SK284582B6 - Farmaceutický prostriedok obsahujúci aspoň jeden imunomodulačne pôsobiaci peptid, proteín alebo proteínový fragment - Google Patents

Abstract

Farmaceutický prostriedok obsahuje aspoň jeden imunomodulačne pôsobiaci peptid, prípadne proteín (proteínový fragment) spolu s jedným adjuvans, pričom peptid je odvodený z patogénu alebo z nádorového antigénu. Adjuvans má schopnosť zvyšovať väzbu peptidu na bunky liečeného jedinca, prípadne vstup peptidu do buniek, a vyvolať posilnenie imunomodulačného pôsobenia peptidu. Výhodnými adjuvans sú bázické polyaminokyseliny, ako je polyarginín alebo polylyzín, ktoré sú prípadne konjugované s bunkovým ligandom, napríklad s uhľohydrátom alebo s transferínom. Farmaceutický prostriedok slúži predovšetkým na použitie ako vakcína, napríklad ako nádorová vakcína.ŕ

Description

Oblasť techniky

Vynález sa vzťahuje na farmaceutický prostriedok z oblasti imunomodulácie.

Vynález je ďalším krokom vo vývoji terapeutickej vakcíny na základe nádorových buniek, ktorý spočíva v podstate na nasledovných predpokladoch: existujú kvalitatívne alebo kvantitatívne rozdiely medzi nádorovými bunkami a normálnymi bunkami; imunitný systém je v podstate schopný tieto rozdiely rozpoznať; imunitný systém možno k tomu aktívnou špecifickou imunizáciou s vakcínami stimulovať, na základe týchto rozdielov nádorové bunky rozpoznať a vyvolať ich elimináciu.

Doterajší stav techniky

Aby sa vyvolala protinádorová odpoveď, musia byť splnené aspoň dva predpoklady: po prvé, nádorové bunky musia exprimovať antigény, ktoré sa na normálnych bunkách buď nevyskytujú alebo sú prítomné v obmedzenom rozsahu, aby sa umožnilo kvalitatívne rozlíšenie medzi normálnym a nádorovým tkanivom prostredníctvom imunitného systému. Po druhé, imunitný systém musí byť zodpovedajúcim spôsobom aktivovaný, aby na tieto antigény reagoval. Podstatnou prekážkou pri imunoterapii nádorov je ich nízka imunogenicita, predovšetkým u človeka.

Nedávno boli objavené antigény asociované s nádormi a nádorovo špecifické antigény, ktoré predstavujú takéto neo-epitopy, a mali by byť preto možnými cieľmi útoku zo strany imunitného systému. To, že sa imunitnému systému napriek tomu nedarí eliminovať nádory, ktoré tieto neo-epitopy exprimujú, nie je zapríčinené chýbaním neo-epitopov, ale tým, že imunitná odpoveď proti týmto neo-epitopom nie je dostatočná.

Na imunoterapiu rakoviny na bunkovom základe boli vyvinuté dve všeobecné stratégie: Na jednej strane adoptívna imunoterapia, ktorá slúži na in vitro namnoženie nádorovo reaktívnych T lymfocytov a ich opätovné zavedenie do pacienta; na strane druhej aktívna imunoterapia, ktorá používa nádorové bunky s očakávaním, že proti nádorovým antigénom sa tým vyvolajú buď nové alebo silnejšie imunitné odpovede, ktoré povedú k systémovej nádorovej odpovedi. Protinádorové vakcíny na základe aktívnej imunoterapie boli pripravené najrozličnejším spôsobom; príkladom nech sú ožiarené nádorové bunky, ktoré boli zmiešané s imunostimulačnými adjuvans, ako je Corynebacterium parvum alebo Bacillus Calmette Guerin (BCG), aby sa vyvolali imunitné reakcie proti nádorovým antigénom (Oettgen aOld, 1991).

V posledných rokoch sa na aktívnu protinádorovú imunoterapiu používali predovšetkým geneticky modifikované nádorové bunky. Prehľad o týchto rozličných postupoch, pri ktorých boli nádorové bunky xenogenizované so zreteľom na posilnenú imunogenicitu zavedením rôznych génov, prezentovali Zatloukal a spol. (1993). Jedna z doteraz použitých stratégií využíva nádorové bunky, ktoré sú geneticky modifikované tak, aby produkovali cytokíny.

Identifikácia a izolácia nádorových antigénov a antigénov asociovaných s nádormi, pripadne z nich odvodených peptidov (ako boli opísané napríklad autormi Wôlfel a spol., 1994a, 1994b; Carrel a spol., 1993; Lehmann a spol., 1989; Tibbets a spol., 1993; alebo v publikovaných medzinárodných prihláškach WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23 031, WO 95/00159), bola predpokladom na ďalšiu stratégiu, pri ktorých sa používajú nádorové antigény ako imunogény pre protinádorové vakcíny, a to tak vo forme proteínov, ako aj vo forme peptidov. V prácach autorov Boon a spol., 1992; Boon a spol., 1994; Boon a spol., 1995; van Peel a spol., 1995; Van der Eynde, 1995 sa zistilo, že peptidy odvodené z nádorových antigénov malignych melanómov sú prítomné v kontexte MHC-I. S protinádorovou vakcínou vo forme nádorových antigénov samotných sa však doteraz nedosiahla dostatočná imunogenicita, ktorá by vyvolala bunkovú imunitnú odpoveď potrebnú na eliminovanie nádorových buniek nesúcich nádorový antigén (Marchand a spol., 1995). Na dosiahnutie toho, aby antigén prezentujúce bunky („antigén presenting cells“, „APCs“) prezentovali na svojom povrchu definované peptidové antigény, bolo navrhnuté, aby peptidy boli „pulzované“, výsledkom čoho však bolo neúčinné spojenie buniek s peptidmi (Tykocinski a spol., 1996); ukázalo sa však aj to, že paralelná aplikácia adjuvans posilnila imunitnú odpoveď len podmienečne (Oettgen a Old, 1991).

Tretia stratégia aktívnej imunoterapie na zvýšenie účinnosti protinádorových vakcín je založená na xenogenizovaných autológnych nádorových bunkách. Základom tejto koncepcie je predpoklad, že imunitný systém reaguje na nádorové bunky, ktoré exprimujú cudzí proteín, a že počas tejto reakcie sa vyvolá aj imunitná odpoveď proti tým nádorovým antigénom, ktoré sú prezentované protinádorovými bunkami vakcíny.

Ústrednú úlohu pri regulácii špecifickej imunitnej reakcie hrá trojmolekulový komplex pozostávajúci z týchto komponentov: receptor antigénov T buniek, molekula MHC („major histocompatibility complex“) a ich ligand, ktorý je peptidovým fragmentom odvodeným z proteínu.

Molekuly MHC (prípadne im zodpovedajúce ľudské molekuly - HLA) sú peptidové receptory, ktoré pri prísnej špecificite umožňujú väzbu množstva rôznych ligandov. Predpokladom na to sú alelicky špecifické peptidické motívy, ktoré vyhovujú nasledovným kritériám na špecificitu: Peptidy majú - v závislosti od MHC haplotypu - definovanú dĺžku, v prípade MHC-I haplotypu majú spravidla dĺžku osem až desať aminokyselinových zvyškov. V typickom prípade dve z aminokyselinových polôh predstavujú takzvané „kotvy“, ktoré môžu byť obsadené blízko príbuznými bočnými reťazcami len cez jedinú aminokyselinu alebo aminokyselinový zvyšok. Presná poloha kotvových aminokyselín v peptide a požiadavky na ich vlastnosti sa menia s MHC haplotypmi. C-terminálový koniec peptidových ligandov je často alifatický alebo nasadený zvyšok. Takéto MHC-I motívy peptidových ligandov sú okrem iných doteraz známe pre haplotypy H-2K^d, K^b, K^k, K^kral, D^b, HLA-A*0201, A*0205 a B *2705.

V rámci obratu proteínov vnútri bunky sa regulárne, transformované a xenogénne génové produkty, ako sú napríklad vírusové proteíny alebo nádorové antigény, rozkladajú na malé peptidy; niektoré z nich predstavujú potenciálne ligandy pre molekuly MHC. Tým je daný predpoklad ich prezentácie cez molekuly MHC, a v dôsledku tohto spustenie imunitnej odpovede, pričom sa ešte nevie presne, ako sa peptidy ako MHC ligandy v bunke produkujú. Cudzie alebo xenogenizované proteíny a ich fragmenty môžu byť rozpoznané, naviazané a odstránené aj prostredníctvom imunoglobulínov, ktoré predstavujú humorálnu imunitnú odpoveď. Platí to aj pre všetky nádorové antigény: na príklade nádormi asociovaných antigénov MUČÍ, CEA a HER2/neu bolo dokázané, že imunoglobulíny, ktoré pre tieto proteíny vykazujú špecificitu, môžu rozpoznávať a usmrcovať bunky nesúce proteíny. Aby sa vyvolala nádorovo špecifická humorálna imunitná odpoveď, vyskúšali sa preto rozličné formy MUC1 a CEA ako imunogénov (napríklad v rekombinovaných pox-vektoroch; Bronte a spol., J. Immunol. 154:5282, 1995) na zvieracích modeloch a v klinických predbežných pokusoch.

V rámci predkladaného vynálezu sa ďalej uvažovalo v súvislosti s vývojom bunkovej protinádorovej vakcíny: kým nemalígne, normálne bunky tela imunitný systém toleruje, na normálnu bunku, ak napríklad v dôsledku vírusovej infekcie syntetizuje proteíny, ktoré sú telu cudzie, telo reaguje imunitnou odpoveďou. Dôvod je v tom, že molekuly MHC prezentujú cudzie peptidy, ktoré pochádzajú od telu cudzích proteínov. V dôsledku toho imunitný systém registruje, že s touto bunkou sa stalo niečo nežiaduce, cudzie. APC bunky (patria medzi ne makrofágy, dendritické bunky, Langerhansove bunky, B bunky, ako aj možno nedávno objavené bifcnotypické bunky, ktoré majú vlastnosti tak B buniek, ako aj makrofágov; Tykocinski a spol., 1996) sa aktivujú, vygeneruje sa nová, špecifická imunita a bunka sa eliminuje.

Nádorové bunky síce obsahujú príslušné nádorovo špecifické nádorové antigény, samy sú však nedostačujúcimi vakcínami, pretože v dôsledku nízkej imunogenicity ich imunitný systém ignoruje. Ak sa nádorová bunka spojí nie s cudzím proteínom, ale s cudzím peptidom, potom spolu s cudzími peptidmi sa aj bunke vlastné nádorové bunky rozpoznávajú ako cudzie. Xenogenizáciou pomocou peptidu sa dá dosiahnuť, že cudzími peptidmi vyvolaná bunková imunitná odpoveď sa nasmeruje proti nádorovým antigénom.

Dôvodom nízkej imunogenicity nádorových buniek nemôže byť len kvalitatívnym, ale aj kvantitatívnym problémom. Pre peptid odvodený z nádorového antigénu to môže znamenať, že sa síce prezentuje molekulami MHC, ale v koncentrácii, ktorá je príliš malá na to, aby vyvolala bunkovú, nádorovo špecifickú imunitnú odpoveď. Zvýšenie počtu nádorovo špecifických peptidov na nádorovej bunke by malo tým tiež spôsobiť xenogenizáciu nádorovej bunky, ktorá vedie k vyvolaniu bunkovej imunitnej odpovede. Bolo navrhnuté, aby sa nádorový antigén, prípadne z neho odvodený peptid, prezentoval na povrchu bunky tak, aby bol transfekovaný pomocou DNA kódujúcou daný proteín pripadne peptid, ako to bolo opísané v medzinárodných prihláškach WO 92/20356, WO 94/05304, WO 94/23031 a WO 95/00159.

V nemeckej patentovej prihláške P 195 43 649.0 bola zverejnená bunková vakcína, ktorá obsahuje nádorové bunky ako aktívne zložky, ktoré sú spojené s jedným alebo s viacerými peptidmi tak, aby nádorové bunky v kontexte s peptidmi boli rozpoznávané imunitným systémom pacienta ako cudzie a aby vyvolali bunkovú imunitnú odpoveď. Podstatným znakom peptidov je to, že sú ligandmi pre MHC haplotyp pacienta. Peptidy sa preto rozpoznávajú imunitným systémom ako cudzie, pretože môžu byť na jednej strane „cudzími peptidmi“ alebo „xenopeptidmi“, to znamená, že sa líšia od peptidov, ktoré sú odvodené z proteinov exprimovaných nádorovými bunkami pacienta. Ďalšia kategória peptidov je odvodená z nádorových antigénov, ktoré exprimujú bunky pacienta. Tieto spôsobujú zvýšenie imunogenicity, a to tým, že na povrchu nádorových buniek vakcíny sú prítomné v takej koncentrácii, ktorá je vyššia, ako je koncentrácia toho istého peptidu na nádorových bunkách pacienta.

Vytýčeným cieľom predkladaného vynálezu bola úloha pripraviť novú imunomodulačne pôsobiaci farmaceutický prostriedok, osobitne vakcínu.

Podstata vynálezu

V ďalšom rozvinutí koncepcie bunkovej vakcíny, ktorá bola uverejnená v nemeckej patentovej prihláške P 195 43 649.0, bol v rámci predkladaného vynálezu vyvinutý farmaceutický prostriedok, ktorý obsahuje imunomodulačne pôsobiace peptidy nie v kontexte s bunkami, ale spolu s adjuvans, aby sa vyvolala bunková a/alebo humorálna, výhodne systémová imunitná odpoveď proti patogénu, alebo aby sa vyvolala pripadne posilnila protinádorová odpoveď, alebo aby sa vyvolala tolerancia proti autoimúnne pôsobiacim proteínom.

Prekvapujúco sa zistilo, že určité adjuvans, napríklad polykatióny, o ktorých bolo prvýkrát už roku 1965 dokázané, že môžu spôsobiť zvýšenie transportu proteínov v bunkách (Ryser a spol., 1965; Ryser a spol., 1978; Shen a spol., 1981), ktoré môžu zvýšiť imunogenicitu peptidov.

Vynález sa týka farmaceutického prostriedku obsahujúceho jeden alebo viacero imunomodulačne pôsobiacich peptidov, proteínov alebo proteínových fragmentov spolu s jedným adjuvans. Adjuvans vo farmaceutickom prostriedku má schopnosť zvýšiť väzbu peptidu prípadne proteínu alebo proteínového fragmentu na bunky liečeného jedinca, pripadne zvýšiť vstup do buniek a spôsobiť zosilnenie imunomodulačného pôsobenia peptidu prípadne proteínu alebo proteínového fragmentu.

V ďalšom budú vo všeobecnosti, kvôli jednoduchosti, zástupcovia uvedených imunomodulačne pôsobiacich peptidov, proteínov alebo proteínových fragmentov označované ako „peptidy“. Výraz „peptid“ znamená, ak sa výslovne nevzťahuje na ligand, aj väčšie proteínové fragmenty alebo proteíny, z ktorých je peptid odvodený, pripadne predstavuje produkt bunkového metabolizmu.

Pod pojmom „imunomodulačné pôsobenie“ sa rozumie na jednej strane vyvolanie alebo posilnenie bunkovej a/alebo humorálnej, výhodne systémovej imunitnej reakcie. V tomto uskutočnení vynálezu pôsobí farmaceutický prostriedok podľa vynálezu ako vakcína.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sú peptidy ligandmi aspoň pre jednu molekulu MHC, ktorú liečený jedinec exprimuje.

Ľudské molekuly MHC sú v ďalšom označované v súlade s medzinárodnými zvyklosťami ako „HLA“ („human leucocyte antigén“).

Pod pojmom „bunková imunitná odpoveď“ sa rozumie predovšetkým cytotoxická imunita T buniek, ktorá ako dôsledok generovania cytotoxických CD8 pozitívnych T buniek a CD4 pozitívnych pomocných T buniek spôsobuje elimináciu nádorových buniek alebo buniek napadnutých patogénom.

Pod pojmom „humorálna imunitná odpoveď“ sa rozumie produkcia imunoglobulínov, ktoré selektívne rozpoznávajú nádorové bunky alebo štruktúry odvodené z patogénu, a následne spolu s inými systémami, ako je napríklad komplement, ADCC (antibody dependent cytotoxicity) alebo fagocytóza, spôsobujú elimináciu týchto nádorových buniek prípadne patogénu alebo ním napadnutých buniek.

Vo vakcíne obsiahnutý peptid je odvodený z antigénu, alebo v prípade proteínov predstavuje antigén, proti ktorému má byť vyvolaná bunková a/alebo humorálna imunitná odpoveď. Tým sa dosiahne, aby T bunky, prípadne iné cytotoxické efektorové bunky, ktoré pôvodcu ochorenia prípadne nádorové bunky, ktoré daný antigén majú, rozpoznali, a/alebo sa vygenerovali protilátky.

Na imunizovanie proti pôvodcom ochorení, ako sú baktérie, vírusy, parazity, sa použijú proteíny alebo peptidy, ktoré predstavujú proteín daného alebo daných pôvod cov, prípadne sú z neho alebo z nich odvodené. Vhodné sú pritom predovšetkým proteíny, ktoré zostávajú ušetrené pred vysokou všeobecnou mutačnou frekvenciou týchto pôvodcov. Publikované príklady sú HPV 16/17 (ľudský vírus papilómov; Feltkamp a spol., 1995), jadrový antigén vírusu hepatitídy B (Viticllo a spol., 1995), Plasmodium Bergheii (Widmann a spol., 1992), nukleoproteín vírusu chrípky, vírus hepatitídy C.

V inom uskutočnení vynálezu je proteín, vzhľadom na vyvolanie protinádorovej odpovede, nádorový proteín pripadne peptid odvodený z nádorového antigénu, pričom sa farmaceutický prostriedok použije ako protinádorová vakcína. V tomto prípade je peptid, pri terapeutickom použití vakcíny, odvodený z nádorového antigénu, ktorý exprimujú nádorové bunky pacienta. Tieto nádorové antigény sú napríklad také, ktoré pacient exprimuje v príliš nízkej koncentrácii, takže nádorové bunky nie sú rozpoznané ako cudzie.

Nádorové antigény pacienta možno počas stanovenia diagnózy a terapeutického plánu určiť štandardnými spôsobmi: nádorové antigény možno jednoducho stanoviť imunohistochemicky pomocou protilátok. Ak sú nádorovými antigénmi enzýmy, napríklad tyrozinázy, možno ich stanoviť enzýmovými testami. Pri nádorových antigénoch so známou sekvenciou možno použiť spôsob RT-PCR (Boon, T. a spol., 1994; Coulie, P. G. a spol., 1994; Weynants, P. a spol., 1994). Ďalšími spôsobmi stanovenia sú testy na základe CTL so špecificitou pre stanovovaný nádorový antigén. Takéto testy opísali okrem iných aj Hérin a spol., 1987; Coulie a spol., 1993; Cox a spol., 1994; Rivoltini a spol., 1995; Kawakami a spol., 1995; ako aj v patentovej prihláške WO 94/14459; z týchto citácií sa dajú tiež získať rôzne nádorové antigény prípadne z nich odvodené peptidové epitopy, ktoré sa hodia v rámci predkladaného vynálezu; príklady vhodných nádorových antigénov sú v ďalšom uvedené v nedávno publikovaných prehľadných článkoch od autorov Roscnberg, 1996; a Henderson a Finn, 1996. Ohľadne použiteľných nádorových antigénov nepodlieha predkladaný vynález nijakému obmedzeniu.

Protinádorovú vakcínu, ktorá obsahuje nádorový antigén, prípadne z nádorového antigénu odvodené peptidy, možno podať nielen terapeuticky, ale aj profylaktický. Pri profylaktickom použití sa účelne aplikuje zmes peptidov, ktoré sú odvodené zo zástupcov často sa vyskytujúcich nádorových antigénov. Pri terapeutickom použití protinádorovej vakcíny podľa vynálezu sa použije jeden alebo viacero peptidov, od ktorých sa očakáva, aby boli obsiahnuté v nádorovom antigéne (antigénoch) pacienta.

Protinádorová vakcína podľa vynálezu má oproti bunkovej vakcíne na báze autológnych nádorových buniek tú výhodu, že je terapeuticky použiteľná aj v prípade pacientov v pomerne ranom štádiu (štádium I a II) ochorenia, u ktorých nie je k dispozícii dostatočné množstvo nádorových buniek na prípravu bunkovej vakcíny.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sa peptid, vzhľadom na vyvolanie bunkovej imunitnej odpovede, zladí s MHC-I alebo MHC-II podtypom vakcinovaného jedinca; peptid má tiež sekvenciu, prípadne obsahuje sekvenciu, ktorá uskutočňuje väzbu na molekulu MHC.

V ďalšom uskutočnení vynálezu farmaceutický prostriedok obsahuje, vo forme použitia ako protinádorová vakcína, okrem imunostimulačne pôsobiaceho polypeptidu osobitne aj cytokin. Vo výhodnom uskutočnení vynálezu sa ako cytokin použije interleukín 2 (IL-2) alebo GM-CSF, napríklad v dávke približne od 1000 jednotiek; ďalšími príkladmi cytokínov sú IL-4, IL-12, lFN-a, IFN-β, IFN-γ,

IFN-ω, TNF-α, ako aj ich kombinácie, napríklad IL-2 + IFN-γ, IL-2 + IL-4, IL-2 + TNF-α alebo TNF-α + IFN-γ.

V ďalšom uskutočnení vynálezu slúži farmaceutický prostriedok na to, aby indukoval toleranciu proti proteínom pripadne ich fragmentom, ktoré vyvolávajú autoimúnne indukované ochorenia, teda na terapiu autoimúnnych ochorení. Peptidy použité v tomto uskutočnení vynálezu sú odvodené z proteínov, ktoré spôsobujú autoimúnne ochorenia.

Na rozdiel od použitia vynálezu ako protinádorovej vakcíny alebo ako vakcíny proti patogénom, pri ktorom peptidy sú s úsekom pôvodného proteinu (nádorového antigénu prípadne proteinu patogénu) podstatným spôsobom zhodné tak, že peptid sa rozpoznáva ako „pôvodný antigén“, pri použití vynálezu na liečenie autoimúnnych ochorení sa použijú okrem iných peptidy, ktoré majú v sekvencií aminokyselín pôvodného proteinu kritické rozdiely. Tieto peptidy sa síce na základe svojich kotvových polôh viažu k molekule MHC, majú však vo svojej sekvencií mutácie, ktoré spôsobujú, že tieto peptidy fungujú ako antagonisty, ktoré aktivované, špecifické T bunky opäť odpoja (Kersh a Alien, 1996).

Ako peptidové antagonisty sa hodia tak „prirodzené“ antagonisty, ktoré boli nájdené vo vírusoch (Bertoletti a spol., 1994), ako aj antagonisty, ktoré sa našli systematickým výskumom, napríklad prezeraním bánk peptidov. Príkladom peptidových antagonistov sú peptidy, ktoré môžu vypnúť T bunky, ktoré sú špecifické pre bázický proteín myelínu (myelin basic proteín), ich účinnosť bola vyskúšaná vo zvieracích pokusoch (Brocke a spol., 1996).

Peptid, ktorý má vyvolať bunkovú imunitnú odpoveď, sa musí dať viazať k molekule MHC. Aby sa u pacienta vyvolala imunitná odpoveď, musí liečený jedinec vo svojom repertoári mať zodpovedajúcu HLA molekulu. Určenie HLA podtypu pacienta tým predstavuje, so zreteľom na vyvolanie bunkovej imunitnej odpovede, jeden z významných predpokladov účinného použitia peptidu u tohto pacienta.

HLA podtyp pacienta možno stanoviť štandardnými spôsobmi, ako je napríklad mikrotest na lymfotoxicitu (Practical Immunology, 1989). Tento test je založený na princípe, že lymfocyty izolované z krvi pacienta sa zmiešali najprv s antisérom alebo s monoklonálnou protilátkou proti určitej molekule MHC v prítomnosti králičieho komplementu (C). Pozitívne bunky sa lyžujú a prijímajú indikátorové farbivo, kým nepoškodené bunky zostanú neofarbené.

Na stanovanie HLA-I alebo HLA-II haplotypu pacienta sa môže použiť aj spôsob RT-PCR (reverse transeriptase polymerase chain reaction) (Curr. Prot. Mol. Biol., kapitoly 2 a 15). K tomu sa pacientovi odoberie krv a izoluje s z nej RNA. Táto RNA prejde najprv reverznou transkripciou, čím vznikne cDNA pacienta. cDNA slúži ako matrica pre polymerázovú reťazovú reakciu s pármi primérov, ktoré špecificky uskutočnia amplifikáciu DNA fragmentu reprezentujúceho určitý HLA haplotyp. Ak sa po elektroforéze v agaróze objaví DNA prúžok, v tom prípade pacient exprimuje zodpovedajúcu HLA molekulu. Ak sa tento prúžok neobjaví, je pacient pre túto molekulu negatívny.

Definícia peptidu použitého podľa vynálezu prostredníctvom HLA molekuly určuje tento peptid vzhľadom na jeho kotvové aminokyseliny a jeho dĺžku; definované kotvové polohy a dĺžka zabezpečujú, aby peptid zapadol do peptidovej väzobnej vidlice danej HLA molekuly pacienta. Následkom tohto sa imunitný systém stimuluje a vyvolá sa bunková imunitná reakcia, ktorá sa v prípade použitia peptidu odvodeného z jedného z nádorových antigénov nasmeruje proti nádorovým bunkám pacienta.

Peptidy, ktoré sú vhodné na použitie v rámci predkladaného vynálezu, sú k dispozícii vo veľkej rozmanitosti. Ich sekvencia môže byť odvodená z prirodzene sa vyskytujúcich imunogénnych proteínov pripadne z ich bunkových produktov rozkladu, napríklad z vírusových alebo bakteriálnych peptidov, z nádorových antigénov, alebo môžu byť antagonistmi k peptidom, ktoré sú odvodené z proteínov indukujúcich autoimúnne ochorenia.

Vhodné peptidy sa môžu zvoliť napríklad na základe peptidových sekvencií známych z literatúry.

Vzhľadom na vyvolanie bunkovej imunitnej odpovede možno peptidy definovať napríklad na základe peptidov odvodených z imunogénnych proteínov rôzneho pôvodu opísaných pre rôzne HLA motívy (Rammensee a spol., 1993; Rammensee a spol., 1995; Falk a spol., 1991), ktoré zapadajú do väzbovej vidlice molekuly daného HLA podtypu.

Pre peptidy, ktoré majú dielčiu sekvenciu proteínu s imunogénnym účinkom, možno na základe už známej alebo prípadne ešte iba určovanej polypeptidovej sekvencie cestou stanovovania rozdielov, pri zohľadnení HLA špecifických požiadaviek, stanoviť, ktoré peptidy sú vhodnými kandidátmi. Príklady vhodných peptidov sú uvedené napríklad v prácach autorov Rammensee a spol., 1993; Falk a spol., 1991; a Rammnesee, 1995; ako aj v patentovej prihláške WO 91/09869 (HIV peptidy); peptidy odvodené z nádorových antigénov boli opísané medzi inými v zverejnených medzinárodných patentových prihláškach WO 95/00159 a WO 94/05304. Výsledky uvedené v týchto citáciách a články citované v súvislosti s peptidmi sa napríklad zohľadňujú. K výhodným kandidátom sa počítajú peptidy, ktorých imunogenicita už bola dokázaná, teda peptidy, ktoré sú odvodené zo známych imunogénov, napríklad z vírusových alebo bakteriálnych proteínov.

Namiesto použitia pôvodných peptidov, ktoré zapadajú do väzobnej vidlice MHC-I alebo MHC-II molekuly, teda peptidov, ktoré sú odvodené z prirodzených proteínov bezozmeny, možno podľa minimálnych požiadaviek udaných na základe pôvodnej sekvencie peptidu ohľadne kotvových polôh a dĺžky urobiť variácie, pokiaľ sa týmito variáciami efektívna imunogenicita peptidu, ktorá sa skladá z väzobnej afinity k molekule MHC a zo schopnosti stimulovať receptory T buniek, nielenže nezredukuje, ale sa dokonca výhodne posilní. V tomto prípade sa teda použijú umclé peptidy podľa vynálezu, ktoré sú navrhnuté v súlade s požiadavkami na schopnosť viazať sa k molekule MHC. Tak napríklad, vychádzajúc z H2-K^d ligandu Leu Phe Glu Ala íle Glu Gly Phe íle (LFEAIEGFI), aminokyseliny, ktoré nepredstavujú kotvové aminokyseliny, môžu byť zmenené, aby sa peptid so sekvenciou Phe Phe íle Gly Ala Leu Glu Glu íle (FFIGALEEI) zachoval; okrem toho kotvová aminokyselina íle v polohe 9 môže byť nahradená aminokyselinou Leu. Určenie epitopov MHC-I alebo MHC-Π ligandov, prípadne ich variácií, sa môže uskutočniť napríklad podľa princípu, ktorý opísali Rammensee a spol. (1995). Dĺžka peptidu, ak sa zhoduje s MHC-I molekulou, zodpovedá výhodne minimálnej sekvencií 8 až 10 aminokyselín s potrebnými kotvovými aminokyselinami. Väzbový motív MHC-II, ktorý sa rozprestiera nad novými aminokyselinami, má v kotvových polohách vyšší stupeň degenerácie. Na základe rôntgenovej analýzy štruktúry MHC-II molekúl boli nedávno vyvinuté spôsoby, ktoré umožňujú presnú analýzu väzobných motívov MHC-II, a vychádzajúc z nich, aj variácií v sekvencií peptidov (Rammensee a spol., 1995, a tam citovaná pôvodná literatúra).

V danom prípade možno peptid predĺžiť aj na Ca/alebo N-konci, pokiaľ toto predĺženie neobmedzí väzbo vú schopnosť k molekule MHC, prípadne predĺžený peptid sa dá celuláme spracovať na minimálnu sekvenciu.

V jednom uskutočnení vynálezu je peptid negatívne nabitý. V tomto uskutočnení vynálezu môže byť peptid predĺžený o negatívne nabité aminokyseliny, alebo možno negatívne nabité aminokyseliny zabudovať do peptidu, výhodne v polohách, ktoré pre rozpoznávanie špecifickými CTL alebo ako kotvové aminokyseliny nie sú potrebné, aby sa dosiahla elektrostatická väzba peptidu na polykatiónový adjuvans, ako je napríklad polylyzín.

V ďalšom uskutočnení vynálezu sa antigén nepoužije vo forme peptidu, ale ako proteín alebo proteínový fragment, prípadne ako zmes proteínov alebo proteínových fragmentov. V rámci predkladaného vynálezu sú vhodné väčšie proteínové fragmenty, pripadne celé proteíny, pri ktorých je zaručené, že po aplikácii APC buniek pacienta budú spracované na peptidy, ktoré sa k molekule MHC hodia.

Proteín predstavuje antigén, prípadne nádorový antigén, z ktorého sú odvodené fragmenty získané po spracovaní. V tomto uskutočnení slúži adjuvans na to, aby umožnil alebo posilnil spojenie („transloading“) buniek, osobitne APC bunky, ako sú dendritické bunky alebo makrofágy, s nádorovým antigénom, prípadne s fragmentmi. Takto prijaté proteíny prípadne proteínové fragmenty bunky spracujú a môžu byť potom v MHC kontexte prezentované efektorovými bunkami, čím sa vyvolá, prípadne posilní imunitná odpoveď (Braciale a Braciale, 1991; Kovacsovics Bankowski a Rock, 1995; York a Rock, 1996).

Uskutočnenie vynálezu, v ktorom proteíny prípadne väčšie proteínové fragmenty sa použijú ako antigény, má tú výhodu, že je tu menšia závislosť od HLA typu pacienta, pretože proteín sa spracúva do viacerých fragmentov a tým je daná väčšia variabilita ohľadne „vhodnej formy“ peptidov.

V prípade podania proteínov alebo proteínových fragmentov možno identitu spracovaných koncových produktov dokázať prostredníctvom chemickej analýzy (rozklad podľa Edmana alebo hmotnostná spektrometria spracovaných fragmentov; porovnaj s prehľadným článkom autorov Rammensee a spol., 1995, ako aj s tam citovanou pôvodnou literatúrou) alebo biologickými analýzami (schopnosť APC buniek stimulovať T bunky, ktoré sú pre spracované fragmenty špecifické).

Výber kandidátov na peptidy, ktoré sú vhodné na vyvolanie bunkovej imunitnej odpovede, sa uskutočňuje v podstate vo viacerých krokoch: vo všeobecnosti sa kandidáti, najlepšie v sériových pokusoch, najprv otestujú v teste na peptidickú väzbu, aby sa zistila ich väzobná schopnosť k molekule MHC.

Jedna z vhodných vyšetrovacích spôsobov spočíva na schopnosti peptidov, že môžu stabilizovať prázdne molekuly MHC, ako to opísali napríklad autori Stuber a spol., 1994, a Mclntyre a spol., 1996. Pri tomto spôsobe sa peptid nanesie na bunky, ktoré sú schopné exprimovať danú molekulu MHC, ale kvôli genetickému defektu neviažu nijaké endogénne peptidy v MHC kontexte. Vhodné bunkové línie tohto typu sú RMA-S (myš) a T2 (človek), prípadne ich transfekované varianty. Dajú sa potom dokázať iba molekuly MHC stabilizované daným peptidom, výhodne prostredníctvom FACS analýzy založenej na prietokovej cytometrii (Flow Cytometry, 1989; FACS Vantage™ User’s Guide, 1994; CELL Quest™ User’s Guide, 1994). Stabilné molekuly MHC sa stanovujú pomocou vhodnej anti-MHC protilátky, a pomocou druhej (napríklad polyklonálnej), fluorescenčným farbivom (napríklad fluoresceín izotiokyanátom, FITC) značenej protilátky. V prietokovej cytometrii

SK 284582 Β6 sa potom jednotlivé bunky excitujú laserom s určitou vlnovou dĺžkou; emitovaná fluorescencia sa potom meria. Táto fluorescencia je závislá od množstva peptidu viazaného na bunku.

Ďalším spôsobom na stanovenie viazaného množstva peptidu je Scatchardova analýza, ako to opísali Sette a spol. (1994). Použije sa na to peptid, ktorý je napríklad značený jódom ¹²⁵I, a inkubuje sa cez noc s izolovanými alebo rekombinovane pripravenými molekulami MHC pri 4 °C s rôznymi definovanými koncentráciami peptidu. Na stanovenie nešpecifického vzájomného pôsobenia peptidu sa k niektorým próbam pridá nadbytok neznačeného peptidu, ktorý zastaví nešpecifickú interakciu značeného peptidu. Následne sa odstráni nešpecifický viazaný peptid, napríklad gélovou chromatografiou. Množstvo viazaného peptidu sa potom meria v scintilačnom počítači na základe emitovanej rádioaktivity. Vyhodnotenie takto získaných údajov sa uskutoční štandardnými spôsobmi.

Prehľad spôsobov na charakterizovanie vzájomného pôsobenia MHC/peptid, analýzy MHC ligandov a testov na väzbu peptidov, ktoré možno v rámci predkladaného vynálezu použiť, prezentovali Rammensee a spol., 1995.

V ďalšom kroku sa kandidáti na peptidy s dobrými väzbovými kvalitami otestujú na imunogenicitu.

Vyvolanie bunkovej imunitnej odpovede možno potvrdiť dokázaním peptidovo špecifických CTL, napríklad spôsobom opísaným v Current Protocols in Immunology, kapitola 3, alebo ktorý opísali Blomberg a spol., 1993. Ďalší dôkaz prítomnosti bunkovej imunitnej odpovede je daný vtedy, keď v neprítomnosti T buniek v pokusnom zvierati (čo sa dosiahne tým, že sa zviera ovplyvní protilátkami, ktoré ničia CD-4 alebo CD-8 bunky) sa nevyvolá nijaká imunitná odpoveď (Current Protocols in Immunology, kapitola 3).

Bunkovú imunitnú odpoveď možno ukázať aj dôkazom reakcie hypersenzitivity oneskoreného typu (delayed type hypersensitivity, DTH) v imunizovaných zvieratách. S týmto cieľom sa môžu peptidy injikovať do chodidiel myší, a na mieste vpichu sa potom meria rozsah opuchu (Grohman a spol., 1995; Puccetti a spol., 1994).

Indukciu humorálnej imunitnej odpovede peptidmi, ktoré sú pre organizmus cudzími antigénmi, pripadne antigénmi, ktoré liečený organizmus exprimuje v nízkej koncentrácii, možno stanoviť dôkazom špecifických protilátok v sére. Vhodným spôsobom na stanovenie protilátok v sére je ELISA (enzýme linked immunoassay). Pri tomto spôsobe sa špecifické protilátky, podľa väzby k peptidu použitého na imunizovanie, dokazujú pomocou farebnej reakcie. Alternatívnym spôsobom je Westem blot. V tomto spôsobe sa špecifické sérové protilátky viažu na peptid imobilizovaný na membráne. Viazané protilátky sa potom opäť dokazujú pomocou farebnej reakcie (odkaz pre oba spôsoby: Current Protocols in Immunology. Vydavateľ: Coligan a spol., 1991).

Predovšetkým po vakcinácii s cudzími antigénmi, napríklad vírusového pôvodu, sa dá očakávať tvorba protilátok. Nedá sa však vylúčiť ani to, že špecifické protilátky sa budú tvoriť aj proti zmutovaným alebo nadmerne exprimovaným peptidom, ktoré sú odvodené z bunkových nádorových antigénov. Eliminácia nádoru takými protilátkami by sa po naviazaní protilátok na nádorové bunky mohla uskutočniť inými zložkami imunitného systému, ako je napríklad komplement, cytotoxicita závislá od protilátok (ADCC), alebo fagocytóza makrofágmi (Roitt I. M., BrostoffJ., Malé D. K., Immunology, Churchill Livingstone).

Vyvolanie bunkovej imunitnej odpovede peptidmi odvodenými z proteínov, ktorých imunogénny účinok nie je známy, sa môže otestovať, ako to bolo opísané autormi Rivoltini a spol., 1995, alebo Kawakami a spol., 1994a. Sú k tomu potrebné T bunky, ktoré želaný peptid dokážu rozpoznať, ak je prezentovaný molekulami MHC. V prípade peptidov pochádzajúcich z nádorových buniek zodpovedajúce T bunky sa získajú z lymfocytov infiltrujúcich nádor (TIL), ako to bolo opísané autormi Kawakami a spol. (1994b); v prípade cudzích peptidov sa také T bunky získajú analogicky z periférnej krvi. T bunky sa inkubujú s bunkovými líniami, ako je T2 (Alexander a spol., 1989) alcbo RMA-S (Kärrc a spol., 1986), ktoré sú zmiešané s daným peptidom, a lyžujú ich, ak ide o imunogénny peptid.

Ďalšou možnosťou testovania MHC viažucich peptidových kandidátov na imunogenicitu spočíva v analýze naviazania peptidov na bunky T2. Takýto test je založený na zvláštnosti buniek T2 (Alexander a spol., 1989) alebo buniek RMA-S (Kärre a spol., 1986), ktoré sú defektné v transportnom mechanizme TAP peptidu a stabilné molekuly MHC prezentujú až potom, keď sa nanesú na peptidy, ktoré sa prezentujú v kontexte MHC. Na test sa použijú napríklad bunky T2 alebo RMA-S, ktoré boli stabilne transfekované jedným HLA génom, napríklad génom HLA-A1 a/alebo HLA-A2. Ak sa bunky zmiešajú s peptidmi, ktoré sú dobrými HLA ligandmi, pretože v HLA kontexte sú prezentované tak, aby ich imunitný systém rozpoznal ako cudzie, takéto peptidy spôsobujú, že molekuly HLA sa na povrchu buniek objavia vo výraznejšom množstve. Dôkaz molekúl HLA na povrchu buniek, napríklad prostredníctvom monoklonálnych protilátok, umožňuje identifikovať vhodné peptidy (Malnati a spol., 1995; Sykulev a spol., 1994). Aj tu sa výhodne používa štandardný peptid so známou dobrou schopnosťou väzby HLA.

So zreteľom na čo najširšiu použiteľnosť farmaceutických prostriedokov podľa vynálezu sa výhodne použije zmes viacerých peptidov, z ktorých sa každý môže viazať na inú molekulu MHC, výhodne na jeden z dvoch alebo troch najčastejšie sa vyskytujúcich MHC podtypov. S vakcínou na základe zmesi peptidov, ktoré sa môžu na tieto haplotypy viazať, možno obsiahnuť širokú populáciu pacientov.

V uskutočnení podľa vynálezu vakcína môže obsahovať sekvencie viacerých peptidov. Použité peptidy sa v tomto prípade môžu odlišovať tým, že sa viažu na rôzne HLA podtypy. Tým sa dá dosiahnuť to, že sa obsiahnu viaceré prípadne všetky HLA podtypy jedného pacienta alebo väčšej skupiny pacientov.

Ďalšia, prípadne dodatočná variabilita ohľadne použitých peptidov môže byť v tom, že peptidy, ktoré sa viažu na určitý HLA podtyp, sa vzájomne odlišujú ohľadne svojich sekvencií, ktoré pre väzbu na HLA nie sú rozhodujúce, pokiaľ sú napríklad odvodené z rozličných proteínov toho istého patogénneho pôvodcu, alebo z rozličných pôvodcov. Z takejto variability možno dosiahnuť posilnenie stimulácie imunitnej odpovede, prípadne imunizovanie proti rozličným pôvodcom.

Množstvo účinného peptidu v prostriedku podľa vynálezu sa môže pohybovať v širokom rozmedzí. Množstvo peptidu závisí okrem iného aj od spôsobu podania a od danej formulácie. Podávané množstvo peptidu môže byť približne 1,0 pg až približne 5000 pg na dávku, všeobecne 1,0 pg až približne 1000 pg, obzvlášť približne 10 pg až približne 500 pg. Podávanie sa môže uskutočniť jednorazovo alebo opakovane, pri viacnásobnom podávaní výhodne aspoň trikrát. Obzvlášť pri terapeutickom použití môže aplikácia prebiehať v intervaloch (napríklad 1 x týždenne až 1 x mesačne) po ľubovoľný čas, ktorý je podmienená špecifickým imunitným stavom pacienta, prípadne priebehom ochorenia.

Farmaceutický prostriedok podľa vynálezu môže byť použitý aj ex vivo: princíp možného ex vivo použitia spočíva v tom, že APC bunky, napríklad dendritické bunky, sa kultivujú ex vivo, bunková kultúra sa inkubuje s prostriedkom podľa vynálezu a APC bunky, ktoré teraz peptid prezentujú v MHC kontexte, sa podajú liečenému jedincovi. Na túto možnosť použitia možno použiť spôsoby známe z literatúry, ako to opísali napríklad autori Porgador a Gilboa, 1995; Young alnabe, 1996.

Adjuvans obsiahnutý v prostriedku podľa vynálezu má tú vlastnosť, že uľahčuje vstup peptidu do buniek, prípadne uľahčuje naviazanie peptidu na bunky pacienta, a posilňuje imunogenicitu peptidu. Adjuvans môže napríklad umožniť, aby membrány cieľových buniek, do ktorých sa má peptid dostať, boli aspoň krátkodobo priechodné, a aby týmto spôsobom napomohli peptidu dostať sa do bunky. Preto by to mohlo byť výhodné, ale to nie je nevyhnutné, keby bol peptid naviazaný na adjuvans, napríklad elektrostatickým pôsobením medzi elektronegatívnym peptidom a polykatiónovým adjuvans. Vstup peptidu do bunky sa môže uskutočniť aj tak, že peptidu na základe svojej priestorovej blízkosti k bunkovej membráne sa môže podariť dostať sa cez ňu, akonáhle adjuvans spôsobil zmenu priepustnosti tejto membrány. Pôsobenie adjuvans môže spočívať aj na tom, že na povrchu bunky zvýši koncentráciu peptidu, ktorá je pre vstup do bunky kritická, alebo že uskutoční fagocytózu alebo kvapalný transport (pinocytózu) peptidu do bunky.

Prekvapujúco, prítomnosť adjuvans posilňuje nielen prijatie peptidu do bunky, ale jeho výsledkom je aj posilnenie imunomodulačného pôsobenia peptidu, ktoré sa dá vyvodiť z korektnej prezentácie peptidu molekulami MHC.

V uskutočnení vynálezu môžu byť adjuvans okrem iného v zásade všetky také látky permeabilizujúce membrány, ktoré možno použiť na transport nukleových kyselín do bunky; v tejto súvislosti sa príkladne berú do úvahy závery patentovej prihlášky WO 93/19768, kde sú také látky uvedené.

Vo výhodnom uskutočnení vynálezu je adjuvans bázická polyaminokyselina alebo zmes bázických polyaminokyselín.

Polymerizačný stupeň polyaminokyselin sa môže pohybovať v širokom rozmedzí. Jeho hodnota je približne 5 až približne 1000, osobitne približne 15 až približne 500.

V rámci predkladaného vynálezu sa ako adjuvans výhodne použije polyarginín.

Ďalším výhodným adjuvans v rámci predkladaného vynálezu je polylyzín.

Príkladmi ďalších vhodných, osobitne polykatiónových, organických zlúčenín (bázických polyaminokyselin) sú polyomitín, históny, protamíny, polyetylénimíny, alebo ich zmesi.

Adjuvans je prípadne konjugovaný s bunkovým ligandom, ako je napríklad transferín, gpl20, LDL (lipoproteín s nízkou hustotou, low density lipoproteín), α-fetuín, peptidy EGF (epidermálny rastový faktor, epidermal growth factor), alebo so zástupcom iných bunkových ligandov, ktoré sú opísané na transport DNA prostredníctvom receptormi sprostredkovanej endocytózy v patentovej prihláške WO 93/07283, zvyškov uhľohydrátov, ako je manóza alebo fukóza (ligandy pre makrofágy) alebo protilátky (fragmenty protilátok) proti povrchovým proteínom bunky.

V danom prípade sú polykatiónové adjuvans, ako je polyarginín alebo polylyzín, ktoré sú prípadne konjugované s bunkovým ligandom, súčasťou komplexu s DNA, napríklad vo forme plazmidovej DNA.

DNA môže byť bez sekvencií, ktoré kódujú funkčné proteíny, v tomto prípade DNA je prázdnym plazmidom.

V uskutočnení vynálezu obsahuje DNA sekvencie, ktoré kódujú imunomodulačné proteíny, osobitne cytokíny ako je IL-2, interferóny, GM-CSF.

Na objasnenie mechanizmu transportu peptidov sprostredkovaného bázickými polyaminokyselinami, sa v rámci predkladaného vynálezu meralo uvoľňovanie laktátdehydrogenázy (LDH). Kým v próbach ovplyvnených polyarginínom sa koncentrácie uvoľnenej LDH prakticky nedali dokázať, po inkubácii s polylyzínom sa v rozrastených bunkových kultúrach namerali vysoké koncentrácie LDH. Tieto výsledky dovoľujú predpokladať, že účinok polylyzínu sa dá odvodiť z permeabilizácie bunkovej membrány.

Bez toho, že by sme chceli vziať teóriu za slovo, účinok farmaceutického prostriedku podľa vynálezu by mohol spočívať v tom, že peptid pomocou adjuvans vnikne do cieľových buniek, alebo sa naviaže na bunky, ktoré sa vyskytujú v endodermálnej oblasti kože. Cieľovými bunkami sú okrem iných bunky prezentujúce antigén, ktoré prezentujú peptid, pripadne po spracovaní B a/alebo T bunkami. Príkladmi cieľových buniek sú makrofágy, fibroblasty, keratinocyty, Langerhansove bunky, dendritické bunky alebo B bunky.

V rámci predkladaného vynálezu sa zisťovalo, či malé peptidy v prítomnosti bázických polyaminokyselin alebo glykozylovaných foriem polykatiónu sú vo zvýšenej miere prijímané antigén prezentujúcimi bunkami (APC) podobnými makrofágom. O použitých zvyškoch cukrov je známe, že sú prijímané makrofágmi cestou receptormi sprostredkovanej endocytózy. O (APC) bunkách sa predpokladá, že in vivo predstavujú ten typ buniek, ktorý prijíma peptidy, a prezentuje ho iným bunkám imunitného systému. Výsledky in vitro pokusov, ktoré ukazujú, že APC bunky v prítomnosti testovaných adjuvans endocytujú zvýšené množstvá peptidových antigénov, poukazujú na to, že tieto adjuvans sú aj in vivo vhodné na posilnenie prezentovania peptidov proti cytotoxickým efektorovým bunkám, ako aj ich aktivovania, čo dohromady vedie k silnejšej imunitnej odpovedi proti cieľu obsiahnutom vo vakcíne.

Ako adjuvans možno použiť aj zložky vo forme častíc, prípadne aj dodatočne k uvedeným adjuvans. Ako častice sú v podstate vhodné látky, ktoré sa používajú aj na prípravu materiálu kolóny na syntézu peptidov, napríklad silikagél alebo umelá živica, pokiaľ sú fyziologicky prijateľné a dajú sa z nich pripraviť častice, ktoré sú dostatočne malé na to, aby sa dostali do bunky. Pomocou adjuvans vo forme častíc sa dajú dosiahnuť vysoké lokálne koncentrácie peptidov, čo uľahčuje ich prijatie do buniek.

Druh použitej adjuvans, účelnosť jeho modifikácie s bunkovým ligandom, prípadne prímes DNA, ako aj požadované množstvo adjuvans v pomere k peptidu možno jednotlivo stanoviť empiricky, možno napríklad jednotlivo zvolený pomer peptidu k adjuvans, ktorý sa môže v princípe pohybovať v širokom rozmedzí, stanoviť pomocou titrácie.

Testovanie adjuvans sa môže v princípe uskutočniť pomocou tých istých spôsobov ako testovanie peptidov, prípadne aj vo viacerých krokoch:

Schopnosť adjuvans zvyšovať naviazanie a/alebo internalizáciu peptidu na APC bunky sa môže napríklad stanoviť v prvom kroku, v ktorom sa APC bunky inkubujú s fluorescenčné značenými peptidmi a s adjuvans. Zvýšený príjem prípadne väzbu uskutočnenú prostredníctvom adjuvans možno stanoviť prietokovou cytometriou porovnaním s bunkami, ktoré boli zmiešané iba s peptidom.

V druhom kroku možno tieto adjuvans otestovať, či a v akej miere vedie ich prítomnosť k prezentácii peptidu na APC bunkách, pričom podľa spôsobov opísaných skôr na testovanie peptidov na bunkách sa dá stanoviť koncentrácia MHC.

Ďalšou možnosťou na testovanie účinnosti adjuvans je použitie modelového systému in vitro. Pri takomto systéme sa inkubujú APC bunky spolu s adjuvans a s peptidom, a stanovuje sa relatívne aktivovanie klónu T buniek, ktorý použitý peptid špecificky rozpoznáva (Colligan a spol., 1991; Lopez a spol., 1993).

Účinnosť formulovania možno ukázať aj bunkovou imunitnou odpoveďou dôkazom reakcie hypersenzitivity oneskoreného typu (delayed-type hypersensitivity, DTH) v imunizovaných zvieratách.

Nedávno bol stanovený imunomodulačný účinok formulácie v zvieracích pokusoch. Možno tu použiť okrem iného etablované nádorové modely, pri ktorých sú peptidové sekvencie rozpoznávané bunkami imunitného systému známe. Vakcína obsahujúca peptid a adjuvans sa aplikuje v rôznych pomeroch vo vzťahu peptidu k adjuvans a k celkovému množstvu. Ochrana pred rastom nádoru je mierou účinnosti protinádorovej vakcíny.

Farmaceutický prostriedok možno podať parenterálne, topicky, orálne alebo lokálne. Výhodne sa podáva parenterálne, napríklad podkožné, intradermálne alebo intramuskuláme, výhodne podkožné alebo intradermálne, aby zmes dosiahla predovšetkým bunky kože (keratinocyty, fibroblasty), dendritické bunky, Langerhansove bunky alebo makrofágy ako cieľové bunky. V rámci nádorovej terapie možno protinádorovú vakcínu podať aj vnútronádorovo.

Prostriedok podľa vynálezu na parenterálne podanie je k dispozícii všeobecne ako roztok alebo suspenzia peptidu a adjuvans vo farmaceutický prijateľnom nosiči, výhodne vo vodnom nosiči. Ako vodné nosiče možno použiť napríklad vodu, pufrovanú vodu, roztok soli (0,4 %), roztok glycínu (0,3 %), kyselinu hyalurónovú a podobné známe nosiče. Okrem vodných nosičov možno použiť aj rozpúšťadlá, ako je dimetylsulfoxid, propylénglykol, dimetylformamid a ich zmesi. Prostriedok môže okrem toho obsahovať farmaceutický prijateľné pomocné látky, ako sú pufrovacie látky, ako aj anorganické soli, aby sa dosiahol normálny osmotický tlak a/alebo účinná lyofilizácia. Príkladmi takých prísad sú soli sodíka a draslíka, napríklad chloridy a fosfáty, sacharóza, glukóza, hydrolyzáty proteínov, dextrán, polyvinylpyrolidon alebo polyetylénglykol. Prostriedky možno sterilizovať prostredníctvom bežných spôsobov, napríklad prostredníctvom sterilnej filtrácie. Farmaceutický prostriedok možno v tejto forme okamžite plniť alebo aj lyofilizovať a pred použitím zmiešať so sterilným roztokom.

V uskutočnení podľa vynálezu je farmaceutický prostriedok podľa vynálezu k dispozícii ako topická formulácia určená napríklad na dermálnu, prípadne transdermálnu aplikáciu. Farmaceutický prostriedok môže byť k dispozícii napríklad ako hydrogél na báze kyseliny polyakrylovej alebo polyakrylamidu (ako je napríklad Dolobene®, Merckle) ako masť, napríklad s polyetylénglykolom (PEG), ako vehikulum, ako je napríklad štandardná masť DAB 8 (50 % PEG 300, 50 % PEG 1500), alebo ako emulzia, predovšetkým ako mikroemulzia na báze vody v oleji prípadne oleja vo vode, prípadne aj s pridaním lipozómov. Ako urýchľovače priepustnosti („ťahače“) sú vhodné okrem iných deriváty sulfoxidu, ako je dimetylsulfoxid (DMSO) alebo decylmetylsulfoxid (decyl-MSO), ako aj transkutol (dietylénglykolmonoetyléter) alebo cyklodextrín, ďalej pyrolidony, napríklad 2-pyrolidon, N-metyl-2-pyrolidon, kyselina 2-pyrolidon-5-karbónová alebo biologicky odbúrateľný N

-(2-hydroxyetyl)-2-pyrolidon a ich estery mastných kyselín, deriváty močoviny, ako je dodecylmočovina, 1,3-didodecylmočovina a 1,3-difenylmočovina, terpény, napríklad D-limóny, mentón, a-terpinol, karvol, oxid limónny alebo 1,8-cineol.

Ďalšou formou použitia sú aerosóly, napríklad na podanie ako nosový sprej, alebo na inhalovanie.

Prostriedok podľa vynálezu možno podať aj prostredníctvom lipozómov, ktoré môžu byť vo forme emulzií, pien, micel, nerozpustných jednovrstiev, disperzií fosfolipidov, lamclámych vrstiev a podobne. Tieto slúžia ako vehikulum, aby sa peptidy dostali cielene do určitého tkaniva, napríklad do lymfoidného tkaniva alebo tkaniva nádoru, prípadne aby sa predĺžil polčas peptidov.

V prípade prostriedku podľa vynálezu ako topickej formulácie môže táto obsahovať aj absorbátory UV žiarenia, aby napríklad pri profylaktickom použití proti melanómu pôsobili zároveň aj ako ochranný prostriedok proti slnečnému žiareniu.

Odborník si môže vhodné pomocné látky a formulácie vziať zo štandardných prác, ako je „Remington’s Pharmaceutical Sciences“, 1990.

Prehľad obrázkov na výkresoch

Obr. 1 Vakcinácia myší kmeňa DBA/2 proti mastocytómu P815 peptidom KYQAVTTTL.

Obr. 2 Vakcinácia myší kmeňa DBA/2 proti mastocytómu P815 peptidom SYFPEITHI.

Obr. 3 Vakcinácia myši kmeňa DBA/2 proti mastocytómu P815 peptidom SYFPEITHI.

Obr. 4 Vakcinácia myší kmeňa DBA/2 proti melanómu M-3 zmesou peptidov.

Obr. 5 Vakcinácia myší kmeňa DBA/2 proti melanómu M-3 s použitím topickej aplikácie.

Obr. 6 Vakcinácia myší kmeňa DBA/2 proti metastázam melanómu M-3.

Obr. 7 Vyliečenie myši s mikrometastázami M-3 po vakcinácii zmesou peptidov.

Obr. 8 Spojenie buniek s tyrozinázou sprostredkované polylyzínom.

Obr. 9 Aktivovanie T buniek po vakcinácii v terapeutickom modeli (uvoľňovanie IFN-γ z micel vakcinovaných zvierat ako reakcia na bunky M-3).

Obr. 10 Indukovanie protivírusovej imunity prostredníctvom peptidu ASNENMETM nukleokapsidu vírusu chrípky a fukozylovaného polylyzínu ako adjuvans (aktivácia CTL).

Obr. 11 Posilnenie väzby peptidov na APC bunky bázickými polyaminokyselinami.

Obr. 12 Permeabilizácia bunkovej membrány bázickými polyaminokyselinami (uvoľňovanie LDH po ovplyvnení buniek polylyzínom alebo polyarginínom).

Obr. 13 Intemalizácia peptidov polyarginínom.

Obr. 14 Transport peptidov v antigén prezentujúcich bunkách z kostnej drene.

Obr. 15 Zvýšenie transportu peptidov v antigén prezentujúcich bunkách prostredníctvom polykatiónových polyaminokyselín a histónov.

Obr. 16 Účinnosť transportu v závislosti od stupňa polymerizácie bázických aminokyselín.

Obr. 17 Transport peptidov s polyarginínmi nižšej molekulovej hmotnosti.

Obr. 18 Ovplyvnenie účinnosti transportu v závislosti od dávky peptidu.

Príklady uskutočnenia vynálezu

V nasledujúcich príkladoch, pokiaľ to nie je uvedené inak, boli použité nasledovné materiály a spôsoby:

A) Bunky

a) Bunkové línie

Myšacia bunková línia z melanómu Cloudman S91 (klón M-3; ATCC č. CCL 53.1), bunková línia z mastocytómu P815 (ATCC č. TIB 64) a bunková línia z monocytov-makrofágov P388D1 (ATCC TIB 63) sa získali z ATCC. Bunky boli kultivované v médiu DMEM s vysokým obsahom glukózy („high glucose DMEM, Life Technologies) doplnenom o 10 % FCS, 2 mM L-glutamínu a 20 gg/ml gentamycínu. Bunky boli rutinne testované na neprítomnosť mykoplazmatickej kontaminácie (PCR súprava na detekciu mykkoplazmy, Stratagene).

Myšacia bunková línia RMA/S (myšací lymfóm) bola opísaná autormi Kärre a spol., 1986, a Ljunggren a spol., 1990.

b) Antigén prezentujúce bunky z kostnej drene

Najprv sa vypláchli stehnové kosti myší DBA/2. Bunky kostnej drene boli kultivované v médiu DMEM s vysokým obsahom glukózy obsahujúcom 10 % FCS, 5 % konského séra, 2 mM L-glutamínu a 20 gg/ml gentamycínu v prítomnosti 200 jednotiek/ml myšacieho GM-CSF (Li a spol., 1989; Genzyme, Cambridge, MA, USA). Počas prvých piatich dní sa každých 24 hodín vymenili dve tretiny média, aby sa odstránili neadherované granulocyty a B bunky (Inaba a spol., 1992). Tak adherované, ako aj voľne prichytené bunky sa po 8 až 10 dňoch inkubácie pozbierali pomocou PBS/5 mM EDTA a vysiali sa pri hustote 3 * 10⁴ buniek/jamka na 8-jamkové mikroskopické podložné sklíčko (Nunc, Roskilde, Dánsko). Pri viac ako 90 % buniek sa pozorovala pozitívna reakcia s protilátkou F4/80 (Endogen, Cambridge, MA, USA).

B) Syntéza peptidov

Peptidy boli syntetizované v syntetizátore peptidov (model 433 A so spätnou väzbou, Applied Biosystems, Foster City, Kanada) s použitím TentaGél S PBH (Rapp, Tllbingen) ako tuhej fázy podľa spôsobu Fmoc (HBTU aktivácia, Fastmoc™, mierka 0 : 25 mmol). Peptidy sa rozpustili v 1 M TEAA, pH 7,3, a pomocou reverznej chromatografie sa vyčistili na kolóne Vydac C 18. Sekvencie boli stanovované pomocou hmotnostnej spektrometrie na zariadení MAT Lasermat (Finnigan, San Josc, Kanada).

C) Zoznam použitých peptidov

Označenie peptidu	Sekvencia	Príslušný antigén	Číslovanie aminokyselín v protelne	MHC haplotyp
kpep 117	SYFPEITHI	tyrozínkináza JAK1	355 až 353	H2-K
kpep 113	KYQAVTTTL	Tum-P198	14až22	hTÍ?
Kpep162	GPPHSNNFGY	Tum-P35B	4 až 13	H2-D“
Kpep 163	ISTQNHRAL	P91A	12až 20	H2-L°
Kpep 164	LPYLGWLVF	P815	35 až 43	H2-Ľ
kpep 143	RYAEDYEEL	trp-1		hTÍ?
kpep 145	PYLEQASRI	tyrozináza		H2-K”
kpep146	YYVSRDTLL	tyrozináza		H2-K“
kpep 150	YYSVKKTFL	trp-1		H2-Kd
	ASNENMETM	peptid nukleokapsidu vírusu chrípky		H2-K

Zmesi peptidov:

Zmes peptidov I na vakcínu proti melanómu M-3: kpep 143, kpep 145, kpep 146, kpep 150.

Zmes peptidov III na vakcínu proti mastocytómu P815: kpep 117, kpep 118, Kpep 162, Kpep 163, Kpep 164

D) Príprava vakcín

Dl) Vakcíny s jednotlivými peptidmi

a) Pripravili sa kontrolné vakcíny s jednotlivými peptidmi bez adjuvans, do ktorého bol peptid pridaný v koncentrácii 1 mg/ml PBS. Inkubačná doba až do injekcie bola 4 h pri izbovej teplote.

b) Pripravili sa vakcíny s jednotlivými peptidmi s polylyzínom (pokiaľ to ďalej nie je uvedené inak, bol použitý polylyzín s dĺžkou reťazca 200) ako adjuvans, kde peptid a polylyzín boli zmiešané v udaných množstvách v HBS. Inkubačná doba až do injekcie bola 4 hodiny pri izbovej teplote.

i) Na získanie vakcíny s obsahom 16 gg účinného peptidu sa zmiešalo 11,8 gg polylyzínu a 160 gg peptidu kpep 117 v celkovom objeme 1 ml HBS.

ii) Na získanie vakcíny s obsahom 100 gg účinného peptidu sa zmiešalo 74 gg polylyzínu s 1 mg peptidu kpep 117 v celkovom objeme 1 ml HBS.

c) Pripravili sa kontrolné vakcíny s jednotlivými peptidmi s nekompletným Freundovým adjuvans (incomplete Freunďs adjuvant, IFA), kde peptid a IFA boli emulgované v uvedených množstvách. Inkubačná doba až do injekcie bola 30 min. pri izbovej teplote.

i) Pre kontrolnú vakcínu obsahujúcu 16 gg účinného peptidu sa emulgovalo 192 gg peptidu kpep 117 v 600 gl HBS so 600 gl IFA.

ii) Pre kontrolnú vakcínu obsahujúcu 100 gg účinného peptidu sa emulgovalo 1,2 mg peptidu kpep 117 so 600 gl HBS IFA.

D2) Zmesi peptidov ako vakcíny

a) Zmes peptidov I ako kontrolná vakcína bez adjuvans obsahovala po 250 gg peptidov kpep 143, kpep 145, kpep 146, kpep 150 v celkovom objeme 1 ml PBS.

b) Zmes peptidov III ako kontrolná vakcína bez adjuvans obsahovala po 250 gg peptidov kpep 117, kpep 118, Kpep 162, Kpep 163, Kpep 164 v celkovom objeme 1 ml PBS.

c) Pripravila sa zmes peptidov I ako vakcína s polylyzínom ako s adjuvans, v ktorej 1 mg zmesi peptidov I (obsahujúcej po 250 gg peptidov) sa zmiešal so 74 gg polylyzínu v HBS. Inkubačná doba až do injekcie bola 4 h pri izbovej teplote.

d) Pripravila sa zmes peptidov III ako vakcína s polylyzínom ako s adjuvans, v ktorej 1,25 mg zmesi peptidov III (obsahujúcej po 250 gg peptidov) sa zmiešalo s 93 gg polylyzínu v HBS. Inkubačná doba až do injekcie bola 4 h pri izbovej teplote.

e) Pripravila sa zmes peptidov I ako kontrolná vakcína s nekompletným Freundovým adjuvans, v ktorej 1,2 mg zmesi peptidov I v 600 gl HBS (obsahujúcej po 300 gg peptidov) sa emulgovalo so 600 gl IFA. Inkubačná doba až do injekcie bola 30 min pri izbovej teplote.

f) Pripravila sa zmes peptidov III ako kontrolná vakcína s nekompletným Freundovým adjuvans, v ktorej sa 1,5 mg zmesi peptidov III v 600 gl HBS (obsahujúcej po 300 gg peptidov) emulgovalo so 600 gl IFA. Inkubačná doba až do injekcie bola 30 min. pri izbovej teplote.

g) Na topické podanie s polylyzínom ako adjuvans sa inkuboval 1 mg zmesi peptidov I (obsahujúcej po 250 pg peptidov) so 74 pg polylyzínu po dobu 4 h v celkovom objeme 400 μΐ HBS. Získaná zmes sa zamiešala do 1,6 g hydrogélu DOLOBENE (Merckle).

h) Na topické podanie kontrolnej vakcíny bez adjuvans sa zamiešal 1 mg zmesi peptidov I (obsahujúcej po 250 pg peptidov) v celkovom objeme 200 pl HBS do 1,8 g hydrogélu DOLOBENE (Merckle).

i) Príprava fukózou spojeného polylyzínu (dĺžka reťazca: 240, prípadne 200) sa uskutočnila podľa spôsobu opísaného autormi MacBroom a spol., 1992, pričom sa dosiahla asi 40 %-ná substitúcia (východiskový materiál, β-L-fukopyranozylfenyl-izotiokyanát a polylyzín bol nakúpený od firmy Sigma).

j) Ak boli použité konjugáty transfcrín/polylyzín (pripravené, ako to je opísané v patentovej prihláške WO 93/07283), boli množstvá nastavené tak, aby absolútne množstvo polylyzínu bolo 75 pg na mg peptidu. Ak bola do komplexov integrovaná plazmidová DNA (prázdny plazmid pSP65, bez LPS, Boehringer Mannheim), bol pomer 37,5 pg DNA/75 pg polylyzinu/1 mg peptidu. V prípade použitia 160 pg namiesto 1 mg peptidu boli množstvá ostatných komponentov znížené o ten istý faktor (6,25).

E) Injikovanie vakcíny

Pred podkožnou injekciou boli myši v izolovanej vzduchovej komore uspané v skupinách po osem zvierat. Po ovplyvnení Halothanom počas 3,5 min. (4 % v O₂, rýchlosť prietoku 4) boli myši narkotizované asi na čas 1 min.; počas tohto času bola vakcína injikovaná podkožné.

Intraperitoneálna injekcia sa uskutočnila bez predchádzajúcej anestézie. Objem injekcie pre každú vakcínu bol 100 pl na zviera, čo zodpovedá 100 pg jednotlivých peptidov alebo zmesi peptidov I na zviera. V prípade zmesi peptidov 111 celkové aplikované množstvo peptidov bolo 125 pg.

F) Topické použitie vakcíny

Do kože oholených myší sa votrelo po 200 mg masti obsahujúcej 100 pg peptidu alebo zmesi peptidov I, prípadne 125 pg zmesi peptidov I, a to do oblasti celého chrbta a uší. Správne množstvo bolo kontrolované pomocou váh.

G) Použitie vakcíny proti nádorovému rastu v myšacom modeli

Protokol testovania účinnosti protinádorových vakcín v profylaktickom alebo terapeutickom myšacom modeli zodpovedal, pokiaľ to nie je uvedené inak, princípu opísanému v patentovej prihláške WO 94/21808, pričom ako myšací model bol použitý model DBA/2.

Príklad 1

Vakcinácia myší kmeňa DBA/2 proti mastocytómu P815

160 pg peptidu so sekvenciou KYQAVTTTL (kpep 118), odvodeného z nádorového antigénu P815 opísaného autormi Lethe a spol., 1992, z ligandu H2-K^d, sa zmiešalo s 11,8 pg polylyzínu 300 v 500 pl HBS a inkubovalo sa 4 h pri izbovej teplote. Potom sa pridalo 500 pl EBSS (pufrovaný roztok solí podľa Earla). Získaná zmes sa podávala 8 myšiam podkožné v týždňových intervaloch. Po tejto predchádzajúcej imunizácii sa po ďalšom týždni inokulovali nádory, a to tak, že do každej myši bolo kontralaterálne injikovaných 5 * 10⁴ buniek línie mastocytómu P815 (ATCC č. TIB 64; tieto bunky exprimujú nádorový antigén, z ktorého je peptid P815 odvodený) v 100 pl EBSS.

V paralelnom pokuse sa 200 pg peptidu zmiešalo s 500 pl HBS a následne sa emulgovalo s 500 pl Freundovho adjuvans. So získanou emulziou (po 100 pl) sa najprv imunizovalo osem myši a následne boli inokulované nádorové bunky P815, ako je to uvedené (obr. 1: plné kruhy).

Pre ďalší paralelný pokus sa pripravila nasledovná bunková protinádorová vakcína:

160 pg peptidu kpep 118 sa zmiešalo s 3 pg transferínu/polylyzínu (TfpL), 10 pg pL a 6 pg plazmidu psp65 (bez LPS) v 500 pl pufru HBS. Po 30 min. pri izbovej teplote sa uvedený roztok dal do kultivačnej fľaše T 75 spolu s 1,5 x 10⁶ buniek alogénnej fibroblastovej bunkovej línie NIH3T3 (ATCC č. CRL 1658) v 20 ml média DMEM (10 % FCS, 20 mM glukózy) a inkuboval sa pri 37 °C. Po 3 h sa bunky zmiešali s 15 ml čerstvého média a inkubovali sa cez noc pri 37 °C a v atmosfére s 5 % CO₂. 4 hodiny pred aplikáciou boli bunky ožiarené dávkou 20 Gy. Dokončenie vakcíny sa uskutočnilo, ako to bolo opísané v patentovej prihláške WO 94/21808. Predchádzajúca imunizácia touto vakcínou sa robila v týždňových intervaloch s použitím 10⁵ buniek; po ďalšom týždni sa uskutočnila inokulácia nádorových buniek, ako to bolo opísané skôr (obr. 1: plné trojuholníky). Ukázalo sa, že vakcína, ktorá obsahovala peptid spojený s polylyzínom, chránila myši pred vznikom nádorov najlepšie.

Príklad 2

Vakcinácia myši kmeňa DBA/2 proti mastocytómu P815 pomocou vakcíny s jediným peptidom

a) Testovali sa tri vakcíny s jednotlivými peptidmi, ktoré obsahovali buď peptid kpep 117 samostatne v PBS (obr. 2a), peptid kpep 117 emulgovaný v IFA (obr. 2b), alebo peptid kpep 117 s polylyzínom (dĺžka reťazca: 240) ako s adjuvans (obr. 2c), na ochranný účinok proti nádorovému inokulu buniek P815. Vakcíny boli pripravené, ako to bolo opísané skôr v odseku D. Objem injekcie bol vždy 100 μΐ; injekcia bola podaná podkožné (sc) alebo intraperitoneálne (ip). Intaktné myši slúžili ako negatívna kontrola, pozitívnou kontrolou bola vakcína z celých buniek, pozostávajúca z buniek P815 sekretujúcich GM-CSF (P815-GM-CSF; podkožné sa injikovalo 10⁵ buniek/myš v objeme 100 pl). Každá pokusná skupina pozostávala z ôsmich zvierat, vakcinácia sa uskutočnila trikrát podkožné (sc) v sedemdňových intervaloch. Týždeň po poslednej vakcinácii dostali zvieratá kontralaterálne inokulum obsahujúce 5 ^χ 10⁴ buniek P815. Zvieratá boli denne prezerané, nástup rastu nádorov bol kontrolovaný v týždňových intervaloch.

Najlepší protinádorový účinok sa dosiahol s peptidom kpep 117 spolu s polylyzínom ako s adjuvans, ak bol injikovaný podkožné v dávke 100 μg na myš (ochrana bola zistená u troch až ôsmich zvierat). Tento účinok bol približne taký dobrý ako účinok dosiahnutý s vakcínou obsahujúcou celé bunky (ochrana bola vtedy zistená u štyroch až ôsmich zvierat). 16 pg peptidu spolu s polylyzínom na myš bolo menej účinné (ochrana u dvoch zvierat), ale bolo to výrazne lepšie ako 100 pg peptidu v PBS (obr. 2a, nijaký ochranný účinok). Ani peptid emulgovaný v IFA nedal taký účinok, aký sa dosiahol spolu s polylyzínom (obr. 2c).

b) V ďalšom pokuse v modeli s mastocytómom P815 sa vzájomne porovnávali dva nemodifikované polylyzíny s rôznou dĺžkou reťazcov, krátky polylyzín iba so 16 lyzínovými zvyškami (pL16) a dlhý polylyzín s 240 zvyškami (pL240). Zvieratám kontrolnej skupiny sa injikovalo po 100 pg peptidu kpep 117, buď rozpusteného v PBS alebo emulgovaného v IFA. Ako pozitívne kontroly sa použili dve bunkové vakcíny sekretujúce GM-CSF (porovnaj s bodom a)), pričom jedna vakcína sa získala zo stabilne transfekovaných buniek P815 a druhá sa získala prostredníctvom prechodnej transfekcie s použitím spôsobu opísaného autormi Wagner a spol., 1992 (AVET). Obe vakcíny s celými bunkami poskytli ochranu štyrom prípadne piatim myšiam z ôsmich. Vakcíny na základe peptidov, ktoré pozostávali iba zo samotného peptidu alebo z peptidu emulgovaného v IFA nevykazovali nijaké ochranné účinky; čoskoro po inokulácii nádorových buniek u všetkých zvierat vznikli nádory. Ak sa však peptid podal spolu s polylyzínom, peptidová vakcína chránila zvieratá proti nádorovému inokulu: ochrana bola pozorovaná u dvoch z ôsmich myší, ak sa použil dlhý polylyzín (pL240), a u štyroch z ôsmich zvierat v prípade krátkeho polylyzínu. Tieto výsledky, ktoré sú uvedené na obr. 3, ukazujú, že jednotlivý peptid, ak je podaný s polylyzinom ako s adjuvans, spôsobuje účinnú protinádorovú ochranu, ktorá je porovnateľná s ochranou jednej z najúčinnejších celobunkových vakcín sekretujúcich cytokín, ktorá je v literatúre uvedená ako štandard na protinádorovú vakcináciu (Dranoff a spol., 1993; Schmidt a spol., 1995).

Príklad 3

Vakcinácia myší kmeňa DBA/2 proti mastocytómu P815 protinádorovou vakcínou obsahujúcou jednotlivý peptid P815 alebo zmesi peptidov P815

Na prípravu vakcíny boli použité nasledovné peptidy: kpep 118 (100 pg na injekciu)

Zmes peptidov III (kpep 117, kpep 118, kpep 162, kpep 163, kpep 164). Táto zmes peptidov obsahovala všetky doteraz známe peptidy P815; podalo sa po 25 pg z každého peptidu).

Ako pozitívne kontroly boli použité bunky P815 sekretujúce GM-CSF.

V predbežných pokusoch sa ukázalo, že kpep 117 je peptid s najlepším ochranným účinkom proti inokulu nádorových buniek P815, ak sa použilo 100 pg peptidu spolu s polylyzinom (7,5 pg polylyzínu/100 pg peptidu, podľa štandardného pomeru; polylyzín: dĺžka reťazca = 200). Menšie množstvo (16 pg) kpep 117 bolo menej účinné. V tomto príklade bolo injikovaných 100 pg kpep 118 na myš, a síce raz iba s polylyzinom (skupina B), raz s transferinom/polylyzínom (skupina C) a raz s transferínom/polylyzínom/DNA (skupina D). Ako kontrola bol použitý kpep 118 s IFA. V tomto pokuse kpep 118 samotný nemal proti nádorovému inokulu nijaký ochranný účinok.

V pokusoch uvedených v príklade 4 sa ukázalo, že vakcína obsahujúca zmes peptidov, pozostávajúca z melanómových peptidov, má ochranný účinok proti melanómu. Bolo preto v tomto príklade testované, či koncepcia zmesi peptidov je vhodná aj pre P815. Zmes peptidov III bola podaná raz iba so samotným polylyzinom (skupina E), raz s transferínom/polylyzínom (skupina F) a raz s transferínom/polylyzínom/DNA (skupina G). Ako kontrola bola použitá zmes peptidov III v IFA. Ako negatívna kontrola boli použité intaktné myši; ako pozitívna kontrola boli použité bunky P815 transfekované s GM-CSF (10⁵ buniek na myš).

Pokusy uvedené v tomto príklade sa v porovnaní s inými pokusmi vyvinuli skôr netypicky: v skupine pozitívnej kontroly (bunky sekretujúce GM-CSF) sa u všetkých zvierat onedlho po inokulácii vyvinuli nádory, pričom väčšina týchto nádorov zmizla práve tak rýchlo, ako vznikla. Možným vysvetlením je to, že nádor pred svojou elimináciou nejaký čas rástol. Ďalším možným vysvetlením by bolo, že opuch diagnostikovaný ako nádor nepochádzal od nádorového rastu, ale od silného infíltrátu imunitných buniek (granulóm). Pretože zvieratá neboli pitvané, príčina nemohla byť definitívne stanovená; v každom prípade inokulované nádory boli neskôr eliminované. Ďalší zaujímavý výsledok bol získaný v skupine G, v ktorej boli zvieratá ošetrené kombináciou pozostávajúcou zo zmesi peptidov III a polylyzínu. U všetkých zvierat vznikli nádory, ale u dvoch zvierat boli rozmery nádorového opuchu (prípadne infíltrátu imunitných buniek) pomerne malé, opuch nerástol, a myši nevyzerali nezdravo. Obe tieto zvieratá neboli usmrtené, ale boli ďalej pozorované. Prekvapujúco, prítomnosť nádorov sa po deviatich týždňoch nedala viac dokázať, čo bol dovtedy nepozorovaný výsledok. Dva z ôsmich zvierat napokon eliminovali svoje nádory. Eliminácia nádorov sa mohla vysvetliť obsahom kpep 117 v zmesi peptidov, čo bolo analogické s príkladom 2, kde bola zistená ochrana u dvoch z ôsmich zvierat so 16 pg kpep 117, a u troch z ôsmich zvierat so 100 pg kpep 117. Ale ochranný účinok mohol byť vyvolaný aj viacerými než jediným peptidom zmesi.

Príklad 4

Ochrana myší kmeňa DBA/2 proti melanómu M-3 prechádzajúcou imunizáciou protinádorovou vakcínou obsahujúcou zmes peptidov

Použila sa profylaktická vakcína, ktorá obsahovala zmes melanómových peptidov (zmes peptidov I, odsek D2).

Protokol predchádzajúcej imunizácie s vakcínou, ako aj nádorová inokulácia zodpovedali protokolu opísanému v príklade 2, s tým rozdielom, že nádorová inokulácia sa uskutočnila s bunkami M-3 (10⁵ buniek na myš). Ako kontrolná vakcína bola použitá vakcína obsahujúca celé bunky M-3, ktorá sekretuje optimálne množstvo IL-2 (1000 až 2000 jednotiek na 10⁵ buniek) a pripravila sa, ako to bolo opísané autormi Schmidt a spol., 1995. Za zvolených pokusných podmienok sa touto vakcínou dosiahla 100 %-ná ochrana (obr. 4). Vakcíny so zmesou peptidov boli podané štyrom skupinám pokusných zvierat. Dve skupiny dostali - buď podkožné (sc) alebo intraperitoneálne (ip) - peptidy emulgované v IFA. Obe ďalšie skupiny dostali, buď podkožné (sc) alebo intraperitoneálne (ip) peptidy spolu s polylyzínom (pL240).

Na obr. 4 je znázornený ochranný účinok peptidovej vakcíny s polylyzinom (pL240) ako s adjuvans; 50 % ovplyvnených myší bolo chránených proti nádorovému inokulu M-3 v porovnaní s neovplyvnenými myšami, u ktorých sa rýchlo vyvinuli solídne nádory. Tento účinok sa dal dosiahnuť vtedy, ak vakcína obsahujúca peptid/polylyzín bola injikovaná podkožné alebo sa naniesla na kožu ako hydrogél (obr. 5). V ostatných troch kontrolných skupinách, ktoré boli ovplyvnené vakcínami obsahujúcimi peptid/polylyzín intraperitoneálne alebo boli ovplyvnené peptidmi v IFA, bola vakcína v podstate neúčinná. Inokulované nádory v tomto prípade neboli eliminované, a nádory rástli v porovnaní s neovplyvnenými kontrolnými zvieratami iba s nepatrným oneskorením. Tieto výsledky ukazujú, že vakcína obsahujúca zmes peptidov umožňuje protinádorovú ochranu vtedy, ak obsahuje polylyzín. Za zvolených pokusných podmienok bola táto peptidová vakcína len spolovice taká účinná ako bunková vakcína s IL-2, ktorá, v súlade s nedávno publikovanými prácami (Zatloukal, 1993, Zatloukal, 1995) chránila až 100 % myši proti nádorovému inokulu 10⁵ živých M-3 buniek.

Príklad 5

Ochrana myší kmeňa DBA/2 proti metastázam z buniek M-3

a) Použila sa terapeutická vakcína, ktorá obsahovala zmes melanómových peptidov (zmes peptidov I opísaná v odseku D2). Podali sa tri vakcinácie (sc) v týždňových intervaloch. Prvá vakcinácia sa uskutočnila päť dní po inokulácii metastáz, podľa toho sa očkovalo proti päťdňovým metastázam. Ako inokulum metastáz sa naočkovalo 1,2 x 10⁴ buniek M-3, použil sa pritom protokol opísaný v patentovej prihláške WO 94/21808 a autormi Schmidt a spol., 1996.

Ako vakcína sa použila zmes peptidov I: bez adjuvans (pepmixl PBS), s IFA ako s adjuvans (IFA pepmixl) alebo s polylyzínom modifikovaným fukózou (fpL pepmixl). Kontrolné skupiny nedostali nijaké vakcíny (intaktné), alebo dostali vakcínu s celými bunkami M-3 produkujúcimi IL-2, uvedenými v príklade 4. Obr. 6 ukazuje, že najlepšia ochrana bola dosiahnutá v skupine, ktorá bola ovplyvnená zmesou peptidov I s polylyzínom modifikovaným fukózou ako s adjuvans (obr. 6a). 50 % myší dokázalo metastázy eliminovať (4/8). Toto ošetrenie bolo dokonca účinnejšie ako ovplyvnenie s vakcínou s celými bunkami, ktorá ochránila iba 33 % myší (3/9). Peptidová vakcína s IFA alebo bez adjuvans viedla iba k oneskorenému rastu metastáz (obr. 6b).

b) V ďalšom pokuse sa v terapeutickom modeli testoval ochranný účinok vakcíny, ktorá obsahovala zmesi peptidov I a bola podaná podkožné. Kontrolné skupiny dostali zmes peptidov v PBS (bez adjuvans) alebo s IFA. Ako adjuvans boí použitý nemodifíkovaný polylyzín 240. Okrem toho bol ako adjuvans použitý fukózou modifikovaný polylyzín 200 (fpL 200). Ako kontrola bola do tohto pokusu zaradená skupina zvierat s bunkovou vakcínou exprimujúcou IL-2. Ako je to ukázané na obr. 7a, bola vakcína obsahujúca peptid/polylyzín pri ovplyvnení metastáz M-3 účinná. Výrazný podiel vyliečených zvierat sa v tomto pokuse dosiahol iba s polylyzínom modifikovaným fukózou. Pri tomto ovplyvnení 50 % zvierat metastázy odbojilo, čo je v porovnaní s vakcínou IL-2, ktorá v tomto prípade uzdravila 70 % zvierat, dobrým výsledkom.

c) V ďalšom pokuse sa v terapeutickom modeli testovalo, ako sa prejavia zmeny a modifikácie polykatiónu na protinádorové účinky. Pritom sa k nemodifikovanému a k fukózou modifikovanému polylyzínu 200 dodatočne testovali krátky, nemodifíkovaný polylyzín pL16, dlhý polylyzín pL450 a ďalší polykatión, a to polyarginín (pArg720). Ako pozitívna kontrola sa použila bunková vakcína M-3, ktorá sekretovala optimálne množstvo (> 10 ng na 10⁵ buniek) GM-CSF (Schmidt, 1995). Aj v tomto pokuse dostali kontrolné skupiny zmes peptidov v IFA alebo bez akéhokoľvek adjuvans. Ako aj v príklade 5b), najlepší účinok sa dosiahol vtedy, ak sa použil fukózou modifikovaný polylyzín ako adjuvans (obr. 7b). V tejto skupine 40 % zvierat metastázy odhojilo, v porovnaní s 30 % v skupine s krátkym polylyzínom pL16. Okrem skupiny, v ktorej zvieratá dostali peptidy spolu s polyarginínom, u zvierat ostatných skupín, ktorým bola podaná peptidová vakcína, sa pri vzniku nádorov pozorovalo iba krátke oneskorenie. Nemodifíkovaný polyarginín bol v tomto pokuse práve taký účinný, ako bol fukózou modifikovaný polylyzín, viedol k odhojeniu metastáz u štyroch z desiatich zvierat.

Obr. 7c ukazuje opakovanie tohto účinku dosiahnutého polyarginínom v nezávislom pokuse. Aj tu ukázala vakcinácia so zmesou peptidov v spojení s polyarginínom protinádorový účinok u štyroch z ôsmich zvierat.

Príklad 6

Transloading buniek tyrozinázou s použitím polylyzínu ako adjuvans.

Tento príklad slúžil ako pokus, ktorý mal ukázať, že polylyzín ako adjuvans je vhodný na spojenie buniek s väčšími proteínovými fragmentmi alebo s celými proteínmi, pričom ako bunky boli použité bunky M-3.

Na spojenie s bunkami sa zmiešalo 160 pg tyrozinázy značenej FITC (EC 1.14.18.1; Sigma) s 3 pg polylyzínu (pL240) a inkubovalo sa 3 h pri izbovej teplote. Potom sa získaný roztok dal do kultivačnej fľaše T 75 s 2 χ 10⁶ buniek M-3 a inkuboval sa pri 37 °C. Potom sa bunky dvakrát premyli s PBS, uvoľnili sa s PBS/2 mM EDTA a pridali sa do 1 ml PBS/5 % FCS na analýzu prietokovou cytometriou v analyzátore FACS. Obr. 8 ukazuje spojenie buniek M-3 s tyrozinázou (ľavá krivka je kontrola, pravá krivka predstavuje spojenie s tyrozinázou).

Príklad 7

Stanovenie aktivácie T buniek po imunizácii v terapeutickom modeli

Po tom, ako sa ukázalo, že vakcína obsahujúca peptid/polykatión v myšacom terapeutickom modeli (porovnaj s príkladom 5) je jednoznačne účinná, zisťovalo sa, či toto ovplyvnenie vedie aj k aktivácii T buniek. Na to sa inkubáciou slezinových buniek vakcinovaných zvierat s pôvodnými bunkami M-3 ako markerom vyvolala sekrécia cytokínu (Kawakami a spol., 1994b).

Pripravili sa jednobunkové suspenzie slezinových buniek z vakcinovaných a intaktných zvierat, erytrocyty boli následne lyzované hypotonickým pufrom (0,15 NH₄C1, 1 mM KHCO₃, 0,1 mM EDTA, pH 7,4). Adherované bunky sa odstránili, a 3 x 10^ó slezinových buniek na ml média DMEM (10 % FCS) sa inkubovalo v Petriho miskách počas 90 min. pri 37 °C. Neadherované bunky boli opatrným napipetovaním a kultiváciou s 1 χ 10³ parentálnych buniek v rôznom pomere kokultivované. Bunky boli kultivované v 200 pl média DMEM (10 % FCS) obohatenom o 2 mM L-glutamínu a 20 pg/ml gcntamycínu v 96-jamkovej kultivačnej platničke s plochým dnom. Na 9. deň sa z kultúr zobralo po 100 pl média a stanovil sa obsah IFN-γ s použitím komerčne dostupnej ELISA súpravy (Endogen, Cambridge, MA, USA) podľa návodu výrobcu. Ukázalo sa, že po 9-dňovej inkubácii do média sekretovali väčšie množstvá IFN-γ iba slezinové bunky vakcinovaných zvierat, kým v kokultúrach slezinových buniek z neovplyvnených zvierat a buniek M-3 sa prakticky nedal dokázať nijaký IFN-γ. Výsledok týchto pokusov je znázornený na obr. 9.

Príklad 8

Indukcia antivirusovej imunity prostredníctvom peptidu z nukleokapsidu vírusu chrípky ASNENMETM a fukozylovaného polylyzínu ako adjuvans

Použila sa vakcína, ktorá na 1 mg peptidu ASNENMETM obsahovala 75 pg fpLys. Vakcína bola podaná jednorazovou injekciou, ako to je uvedené v metodickej časti, pričom sa injikovalo 100 pg peptidu/7,5 pg fpLys na myš. Na kontrolu sa použila injekcia 100 pg samotného peptidu (PBS), prípadne sa nepodala nijaká injekcia (intaktná kontrola).

Bunky myšacieho lymfómu RMA-S sa inkubovali cez noc v bezsérovom médiu pri 26 °C s 10 pg/ml peptidu ASNENMETM.

SK 284582 Β6 dní po vakcinácii sa z vakcinovaných zvierat vyizolovali slezinové bunky, zmiešali sa v pomere 5 : 1 s bunkami RMA-S spojenými s peptidom a ďalej sa kultivovali počas 5 dní (Stuber a spol., 1994). Stanovil sa počet prežívajúcich efektorových slezinových buniek v rôznych kultúrach, potom sa bunky na stanovenie CTL aktivity pomocou štandardného 4-hodinového testu uvoľňovania európia (Blomberg a spol., 1993) zmiešali v rôznom pomere s bunkami RMA-S, ktoré boli predtým zmiešané s peptidom ASNENMETM a s chelátom európia. Ako je to ukázané na obr. 10, špecifická imunita v tomto pokuse sa dosiahla iba vakcináciou s peptidom a s fpLys, ale nie v tom prípade, keď bol podaný iba samotný peptid.

Príklad 9

Testovanie rôznych bázických polyaminokyselín na ich schopnosť posilniť intemalizáciu a/alebo naviazanie peptidov na APC

Na tieto testy bol použitý fluorescenčný test: modelový peptidový antigén so sekvenciou LFEAIEGFI (MHC Kd reštringovaný) bol označený fluorescenčným farbivom fluoresceín izotiokyanátom (FITC) podľa návodu výrobcu (Molecular Probes). Prijatie prípadne väzba peptidu značeného s FITC („pulzovaného“) samostatne alebo spolu s rôznymi koncentráciami bázických aminokyselín (polylyzinu s dĺžkou reťazca 16 až 490, polyarginínu s dĺžkou reťazca 15 až 720) prostredníctvom monocytámej-makrofágovej MHC Kd reštringovanej bunkovej línie P388D1 sa merala pomocou prietokovej cytometrie. S týmto cieľom sa 1 x 10⁶ buniek P388D1 vo finálnom objeme 1 ml média (DMEM/10 % FCS) inkubovalo v centrifugačnej skúmavke s 5 pg peptidu značeného s FITC samostatne alebo so zmesou peptidu a polyaminokyseliny 30 minúť pri 37 °C a potom sa bunky intenzívne premyli, aby sa odstránil voľný peptid. Polyaminokyseliny sa pridali v koncentrácii 50, 25, 12, 6 a 3 pg na ml média, obsahujúc 5 pg peptidu značeného s FITC. Porovnala sa relatívna intenzita fluorescencie rôznych prób, aby sa stanovila účinnosť prijatia a/alebo naviazania peptidu. Výsledok týchto pokusov je uvedený na obr. 11; pokusy sa robili vždy s 25 pg pL450, prípadne pArg450. Za zvolených podmienok bol polyarginín približne päťkrát účinnejší ako polylyzín.

Príklad 10

Určenie mechanizmu, cez ktorý APC prijímajú peptidy

APC môžu prijať peptidy pomocou špecifických mechanizmov, ako je makropinocytóza alebo receptormi sprostredkovaná endocytóza (Lanzavecchia, 1996). Alternatívny mechanizmus môže spočívať v tom, že polyaminokyseliny môžu bunkovú membránu urobiť priepustnou, čím umožnia difúziu peptidov z média do cytoplazmy.

a) To, či ide o permeabilizáciu bunkovej membrány, sa otestuje tak, že sa stanoví uvoľňovanie cytoplazmatického enzýmu laktátdehydrogenázy (LDH) po inkubovaní P388D1 buniek s polyaminokyselinami (polylyzínom alebo polyarginínom) za izotonických podmienok s použitím komerčne dostupných súprav (Cytotox 96, Promega, Madison, Wisconsin, USA) podľa pokynov výrobcu. Na základe výsledkov uvedených na obr. 12a sa dá predpokladať, že účinok pLys spočíva v tom, že robí bunkovú membránu priepustnou, čo sa prejavuje vysokými koncentráciami cytoplazmatického enzýmu uvoľňovaného za izotonických podmienok. Na rozdiel od toho, po ovplyvnení s pArg (obr. 12b) sa nedala dokázať prakticky nijaká LDH. Pri porovna ní prób, ktoré boli ovplyvnené iba s polyaminokyselinami, sa v porovnaní s ovplyvnením so zmesou polylyzínu alebo polyarginínu nezistil v uvoľňovaní LDH nijaký rozdiel. Po inkubácii s peptidom samotným sa nedala dokázať nijaká merateľná aktivita LDH.

b) Či ide o intemalizáciu peptidov značených s FITC v prítomnosti alebo neprítomnosti bázických aminokyselín, sa zisťovalo sa základe princípu opísaného autormi Midoux a spol., 1993: čiastočky internalizované bunkami sú transportované v endozómoch. V porovnaní s cytoplazmou alebo s médiom z bunkových kultúr, ktoré vykazujú neutrálne hodnoty pH, sú tieto organely s hodnotou asi pH 5 kyslé. Fluorescencia emitovaná prostredníctvom FITC je silne závislá od pH. V prostredí s hodnotami pH, aké sa nachádzajú v endozómoch, sa fluorescencia potláča. Preto vykazujú peptidy značené s FITC, ktoré sú prijaté bunkami do endozómov, zníženú fluorescenciu. Pridaním monensinu sa nízka hodnota pH endozómov neutralizuje, čo vedie k merateľne posilnenej fluorescencii intemalizovaných peptidov značených s FITC.

Bunky sa inkubujú so zmesou pozostávajúcou z polyarginínu (priemerná molekulová hmotnosť 100 000, dĺžka reťazca 490) a fluorescenčné značeného peptidu pri 4 °C alebo 37 °C. Alikvotná časť prób inkubovaných pri 37 °C sa zadržala a pred analýzou prietokovou cytometriou sa pri 4 °C vystavila účinkom 50 μΜ monensinu.

Ukázalo sa, že inkubácia APC s určitými bázickými polyaminokyselinami, ako je polylyzín (pLys) a polyarginín (pArg) posilňuje prijímanie prípadne väzbu peptidov na APC.

Ako vyplýva z obr. 13, v bunkách, ktoré boli ovplyvnené iba s peptidom a s monensinom, bol pozorovaný iba nepatrný nárast fluorescencie. Naproti tomu fluorescenčné signály v próbach, ktoré boli ovplyvnené monensinom a zmesou polyarginínu a peptidu, boli výrazne zvýšené. Nepozorovalo sa nijaké prijímanie peptidov v prípade, ak sa próby inkubovali pri 4 °C. Výrazný nárast fluorescencie po ovplyvnení monensinom poukazuje na to, že spojenie peptidov s pArg vedie k tomu, že tieto peptidy sa hromadia vo vezikulách vnútri bunky (Midoux a spol., 1993; obr. 13). Podľa očakávania sa po ovplyvnení polylyzínových prób monensinom pozoroval iba nepatrný nárast fluorescencie. Spojenie s polylyzínom pri 4 °C spôsobilo merateľný nárast fluorescencie, čo je ďalším dôkazom pre to, že účinok polylyzínu je spôsobený hlavne permeabilizáciou bunkových membrán (obr. 12b).

Príklad 11

Analýza spojenia APC s krátkymi peptidmi

APC získané pomocou GM-CSF pochádzajúce z kostnej drene sa analyzovali pod fluorescenčným mikroskopom pomocou kombinácie fluorescenčné značeného peptidu a polylyzínu (pL200; Sigma), alebo iba s peptidom. Pre mikroskopický dôkaz prijatia peptidu sa APC vysiali na podložné sklíčko a inkubovali sa so 40 pg fluorescenčné značeného peptidu LFEAIEGFI buď samostatne alebo so zmesou s 50 pg/ml polylyzínu (pL200) a 40 pg/ml peptidu LFEAIEGFI 30 minút pri 37 °C. Po dôkladnom premytí sa bunky fixovali 4 %-ným paraformaldehydom, pokryli sa s anti-fadentom (Dáko Glostrup, Dánsko) a vyhodnotili sa pod fluorescenčným mikroskopom (Zeiss). Bunkové jadrá boli ofarbené pomocou 4,6-diamidino-2-fenylindolu (DAPI; Sigma). Ako to vidieť na mikrofotografiách z fluorescenčného mikroskopu (obr. 14), vykazujú bunky, ktoré boli inkubované s peptidom a s polylyzínom (A), v porov naní s bunkami, ktoré boli ovplyvnené iba s peptidom (B), výrazne posilnené prijatie peptidu. Kým v bunkách, ktoré boli ovplyvnené iba s peptidom („pulzované“), sa fluorescencia zistila iba ojedinelo a v podobe čiastočiek, zatiaľ intenzívna fluorescencia buniek spojených s peptidom v prítomnosti polylyzínu sa nedala lokalizovať a bola v bunke rozložená rovnomerne.

Príklad 12

Kvantitatívne stanovenie spojenia buniek s peptidom prostredníctvom prietokovej cytometrie („transloading assay“)

a) Po tom, ako sa v pokusoch robených v príklade 11 ukázalo, že APC sú na spojenie s malými peptidmi vynikajúcimi cieľovými bunkami, urobili sa in vitro FACS testy, aby sa pre peptidovú vakcínu našli vhodné adjuvans. Tento test umožňuje rýchly kvantitatívny test fluorescenčné značených peptidov; ako modelový peptid sa použil peptid so sekvenciou LFEAIEGFI. V týchto pokusoch sa ako APC použila myšacia bunková línia P388D1. 1 x 10⁶ buniek sa inkubovalo vo finálnom objeme 1 ml média DMEM s vysokým obsahom glukózy a 10 % FCS počas 30 minút s 5 pg peptidu pri finálnej koncentrácii 5 nmol/ml. Bunky boli ovplyvnené buď iba samostatne s peptidom alebo s kombináciou peptidu a polykatiónov alebo peptidu a histónov pri stúpajúcej koncentrácii (3 až 50 pg/ml), ako to je uvedené na obr. 15. Použili sa nasledovné spojenia: A: polyomitín (priemerná molekulová hmotnosť 110 000, dĺžka reťazca 580); B: histón s bohatým obsahom arginínu; C: histón s bohatým obsahom lyzínu; D: polyarginín (priemerná molekulová hmotnosť 100 000, dĺžka reťazca 490); E: polylyzín (priemerná molekulová hmotnosť 94 000, dĺžka reťazca 450). V predbežných pokusoch sa zistilo, že maximálne prijímanie peptidu sa dosiahlo inkubačnou dobou 30 minút. Dlhšie ovplyvnenie (4 prípadne 8 hodín) už neviedlo k výraznejšiemu nárastu fluorescenčného signálu. Pred analýzou boli bunky 5 x premyté veľkým objemom PBS obsahujúcim 0,2 % BSA. Bunky sa opäť rozmiešali v 1 ml ľadového PBS/0,2 % BSA a analyzovali sa prietokovou cytometriou (FACScan; Becton Dickinson, San Jose, CA, USA).

Ukázalo sa, že polyarginín a polylyzín sú najúčinnejšími adjuvans; polyomitín mal za zvolených podmienok cytotoxický účinok. Posilnenie prijatia peptidov polyargininom a polylyzínom koreluje s koncentráciou (obr. 15d, e); prijímanie narastá s dĺžkou reťazca (obr. 16).

Bolo pozorované, že polyarginín s nárastom o tri rády oproti kontrole má širšie vhodné koncentračné rozpätie ako polylyzín, pri ktorom bol zistený maximálny nárast o menej ako dva rády, a že pri všetkých použitých dĺžkach reťazca je účinnejší na transport proteínov ako polylyzín (obr. 16): polyarginín umožňuje účinný transport aj pri takých nízkych koncentráciách, ako je 3 pg/ml, kým pre polylyzín boli potrebné koncentrácie nad 25 pg/ml na to, aby sa dosiahlo významné zvýšenie fluorescencie (obr. 15 d, e).

b) Na zistenie, či na transport peptidov existuje dolná hranica dĺžky reťazca, sa syntetizoval polyarginín s rôznou dĺžkou reťazca (10 až 30 zvyškov) a analyzovala sa jeho schopnosť zvýšiť transport peptidu pri vysokej koncentrácii polykatiónov (obr. 17). V týchto pokusoch sa použil peptid LFEAIEGFI, testované polyarginínové polyméry boli použité v koncentrácii 100 pg/ml.

Zvýšenie transportu peptidu, aj keď maličké, sa pozorovalo už pri najkratšom testovanom polyarginíne.

c) Bázické aminokyseliny sú kladne nabité molekuly. Dá sa preto predpokladať, že záporne nabité peptidy by sa mohli na tieto polykatióny naviazať pomocou elektrostatického vzájomného pôsobenia, čo možno vedie ku zvýšeniu prijímania peptidu. Na overenie tejto hypotézy sa porovnala schopnosť katiónových polyaminokyselín prijať krátke peptidy v závislosti od ich spojenia s bunkami P388D1. V nasledujúcej tabuľke sú uvedené použité záporne nabité peptidy, ktoré spĺňajú všetky podmienky potrebné pre väzbu MHC-I (Rammensee a spol., 1995). Peptid 1 je odvodený z myšacieho TRP („tyrosinase related proteín“, proteín príbuzný tyrozináze), peptid 2 pochádza z hemaglutinínu vírusu chrípky (Schmidt a spol., 1996), peptid 3 z myšacej tyrozinázy, peptid 4 z nádorového antigénu P198, peptid 5 z beta-galaktozidázy (Gavin a spol., 1993). („Mr“ znamená oblasť molekulárnej hmotnosti).

Tabuľka

Sekvencia	Mr	M'fluoresceínu	Spojenie	Spojenie + fluoresceín
YAEDYEEL	1031	1389	4 x záporné	6 * záporné
LFEAIEGFI	1038	1396	2 x záporné	4 * záporné
IFMNGTMSQV	1127	1485	neutrálne	2 x záporné
KYQAVTTTL	1024	1382	1 x kladné	1 x záporné
TPHPARIGL	S61	1319	2 x kladné	neutrálne

Na základe spôsobu použitého na značenie peptidu fluoresceínom sa zavádzajú dva negatívne spojenia. Ukázalo sa, že po inkubácii s polyarginínom sú do buniek P388D1 transportované najúčinnejšie peptidy (5 nmol/próba) s najvyšším počtom záporných nábojov, čo poukazuje na to, že iónové vzájomné pôsobenie medzi peptidom a polykatiónom ďalej zvyšuje transport peptidu do buniek (obr. 18). Ale v porovnaní s bunkami, ktoré boli ovplyvnené iba samotným peptidom, boli v prípade neutrálnych peptidov v prítomnosti polykatiónov prijaté väčšie množstvá. Ovplyvnenie samotným peptidom viedlo u všetkých testovaných peptidov k takmer zhodným fluorescenčným signálom; z dôvodov vyobrazenia sa na obr. 18 uvádza „samotný peptid“, čo znamená znázornenie fluorescenčného signálu získaného s peptidom LFEAIEGFI.

Literatúra

Alexander, J. a spol., 1989, Immunogenetics 29, 380 Allred, D. C. a spol., 1992, J. Clin. Oncol. 10 (4), 599-605 Avrameas, A. a spol., 1996, Eur. J. Immunol. 26,394-400 Behr, J. P., 1994, Bioconjug/Chem., sept.-okt„ 5 (5), 382-389

Bertoletti, A. a spol., 1994, Náture 369,407-410

Biológie Therapy of Cancer, zostavovatelia DeVita, V. T. Jr„ Hellman, S.Rosenberg, S. A., J. B. Lippincott Company, Philadelphia, New York, London, Hagerstown Blomberg, K. aUlfstedt, A. C., 1993, J. Immunol. Methods 160, 27-34

Boon, T., 1992, Adv. Cancer Res. 58,177-210 Boon, T., 1993, Spektrum der Wissenschaft (máj), 58-66 Boon, T. a spol., 1994, Annu. Rev. Immunol. 12, 337-365 Boon, T. a van der Bruggen, P., 1996, J. Exp. Med. 183, 725-729

Braciale, T. J. a Braciale, V. L., 1991, Immunol. Today 12, 124-129

Brocke, S. a spol., 1996, Náture 379 (6563), 343-346 Bronte, a spol., 1995, J. Immunol. 154,5282

Carrel, S. a Johnson, J. P., 1993, Current Opinion in Oncology 5, 383-389

Coligan, J. E. a spol., 1991, Náture 351,290-296

Coligan, J. E. a spol., 1991, Current Prot. in Immunol., Wiley, New York

Coulie, P. G. a spol., 1992, Int. J. Cancer 50, 289-297

Coulie, P. G. a spol., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA 92, 7976-7980

Coulie, P. G. a spol., 1994, J. Exp. Med. 180,35-42 Cox, A. L. a spol., 1994, Science 264, 5159, 716-719 Current Protocols in Molecular Biology, 1995, zostavovateľ: Ausubel F. M. a spol., John Wiley & Sons, Inc.

Dranoff, G. a spol., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 3539-3543

Dranoff, G. a Mulligan, R. C., 1995, Advances in Immunology 58, 417

Falk, K. a spol., 1991, Náture 351, 290-296

Felgner, J. H. a spol., 1994, J. Biol. Chem. 269,2550-2561 Feltkamp, M. C. a spol., 1995, Eur. J. Immunol. 24 (9), 2638-2642

Fenton, R. G. a spol., 1993, J. Natl. Cancer Inst. 85, 16, 1294-1302

Fisk, B. a spol., 1995, J. Exp. Med. 1881,2109-2117

Flow Cytometry, Acad. Press, Methods in Celí Biology, 1989, vol. 33, zostavovatelia Darzynkiewicz, Z. a Crissman, H. A.

Gedde Dahl, T. a spol., 1992, Hum. Immunol. 33, 4, 266-274

Grohmann, U. a spol., 1995, Eur. J. Immunol. 25, 2797-2802

Guarini, A. a spol., 1995, Cytokines and Molecular Therapy 1,57-64

Han, X. K. a spol., 1995, PNAS 92, 9747-9751

Henderson, R. A. a Finn, O. J., 1996, Advances in Immunology 62, 217-256

Hérin, M. a spol., 1987, Int. J. Cancer 39,390

Hock, H. a spol., 1993, Cancer Res. 53, 714-716

Houbiers, J. G. a spol., 1993, Eur. J. Immunol. 23, 2072-2077

Huang, A. Y. C. a Pardoll, D. M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9730-9735

Inaba, K. aspol., 1992, J. Exp. Med. 176, 1693-1702 Jung, S. a spol., 1991, J. Exp. Med. 173,1, 273-276

Kärre, K. a spol., 1986, Náture 319,20. feb., 675 Kawakami, Y. a spol., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,6458-6462

Kawakami, Y. a spol., 1994a, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91,9,3515-3519

Kawakami, Y. a spol., 1994b, J. Exp. Med. 180,1,347-352 Kawakami, Y. a spol., 1995, J. Immunol. 154, 3961-3968 Kersh, G. J. a spol., 1996, Náture 380 (6574), 495-498 Kovacsovics Bankowski, M. a Rock, K. L., 1995, Science 267,243-246

Lanzavecchia, A., 1996, Curr. Opin. Immunol. 8, 348-354 Lehmann, J. M. a spol., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 9891-9895

Lethe, B. a spol., 1992, Eur. J. Immunol. 22, 2283-2288

Li, H. a spol., 1989, J. Exp. Med. 169, 973-986

Lill, N. L., Tevethia, M. 1, Hendrickson, W. G. a Tevethia,

S. S., 1992, J. Exp. Med. 176, 449-457

Ljunggren, H. G. a spol., 1990, Náture 346,476-480 Loeffler, J.-P. a spol., 1993, Methods Enzymol. 217, 599-618

Lopez, J. A. a spol., 1993, Eur. J. Immunol. 23, 217-223 MacBroom, C. R. a spol., 1972, Meth. Enzymol. 28, 212-219

Mackiewicz, A. a spol., 1995, Human Gene Therapy 6, 805-811

Malnati, M. S. aspol., 1995, Science 267, 1016-1018 Mandelboim, O. a spol., 1994, Náture 369, máj 5, 67-71

Mandelboim, O. a spol., 1995, Náture Medicíne 1, 11, 1179-1183

Marchand, M. a spol., 1995, Int. J. Cancer 63, 883-885 Mclntyre, C. A. a spol., 1996, Cancer Immunol. Immunother. 42, 246-250

Midoux, P. a spol., 1993, NATO ASI Šerieš H67, 49-64 Morishita, R. a spol., 1993, J. Clin. Invest. 91, 6, 2580-2585

Nabel, G. J. a spol., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11307-11311

Noguchi, Y. a spol., 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3171-3175

Oettgen, H. F. a Old, L. J., 1991, Biológie Therapy of Cancer, zostavovatelia: DeVita, V. T. Jr., Hellman, S., Rosenberg, S. A., J. B. Lippincott Company, Philadelphia, New York, London, Hagerstown, 87-119

Ostrand-Rosenberg, S., 1994, Current Opinion in Immunology 6, 722-727

Pardoll, D. M., 1993, Immunology Today 14, 6, 310 Peace, D. J. a spol., 1991, J. Immunol. 146, 6, 2059-2065 Peoples, G. E. a spol., 1994, J. Immunol. 152, 10, 4993-4999

Plautz, G. E. a spol., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 4645-4649

Porgador, A., Gilboa, E., 1995, J. Exp. Med. 182, 255-260 Practical Immunology, zostavovatelia: Leslie Hudson a Frank C. Hay, Blackwell Scientific Publications, Oxford, London, Edinburgh, Boston, Melboume

Príručka: FACS Vantage™ User’s Guide, apríl 1994, Becton Dickinson

Príručka: CELL Quest™ Softwarc User’s Guide, jún 1994, Becton Dickinson

Puccetti, P. aspol., 1995, Eur. J. Immunol. 24,1446-1452 Rammensee, H. G. a spol., 1993, Annu. Rev. Immunol. 11, 213-244

Rammensee, H. G. a spol., 1993, Current Opinion in Immunology 5, 3-44

Rammensee, H. G. a spol., 1995, Current Biology 7, 85-96 Rammensee, H. G., 1995, Current Opinion in Immunology

7, 85-96

Rammensee, H. G. a spol., 1995, Immunogenetics 41, 178-228

Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18. vydanie 1990, Mack Publishing Company, Easton, Penn. 1990

Remy, J. S. a spol., 1994, Bioconjug/Chem., nov.-dec., 5 (6), 647-654

Rennie, J. a Rusting, R., 1996, Scientific Američan, sept., 28-30

Rivoltinin, L. a spol., 1995, J. Immunol. 154, 2257-2265 Robbins, P. F. a spol., 1994, Cancer Res. 54, 3124-3126 Robbins, P. F. a spol., 1995, J Immunol. 154, 5944-5950 Robbins, P. F. a Rosenberg, S. A., 1996, J. Exp. Med. 183, 1185-1192

Robbins, P. F. a Kawakami, Y. 1996, Curr. Opin. Immunol

8, 628-636

Roitt, 1. M., Brostoff, J., Malé, D. K., Immunology, Churchill Livingstone

Rosenberg, S. A., 1996, Annual Reviews of Medicíne, 47, 481-491

Ryser, H. J. a Hancock, R., 1965, Science 150, 501-503

Ryser, H. I. a Shen, W. C., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3867-3870

Schmidt, W. a spol., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 4711-4714

Schmidt, W. a spol., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9759-9763

Sette, A. a spol., 1994, Mol. Immunol. 31 (11), 813-822

Shen, W. C. a Ryser, H. J., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 1872-1876

Shen, W. C. a Ryser, H. J., 1979, Mol. Phrmacol. 16, 614-622

Shen, W. C. a Ryser, H. J., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78,7589-7593

Skipper, J. a Stauss, H. J., 1993, J. Exp. Med. 177, 5, 1493-1498

Slingluff, C. L. a spol., 1994, Current Opinion in Immunology 6, 733-740

Stein, D. a spol., 1994, EMBO Joumal 13, 6, 1331-1340 Stuber, G. a spol., 1994, Eur. J. Immunol. 24, 765-768 Sykulev, Y. a spol., 1994, Immunity 1, 15-22 Theobald, M., Levine, A. J. a Sherman, L. A., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 11993-11997

Tibbets, L. M. a spol., 1993, Cancer, jan. 15, vol. 71, 2, 315-321

Tykocinski, M. L. a spol., 1996, Am. J. Pathol. 148, 1-16 van der Bruggen, P. a spol., 1994, Eur. J. Immunol. 24, 9, 2134-2140

Van der Eynde, B. a Brichard, V. G., 1995, Current Opinion in Immunology 7, 674-681

Van Pel, A. a Boon, T., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79,4718-4722

Van Pel, A. a spol., 1995, Immunological Reviews 145, 229-250

Vitiello, A. a spol., 1995, J. Clin. Inv. 95, 1,341-349 Wagner, E. a spol., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 3410-3414

Wagner, E. a spol., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 6099-6103

Wang, R. F. a spol., 1995, J. Exp. Med. 181, 799-804 Weynants, P. a spol., 1994, Int. J. Cancer 56, 826-829 Widmann, C. a spol., 1992, J. Immunol. Methods 155 (1), 95-99

Wolfel, T. a spol., 1994a, Int. J. Cancer 57,413-418 Wolfel, T. a spol., 1994b, Eur. J. Immunol. 24, 759-764 York, I. A. a Rock, K. L., 1996, Ann. Rev. Immunol. 14, 369-396

Yoshino, I. a spol., 1994a, J. Immunol. 152, 5, 2393-2400 Yoshino, I. a spol., 1994b, Cancer Res. 54, 13, 3387-3390 Young, J. W., Inaba, K., 1996, J. Exp. Med. 183, 7-11 Zatloukal, K. a spol., 1993, Gene 135, 199-220 Zatloukal, K. a spol., 1995, J. Immunol. 154, 3406-3419

Claims (33)

1. Farmaceutický prostriedok, obsahujúci aspoň jeden imunomodulačnc pôsobiaci pcptid, protcín alebo proteínový fragment spolu s adjuvans, vyznačujúci sa tým, že adjuvans má schopnosť zvyšovať naviazanie peptidu prípadne proteínu alebo proteínového fragmentu na bunky liečeného jedinca, prípadne vstup do buniek, a má schopnosť posilniť imunomodulačný účinok peptidu prípadne proteínu alebo proteínového fragmentu.

2. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, vyzná č u j ú c i sa tým, že peptid, prípadne bunkový produkt rozkladu proteínu alebo proteínového fragmentu je ligandom aspoň pre jednu molekulu MHC, ktorú liečený jedinec exprimuje.

3. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 2, v y značujúci sa tým, že peptid, prípadne bunkový produkt rozkladu proteínu alebo proteínového fragmentu je ligandom pre molekulu MHC-I.

4. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 2, v y značujúci sa tým, že peptid prípadne bunko vý produkt rozkladu proteínu alebo proteínového fragmentu je ligandom pre molekulu MHC-II.

5. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov vyznačujúci sa tým, že peptid je odvodený z proteínu patogénu.

6. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 5, vyzná í u j ú c i sa tým, že peptid je odvodený z bakteriálneho proteínu.

7. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 5, vyzná J u j ú c i sa tým, že peptid jc odvodený z vírusového proteínu.

8. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z nárokov 1 až 4 na použitie ako protinádorová vakcína, vyznačujúci sa tým, že proteín je nádorový antigén prípadne proteínový fragment alebo peptid prípadne peptidy sú odvodené z nádorového antigénu (antigénov).

9. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 8 na terapeutické použitie, vyznačujúci sa tým, že nádorový antigén prípadne nádorové antigény sú odvodené z nádorových antigénov, ktoré liečený jedinec exprimuje.

10. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 8 na profylaktické použitie, vyznačujúci sa tým, že nádorové antigény sú odvodené zo zástupcov často sa vyskytujúcich nádorových antigénov.

11. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z nárokov 8ažl0, vyznačujúci sa tým, že nádorový antigén prípadne antigény sú antigénmi melanómu.

12. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z nárokov 8 až 11, vyznačujúci sa tým, že obsahuje cytokín.

13. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 12, v y značujúci sa tým, že cytokín sa volí zo skupiny IL-2, IL-4, IL-12, IFN-a, IFN-β, IFN-γ, IFN-ω, TNFa, GM-CSF alebo ich zmesí.

14. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z nárokov 2 až 11, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že obsahuje viacero peptidov, ktoré sa líšia tým, že sa viažu na rôzne MHC podtypy liečeného jedinca.

15. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z nárokov 2až 14, vyznačujúci sa tým, že obsahuje jeden alebo viacero peptidov, ktoré sú odvodené z prirodzene sa vyskytujúceho imunogénneho proteínu alebo nádorového antigénu prípadne z jeho bunkového produktu rozkladu.

16. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z nárokov 2až 14, vyznačujúci sa tým, že obsahuje jeden alebo viacero peptidov, ktoré sa odlišujú od peptidov, ktoré sú odvodené od prirodzene sa vyskytujúceho imunogénneho proteínu (proteínov) alebo nádorového antigénu (antigénov), prípadne z ich bunkového produktu (produktov) rozkladu.

17. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 1, v y značujúci sa tým, že peptid je antagonistom peptidu, ktorý je odvodený z proteínu, spôsobujúceho autoimúnnu chorobu.

18. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z predchádzajúcich nárokov, vyznačujúci sa t ý m , že adjuvans je organický polykatión alebo zmes organických polykatiónov.

19. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 18, vyzná č uj ú c i sa tým, že peptid je záporne nabitý·

20. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 18 alebo 19, vyznačujúci sa t ý m , že adjuvans je bázická polyaminokyselina alebo zmes bázických polyaminokyselín.

21. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 20, v y z n a t u j ú t i sa tým, že adjuvans je polyarginín.

22. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 20, v y z n a ť u j ú c i sa tým, že adjuvans je polylyzin.

23. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z nárokov 18 až 21, v y z n a č u j ú c i sa t ý m , že adjuvans je konjugovaný s bunkovým ligandom.

24. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 23, v y z n až u j ú c i sa tým, že ligandom je uhľohydrátový zvyšok.

25. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 24, v y z n a ť u j ú t i sa tým, že ligandom je fukóza.

26. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 23, v y z n a č u j ú c i sa tým, že ligandom je transferín.

27. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z nárokov 18až 26,vyznačujúci sa tým, že obsahuje okrem toho DNA, ktorá neobsahuje sekvencie kódujúce funkčné proteíny.

28. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z nárokov 18až 26, vyznačujúci sa tým, že obsahuje DNA, ktorá kóduje imunomodulačný proteín.

29. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 28, v y značujúci sa tým, že imunomodulačným proteínom je cytokín zo skupiny IL-2, IL-4, IL-12, IFN-a, IFN-β, IFN-y, IFN-ω, TNF-a, GM-CSF.

30. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z nárokov laž 29, vyznačujúci sa tým, že je vo forme na parenterálne podanie.

31. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 30, v y značujúci sa tým, že je vo forme roztoku alebo suspenzie peptidu a adjuvans vo farmaceutický prijateľnom nosiči.

32. Farmaceutický prostriedok podľa niektorého z nárokov 1 až 29, v y z n a č u j ú c i sa t ý m, že je vo forme na topické podanie.

33. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 32, v y značujúci sa t ý m , žeje vo forme hydrogélu.