ES2172773T5 - Procedimiento de dosificado de linfocitos t especificos para un peptido. - Google Patents

Abstract

Un método de ensayo donde se enumeran las células T efectoras péptido-específicas, método que comprende: el suministro de un fluido con células T frescas, que no han estado en cultivo in vitro en contacto con una superficie que lleva un anticuerpo inmovilizado al interferon-gamma citoquina, la presentación a las células T de un péptido activador de células T; la incubación del fluido para producir la liberación de dicha citoquina y la detección del interferon-gamma unido al anticuerpo inmovilizado; en el cual la incubación se continua durante un tiempo par permitir la liberación de la citoquina solamente por células T que habían sido presensibilizadas al péptido in vivo y que son capaces de ejercer una función efectora inmediata sin la necesidad de llevar a cabo una división/diferenciación mediante cultivo in vitro en presencia del péptido; y aplicando dicho método al diagnosis o control de infección con un patógeno intracelular, tal como Hepatitis B, Hepatitis C, tuberculosis, malaria, VIH o gripe.

Description

Procedimiento de dosificado de linfocitos T específicos para un péptido.

Esta invención tiene que ver con un método de ensayo para determinar células T péptido-específicas activadas donde se enumeran las células T efectoras péptido-específicas. Es un desarrollo del conocido ensayo ELISPOT, que está revisado en Current Protocols in Immunology, Unidad 6.19, páginas 6.19.1-8.

El ensayo de inmunoplacas en filtro, denominado de otro modo ensayo de inmunomanchas con enzima unido (ELISPOT), fue desarrollado inicialmente para detectar y cuantificar células B secretoras de anticuerpos individuales. En el momento en el que se desarrolló, la técnica proporcionaba una alternativa rápida y versátil a los ensayos convencionales de células formadoras de placas. Modificaciones recientes han mejorado la sensibilidad del ensayo ELISPOT de tal manera que pueden detectarse células que producen tan solo 100 moléculas de proteína específica por segundo. Estos ensayos aprovechan la concentración relativamente elevada de una proteína dada (tal como una citoquina) en el entorno que circunda inmediatamente a la célula secretora de la proteína. Estos productos celulares son capturados y detectados utilizando anticuerpos de alta afinidad.

Herr y col. (1996), Journal of Immunological Methods 191, 131-42, describen la utilización del ensayo ELISPOT para la detección y cuantificación de linfocitos T CD8^{+} derivados de la sangre que secretan TNF-\alpha en respuesta a antígenos del melanoma y a péptidos víricos antigénicos que se unen al HLA-A 2.1.

El ensayo ELISPOT utiliza dos anticuerpos específicos de una citoquina de alta afinidad dirigidos contra epítopos diferentes en la misma molécula de citoquina: dos anticuerpos monoclonales o una combinación de un anticuerpo monoclonal y un antisuero polivalente. El ELISPOT genera manchas basadas en una reacción colorimétrica que detecta la citoquina secretada por una célula individual. La mancha representa una "huella" de la célula productora de la citoquina original. Las manchas son permanentes y pueden ser cuantificadas visualmente, microscópicamente o electrónicamente.

El ensayo ELISPOT implica cinco etapas específicas: (1) revestimiento de una placa de microvaloración reforzada con nitrocelulosa con un anticuerpo específico para una citoquina purificado; (2) bloqueo de la placa para prevenir la absorción no específica de cualquier otra proteína; (3) incubación de las células secretoras de la citoquina a varias diluciones diferentes; (4) adición de un segundo anticuerpo anti-citoquina marcado y (5) detección del complejo anticuerpo-citoquina.

En esta invención la técnica ha sido utilizada con el fin de desarrollar un ensayo para determinar células T péptido-específicas que han sido presensibilizadas in vivo a un péptido particular.

Por tanto, la presente invención proporciona un método de ensayo donde se enumeran las células T efectoras péptido-específicas, método que comprende el suministro de un fluido con células T frescas, que no han estado en cultivo in vitro en contacto con una superficie que lleva un anticuerpo inmovilizado al interferon-\gamma citoquina, la presentación a las células T de un péptido activador de células T;

la incubación del fluido para producir la liberación de dicha citoquina y la detección del interferon-\gamma unido al anticuerpo inmovilizado;

en el cual la incubación se continua durante un tiempo par permitir la liberación de la citoquina solamente por células T que habían sido presensibilizadas al péptido in vivo y que son capaces de ejercer una función efectora inmediata sin la necesidad de llevar a cabo una división/diferenciación mediante cultivo in vitro en presencia del péptido;

y aplicando dicho método al diagnosis o control de infección con un patógeno intracelular, tal como Hepatitis B, Hepatitis C, tuberculosis, malaria, VIH o gripe.

Preferiblemente, en el método el fluido está en contacto con una superficie que lleva un primer anticuerpo hacia la citoquina inmovilizado, y la citoquina es detectada en la forma que está unida al primer anticuerpo inmovilizado.

Las células son preferiblemente células mononucleares de sangre periférica (PMBC). Pueden ser tomadas adecuadamente de un paciente que se sabe que padece, o que ha padecido, una infección por un patógeno intracelular, por ejemplo un virus. Es una característica de la invención el que se utilizan células frescas, ya que las células cultivadas in vitro pueden desarrollar características alteradas, reduciendo así el valor diagnóstico del ensayo. El fin del ensayo es identificar o cuantificar células T péptido-específicas, por ejemplo células CD8^{+} o CD4^{+} que han sido activadas o presensibilizadas in vivo a un péptido particular. Éstas son células T no reestimuladas, esto es células capaces de ejercer una función efectora inmediata sin necesidad de llevar a cabo una división/diferenciación mediante cultivo in vitro. Cuando el péptido en cuestión es presentado a tales células, las células secretan varias citoquinas, de las cuales puede ser seleccionada cualquiera para los fines de este ensayo. La citoquina seleccionada es interferón-\gamma (IFN-\gamma).

La citoquina secretada puede ser detectada mediante cualquiera de una variedad de métodos conocidos en la literatura. Preferiblemente, el método de ensayo implica el suministro de una superficie que lleve un primer anticuerpo inmovilizado hacia el IFN-\gamma o hacia otra citoquina. Un fluido que contenga las PBMC u otras células frescas es puesto en contacto con ese anticuerpo inmovilizado. El 30% aproximadamente de las PBMC son células CD8^{+}. En las PBMC de un paciente que se haya recuperado de una infección previa por el virus de la influenza, 1 célula CD8^{+} aproximadamente de cada 10^{5}-10^{6} es una célula con memoria que ha sido presensibilizada a un epítopo específico asociado con el virus de la influenza.

El método de la invención implica la presentación de un péptido a las células T efectoras. El péptido puede ser un epítopo conocido para una infección vírica bien caracterizada; o puede ser un epítopo candidato asociado posiblemente con una infección vírica peor caracterizada. La mezcla de fluidos es incubada bajo condiciones que estimulan cualquier célula T péptido-específica que pueda haber sido presensibilizada a ese péptido derivado de un virus particular in vivo. El péptido necesita tener una longitud de, por ejemplo, 7-15 y, particularmente, 8-12 u 8-10 residuos de aminoácidos, que sea reconocida por las células CD8^{+}. Se supone que la generalidad de las células CD8^{+} (y otras PBMC) presentan el péptido a la pequeña minoría de células CD8^{+} que pueden haber sido presensibilizadas al péptido. Si tales células T péptido-específicas activadas o presensibilizadas están presentes en el fluido de ensayo, responden secretando IFN-\gamma u otra citoquina que se une posteriormente al anticuerpo inmovilizado.

Se prefiere que el péptido sea añadido a las células frescas en forma no combinada. Aunque es posible añadir células cultivadas que hayan sido sometidas a un pulso con el péptido, esto no es necesario cuando se utilizan epítopos del péptido definidos. Los péptidos deben ser añadidos en una cantidad suficiente para generar una señal observable; un rango de concentración preferido en el fluido es de 0,01 hasta 100 \muM, particularmente 0,5-5,0
\muM.

La incubación debe ser continuada durante un tiempo suficiente para permitir que las células CD8^{+} que hayan sido presensibilizadas in vivo al péptido particular elegido secreten el IFN-\gamma u otra citoquina. La incubación no debe continuar durante un tiempo tan largo como para que las células CD8^{+} quiescentes tengan tiempo de diferenciarse y resulten activadas por el péptido y comiencen a secretar citoquinas. Esto sugiere un tiempo de incubación de 4-24 horas, más particularmente 6-16 horas. Es una ventaja de la invención el que la parte de incubación del ensayo pueda ser realizada en un único día de trabajo o durante la noche, y sin la utilización de las condiciones estériles requeridas para el cultivo celular in vitro.

Durante la incubación, cualquier IFN-\gamma u otra citoquina secretada por las células CD8^{+} se une al primer anticuerpo inmovilizado sobre la superficie. Después de la incubación, la superficie puede ser lavada para eliminar el material no unido. Para la detección se utiliza preferiblemente un segundo anticuerpo contra la citoquina marcado. Cuando éste es aplicado a la superficie se une a cualquier citoquina presente. El segundo anticuerpo debe reconocer preferiblemente un epítopo diferente al del primer anticuerpo. Uno o los dos del primer y segundo anticuerpo debe ser preferiblemente monoclonal. La marca puede ser cualquiera de las que se usan convencionalmente en el campo, incluyendo radioisótopos, enzimas para generar color o quimioluminiscencia, grupos fluorescentes o grupos para la detección mediante espectrometría de masas o índice de refracción (por ejemplo mediante resonancia de plasmones de superficie). Es conveniente, pero no necesario, utilizar un anticuerpo marcado; puede marcarse y utilizarse cualquier reactivo que se una específicamente a la citoquina. La detección y quizá la cuantificación de la marca se realiza por medios bien conocidos en el campo y apropiados para la naturaleza de la marca utilizada.

El ensayo puede ser llevado a cabo de manera conveniente en una placa de múltiples pocillos. Cada pocillo de la placa tiene una superficie que lleva un primer anticuerpo unido. Se añade a cada pocillo un fluido que contenga un número apropiado, por ejemplo 10^{3}-10^{6}, de células. Se añaden a los pocillos individuales de la placa diferentes péptidos y/o controles. Las células que secretan una citoquina durante la incubación se ponen de manifiesto como manchas (células formadoras de manchas o SFCs) y puede determinarse fácilmente el número o la densidad de éstas en cada pocillo.

La técnica de ensayo tiene varias ventajas sobre las técnicas conocidas anteriores:

a) Es más rápida y más cómoda; la duración del ensayo es de sólo 6 horas y por tanto no requiere condiciones o técnicas estériles. Los métodos actuales para el recuento de células T efectoras precursoras requieren el cultivo in vitro con el antígeno específico y con células alimentadoras autólogas en un ensayo de dilución limitante (LDA). El método es laborioso y requiere mucho tiempo.

b) Requiere un equipamiento técnico mínimo y es adecuada para condiciones de campo en los trópicos y en los países en desarrollo, así como para laboratorios de diagnóstico de rutina. El LDA, en contraste, requiere muchos linfocitos de sangre periférica, una fuente de radiación gamma para inactivar las células alimentadoras y condiciones estériles, ya que las células necesitan ser cultivadas durante 1-2 semanas.

c) Es segura y no radioactiva. En el LDA, sin embargo, las células cultivadas son analizadas en un ensayo de células T citotóxicas (CTL) utilizando el isótopo radioactivo cromo-51.

d) Es un ensayo ex vivo inmediato. Como tal mide las células efectoras en su estado natural sin la introducción de sesgos desconocidos que tienen lugar cuando las células proliferan en un cultivo in vitro con el antígeno y citoquinas exógenas.

e) El ensayo es realizado en solamente 6 horas; como tal mide directamente las células efectoras péptido-específicas, sin requerir que estas células proliferen in vitro. La corta duración del ensayo elimina también la posibilidad de que las células puedan resultar activadas in vitro; mide por tanto la función efectora que está presente in vivo. Los LDAs requieren que las células proliferen muchas veces; sin embargo muchas células efectoras no proliferan en estas condiciones y por tanto el resultado del LDA es a menudo una subestimación del número verdadero de efectores circulantes.

Se espera que la técnica de ensayo tenga valor de varias formas diferentes:

i) Para la cuantificación de efectores péptido-específicos en individuos infectados por VIH directamente de sangre periférica.

ii) Para la monitorización del progreso de, o de la resistencia a, una enfermedad infecciosa crónica, por ejemplo en respuesta a un fármaco o a una vacuna terapéutica. Se espera que esto sea particularmente útil para VIH, Hepatitis B y Hepatitis C.

iii) Para la monitorización del grado al que un paciente, que ha padecido una enfermedad particular tal como influenza, pueda ser resistente a futuras infecciones.

Los ejemplos siguientes ilustran la invención.

Ejemplo 1

Memoria Inmunológica para el Virus de la Influenza: Recuento y Caracterización Ex vivo de Células T Activadas CD8^{+} Péptido-Específicas Circulantes en el Estado de Memoria

Los sujetos fueron personal sano del laboratorio o voluntarios sanos adultos cuyo HLA fue tipificado serológicamente mediante linfotoxicidad mediada por el complemento. Se utilizaron 5 epítopos de la influenza restringidos por el MHC de Clase I y están enumerados en la Tabla 1.

Se revistieron placas de 96 pocillos reforzadas con PVDF con 100 \mul de 15 \mug/ml del mAb anti-IFN-\gamma 1-DIK durante una noche a 4ºC o a temperatura ambiente durante 3 horas. Las placas fueron lavadas y bloqueadas luego con R10 (medio de cultivo de tejidos estándar que contenía un 10% de suero de ternera fetal) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las PBMC de los sujetos fueron separadas mediante centrifugación de sangre completa heparinizada, resuspendidas en R10 y añadidas en un volumen final de 100 \mul de R10/pocillo a las placas de microvaloración de 96 pocillos reforzadas con PVDF. El número inicial de células era normalmente de 5 x 10^{5} por pocillo, y todos los ensayos se realizaron en pocillos duplicados. Los péptidos fueron añadidos normalmente a una concentración final de 1-2 \muM, excepto en un experimento de valoración de un péptido en el que la concentración del péptido M1 58-66 fue diluida hasta 20 nM. Los ensayos fueron realizados normalmente en 12-14 horas, pero ciertos ensayos fueron realizados en 6 horas para confirmar que las células antígeno-específicas eran capaces de realizar una función efectora inmediata. La incubación se llevó a cabo a 37ºC en una atmósfera que contenía un 5% de CO_{2}. La incubación fue parada vaciando con una sacudida el contenido de los pocillos y lavando. Posteriormente se añadieron a los pocillos 100 \mul de 1 \mug/ml de un segundo mAb anti-IFN-\gamma biotinilado, 7-B6-1-biotina (Mabtech, Stockholm, Suecia), y las placas se incubaron durante 3 horas. Se añadieron a los pocillos 100 \mul de una dilución 1:1000 del conjugado estreptavidina-fosfatasa alcalina, y las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 2 horas más. Los pocillos fueron lavados de nuevo y se añadieron a los mismos 100 \mul de sustrato cromogénico para la fosfatasa alcalina diluido 1:25 con agua desionizada. Después de una incubación adicional de 30-60 minutos a temperatura ambiente, los pocillos fueron lavados para finalizar la reacción colorimétrica. Las manchas fueron contadas bajo un aumento de 20x con un estereomicroscopio de disección.

Resultados

Utilizando 5 epítopos bien definidos de la influenza restringidos por el HLA de Clase I, se añadió péptido libre a una concentración final de 2 \muM directamente a PBMC recién aisladas en el ensayo ELISPOT. Para casi todos los individuos analizados de esta forma, utilizando epítopos restringidos por alelos del HLA de Clase I presentes en el individuo, se detectaron células T efectoras péptido-específicas que secretaban IFN-\gamma. La Tabla 1 resume las respuestas a estos cinco epítopos. La mayoría de estos ensayos se realizaron durante 12-14 horas, y la Figura 1 es un gráfico de barras que muestra la respuesta a diferentes concentraciones de PBMC por pocillo. Sin embargo, para excluir la posibilidad de que células T con memoria pudieran proliferar o pudieran resultar activadas in vitro durante el curso de un ensayo de 14 horas, se realizaron también ensayos de 6 horas. Se detectaron SFCs péptido-específicas según se muestra cuantitativamente en la Figura 2 para el mismo epítopo M1 58-66. Para un control negativo, se añadieron directamente a las PBMC frescas péptidos irrelevantes procedentes de agentes infecciosos con los que no estaba infectado el donante.

La mayoría de los experimentos se realizaron a concentraciones finales del péptido de 2 \muM. Sin embargo, había repuestas todavía fácilmente detectables cuando las concentraciones peptídicas fueron reducidas hasta 0,02 \muM, según se muestra en la Figura 3 para el epítopo de la matriz de la influenza restringido por el HLA-A2.01.

Una reducción de células T CD8^{+} en PBMC frescas con esferas magnéticas revestidas con un anticuerpo anti-CD8, eliminó completamente la respuesta péptido-específica, confirmando que los efectores que daban lugar a las manchas inducidas por epítopos conocidos restringidos por la Clase I eran linfocitos T CD8^{+}. A la inversa, la eliminación de células CD4^{+} no disminuyó el número de SFCs de IFN-\gamma, indicando que no se requerían productos CD4^{+} ni citoquinas para la adquisición o despliegue de la función efectora por las células T CD8^{+} péptido-específicas recién aisladas. Las respuestas efectoras inmediatas fueron detectadas solamente para los epítopos de la influenza restringidos por los alelos del HLA de Clase I presentes en el donante particular que estaba siendo analizado; la adición de epítopos de la influenza restringidos por moléculas del HLA de Clase I no presentes en el donante no tuvieron nunca como resultado SFCs (datos no mostrados).

Aunque la expansión de CTL efectores CD8^{+} péptido-específicos durante la influenza aguda hace que las células sean detectables por medio del conocido ensayo de citotoxicidad de liberación de ^{51}Cr realizado con PBMC no cultivadas frescas, después de la recuperación de la enfermedad aguda, tales células no son ya detectables. Parece que esto no es debido a que estén ausentes, sino más bien a que están presentes con una frecuencia demasiado baja para ser detectable. Después de la recuperación de la enfermedad aguda, tales células permanecen detectables por la técnica del ensayo ELISPOT de la presente invención.

El recuento de las manchas bajo aumento y la comparación de este número con el número inicial de PBMC frescas, proporciona una medida de la frecuencia relativa de efectores CD8^{+} péptido-específicos activados circulantes en sangre periférica. La frecuencia de efectores CD8^{+} que secretan IFN-\gamma para el epítopo M1 58-66 restringido por el HLA-A2.1 en el donante WB, fue medida por el ensayo de la invención (1/15000) y mediante el análisis de dilución limitante convencional (LDA) (1/103000).

TABLA 1 Epítopos de la influenza restringidos por la Clase I reconocidos por células T efectoras CD8^{+} recién aisladas

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El experimento anterior está descrito con más detalle en J. Exp. Med., 186, 6, 15 de Septiembre de 1997, 859-865.

Ejemplo 2

Aplicación para Cuantificar Efectores Péptido-Específicos en Individuos Infectados con VIH Directamente de Sangre Periférica

Linfocitos de sangre periférica (PBL) crioconservados que habían sido recién aislados de la sangre periférica del paciente 868 fueron plaqueados a 50.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos revestida con PVDF, que había sido revestida previamente con un anticuerpo monoclonal anti-interferón-gamma. Se prepararon pocillos por duplicado para cada antígeno. Se utilizaron dos tipos de pocillos control por duplicado: sin péptido y con un epítopo del gag del VIH irrelevante restringido a través de HLA-B8, un alelo del HLA no presente en el paciente 868.

Se añadieron directamente a las células un rango de péptidos y sus variantes respectivas que existían de forma natural (identificados previamente en el paciente 868) a una concentración final de 2 \muM. La placa fue incubada durante 12 horas a 37ºC en un 5% de CO_{2} y revelada según se describió previamente (ver el Ejemplo 1). Las manchas resultantes fueron contadas con un microscopio de disección a 40x. Estos resultados están presentados en forma de diagrama en la Figura 4.

Ejemplo 3

Identificación de Epítopos de CD4^{+} y CD8^{+} en Antígenos Secretados de M. tuberculosis

Una evidencia creciente apunta hacia un papel protector para los linfocitos T citotóxicos CD8^{+} en la infección por Mycobacterium tuberculosis, pero hasta ahora no se han identificado en el hombre células T CD8^{+} específicas de M. tuberculosis. Utilizando una aproximación inmunogenética inversa, los inventores han sintetizado una serie de péptidos candidatos restringidos por el HLA de Clase I a partir de dos antígenos inmunodominantes de M. tuberculosis, ESAT-6 y el antígeno 85. Los inventores han sometido a selección a 75 sujetos que representaban un amplio espectro clínico de infección por M. tuberculosis. Se estimularon in vitro linfocitos de sangre periférica con los péptidos y posteriormente se analizaron para determinar actividad citolíta en un ensayo de liberación de ^{51}Cr y para determinar la liberación de interferón-\gamma por células individuales en un ensayo ELISPOT. Los inventores han identificado varios epítopos octámeros y nonámeros de ESAT-6 y del antígeno 85 en pacientes y en contactos expuestos. Ciertos epítopos son reconocidos por linfocitos CD8^{+} de manera restringida por el MHC de Clase I; otros son reconocidos preferencialmente por células T CD4^{+}.

Las secuencias de ESAT-6 y del antígeno 85A, B y C fueron sometidas a barrido con motivos peptídicos alelo-específicos para los tipos A2, B7, B8, B35, B52 y B53 del HLA de Clase I, todos los cuales estaban presentes en la población del estudio.

Para ESAT-6, se identificaron secuencias congruentes con los motivos peptídicos para HLA-A2, -B8 y -B52; se sintetizaron estos péptidos y se muestran en la Tabla 2. No estaban presentes secuencias congruentes con HLA-B7, -B35 y -B53 en ESAT-6 y, por tanto, no se sintetizaron péptidos para estos alelos del HLA de Clase I. Los péptidos fueron clasificados en grupos que fueron utilizados para la reestimulación in vitro de PBMC de los donantes. Los péptidos que se encontró que eran epítopos del CD8^{+} están mostrados en negrita. De manera similar, se sintetizaron 42 péptidos basados en las secuencias de los antígenos 85A y 85C. No se identificaron epítopos de CD8^{+} entre ellos y no se muestran los péptidos.

TABLA 2

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Ensayo ELISPOT para determinar IFN-\gamma

Placas de 96 pocillos reforzadas con PVDF prerrevestidas con el mAb anti-IFN-\gamma 1-DIK a 15 \mug/ml, fueron lavadas con RPMI y bloqueadas con R10 durante 1 hora a temperatura ambiente. En un experimento, se utilizaron 500.000 PBMC recién aisladas no cultivadas, por pocillo. En otro experimento, líneas celulares de corta duración (STCL) o linfocitos T citotóxicos CD8^{+} (CTL) o clones fueron lavados 2x en RPMI, resuspendidos en R10 y dispersados en pocillos duplicados a un número inicial de células/pocillo conocido. Las respuestas eran consideradas significativas si estaba presente un mínimo de 10 SFCs por pocillo y adicionalmente si este número era al menos el doble que en los pocillos control. Se añadió el péptido directamente al sobrenadante a una concentración final de 2 \mul (péptido libre). Las placas fueron incubadas durante 12 horas a 37ºC, 5% de CO_{2}. Después de lavar 6x con solución salina tamponada con fosfato con un 0,05% de Tween-20 para extraer las células, las placas fueron incubadas durante 3 horas con el segundo mAb anti-IFN-\gamma biotinilado, 7-B6-1-biotina, a 1 \mug/ml. Un lavado adicional igual que anteriormente fue seguido por incubación con una dilución 1:1000 del conjugado estreptavidina-fosfatasa alcalina durante 2 horas. Después de otro lavado, se añadió a los pocillos un sustrato cromogénico de la fosfatasa alcalina y 30 minutos después se lavaron las placas con agua corriente. Después de secar, se contaron las células formadoras de manchas (SFC) bajo un aumento de 20x.

Las STCL fueron generadas por el método descrito en Nature 346 (1990) 183-7. Los clones de células T CD8^{+} fueron generados por métodos estándar.

Identificación de células T efectoras específicas de ESAT-6 directamente de sangre periférica

Se identificaron dos epítopos de CD8^{+} en ESAT-6. Las células T del donante NPH54, que tenía linfoadenitis mediastinal tuberculosa, reconocían péptidos correspondientes a estos dos epítopos. PBMC no cultivadas aisladas en el momento del diagnóstico de NPH54, que tiene HLA-B52 y HLA-A2.01, secretaban IFN-\gamma en respuesta a un grupo de péptidos derivados de ESAT-6 para estos alelos de Clase I en un ensayo ELISPOT ex vivo. El número medio de células formadoras de manchas (SFCs) de IFN-\gamma contadas a partir de 5 x 10^{5} PBMC en pocillos duplicados era de 19 para los péptidos de ESAT-6 en comparación con 2 en los pocillos control sin péptido. Un ensayo posterior analizó PBMC recién aisladas contra cada uno de los péptidos individuales en los grupos respondedores; se detectaron SFCs de IFN-\gamma en respuesta a los péptidos ES12 y ES13, cuyas secuencias son congruentes con los motivos peptídicos de HLA-B52 y HLA-A2.01, respectivamente. La frecuencia de SFCs de IFN-\gamma específicas de ES12 y ES13 es del mismo orden de magnitud que la de SFCs para el epítopo M1 58-66 de la matriz de la influenza restringido por HLA-A2.01. PBMC no reestimuladas procedentes de un segundo donante, NPH97, con osteomielitis tuberculosa, reconocieron también el péptido ES12. Este paciente tenía también HLA-B52 y -A2.01 y la magnitud de la respuesta específica de ES12 fue similar a la de la respuesta al epítopo de la matriz de la influenza restringido por HLA-A2. La liberación de IFN-\gamma en células individuales por células T recién aisladas en estos ensayos ex vivo cortos de 12 horas, sin emplear más estímulos que el péptido cognado, indica que es muy probable que estas células sean células T efectoras activadas circulantes.

Claims (10)

1. Un método de ensayo donde se enumeran las células T efectoras péptido-específicas, método que comprende: el suministro de un fluido con células T frescas, que no han estado en cultivo in vitro en contacto con una superficie que lleva un anticuerpo inmovilizado al interferon-\gamma citoquina, la presentación a las células T de un péptido activador de células T;

la incubación del fluido para producir la liberación de dicha citoquina y la detección del interferon-\gamma unido al anticuerpo inmovilizado;

en el cual la incubación se continua durante un tiempo par permitir la liberación de la citoquina solamente por células T que habían sido presensibilizadas al péptido in vivo y que son capaces de ejercer una función efectora inmediata sin la necesidad de llevar a cabo una división/diferenciación mediante cultivo in vitro en presencia del péptido;

y aplicando dicho método al diagnosis o control de infección con un patógeno intracelular, tal como Hepatitis B, Hepatitis C, tuberculosis, malaria, VIH o gripe.

2. Un método como el reivindicado en la reivindicación 1, en el que se presenta a las células T un péptido derivado de ESAT-6 de M. tuberculosis.

3. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que las células T son células mononucleares de sangre periférica.

4. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que se añade al fluido que contiene células T un péptido de 7-12 residuos de aminoácidos de longitud, que está reconocido por las células CD8^{+}.

5. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la mezcla de fluidos resultante es incubada bajo condiciones no estériles.

6. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el péptido es un epítopo conocido.

7. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la incubación es continuada durante un tiempo de 4 a 24 horas.

8. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las células T son obtenidas de un paciente que se sabe que padece, o ha padecido, una infección con un patógeno intracelular.

9. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 8, realizado para monitorizar el progreso de una infección por VIH.

10. Un método como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, realizado para monitorizar el efecto de una vacuna.