CN1103431A - 测定富集于肿瘤反兴性细胞中的淋巴结的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及测定富集于肿瘤反应性细胞中的淋 巴结的方法。该方法包括给患者施用有效量的放射 性标记的定位剂，该定位剂特异性地与由瘤组织产生 的或与之相关的一个标志相结合。然后，通过用放射 检测探针检测淋巴结位点处提高的辐射水平而确定 显示有合生了放射性标记定位剂的淋巴结位点，从而 用该探针接近病人(优选用外科手术)，取出显示有辐 射水平提高的淋巴结位点并进行肉眼观察分析或组 织学分析。然后选择出肉眼观察无肿瘤组织或可转 移疾病的淋巴结进行培养，目的是激增肿瘤反应性细 胞，使其成为治疗癌症的有效治疗剂。

Description

本发明涉及测定富集于肿瘤反应性细胞中的淋巴结的方法，和这些淋巴结的增殖及其在适于采用的细胞治疗中的应用。

本发明中将使用下列缩写：

LNL  淋巴结淋巴细胞

PBL  外周血淋巴细胞

TIL  肿瘤侵润性淋巴细胞

LAK  淋巴因子激活的杀伤细胞

IL-2  白细胞介素-2

抗-CD₃抗-CD₃单克隆抗体

CC49  CC49单克隆抗体

TAG  肿瘤相关性糖蛋白

Auto  自体的

Allo  异源的

Glio  人工培养的人神经胶质瘤细胞系

CAR1  人类癌瘤肿瘤

CEA  癌胚抗原

MoAB  单克隆抗体

BSM  牛下颌粘液

PBMC  外周血单核细胞

WD124  人工培养的人结肠癌细胞系

大约有50%的确诊为结肠直肠癌的患者将发展为结肠或直肠外的转移性疾病。这些患者中大多数人在进行辅助外科手术后不能痊愈，因为疾病不仅是肝内的也是肝外的。需要其它的治疗方法以提高患有这种疾病的病人的存活性。

适于采用的免疫治疗法为癌症治疗提供了一种吸引人的治疗模式。Rosenberg等人利用淋巴因子如白细胞介素2（IL-2）以及来源于患者外周血的淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）证明，占少量但却是重要的百分比的患有黑素瘤和肾细胞癌的患者获得了长期持久的反应。Rosenberg等人，“Adoptive Cellular Therapy：Clinical Applications”，Biologic Therapy of Cancer，Devita，etal.（Eds.），J.B.Lippincott Company，Philadelphia，Pa.，1991。第二种适于采用的免疫治疗的途径是从人工培养肿瘤扩展淋巴细胞。Rosenberg，“Adoptive Cellular Therapy：Clinical Applications”，Biologic Therapy of Cancer，Devita，et al.，（Eds），J.B.Lippincott Compary，Philadelphia，Pa.，P.241（1991）;Topalian，et al.“Tumor Infiltrating Lymphocytes：Evidence of Specific Immune Reactions Against Growing Cancers in Mice and Human”，Important Advances in Oncology 1990，DeVita，et al，（Eds），J.B.Lippincott Company，Philadelphia，Pa.，P.19（1990），and Rosenberg;et al.，“Use of Tumor-Infiltrating Lymphocytes and Interleukin-2 in the Immuno-therapy of Patients with Metastatic Melanoma”，N.Engl.J.Med.，25：1671，1988。利用这些肿瘤侵润性淋巴细胞（TIL），几个研究者已提供文件证明这些TIL细胞比LAK细胞具更优越的肿瘤细胞裂解活性以及更好地运输到肿瘤。Rosenberg et al.，N.Engl.J.Med.，id.;Dillman，et al.，“Continuous Interleukin-2 and Tumor-Infiltrating Lymphocytes as Treatment of Advanced Melanoma”，Cancer，68∶1，1991;Kradin，et al.，“Tumor-Infiltrating Lymphocytes in Interleukin-2 in Treatment of Advanced Cancer”，Lancet，33∶577，1989;and Bukowski，et al.，“Clinical Results and Characterization of Tumor-Infiltrating Lymphocytes with or without Recombinant Interleu-kin-2 in Human Metastatic Renal Cell Carcinoma”，Cancer Res.51∶4199，1991。总之，这些TIL细胞对患有黑素瘤的病人显示有治疗效果。已从许多固态肿瘤，包括结肠和乳腺癌中繁殖出肿瘤侵润性淋巴细胞;但是，在体外这些细胞并不显示出传递肿瘤特异性细胞裂解活性，并且这些细胞是否在适于采用的免疫治疗模型中有效还有待测定。Rosenberg，“Gene Therapy of Cancer”，Important Advances in Oncology，1992，DeVita，et al.（Eds），J.B.Lippincott Co.，New York，NY，pp 17-18，1992。

另一条用肿瘤特异性淋巴细胞进行肿瘤治疗的令人振奋的途径是替代能够定点地将细胞因子释放到肿瘤上的细胞中的细胞因子基因。Kasid，et al.，“Human Gene Transfer：Characterizationof Human Tumor Infiltrating Lymphocytes as Vehicles for Retroviral-Mediated Gene Transfer in Man”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87∶473-477，1990;and Rosenberg，et al.，“Gene Transfer into Humans：Immunotherapy of Patients with Advanced Melanoma Using Tumor Infiltrating Lymphocytes Modified by Retroviral Gene Transduction”，New Engl.J.Med.，323∶570-578，1990。已在几个模型系统中证实，已感染了各种细胞因子基因包括IL-2、γ-干扰素以及肿瘤坏死因子（TNF）的肿瘤细胞比没有产生细胞因子的亲本细胞更具免疫原性以及更小的致瘤性。Gansbacher，et al.，“Retroviral Vector-Mediated Gamma Interferon Gene Transfer into Tumor Cells Generates Potent and Long Lasting Antitumor Immunity”，Cancer Res.50∶7820-7825，1990;Gansbacher，et al.，“Interleukin 2 Gene Transfer into Tumor Cells Abrogates Tumorigenecity and Induces Protective Immunity”，J，Exp.Med.，172∶1217-1224，1990;and Blankenstein，et al.，“Tumor Suppression after Tumor Cell-Targeted Tumor Necrosis Factor-Alpha Gene Transfer”，J.Exp.Med.173∶1047-1052，1991。这将暗示在肿瘤细胞附近定位地产生细胞因子对抑制肿瘤生长和刺激免疫应答产生有利的影响。的确，发现能识别肿瘤的并且能分泌各种应答肿瘤的细胞因子的淋巴细胞，并将这些细胞用于适于采用的免疫治疗中将是十分有用的。最后，已证明，尽管某些TIL细胞在体外并不显示有直接的肿瘤细胞毒性作用，但这些能分泌γ-干扰素和TNF-α的TIL细胞在体内能介导使肿瘤退化的作用。Barth et al.，“Inerferon-Gamma andTumor Necrosis Factor Have a Role in Tumor Regression Mediated by Murine CD₈+Tumor-Infiltrating Lymphocytes”，J.Exp.Med.，173∶647，1991。

由于存在着包括从大多数固体肿瘤如乳腺和结肠直肠癌获得TIL细胞的难度，在这些条件下扩展的淋巴细胞类型，以及产生TIL细胞所需的培养时间长几个问题，使得该途径不能广泛地应用于抑制大多数的肿瘤。肿瘤淋巴细胞的另一个来源是淋巴结。在几个实验室中已证明在来自患有胸腺、头和颈，胰和结肠的癌症患者的局部淋巴结中的肿瘤特异性免疫应答。Hoover，et al.，“Activation and In Vitro Expansion of Tumor-Reactive T Lymphocytes from Lymph Nodes Draining Human Prinmary Breast Cancers”，J.Surg.Oncol.，46∶117，1991;Cozzolino，et al.，“Characterization of Cells from Invaded Lymph Nodes in Patients with Solid Tumors，Lymphokine Requirement for Tumor-Specific Lymphoproliferative Response”，J.Exp.Med.，166∶303，1987;Barnd，et al.，“Specific，Major Histocompatibility Complex-Unrestricted Recognition of Tumor-Associated Mucins by Human Cytotoxic T-Cells”，Proc.Nat.Acad.Sci，USA，86：7159-7163，1989;and Vose，et al.，“Tumor Reacting Lymphocytes Stimulated in Mixed Lymphocyte and Tumor Culture”，Cancer Immunol.and Immunother.，15∶227-236（1983）。在试验动物模型中，已证明局部淋巴结含有肿瘤特异性前效应子细胞，当体外扩展这些细胞时，它们能清除试验转移瘤。Yoshizawa，et al.，“Activation by Anti-CD₃of Tumor-Draining LymphNode Cells for Specific Adoptive Immunotherapy”，Cell Immunol.，134∶473，1991;and Yoshizawa et al.，“Specific Adoptive Immunotherapy Mediated by Tumor-Draining Lymph Node Cells Sequentially Activated by Anti-CD₃and IL-2”，J.Immunol∶147∶729，1991。在动物模型中，淋巴结移走的时间的选择以及原始肿瘤的大小是关系到能否检测前效应子淋巴细胞的关键因素。Yoshizawa，et al.，“Activation by Anti-CD₃of Tumor-Draining Lymph Node Cells for Specific Adoptive Immunotherapy，见上文：and Sakai，et al.，“Phenotype Analysis in Cellular Mechanisms of Pre-Effector T-Lymphoctye Resp-onse to a Progressive Syngeneic Murine Sarcoma”，Cancer Res.，50∶4371-4376，1990。在没有刺激肿瘤情况下通过利用抗-CD₃和IL-2也可以在体外扩展这些淋巴细胞。如果在人体中鉴别，前效应淋巴细胞可能是潜在地用于适于采用的免疫治疗的有价值的细胞。在人体中，选择可靠的含有肿瘤特异性免疫应答的淋巴结是困难的，因此限制了将淋巴结淋巴细胞（LNL）用作为肿瘤特异性适于采用的免疫治疗源的能力。

上述的参考说明书仅引入本文作参考。

广泛地讲，本发明的一个方面是涉及可靠地测定富集在肿瘤反应性细胞，例如CD4+肿瘤特异性淋巴细胞，常称为T-辅助细胞或T-辅助淋巴细胞中的淋巴结的方法。该方法包括给患者施用有效量的放射性标记的定位器的步骤，该定位器能特异性地结合一个由瘤组织如癌产生或与之相关的一个标记物。然后，给予一段在给药后放射性标记的定位器优先在瘤组织中聚集的时间以及清除未结合的放射性标记的定位器的时间，以便增加患者瘤组织的光发射与背景光发射的比例。在这一时间过去后，用一放射性检测探针检测淋巴结位点中放射的增加量，而测定出显示有合生了放射标记的定位器的淋巴结位点，从而对患者进行评估（例如，较好的是，通过外科手术;注意，使用Laproscope是不切实际的，尽管这种仪器的使用不排除于本发明中）。然后移走发射量显示出增加的淋巴结位点，并且进行粗略的肉眼观察分析，尽管可将这些位点换另一种可选择方法或再用另一方法进行组织学分析，例如苏木精和曙红（H&E）组织学估价。

然后筛选那些经过测定并且移走了的淋巴结，所述淋巴结也已经通过粗略的观察测定是没有肿瘤的或没有粗略的瘤疾病的（即，肉眼观察正常，但可以摄取抗体的那些淋巴结），培养它们以增殖肿瘤反应性细胞，例如本文中肿瘤特异性T淋巴细胞。如果将这些淋巴结位点进行组织学分析，筛选出那些经H&E测定是组织学阴性的位点进行扩展。然后将选出淋巴结进行促有丝分裂刺激。然后较好的是在例如白细胞介素-2（IL-2）和抗-CD₃单克隆抗体，以及选择性地采用自体或异源肿瘤的瘤组织存在下培养淋巴结。然后根据适于采用的免疫治疗制度可将经过增殖的肿瘤反应性细胞例如，T淋巴细胞用于缓和（减轻）肿瘤的级别。在癌症的治疗中经过扩展或增殖的肿瘤反应性细胞，例如T淋巴细胞，是有效的治疗剂。

最近，有人认为CD4+肿瘤特异性淋巴细胞与由有创造力的治疗剂显示的治疗效果相关，尽管这并没有被证明。被移走的淋巴结其特点一定在于CD4+肿瘤特异性淋巴细胞含量，不论这些淋巴细胞是否能显著地减轻肿瘤级别。选择“肿瘤反应性细胞”术语用于描述在扩展的移走的淋巴结中存在的活性细胞（在减轻肿瘤级别中的活性）。尽管这些“活性细胞”被认为含有CD4+肿瘤特异性淋巴细胞，但本发明并不限于此。

本发明的优点包括用确实在胆瘤反应性细胞例如，CD4肿瘤特异性淋巴细胞中富集的特定的淋巴结进行选择的能力。另一优点是通过淋巴结切除术从患者中除去病变组织的能力。本发明的另一优点是扩增包括T淋巴细胞的肿瘤反应性细胞，以便利地形成一种体内减轻肿瘤级别的治疗剂。根据本发明中公开的说明书本领域技术人员很容易明白这些和其它优点。

图1图示出在IL-2和由[³H]胸腺嘧啶掺入法测定的各种浓度的抗-CD₃存在下在加了自体（辐射的）肿瘤的混合性肿瘤淋巴细胞培养物中扩增Ⅰ型LNL。该数据显示于表2中。在96孔平板上用从新生肿瘤分离出的自体（Auto）或异源（Allo）结肠癌细胞，或自体或异源PBL（5×10³个细胞，用4000拉德辐射过）培养的LNL（10⁴个细胞）。四天后加入[³H]胸腺嘧啶（1μCi/孔）并且在18小时后收集平板，利用液体闪烁计数器测定胸腺嘧啶掺入量。所有培养孔含有20μ/ml IL-2。单独用肿瘤培养LNL，用仅带有生长因子的肿瘤细胞培养LNL，或仅培养LNL不发生增殖。

图2图示出IL-2和抗CD₃与IL-2对Ⅰ型LNL在混合的肿瘤淋巴细胞培养中的刺激作用的比较结果。该数据显示于表3中。在各种浓度的单独IL-2，或IL-2（20μ/ml）和抗-CD₃（50ng/ml）存在下将Ⅰ型LNL（10⁴个细胞）与经辐射的自体肿瘤（5×10³）一起培养。在96小时后用[³H]胸腺嘧啶使培养物博动，18小时后收获。通过液体闪烁计数器测定细胞数。

图3图示出Ⅲ型LNL的混合肿瘤淋巴细胞培养物。该数据也显示于表4。LNL（10⁴个细胞）是在自体或异源（5×10³，4000拉德）的人结肠癌细胞和IL-2（20μ/ml）以及各种浓度的抗-CD₃存在下培养96小时。在加入[³H]胸腺嘧啶（1μCi/孔）后18小时收集细胞，并且通过液体闪烁计数器测定胸腺嘧啶的掺入量。

图4图示出O型LNL的混合肿瘤淋巴细胞培养。该数据也显示于表5中。LNL（10⁴/孔）分别与自体或异源人结肠癌细胞（5×10³/孔，4000拉德），以及与20μ/ml IL-2和各种浓度的抗-CD₃一起培养96小时。96小时后加入[³H]胸腺嘧啶（1μCi/孔），并且在18小时后收集平板，通过液体闪烁计数器测定胸腺嘧啶的掺入量。

图5图示出来自同一患有结肠直肠癌的患者的Ⅰ型LNL和O型LNL的比较。该相同的数据也图示于表4中。Ⅰ型和O型LNL（10⁴/孔）都是在自体结肠癌细胞（5×10³/孔，4000拉德）以及20μ/ml IL-2以及抗-CD₃（50ng/ml）存在下培养96小时。96小时后加入[³H]胸腺嘧啶1μCi/孔并在18小时后收集平板。

图6图示出Ⅰ型和Ⅲ型脾细胞的混合肿瘤淋巴细胞培养物。该同样数据也显示于表6中。脾细胞（10⁴个细胞/孔）是在自体或异源结肠癌细胞（5×10³个/孔，经辐射的细胞）存在下培养96小时。至于Ⅲ型脾细胞情况，使用两种异源肿瘤。所有培养物都含有20μ/ml IL-2以及各种浓度抗-CD₃。在96小时后，加入[³H]胸腺嘧啶1μCi/孔，并且在18小时后收集平板，测定胸腺嘧啶的掺入量。

图7图示出各种肿瘤对Ⅰ型LNL在混合肿瘤淋巴细胞培养中的刺激作用的比较结果。该同样数据也显示于表6。在几种肿瘤（5×10³/孔，经辐射的细胞），包括自体结肠癌细胞，人工培养的人神经胶质瘤（Glio）细胞系，从进行肝移植的患者中新鲜收集的人类癌（CAR1）肿瘤，人工培养的结肠癌细胞系（WD 124），以及含有IL-220μ/ml和抗-CD₃（50 ng/ml）的自体PBL＇s存在下复合培养来自Ⅰ型淋巴结的LNL（10⁴/孔）。96小时后加入[³H]胸腺嘧啶（1μCi/孔）并且在18小时后收集细胞。通过液体闪烁计数法测定[³H]胸腺嘧啶的掺入量。没有生长因子的肿瘤培养的LNL，或只有生长因子的肿瘤培养物并不刺激增殖。LNLs是仅用IL-2（20μ/ml）和抗-CD₃（50ng/ml）培养的Ⅰ型。

图8图示出由在两套不同的促有丝分裂刺激条件下培养的经扩增的LNL细胞或在自体肿瘤或异源肿瘤存在时培养的经扩增的LNL细胞产生的肿瘤坏死因子（TNF）。

图9图示出第10天时在IL-2（100U/ml）加抗-CD₃抗体（0.1μg/ml）存在时定位培养的细胞因子mRNA的表达。通过逆转录以及用聚合酶链反应（PCR）扩增cDNA而分析细胞因子mRNA。道M＝123bp分子量梯（Gibco/BRL）。

图10图解显示在已经接收了新的治疗剂后存活的患者的百分数相对于治疗剂给药后时间（月数）的关系。

图表中报道的试验结果将在下面详细讨论。

直到最近，对患病（例如携带肿瘤）的淋巴结的体内筛选只限于外科医生的肉眼观察选择以及病理学家的诊断。Nieroda，etal.，“Radioimmunoguided Surgery（RIGS）in Recurrent Colorectal Cancer”，Cancer Detection and Prevention，Vol.14，Issue 6，pages 651-656（1990），以及“Radioimmunoguided Surgery in Primary Colon Cancer”，Cancer Detection and Prevention，Vol.15，Issue 3，Pages 225-229（1991）公开了探查患有瘤组织的病人的方法，该方法是采用Radioimmunoguided Surgery^TM系统，利用Neoprobe

ROGS

γ检测探针（Radioimmunoguided Surg-ery^TM是商标，Neoprobe

和RIGS

是Neoprobe公司，Columbus，Ohio的注册商标）进行的。由该系统测定的淋巴结含量使外科医生和/或肿瘤学家可能大约地估测患者的发病期，例如着重地对患者进行辅助的化学治疗。

这种分析阶段方法的产生是基于美国专利4，782，840（该公开内容全部引入本文作参考），该专利公开了一种更加改善的用于定位测定、分化和切除肿瘤的方法。该技术利用放射性标记的抗体和外科医生可以在手术中利用的可移动的放射检测探针，从而检测出放射性增加的位点。该方法被称作RIGS

系统，并且是成功的，因为认识到肿瘤检测应该延迟到参与循环的放射性标记的抗体的血库背景有机会从体内清除，以便使肿瘤发射出的光发射或辐射与环境组织相比得到增强。幸运的是，4，782，840号专利公开了放射性标记的抗体能够保留束缚至或结合至瘤组织上更长的时期，在该时期内仍束缚着放射性残迹。并且，即使肿瘤位点的放射活性在整个时期内降低，血库背景和环境组织（相对于肿瘤位点）也会以更大的速率降低，从而可以利用手操作探针，如一种Neoprobe

RIGS

1000放射性检测器容易地测定放射性位点。

使用带有Neoprobe RIGS 1000放射性检测器和¹²⁵ⅠCC49单克隆抗体的＇840专利的RIGS

系统，已经鉴定了淋巴结并且有独创性地将它分为五个类别。最近的工作表明为了筛选出适于扩增和形成能减轻肿瘤级别的治疗剂并不必需要这种外延的分类。如果下列的某些讨论涉及这种有独创性的淋巴结的分类，应理解实施本发明并不必需要使用这样一种分类系统。早期产生的分类系统列于下面表1中。

表1

淋巴结类别

O型 RIGS 探针(-),组织学(-)

I型 RIGS

探针(+),组织学(-)

II型 RIGS 探针(+),显示有隐藏肿瘤

III型 RIGS 探针(+),常规组织学(+)(肉眼观察)

IV型 RIGS 探针(-),常规组织学(+)(肉眼观察)

O型淋巴结没有可检测的放射性活性，也没有肿瘤的组织学特征。Ⅰ型淋巴结呈放射性阳性，但常规H&E组织学检测为阴性;Ⅱ型淋巴结呈放射性阳性，并且含有隐藏肿瘤的迹象。Ⅲ型淋巴结呈放射性阳性并且含有肿瘤的组织学迹象。Ⅳ型淋巴结呈放射性阴性并且含有肿瘤迹象。

从解剖学上说，大多数Ⅰ型淋巴结存在于外周淋巴结、腹腔淋巴结以及胰上的主动脉淋巴结。在患有初发的结肠直肠癌的患者中，约30%的引流局部结肠的肠系膜的结是Ⅰ型。大部分的Ⅲ型和Ⅳ型淋巴结存在于肿瘤附近的结肠肠系膜。如果采用一系列切片法或细胞角蛋白抗体进一步分析Ⅰ型淋巴结，发现约40%的Ⅰ型淋巴结有肿瘤迹象，因此它们实际上是Ⅱ型淋巴结。为了达到本发明目的，采用H&E组织学法测定Ⅰ型淋巴结，筛选这些淋巴结进行培养以增殖肿瘤反应性细胞，例如，CD4+T淋巴细胞。但是较好的是，将明显的Ⅰ型淋巴结进行一系列切片分析或细胞角蛋白抗体分析以重新确定组织学分析为阳性并且因而含有隐藏肿瘤的那些淋巴结的类型，实际上这样的淋巴结属于Ⅱ型。因此，用几乎不带有或完全不带有肿瘤的LNL进行培养以增殖CD4+肿瘤特异性淋巴细胞。对涉及淋巴结类别的进一步的讨论见于Arnold等人，“Radioimmunoguided Surgery Challenges Traditional Decision Making in Patients with Primary Colorectal Cancer”，Surgery.Vol.112，No.4，pp 624-630（October 1992）;and Arnold等人，“Intraoperative Detection of Colorectal Cancer with Radioimmunoguided Surgery and CC49，a Second-Generation Monoclonal Antibody”，Annals of Surgery，Nol.216，No.6，627-632（December 1992），所有公开内容引入本文作为参考。

本发明方法的第一个步骤包括给患者施用有效量的放射性标记的定位器，该定位器特异性地结合一种由瘤组织产生或与瘤组织相关的标志物。如上所述，该“定位器”包括一种物质，该物质通过与一种由瘤组织或肿瘤产生的或与之相关的标志物（例如癌细胞或癌细胞的产物）相结合而优先在肿瘤位点聚集。如今合适的定位器主要包括抗体（完全和单克隆）、抗体片段、完全抗体与抗体片段的嵌合形式，以及其人性化形式。但是，应该意识到已经产生了的单链抗体（SCAs，如在美国专利4，946，778中公开的）及其类似物质，同样可以证明是有效的。利用生物化学和遗传工程技术还可以产生能模拟抗体的选择性地聚集在瘤组织位点处的功能的物质（可能是激素，肽以及其它蛋白质等），尽管不能把这些物质归入传统定义的“抗体”一类。选择“定位器”术语包括本发明的抗体及其类似物，以及那些在本发明公开的方法中被测定的具有模拟抗体功能的物质。

目前，在本发明中使用的抗体包括抗-TAG抗体，例如B72.3（一种抗-TAG 72抗体，Dr.Jeffrey Schlom，National Cancer Institute），CC49（一种第二代B72.3抗体，参见Arnold等人，“Intra-operative Detection of Colorectal Cancer with Radioimmuno-guided Surgery^TM（RIGS

）and CC49 a Second-Generation Monoclonal Antibody （Mab）”Ann Surg.，accepted for publication，Cancer Res.50，6987-6994，Nov.1，1990;Cancer Res.48，4597-4603，Aug.15，1987;J.Clin.Lab.Analysis 3∶369-369（1989）;Biol.Chem，Hoppe-Seyler，1989，370∶21-26;Cancer Res.，50∶4885-4890，Aug.15，1990;Cancer Res.，48∶4588-4596，1988;Cancer Res.，50∶4872-2879，Aug.15，1990;Cancer 67∶2880-2886，1991;Cancer Res.50∶1291-1298，1990;Biotech-nology，3∶378-384，1985;Proc.Nat'l Acad.Sci.USA，78∶3199-3203，1981;Cancer Res.，48∶6811-6818，1988;Cancer Res.，48∶2214-2220，1988;J.Nat'l Canc.Inst.1986∶6666）∶995-1003;Int'l J.Cancer 1982∶29∶539-545;Int'l J.Cancer 1983∶31∶543-551;Cancer Res.，50∶6987-6994，1990;Cancer Res.，51∶2889-2896，1991;J.Clin.Lab.Anal.，4∶465-473，1990;Cancer Res.，51，6363-6371，Dec.1，1991;J.Nat'l Cancer Inst.82∶1191-1197，1990;Cancer Res.51，5378-5383，Oct.1，1991）;CC83，another second generation B72.3 antiTAG antibody;CEA antibodies such as A₅B₇monoclonalantibody（Cancer Research Campaign Technology，Ltd，London，England）（see Int.J.Cancer，47∶597-602，1991;Br.J.Cancer，54∶75-82，1986;Br.J.Cancer，61∶891-894，1990;Int.J.Cancer，Supplement 3，34-37，1988;Eur.J.Nucl.Med，13∶197-202，1987;Br.J.Cancer，60∶549-554，1989;and Br.J.Cancer，61∶659-662，1990）;单克隆抗体B17-1A以及它的F（ab'）₂片段（Wistar Institute，Philadelphia，Pa.）;以及单克隆抗体19-9和它的F（ab'）₂片段（Centocor，Inc.Philadelphia，Pa.）。

关于放射性标记的选择，能够使用一种可置于与淋巴结紧密相连处的放射性检测探针意味着低水平能量的同位素是优选的，尤其是那些其光子发射能量水平低于550kev，优选的是低于约300kev，更优选的是低于约150kev的同位素。尽管出于必要，并令人满意或方便考虑，也可以使用在'840号专利中公开的其它的低能量同位素，但目前¹²⁵Ⅰ是优选的同位素。更高能量的放射性同位素（例如，¹³¹Ⅰ）也可以使用，尽管必须使用合适视准的放射性检测探针，而这妨碍了易为外科医生使用的仪器并限制了体腔内适于检查的区域。

除了发射γ射线的放射性同位素，也可以将另外地显示有β射线的放射性同位素与能检测β射线或质子的探针结合起来。在美国专利5，008，546中公开了手术中β发射的检查，该说明书引入本文作为参考。

经标记的定位器的剂量是保证能够利用放射性检查探针测出显示有合生了放射性标记的定位器的淋巴结位点。该剂量依赖于特定类型的标记物，定位器的类型，以及类似的可以影响到如本领域内技术人员认识到的剂量需求的因子。

对于显示出合生了放射性标记的定位器的淋巴结位点的检出，可以参考下列专利，这些专利提供了用于检测γ发射的优选的手操作探针：美国专利4，801，803、4，889，991和5，070，878，所有公开内容引入本文作为参考。如上所述，美国专利5，008，546公开了适于检查β-发射物的探针。如果必要，并令人满意或方便，也可以使用其它的发射检测装置。关于这一点，应该意识到为了测定相关的淋巴结而进行的病人的手术中估评仅仅是本发明实施的另一可选择途径。另外，可将探针用作为腹腔镜、纵隔镜或类似的特定仪器的一部分，该特定仪器适于装备小型放射检测装置，可将该装置置于与淋巴结的紧密连接处，以便检测连生的放射活性。不管使用的仪器或技术，本发明包括所有各种称号的这样的仪器和技术。

如在＇840号专利中报道的，用放射性检测探针对病人进行直接评估是不适当的。优选的是在施用放射性标记的定位器后等待一段时间以便从检查的淋巴结周围组织中清除掉未结合的放射性标记的定位器。合适的放射性检测探针的功能在于检测除存在于正被检查的患者所处位置（例如手术室）的正常背景放射性以外以及除血库背景（在血液中循环的放射性标记的定位器）和可能含有未结合的放射性标记的定位器周围组织以外的放射活性水平。该时间可能短至几分钟，直到几个星期，依据患者体内清除（经过代谢）该放射性标记的定位器的速度而定。重要之处是认识到在这段时间消逝后，放射性标记的定位器仍将与带有完整放射性标记的肿瘤细胞位点结合，尽管其以降低的水平。重要地，按照外来的闪烁法和外来的典型技术的传统教条，基于放射性标记的定位器的最大的肿瘤摄取量检查淋巴结是不合适的。

一旦合适的时间间隔消逝后，用放射性检测探针评估患者，并通过用该探针检测淋巴结位点处增加的放射水平而决定放射性标记的定位器的连生从而用该探针监测淋巴结位点。除了＇840号专利中公开的可改变外科手术治疗进程的微小转移性组织的测定外，本发明现在使内科医师能测定在CD4+淋巴细胞中富集的淋巴结，以用于制备减轻瘤组织（癌）的治疗剂。

然后以一定方式扩增或增殖经过检测的淋巴细胞，该方式与在前面的免疫治疗程序中介绍的常规细胞扩增法完全相背离。简而言之，细胞扩增包括下列步骤：从淋巴结组织中分离开LNL;体外活化并开始细胞扩增;更换培养基，将细胞培养物分离开，断绝外源细胞因子;收集细胞，制备施用给患者的最终产品。

采用常规方法如通过离心将细胞和组织分离开以收集LNLs。细胞扩增的启动包括开始使用无血清的巨噬细胞SFM培养基，该培养基是该细胞扩增方式的独特之处。另外，最优选的促有丝分裂刺激是用IL-2和同时加入的可溶性抗-CD₃细胞（而不是如本领域内已知的依次加入并使用平板束缚的抗-CD₃细胞）。在细胞生长期间定期地向培养物中加入等量新鲜培养基和细胞因子。重要的是，通过只加入新鲜培养基而使IL-2量降低，就是说低于每ml培养物为20个鲸鱼星座单位，从而将细胞与外源细胞因子（例如，IL-2）分离开。据认为将细胞与外源细胞因子分离开，排除了将其它的细胞因子与LNL细胞一起供药给患者的可能性，并且有数据将会证实这一点。

典型的细胞扩增方式详细过程描述于下文：

0天

将含有50μg/ml庆大霉素的无血清巨噬细胞SFM培养基10L预分装到配药袋中，无菌制备体外细胞生长培养基。将装有细胞和组织分离步骤中得到的经过洗涤的淋巴结淋巴细胞的圆锥形试管缓慢地倒转数次以混合细胞。将细胞混合后，移走1ml样品进行计数。基于细胞浓缩法，将IL-3和抗-CD₃加入到细胞悬液中，其量为达到在加入的培养基中的浓度为每10⁶个细胞含100鲸鱼座单位的IL-2（Chiron Corp.，Emeryville，CA）和每10⁶个细胞含100ng抗-CD₃（OKT3，Johnson and Johnson，Raritan，NJ）。

用一个60CC的无菌注射器将含有IL-2和OKT3的细胞悬液转移到含有完全培养基的1升无菌的气体可渗透的培养袋中以便最后细胞浓度为1×10⁶个细胞/ml。现在细胞置于密封的培养系统中并且一直留在该密封系统中直到10天培养期结束。

用病人的鉴别标志标记细胞培养袋，然后置于含7%CO₂的一个37℃湿润培养箱中。

第4天

培养时期起动4天后，从培养箱中移走细胞培养袋。缓慢地揉捏培养袋以使细胞分散于溶液中。将一个无菌注射器刺入培养袋的取样部位，取出5ml试样进行计数、存活性检测及形态学分析。

基于每袋中最后浓度应为0.25×10⁶个细胞/ml而计算出加入到各种新鲜的1升培养袋中的新鲜完全培养基和细胞悬浮液的最终体积。向含有细胞悬液的培养袋中按每10⁶个细胞含300鲸鱼座单位的IL-2浓度加入IL-2，以便使在每个新鲜1升培养袋中IL-2的终浓度达到100鲸鱼座单位/ml。

为了转移到新鲜培养基和新鲜无菌的气体可渗透的培养袋中现在制备细胞培养袋。利用一个DuPont SCD无菌管形焊机，在无菌泵管道装置，含有细胞悬液的培养袋，新鲜的完全培养袋，以及无菌袋之间建立一条封闭的转移线，培养基和细胞将被转移到无菌袋中。将泵管道穿过蠕动泵的凸轮，配置悬浮液的和添加的新鲜完全培养基的量。开启泵并且将细胞悬液袋内含物和新鲜培养基分配到预定数目的新鲜培养袋中。

一旦完成转移后，将每个袋的无菌的管道封口焊上。用患者的鉴别标志标记每个袋。将所有袋移回到37℃，7%CO₂的湿润培养箱中。根据医用废物处理的惯例指南丢弃所有原始的培养袋。

第7天

从培养时间起始7天后，再次通过缓慢揉捏混合细胞，从一个培养袋中移出5ml样品，并分析其细胞数及存活性和形态特征。根据细胞计数结果，计算出新鲜培养基和细胞悬液体积以达到在新鲜的1升培养袋中最终浓度为0.5×10⁶个细胞/ml。向新鲜完全培养基中加入40鲸鱼座单位IL-2/10⁶个细胞，以便在转入了培养基和细胞悬液的每个培养袋中最终浓度达到20鲸鱼座单位IL-2/ml。

利用前面描述的蠕动泵和无菌管道焊接装置将细胞和新鲜培养基转移到新鲜的气体可渗透的袋中。一旦转移和封闭完成后，标记该袋并置于37℃、7%CO₂湿润培养箱中。

第9天

在制备用于输往患者的细胞前24小时，从10%的培养袋中各取出10ml试样进行厌氧和需氧微生物学分析。

给患者输入制剂

第10天

在培养时期的第10天，从培养箱中取出培养袋以除去培养基，将每个培养袋中细胞集中在一起并浓缩细胞。根据培养袋数目，该过程将花费45分钟到2小时。利用Stericell处理机和收集碗，每个1L培养袋的处理速率为250ml/分钟培养袋的管道穿过处理机的凸轮并开启泵和离心机。在处理机碗中浓缩细胞并排出培养废液，丢弃。

在将所有培养袋集中并除去培养基后，用大约950ml的1.25% USP人白蛋白的无菌盐水液洗涤细胞以除去剩留的培养基。逆转Stericell泵的流动方向将大约270ml的细胞泵到一个无菌的500ml转移容器中。使用50ml的白蛋白和盐水混合物将处理机碗浸于转移容器中。该输液制剂的最后细胞浓度为1～5×10¹⁰个细胞。用合适的病人鉴别标志标记该制剂。

用一个无菌注射器从输血袋中取出1ml试样用于质量控制（QC）试验。然后将输液贮存于2～8℃直到完成所有的QC试验。在QC试验得到了满意结果后将患者输液制剂交给护理医师。

制备过程控制

整个QC程序

将质量控制程序设计为能保证在制造中所用的材料的质量以及最终产物的质量。

其它的控制包括保证整个制备过程中患者细胞的确认。将一个给定患者的所有细胞培养容器与其它患者细胞隔离开，并且用特定的患者鉴别标志清楚地标记。给每个患者指定一个培养箱，在10天的培养时期内该培养箱专用于该患者的细胞而不是与其它患者共用。

开放的细胞培养操作是极少见的，并且如果需要，在起始培养准备期间，该操作可在层流罩中无菌条件下完成。包括细胞培养物分离及转移等大多数处理过程是在密闭的培养系统中完成的以防止污染。

细胞培养物QC检测

在0天、第4天、第7天和第10天无菌收集细胞培养物并分析其存活性，细胞数和形态特征。用蓝色染色技术估测存活性及细胞数。用Wrights-Giemsa染色法，用显微镜观察细胞自旋制剂而完成形态学观察。

在患者输液前24小时，用BACTec血液培养试剂进行好氧和厌氧细菌培养。在患者输液前即时进行革兰染色以及用FDA许可的商品检测法进行内毒素测试试验。

经过扩增的活化的细胞的输液制剂必须是革兰染色阴性的，表明细胞存活性≥70%，并且其具有的经检测的LAL水平为＜1.0EU/ml。

根据需要，制备约10¹⁰个细胞用于施药给患者。目前自体扩增细胞优选用于供给已取走淋巴结的患者。优选的是，也可将由外科医生判断的可切除的瘤组织与确定的淋巴结一起切除。此后供给治疗剂。对于那些其包含的瘤组织是不可切除的病人，仅切除其确定的淋巴结并进行扩增，最后供给治疗剂。

下面的试验方案汇聚了本文中产生及报道的初始资料。

实施例1

起始的试验步骤

患者的选择及RIGS

探针系统

患者的选择以及RIGS

探针系统合适的患者已为结肠直肠癌，再发性疾病或初生癌提供了证明材料。所有被研究的患者经历了广泛的外科手术前的评估，以便可能的话消除那些患者的额外的腹腔肿瘤。外科手术前的评估包括胸部、腹部和骨盆的CT扫描，以及如果的确必要的话进行骨扫描。CEA检测以及结肠镜检测也是外科手术前评估的部分。所有患者签署一个惯常的复审部门书面同意书。在放射性标记抗体给药前2天，患者开始用碘化钾的口服液（每天二次10滴SSKI，或者每天二次500mgKI）治疗以阻止甲状腺吸取放射性标记的CC49的单克隆抗体，这一过程继续三星期或直到外科手术。用Ohio州大学（OSU）医学中心核药店进行的生碘学方法将CC49MoAb进行放射性碘标记。一旦证实用未标记的抗体皮肤试验呈阴性，即给患者静脉注射用1mCi的碘-125（¹²⁵Ⅰ）标记的并在4ml磷酸缓冲盐水中稀释的0.1mg的CC49 MoAb并输注5分钟。注射后对所有患者观察1小时，并在这1小时内每隔15分钟记录重要的信号。当由γ检测探针（GDP），Neoprobe

RIGS

1000仪器测定的心前区的点数在每2秒内小于20点时给病人安排外科手术。在外科手术注射前获得血清样品。

手术程序包括利用Neoprobe RIGS

1000仪器进行的彻底的剖腹术，其详细方法已在前面描述过。在外科手术期间，在胃肝炎胸膜、门静脉周区、腹腔结、上胰区以及肠系膜结中检测淋巴结以找到RIGS

检测阳性的淋巴结。根据一种组织与背景比例大于1.5∶1可决定它是RIGS 检测阳性组织。从患者以及肿瘤组织样品中收集各种淋巴结。立即将这些材料浸于缓冲盐水中送到病理诊室。所有这些材料由病理学家检测。无菌处理这些组织。

将所有这些淋巴结纵向剖开并将其中一半送到淋巴结实验室中并且保持另一半用于进行苏术素和曙红（H&E）组织学评估。该病理学家检测所有被解剖的结。由病理学家检查该肿瘤组织，取走小于几厘米的小片段，并置于无菌盐水中，转运到淋巴结实验室。对所有收到的患者材料进行常规病理学包括苏木素和曙红染色检测。

淋巴细胞的制备

在进行手术的那天，取患者的血并进行Ficoll-Hypaque（Pharmacia）分离以获得外周血单核细胞（PBMC）。洗涤这些细胞并重悬于RPMI  1640中，该RPMI  1640中加入了青霉素（100单位/ml）、链霉素（100μg/ml）和10%人血清AB型（GIBCO，检测支原体）。这是完整的RPMI（RPMIc）。如果将要使用脾细胞，缓慢地将脾组织切碎置于RPMIc中。按上面描述的Ficoll-Hypaque分离法处理得到细胞悬液。如果这些淋巴细胞将要用作为刺激细胞，将这些细胞用4000拉德（铯源）照射，然后置于混合的淋巴细胞培养物平板上培养。

将淋巴结置于冰上的无菌培养基中直到进行处理，并且通过缓慢地将淋巴结切碎到RPMIc中而制备淋巴细胞。将细胞悬液离心并在RPMIc中洗涤沉淀。在进行各种检测前先完成蓝色排除试验以测定存活性。通常存活性大于95%。利用来自Coulter的Epics ELITE流式细胞计数器分析CD4+和CD8+淋巴细胞。将LNLs用双重的染色试剂T4-FITC/T8-PE（Olympus）染色。将细胞重悬于0.1ml PBS（1%胎牛血清）（5×10⁵/管）并在10μl T4/T8染色试剂中室温下黑暗中保温20分钟。在其它的PBS中将细胞洗涤二次，用0.5ml PBS缓冲的1%甲醛固定，并贮存于4℃，黑暗中直到利用流式细胞计数器分析。

肿瘤样品的制备

将切下的肿瘤贮存于冰上的无菌盐水中以维持其存活。在移走进行病理学检测所必要的组织后，将该肿瘤在无血清的RPMI（RPM-Iic）中洗涤，并将其切成1～1.5mm片段大小置于培养皿中。将经切碎的肿瘤转移到50ml圆锥形离心管中，其中组织浸于另外的RPMIic中。移走大约5ml至10ml的培养基，并向试管中加入等体积的在PBS中制备的0.4%Ⅰ型胶原酶（SIGMA）。该消化过程在37℃保温1小时。每隔15分钟旋转一下试管以帮助细胞分散。在保温之后，加入RPMIc至相当于45ml的试样。使未消化的肿瘤沉淀下来并且小心地从试管的顶部移走细胞悬液。以400×g将细胞离心15分钟。将得到的肿瘤留在试管中，然后进行其它的消化步骤。在将肿瘤细胞沉淀用RPMIc洗涤2次后，用蓝色排除法测定存活性。假如这些肿瘤细胞用于扩增分析，则将其用3000拉德（铯源）照射，然后平板培养。保存留下的活肿瘤悬液作为冰冻的肿瘤库以在未来的试验中用作为异源细胞。

肿瘤细胞系

将这些肿瘤细胞培养于添加了伊格尔氏盐的基本必需培养基中，该培养基中加入了L-谷氨酰胺2mM、非必需氨基酸、丙酮酸钠0.1mM、MEM维生素溶液，以及15%胎牛血清（所有这些来自GIBCO）。Glio是人体神经胶质瘤细胞系。CAR-1是从由于转移性类癌而进行肝移植的患者中获得的类癌肿瘤，并用相同于处理结肠癌细胞的方法处理之。在RIGS

步骤期间从患有再发性结肠癌的患者中分离出WD124（一种结肠癌细胞系）。如果这些传递的细胞系用于混合的淋巴细胞/肿瘤分析，则将其置于30，000拉德（铯源）下照射，然后平板培养。

混合的肿瘤淋巴细胞分析

使用20μ/ml浓度的IL-2。抗-CD₃是一种鼠抗-人抗体（参见Yoshizawa，et al.“Activation of Anti-CD₃of Tumor-Draining Lymph Node Cells for Specific Adoptive Immunotherapy”，Cellular Immunology，134，473-479，1991）。在96孔圆底组织培养平板进行混合的肿瘤淋巴细胞培养试验。在整个分析中利用RPMIc作为稀释剂，最后的细胞体积为每孔0.2ml。所有组都包括对照，对照包括仅淋巴细胞或肿瘤细胞、淋巴细胞和肿瘤细胞。上述每一种都含有IL-2，并将培养物与IL-2以及一剂量效应的抗-CD₃混合。以每孔1×10⁶密度平板培养淋巴细胞，而肿瘤以每孔5×10³的密度培养。将平板在湿润CO₂培养箱（5%CO₂）37℃保温96小时。在这段时期后，向每孔中加入1μCi的[³H]胸腺嘧啶（ICN，比活性6.7Ci/mmol）维持18小时。用一个细胞收集器结合玻璃纤维滤纸条一起收集孔中细胞。将打孔后得到的滤纸片浸于小试管中在用Bec-kman 1801闪烁计数器计数前加入水相闪烁夹层。将学生试验中使用的统计分析法用于测定显著性。

起始实验结果

当在IL-2和抗-CD₃存在下将Ⅰ型LNL和自体（辐射过的）肿瘤在混合的肿瘤淋巴细胞培养物中共培养时，经[³H]胸腺嘧啶掺入法测定淋巴细胞的扩增有3～10倍增加，如在示意性图1和下面表2中看到的。

表2

细胞系 培养类型 抗-CD₃每分钟

编号  (ng/ml)  细胞数

10 LNL+IL-2+Anti-CD₃1 977

10 LNL+IL-2+Anti-CD₃10 2414

10 LNL+IL-2+Anti-CD₃50 3217

10 LNL+IL-2+Anti-CD₃100 2675

12 Auto+LNL+IL-2+Anti-CD₃1 1827

12 Auto+LNL+IL-2+Anti-CD₃10 8051

12 Auto+LNL+IL-2+Anti-CD₃50 9412

12 Auto+LNL+IL-2+Anti-CD₃100 8920

14 Allo+LNL+IL-2+Anti-CD₃1 1843

14 Allo+LNL+IL-2+Anti-CD₃10 5802

14 Allo+LNL+IL-2+Anti-CD₃50 5803

14 Allo+LNL+IL-2+Anti-CD₃100 5789

16 Auto PBLs+LNL+IL-2+Anti-CD₃1 996

16 Auto PBLs+LNL+IL-2+Anti-CD₃10 1937

16 Auto PBLs+LNL+IL-2+Anti-CD₃50 3201

16 Auto PBLs+LNL+IL-2+Anti-CD₃100 3270

18 Allo PBLs+LNL+IL-2+Anti-CD₃1 1317

18 Allo PBLs+LNL+IL-2+Anti-CD₃10 2324

18 Allo PBLs+LNL+IL-2+Anti-CD₃50 2665

表2(续)

细胞系 培养类型 抗-CD₃每分钟

编号  (ng/ml)  细胞数

18 Allo PBLs+LNL+IL-2+Anti-CD₃100 3729

只有用抗-CD₃和低浓度的IL-2（20U/ml）活化淋巴细胞时才出现增殖。如上述数据可证明这些LNL与自体人结肠癌细胞有各种程度的响应。在仅IL-2存在下，LNL仅有节制地激增肿瘤细胞，并且使用IL-2时没有看到出现显著增殖，肿瘤细胞数仅相当于用IL-2和抗-CD₃时看到的扩增。

表3

细胞系 培养类型 IL-2 抗-CD₃每分钟

编号  (μ/ml)  (ng/ml)  细胞数

20  LNL+IL-2  20  0  558

22 LNL+IL-2+Anti-CD₃20 50 1793

24 Auto+LNL+IL-2+Anti-CD₃20 50 5398

26  Auto+LNL+IL-2  20  0  1070

28  Auto+LNL+IL-2  100  0  986

30  Auto+LNL+IL-2  500  0  277

Ⅰ型淋巴结含有约40%至70%之间的CD4+淋巴细胞以及约80%至15%的CD8+淋巴细胞。用PBL已证明IL-2和抗-CD₃能刺激CD4+和CD8+淋巴细胞的扩增，但单独IL-2不刺激CD4+淋巴细胞扩增。Nishimura，et al.，“Generation，Propagation，and Targeting of Human CD4+ Helper/Killer T-cells Induced by Anti-CD₃Monoclonal Antibody Plus Recombinant IL-2，An Efficient Strategy for Adoptive Tumor Immunotherapy”，J.Immunol.，148∶285-291，1992。也可能是在Ⅰ型结中使用高百分数的CD4+淋巴细胞，抗-CD₃和IL-2可刺激那些单独用IL-2不能刺激的细胞。

与Ⅰ型淋巴结相反，Ⅲ型LNL在自体肿瘤、异源肿瘤或IL-2和抗-CD₃都存在时没有扩增应答，如参照图3和下面表4能看到的。

表4

细胞系 培养类型 抗-CD₃每分钟

编号  (ng/ml)  细胞数

32 LNL+IL-2+Anti-CD₃1 192

32 LNL+IL-2+Anti-CD₃10 310.8

32 LNL+IL-2+Anti-CD₃50 308.6

32 LNL+IL-2+Anti-CD₃100 311

34 Auto+LNL+IL-2+Anti-CD₃1 270.9

34 Auto+LNL+IL-2+Anti-CD₃10 279.5

34 Auto+LNL+IL-2+Anti-CD₃50 246.7

34 Auto+LNL+IL-2+Anti-CD₃100 286.7

表4(续)

细胞系 培养类型 抗-CD₃每分钟

编号  (ng/ml)  细胞数

36 Allo+LNL+IL-2+Anti-CD₃1 439.7

36 Allo+LNL+IL-2+Anti-CD₃10 382.4

36 Allo+LNL+IL-2+Anti-CD₃50 470.5

36 Allo+LNL+IL-2+Anti-CD₃100 446.3

由于肿瘤含有的淋巴结已是TIL细胞的一种来源，因此肿瘤免疫活性丧失及扩增丧失的原因不清楚。Schwartzentruber，et al.，“Specific Release of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor，Tumor Necrosis Factor Alpha，and Gamma Int-erferon by Human Tumor-Infiltrating Lymphocytes After Autologous Stimulations”，J.Immunol.，146∶3674-3681，1991。但是，TIL细胞生长的分析需要长期培养和高浓度的IL-2，在本文中报道的LNL分析是短期的仅在新鲜培养基中培养4天的分析。

O型淋巴结淋巴细胞的应答是不同的。大多数在IL-2和抗-CD₃存在下对异体或自体肿瘤显示非常低的肿瘤特异性扩增，参照图4和下面表5可见。

表5

细胞系 培养类型 抗-CD₃每分钟

编号  (ng/ml)  计数

38 LNL+IL-2+抗-CD₃1 359.1

38 LNL+IL-2+抗-CD₃10 421

38 LNL+IL-2+抗-CD₃50 406

38 LNL+IL-2+抗-CD₃100 376.2

40 Auto+LNL+IL-2+抗-CD₃1 327.6

40 Auto+LNL+IL-2+抗-CD₃10 357.2

40 Auto+LNL+IL-2+抗-CD₃50 321

40 Auto+LNL+IL-2+抗-CD₃100 321.5

42 Allo+LNL+IL-2+抗-CD₃1 476.7

42 Allo+LNL+IL-2+抗-CD₃10 491.1

42 Allo+LNL+IL-2+抗-CD₃50 563.4

42 Allo+LNL+IL-2+抗-CD₃100 504.8

与大于90%以上的Ⅰ型结的显著增殖相比较，仅有25%至30%的选择出的O型结显著地激增肿瘤。曾有从具有Ⅰ型结但并不显示肿瘤特异性扩增的患者中获取O型结的情况，但是，基于一个细胞得到的扩增数总是比在Ⅰ型淋巴结中看到的扩增量小得多，如参照图5和下文表6可看到的。

表6

细胞系编号  培养类型  结类型  每分钟计数

44  LNL+IL-2  O  364

46 LNL+IL-2+抗-CD₃O 345

48 LNL+Auto+IL-2+抗-CD₃O 2398

50  LNL+IL-2  I  912

52 LNL+IL-2+抗-CD₃I 3217

54 LNL+Auto+IL-2+抗-CD₃I 9412

该结果暗示本发明可用于筛选具肿瘤特异活性的淋巴结。

使用LNL时脾淋巴细胞有同样的应答，即Ⅰ型脾淋巴细胞响应结肠肿瘤扩增，Ⅲ型脾淋巴细胞不扩增，如参照图6A和6B以及下文表7所看到的。

表7

细胞系 培养类型 脾类型 CD₃每分钟

编号  (ng/ml)  计数

56 LNL+IL-2+抗-CD₃I 1 425

56 LNL+IL-2+抗-CD₃I 10 990

56 LNL+IL-2+抗-CD₃I 50 1285

56 LNL+IL-2+抗-CD₃I 100 1831

58 Auto+LNL+IL-2+抗-CD₃I 1 426

表7(续)

细胞系 培养类型 脾类型 CD₃每分钟

编号  (ng/ml)  计数

58 Auto+LNL+IL-2+抗-CD₃I 10 1396

58 Auto+LNL+IL-2+抗-CD₃I 50 1598

58 Auto+LNL+IL-2+抗-CD₃I 100 2122

60 Allo+LNL+IL-2+抗-CD₃I 1 1504

60 Allo+LNL+IL-2+抗-CD₃I 10 3744

60 Allo+LNL+IL-2+抗-CD₃I 50 5278

60 Allo+LNL+IL-2+抗-CD₃I 100 4387

62 LNL+IL-2+抗-CD₃III 1 215.6

62 LNL+IL-2+抗-CD₃III 10 412.3

62 LNL+IL-2+抗-CD₃III 50 435.5

62 LNL+IL-2+抗-CD₃III 100 405.5

64 Auto+LNL+IL-2+抗-CD₃III 1 197

64 Auto+LNL+IL-2+抗-CD₃III 10 341

64 Auto+LNL+IL-2+抗-CD₃III 50 343

64 Auto+LNL+IL-2+抗-CD₃III 100 385

66 Allo+LNL+IL-2+抗-CD₃III 1 526.7

66 Allo+LNL+IL-2+抗-CD₃III 10 502.2

66 Allo+LNL+IL-2+抗-CD₃III 50 1012

66 Allo+LNL+IL-2+抗-CD₃III 100 1145.22

大多数脾脏显示出与肿瘤细胞存在相应的探针放射性;但是，由于仅切除了很少几个脾脏，关于脾淋巴细胞的数据目前还很少。

来自Ⅰ型淋巴结的LNL对自体和异体肿瘤有扩增应答。这些LNL对来自同样供体如异体结肠癌的异体PBL不进行应答扩增，它们对自体PBL（见图1），人胶质神经瘤细胞，或人类癌肿瘤细胞不进行应答扩增，如参照图7和下文表8可看到的。

表8

细胞系类型  肿瘤类型  CPM

70  非  1239

72  自体  7496

74  Glio  2340

76  WD124  2208

78  CAR1  2036

80  PBL  2002

最近研究已证明IL-2和抗-CD₃能共同刺激CD4+外周血淋巴细胞的扩增而单独IL-2不能。Nishimura et al.，“Generation，Propagation，and Targeting of Human CD4+Helper/Killer T Cells Induced by Anti-CD₃Monoclonal Antibody Plus Reconbinant IL-2”，见上文。由于Ⅰ型LNL含有多于50%以上的CD4+淋巴细胞，抗-CD₃和IL-2的使用可刺激CD4+淋巴细胞以及CD8+淋巴细胞的扩增。于是，CD4+和CD8+淋巴细胞的分离以及对生长因子和肿瘤的扩增响应似乎是令人满意的。

与在下面实施例Ⅲ中报道的治疗步骤相联系，在IL-2（20μ/ml）和抗-CD₃中培养前和培养后用流式细胞计数器分析淋巴细胞而完成本发明测定的淋巴结的表型分析，获得下面记录的结果：

表9

患者淋巴  天数1  天数12～16

结类型

SMC8-046  CD4  63.2%  CD4  68.3%

淋巴结  CD8  19%  CD8  35.4%

CD3  79%  CD3  82.1%

CD19  11.3%  CD19  4.4%

RG154  CD4  51%  CD4  62.3%

淋巴结  CD8  6%  CD8  29.4%

CD3  61.7%  CD3  97.7%

CD19  <1%  CD19  <1%

JG192  CD4  67.3%  CD4  43.5%

肠膜淋巴结  CD8  8.9%  CD8  41.6%

CD3  84.8%  CD3  96.9%

CD19  3%  CD19  <1%

表9(续)

患者淋巴  天数1  天数12～16

结类型

JG196  CD4  61.4%  CD4  36.2%

periportal  CD8  8.3%  CD8  45.8%

Lnode

CD3  79.6%  CD3  96.3%

CD19  3.9%  CD19  <1%

这些结果证明在培养后T细胞群（CD₃）增加。这些结果还证明在整个培养期间CD19细胞（B细胞）减少。应该注意到，在其它的研究中通过加入抗-Ⅰ级组织相容性抗体（MHC）以及抗-Ⅱ级HMC抗体可抑制LNL扩增。

在不同的促有丝分裂刺激条件下长期培养淋巴结淋巴细胞，这种扩增相当于使用在前面的数据中报道的抗-CD₃。以1×10⁶LNL/mlRPMIc中开始培养1天（其中RPMI 1640培养基补充了HEPES缓冲液，25mM;青霉素，100单位/ml;链霉素，0.1mg/ml以及重新钙化、热失活的人血浆，10%）。在4天后，将细胞分离开成0.25×10⁶/ml，然后以这种方式继续传代。按照说明添加下列物质：IL-2，20单位/ml;抗-CD₃，50ng/ml;佛波醇，12-肉豆蔻酸盐，13-乙酸盐（PMA），2ng/ml，以及Ionomycin 50ng/ml。记录指定的添加以及细胞扩增。

表10

患者天数 IL-2+抗-CD₃扩增倍数 IL-2+PMA+扩增倍数

JK196P

periportal Lnode

5  1  1.7

7  4  10.2

11  15  82

15  16.2  114.8

KM098

periportal Lnode

4  1  1

6  1.6  6

8  2.9  36

11  12  130

13  20.6  223.6

其它特征包括将单独培养的由患者JG196 LNL＇S样品分泌的和与自体肿瘤、异源肿瘤或抗-CD₃一起培养的患者JG196 LNL＇s样品分泌的肿瘤坏死因子（TNF）α进行比较。记录了下列结果并显示于图8中。

表11

TNFα

(pg/ml/10⁶LNL)

患者JG196 IL-2+抗-CD₃IL-2+PMA+Ionomycin

培养细胞(项目82)  培养细胞(项目84)

仅LNL  <15  <15

LNL+自体肿瘤  428  305

LNL+异体肿瘤  75  75

LNL+IL-2+抗-CD₃80 45

这些结果证明在自体肿瘤存在下LNL细胞产生细胞因子。再者，经扩增的LNL细胞产生应答自体肿瘤的细胞因子，从而支持了它们的确是肿瘤活性淋巴细胞的观点。

实施例Ⅱ

后期的实验程序

在包括将上文中提出的方案进行微小变化的本发明的发展过程中进行后期试验工作。患者的选择和外科手术基本上相同于上文中描述的起始试验步骤。再者，待切除并用于细胞扩增的淋巴结的测定包括检测无肉眼可见肿瘤证据（通过肉眼观察和触诊）的放射性标记的抗体的存在。这些资料原来是由：Triozzi等人，Cancer，Vol.73，No.3，February 1，1994报道的，其全部公开内容引入本文作为参考。

细胞

由一位病理学家从解剖开的标本中获得不需论断的淋巴结和肿瘤样品。将每个淋巴结的一半用于组织病理学检测，另一半用于免疫学研究。在层流罩中无菌条件下解离组织。将组织浸于离心管中的RPMI、抗生素以及抗真菌剂（GIBCO，Grand Island，NY）中，并转移到冰上的培养皿中。用解剖刀切除外部组织，并将该组织切割为直径约为2～3mm的小片。用一个5ml注射器的钝端缓慢地分散而分离开细胞，然后用Hank＇s缓冲盐溶液洗涤二次。在所有分离步骤中用蓝色排除法检测到细胞的存活性大于80%。利用标准的梯度离心技术，以及Ficoll-Hypaque（Pharmacia，Piscataway，NJ）的肝素化的外周血，从被研究的患者中分离出外周血淋巴细胞。将所有不必需的细胞立即低温贮存于加5%自体血清的二甲基亚砜中。

荧光激活的细胞分类器分析

用0.5mg的MoAb将在0.1ml培养基中的10⁶细胞在4℃处理1小时。在两次洗涤后，根据制造商的推荐加入以1/40稀释的二级发荧光的单抗鼠IgG（Becton Dickinson，Mountain View，CA）。将细胞标记1小时，洗涤两次后使用细胞荧光体照相术和流式细胞计数器分析。使用下列MoAb's：一般性T-细胞（Leu4;抗-CD₃），细胞溶解性/抑制器T-细胞（Leu2a;抗-CD₈），辅助者/诱导物T-细胞（Leu19;抗-CD56）（所有都来自于Becton Dickinson）;“真”T-细胞（2H4;抗-CD45RA）以及“记忆”T-细胞（UCHL1;抗-CD45RO）两者来自AMAC，Westbrook，ME）;以及抗-HLA-DR（HB103，ATCC，Rockville，MD）。

细胞溶解活性

用100μCi/5×10⁶个细胞/0.5ml和铬酸钠在37℃标记肿瘤细胞1小时。将肿瘤细胞（10⁴/100μl）加入到三个重复的6-mm圆底平板中。用天然的杀伤者-抗性Daudi细胞靶作为分析试验中的阳性对照。向同样的培养基（100μl）中加入按上面描述产生的效应器细胞以使效应器与靶的比例达到40∶1、20∶1、5∶1和1.5∶1。还包括仅含有标记过的靶细胞和Triton X-100（Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO）的三个最大稀释孔，和三个自发稀释孔。离心该平板（200×g，5分钟）并在37℃保温4小时。将该平板再次离心并取出100μl的上清液。用下列通式测定溶解百分数：（每分钟的试验数[cpm]-自发的cpm）/（总cpm-自发的cpm）。测试三个重复中的各个变量。

扩增分析

通过在存在或不存在IL-2的两种情况下，将10⁵淋巴细胞与含辐射自体和异源肿瘤细胞的BSM（Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO）以及辐射过的自体正常结肠细胞一起保温完成扩增分析。培养96小时后，用1mCi[³H]胸腺嘧啶在37℃脉冲标记细胞1小时，并用一个细胞收集器收集。通过闪烁计数测量掺入的放射活性。

统计分析

使用配对的和未配对的学生t试验和Mann-Whitney U试验测定淋巴细胞群的表型和功能特征之间差异的显著性。将使用退化模型的变异分析用于评估扩增速率的差异。

结果

淋巴结

检测参与Ⅰ期研究的患有再发和/或结肠直肠癌的20个患者（8个妇女和12个男性）的组织。平均年龄是57岁（范围33～72岁）。用探针检测这些患者鉴别出1～11（中值为4）淋巴结，这些淋巴结在检查和触诊中显示正常但含有¹²⁵Ⅰ-标记的CC49。常常这些淋巴结的特征在于非常高的放射活性（淋巴结与背景数的比值大于10∶1），并且常在用经典方法检测时认为是结肠癌的肿瘤排斥区位点如胃肝区、腹腔区和肠骨区中鉴别出这些淋巴结。切除二十五个诊断学上正常的含有放射性标记的MoAb的淋巴结以及六个论断为正常不含有放射性标记的MoAb的淋巴结（来自五个不同研究患者）用于免疫学研究。

用常规的组织学评估法，即是苏木精和曙红（H&E）染色法以及利用MoAb AE1-3（Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN）的免疫组织化学鉴定细胞角蛋白而评估淋巴结中存在的肿瘤。使用经改进的抗生物素蛋白-生物素过氧化酶复合物技术（Vectastain，Vector，Burlingame，CA）鉴别鼠MoAb。通常，发现在用常规的H和E染色法检测定位的淋巴结中仅存在肿瘤细胞的一或两个病灶;如果没有鉴别出肿瘤细胞，免疫组织化学研究表明CC49分布在具有特征性的新月状的或环状树枝型的胚层中心。通过染色从分离和梯度离心（Ficoll-Hypaque，Pharmacia）后的淋巴结中制备的细胞离心制剂也可调查肿瘤细胞的存在。

将25个诊断为正常但含有放射性标记MoAb的淋巴结划分为含有“显微镜下的肿瘤”或“排出抗原”。将17个划分为含有显微镜下的肿瘤;在所有17个结中进行淋巴结的解离和梯度离心后发现有肿瘤细胞，在其中的14个淋巴结中根据其一半进行病理学检测的H&E染色后也发现有肿瘤。在8个淋巴结中既未根据解离也未根据H&E鉴定出肿瘤细胞，将这些淋巴结划分为含有脱落抗原。在诊断为不含有放射性标记的MoAb的六个正常淋巴结中既未通过解离也未通过H&E染色鉴别出肿瘤。

表型

将来自用探针鉴定出的淋巴结的淋巴细胞的表型与其它的淋巴细胞群相比较（表9，下文）。研究六个不同的淋巴细胞群：（1）含有显微镜观察下肿瘤的淋巴结，（2）含有脱落抗原的淋巴结，（3）带肉眼可见肿瘤的淋巴结，（4）不相关的淋巴结，（5）TIL;和（6）外周血淋巴细胞（PBL）。利用细胞流式计数器测定刚刚分离的材料的表型特性。在用1000U/ml IL-2培养24小时后测定TIL的表型以促进分离和提高淋巴细胞的产量。

从带有显微镜观察下肿瘤或脱落抗原的淋巴结的CD4-CD8比例大于其它任何淋巴细胞群（P<0.05）。由探针鉴别的淋巴结和带有肉眼可见的肿瘤的淋巴结具有的CD45RO⁺细胞数显著地高于TIL、PBL和未相关淋巴结具有的CD45RO⁺细胞数（P<0.05）。PBL比任何群体和TIL具有显著高的CD56+细胞数（P<0.001）。未检测到带显微镜观察下可见肿瘤的淋巴结以及带脱落抗原之间的表型差异。

表12

淋巴细胞群的表型

显微镜观察  肉眼可见

到的肿瘤  辅抗原  的肿瘤

(n=12)  (n=8)  (n=6)

CD3  73±10  71±15  64±16

CD4  63±11  59±12  44±15

CD8  10±3  10±4  19±7

CD4/CD8 6.3±0.9^ab5.9±1^ab2.3±0.8

CD56  4±3  4±3  1±1

CD45RA  16±8  17±10  12±10

CD45RO 40±13^ac38±16^ae37±16^ae

HLA-DR  13±15  28±6  27±13

表12(续)

淋巴细胞群的表型

肿瘤淋巴细胞  外周血淋巴细胞

非相关的  (TIL)  (PBL)

(n=6)  (n=4)  (n=9)

CD3  72±20  72±16  62±13

CD4  50±12  35±6  41±18

CD8  21±11  24±18  22±14

CD4/CD8  2.4±0.4  1.5±0.5  1.9±0.3

CD56 1±1 1±1 14±5^ac

CD45RA 33±14^ad18±9 20±14

CD45RO  20±9  21±12  29±19

HLA-DR  21±15  24±11  20±15

＊利用流式细胞计数器分析来自淋巴结的淋巴细胞。所获得的数据代表阳性细胞平均百分数±标准偏差。

a 显著差异

b P<0.001相对于肉眼可见的，非相关的，TIL和PBL。

c P<0.001相对于显微镜观察到的，脱落抗原，肉眼可见的，非相关的，以及TIL。

d P<0.001相对于显微镜观察到的，脱落抗原，肉眼可见的，TIL和PBL。

e P<0.05相对于TIL、PBL和非相关的。

扩增

还检查了对1000U/ml人重组IL-2（重组人，铯，Emeryville，CA）产生应答的各种淋巴细胞群的扩增。所有培养物浓度都为10⁶个细胞/ml，并当融合后将细胞分开（每3～6天）。来自显微镜观察下有肿瘤的淋巴结的淋巴细胞的扩增与来自脱落抗原的淋巴结的淋巴细胞的扩增是类似的;两者的扩增显著地大于（P<0.05）TIL及带肉眼可见肿瘤的淋巴结，以及不相关淋巴结的扩增。来自不相关淋巴结的淋巴细胞的扩增显著地高于（P<0.05）带肉眼可见的肿瘤的淋巴结以及TIL的扩增。通常TIL群发育为CD4+和CD8+的结合物或主要是CD8+的群体。所有淋巴结淋巴细胞群发育为CD4+群占优势的CD4+和CD8+的群体。似乎CD8+细胞的出现与培养物扩增的降低以及TIL培养物扩增的增加相关。

增殖

我们首先将来自由Neoprobe

1000探针鉴定的淋巴结的淋巴结淋巴细胞的增殖应答与来自不相关淋巴结（来自相同患者）的淋巴结淋巴细胞的增殖应答。将淋巴细胞（10⁵/孔）与经照射（5000R）的自体和异源肿瘤细胞（0～50，000/孔）在有或没有10U/ml的IL-2存在下共培养5天。还将淋巴细胞置于作为可溶性TAG-72源的表达CC49结合抗原决定基的各种浓度的BSM中。在收集前18小时加入[³H]胸腺嘧啶。在存在和不存在IL-2的情况下自体肿瘤（50，000个细胞）诱导用探针（n＝来自16个不同患者的19个淋巴结）鉴别的所有淋巴结的显著增殖（摄取的[³H]胸腺嘧啶cpm大于未刺激细胞的三个标准偏差。在任何研究中自体正常结肠细胞和PBL不诱导增殖。来自带有显微镜观察下带肿瘤的淋巴结的淋巴细胞的激增应答在存在和不存在IL-2（P<0.01）情况下都大于来自非相关淋巴结的淋巴细胞对自体和对异源TAG-72+结肠肿瘤标本的扩增应答。与来自非相关淋巴结的淋巴细胞相反，将来自淋巴结的淋巴细胞暴露于以剂量-应答方式应答BSM而进行增殖的显微镜观察下可见的肿瘤。为了对在扩增应答中CC49可能有的作用以及其结合抗原决定基进行定性，在未添加或存在BSM（100μg/ml）、CC49（0.1μg/ml）以及BSM+CC49情况下，将来自暴露于显微镜观察下存在的肿瘤中的淋巴结的淋巴细胞在10U/ml的IL-2中培养。单独的CC49不加强增殖，并且CC49与BSM结合后不取消由单独BSM诱导的增殖。

通过比较其对TAG-72⁺和对TAG-72^-肿瘤细胞的激增应答而进一步检测由探针鉴别的淋巴结的淋巴细胞的激增应答。评估下列细胞：衍生的患者自体和异源TAG-72⁺（即CC49⁺）结肠癌细胞，包括来自患有pseudomyxoma peritonaei的患者的丰富的TAG-72⁺细胞;患者衍生的TAG-72⁺胸腺细胞;患者衍生的TAG-72^-鳞片状的细胞肛门直肠癌，TAG-72^-黑素瘤，以及TAG-72^-结肠直肠癌，TAG^-淋巴母细胞样Daudi细胞;以及LS174T细胞（ATCC），一种在体内而不在体外表达TAG-72的结肠癌细胞。来自带有显微镜观察下肿瘤的淋巴结的淋巴细胞激增所有的TAG-72⁺肿瘤;带有显微镜观察下肿瘤的淋巴结对患者衍生的TAG⁺肿瘤细胞的激增大于对TAG-72^-细胞的激增（P＝0.0001）。这些数据列于下面表13中。

表13

对肿瘤细胞^＊的激增反应

无促有丝分裂剂  IL-2

无肿瘤细胞  444±185  5476±1800

TAG-72^*肿瘤细胞

自体结肠  1428±600  10,495±1435

异源结肠  1755±531  9313±1764

粘蛋白结肠^**5203±1866 13,376±2719

乳腺(Breast)  2571±1519  10,302±3277

Tag-72肿瘤细胞

结肠  884±625  7621±1319

直肠  584±268  7410±152

Daudi  712±217  8066±3173

LS174T  124±86  798±282

^＊用50，000辐射过的肿瘤细胞±U/ml的IL-2刺激来自用探针鉴别的淋巴结的淋巴细胞4天。数据代表来自4个不同患者的淋巴结的平均增殖数CPM±标准偏差。在存在和不存在促有丝分裂剂的情况下，淋巴细胞对TAG-72⁺的激增相对于对TAG-72^-肿瘤的激增的差异是显著的P＝0.0001。

^＊＊粘蛋白结肠：来自患有pseudomyxoma peritonea的患者的丰富的TAG-72⁺细胞

人工培养的LS174T细胞抑制增殖应答，表明在该移植细胞系中可能存在肿瘤衍生的抑制因子。使用冷冻的LS174T细胞作为靶并不诱导抑制。

细胞溶解活性

在这些试验中，将分离开的淋巴结和肿瘤以及PBL群与1000U/ml的IL-2一起培养直到35天。所有培养开始浓度为10⁶个细胞/ml，并且在融合时进行离解。在培养4～7天后以及21～28天后进行标准4小时⁵¹Cr-释放分析评估经扩增的淋巴细胞的细胞溶解活性。将以前冷冻的自体肿瘤、异源肿瘤以及天然杀伤者抗性的Daudi细胞用作靶。在所有的异源分析中使用来自两患者之一的TAG-72抑制的肿瘤细胞;来自这两个患者的细胞对由健康的志患者产生的淋巴因子激活的杀伤剂敏感性相同（±10%）。这些数据列于下面表14中。

表14

淋巴细胞群^a的细胞溶解活性

显微镜观察  肉眼可见

到的肿瘤  脱落抗原  的肿瘤

天数  (n=7)  (n=6)  (n=7)

自体的 4-7 21±8^bc18±6^bc11±6

21-28  2±2  5±3  3±3

异源的 4-7 24±8^bc19±6^bc9±4

21-28  3±4  4±3  2±2

Daudi 4-7 34±14^bc38±11^bc15±7

21-28  4±6  3±3  3±2

表14(续)

淋巴细胞群^a的细胞溶解活性

肿瘤淋巴细胞  外周血淋巴细胞

非相关的  (TIL)  (PBL)

(n=6)  (n=4)  (n=7)

自体的 9±5 4±4 39±18^bd

2±1  6±4  6±4

异源的 8±5 3±4 51±28^bd

3±2  4±2  5±4

Daudi 10±7 4±2 73±21^bd

2±3  5±3  3±2

a 来自淋巴结的淋巴细胞与1000U/ml的IL-2培养，测定相对于患者衍生的自体和异源TAG-72^-肿瘤细胞相对于TAG-72^-，天然杀伤抗性，Daudi细胞的细胞裂解活性。在培养4～7天后以及在培养21～28天后测定细胞溶解活性。数据表示在效应剂与靶比例为40∶1时的平均裂解百分数±标准偏差。

b 显著不同。

c P<0.05相对于肉眼可见的，非相关的，以及TIL。

d P<0.001相对于显微镜下可见的和脱落抗原以及<0.0001相对于肉眼可见的，非相关的和TIL。

从PBL产生最高活性的细胞溶解活性。带有显微镜下观察的肿瘤的淋巴结的细胞溶解活性与脱落抗原的淋巴结的细胞溶解活性相当。尽管小于由PBL产生的细胞溶解活性，从这些淋巴结产生的细胞溶解活性一贯大于从TIL产生的和从通过肉眼观察为相关和非相关的淋巴结产生的活性。在任何时候都未观察到自体肿瘤的特定杀伤作用。在所有培养物中细胞溶解活性随时间而降低。

讨论

通过在体内定位肿瘤-反应性淋巴细胞而建立的一种技术。通过鉴定带有显微镜观察下肿瘤和/或脱落抗原的淋巴结，体内使用放射性标记的MoAb以及γ-检测探针可再现性地定位有抗自体肿瘤反应性的淋巴结淋巴细胞。淋巴结对肿瘤的应答效果是变化的。它们是结肠直肠癌中转移的第一个位点并且在宿主-肿瘤相互作用中起着重要的作用。利用包括相关的引流淋巴结的简单外科手术，许多患有转移到淋巴结的结肠直肠癌的患者已生存很长时间。本发明结果支持在患有结肠直肠癌的患者的淋巴结中，甚至在远离原发肿瘤的淋巴结中都存在对显微镜观察下肿瘤的免疫应答的观点。我们的结果证实与肉眼可见的肿瘤的淋巴细胞的微弱的免疫应答性以及TIL的微弱应答性。当与来自带有显微镜观察下可见的肿瘤和脱落抗原的淋巴结产生的淋巴细胞相比较时，来自带有肉眼可见肿瘤的淋巴结，TIL和非相关淋巴结的淋巴细胞功能上显示有抑制。在几种功能研究中包括细胞溶解活性，激增应答以及扩增，证实显示出差异。

鼠MoAb对观察到的免疫应答的作用是未知的。使用体内放射性标记的MoAb检测到的定位于患有再发性和/或转移疾病的患者整个腹腔内的淋巴结的免疫组织学特征相同于在Mariani-Costantini等人，“Immunohistochemical Evidence of Immune Response to Tumor-Associated Antigens in Lymph Nodes of Colon Carcinoma Patients”，Cancer，1991;67∶2880-66的免疫组织学研究中报道的特征。这些研究者使用（体外）各种抗TAG-72的MoAb，包括CC49以及抗淋巴细胞和抗针对来自患有原发性结肠直肠癌的患者的非相关性局部淋巴结切片的单核细胞/巨噬细胞抗原决定簇的MoAb。他们还解释了在初期中央的免疫组织化学反应，并且总结出脱落的TAG-72抗原决定基被选择性地识别和被提供给初期中央B-细胞。

除了来自体内不接收MoAb的患者的淋巴结的免疫组织化学研究，其它研究结果暗示MoAb CC49不是免疫应答中心。单独MoAb CC49不刺激由该探针鉴别的淋巴结淋巴细胞的体内增殖。使用该技术在检测到人抗鼠MoAb抗体的患者以及未检测到人抗鼠MoAb抗体的患者中检识出与自体肿瘤反应的淋巴结淋巴细胞。再者，淋巴结单独定位以及带有肉眼可见的肿瘤和TIL的淋巴结也含有MoAb也证明与所观察到的免疫学变化仅是对抗鼠MoAb的二次应答的可能性相反。

用探针鉴定的淋巴结特征在于CD4∶CD8比例增加。CD4+细胞的脑脊液细胞异常增多是炎症反应的重要的早期症状。已对癌症患者，包括结肠直肠癌患者的淋巴细胞表型进行了广泛的研究;从各个研究组获得的结果都不相一致。大多数的调查工作，包括本发明的调查已发现TIL的CD4∶CD8比例远远低于通常在PBL和在非相关淋巴结中观察到的2∶1比例。其它的调查者也已观察到在患有结肠直肠癌患者的淋巴结中CD4+细胞数的增加。Adachi等人报道在患有结肠直肠癌患者的淋巴结中CD4+细胞显著增加。Adachi等人报道与中间产物结（即动脉干中的那些结）相比和与来自胆囊切除术步骤中的结相比没有肿瘤的结肠结中CD4+细胞显著增加。Adachi等人“Immune Competent Cells of Regional Lymph Nodes in Colorectal Cancer Patients：I.Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Subpopulation”，J.Surg.Oncol.，1991;46∶110-6。

用探针鉴别的淋巴结始终显示对TAG-72⁺肿瘤细胞和对可溶性粘蛋白的激增应答，暗示存在前敏化作用。虽然对TAG-72^-肿瘤的激增应答低于对TAG-72⁺肿瘤的激增应答，但激增反应的特异性以及是否TAG-72/肿瘤相关的粘蛋白是关键的均无定论。向激增分析中加入结合到碳水化合物抗原决定基上的CC49 MoAb并不阻碍应答。

没有观察到由任何淋巴细胞群优先杀死自体肿瘤。更确切地说，在所有研究中平行地出现抗Daudi细胞，异源肿瘤和自体肿瘤的细胞裂解活性。现在的发现可能是所使用的IL-2浓度（1000U/ml）的后果;大多数仅用IL-2培养的TIL并不显示最大的组织相容性限制的细胞毒性，而是证明非特异的细胞毒性。在非主要的组织相容性限制的形式中识别粘蛋白的细胞毒性，T细胞显示出致死作用。已假定粘蛋白的多价特性允许多样的T细胞受体的有效的，同时的接合，因此排除了对抗原-受体复合物的主要的组织相容性限制的稳定作用的需要。细胞毒性和扩增研究的结果与非主要组织相容性限制的相互作用相一致。由探针鉴别的淋巴结的细胞溶解活性大于其它的淋巴结但小于PBL。前面研究的淋巴细胞的细胞毒性的结果有分歧。一些研究已得出结论，相关的和非相关的淋巴结淋巴细胞以及TIL的非特异细胞溶解活性是低于PBL的溶解活性。其它人已报道从淋巴结和TIL中产生的非特异性致死作用相当于或大于相应的PBL的致死作用。

未检测到淋巴细胞表型和带有显微镜观察下肿瘤的淋巴结和脱落抗原的淋巴结之间的功能有差异。由于患有结肠直肠癌的患者的局部淋巴结潜在地受各种各样的微生物和化学抗原的影响，并且是肿瘤诱导的正常障碍互解的结果，因而常弄不清楚是否在结肠直肠瘤的局部淋巴结中观察到的免疫学变化是肿瘤的或其它肠衍生的第二级刺激的结果。在来源于原发肿瘤和来源于结肠本身的淋巴结中观察到免疫学变化的事实暗示应答是对肿瘤产生的而不是对第二级肠衍生的刺激产生的。

实施例Ⅲ

进一步的试验操作

按上面报道的方式完成患者外科手术，淋巴结检测和切除。上述分析产生了下面所述的另外的后期试验结果。

细胞培养

在75cm²组织培养瓶（Falcon Co.）中以10⁶个细胞/ml的起始浓度在各种条件下将淋巴细胞悬液培养于添加了10%热失活的人血浆、青霉素和L-谷氨酰胺（GIBCO，Grand Island，NY）的RPMI 1640中。培养是在37℃，无菌条件下于5.0%CO₂的湿润组织培养箱（Forma Scientific）中完成的。在4天时通过向限制性培养基中加入新鲜培养基而将细胞培养物分离开至密度为2.5×10⁵个细胞/ml，并且在第7天时将细胞分离到密度为5.0×10⁶。采用Coulter计数器测定细胞数，并采用蓝色排除法检测存活性。使用下列的生物学应答修饰因子完成培养：IL-1（Immunex，Seattle WA），IL-2（Cetus Corp.，Emeryville，CA）IL-4（Amgen，Thousand Oaks，CA），干扰素-（IFN-γ）γ（Biogen，Cambridge，MA），OKT3抗-CD₃抗体（Ortho，Raritan，NJ），消炎痛（indomethacin）和甲氰咪胺。

表型分析：

用单克隆抗体和FACS测定淋巴细胞表型。将新鲜LNLs和人工培养的淋巴细胞以每50μl的含有10% FCS（FACS培养基）的Han-k＇s平衡盐溶解（HBSS）中10⁶个细胞的浓度置入V形96孔平板（Linbro Co.）上。将细胞0.2μg/20μl的鼠单抗（Beeton-Dickinson）在4℃保温1小时。以600rpm转速离心微滴板，并旋转沉淀和用150μlFACS重复洗涤三次。旋转细胞沉淀并在4℃将沉淀重新悬于荧光素结合的单抗-鼠单克隆抗体（Beeton-Dickinson）1小时。离心FITC染色的细胞并用FACS培养基洗涤三次，重新悬于加有1%福尔马林的0.5ml FACS中并置于4℃直到分析时使用。所使用的抗体针对抗原决定基CD₃（T-细胞受体），CD4（T-辅助细胞/诱导剂），CD8（T-细胞毒性/抑制剂），CD25（Tac/IL-2受体），CD45RA（真的），CD45RO（记忆），CD56（NK/LAK），CD19（B细胞），CD14（单核细胞/巨噬细胞）和荧光素结合的单抗-鼠IgG。

淋巴细胞细胞毒性

利用标准的⁵¹Cr释放4小时分析评估培养的淋巴细胞的细胞毒性。将自体结肠癌的肿瘤细胞靶和NK-抗性Daudi细胞系与铬酸钠⁵¹Cr100μCi/5×10⁶个细胞/0.5ml一起在37℃保温1小时。用10⁴肿瘤靶以100μl/孔的浓度在96孔微滴板中完成细胞毒性分析。加入100μl的效应细胞以达到效应器：靶（E∶T）的比例为1.5∶1、5∶1、20∶1和40∶1。向标记的肿瘤靶中加入Triton X-100以进行完全释放试验;在每一个分析试验中都既用完全释放又用自发释放样品作为对照。在37℃和5%CO₂中保温平板4小时，然后收集。在保温时期完成后，小心地吸出10μl的无细胞上清液，并计数。由通式：（试验cpm-自发cpm）/（总cpm-自发cpm）计算细胞毒性百分数。

淋巴增殖分析

通过³H-胸腺嘧啶掺入法测定淋巴细胞的增殖应答。在96孔微滴板中以每孔0.2ml完全培养基中10⁵个细胞的浓度培养淋巴细胞。用胶原酶消化自体肿瘤，洗涤并用3000拉德（铯源）辐射，然后以应答者：刺激器比例为2∶1将它与淋巴细胞一起保温。将淋巴细胞保温96小时，并用10μCi/孔³H-胸腺嘧啶（New England Nuclear）脉冲最后的12小时。用Skatron Ph.D.（Cambridge Technology）技术将平板收集到尼龙滤膜上并在Beckman 6500γ计数器的闪烁夹层中计数。

IL-2制备分析

利用IL-2依赖性CTLL细胞检测淋巴细胞扩增前和扩增后产生的IL-2。简而言之，将1×10⁵淋巴细胞在96孔微滴板上与生物学应答调节物一起保温过夜后，从每个孔中吸出10μl的上清液并转移到另一个平板上。以2×10³个细胞/孔的密度向平板中加入CTLL细胞，并在6小时后用1μCi/孔的³H-胸腺嘧啶脉冲。在12小时时收集平板并按前面描述计数。以达到标准浓度的IL-2时CTLL吸收的³H-胸腺嘧啶的cpm作为阳性对照。

细胞因子mRNA分析：

利用按Morgan等人“Detection of Cytokine mRNA in Vivoby PCR：Problems and Solutions”，Transplantation，56∶2∶437（1993）描述的聚合酶链反应（PCR）进行逆转录和扩增而分析细胞因子mRNA。通过在异硫氰酸胍缓冲液（4M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠pH7.0，0.5%，肌氨酸（Sarkosyl）钠，0.7%β-巯基乙醇）中匀浆化并在5.7M CsCl垫上超离心来提取总RNA。利用寡聚（dT）引物和200U MMLV逆转录酶从5μg RNA制备cDNA。用无菌水将样品稀释到终体积为150μl用于PCR。用标准技术在Perkin-Elmer或Thermolyne Temptronic热循环仪中完成PCR扩增。将cDNA（5μl）在含有10mM Tris-Cl，pH8.3，50mM Kcl，1.5mM MgCl₂，0.2mM dNTPs，0.4μM引物，和1.25U Taq聚合酶的50μl反应中扩增cDNA（5μl）。循环参数94℃，1分钟;50℃～60℃，2分钟;72℃，1分钟;循环40次。通过在2%琼脂糖上电泳并用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色。用于IL-2、IL-4、IL-5的PCR引物、肿瘤坏死因子（TNF）-β、β-肌动蛋白和干扰素（IFN）-γ是来自于Brenner等人“Message Amplification Phenotyping：ATechnique to Simultaneously Measure Multiple mRNAs from Small Numbers of Cells”，Biotechniques，7∶1096（1989），并用Oligos，Etc，（Wilsonville，OR）分析。

统计分析：

使用方差分析（ANOVA）比较在扩增和IL-2产生分析试验中各处理组之间的差异;使用非参数分析评估扩增指数。

结果

扩增：

用CC49单克隆抗体定位根据＇840专利描述进行了外科手术的30个患者的淋巴结。利用各种各样生物学应答调节剂体外扩增。在进行短期扩增（<21天）后的扩增参数（即总淋巴细胞数增加倍数）显示于表15中。

表15

RIGS-定位的淋巴结的扩增参数

以1×10⁶个细胞/ml的浓度培养LNLs并在培养4天和10天时将细胞分离开以便达到最大增殖。数据代表淋巴结淋巴细胞的扩增参数（倍数增加）的平均值±S.D.。用Ⅰ-2/抗-CD₃培养RIGS-定位的LNLs导致与Ⅰ-2和IL-1/IL-2相比增加倍数显著地提高（P<0.00001）。

天数6  天数10  天数14  天数21

IL-2 1000 U  0.94±0.2  2.52±0.8  7.84±3.8  32.5±12

IL-1/IL-2  1.27±0.3  3.6±1.0  13.6±8.2  41.3±18

IL-2/抗-CD₃2.88±1.8 36.0±13 88.6±21 173±115

RIGS定位的LNL在与IL-2 100U/ml和IL-1 200U/ml+IL-2 100U/m培养时大约扩增40倍。用I-2 100U/ml和抗-CD₃MAb培养的淋巴结群显示比仅用IL-2培养时其扩增显著地增高（P＜0.00001）。向含有IL-2的培养物中加入IL-4（100～1000U/ml），干扰素-γ（100～1000U/ml），甲腈咪胍（100μg/ml），或消炎痛（100μg/ml）在任何时间点都不显著地改变扩增或表型。

在各个时间期间进行表型分析，以鉴别淋巴细胞的哪一个群体应答这些培养条件而生长。

表16

培养的淋巴结淋巴细胞的表型

用IL-2 1000U/ml，IL-1 200 U/ml和IL-2 100 U/ml，或IL-2 100 U/ml以及抗-CD₃0.1g/ml扩增的RIGS定位的LNLs的表型。结果表示根据FACS染色显示阳性的细胞的平均百分数±SD（n＝6患者）。

CD4  CD8  CD10

0天  10天  0天  10天  0天  10天

IL-2  74±5.2  36±2.4  14±4  29±12  7±4  29±5

IL-1/IL-2  74±5.2  44±7.9  14±4  33±13  7±4  23±7

IL-2/抗-CD₃74±5.2 76±10 14±4 15±10 7±4 7.7±5

在0天时由RIGS定位的新鲜LNLs的表型显示CD4/CD8的比例为大约5∶1。在10天时在IL-2/抗-CD₃细胞中维持CD4+主要表型，而在IL-2和IL-1/IL-2中培养的LNL在第10天时趋向于产生CD8+和CD56+表型。表13提供了来自五个患者的在IL-2/抗-CD₃中扩增的LNL的特性。

表17

用IL-2/抗-CD₃培养的RIGS定位的LNLs的表型

在IL-2 100 U/ml和抗-CD₃抗体0.1μg/ml时在各个时期培养的RIGS定位的淋巴结的表型。数据表示阳性染色细胞百分数的平均值±S.D.（n＝5个患者）。

4天  7天  10天  14天  21天

CD3  70±16  85±19  83±18  89±11  88±13

CD4  64±17  74±13  79±21  78±14  66±12

CD8  9±5  16±9  19±4  23±5  34±9

CD56  4±3  6±4  5±4  3±4  2±2

CD45RA  13±5  4±6  13±8  11±9  13±6

CD45RO  42±11  74±12  51±13  78±10  80±8

HLA-DR  28±7  64±12  61±11  83±11  87±5

在培养期的早期（＜12天），维持脑脊液（淋巴）细胞增多，这种状况与在10天时大约有40倍扩增。当培养期延长到14天时，产生CD8+细胞并且CD4∶CD8细胞比例降低。在整个培养期间可观察到CD45RO+（记忆）增加，并且HLA-DR表达增加，暗示活化。在10天后与B细胞（CD19）和单核细胞（Leu-M3）相关联的表型低于所有测试培养物的5%。

细胞毒性：

为了评估是否这些培养条件导致细胞溶解的淋巴细胞的过度生长，体外检测细胞毒性。在7天前观察抗自体结肠肿瘤细胞的细胞毒性，随后在培养10天后这种毒性减至无意义水平。没有一种测试的培养条件导致细胞溶解T细胞的长期过度生长。在整个培养期间抗NK-抗性Daudi细胞的细胞毒性显示相似的动力学，暗示在培养期的早期的细胞毒性与淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）活性有关。

经扩增的LNL的激增应答：

为了评估经扩增的细胞的激增能力，在自体肿瘤以及含有CC49抗原决定基的牛颌下腺粘蛋白（BSM）存在下在10天时检测在IL-2/抗-CD₃中培养的LNL。记录了下列数据。

表18

试验1  试验2

分裂素  应答(cpm)  应答(cpm)

未处理  777±226  901±223

IL-2  17337±3507  19283±3199

IL-2+肿瘤  28527±3969  30962±4412

IL-1+BSM  25585±4941  30034±1130

这些结果暗示IL-2/抗-CD₃扩增的细胞保留了应答可溶性粘蛋白以及自体肿瘤而激增的能力。

IL-2产生：

为了评估扩增的细胞分泌细胞因子的能力，评估在IL-2和抗-CD₃抗体扩增的探针定位的LNL（＇840专利方法），在0天（扩增前）和10天（扩增后）时产生的IL-2。

表19

IL-2/抗-CD₃扩增的LNL产生的IL-2

将扩增的细胞单独培养（NT）或与PMA 10 ng/ml一起培养12小时。通过将CTLL³H-胸腺嘧啶掺入其中而检测上清液中产生的IL-2。结果表示4个重复测定的平均值±S.D.。与所有三个试验（P<0.0001）中0天时相比，PMA刺激的经过10天培养的淋巴细胞产生的IL-2显著增高。

试验1  试验2  试验3

NT  PMA  NT  PMA  NT  PMA

0天  1549±  4187±  1039±  3626±  1522±  10648

123  416  145  1072  428  ±742

10天  3776±  16919±  1796±  15459  4997±  21013

60  2136  472  ±739  258  ±1307

用IL-2和抗-CD₃培养10天的LNLs保留了向体外分泌IL-2的能力。尽管基线值反应患者存活性，但用佛波醇酯（PMA 10ng/ml）刺激的扩增细胞与0天相比导致IL-2产生显著增加（P＝0.0001）。

细胞因子mRNA的表达：

利用RT-PCR进行LNLs的细胞因子mRNA分析以证实经扩增的效应产生细胞因子的潜力。图9显示在IL-2/抗-CD₃中经扩增10天的LNLs的细胞因子mRNA的表达。该培养的细胞群表达各种各样的mRNAs如IL-2、IL-4、IL-5、IFN_γ以及TNF-β，一种混合的Th1和Th2群体的暗示形式。

讨论：

选定的细胞治疗法已证明在临床试验中有希望治疗几种癌症。就绝大部分而言还能抗结肠直肠癌。涉及到细胞来源，体外活化方法，以及体内抗肿瘤活性的机理是引起争论的问题。尽管还没有确定在选定的细胞治疗中使用的效应细胞的特性，但是最近的证据表明选定的转化细胞的体内效果与分泌细胞因子的能力的相关性比与体外细胞毒性的相关性更大。Barth等人，“Interferon γ and tumor Necrosis Factor Have a Role in Tumor Regression Mediated by Murine CD8+Tumor-Infiltrating Lymphocytes”，J.Exp.Med.，173∶647（1991）。本发明的工作包括调查使用TAG-72-特异性CC49单克隆抗体扩增淋巴结的效应细胞的方法，这种淋巴结在体内反抗患有结肠直肠癌的患者的显微镜观察到的肿瘤以及脱落肿瘤粘蛋白。

在试图避免对肿瘤分泌的因子的次级抑制的方案中，使用＇840专利系统以鉴别远离诊断为含有隐性的、显微镜可观察到的肿瘤以及脱落TAG-72的淋巴结。上面提供的资料证明根据＇840号专利定位的淋巴结是CD4+细胞的好来源，该CD4+细胞已在体内经受对微小的转移性肿瘤和脱落肿瘤抗原产生应答而激活。这些经过定位的淋巴细胞其特征在于CD4+脑脊液细胞增多，并且相对于主要是“真的”CD45RA+的非相关LNLs而言，它含有高百分数的CD45RO+“记忆”细胞。带有显微镜下观察到的肿瘤和脱落抗原的LNLs对分裂素的体外激增应答比外周血淋巴细胞、TILs、非相关的淋巴结或带有肉眼可见的肿瘤的结显著增高并且更专一。

几种方法的证据始终与这些淋巴结对TAG-72抗原的抗原-特异性加工相一致。通过将患有结肠直肠癌的以前未收到抗体的患者的无肿瘤淋巴结的胚中央进行免疫组织化学染色;以及对有抗-CEA抗体的这些淋巴结的染色的免疫组织化学研究没有证明同样类型的抗原加工过程。另外，这些淋巴结淋巴细胞对可溶性粘蛋白TAG-72的体外应答激增表明它们在体内已对TAG-72敏感，对可溶性CEA的同样应答没有看到。

可能是由于限制的培养间隔以及培养条件的缘故，所测试的培养方法没有引出肿瘤-特异性CTL产生的证据。由Finn及其同事们将胰癌患者的引流肿瘤的淋巴结与IL-2一起培养并用肿瘤细胞重复刺激。Finn关于“Pancreatic Tumor Antigens：Diagnostic Markets and Targets for Immunotherapy”，PP.16-17一章，在DeVita等人，Important Advances in Oncology，J.B.Lippincott，Philadelphia，PA（1992）;以及Jerome等人，“Cytotoxic T-Lymphocytes Derived from Patients with Breast Adenocarcinoma Recognize an Epitope Present on the Protein Core of a Mucin Molecule Preferentially Expressed by Malignant Cells”，Cancer Res.，51∶2908-2916，1991;and Brand，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA（上文）上公开。由于在＇840专利定位的淋巴结淋巴细胞的培养物中CD4+细胞占优势，因而抗肿瘤靶的直接细胞毒性一般来说是低的也不令人吃惊。由＇840系统检测出的LNLs是否按Finn等人观察到的非MHC限制的方式识别粘蛋白核心蛋白抗原现在仍在调查中。

已在几个动物模型中证明非细胞溶解的，分泌细胞因子的T细胞的选定的转移促进了扩散性癌的完全根除。Kahn等人“CD4 Cell Clones Specific for the Human P⁹⁷Melanoma-Associated Antigen Can Eradicate Pulmonary Metastases from Murine Tumor Expressing the P⁹⁷Antigen”，J.Immunal.，146∶3225（1991）;和Forni等人，“Helper Strategy in tumor Immunology：Expansion of Helper Lymphocytes and Utilization of Helper Lymphokines for Experimental and Clinical Immumotherapy”，Can.Metast.Rev.，7∶289（1988）。已证明分泌许多细胞因子的T细胞激活各种各样的宿主效应器机构，包括CTL，多形态核细胞和杀癌细胞巨噬细胞。细胞因子mRNA的IL-2、IL-4、TNF-β和IFN-γ存在于IL-2/抗-CD₃扩增细胞中暗示一种包括细胞和体液的免疫应答的混合的Th1和Th2表型。观察到在扩增后由这些＇840专利定位的LNLs显著地产生IL-2，暗示它们在体内作为T-辅助细胞起作用。在几个试验动物模型中已观察到可控制肿瘤的演化和减轻，在这几个模型中通过将基因转染的肿瘤细胞，可能借助补充效应宿主而连续地产生低含量的IL-2和IL-4。Golumberk等人，“Treatment of Established Renal Cancer by Tumor Cells Engineered to Secrete Interleukin-4”，Science，254∶713（1991）。

使用放射性标记的单克隆抗体分泌体内反抗一种特异性肿瘤相关的粘蛋白的LNL为患有晚期结肠直肠癌患者的选定的细胞免疫治疗提供了独特机会。由于每一个＇840专利定位的淋巴结含有大约5×10⁸细胞，以每一个类群为基础，在试验动物模型中将有效的细胞数目扩增20倍。

为了证明本发明公开的新治疗剂的减轻肿瘤的能力，提供下列数据。这些数据是本发明的图表，并不构成对本发明的限制。

实施例Ⅳ

治疗方案

结肠直肠癌的研究

在该结肠直肠癌研究中已收集了二十七个患者。按上文描述以及在＇840号专利中公开的内容每个患者接收¹²⁵I CC49单克隆抗体，之后间隔一定的时间。然后给每个患者进行外科手术。测定出其中三个患者完全是可切除的，因而从该研究中排除出。测定出留下的24个患者患有不可切除的疾病。测定出淋巴结，并移出。将通过肉眼观察检测测定出那些不含有肿瘤的淋巴结，以上文中描述的方式进行扩增。随机分配这些患者使之仅接收细胞（无IL-2）或施用细胞加IL-2。记录下列资料：

表20

患者 年龄/ RIGS 细胞 IL-2 最好^*评价

编号 性别 日期 (10¹⁰) 应答

1  54/M  11/20/92  1.4  -  SD  93年4月开始化疗

93年5月观察到部分

应答

2  55/F  12/10/92  4.0  -  PD  进行性疾病:在治疗

前负担了大肿瘤(肝

块17×15cm)

3  37/F  1/8/93  2.4  -  CD  肿瘤继续减轻,肿瘤

是5×5cm,现在<2cm

并大量骨化(11/93)

4  69/F  1/29/93  3.3  +  MR  在1个月后,肝转移

降低>20%。从93年4

月28日开始演化。

部分应答的化疗开

始于93年5月

表20(续)

患者 年龄/ RIGS 细胞 IL-2 最好^*评价

编号 性别 日期 (10¹⁰) 应答

5  37/M  2/18/93  4.3  +  SD  CA-125从133(4/93)

降至62(6/93)。CEA

是在正常限值(11/

93)内

6  46/M  3/5/93  7.3  +  SD  从93年6月14日开始

转移到肺

7  50/M  3/26/93  NA  NA  NA  完全切除-终止研究

8  70/M  4/9/93  4.3  +  SD  93年9月8日开始演化

9  54/M  4/23/93  4.3  +  PR  未观察到盲肠,损伤

6×6cm(93年7月)

10  36/M  6/18/93  3.2  -  PD  由肿瘤取代70%肝脏

(演化从93年8月25

日)

表20(续)

患者 年龄/ RIGS 细胞 IL-2 最好^*评价

编号 性别 日期 (10¹⁰) 应答

11  70/F  7/2/93  3.2  +  SD  从93年10月6日开始

演化

12  23/M  7/9/93  1.7  +  PD  93年9月2日终止

13  47/M  7/23/93  0.6  -  PD  在治疗前负担大批

肿瘤(11cm×12cm肝

损坏)新损伤8/1/93

终止12/24/93

14  53/M  7/30/93  0.4  -  SD  在93年9月15日演化

从9/15到11/17稳定

15  58/F  8/27/93  NA  NA  NA  完全切除-终止研究

16  55/M  9/3/93  2.3  -  SD  完成研究

17  68/F  9/24/93  1.1  -  SD  完成研究

表20(续)

患者 年龄/ RIGS 细胞 IL-2 最好^*评价

编号 性别 日期 (10¹⁰) 应答

18  66/M  10/8/93  5.4  +  SD  二月后疾病稳定

19  65/M  11/19/93  2.5  +  SD  二月后疾病稳定

20  63/M  NA  NA  NA  NA  完全切除-终止研究

21  56/M  2/25/94  N/A  +  PD  所有损伤增加

无新的LFT's稳定

22  52/M  3/11/94  N/A  +  SD

23  59/F  4/15/94  0.49  -  N/A

24  46/M  4/22/94  0.16  -  N/A

25  50/M  5/6/94  N/A  -  N/A

26  64/F  5/13/94  N/A  -  N/A

表20

患者 年龄/ RIGS 细胞 IL-2 最好^*评价

编号 性别 日期 (10¹⁰) 应答

27  59/M  5/27/94  N/A  -  N/A

＊CR＝完全应答;PR＝部分应答;MR＝微小应答

SD＝稳定疾病;PD＝演化疾病;NA＝不适用

临床应答：

有两个患者（编号3和4）已显示在有和无IL-2情况下有减轻肿瘤的迹象。然后对这些患者重复扫描评价肿瘤应答，作出本研究的补充部分。

毒性：本治疗有很好的耐药力。伴随细胞输注没有并发症。在细胞输注后大约1小时所有患者开始发烧和发冷。用药剂很容易控制这些症状。在接收了外源IL-2的患者中已观察到肝酶的无症状的和暂时的提高。

免疫效果：

已收集到大量的免疫学数据包括表面表型，细胞因子mRNA表达，以及经扩增细胞的细胞毒性;对自体肿瘤的DTH应答（皮肤试验）;外周血淋巴细胞毒性;外周血细胞表型;血清细胞因子;以及¹¹¹In-标记细胞的细胞输送研究（患者5号）。由于收集太早没有获得决定性结果。

上述数据清楚地证明来自于富含CD4+淋巴细胞中的经确定的淋巴结的治疗剂的效果。基于在患者4中观察到的应答，将已接收了本发明治疗剂的患者给予佐剂化学治疗可能是对患者特别有益，甚至在接收本发明中公开的本发明的选定的细胞治疗处理前将已重钙化的患者进行化疗。根据涉及将佐剂化疗施用给合适阶段的患者的国家健康机构（NIH）的一致报告这一点特别重要。“NIH Consensus Conference：Adjuvant Therapy for Patients with Colon and Rectal Cancer”，JAMA，1990;264∶1444-50。

Buroker等人“Randomized Comparison of Two Schedules of Fluorouracil and Leucovorin in the Treatment of Advanced Colorectal Cancer”，J.Clin.Oncol.，Vol.12，No.1，pp14-20（January 1994），报道了接收两种不同给药方式的5FU/甲酰四氢叶酸的372个患者存活9.3和10.7个月（中数）。而Stangl等人“Factors Influencing the Natural History of Colorectal Liver Metastases”，Lancet，1994;343∶1405-10，报道了在484个未处理的患者中，中数存活期是从诊断时间开始的7.5个月;而对于经受了局部的或全身化疗的患者，中数存活时间分别为12.7和11.1个月。图12图解显示给药后的时间对施用新的治疗剂后存活的患者的数目（参见表12）。这些结果是初步的并且是对于小群体的患者，可以看到对患者的利益。

胰癌研究

迄今为止在这一胰癌研究中收编了二个患者。按上面描述和在＇840患者中描述每个患者接收¹²⁵I CC49单克隆抗体，之后间隔1个时间阶段。然后给每个患者进行外科手术。测出这两个患者患有不可切除的疾病。检测出淋巴结，然后移出。然后按上面描述的方式将用肉眼观察到的不含有肿瘤的那些淋巴结进行扩增。随机地分配患者接受单独的细胞（无IL-2）、对他们使用细胞+IL-2，记录下面数据：

表21

患者  年龄/  RIGS  细胞  IL-2  最好  评论

编号 性别 日期 (10¹⁰) 应答

1  62/F  4/1/94  N/A  -  PD

2  69/F  4/1/94  N/A  +  N/A

＊CR＝完全应答;PR＝部分应答;MR＝微小应答

SD＝稳定疾病;PD＝演化疾病;NA＝不适用

在该申请中，所有引文特地引入本文作为参考。

Claims (66)

1、一种检测淋巴结的方法，该淋巴结富集于包括CD4+肿瘤特异性淋巴细胞的肿瘤特异性淋巴细胞中，包括下列步骤：

a)给患者施用有效量的放射性标记的定位剂，该定位剂特异性地结合一种由瘤组织产生的或与之相关的一种标志；

b)在步骤a)之后间隔一段时间，目的使所说的放射性标记的定位剂优先富集于瘤组织中，并且清除掉未结合的放射性标记的定位剂，以便提高患者瘤组织的光发射与背景光发射的比例；

c)在步骤b)中所述的时间间隔之后，通过用放射性检测探针检测所述淋巴结位点处提高的发射含量的方法，用所述探针确定显示有合生了放射性标记的定位剂的淋巴结位点来接近所述患者；

d)取出在步骤c)中测出的淋巴结；

e)从那些取出的淋巴结中选择肉眼观察不含有肿瘤迹象的淋巴结；并且

f)培养从步骤e)中选出的所说的淋巴结以激增本文中所述的肿瘤特异性淋巴细胞。

2、根据权利要求1的方法，其中在步骤d）中取出的淋巴结是那些通过肉眼观察和触诊没有肉眼可见肿瘤迹象的淋巴结。

3、根据权利要求1的方法，其中所述的选出的淋巴结在步骤f）中受促细胞分裂素刺激进行培养。

4、根据权利要求3的方法，其中在步骤f）中所述的淋巴细胞是在白细胞介素-2和抗-CD₃单克隆抗体存在下培养。

5、根据权利要求4的方法，其中所述的培养进一步包括肿瘤相关的糖蛋白（TAG）抗原。

6、根据权利要求4的方法，其中所述的培养进一步包括含有一种或多种自体瘤组织或异源瘤组织的瘤组织。

7、根据权利要求4的方法，其中白细胞介素-2的量在约10～500μ/ml的范围内并且抗-CD₃单克隆抗体的比例在约10～500ng/ml的范围内。

8、根据权利要求6的方法，其中所述瘤组织已在所述培养步骤g）之前失活。

9、根据权利要求8的方法，其中所述瘤组织已用放射源进行辐射以使之失活。

10、根据权利要求1的方法，其中包括从步骤e）中选定的所述淋巴结中分离出CD4+细胞以便进行步骤f）的培养。

11、根据权利要求1的方法，其中在步骤f）中培养的所述的淋巴细胞来源于脾淋巴细胞。

12、根据权利要求1的方法，所述定位器是一种或多种多克隆抗体、单克隆抗体、抗体片段及其嵌合体，及一种人变体，一种单链抗体或肽。

13、根据权利要求1的方法，其中的定位器选自于A₅B₇单克隆抗体、CC49单克隆抗体、CC83抗体及其结合体。

14、根据权利要求1的方法，其中所述的放射性标记发射出γ射线或β-射线，这种射线可由所述的放射检测探针检测。

15、根据权利要求14的方法，其中所述的放射性标记具有不超过约550kev的能量选择范围。

16、根据权利要求15的方法，其中所述的放射性标记包括¹²⁵I。

17、根据权利要求1的所述方法，其中所述放射性标记包括¹²⁵I。

18、根据权利要求4所述方法，其中所述放射性标记包括¹²⁵I。

19、根据权利要求1所述方法，其中可用手工操作的可移动位置的轻便发射检测探针在步骤c）中通过外科手术接近所述患者。

20、根据权利要求1所述方法，其中用一种内窥镜或腹腔镜在步骤c）中评估所述患者。

21、根据权利要求1所述方法，其中所述放射检测探针在增加放射含量的情况下与一种产生声音的应答器结合。

22、根据权利要求1所述方法，其中在步骤b）中所述比例大于约1.5∶1。

23、根据权利要求4所述方法，其中在步骤c）中用一种内窥镜或腹腔镜接近所述患者。

24、根据权利要求1的方法，其中给患者施用步骤f）中经激增的淋巴结。

25、根据权利要求7的方法，其中给患者施用步骤f）中经激增的淋巴结。

26、根据权利要求9的方法，其中给患者施用步骤f）中经激增的淋巴结。

27、一种治疗剂，其能有效地减轻肿瘤患者的肿瘤的演化，该治疗剂包含药物学上可接受的载体：

从患者切下的富集包含CD4+肿瘤特异性淋巴细胞的肿瘤特异性淋巴细胞的淋巴结，其中淋巴结已受分裂素刺激以便其扩增。

28、根据权利要求27的所述治疗剂，其中在白细胞个素-2和抗-CD₃单克隆抗体存在下培养所述的淋巴结。

29、根据权利要求28的所述治疗剂，其中所述培养进一步包括一种或多种肿瘤相关的糖蛋白（TAG）抗原或瘤组织。

30、根据权利要求29的治疗剂，其中所述培养包括含有一种或多种自体瘤组织或异源瘤组织的瘤组织。

31、根据权利要求28的治疗剂，其中白细胞介素-2的含量范围从约10到500U/ml范围，抗-CD₃单克隆抗体的比例范围为约10～500ng/ml。

32、根据权利要求30的治疗剂，其中所述瘤组织在用所述淋巴结培养前失活。

33、根据权利要求32的治疗剂，其中所述瘤组织用放射源辐射使其失活。

34、根据权利要求27的治疗剂，其中所述的淋巴结来源于脾淋巴细胞。

35、一种使患有肿瘤的患者减轻肿瘤症状的方法，包括给所述病人施用有效量的权利要求27的治疗剂。

36、一种使患有肿瘤的患者减轻肿瘤症状的方法，包括给所述病人施用有效量的权利要求28的治疗剂。

37、一种使患有肿瘤的患者减轻肿瘤症状的方法，包括给所述病人施用有效量的权利要求29的治疗剂。

38、使患有肿瘤的患者减轻肿瘤症状的方法，包括给所述病人施用有效量的权利要求33所述的治疗剂。

39、使患有肿瘤的患者减轻肿瘤症状的方法，包括给所述病人施用有效量的权利要求34所述的治疗剂。

40、根据权利要求35的方法，所述患者随后将进行佐剂化学治疗。

41、用于培养含有从患者切下的淋巴结的淋巴结的方法，该淋巴结富集在肿瘤特异性淋巴细胞包括CD4+肿瘤特异性淋巴细胞中，该方法包括以下步骤：

（a）从所述切下的淋巴结中分离出淋巴结淋巴细胞（LNL）;

（b）在存在分裂素刺激条件下培养所述LNL以扩增所述LNL;

（c）随后，除去所述分裂素的刺激。

42、根据权利要求41所述方法，其中所述的LNL在白细胞介素-2（IL-2）、抗-CD₃单克隆抗体，和肿瘤相关的糖蛋白（TAG）抗原存在下进行培养。

43、根据权利要求42的方法，其中白细胞介素-2的量范围为10～500U/ml，并且抗-CD₃单克隆抗体的比例范围为从约10～500ng/ml。

44、根据权利要求42的方法，其中所述的IL-2和抗-CD₃是可溶的，并同时被加入到所述的LNL中。

45、根据权利要求41所述方法，在巨噬细胞培养基中培养所述的LNL。

46、根据权利要求45所述方法，其中所述培养基是无血清培养基。

47、一种培养淋巴结的方法，该淋巴结包括从患者切下的富集于肿瘤反应性细胞的淋巴结，该方法包括：

（a）从所述切下的淋巴结中分离出肿瘤活性细胞;

（b）在分裂素刺激条件下培养所述肿瘤活性细胞以扩增所述的肿瘤活性细胞;

（c）之后，除去所述分裂素刺激。

48、根据权利要求41的方法，其中在白细胞介素-2（IL-2）、抗-CD₃单克隆抗体，和肿瘤相关的糖蛋白（TAG）抗原存在的条件下培养所述肿瘤反应性细胞。

49、根据权利要求48的方法，其中白细胞介素-2的量的范围为约10～500U/ml，抗-CD₃单克隆抗体的量为从约10～500ng/ml。

50、根据权利要求48所述方法，其中向所述肿瘤反应性细胞中同时加入所述可溶性IL-2和抗-CD₃。

51、根据权利要求47所述方法，其中所述肿瘤反应性细胞于巨噬细胞培养基中进行培养。

52、根据权利要求51的方法，其中所述培养基是无血清培养基。

53、一种有效地减轻肿瘤患者的肿瘤治疗剂，该治疗剂包括药物学上可接受载体以及：

富集于肿瘤反应性细胞上的从病人切下的淋巴结，该淋巴结已受分裂素刺激而扩增。

54、根据权利要求53所述的治疗剂，其中在白细胞介素-2和抗-CD₃单克隆抗体存在下培养所述淋巴细胞。

55、根据权利要求54所述治疗剂，其中包括进一步培养一种或多种肿瘤相关的糖蛋白（TAG）抗原或瘤组织。

56、根据权利要求55所述治疗剂，其中所述培养包括含有一种或多种自体瘤组织或异源瘤组织的瘤组织。

57、根据权利要求54所述治疗剂，其中白细胞介素-2的量范围是从约10～500U/ml，抗-CD₃单克隆抗体的比例范围为从约10～500ng/ml。

58、根据权利要求56的治疗剂，其中所述瘤组织已在用所述淋巴结培养前进行过失活。

59、根据权利要求58的治疗剂，其中所述瘤组织已用放射源进行辐射使其失活。

60、根据权利要求53的治疗剂，其中所述淋巴结来自于脾淋巴细胞。

61、一种减轻肿瘤患者肿瘤症状的方法，包括给患者施用有效剂量的权利要求53所述治疗剂。

62、一种减轻肿瘤患者症状的方法，包括给所述患者施用有效量的权利要求54的治疗剂。

63、一种减轻肿瘤患者症状的方法，包括给所述患者施用有效量的权利要求55的治疗剂。

64、一种减轻肿瘤患者症状的方法，包括给所述患者施用有效量的权利要求59的治疗剂。

65、一种减轻肿瘤患者症状的方法，包括给所述患者施用有效量的权利要求34的治疗剂。

66、根据权利要求61所述方法，其中所述患者随后将进行佐剂化疗。

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