CN103374128A - 两亲性三嵌段共聚物、聚合物纳米载体制剂及制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种两亲性三嵌段共聚物、聚合物纳米载体制剂及制备方法，该共聚物为包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的线性高分子化合物，其中，所述聚赖氨酸一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连。该两亲性三嵌段共聚物，即聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物，结合了聚乙二醇和聚氨基酸的优势，可以在水溶液中自组装形成具有三层结构的纳米载体，可以同时有效的负载小分子疏水性药物、基因物质以及蛋白质或多肽，是一种多功能的纳米载体。
Description
【技术领域】
本发明涉及纳米医学领域，尤其涉及一种两亲性三嵌段共聚物、聚合物纳米载体制剂及相应的制备方法。
【背景技术】
纳米载体是指可以负载小分子药物、基因和蛋白质等目标物质且具有纳米尺度的系统。
纳米药物载体是指可以负载药物的纳米系统，主要用于药物的缓释、控释、靶向输送以及增加疏水性药物的溶解性等。聚合物纳米胶束是研究最多的纳米药物载体，其由两亲性(同时具有亲水和亲油组分)的聚合物分子在水溶液中经过自组装制备而成，具有疏水性的内核和亲水性的外壳。聚合物纳米胶束和常规的小分子胶束相比较具有较低的最低成胶束浓度(CMC)，因此它能高效稳定的负载疏水性小分子药物。同时聚合物纳米胶束容易进行适当的靶向修饰和能性改进，十几年来一直是各国科学家研究的热点。
纳米基因载体是指可以负载基因物质(DNA或RNA)的纳米系统，主要用于基因治疗过程中向体内传输基因。基因治疗是指通过将治疗基因导入患者体内，来补救缺陷基因或表达产生有治疗作用的蛋白质从而达到治疗疾病的效果。基因治疗可以从根本上治疗很多疾病，是当前医学和化学领域的研究热点之一。从目前的研究现状来看，基因治疗的关键问题是如何通过合适的载体将基因有效导入体内并使其表达。在这个过程中需要跨越的屏障很多，如基因物质非常容易降解或失活或难以到达靶细胞内部。阳离子聚合物纳米基因载体是近十年来研究热点，阳离子聚合物通过正负电荷作用力可以与DNA或者RNA形成纳米结构，可以有效的保护基因不被降解并且由于带有正电荷从而容易被细胞吞噬，因此它具有高效、低毒等各种优势。
纳米蛋白质载体是指可以负载蛋白质或多肽的纳米系统，纳米蛋白质载体主要用于大分子蛋白质药物的传输或用于负载抗体作为疫苗佐剂。一般来讲纳米蛋白质载体需要带有比较强的正电荷，从而可以吸附带负电荷的蛋白质。常见的纳米蛋白质载体有阳离子脂质体、纳米凝胶等。
但传统的纳米载体一般只能负载一种成分，不能同时负载小分子药物、基因和蛋白。
【发明内容】
基于此，有必要提供一种既能负载药物又能负载基因和蛋白的两亲性三嵌段共聚物及其制备方法。
一种两亲性三嵌段共聚物，为包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的线性高分子化合物；其中所述线性高分子化合物结构为聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连，且所述聚乙二醇衍生物的分子量范围为500-10000，所述聚赖氨酸的聚合度为10-200，所述聚亮氨酸的聚合度为10-200。
在一个实施例中，所述聚乙二醇衍生物为单甲醚氨基聚乙二醇或者氨基聚乙二醇羧酸。
在一个实施例中，所述共聚物的分子量为3000-60000。
一种两亲性三嵌段共聚物的制备方法，包括如下步骤：将分子量范围为500-10000的聚乙二醇衍生物溶于有机溶剂中，浓度范围为1-100mg/mL；在氮气保护下，将上述溶液加热至30-50℃，然后加入侧链保护的赖氨酸环状酸酐单体，所述侧链保护的赖氨酸环状酸酐单体与所述聚乙二醇衍生物的摩尔比为10-200∶1，氮气保护下恒温反应24-120小时；加入亮氨酸环状酸酐单体，所述亮氨酸环状酸酐单体与所述聚乙二醇衍生物的摩尔比为10-200∶1，氮气保护下继续恒温反应24-120小时，反应结束后加入5-50倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤、干燥得到包含聚乙二醇衍生物、侧链保护的聚赖氨酸及聚亮氨酸的三嵌段共聚物，其中，所述侧链保护的聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连；将所述包含聚乙二醇衍生物、侧链保护的聚赖氨酸及聚亮氨酸的三嵌段共聚物溶于0℃的三氟乙酸中，加入HBr体积分数为30％的HBr/HAc溶液，其中，HBr的摩尔量为赖氨酸的侧链保护基团摩尔量的2-4倍，反应2-4小时后，再加入5-50倍于反应体系体积的乙醚进行沉淀、过滤；及将过滤后固体产物溶解于极性有机溶剂中，使用截留分子量为2000-8000的透析袋在水中透析12-96小时，每2-6小时换透析水一次，随后冻干，得到包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸及聚亮氨酸所述两亲性三嵌段共聚物，其中，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连。
该两亲性三嵌段共聚物，即聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物，结合了聚乙二醇和聚氨基酸的优势，可以在水溶液中自组装形成具有三层结构的纳米载体，其中最内层的聚亮氨酸链段聚集形成疏水性内核，中间层的聚赖氨酸构成正电荷层，最外层的PEG衍生物起保护作用。以聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物为基础制备而成的阳离子纳米载体由于其特殊的结构使得聚赖氨酸正电荷得到聚集形成了一个正电荷层，大大曾强了负载基因和蛋白质等负电物质的能力，同时由于聚亮氨酸具有α-螺旋的二级结构使得阳离子纳米载体稳定性得到增加，由于该阳离子纳米载体同时具有疏水性内核和正电荷层，因此可以同时有效的负载小分子疏水性药物、基因物质以及蛋白质或多肽，是一种多功能的纳米载体。
通过使用NCA开环聚合的方法合成该两亲性三嵌段共聚物，制备过程简单，合成效率高。
同时，还有必要提供一种负载药物或者负载基因蛋白的聚合物纳米载药制剂及其制备方法。
一种聚合物纳米载体制剂，包括大于零小于等于20重量份数的疏水性药物以及1-100重量份数的纳米载体胶束；所述纳米载体胶束是由两亲性三嵌段共聚物形成的具有三层结构的复合体，所述两亲性三嵌段共聚物为包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的线性高分子化合物；其中，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连，且所述聚乙二醇衍生物的分子量范围为500-10000，所述聚赖氨酸的聚合度为10-200，所述聚亮氨酸的聚合度为10-200；所述聚亮氨酸构成所述复合体的内层，所述聚赖氨酸构成所述复合体的中间层，所述聚乙二醇衍生物构成所述复合体的外层；所述疏水性药物分散中内层的聚亮氨酸中。
在一个实施例中，所述疏水性药物选自阿霉素、紫杉醇、顺铂、氟尿嘧啶、甲氨喋呤及喜树碱中的至少一种。
在一个实施例中，还包括大于零小于等于20重量份数的基因物质，所述基因物质分散在中间层的所述聚赖氨酸中。
在一个实施例中，所述基因物质选自抑癌基因、自杀基因、SiRNA、mRNA及反义核酸中的至少一种。
在一个实施例中，还包括大于零小于等于20重量份数的蛋白质或多肽，所述蛋白质或多肽分散在中间层的所述聚赖氨酸中。
在一个实施例中，所述蛋白质或多肽为血清蛋白、重组蛋白、多肽疫苗、药物蛋白分子、抗原、治疗肽、生长因子及单克隆抗体中的至少一种。
在一个实施例中，所述聚合物纳米载体制剂的剂型为冻干粉针剂或水溶液针剂，所述纳米载体胶束的粒径范围为10-200nm，所述水溶液针剂的Zeta电位为10mV-50mV。
一种聚合物纳米载体制剂的制备方法，包括如下步骤：
按照上述方法制备两亲性三嵌段共聚物；
按照如下重量份数称取各组分：
疏水性药物 大于零小于等于20份、
两亲性三嵌段共聚物 1-100份、以及
有机溶剂 20-500份；
将所述两亲性三嵌段共聚物及所述疏水性药物溶于所述有机溶剂中形成均匀的溶液，将所述溶液进行透析处理除去有机溶剂，得到负载疏水性药物的纳米载体胶束；
将所述负载疏水性药物的纳米载体胶束干燥或溶于水后得到所述聚合物纳米载体制剂。
在一个实施例中，还包括在得到负载疏水性药物的纳米载体胶束之后，将所述纳米载体胶束溶于水中，加入所述基因物质、所述蛋白质或多肽，振荡1-6小时后在37℃下静置0.5-2小时，静置后得到的溶液或者干燥后得到的固体粉末即为所述聚合物纳米载体制剂；其中，所述基因物质的重量份数为0-20份，所述蛋白质或多肽的重量份数0-20份，且所述基因物质与所述蛋白质或多肽的总重量分数大于零。
在一个实施例中，所述有机溶剂选自丙酮、甲醇、乙醇、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜及N-甲基吡咯烷酮中的至少一种。
一种聚合物纳米载体制剂，包括如下重量份数的各组分：
基因物质 0-20份、
蛋白质或多肽 0-20份、以及
纳米载体胶束 1-100份；
其中，所述基因物质与所述蛋白质或多肽的总重量分数大于零；
所述纳米载体胶束是由两亲性三嵌段共聚物形成的具有三层结构的复合体，所述两亲性三嵌段共聚物为包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的线性高分子化合物；其中，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连，且所述聚乙二醇衍生物的分子量范围为500-10000，所述聚赖氨酸的聚合度为10-200，所述聚亮氨酸的聚合度为10-200；所述聚亮氨酸构成所述复合体的内层，所述聚赖氨酸构成所述复合体的中间层，所述聚乙二醇衍生物构成所述复合体的外层；所述基因物质与所述蛋白质或多肽分散在中间层的所述聚赖氨酸中。
一种聚合物纳米载体制剂的制备方法，包括如下步骤：
按照上述方法制备两亲性三嵌段共聚物；
按照如下重量份数称取各组分：
基因物质 0-20份、
蛋白质或多肽中的至少一种 0-20份、
两亲性三嵌段共聚物 1-100份、以及
有机溶剂 20-500份；
其中，所述基因物质与所述蛋白质或多肽的总重量分数大于零；
将所述两亲性三嵌段共聚物溶于所述有机溶剂中形成均匀的溶液，将所述溶液进行透析处理除去有机溶剂，制备纳米载体胶束；
将所述纳米载体胶束溶于水中，加入所述基因物质、所述蛋白质或多肽，振荡1-6小时后在37℃下静置0.5-2小时，静置后得到的溶液或者干燥后得到的固体粉末即为所述聚合物纳米载体制剂。
该聚合物纳米载体制剂可以同时负载小分子疏水性药物、基因物质、蛋白质或多肽，且负载效率较高，纳米载体制剂在生物体内可以完全降解，并参与代谢，可以避免免疫系统的清除，比较容易到达病灶。
上述两亲性三嵌段共聚物及疏水性药物可以在水溶液中自组装形成纳米载体的胶束，疏水性药物分散在聚亮氨酸疏水内核中，且得到的纳米胶束可以很容易的吸附带负电荷的基因物质、蛋白质或多肽至带正电荷的中间层，利用此特性的聚合物纳米载体制剂的制备过程简单易行，可以广泛推广应用。
【附图说明】
图1为一实施方式的两亲性三嵌段共聚物的结构示意图，图中线条粗细仅示区别不同物质；
图2为由图1中两亲性三嵌段共聚物形成三层结构的纳米载体的结构示意图；
图3为实施例5中负载紫杉醇的聚合物纳米载体制剂的DSL数据图；
图4为实施例6中负载阿霉素的聚合物纳米载体制剂的DSL数据图；
图5为实施例7负载P53基因的聚合物纳米载体制剂的DSL数据图；
图6为实施例8负载SiRNA基因的聚合物纳米载体制剂的DSL数据图；
图7为实施例9负载BSA的聚合物纳米载体制剂的DSL数据图；
图8为实施例10中同时负载了紫杉醇、SiRNA的聚合物纳米载体制剂的SEM图；
图9为实施例10中负载了紫杉醇、SiRNA的聚合物纳米载体制剂的DSL数据图；
图10为实施例11中GFP(绿色荧光蛋白)标记的细胞的电镜图；
图11为实施例11中聚合物纳米载体制剂对GFP基因表达的影响；
图12为实施例12中聚合物纳米载体制剂对树突状细胞摄取OVA抗原的影响；
图13为实施例13中聚合物纳米载体制剂对小鼠抗OVA抗体的影响。
【具体实施方式】
下面主要结合附图及具体实施例对两亲性三嵌段共聚物、聚合物纳米载体制剂及相应的制备方法作进一步详细的说明。
如图1所示，一实施方式的两亲性三嵌段共聚物，其为包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的线性高分子化合物(聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸)。分子量范围优选在3000-60000。其中，聚赖氨酸一端通过酰胺键与聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与聚亮氨酸相连。且该聚乙二醇衍生物的分子量范围为500-10000，聚赖氨酸的聚合度为10-200，聚亮氨酸的聚合度为10-200。
优选的，本实施方式的聚乙二醇衍生物为单甲醚氨基聚乙二醇(CH3O-PEG-NH2)或者氨基聚乙二醇羧酸(NH2-PEG-COOH)。
聚乙二醇(PEG)具有良好的生物相容性、生物可降解性并且降解产物没有毒性，在美国得到FDA的批准，并被广泛应用于生物材料领域和纳米医学领域。纳米材料经PEG表面修饰以后，可以降低其细胞粘附性，减少血清内物质的吸附性，同时减少巨噬细胞的排异吞噬，因此PEG修饰后的纳米材料可显著增加体内循环的时间。该两亲性三嵌段共聚物，即聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物(PEG-PLys-PLeu)，结合了聚乙二醇和聚氨基酸的优势，可以在水溶液中自组装形成具有三层结构的纳米载体，如图2所示，其中最内层的聚亮氨酸链段聚集形成疏水性内核，中间层的聚赖氨酸构成正电荷层，最外层的PEG衍生物起保护作用。以聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物为基础制备而成的阳离子纳米载体由于其特殊的结构使得聚赖氨酸正电荷得到聚集形成了一个正电荷层，大大曾强了负载基因和蛋白质等负电物质的能力，同时由于聚亮氨酸具有α-螺旋的二级结构使得阳离子纳米载体稳定性得到增加，由于该阳离子纳米载体同时具有疏水性内核和正电荷层，因此可以同时有效的负载小分子疏水性药物、基因物质以及蛋白质或多肽，是一种多功能的纳米载体。
本实施方式还提供了一种两亲性三嵌段共聚物的制备方法，包括如下步骤：
步骤S110：以聚乙二醇衍生物作为引发剂，通过NCA开环聚合的方法合成包含聚乙二醇衍生物、侧链保护的聚赖氨酸及聚亮氨酸的线性三嵌段共聚物，其中，侧链保护的聚赖氨酸一端通过酰胺键与聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与聚亮氨酸相连，且聚乙二醇衍生物的分子量范围为500-10000，侧链保护的聚赖氨酸的聚合度为10-200，聚亮氨酸的聚合度为10-200。
具体如下：将分子量范围为500-10000的聚乙二醇衍生物溶于有机溶剂中，浓度范围为1-100mg/mL，氮气保护下加热至30-50℃后加入LysZ-NCA(苄氧羰基赖氨酸的环状酸酐，一种侧链保护的赖氨酸环状酸酐)单体，LysZ-NCA单体与聚乙二醇衍生物的摩尔比为10-200∶1，氮气保护下恒温反应24-120小时后加入Leu-NCA(亮氨酸的环状酸酐)单体，Leu-NCA单体与聚乙二醇衍生物的摩尔比为10-200∶1，氮气保护下继续恒温反应24-120小时，反应结束后加入5-50倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤、干燥得到包含聚乙二醇衍生物、侧链保护的聚赖氨酸及聚亮氨酸的三嵌段共聚物。
步骤S120：脱去侧链保护的聚赖氨酸的侧链保护基团，得到包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸、且分子量在3000-60000的两亲性三嵌段共聚物。
具体如下：将包含聚乙二醇衍生物、侧链保护的聚赖氨酸及聚亮氨酸的三嵌段共聚物溶于0℃的三氟乙酸中，加入一定量的HBr体积浓度为30％的HBr/HAc溶液反应2-4小时后，再加入5-50倍于反应体系体积的乙醚进行沉淀、过滤，其中，加入的HBr的摩尔量为赖氨酸侧链保护基团摩尔量的2-4倍；将过滤后固体产物溶解于极性有机溶剂中，使用截留分子量为2000-8000的透析袋在水中透析12-96小时，每2-6小时换透析水一次，随后冻干，得到两亲性三嵌段共聚物。
通过使用NCA开环聚合的方法合成该两亲性三嵌段共聚物，制备过程简单，合成效率高。
同时，本实施方式还提供了一种负载疏水性药物、基因物质、蛋白质或多肽的聚合物纳米载体制剂及其制备方法。
该聚合物纳米载体制剂，包括如下重量份数的各组分：
疏水性药物 0-20份；
基因物质 0-20份；
蛋白质或多肽 0-20份；以及
纳米载体胶束 1-100份；
其中，疏水性药物、基因物质与蛋白质或多肽的总重量份数大于0。
该纳米载体胶束是由两亲性三嵌段共聚物形成的具有三层结构的复合体，其中，聚亮氨酸构成内层，聚赖氨酸构成中间层，聚乙二醇衍生物构成外层；疏水性药物分散在聚亮氨酸内层中。基因物质、蛋白质或多肽分散在带正电荷的聚赖氨酸中间层中。
优选的，本实施方式的疏水性药物选自阿霉素、紫杉醇、顺铂、氟尿嘧啶、甲氨喋呤及喜树碱中的至少一种。基因物质选自抑癌基因、自杀基因、SiRNA、mRNA及反义核酸中的至少一种。蛋白质或多肽为血清蛋白、重组蛋白、多肽疫苗、药物蛋白分子、抗原、治疗肽、生长因子及单克隆抗体中的至少一种。有机溶剂选自丙酮、甲醇、乙醇、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜及N-甲基吡咯烷酮中的至少一种。
该聚合物纳米载体制剂可以为冻干粉针剂或水溶液针剂。其中，纳米载体胶束的粒径范围为10-200nm。若为水溶液针剂，其Zeta电位为10mV-50mV。
该聚合物纳米载体制剂的制备方法，包括如下步骤：
步骤S210：制备两亲性三嵌段共聚物：以聚乙二醇衍生物作为引发剂，通过NCA开环聚合的方法合成包含聚乙二醇、侧链保护的聚赖氨酸及聚亮氨酸的三嵌段共聚物，其中，侧链保护的聚赖氨酸一端通过酰胺键与聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与聚亮氨酸相连，且聚乙二醇衍生物的分子量范围为500-10000，侧链保护的聚赖氨酸的聚合度为10-200，聚亮氨酸的聚合度为10-200；脱去侧链保护的聚赖氨酸的侧链保护基团，得到包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸、且分子量在3000-60000的两亲性三嵌段共聚物，其中聚亮氨酸为内核，聚赖氨酸为中间层，聚乙二醇衍生物为外层；
步骤S220：按照如下重量份数取各组分：
疏水性药物 0-20份、
基因物质 0-20份、
蛋白质或多肽 0-20份、
两亲性三嵌段共聚物 1-100份、
有机溶剂 20-500份、
且疏水性药物、基因物质与蛋白质或多肽的总重量份数大于0。
步骤S230：将两亲性三嵌段共聚物及疏水性药物溶于有机溶剂中形成均匀的溶液，将溶液置于透析袋中，在10-500倍于反应体系体积的水中透析12-96小时除去有机溶剂，该两亲性三嵌段共聚物自组装形成具有三层结构的纳米载体胶束，在有疏水性药物存在的条件下，疏水性药物会自动被包裹在内层的聚亮氨酸中。透析过程中，每2-6小时换水一次。
步骤S240：将纳米载体胶束制成相应的制剂，得到聚合物纳米载体制剂；或者
将纳米载体胶束溶于水中，加入基因物质、蛋白质或多肽，振荡1-6小时后在37℃下静置0.5-2小时，再将静置后得到的溶液制成所需剂型的制剂得到聚合物纳米载体制剂。
负载疏水性小分子药物的过程可以在胶束形成过程中将疏水性小分子药物一起加入，自组装形成纳米药物载体。负载基因的过程是先将合成的聚乙二醇-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物形成阳离子纳米胶束，再按一定比例加入DNA或RNA后振荡混匀。负载蛋白质的过程是先将合成的聚乙二醇-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物形成阳离子纳米胶束，再按一定比例加入带负电荷的蛋白质后振荡混匀。同时负载疏水性小分子药物、基因和蛋白质的过程是先制备纳米药物载体，再按一定比例加入基因和蛋白质振荡混匀。
如：负载疏水性药物的聚合物纳米载体制剂的制备方法可以参照如下：
称取PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物1-100份，疏水性药物1-20份，有机溶剂20-500份，将药物和聚合物按比例完全溶解于有机溶剂形成均一、透明的溶液；将制得的溶液置于透析袋中，然后在10-500倍于反应体系体积的水中透析12-96小时，每2-6小时换水一次；透析结束后将透析袋中形成的载药胶束水溶液制成所需要剂型的制剂。
负载基因物质的聚合物纳米载体制剂的制备方法可以参照如下：
称取PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物1-100份，有机溶剂20-500份，将聚合物完全溶解于有机溶剂形成均一、透明的溶液；将制得的溶液置于透析袋中，然后在10-500倍于反应体系体积的水中透析12-96小时，每2-6小时换水一次；透析结束后得到胶束水溶，称取基因物质1-20份加入到胶束水溶液中涡旋振荡1-6小时，37℃条件下放置0.5-2小时后将所得溶液制成所需的制剂。
负载蛋白质的纳米载体制剂的制备方法可以参照如下：
称取PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物1-100份，有机溶剂20-500份，将聚合物完全溶解于有机溶剂形成均一、透明的溶液；将制得的溶液置于透析袋中，然后在10-500倍于反应体系体积的水中透析12-96小时，每2-6小时换水一次；透析结束后得到胶束水溶，称取蛋白质1-20份加入到胶束水溶液中涡旋振荡1-6小时，37℃条件下放置0.5-2小时后将所得溶液制成所需的制剂。
同时负载疏水性药物、基因物质和蛋白质或多肽的纳米载体制剂的制备方法可以参照如下：
称取PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物1-100份药物1-20份，有机溶剂20-500份，将药物和聚合物按比例完全溶解于有机溶剂形成均一、透明的溶液；将制得的溶液置于透析袋中，然后在10-500倍于反应体系体积的水中透析12-96小时，每2-6小时换水一次，透析结束后得到载药胶束水溶液；称取蛋白质1-20份加入到载药胶束水溶液中涡旋振荡1-6小时，37℃条件下放置0.5-2小时后将所得溶液制成所需的制剂。
该聚合物纳米载体制剂可以同时负载小分子疏水性药物、基因物质、蛋白质或多肽，且负载效率较高，纳米载体制剂在生物体内可以完全降解，并参与代谢，可以避免免疫系统的清除，比较容易到达病灶。
上述两亲性三嵌段共聚物及疏水性药物可以在水溶液中自组装形成纳米载体的胶束，疏水性药物分散在聚亮氨酸疏水内核中，且得到的纳米胶束可以很容易的吸附带负电荷的基因物质、蛋白质或多肽至带正电荷的中间层，利用此特性的聚合物纳米载体制剂的制备过程简单易行，可以广泛推广应用。
以下为具体实施例部分：
实例1、聚乙二醇单甲醚-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物的制备
将聚合管抽真空后充氮气保护，将1g分子量为500的CH3O-PEG-NH2用20mLDMF溶解后加入到聚合管内，按LysZ-NCA单体与CH3O-PEG-NH2的摩尔比为10∶1的比例加入LysZ-NCA单体，氮气保护下恒温反应24小时，然后按Leu-NCA单体与CH3O-PEG-NH2的摩尔比为10∶1的比例加入Leu-NCA单体，氮气保护下继续恒温反应24小时，反应结束后加入50倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤、干燥得到PEG-PLysZ-PLeu三嵌段共聚物。
将上述所得的PEG-PLysZ-PLeu聚合物溶于0℃的三氟乙酸中，加入r体积浓度为30％的HBr/HAc溶液反应2时后，加入10倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤，其中，HBr的摩尔量为赖氨酸侧链保护基团摩尔量的2倍；将所得产物溶解于N，N-二甲基甲酰胺，使用截留分子量为2000的透析袋在水中透析48小时，每2小时换透析水一次，随后冻干得到PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物，平均分子量为3000。
实例2、羧基聚乙二醇-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物的制备
将聚合管抽真空后充氮气保护，将0.5g分子量为2000的NH2-PEG-COOH用20mLDMF溶解后加入到聚合管内，按LysZ-NCA单体与CH3O-PEG-NH2的摩尔比为20∶1的比例加入LysZ-NCA单体，氮气保护下恒温反应24小时，然后按Leu-NCA单体与CH3O-PEG-NH2的摩尔比为40∶1的比例加入Leu-NCA单体，氮气、保护下继续恒温反应48小时，反应结束后加入20倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤、干燥得到PEG-PLysZ-PLeu三嵌段共聚物。
将以上所得PEG-PLysZ-PLeu聚合物溶于0℃的三氟乙酸中，加入HBr体积浓度为30％的HBr/HAc溶液反应2时后，加入15倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤，其中，HBr的摩尔量为赖氨酸侧链保护基团摩尔量的2倍；将所得产物溶解于N，N-二甲基甲酰胺，使用截留分子量为3500的透析袋在水中透析12小时，每2小时换透析水一次，随后冻干得到PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物，平均分子量为8300。
实例3、羧基聚乙二醇-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物的制备
将聚合管抽真空后充氮气保护，将0.2g分子量为5000的NH2-PEG-COOH用20mLDMF溶解后加入到聚合管内，按LysZ-NCA单体与CH3O-PEG-NH2的摩尔比为200∶1的比例加入LysZ-NCA单体，氮气保护下恒温反应24小时，然后按Leu-NCA单体与CH3O-PEG-NH2的摩尔比为100∶1的比例加入Leu-NCA单体，氮气、保护下继续恒温反应96小时，反应结束后加入30倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤、干燥得到PEG-PLysZ-PLeu三嵌段共聚物。
将以上所得PEG-PLysZ-PLeu聚合物溶于0℃的三氟乙酸中，加入HBr体积浓度为30％的HBr/HAc溶液反应4时后，加入30倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤，其中，HBr的摩尔量为赖氨酸侧链保护基团摩尔量的4倍；将所得产物溶解于二甲基亚砜，使用截留分子量为8000的透析袋在水中透析48小时，每4小时换透析水一次，随后冻干得到PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物，平均分子量为40000。
实例4、聚乙二醇单甲醚-聚赖氨酸-聚亮氨酸三嵌段共聚物的制备
将聚合管抽真空后充氮气保护，将0.1g分子量为10000的CH3O-PEG-NH2用20mLDMF溶解后加入到聚合管内，按LysZ-NCA单体与CH3O-PEG-NH2的摩尔比为200∶1的比例加入LysZ-NCA单体，氮气保护下恒温反应24小时，然后按Leu-NCA单体与CH3O-PEG-NH2的摩尔比为200∶1的比例加入Leu-NCA单体，氮气、保护下继续恒温反应120小时，反应结束后加入50倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤、干燥得到PEG-PLysZ-PLeu三嵌段共聚物。
将以上所得PEG-PLysZ-PLeu聚合物溶于0℃的三氟乙酸，加入HBr体积浓度为30％的HBr/HAc溶液反应4时后，加入50倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤，其中，HBr的摩尔量为赖氨酸侧链保护基团摩尔量的4倍；将所得产物溶解于二甲基亚砜，使用截留分子量为8000的透析袋在水中透析96小时，每6小时换透析水一次，随后冻干得到PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物，平均分子量为54600。
实例5、负载紫杉醇的聚合物纳米载体制剂的制备
称取实施例1制得的PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物10mg，紫杉醇2mg，用10mL二甲基亚砜溶解，室温下超声10min，使药物和聚合物充分溶解，形成均一、透明的有机相溶液；将制得的二甲基亚砜溶液置于截留分子量为2000透析袋中，然后在1L水中透析48小时，每2小时换水一次；透析结束后，收集透析袋中形成的载药胶束水溶液，如图3所示，DSL测得粒径大小分60nm，TEM照片显示载药胶束纳米颗粒的平均粒径为60nm左右，粒子呈球形，分散比较均匀。
实例6、负载阿霉素的聚合物纳米载体制剂的制备
称取实施例2制得的PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物80mg，紫杉醇5mg，用100mLN，N-二甲基甲酰胺溶解，室温下超声10min，使药物和聚合物充分溶解，形成均一、透明的有机相溶液；将制得的N，N-二甲基甲酰溶液置于截留分子量为2000透析袋中，然后在2L水中透析60小时，每4小时换水一次；透析结束后，收集透析袋中形成的载药胶束水溶液，然后冷冻干燥得到粉末状固体。如图4所示，DSL测得粒径大小分85nm，TEM照片显示载药胶束纳米颗粒的平均粒径为80nm左右，粒子呈球形，分散比较均匀。
实例7、负载P53基因的聚合物纳米载体制剂的制备
称取实施例1制得的PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物1mg，用4mLN，N-二甲基甲酰胺溶解，室温下超声10min，使聚合物充分溶解，将制得的N，N-二甲基甲酰溶液置于截留分子量为2000透析袋中，然后在1.5L水中透析60小时，每6小时换水一次，透析结束后，收集透析袋中形成的聚合物胶束水溶液；量取P53基因0.05mg加入到制得的聚合物胶束水溶液中涡旋振荡2小时，37℃条件下放置1小时后负载P53基因的纳米载体制剂。如图5所示，DSL测得粒径大小分156nm，分散比较均匀。
实例8、负载SiRNA基因的聚合物纳米载体制剂的制备
称取实施例1制得的PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物10mg，用5mL二甲基亚砜溶解，室温下超声10min，使聚合物充分溶解，将制得的二甲基亚砜溶液置于截留分子量为2000透析袋中，然后在1.5L水中透析60小时，每6小时换水一次，透析结束后，收集透析袋中形成的聚合物胶束水溶液，将其稀释到1mg/mL。量取SiRNA5μg置于离心管中，然后入到制得的聚合物胶束水溶液100μL涡旋振荡2小时，37℃条件下放置1小时后负载SiRNA基因的纳米载体制剂。如图6所示，DSL测得粒径大小分50nm，分散比较均匀。
实例9、负载BSA的聚合物纳米载体制剂的制备
称取实施例1制得的PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物1mg，用4mLN，N-二甲基甲酰胺溶解，室温下超声10min，使聚合物充分溶解，将制得的N，N-二甲基甲酰溶液置于截留分子量为2000透析袋中，然后在1.5L水中透析60小时，每6小时换水一次，透析结束后，收集透析袋中形成的聚合物胶束水溶液；量取BSA蛋白0.05mg加入到制得的聚合物胶束水溶液中涡旋振荡2小时，37℃条件下放置1小时后负载BSA蛋白的纳米载体制剂。如图7所示，DSL测得粒径大小分95nm，分散比较均匀。
实施例10、同时负载了紫杉醇、SiRNA的聚合物纳米载体制剂的制备
称取实施例1制得的PEG-PLys-PLeu三嵌段共聚物10mg，紫杉醇2mg，用5mL二甲基亚砜溶解，室温下超声10min，使聚合物充分溶解，将制得的二甲基亚砜溶液置于截留分子量为2000透析袋中，然后在1.5L水中透析60小时，每6小时换水一次，透析结束后，收集透析袋中形成的聚合物载药 胶束水溶液，将其稀释到1mg/mL。量取SiRNA5μg置于离心管中，然后入到制得的聚合物胶束水溶液100μL涡旋振荡2小时，37℃条件下放置1小时后负载SiRNA基因的纳米载体制剂，如图8所示。如图9所示，DSL测得粒径大小分56nm，分散比较均匀。
实施例11
采用实施例1制得的聚合物纳米载体制剂(NP)负载含有GFP(绿色荧光蛋白)的质粒DNA，制备方法参考前述实施例，观察GFP在293T细胞的表达水平。结果表明纳米颗粒显著提高了GFP的蛋白表达，如图10和图11所示。
实施例12
采用实施例1制得的聚合物纳米载体制剂(NP)包裹抗原蛋白(OVA-FITC)，制备方法参考前述实施例，观察小鼠树突状细胞在体外对抗原的摄取。结果表明纳米颗粒显著提高了树突状细胞对抗原的摄取，如图12所示。
实施例13
采用实施例1制得的聚合物纳米载体制剂(NP)作为疫苗载体，包裹卵清蛋白(Ovalbumin，OVA)制备纳米疫苗，并对小鼠进行皮下注射免疫，制备方法参考前述实施例。结果显示纳米载体显著地提高了抗OVAIgG抗体，如图13所示。
综合实施例11-13可知，本实施方式的聚合物纳米载体制剂是一种优良的疫苗载体，利用其携带疫苗导入靶组织，能够有效地提高疫苗的免疫效力。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (16)
1.一种两亲性三嵌段共聚物，其特征在于，为包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的线性高分子化合物；其中所述线性高分子化合物结构为聚乙二醇衍生物-聚赖氨酸-聚亮氨酸，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连，且所述聚乙二醇衍生物的分子量范围为500-10000，所述聚赖氨酸的聚合度为10-200，所述聚亮氨酸的聚合度为10-200。
2.如权利要求1所述的两亲性三嵌段共聚物，其特征在于，所述聚乙二醇衍生物为单甲醚氨基聚乙二醇或者氨基聚乙二醇羧酸。
3.如权利要求1所述的两亲性三嵌段共聚物，其特征在于，所述共聚物的分子量为3000-60000。
4.一种两亲性三嵌段共聚物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将分子量范围为500-10000的聚乙二醇衍生物溶于有机溶剂中，浓度范围为1-100mg/mL；
在氮气保护下，将上述溶液加热至30-50℃，然后加入侧链保护的赖氨酸环状酸酐单体，所述侧链保护的赖氨酸环状酸酐单体与所述聚乙二醇衍生物的摩尔比为10-200∶1，氮气保护下恒温反应24-120小时；
加入亮氨酸环状酸酐单体，所述亮氨酸环状酸酐单体与所述聚乙二醇衍生物的摩尔比为10-200∶1，氮气保护下继续恒温反应24-120小时，反应结束后加入5-50倍于反应体系体积的乙醚沉淀、过滤、干燥得到包含聚乙二醇衍生物、侧链保护的聚赖氨酸及聚亮氨酸的三嵌段共聚物，其中，所述侧链保护的聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连；
将所述包含聚乙二醇衍生物、侧链保护的聚赖氨酸及聚亮氨酸的三嵌段共聚物溶于0℃的三氟乙酸中，加入HBr体积分数为30％的HBr/HAc溶液，其中，HBr的摩尔量为赖氨酸的侧链保护基团摩尔量的2-4倍，反应2-4小时后，再加入5-50倍于反应体系体积的乙醚进行沉淀、过滤；及
将过滤后固体产物溶解于极性有机溶剂中，使用截留分子量为2000-8000的透析袋在水中透析12-96小时，每2-6小时换透析水一次，随后冻干，得到包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸及聚亮氨酸所述两亲性三嵌段共聚物，其中，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连。
5.一种聚合物纳米载体制剂，其特征在于，包括大于零小于等于20重量份数的疏水性药物以及1-100重量份数的纳米载体胶束；
所述纳米载体胶束是由两亲性三嵌段共聚物形成的具有三层结构的复合体，所述两亲性三嵌段共聚物为包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的线性高分子化合物；其中，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连，且所述聚乙二醇衍生物的分子量范围为500-10000，所述聚赖氨酸的聚合度为10-200，所述聚亮氨酸的聚合度为10-200；所述聚亮氨酸构成所述复合体的内层，所述聚赖氨酸构成所述复合体的中间层，所述聚乙二醇衍生物构成所述复合体的外层；所述疏水性药物分散中内层的聚亮氨酸中。
6.如权利要求5所述的聚合物纳米载体制剂，其特征在于，所述疏水性药物选自阿霉素、紫杉醇、顺铂、氟尿嘧啶、甲氨喋呤及喜树碱中的至少一种。
7.如权利要求5所述的聚合物纳米载体制剂，其特征在于，还包括大于零小于等于20重量份数的基因物质，所述基因物质分散在中间层的所述聚赖氨酸中。
8.如权利要求7所述的聚合物纳米载体制剂，其特征在于，所述基因物质选自抑癌基因、自杀基因、SiRNA、mRNA及反义核酸中的至少一种。
9.如权利要求5或7所述的聚合物纳米载体制剂，其特征在于，还包括大于零小于等于20重量份数的蛋白质或多肽，所述蛋白质或多肽分散在中间层的所述聚赖氨酸中。
10.如权利要求9所述的聚合物纳米载体制剂，其特征在于，所述蛋白质或多肽为血清蛋白、重组蛋白、多肽疫苗、药物蛋白分子、抗原、治疗肽、生长因子及单克隆抗体中的至少一种。
11.如权利要求5所述的聚合物纳米载体制剂，其特征在于，所述聚合物纳米载体制剂的剂型为冻干粉针剂或水溶液针剂，所述纳米载体胶束的粒径范围为10-200nm，所述水溶液针剂的Zeta电位为10mV-50mV。
12.一种聚合物纳米载体制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
按照权利要求4所述的方法制备两亲性三嵌段共聚物；
按照如下重量份数称取各组分：
疏水性药物 大于零小于等于20份、
两亲性三嵌段共聚物 1-100份、以及
有机溶剂 20-500份；
将所述两亲性三嵌段共聚物及所述疏水性药物溶于所述有机溶剂中形成均匀的溶液，将所述溶液进行透析处理除去有机溶剂，得到负载疏水性药物的纳米载体胶束；
将所述负载疏水性药物的纳米载体胶束干燥或溶于水后得到所述聚合物纳米载体制剂。
13.如权利要求12所述的聚合物纳米载体制剂的制备方法，其特征在于，还包括在得到负载疏水性药物的纳米载体胶束之后，将所述纳米载体胶束溶于水中，加入所述基因物质、所述蛋白质或多肽，振荡1-6小时后在37℃下静置0.5-2小时，静置后得到的溶液或者干燥后得到的固体粉末即为所述聚合物纳米载体制剂；其中，所述基因物质的重量份数为0-20份，所述蛋白质或多肽的重量份数0-20份，且所述基因物质与所述蛋白质或多肽的总重量分数大于零。
14.如权利要求12所述的聚合物纳米载体制剂，其特征在于，所述有机溶剂选自丙酮、甲醇、乙醇、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、N，N-二甲基乙酰胺、二甲基亚砜及N-甲基吡咯烷酮中的至少一种。
15.一种聚合物纳米载体制剂，其特征在于，包括如下重量份数的各组分：
基因物质 0-20份、
蛋白质或多肽 0-20份、以及
纳米载体胶束 1-100份；
其中，所述基因物质与所述蛋白质或多肽的总重量分数大于零；
所述纳米载体胶束是由两亲性三嵌段共聚物形成的具有三层结构的复合体，所述两亲性三嵌段共聚物为包含聚乙二醇衍生物、聚赖氨酸和聚亮氨酸的线性高分子化合物；其中，所述聚赖氨酸的一端通过酰胺键与所述聚乙二醇衍生物相连，另一端通过肽键与所述聚亮氨酸相连，且所述聚乙二醇衍生物的分子量范围为500-10000，所述聚赖氨酸的聚合度为10-200，所述聚亮氨酸的聚合度为10-200；所述聚亮氨酸构成所述复合体的内层，所述聚赖氨酸构成所述复合体的中间层，所述聚乙二醇衍生物构成所述复合体的外层；所述基因物质与所述蛋白质或多肽分散在中间层的所述聚赖氨酸中。
16.一种聚合物纳米载体制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
按照权利要求4所述的方法制备两亲性三嵌段共聚物；
按照如下重量份数称取各组分：
基因物质 0-20份、
蛋白质或多肽中的至少一种 0-20份、
两亲性三嵌段共聚物 1-100份、以及
有机溶剂 20-500份；
其中，所述基因物质与所述蛋白质或多肽的总重量分数大于零；
将所述两亲性三嵌段共聚物溶于所述有机溶剂中形成均匀的溶液，将所述溶液进行透析处理除去有机溶剂，制备纳米载体胶束；
将所述纳米载体胶束溶于水中，加入所述基因物质、所述蛋白质或多肽，振荡1-6小时后在37℃下静置0.5-2小时，静置后得到的溶液或者干燥后得到的固体粉末即为所述聚合物纳米载体制剂。
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