CN102274181A - 一种多西他赛脂质微球注射液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种含有两亲性聚氨基酸的多西他赛脂质微球注射液及其制备方法。本发明注射液的组成包括多西他赛、两亲性聚氨基酸、注射用油、乳化剂、辅助乳化剂、电位调节剂、抗氧剂、金属螯合剂、等渗调节剂及注射用水，所述两亲性聚氨基酸是由亲水链段与消旋聚疏水氨基酸组成的嵌段共聚物。该注射液明显提高了载药量与稳定性，且药物90%以上被包裹在脂质微球的油相及油水界面膜中，降低了毒性和刺激性，提高了药物在制剂中的溶解性和稳定性，进而改善了靶向性，提高了疗效。适于工业化生产和临床应用。

Description

一种多西他赛脂质微球注射液及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，更具体的说是涉及一种以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液及其制备方法。

背景技术

多西他赛(Docetaxel)是由罗纳普朗克·乐安(Rhone-Poulenc Rorer)公司开发的一个半合成紫杉醇衍生物，属微管解聚抑制剂，它通过促进小管聚合成稳定的微管并抑制其解聚从而使游离小管的数量显著减少。

多西他赛化学名称为：{2aR-[2aα,4β,4aβ,6β,9α(αR*,βS*),11α,12α,12aα,12bα]}-β-{[(1,1-二甲基乙氧基)羰基]氨基}-α-羟基苯丙酸[12b-乙酰氧-12-苯甲酰氧-2a,3,4,4a,5,6,9,10,11,12,12a,12b-十二氢-4,6,11-三羟基-4a,8,13,13-四甲基-5-氧代-7,11-亚甲基-1H-环癸五烯并[3,4]苯并[1,2-b]氧杂丁环-9-基]酯。其结构式为：

分子式：C₄₃H₅₃NO₁₄

分子量：807.88

多西他赛为目前临床上常用的效果显著的抗肿瘤药物，已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于乳腺癌、宫颈癌、非小细胞肺癌以及前列腺癌的临床治疗。多西他赛已有的制剂都有理想的抗肿瘤效果，但是其制剂开发却一直受到其极差的溶解性的制约(水中溶解度约0.006～0.007mg/ml)。

为解决这一问题，传统制剂学采取了大量加入表面活性剂(如聚氧乙烯蓖麻油、吐温-80)的做法，但是临床研究显示，Cremophor EL不仅能够诱导超敏反应，而且给这类抗肿瘤药物带来极为不利的药代动力学改变，又由于严重的外周神经毒，使用剂量上受到限制。而用聚山梨酯80作为潜溶剂增溶多西他赛（比如现今用于临床的多西他赛注射液泰索帝，即以聚山梨酯80作为潜溶剂，制成粘稠状注射用浓缩液），发现其和多种毒性反应有关，其中文献报道较多的包括有严重的过敏反应及周围神经病变。因此，在临床使用时，剂量也受到极大的限制。患者常常需要提前口服皮质激素和抗组织胺类(西咪替丁、苯海拉明)药物加以预防，且需谨慎监测整个用药过程，给临床用药带来巨大不便；同时，这种非水溶剂给药系统极其不稳定的理化性质使得多西他赛注射用浓缩液的临床配制及使用过程非常不便：泰索帝使用时需先以专用稀释剂（13%(v/v) 注射用乙醇水溶液）配置预注射液，再用注射溶媒稀释至0.3～0.9 g/L后静脉滴注。在整个过程中可能因药物溶解或转移稀释过程产生二次污染，并且制剂稀释后有析出药物结晶的可能。故泰索帝说明书强调：泰索帝预注射液应于配制后立即使用。其理化特性研究表明不论是在2-8℃或室温保存，预注射液的稳定性为8小时，注射液在室温条件下应于配制后4小时内使用。

临床上不良反应的发生及使用上的不便迫使我们寻找新的剂型，以剂型的优势充分发挥药物的疗效，降低不良反应，简化临床使用过程。在所有关于多西他赛新型制剂的探索中，脂质微球制剂因其载药量大、能有效增加所包裹药物的稳定性、大幅降低药物刺激性、安全且易于工业化生产等特殊优点而受到制剂领域的普遍关注。

脂质微球与传统制剂学领域亚微乳剂的概念相同，是通过将药物溶于脂肪油中，并经磷脂乳化分散于水相后制成的微粒分散体系，平均粒径在200nm左右。现今国内已有多个关于多西他赛的脂质微球注射液申请到专利，如：CN100998559A（多烯紫杉醇亚微乳注射剂及其制备方法）、CN1857222A（多烯紫杉醇静脉注射亚微乳剂及其制备方法）、CN101433533A（一种紫杉醇或多烯紫杉醇静脉注射乳剂）等。但是，这些以传统方法制备的脂质微球制剂载药量有限，且均不能经受热压灭菌，长期稳定性试验中有关物质增加显著，严重阻碍了这些制剂的进一步产业化发展与实际应用。专利CN101601648A（多烯紫杉醇磷脂复合物静脉注射用亚微乳剂及其制备方法）采用先制备磷脂复合物，再制备亚微乳剂的方法，从一定程度上提高了多西他赛的载药量与稳定性，但是，仍然不能耐受热压灭菌，且磷脂复合物制备过程中使用的大量四氢呋喃、二氯甲烷等毒性有机溶剂不易完全除尽，给用药安全带来巨大隐忧。

专利CN1965820A（一种含有多西他赛的脂质微球、冻干脂质微球及制备方法）所公开的制备方法中，所涉及的需要高压灭菌的脂质微球注射液均采用了大量的维生素E和吐温-80，但是Earhart R.H(1999)等人曾报道此两种辅料具有严重的不良反应和毒副作用；且冻干过程费时耗力，不仅大幅增加了制备成本，且冻干产物稳定性不可控。因此，在实际应用中也具有很大的局限性。

综合看来，现有的研究均不能很好的解决多西他赛脂质微球制剂的稳定性，尤其是灭菌过程中的稳定性及制剂安全性问题。

发明内容

本发明旨在克服现有多西他赛脂质微球制剂的缺点，提供一种简便的方法制备出不含聚氧乙烯蓖麻油，不大量使用VE，不引入有机溶剂，能耐受热压灭菌的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液。该制剂无刺激性、毒性小、稳定性好、成本低、适用于工业化大生产。

本发明所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球制剂具有与传统脂质微球制剂不同的微观结构：传统脂质微球制剂以小分子磷脂为乳化剂，具有以脂肪油为软基质而被磷脂分子组成的单层膜包裹的球状微观结构，示意图见附图1，由于这种结构由油水两相组成，属于热力学不稳定体系，因此灭菌和贮存过程中易发生破乳、聚集、合并和沉积等现象，并最终导致油水分层或药物沉降；而本发明所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球制剂的微观结构中，疏水的消旋聚氨基酸链亲油性远强于磷脂的疏水段，因此能插入并牢牢锚定于油相中，而亲水链段又要远长于磷脂分子的极性头部，故能伸展于外周水相中，并包绕在乳滴周围，为乳滴提供一层空间屏障，阻止各个乳滴间的合并，这种特殊的结构特点能大幅增加所制备脂质微球制剂的稳定性，其结构示意图见附图2、附图3。传统脂质微球制剂与以两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球制剂的透射电镜照片分别见附图4和附图5。

本发明所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液通过在传统脂质微球制剂中引入两亲性聚氨基酸，并将其制备成药学上可以接受的供静脉注射用的脂质微球制剂。其理化性质符合静脉用药要求，不仅能经受高温热压灭菌，而且无论是常温还是冷藏长期放置，其有关物质均可控制在1.5%以内，物理化学稳定性良好，并且血管刺激性小，工艺简单，易于产业化生产。

本发明所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，其组成包括：多西他赛、两亲性聚氨基酸、注射用油、乳化剂、辅助乳化剂、抗氧剂及注射用水，优选组成包括电位调节剂、金属螯合剂和等渗调节剂。

本发明所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，所述的两亲性聚氨基酸由亲水链段和疏水链段组成，其中所述疏水链段为消旋化的聚氨基酸链，选自亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸苄酯等疏水氨基酸单体组成的消旋化均聚物链，分子量1000～5000Da；所述亲水链段选自聚乙二醇、带正电的聚谷氨酸、带负电的聚赖氨酸等生物相容性聚合物，分子量2000～10000Da。优选的，所述疏水链段选自消旋聚亮氨酸；所述亲水链段选自聚乙二醇链(PEG)。更优选的，所述两亲性聚氨基酸为PEG₅₀₀₀-消旋聚亮氨酸₃₀₀₀嵌段共聚物。

本发明所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，所述的注射用油优选为长链甘油三酯和中链甘油三酯中的一种或几种的混合物，最优选为大豆油、红花油、沙棘油、月见草油、玉米油、薏苡仁油、鸦胆子油、椰子油、紫苏油、葡萄籽油、橄榄油、蓖麻油、茶油、棉籽油和棕榈油中的一种或几种的混合物。

本发明所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，所述的乳化剂选自大豆磷脂、蛋黄卵磷脂和合成磷脂中的一种或几种的混合物。

本发明所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，所述的辅助乳化剂选自泊洛沙姆188和聚山梨酯-80中的一种或几种的混合物。

本发明所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，所述的抗氧剂优选为L-半胱氨酸、抗坏血酸、dl-α-生育酚、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠和无水亚硫酸氢钠中的一种或几种的混合物。

本发明所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，所述的电位调节剂优选为油酸。

本发明所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，所述金属螯合剂优选为乙二胺四乙酸二钠盐、乙二胺四乙酸钠钙盐或其混合物。

本发明所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，所述等渗调节剂优选为注射用甘油。

本发明所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球制剂，其组成以重量百分比计优选为：

多西他赛                              0.01%～1%

注射用油                              5%～30% 

两亲性聚氨基酸                        0.05%～1%

乳化剂                                1%～6%

辅助乳化剂                            0.2%～5% 

电位调节剂                            0%～1%

抗氧剂                                0.01%～0.5% 

等渗调节剂                            0.1%～10%

金属螯合剂                            0.001%～2%

其余为注射用水。

本发明所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球制剂，其组成以重量百分比计更优选为：

多西他赛                              0.04%～0.16%

注射用油                              10%～20% 

两亲性聚氨基酸                        0.1%～0.5%

乳化剂                                2%～5%

辅助乳化剂                            0.5%～2.5% 

电位调节剂                            0%～0.1%

抗氧剂                                0.02%～0.1% 

等渗调节剂                            2%～5%

金属螯合剂                            0.01%～1%

其余为注射用水。

一种以两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球注射液的制备方法，其特征在于包括下述工艺步骤： 

（1）将多西他赛、乳化剂和电位调节剂在油相中制备载药油相；

（2）将两亲性聚氨基酸、等渗调节剂、辅助乳化剂、抗氧剂、金属螯合剂加入注射用水中，加热，搅拌使分散均匀得水相；

（3）搅拌下，将载药油相加入水相中，制得初乳；将初乳冷却，用注射用水定容至全量，调节pH值至4-6，转移至高压均质机中，高压均质；

（4）装瓶，充氮气，轧盖密封，灭菌，取出后于迅速冷却即得。

优选的，本发明所述的制备方法，包含以下步骤： 

（1）将多西他赛和蛋黄卵磷脂加入75℃中链脂肪酸甘油三酯（MCT）中，75℃下继续搅拌0.5h，得含多西他赛的载药油相；

（2）将两亲性氨基酸、等渗调节剂、辅助乳化剂加入注射用水中，加热至60-80℃，搅拌使分散均匀得水相；

（3）在高速组织捣碎机搅拌下以10,000-20,000r/min的转速，将载药油相加入水相中，待完全加入后，继续搅拌5-15分钟，制得初乳；初乳冷却至室温，用注射用水定容至全量，以氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至4-6，转移至高压均质机中，40℃以下，以60-100 Mpa压力高压均质6-10次；

（4）装瓶，充氮气，轧盖密封，121℃旋转水浴灭菌10min，取出后于冷水浴中迅速冷却即得。

本发明所述的的脂质微球注射液中两亲性聚氨基酸分子包绕在乳滴周围，药物分布于油水两相界面，从而大大提高了制剂的物理和化学稳定性，相比于传统脂质微球制剂，其不易析出和氧化，避免了灭菌及储存过程中稳定性不好、有关物质超标，及用药过程易产生二次污染和析出药物等多种问题。本发明所制备的含有多西他赛脂质微球注射液在121℃高压蒸汽灭菌10min后，物理、化学稳定性均良好，样品经6-12个月6 ± 2℃留样试验，各项物理、化学稳定性指标均未发生显著改变。说明本品在6～15℃条件下放置12个月理化性质几乎没有改变，具有较传统脂质微球制剂更为优良的稳定性。

附图说明

图1  传统脂质微球结构示意图   1为水相  2为油相   3为磷脂分子

图2  以两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球结构示意图  2-1为水相  2-2为油相   2-3为磷脂分子  4为两亲性聚氨基酸分子  

图3  两亲性聚氨基酸分子结构示意图   5为亲水链段   6为疏水链段

图4  传统脂质微球透射电镜照片

图5  以两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球透射电镜照片。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，实例仅为提供解释性说明，不意味着以任何方式对本发明的保护范围予以限制。

下述实施例中制备的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球制剂具有与传统脂质微球制剂不同的微观结构：传统脂质微球制剂以小分子磷脂为乳化剂，具有以脂肪油为软基质而被磷脂分子组成的单层膜包裹的球状微观结构，示意图见附图1，其中1为水相  2为油相   3为磷脂分子。由于这种结构由油水两相组成，属于热力学不稳定体系，因此灭菌和贮存过程中易发生破乳、聚集、合并和沉积等现象，并最终导致油水分层或药物沉降；而本发明实施例中制备得到的以两亲性聚氨基酸分子为稳定剂的脂质微球制剂，其结构示意图见附图2、附图3，两亲性聚氨基酸分子4中，疏水链段6的消旋聚氨基酸链亲油性远强于磷脂的疏水段，因此能插入并牢牢锚定于油相2-2中，而亲水链段5又要远长于磷脂分子2-3的极性头部，故能伸展于外周水相2-1中，并包绕在乳滴周围，为乳滴提供一层空间屏障，阻止各个乳滴间的合并，这种特殊的结构特点能大幅增加所制备脂质微球制剂的稳定性。传统脂质微球制剂与以两亲性聚氨基酸为稳定剂的脂质微球制剂的透射电镜照片分别见附图4和附图5。

实施例1 制备以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液

【处方1】     规格：40mg/50ml

多西他赛                       0.04%

中链甘油三酯（MCT）            15%

PEG₅₀₀₀-消旋聚亮氨酸₃₀₀₀           0.1%

蛋黄卵磷脂                      3%

聚山梨酯-80                    0.1%

泊洛沙姆188                 0.3%

无水亚硫酸氢钠                 0.05%

甘油                           2.5%

依地酸二钠                     0.02%

注射用水加至                   100%

制备方法：

（1）将多西他赛和蛋黄卵磷脂加入中链甘油三酯，75℃加热搅拌至澄清后继续搅拌0.5h，得多西他赛载药油相备用；

（2）将处方量PEG₅₀₀₀-消旋聚亮氨酸₃₀₀₀、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、无水亚硫酸氢钠、甘油、依地酸二钠加至适量注射用水中，至磁力搅拌器中75℃加热搅拌使分散均匀，制得水相；

（3）在高速分散均质机搅拌下（10,000 rpm），将油相加入至水相中，继续搅拌约5分钟，制得初乳；

（4）将初乳以0.1 mol·L^-1 氢氧化钠溶液调节pH值至5.3左右，用注射用水定容至全量，冷却至40℃左右，转移至高压均质机中，以800 bar压力均质10次；

（5）装瓶，冲氮气，封口，121℃高压蒸汽旋转灭菌10min，冷水浴迅速降温即得。

【处方2】 同处方1   规格：40mg/50ml

制备方法：

（1）将多西他赛和蛋黄卵磷脂加入中链甘油三酯，80℃加热搅拌至澄清后继续搅拌1h，得多西他赛载药油相备用；

（2）将处方量PEG₅₀₀₀-消旋聚亮氨酸₃₀₀₀、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、无水亚硫酸氢钠、甘油、依地酸二钠加至适量注射用水中，至磁力搅拌器中75℃加热搅拌使分散均匀，制得水相；

（3）在高速分散均质机搅拌下（10,000 rpm），将油相加入至水相中，继续搅拌约5分钟，制得初乳；

（4）将初乳以0.1 mol·L^-1盐酸溶液调节pH值至5.3左右，用注射用水定容至全量，冷却至40℃左右，转移至高压均质机中，以800 bar压力均质10次；

（5）装瓶，冲氮气，封口，121℃高压蒸汽旋转灭菌10min，冷水浴迅速降温即得。

【处方3】    规格：80mg/50ml

多西他赛                       0.16%

PEG₂₀₀₀-消旋聚亮氨酸₁₀₀₀           0.2%

中链甘油三酯（MCT）            30%

蛋黄卵磷脂                      6%

聚山梨酯-80                    0.1%

泊洛沙姆188                    0.3%

焦亚硫酸钠                     0.2%

甘油                           2.5%

依地酸二钠                     0.02%

注射用水加至                  100%

制备方法：

（1）将多西他赛和蛋黄卵磷脂加入中链甘油三酯，75℃加热搅拌至得到澄清后继续搅拌1h，得多西他赛载药油相备用；

（2）将处方量PEG₂₀₀₀-消旋聚亮氨酸₁₀₀₀、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、焦亚硫酸钠、甘油、依地酸二钠加至适量注射用水中，至磁力搅拌器中75℃加热搅拌使分散均匀，制得水相；

（3）在高速分散均质机搅拌下（10,000 rpm），将油相加入至水相中，继续搅拌约5分钟，制得初乳；

（4）将初乳以0.1 mol·L^-1盐酸溶液调节pH值至5.3左右，用注射用水定容至全量，冷却至40℃左右，转移至高压均质机中，以800 bar压力均质10次；

（5）装瓶，冲氮气，封口，121℃高压蒸汽旋转灭菌10min，冷水浴迅速降温即得。

【处方4】    规格：80mg/50ml

多西他赛                       0.16%

PEG₂₀₀₀-消旋聚亮氨酸₁₀₀₀           0.2%

中链甘油三酯（MCT）            20%

蛋黄卵磷脂                      5%

聚山梨酯-80                    0.1%

泊洛沙姆188                    0.3%

焦亚硫酸钠                     0.2%

甘油                           2.5%

依地酸二钠                     0.02%

注射用水加至                  100%

制备方法：

（1）将多西他赛和蛋黄卵磷脂加入中链甘油三酯，65℃加热搅拌至得到澄清后继续搅拌2h，得多西他赛载药油相备用；

（2）将处方量PEG₂₀₀₀-消旋聚亮氨酸₁₀₀₀、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、焦亚硫酸钠、甘油、依地酸二钠加至适量注射用水中，至磁力搅拌器中65℃加热搅拌使分散均匀，制得水相；

（3）在高速分散均质机搅拌下（10,000 rpm），将油相加入至水相中，继续搅拌约5分钟，制得初乳；

（4）将初乳以0.1 mol·L^-1盐酸溶液调节pH值至5.3左右，用注射用水定容至全量，冷却至40℃左右，转移至高压均质机中，以800 bar压力均质10次；

（5）装瓶，冲氮气，封口，121℃高压蒸汽旋转灭菌10min，冷水浴迅速降温即得。

【处方5】规格：40mg/50ml

多西他赛                       0.08 %

中链甘油三酯（MCT）             10%

PEG₅₀₀₀-消旋聚苯丙氨酸₂₀₀₀          0.1%

大豆磷脂                        2%

聚山梨酯-80                     0.1%

泊洛沙姆188                     0.3%

dl-α-生育酚                    0.1%

油酸                            0.05%

甘油                            2.5%

依地酸二钠                      0.02%

注射用水加至                    100%

制备方法：

（1）将多西他赛和大豆磷脂加入已混合均匀的中链甘油三酯和油酸中，65℃加热搅拌至得到澄清后继续搅拌2h后，得多西他赛载药油相备用；

（2）将处方量PEG₅₀₀₀-消旋聚苯丙氨酸₂₀₀₀、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、dl-α-生育酚、甘油、依地酸二钠加至适量注射用水中，至磁力搅拌器中40℃加热搅拌使分散均匀，制得水相；

（3）在高速分散均质机搅拌下（10,000 rpm），将油相加入至水相中，继续搅拌约5分钟，制得初乳；

（4）将初乳以0.1 mol·L^-1盐酸溶液调节pH值至5.3左右，用注射用水定容至全量，冷却至40℃左右，转移至高压均质机中，以800 bar压力均质10次；

（5）装瓶，冲氮气，封口，121℃高压蒸汽旋转灭菌10min，冷水浴迅速降温即得。

【处方6】规格：20mg/50ml

多西他赛                       0.04%

中链甘油三酯（MCT）            5%

PEG₅₀₀₀-消旋聚谷氨酸苄酯₂₀₀₀      0.05%

大豆油（LCT）                  5%

蛋黄卵磷脂                       1.5%

聚山梨酯-80                     0.2%

泊洛沙姆188                     0.2%

亚硫酸钠                        0.01%

甘油                            2.5%

依地酸二钠                      0.01%

注射用水加至                     100%

制备方法：

（1）将多西他赛和蛋黄卵磷脂加入已混合均匀的中链甘油三酯与大豆油中，75℃加热搅拌至澄清后继续搅拌2h，得多西他赛载药油相备用；

（2）将处方量PEG₅₀₀₀-消旋聚谷氨酸苄酯₂₀₀₀、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、亚硫酸钠、甘油、依地酸二钠加至适量注射用水中，至磁力搅拌器中75℃加热搅拌使分散均匀，制得水相；

（3）在高速分散均质机搅拌下（10,000 rpm），将油相加入至水相中，继续搅拌约5分钟，制得初乳；

（4）将初乳以0.1 mol·L^-1 氢氧化钠溶液调节pH值至5.3左右，用注射用水定容至全量，冷却至40℃左右，转移至高压均质机中，以800 bar压力均质10次；

（5）装瓶，冲氮气，封口，121℃高压蒸汽旋转灭菌10min，冷水浴迅速降温即得。

【处方7】规格：160mg/50ml

多西他赛                        0.32%

大豆油（LCT）                   30%

聚谷氨酸₄₀₀₀-消旋聚亮氨酸₁₀₀₀       0.3%

蛋黄卵磷脂                       5%

聚山梨酯-80                     0.5%

泊洛沙姆188                     0.4%

抗坏血酸                        0.03%

油酸                            0.1%

甘油                            2.5%

依地酸二钠                      0.01%

注射用水加至                 100%

制备方法：

（1）将多西他赛和蛋黄卵磷脂加入已混合均匀的大豆油与油酸中，75℃加热搅拌至澄清后继续搅拌2h后，得多西他赛载药油相备用；

（2）将处方量聚谷氨酸₄₀₀₀-消旋聚亮氨酸₁₀₀₀、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、抗坏血酸、甘油、依地酸二钠加至适量注射用水中，至磁力搅拌器中75℃加热搅拌使分散均匀，制得水相；

（3）在高速分散均质机搅拌下（10,000 rpm），将油相加入至水相中，继续搅拌约5分钟，制得初乳；

（4）将初乳以0.1 mol·L^-1 氢氧化钠或0.1 mol·L^-1盐酸溶液调节pH值至5.3左右，用注射用水定容至全量，冷却至40℃左右，转移至高压均质机中，以800 bar压力均质10次；

（5）装瓶，冲氮气，封口，121℃高压蒸汽旋转灭菌10min，冷水浴迅速降温即得。

【处方8】规格：40mg/50ml

多西他赛                         0.08%

中链甘油三酯（MCT）              15%

聚谷氨酸₄₀₀₀-消旋聚苯丙氨酸₁₀₀₀      0.15%

大豆磷脂                         2%

油酸                             0.05%

聚山梨酯-80                      0.2%

泊洛沙姆188                      0.3%

L-半胱氨酸                       0.5%

甘油                             2.5%

依地酸二钠                       0.02%

注射用水加至                     100%

制备方法：

（1）将多西他赛和大豆磷脂加入已混合均匀的中链甘油三酯与油酸中，75℃加热搅拌至澄清后继续搅拌2h后，得多西他赛载药油相备用；

（2）将处方量聚谷氨酸₄₀₀₀-消旋聚苯丙氨酸₁₀₀₀、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、L-半胱氨酸、甘油、依地酸二钠加至适量注射用水中，至磁力搅拌器中75℃加热搅拌使分散均匀，制得水相；

（3）在高速分散均质机搅拌下（10,000 rpm），将油相加入至水相中，继续搅拌约5分钟，制得初乳；

（4）将初乳以0.1 mol·L^-1 氢氧化钠或0.1 mol·L^-1盐酸溶液调节pH值至5.3左右，用注射用水定容至全量，冷却至40℃左右，转移至高压均质机中，以800 bar压力均质10次；

（5）装瓶，冲氮气，封口，121℃高压蒸汽旋转灭菌10min，冷水浴迅速降温即得。

【处方9】规格：40mg/50ml

多西他赛                        0.08%

中链甘油三酯（MCT）             10%

聚赖氨酸₄₀₀₀-消旋聚苯丙氨酸₁₀₀₀     0.15%

蛋黄卵磷脂                      2%

油酸                            0.1%

聚山梨酯-80                     0.2%

泊洛沙姆188                     0.2%

甘油                            2.5%

依地酸二钠                      0.02%

注射用水加至                    100%

制备方法：

（1）将多西他赛和蛋黄卵磷脂加入已混合均匀的中链甘油三酯与油酸中，75℃加热搅拌至澄清后继续搅拌0.5h，得多西他赛载药油相备用；

（2）将处方量聚赖氨酸₄₀₀₀-消旋聚苯丙氨酸₁₀₀₀、聚山梨酯-80、泊洛沙姆188、甘油、依地酸二钠加至适量注射用水中，至磁力搅拌器中75℃加热搅拌使分散均匀，制得水相；

（3）在高速分散均质机搅拌下（10,000 rpm），将油相加入至水相中，继续搅拌约5分钟，制得初乳；

（4）将初乳以0.1 mol·L^-1 氢氧化钠或0.1 mol·L^-1盐酸溶液调节pH值至5.3左右，用注射用水定容至全量，冷却至40℃左右，转移至高压均质机中，以800 bar压力均质10次；

（5）装瓶，冲氮气，封口，121℃高压蒸汽旋转灭菌10min，冷水浴迅速降温即得。

【处方10】  规格：80mg/50ml

多西他赛                      0.16%

中链甘油三酯（MCT）           25%

聚赖氨酸₄₀₀₀-消旋聚亮氨酸₁₀₀₀     0.15%

大豆磷脂                      4%

油酸                          0.05%

聚山梨酯-80                   0.5%

泊洛沙姆188                   0.5%

甘油                          2.5%

依地酸二钠                    0.02%

注射用水加至                  100%

制备方法：同制备方法9

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

实施例2    

以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液

（处方5）贮存稳定性考察

按本发明技术方案制备的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，在低温（6±2℃）及加速条件（25±2℃）条件下的稳定性结果见表1-6。

表1 优选处方25±2℃加速6个月试验结果

表2优选处方6±2℃长期留样试验结果

以上样品在放置过程中均无晶体析出情况。而单纯采用普通方法制备的传统脂质微球制剂的物理化学稳定性均不好，室温留样在2-30天就会出现药物结晶析出，药物含量下降，有关物质增加等现象。

实施例3 

以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液的

溶血性、刺激性及致敏性试验

1. 受试药品（按本发明制得）

名称：以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液

规格:  40mg:50ml

提供单位：沈阳药科大学药剂教研室提供

2、受试动物

新西兰种白兔：雄性，体重2.0~3.0 kg，由沈阳市东陵区龙元养殖场提供，合格证号：SCXK(辽)2003-0011号。

豚鼠：雌雄各半，体重300~400 g，由沈阳市东陵区龙元养殖场提供，合格证号： SCXK(辽)2003-0011号。

SD大鼠：雄性，体重100~150g, 由沈阳药科大学动物中心提供，合格证号： SCXK(辽)2003-008

3、试验方法

3.1 体外溶血试验

自家兔心脏穿刺采血20 ml，放入盛有玻璃珠的锥形瓶中振摇约10 min，除去纤维蛋白原，制成脱纤维血，1500 rpm离心15 min，除去上清液，加10倍体积的生理盐水同法洗涤三次(均离心弃去上清液)，至上清液无色，用生理盐水配成2%红细胞混悬液备用。

取洁净的10 ml玻璃试管14支，按表1顺序加样，其中第6管和第13管为生理盐水(溶血阴性)对照，第7管和第14管为蒸馏水(溶血阳性)对照。各管轻度摇动至均匀后，于37℃水浴中温育4小时，观察0.25~4小时内各管的溶血程度，按表2标准判断。

表1  体外溶血试验加样表

续表1  体外溶血试验加样表（续）

表2  溶血结果判断

3.2刺激性试验

a．药物剂量的确定

受试药物药品说明书所记载的用法为原药液单次静注给药，故本试验中亦采取原药液静注给药，给药体积为2 ml/只。

b. 血管刺激性试验方法

取家兔6只，分为两组，每组3只，分别为多西他赛组和赋形剂对照组。多西他赛组左耳注射生理盐水2 ml/只, 右耳注射以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液2 ml/只；赋形剂对照组左耳注射生理盐水2 ml/只, 右耳注射赋形剂2 ml/只。在用医用酒精消毒兔耳的给药部位后，于耳缘静脉距尖端约1cm 处进针，分别缓慢注入相应药液。每日同一时间、同一方法注射一次，连续给药3日，每次给药尽量靠近前一次进针处。于每次给药后和下一次给药前肉眼观察注射部位静脉(血管)和周围皮下组织及耳表皮有无刺激性反应，并作详细记录。于末次给药后48小时处死动物，剪取注射部位耳壳约6 cm长，以10%甲醛固定后，分别于注射部位下1 cm和5 cm处取材送检病理，显微镜下观察血管内皮、内皮下组织及血栓形成情况，然后按肉眼和组织学检查结果评价受试药物有无血管刺激性。

c．肌肉刺激性试验方法

分组方法同上。給药前对家兔的后肢给药部位作去毛处理(要避免损伤皮肤)，然后用医用酒精进行消毒，多西他赛组于左股四头肌注射生理盐水1 ml/只，右股四头肌注射以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液1 ml/只。赋形剂组于左股四头肌注射生理盐水1 ml/只，右股四头肌注射赋形剂1 ml/只。每日同一时间、同一方法注射一次，连续给药3日，每次给药尽量靠近前一次进针处。于每次给药后和下一次给药前肉眼观察注射部位有无刺激性反应，并作详细记录。于末次给药后48小时处死动物，剖取股四头肌，观察注射部位肌肉组织有无改变，以10%甲醛固定后送检病理，显微镜下观察注射部位与对照部位肌肉有无无充血、红肿、坏死点等现象出现，然后按肉眼和组织学检查结果评价受试药液有无肌肉刺激性

3.3 主动过敏反应试验

a. 给药剂量的确定

依据《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》(编号：[H]GPT4-1，2005年3月)，致敏用低剂量由人的拟临床给药剂量折算而得，高剂量为低剂量的2倍；激发用剂量在本试验均设为致敏用剂量的2倍。

受试药物临床推荐用法用量为：80 mg/m²。300 g豚鼠的体表面积约为0.036m²。故单次给药量为2.88 mg，合受试药液为3.6 ml。但由于临床上为隔周给药，又考虑到豚鼠对多西他赛敏感而易中毒死亡，故进一步降低剂量，低剂量组设为单次给药量的1/10,即0.36 ml/只,高剂量组为低剂量组的2倍，为0.72 ml/只。

故确定受试药物给药剂量如下：　

致敏用：低剂量组为0.36 ml/只，高剂量组为0.72 ml/只。 

激发用：低剂量组为0.72 ml/只，高剂量组为1.44 ml/只。

致敏用药液的配制：

1) 阳性对照组用0.3%卵白蛋白溶液：取卵白蛋白24 mg，用8 ml生理盐水溶解即得；

2) 阴性对照组用0.9%氯化钠溶液。

激发用药液的配制：

1) 阳性对照组用0.6%卵白蛋白溶液：取卵白蛋白48 mg，用8 ml生理盐水溶解即得；

2) 阴性对照组用0.9%氯化钠溶液。

b. 试验方法

取雄性豚鼠30只，体重300-400 g，按体重随机分为5组(每组6只)，分别为阳性对照组、以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液高剂量组、以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液低剂量组、赋形剂对照组和阴性对照组。各组分别腹腔注射与其相对应的致敏用药液致敏，隔日致敏1次，连续3次。于末次致敏10天后给药激发，各组均由后脚掌外侧的静脉注射相应激发用药液，给药后立即按表3详细观察每只动物的反应症状，记录症状的出现及消失时间，连续观察30 min后，每隔30 min观察1次，直至3小时，根据表4标准评价受试药物有无致敏作用。

表3 过敏反应症状

表4  全身致敏性评价标准

3.4被动皮肤过敏试验

a. 给药剂量的确定及药物的配制方法

依据《化学药物刺激性、过敏性和溶血性研究技术指导原则》(编号：[H]GPT4-1，2005年3月)，致敏用剂量由人的临床推荐给药剂量折算而得。高剂量为低剂量的2倍，激发用剂量与致敏剂量相同。

受试药物临床推荐用法用量为：治疗用量为每次80 mg/m²，分别在第1、8日各给药一次。

故本试验确定给药剂量如下：　

1)致敏用：高剂量组为单次给药的四分之一剂量即20 mg/m²，合给药容积为0.75 ml，低剂量组为10 mg/kg合给药容积为0.375 ml，同时增加赋形剂对照组，其给药容量与高剂量组相同；

2)激发用：激发用剂量与致敏剂量相同。

致敏用药液的配制：

1)阳性对照组：取卵白蛋白6 mg，用1.5 ml生理盐水溶解，再加入1.5 ml 10%Al(OH)₃凝胶液，即得含卵白蛋白2 mg/ml的药液；

2)阴性对照组：于2 ml 10%Al(OH)₃凝胶中加入2 ml 生理盐水混匀即得。

激发用药液的配制：

1)2%伊文思蓝溶液：取伊文思蓝0.4g，用20 ml生理盐水溶解即得；

2)阳性对照组：取卵白蛋白16 mg，用4 ml生理盐水溶解，再加入4 ml 2%伊文思蓝溶液，即得含卵白蛋白2 mg/ml的试液。

3)阴性对照组：取4 ml 2%伊文思蓝溶液，加入4ml 生理盐水混匀即得。

b. 试验方法

1) 抗血清的制备：雄性健康大鼠10只，体重100~150 g。随机分成5组，分别为阳性对照组、阴性对照组、以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液低、高剂量组及赋形剂对照组。采取隔日致敏，共致敏4次，其中仅在第1次给药前每组大鼠均分别腹腔注射百白破疫苗每只0.5 ml。第1日，每组大鼠均分别腹腔注射百白破疫苗每只0.5 ml，除含有多西他赛磷脂复合物的脂质微球注射液高剂量组外，其余各组大鼠分别肌注各相应致敏药液0.6 ml(两后腿各0.3 ml)，四脚掌皮下注射各0.1 ml；含有多西他赛磷脂复合物的脂质微球注射液高剂量组大鼠肌注相应致敏药液0.6 ml(两后腿各0.3 ml)，四脚掌皮下注射各0.1 ml，腹腔注射0.5 ml；第3、5日，给药方式及剂量同第一日；第7日，除以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液高剂量组外，其余各组大鼠分别肌注各相应致敏药液0.6 ml(两后腿各0.3 ml)，腹腔注射0.4 ml，高剂量组大鼠肌注相应致敏药液0.6 ml(两后腿各0.3 ml)，腹腔注射0.9 ml。于末次致敏后12天 (IgE高峰时间)，自大鼠眼眶后静脉丛采血，将血液3000转离心10 min分离血清。此抗血清置冰箱冷冻(-20℃)保存，两周内备用。 

2) 被动皮肤致敏：另取雄性健康大鼠24只，体重140~180 g。随机分成4组，分别为阳性对照组、阴性对照组、以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液低剂量组、高剂量组及赋形剂组。用乙醚浅麻醉，在大鼠背中线两侧距脊柱1.5 cm处把毛剪光，每侧剪2点，每点间隔1.5~2 cm。取上述各组抗血清，用生理盐水稀释不同倍数(分别为1:50、1:40、1:30和1:20)。按抗血清不同浓度次序，皮内注射于剪毛的各点，每点皮内注射0.1 ml。48小时后进行抗原攻击，阳性对照组、阴性对照组以及多西他赛低剂量组尾静脉注射上述配得的各组相应激发用药液1 ml，多西他赛赋形剂组尾静脉注射1.5 ml，20 min后颈椎脱臼处死动物，剪下背部皮肤，检查内侧各注射点位置的蓝色反应斑。

3) 测量各注射点所形成的蓝色反应斑的直径，并求出各浓度抗血清所形成的蓝色反应斑直径的平均值。

4、试验结果

4.1体外溶血试验

加入以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液的1~5号管，加入赋形剂的8~12号管和第6号、13号管的生理盐水对照管未见溶血现象，管底有大量红细胞沉积，轻轻振摇可分散；加入蒸馏水的7号和14号管血细胞则发生全溶 (表5)。

表5  以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液体外溶血试验结果

4.2刺激性试验

a.多西他赛组

1)血管刺激性试验

肉眼观察受试药物组注射部位血管周围无红斑、水肿及组织坏死等现象出现。组织学检查所见：受试药物组标本的注射部位下1 cm及5 cm处血管内未见血栓，内皮细胞未见肿胀、增生，血管外未见出血、水肿、坏死及炎性细胞浸润等病理改变。

2)肌肉组织刺激性试验

肉眼观察受试药物组注射部位周围无充血及组织坏死等现象。组织学检查所见：受试药物组注射部位肌肉组织未见水肿及炎性细胞浸润。  

     b. 赋形剂组 

 1)血管刺激性试验

肉眼观察受试药物组注射部位血管周围无红斑、水肿及组织坏死等现象出现。组织学检查所见：注射部位下1 cm处有1例血管周围间质内可见少许炎性细胞浸润，其它2例及5 cm处3例，血管内及血管外均未见异常。

2)肌肉组织刺激性试验

肉眼观察受试药物组注射部位周围无充血及组织坏死等现象出现。组织学检查所见：注射部位肌肉未见断裂、坏死及炎性细胞。

c.生理盐水对照组

血管6例，肌肉3例：均未见异常。

注：以上刺激性试验病理检验结果详见所附病理报告。

4.3主动过敏反应试验

在末次给药后的观察期，以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液高剂量组的6只豚鼠中有2只豚鼠在第2天死亡，1只在第5天死亡，1只在第7天死亡；低剂量组的6只中有1只在第5天死亡，分析可能由于多西他赛的毒性反应所致。用存活的豚鼠进行了下一步的抗原激发试验，结果如下：阳性对照组在由后脚掌外侧的静脉注射0.9%卵白蛋白激发后，均出现呼吸困难、抽搐等明显的过敏反应症状，并于2分钟内死亡。阴性对照组、受试药低剂量组由后脚掌外侧的静脉注射相应药物激发后，均未见呼吸困难、抽搐、喷嚏、搔鼻等过敏反应症状，亦无死亡发生，所以认为以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液对豚鼠没有致敏作用。

4.4被动皮肤过敏试验

制备抗血清时，多西他赛高剂量组2只大鼠分别于第3次及第4次给药后死亡，分析可能由于多西他赛的毒性反应所致。因此用仅剩的多西他赛低剂量组及赋形剂组进行了下一步的抗原激发试验，结果如下：阳性对照组各浓度抗血清所形成的蓝色反应斑直径的平均值分别为：抗血清浓度为1:50时各点蓝斑直径的平均值为0.78 cm；抗血清浓度为1:40时各点蓝斑直径的平均值为0.98 cm；抗血清浓度为1:30时各点蓝斑直径的平均值为.44 in；抗血清浓度为1:20时各点蓝斑直径的平均值为1.29 cm阴性对照组、多西他赛低剂量组及赋形剂组均未见蓝色反应斑。

5、结果

本实验条件下，以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液体外溶血试验未见溶血性及促血细胞凝集作用；对家兔耳血管及肌肉组织未见明显刺激性；对豚鼠未发生主动过敏反应，对大鼠未见被动皮肤过敏反应。受试品含有多西他赛磷脂复合物的脂质微球注射液在溶血性、刺激性及致敏性三方面均符合注射剂的安全性要求，故可供注射用。

Claims (15)

1.一种以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，其特征在于该注射液的组成包括：多西他赛、两亲性聚氨基酸、注射用油、乳化剂、辅助乳化剂、抗氧剂及注射用水。

2.根据权利要求1所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，其特征在于所述的两亲性聚氨基酸是由消旋化聚疏水氨基酸链与其他亲水链构成的嵌段共聚物。

3.根据权利要求2所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，其特征在于所述疏水链段为消旋化的聚氨基酸链，选自亮氨酸、苯丙氨酸、谷氨酸苄酯等疏水氨基酸单体组成的消旋化均聚物链，分子量1000～5000Da；所述亲水链段选自聚乙二醇、带正电的聚谷氨酸、带负电的聚赖氨酸等生物相容性聚合物，分子量2000～10000Da。

4.根据权利要求3所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，其特征在于所述疏水链段选自消旋聚亮氨酸；所述亲水链段选自聚乙二醇链(PEG)。

5.根据权利要求1所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，其特征在于所述注射用油为长链甘油三酯和中链甘油三酯中的一种或几种的混合物。

6.根据权利要求5所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，其特征在于所述注射用油为大豆油、红花油、沙棘油、月见草油、玉米油、薏苡仁油、鸦胆子油、椰子油、紫苏油、葡萄籽油、橄榄油、蓖麻油、茶油、棉籽油和棕榈油中的一种或几种的混合物。

7.根据权利要求1所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，其特征在于所述的乳化剂选自大豆磷脂、蛋黄卵磷脂和合成磷脂中的一种或几种的混合物。

8.根据权利要求1所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，其特征在于所述的辅助乳化剂选自泊洛沙姆188和聚山梨酯-80中的一种或几种的混合物。

9.根据权利要求1所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，其特征在于所述的抗氧剂优选为L-半胱氨酸、抗坏血酸、dl-α-生育酚、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠和无水亚硫酸氢钠中的一种或几种的混合物。

10.根据权利要求1所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，其特征在于还含有电位调节剂、等渗调节剂和金属螯合剂。

11.根据权利要求10所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，其特征在于所述所述两亲性聚氨基酸为PEG₅₀₀₀-消旋聚亮氨酸₃₀₀₀嵌段共聚物、电位调节剂为油酸、等渗调节剂为注射用甘油、金属螯合剂为乙二胺四乙酸二钠盐、乙二胺四乙酸钠钙盐或其混合物。

12.根据权利要求1-11中任一权利要求所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，其特征在于该注射液的重量百分比组成为：

多西他赛                              0.01%～1%

注射用油                              5%～30% 

两亲性聚氨基酸                        0.05%～1%

乳化剂                                1%～6%

辅助乳化剂                            0.2%～5% 

电位调节剂                            0%～1%

抗氧剂                                0.01%～0.5% 

等渗调节剂                          0.1%～10%

金属螯合剂                            0.001%～2%

其余为注射用水。

13.根据权利要求12所述的以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液，其特征在于该注射液的重量百分比组成为：

多西他赛                              0.04%～0.16%

注射用油                              10%～20% 

两亲性聚氨基酸                        0.1%～0.5%

乳化剂                                2%～5%

辅助乳化剂                            0.5%～2.5% 

电位调节剂                            0%～0.1%

抗氧剂                                0.02%～0.1% 

等渗调节剂                            2%～5%

金属螯合剂                            0.01%～1%

其余为注射用水。

14.一种以两亲性聚氨基酸为稳定剂的多西他赛脂质微球注射液的制备方法，其特征在于包括下述工艺步骤： 

（1）将多西他赛、乳化剂和电位稳定剂在油相中制备载药油相；

（2）将两亲性聚氨基酸、等渗调节剂、辅助乳化剂、抗氧剂、金属螯合剂加入注射用水中，加热，搅拌使分散均匀得水相；

（3）搅拌下，将载药油相加入水相中，制得初乳；将初乳冷却，用注射用水定容至全量，调节pH值至4-6，转移至高压均质机中，高压均质；

（4）装瓶，充氮气，轧盖密封，灭菌，取出后于迅速冷却即得。

15.根据权利要求14所述的制备方法，其特征在于包含以下步骤：

（1）将多西他赛、蛋黄卵磷脂加入75℃中链脂肪酸甘油三酯（MCT）中，75℃下继续搅拌0.5h，得含多西他赛的载药油相；

（2）将两亲性氨基酸、等渗调节剂、辅助乳化剂加入注射用水中，加热至60-80℃，搅拌使分散均匀得水相；

（3）在高速组织捣碎机搅拌下以10,000-20,000r/min的转速，将载药油相加入水相中，待完全加入后，继续搅拌5-15分钟，制得初乳；初乳冷却至室温，用注射用水定容至全量，以氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至4-6，转移至高压均质机中，40℃以下，以60-100 Mpa压力高压均质6-10次；

（4）装瓶，充氮气，轧盖密封，121℃旋转水浴灭菌10min，取出后于冷水浴中迅速冷却即得。

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