T细胞和CD4T细胞刺激的EBV MHC I类限制性肽库(EBV库1)和EBVMHC II类限制性肽库(EBV库4)。
8.FlowCytomix分析
在5天后收集的培养物上清液中，使用基于流式的方法根据制造商说明书检测13种细胞因子。人Th1/Th2/Th9/Th17/Th2213-plex KitFlowCytomix(eBioscience)是基于珠的分析检测系统，用于通过流式细胞术定量检测人IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17A、IL-22和TNFα。简而言之，用与不同的待检测细胞因子特异性反应的抗体包被具有不同尺寸和光谱地址(spectraladdresses)的荧光珠。使样品与用于每一种细胞因子的经包被珠的混合物在室温孵育2小时。添加生物素辍合的第二抗体并在室温孵育1小时，之后添加链亲和素-藻红蛋白(Streptavidin-Phycoerythrin)以基于珠尺寸及其特异的发射光谱来检测和定量不同的细胞因子。对于抗原特异性的应答，使用所有患者的每一种细胞因子的未经刺激培养物的中值水平(pg/ml)作为阳性应答的截止(cut off)。
9.加强的流式细胞术
加强的流式细胞术方法以之前描述的用于多功能研究的细胞内细胞因子方案(Lamoreaux，L.2006.Nat Protoc.1：1507-1516)为基础，具有少数改变。简言之，在GolgiStop和抗CD107a抗体(Beckton Dickinson)的存在下，用单独切换肽以及CD49d和CD28抗体(Becton Dickinson，Mountain View，CA)刺激新鲜的PBMC(500,000细胞每孔)6小时。在孵育6小时后，将培养物保持在4℃过夜直到细胞内细胞因子染色。在细胞洗涤后，添加用于生存力染色的紫色胺活性染料(Fixable Dead Cell Stain Kit，Invitrogene)，之后对细胞的T细胞标记(来自Becton Dickinson的CD3PE、CD4APC和CD8V500)染色并分别使用CD19-V450和CD14-V450(Becton Dickinson)排除B淋巴细胞和骨髓细胞。对于细胞内细胞因子染色，进行固定和透化步骤(来自Invitrogen的Fix和Perm试剂盒)，然后用与FITC辍合的针对Th1细胞因子(IFN-γ、IL-2、TNFα和MIP1β)之抗体和与Pe-Cy7辍合的针对Th2/17细胞因子(IL-4(eBioscience)、IL-10和IL-17(Biolegend))之抗体进行染色。在配置成检测8色参数的LSR II仪器(Becton Dickinson)上收集细胞并使用FACSDiva软件进行分析。在来自单峰的活着的CD14细胞和CD19细胞中，选通辅助T细胞(CD3+CD4+)和CTL(CD3+CD8+)以及测定细胞因子分泌模式(Th1样和/或Th2/17样)加脱粒能力(CD107a+)(补充性附图5)。在选通之后，对于每一种特定功能组合，用在经刺激样品中检测到的应答减去在阴性对照培养物中检测到的背景应答。将数种细胞因子包含到同一通道中加强了信号，但也意味着应用背景的非常受限的截止。如Roederer等(Roederer，M.2011.Cytometry A.doi：10.1002/cyto.a.21015)描述的，在减去来自背景数据的阈值之后可检测到的应答被认为是阳性信号。
10.IFN-γELISPOT
将新鲜分离的PBMC(100,000PBMC细胞/孔)添加到140ul的R1096-孔聚乙烯板(Millipore，Bedford，MA)中。根据制造商说明书以及之前描述(Frahm，N.2007.Jour of Immunol)使用IFN-γMabtech试剂盒。阳性应答的阈值定义为每孔至少5个斑点并且应答超过“阴性对照孔中斑点的平均值加阴性对照孔的3倍标准差”和“三倍的阴性对照孔的平均值”中的较高者。
11.统计学分析
使用Prism Version 4，GraphPad Prism进行统计学分析。在加强的流式细胞术测定的背景校正之后，按照之前描述的分析方法(Roederer，M.2011.Cytometry A.doi：10.1002/cyto.a.21015)对数值设置阈值。实施χ卡方检验以检测所检测到的阳性应答的质量之间的差异。为了特异性比较，如所指出的，应用非参数Mann-Whitney检验。在全部分析中，p值＜0.05被认为是统计学显著的。应用Mann-Whitney检验。应用χ卡方检验。在全部分析中，p值＜0.05被认为是统计学显著的。
实施例
实施例1
根据上述一般方法分析HIV血清反应阳性患者(n＝18，控制者和非控制者)和高度暴露的持续血清反应阴性对象(n＝8)。
IFN-γELISpot测定示出在幅度和量级方面HIV患者的更高应答。在控制者组患者和非控制者组患者之间未观察到统计学上的显著差异。另外，在HEPS组检测到较少应答。参见图1。
通过“Blow”研究CD8+和CD4+T细胞上的产生跨(spanning)p24之切换肽的另外的应答、Th1样应答(IFN-γ、TNF-α、MIP1-β、IL-2)或Th2样应答(IL-4、IL-10)和Th17(IL-17)应答的产生。简单地说，该分析以通过流式细胞术检测同一荧光通道中的加强的细胞因子为基础。Th1加强的“Blow”分析比ELISpot测定检测到显著更多的Th1样应答，在HEPS群中的阳性应答的检测中具有更高相关性。通常，“Blow”分析比IFNγELISpot测定检测到显著更多的应答。除了通过IFNγElispot测量到的IFNγCD8应答外，“Blow”分析还区分CD8和CD4T细胞群中针对切换肽的“Th1”和“Th2/17”样应答。在HEPS中增加的检测率尤其突出。参见图2。
在测量产生的全部CD4和CD8应答之后，可观察到尽管HIV感染患者主要产生CD8应答，而HEPS群体主要产生CD4T细胞应答。参见图3A。此外，对于CD4和CD8T细胞二者，HIV控制者、非控制者和HEPS对象的应答谱在Th1和Th2/IL-17模式以及其脱粒能力方面变化极大(CD4Th1：χ2＝12.59，p＝0.013；CD4Th2：χ2＝11.04，p＝0.026；CD8Th1：χ2＝33.16，p＝1.107e-06；CD8Th2：χ2＝15.90，p＝0.003)。参见图3B。显著地，与HIV患者相比，HEPS个体中的CD8T细胞应答经常(Th1的52％和Th2/IL17的63％)产生细胞因子但是不脱粒(CD107-)。但是，在相同组的该群体中观察到常见的Th2谱可能由于同一组中包含IL-17而有所偏离。
作为比较，通过13种细胞因子的FlowCytomix和ELISpot IFN-γ评估单独细胞因子的产量。事实上，随后的flow-cytomix去卷积表明与HIV+个体相比，HEPS对象中细胞因子(即，IL-17、IL-22、IL-9)的水平提高。参见图4A-D。
实施例2
重复与实施例1所示类似的实验，但使用PMA+Io或EBV-来源的抗原作为阳性对照(参见图6和7)，或不同的HIV来源的抗原，如p17。在HEPS中，使用多克隆刺激物PMA+Io产生比肽特异性刺激更高的阳性应答。但是，通过使用EBV肽的库，也可检测到阳性应答。此外，通过使用加强的流式细胞术方法，我们能够检测到HESN个体(血清不一致夫妻)中对于HIV肽库的应答类似于在用EBV肽库刺激后检测到的应答。最后，本发明允许测定CD4(MHC II类肽)和CD8(MHC I类肽)中的特异性肽应答和捕获HESN中至今未观察到的针对HIV的应答。

Claims (29)

1.一种用于测定对象中特异性针对病原体之T细胞应答的方法，其包括：i)使包含来自所述对象之T细胞的样品与包含来自所述病原体之抗原的组合物接触，以及ii)测定由所述样品中的所述T细胞产生的多种细胞因子的水平。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述包含抗原的组合物是抗原或抗原文库。
3.根据权利要求2所述的方法，其中来自所述病原体的所述抗原或所述抗原文库是来源于所述病原体之多肽的肽变体或肽变体文库。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述肽变体文库是切换肽。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述病原体是HIV或EBV。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述肽变体来源于Gag或Nef多蛋白。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述肽变体来源于p24或p17。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述多种细胞因子选自：表征Th1应答的细胞因子、表征Th2应答的细胞因子和二者皆有。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述表征Th1应答的细胞因子选自IFN-γ、TNF-α、MIP1-β、IL-2、IL-12和IL-1B。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述表征Th2应答的细胞因子选自IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中在CD4+细胞和/或CD8+细胞中测定所述表征Th1应答的细胞因子、所述表征Th2应答的细胞因子或二者皆有。
12.根据权利要求8至11中任一项所述的方法，其还包括测定表征Th9应答、Th17应答或Th22应答之细胞因子的水平。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法，其中通过加强的流式细胞术测定所述多种细胞因子的水平。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述含有T细胞的样品是PBMC制备物。
15.一种用于鉴定高度暴露的持续血清反应阴性患者的方法，其包括：i)用HIV或EBV肽组合物孵育含有所述患者之T细胞的样品，以及ii)测定选自IL-1b、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17和IL-22的一种或更多种细胞因子的水平，
其中一种或更多种所述细胞因子的表达水平相对于参考值升高表明所述患者是高度暴露的持续血清反应阴性患者。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述HIV肽组合物包含来源于Gag p24HIV蛋白或Gag p17HIV蛋白或Nef蛋白的肽。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述来源于Gag p24HIV蛋白或Gag p17HIV蛋白或Nef蛋白的肽是切换肽。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的方法，其中所述含有T细胞的样品是PBMC制备物。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的方法，其中各种细胞因子的参考值是含有来自HIV感染患者之T细胞的样品中所述细胞因子的表达水平。
20.根据权利要求15至19所述的方法，其中通过流式细胞术分析进行所述细胞因子水平的测定。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述流式细胞术分析是加强的流式细胞术。
22.一种试剂盒，其包含用于检测选自IL-1b、IL-5、IL-6、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-17和IL-22的一种或更多种细胞因子的试剂。
23.一种用于鉴别高度暴露的持续血清反应阴性患者的方法，其包括：i)用来源于HIV或EBV蛋白的肽组合物孵育所述患者的含有T细胞的样品，以及ii)测定Th1样应答、Th2样应答或Th17应答，其中所述细胞中Th1样应答、Th2样应答或Th17应答相对于参考值升高表明所述患者是高度暴露的持续血清反应阴性患者。
24.根据权利要求23所述的方法，其中通过测量选自IFN-γ、TNF-α、MIP1-β和IL-2的一种或更多种细胞因子的水平来测定Th1样应答；通过测量选自IL-4和IL-10的一种或更多种细胞因子的水平来测定Th2样应答；或者通过测量Th17(IL-17)的水平来测定Th17应答。
25.根据权利要求24所述的方法，其中通过加强的流式细胞术在CD4和CD8T淋巴细胞中测定所述细胞因子水平的测定。
26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述HIV蛋白是p24或p17或Nef。
27.根据权利要求23至26中任一项所述的方法，其中所述肽组合物是切换肽混合物。
28.根据权利要求23至27中任一项所述的方法，其中所述含有T细胞的样品是PBMC制备物。
29.根据权利要求23至28中任一项所述的方法，其中所述参考值是含有来自被感染患者之T细胞的样品中Th1样应答、Th2样应答或Th17应答的水平。
CN201380022862.8A 2012-03-23 2013-03-22 用于监测hiv特异性t细胞应答的方法 Pending CN104272108A (zh)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261615038P 2012-03-23 2012-03-23
EP12382109 2012-03-23
EP12382109.2 2012-03-23
US61/615,038 2012-03-23
PCT/EP2013/056110 WO2013139972A1 (en) 2012-03-23 2013-03-22 Method for monitoring hiv specific t cell responses

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104272108A true CN104272108A (zh) 2015-01-07

Family

ID=49221879

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201380022862.8A Pending CN104272108A (zh) 2012-03-23 2013-03-22 用于监测hiv特异性t细胞应答的方法

Country Status (9)

Country Link
US (1) US9709577B2 (zh)
EP (1) EP2828656B1 (zh)
JP (1) JP6272820B2 (zh)
CN (1) CN104272108A (zh)
CA (1) CA2868066C (zh)
HK (1) HK1205264A1 (zh)
IN (1) IN2014DN08394A (zh)
MX (1) MX2014011484A (zh)
WO (1) WO2013139972A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110308285A (zh) * 2019-07-12 2019-10-08 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 用于预测重度电离辐射损伤死亡的标志物组合

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101777256B1 (ko) 2016-07-07 2017-09-12 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) T 세포의 병원체 감염 세포 독성능 평가 방법
KR101777252B1 (ko) 2016-07-07 2017-09-12 대한민국(농림축산식품부 농림축산검역본부장) T 세포의 prrsv 증식 억제능 평가 방법
WO2023170189A1 (en) * 2022-03-09 2023-09-14 Fundacio Privada Institut De Recerca De La Sida-Caixa Boosted immune monitoring methods for assaying antigen-specific t cell responses

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1333873A (zh) * 1998-11-16 2002-01-30 德克萨斯州立大学董事会 Hiv－特异的t－细胞诱导
WO2009145853A1 (en) * 2008-04-16 2009-12-03 Virostatics Srl Novel assay for precursor t-cells having high proliferative capacity (phpc-assay)
CN102123733A (zh) * 2008-09-30 2011-07-13 库瑞瓦格有限责任公司 用于提供或增强哺乳动物中免疫刺激应答的包含复合(m)RNA和裸(m)RNA的组合物及其应用

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9624456D0 (en) * 1996-11-25 1997-01-15 Isis Innovation Assay method
AU2002952548A0 (en) * 2002-11-08 2002-11-21 Cellestis Limited Diagnostic assay
US7323346B2 (en) * 2003-08-14 2008-01-29 The General Hospital Corporation Screening for gestational disorders
EP1767937A1 (en) * 2005-09-27 2007-03-28 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) Method of diagnosis of tuberculosis related immune restoration syndrome (IRS)
JP5116756B2 (ja) * 2006-03-20 2013-01-09 セントビンセンツ ホスピタル シドニー リミテッド 抗原特異的又はマイトジェン活性化ｔ細胞の検出方法
WO2008127840A2 (en) * 2007-03-22 2008-10-23 University Of Iowa Research Foundation Flavivirus ns5a proteins for the treatment of hiv
US9265815B2 (en) * 2011-04-29 2016-02-23 Selecta Biosciences, Inc. Tolerogenic synthetic nanocarriers

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1333873A (zh) * 1998-11-16 2002-01-30 德克萨斯州立大学董事会 Hiv－特异的t－细胞诱导
WO2009145853A1 (en) * 2008-04-16 2009-12-03 Virostatics Srl Novel assay for precursor t-cells having high proliferative capacity (phpc-assay)
CN102123733A (zh) * 2008-09-30 2011-07-13 库瑞瓦格有限责任公司 用于提供或增强哺乳动物中免疫刺激应答的包含复合(m)RNA和裸(m)RNA的组合物及其应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MICHAEL R. BETTS ET AL.: "HIV nonprogressors preferentially maintain highly functional HIV-specific CD8+ T cells", 《BLOOD》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110308285A (zh) * 2019-07-12 2019-10-08 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院 用于预测重度电离辐射损伤死亡的标志物组合

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013139972A1 (en) 2013-09-26
CA2868066A1 (en) 2013-09-26
EP2828656A1 (en) 2015-01-28
CA2868066C (en) 2019-11-12
US9709577B2 (en) 2017-07-18
EP2828656B1 (en) 2019-09-18
JP2015513100A (ja) 2015-04-30
HK1205264A1 (zh) 2015-12-11
JP6272820B2 (ja) 2018-01-31
IN2014DN08394A (zh) 2015-05-08
MX2014011484A (es) 2015-09-23
US20150057175A1 (en) 2015-02-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Obeng-Adjei et al. Circulating Th1-cell-type Tfh cells that exhibit impaired B cell help are preferentially activated during acute malaria in children
Chew et al. TIGIT marks exhausted T cells, correlates with disease progression, and serves as a target for immune restoration in HIV and SIV infection
Ma et al. Monogenic mutations differentially affect the quantity and quality of T follicular helper cells in patients with human primary immunodeficiencies
Appleby et al. Sources of heterogeneity in human monocyte subsets
EP1996936B1 (en) A method for detecting antigen-specific or mitogen-activated t cells
Wullner et al. Considerations for optimization and validation of an in vitro PBMC derived T cell assay for immunogenicity prediction of biotherapeutics
Nemeth et al. Specific cytokine patterns of pulmonary tuberculosis in Central Africa
Jayaratne et al. Regulatory T‐cells in acute dengue viral infection
Martirosyan et al. In vivo identification and characterization of CD4+ cytotoxic T cells induced by virulent Brucella abortus infection
Steiner et al. SARS-CoV-2 T cell response in severe and fatal COVID-19 in primary antibody deficiency patients without specific humoral immunity
Chruewkamlow et al. Immune alterations in patients with anti-interferon-γ autoantibodies
Lu et al. Low double-negative CD3+ CD4− CD8− T cells are associated with incomplete restoration of CD4+ T cells and higher immune activation in HIV-1 immunological non-responders
CN104272108A (zh) 用于监测hiv特异性t细胞应答的方法
El Costa et al. Effector memory CD8 T cell response elicits Hepatitis E Virus genotype 3 pathogenesis in the elderly
Tomaszewski et al. Overexpression of PD-1 on peripheral blood lymphocytes in patients with idiopathic pulmonary arterial hypertension and its association with high viral loads of Epstein-Barr virus and poor clinical parameters
Comeau et al. Cytomegalovirus-driven adaption of natural killer cells in NKG2Cnull human immunodeficiency virus-infected individuals
Natale et al. Immune exhaustion in chronic Chagas disease: Pro-inflammatory and immunomodulatory action of IL-27 in vitro
Jimenez-Leon et al. Toll-like receptor agonists enhance HIV-specific T cell response mediated by plasmacytoid dendritic cells in diverse HIV-1 disease progression phenotypes
Zhang et al. IL-15 induced bystander activation of CD8+ T cells may mediate endothelium injury through NKG2D in Hantaan virus infection
Sandberg et al. Longitudinal characterization of humoral and cellular immunity in hospitalized COVID-19 patients reveal immune persistence up to 9 months after infection
Ivanova et al. mRNA COVID-19 vaccine elicits potent adaptive immune response without the acute inflammation of SARS-CoV-2 infection
Huang et al. Development of a capture ELISA to determine kinetics of soluble CD25 following in vitro and in vivo stimulation of duck peripheral blood monocytes
Waickman et al. Virologic, clinical, and immunological characteristics of a dengue virus 3 human challenge model
Kaaijk et al. Corrigendum: Children and adults with mild COVID-19: Dynamics of the memory T cell response up to 10 months
Sharma et al. Human germline biallelic complete NFAT1 deficiency causes the triad of progressive joint contractures, osteochondromas, and susceptibility to B cell malignancy

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
TA01 Transfer of patent application right
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20180302

Address after: Badalona, Spain

Applicant after: Fundacio Privada Institut de Recerca de La Sida-Caixa

Address before: Barcelona

Applicant before: Esteve Labor Dr.

Applicant before: Fundacio Privada Institut de Recerca de La Sida-Caixa

Applicant before: Institucio Catalana De Recerca I Estudis Avancats

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20150107