CN104323990B - 一种紫杉烷衍生物tm‑2的脂质微球注射液及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种紫杉烷衍生物TM‑2的脂质微球注射液及其制备方法属医药技术领域。该注射液包含以下成分：TM‑2、注射用油、乳化剂、胆固醇、聚乙二醇‑聚天冬氨酸共聚物、辅助乳化剂、稳定剂、等渗调节剂及注射用水。其制备方法为按上述制剂质量计，将TM‑2与油溶性介质混合均匀后，在分散在水相中，经过高速搅拌制备初乳后，再进行高压均质过程，制剂采用高压旋转灭菌法灭菌。与参比制剂紫杉醇脂质微球注射液相比，TM‑2脂质微球注射液显示出更好的抗肿瘤活性。本发明公开的TM‑2脂质微球注射液不仅药效好于参比制剂紫杉醇脂质微球注射液，而且其稳定性好，降低了TM‑2的毒性，提高了疗效，同时可以耐受热压灭菌，适合工业化生产。
Description
技术领域
本发明属医药技术领域，具体涉及一种紫杉烷衍生物TM-2的脂质微球注射液及其制备方法。
背景技术
癌症是严重危害人类健康的一大顽症，每年全世界因癌症而死亡的人不计其数。攻克癌症难关已成为医药工作者和化学工作者当务之急的任务。因此寻找有效的抗癌药物成为研究的热点。抗癌药物的研发是当今的一个世界课题，特别是从天然产物中筛选抗癌新药，已成为抗癌药物研发的热点。
紫杉醇(Paclitaxe,Taxol TAX)最初是由美国科学家Wall和Wani于1971年从太平洋短叶红豆杉(Taxus drevifolia)的树皮中提取分离得到的，后由Albert Einstein医学院的生化教授Schiff和Horwitz报道其独特作用后被广泛重视的一种天然活性产物。近四十年来，紫杉醇作为一种抗癌机理独特、抗癌效果显著、抗癌谱广的一线抗癌药物至今仍成为全世界药物学家研究的焦点，其中代表药物紫杉醇和多西紫杉醇已被美国食品药品监督管理局(FDA)批准用于乳腺癌、宫颈癌、非小细胞肺癌以及前列腺癌的临床治疗。紫杉烷类化合物可与微管蛋白的亚基结合以及通过激活多条信号转导通路，诱导肿瘤细胞凋亡。尽管紫杉烷类化合物具有理想的抗肿瘤效果，但制剂开发却一直受到其极差的水溶性的制约，时至今日美国FDA批准上市的制剂也屈指可数。为解决这一问题，传统制剂学采取了大量加入表面活性剂(聚氧乙烯蓖麻油、吐温-80)的做法，但会直接导致如过敏反应、神经毒性等严重不良反应。开发不含或低含量表面活性剂的紫杉烷制剂，已成为其制剂研究的主要问题。此外，长期的化疗给药导致的多药耐药也限制了对癌症病人的成功治疗。多药耐药(MDR)主要归因于P-糖蛋白(P-gp)在肿瘤细胞中过表达，P-gp外排泵能够显著降低细胞内化疗药物的浓度。近年来随着多药耐药肿瘤的出现，紫杉烷类药物的抗肿瘤效果大打折扣。因此，现有的紫杉烷衍生物制剂不但毒副作用较大，疗效降低，而且降低了病人的顺应性，不利于临床应用。这些问题的解决往往有赖于新颖化学结构和独特作用机制化合物的发现。
近十几年来，紫杉醇对敏感肿瘤细胞和耐药肿瘤细胞的构效关系一直是人们研究的重点和热点。紫杉醇对敏感肿瘤细胞的构效关系研究结果表明：C-13侧链、C-4、C-5的四元氧环及C-4位的乙酰氧基取代、C-2位酯基与细胞毒性密切相关。紫杉醇的对P-gp过表达机制引起的多药耐药肿瘤(MDR)的构效关系研究结果表明：紫杉醇C-13侧链的C-3′苯甲酰基及苯基区域、C-7位及10位的羟基为P-糖蛋白识别并结合的结合高度敏感区域，将这些区域进行结构改造可显著增强对多药耐药(MDR)肿瘤的活性。根据此研究基础，由法国制药公司Sanofi-Aventis投资研发了骨架结构较为新颖的紫杉烷类化合物-拉洛他赛(Larotaxel，XRP9881)，其结构特点是将多西他赛的C-10位乙酰化，C-7、C-8、C-19成三元环。拉洛他赛的临床研究证明，人们对拉洛他赛显著的抗癌疗效，较低的副作用非常满意，尤其是对于过表达多药耐药基因的卵巢癌、乳腺癌疗效更佳。而新一代紫杉烷衍生物TM-2是以拉洛他赛(Larotaxel,XRP9881)为先导化合物,用叔丁基替换C-13侧链的C-3′位苯环，设计而成。与拉洛他赛相比，TM-2对敏感肿瘤细胞和耐药肿瘤细胞的活性均有显著提高，同时，由于侧链C-3′位苯环对位也是细胞色素P450酶系统的代谢位点，此部位叔丁基的引入在一定程度上可使药物代谢稳定性增加，药物作用时间延长。
以紫杉醇和多西他赛为阳性对照而进行的各体内体外抗肿瘤活性研究结果表明，TM-2对多种人源肿瘤细胞系的增殖抑制作用均显著强于阳性对照，尤其是针对MDR肿瘤细胞(MCF-7/ADR、KB/VCR)与紫杉醇相比具有3-5个数量级活性的提高，与多西他赛相比具有1-3个数量级活性的提高，与拉洛他赛相比具有1-2个数量级活性的提高。TM-2作为新一代具有抗多药耐药性的半合成紫杉烷衍生物，在抗肿瘤活性、抗耐药性、生物利用度、抗代谢等方面均有显著优势，因此TM-2的开发与应用具有重大的社会价值。
处方前研究结果表明TM-2难溶于水，且水中稳定性差，但其脂溶性极佳，其在油中的溶解度明显优于多西他赛等现有的紫杉烷类衍生物，TM-2的降解主要发生在水中，而在油中几乎不发生降解。因此采用高压均质技术将TM-2载入O/W型脂质微球的油相或界面膜中，提高其在制剂中的溶解性能及化学稳定性，同时以脂质微球的高效、低毒的优势充分发挥TM-2抗肿瘤活性并降低毒副作用，以促进和推广TM-2的应用。
静脉注射脂肪乳剂作为肠外能量的重要补给方式应用于临床已近半个世纪，是根据乳糜微粒的组成、结构与特点而设计，主要是由甘油三酯和磷脂组成的乳剂颗粒溶液。由于药物包裹于脂肪乳剂的脂质核心部分，该结构类似于微球，因此脂质微球(LipidMicrosphere,LM)的名称也应用而生。载药脂质微球最主要的优点是解决了脂溶性药物难溶于水的问题，避免了有机溶剂的加入，而且药物大部分分散在油相，少部分分散在油水界面层，减少了药物与血管的直接接触，从而减少了对血管的刺激性；其乳化形成的乳滴与人体的乳糜微粒极为相似，易为人体吸收、利用；另外，载药脂质微球也具有靶向定位作用，淋巴系统和MPS靶向性显著，即乳剂中的药物可被动靶向至淋巴液及富含MPS的脏器组织。利用这一特点，将抗癌药物制成静脉注射用脂质微球注射液，注入体内后可明显提高在肝、脾、肺及淋巴等部位的药物浓度，增强疗效，减轻不良反应；而且较高的淋巴药物浓度可有效防止癌细胞从淋巴途径转移。高晓黎等制备的去氢骆驼蓬碱静脉注射用脂质微球注射液，可显著提高药物在肝、脾、淋巴等器官的分布，减少向脑组织的转运，表明其可提高去氢骆驼蓬碱治疗肝、脾等部位癌症的疗效并降低其对神经系统的不良反应。Wang等制备了阿克拉霉素A乳剂，并进行了小鼠药物动力学、组织分布、急毒和药效学研究。结果表明，乳剂可提高疗效并降低药物的心脏毒性，急毒和药效学研究也证实了这项推测。鉴于脂质微球给药系统有上述诸多优势，该剂型已经成为抗癌药物的良好载体。通过系统的处方及工艺摸索，载药脂质微球存在的粒径、灭菌及稳定性等三大难题也已基本得以解决,为实现其工业化生产提供了有力的保证。
发明内容
本发明提供一种紫杉烷衍生物TM-2的脂质微球注射液及其制备方法，目的在于不使用聚氧乙烯蓖麻油、Tween-80、有机溶剂，解决TM-2水溶性差及物理和化学稳定性问题，增加药物的包封率，延长药物的半衰期，制备能耐受热压灭菌的长期放置稳定的TM-2脂质微球注射液。该制剂刺激性小、稳定性好、成本低、适用于工业化大生产。
一种紫杉烷衍生物TM-2的脂质微球注射液，该注射液包含以下成分：TM-2、注射用油、乳化剂、胆固醇、聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物、辅助乳化剂、稳定剂、等渗调节剂及注射用水，各组成成分按质量百分比组成为：TM-20.001％-1％、注射用油5-25％、乳化剂0.8-8％、胆固醇0.03％-0.15％、聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物0.05％-1％、辅助乳化剂0.2-0.8％、稳定剂0.02-0.2％、等渗调节剂1.5-3.5％，余量为注射用水。
所述注射液中TM-2结构式为：
所述注射用油选自红花油、大豆油、玉米油、中链脂肪酸甘油三酯、薏芢油、沙棘油、紫苏油、橄榄油、蓖麻油或鸦胆子油中的一种或几种混合。
所述的乳化剂选自天然磷脂或合成磷脂中的一种或几种；其中所述天然磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂；所述合成磷脂为磷脂酰甘油酯或二硬脂酰磷脂酰胆碱。
所述聚乙二醇-聚氨基酸材料为亲水性的聚乙二醇与疏水性的聚氨基酸构成的嵌段共聚物。所述疏水性聚氨基酸为聚天冬氨酸，分子量1000～5000Da；所述亲水链段选自聚乙二醇，分子量2000～10000Da。
所述的辅助乳化剂选自泊洛沙姆188和聚山梨酯-80中的一种或几种的混合物。
所述的稳定剂选自油酸。
所述的等渗调节剂为甘油，山梨醇，甘露醇，葡萄糖中的一种或其混合物。
一种紫杉烷衍生物TM-2的脂质微球注射液的制备方法，按上述制剂质量计，将TM-2与油溶性介质混合均匀后，在分散在水相中，经过高速搅拌制备初乳后，再进行高压均质过程，制剂采用高压旋转灭菌法灭菌。
该方法按以下工艺步骤进行：
(1)将处方量TM-2、乳化剂、稳定剂、胆固醇分散在适量注射用油中，置磁力搅拌器中加入60～80℃至混合均匀，作为油相；
(2)将处方量的辅助乳化剂、等渗调节剂、聚乙二醇-聚天冬氨酸材料加入适量注射用水中，置磁力搅拌器中加入60～80℃至混合均匀，作为水相；
(3)利用组织捣碎机，缓慢将水相加入油相或将油相加入水相中，以每分钟8，000～20，000转搅拌3～5分钟，即得初乳，将出初乳冷却，用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至4-7左右，用注射用水定容至全量；
(4)将初乳转移至高压乳匀机中，在20-80MPa，30℃～60℃条件下匀化4-15次；
(5)装瓶，封罐氮气，旋转式高压蒸汽灭菌，冷水浴迅速降温即得。
所述处方量为：按质量百分比为：TM-20.001％-1％、注射用油5-25％、乳化剂0.8-8％、胆固醇0.03％-0.15％、聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物0.05％-1％、辅助乳化剂0.2-0.8％、稳定剂0.02-0.2％、等渗调节剂1.5-3.5％，余量为注射用水。
本发明所述的新型紫杉烷衍生物TM-2的脂质微球注射液与传统的脂质微球注射液相比，有很多优势。首先，抗肿瘤活性与同剂型紫杉醇注射液相比有显著提高，特别是针对高度耐药的MDR肿瘤细胞。其次，在微球结构上，加入的两亲性聚乙二醇聚氨基酸嵌段共聚物可在水分散介质中自发定向排列，亲水段向分散介质中伸展，而疏水段排斥于分散介质向内聚集以减小表面张力，刚性强的疏水聚天冬氨酸嵌段内聚可形成固态内核，高柔性的亲水聚乙二醇嵌段在内核表面形成水合性外壳，这一核-壳结构将药物包裹在中心，避免了药物直接与水接触，保护药物活性，从而大大提高了制剂的化学稳定性。给药后，药物在体内缓慢从核-壳结构内油相释放，降低了TM-2自身产生的局部及血管刺激性，也延长了载药脂质微球在体内的循环时间，即可使半衰期延长。由于亲水嵌段聚乙二醇形成的水合性外壳的构象千变万化，因此可掩蔽脂质微球核心且阻止核间凝集，增加粒子的物理稳定性。胆固醇的加入使药物的包封率增加，超过90％的药物被载入脂质微球的核心，这无疑可使药物的物理和化学稳定性增加。磷脂、胆固醇与聚乙二醇聚氨基酸嵌段共聚物形成的三元复合物，大大增加了制剂对高压蒸汽灭菌的耐受能力。该制剂避免了聚氧乙烯蓖麻油、乙醇以及吐温80的使用，也就避免了由其引起的超敏反应和神经毒性。本发明制备的TM-2脂质微球注射液分散相粒径均匀，绝大多数在200nm左右，这些小微粒能被机体的网状组织系统的吞噬细胞所吞噬而滞留在网状组织系统，然后机体再进一步进行分解、代谢、排泄这些胶体状微粒，使药物在体内的网状内皮系统较多聚集，对癌症的治疗具有重要意义。另外，本制剂载药量高，制备工艺可生产放大。经121℃高压蒸汽灭菌10min后，TM-2脂质微球注射液的物理、化学稳定性均良好，样品经6个月加速(25℃)及12个月长期(6℃)试验，各项物理、化学稳定性指标均未发生显著改变。
附图说明
图1体外细胞(KBv)毒性实验；
图2不同制剂在(a)KBv移植瘤小鼠体内的抗肿瘤效果和(b)小鼠体重变化曲线；
图3分别静脉给予小鼠TM-2的Tween-80注射液和TM-2的脂质微球注射液后的体内血药浓度-时间曲线图(给药剂量8mg/kg，n＝6)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，实例仅为提供解释性说明，不意味着以任何方式对本发明的保护范围予以限制。
实施例1
制备TM-2脂质微球注射；规格：0.01mg/ml
制备方法：
(1)称取处方量甘油、泊洛沙姆188和聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物加入适量注射用水中，至磁力搅拌器中30-80℃加热搅拌使分散均匀得水相。
(2)称取处方量中链甘油三酯(MCT)、蛋黄卵磷脂、油酸、胆固醇和TM-2于30-80℃下搅拌分散均匀，得到澄清的含药油相。
(3)在高速组织捣碎机搅拌下，将载药油相加入水相中，以8000转/分搅拌3-5分钟。
(4)初乳冷却至室温，用注射用水定容至全量，用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至4.0-9.0，转移至高压均质机中，以冰水浴控制均质温度在30-80℃，以20-80MPa压力均质4-15次。
(5)装瓶，封罐氮气，旋转式高压蒸汽灭菌，取出后于冷水浴中迅速冷却。灯检合格后，包装，于4-10℃贮存。
实施例2
制备TM-2脂质微球注射液，规格：10mg/ml
制备方法：
(1)称取处方量甘油、泊洛沙姆188和聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物加入适量注射用水中，至磁力搅拌器中30-80℃加热搅拌使分散均匀得水相。
(2)称取处方量的大豆油和中链甘油三酯(MCT)、蛋黄卵磷脂、油酸、胆固醇和TM-2于30-80℃下搅拌分散均匀，得到澄清的含药油相。
(3)在高速组织捣碎机搅拌下，将载药油相加入水相中，以10000转/分搅拌3-5分钟。
(4)初乳冷却至室温，用注射用水定容至全量，用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至4.0-9.0，转移至高压均质机中，以冰水浴控制均质温度在30-80℃，以20-80MPa压力均质4-15次。
(5)装瓶，封罐氮气，旋转式高压蒸汽灭菌，取出后于冷水浴中迅速冷却。灯检合格后，包装，于4-10℃贮存。
实施例3
制备TM-2脂质微球注射液规格：2mg/ml
制备方法：
(1)称取处方量甘油、泊洛沙姆188和聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物加入适量注射用水中，至磁力搅拌器中30-80℃加热搅拌使分散均匀得水相。
(2)称取处方量的大豆油、中链甘油三酯(MCT)、蛋黄卵磷脂、油酸、胆固醇和TM-2于30-80℃下搅拌分散均匀，得到澄清的含药油相。
(3)在高速组织捣碎机搅拌下，将载药油相加入水相中，以10000转/分搅拌3-5分钟。
(4)初乳冷却至室温，用注射用水定容至全量，用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至4.0-9.0，转移至高压均质机中，以冰水浴控制均质温度在30-80℃，以20-80MPa压力均质4-15次。
(5)装瓶，封罐氮气，旋转式高压蒸汽灭菌，取出后于冷水浴中迅速冷却。灯检合格后，包装，于4-10℃贮存。
实施例4
制备TM-2脂质微球注射液规格：1mg/ml
制备方法：
(1)称取处方量甘油、泊洛沙姆188和聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物加入适量注射用水中，至磁力搅拌器中30-80℃加热搅拌使分散均匀得水相。
(2)称取处方量的中链甘油三酯(MCT)、蛋黄卵磷脂、油酸、胆固醇和TM-2于30-80℃下搅拌分散均匀，得到澄清的含药油相。
(3)在高速组织捣碎机搅拌下，将载药油相加入水相中，以9000转/分搅拌3-5分钟。
(4)初乳冷却至室温，用注射用水定容至全量，用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至4.0-9.0，转移至高压均质机中，以冰水浴控制均质温度在30-80℃，以20-80MPa压力均质4-15次。
(5)装瓶，封罐氮气，旋转式高压蒸汽灭菌，取出后于冷水浴中迅速冷却。灯检合格后，包装，于4-10℃贮存。
实施例5
制备TM-2脂质微球注射液 规格：4mg/ml
制备方法：
(1)称取处方量甘油、泊洛沙姆188和聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物加入适量注射用水中，至磁力搅拌器中30-80℃加热搅拌使分散均匀得水相。
(2)称取处方量的大豆油和中链甘油三酯(MCT)、蛋黄卵磷脂、油酸、胆固醇和TM-2于30-80℃下搅拌分散均匀，得到澄清的含药油相。
(3)在高速组织捣碎机搅拌下，将载药油相加入水相中，以10000转/分搅拌3-5分钟。
(4)初乳冷却至室温，用注射用水定容至全量，用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至4.0-9.0，转移至高压均质机中，以冰水浴控制均质温度在30-80℃，以20-80MPa压力均质4-15次。
(5)装瓶，封罐氮气，旋转式高压蒸汽灭菌，取出后于冷水浴中迅速冷却。灯检合格后，包装，于4-10℃贮存。
实施例6
制备TM-2脂质微球注射液 规格：0.01mg/ml
制备方法：
(1)称取处方量甘油、泊洛沙姆188和聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物加入适量注射用水中，至磁力搅拌器中30-80℃加热搅拌使分散均匀得水相。
(2)称取处方量中链甘油三酯(MCT)、大豆卵磷脂、油酸、胆固醇和TM-2于30-80℃下搅拌分散均匀，得到澄清的含药油相。
(3)在高速组织捣碎机搅拌下，将载药油相加入水相中，以8000转/分搅拌3-5分钟。
(4)初乳冷却至室温，用注射用水定容至全量，用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至4.0-9.0，转移至高压均质机中，以冰水浴控制均质温度在30-80℃，以20-80MPa压力均质4-15次。
(5)装瓶，封罐氮气，旋转式高压蒸汽灭菌，取出后于冷水浴中迅速冷却。灯检合格后，包装，于4-10℃贮存。
实施例7
制备TM-2脂质微球注射液 规格：10mg/ml
制备方法：
(1)称取处方量甘油、泊洛沙姆188和聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物加入适量注射用水中，至磁力搅拌器中30-80℃加热搅拌使分散均匀得水相。
(2)称取处方量的大豆油和中链甘油三酯(MCT)、大豆卵磷脂、油酸、胆固醇和TM-2于30-80℃下搅拌分散均匀，得到澄清的含药油相。
(3)在高速组织捣碎机搅拌下，将载药油相加入水相中，以10000转/分搅拌3-5分钟。
(4)初乳冷却至室温，用注射用水定容至全量，用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至4.0-9.0，转移至高压均质机中，以冰水浴控制均质温度在30-80℃，以20-80MPa压力均质4-15次。
(5)装瓶，封罐氮气，旋转式高压蒸汽灭菌，取出后于冷水浴中迅速冷却。灯检合格后，包装，于4-10℃贮存。
实施例8
制备TM-2脂质微球注射液，规格：2mg/ml
制备方法：
(1)称取处方量甘油、泊洛沙姆188和聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物加入适量注射用水中，至磁力搅拌器中30-80℃加热搅拌使分散均匀得水相。
(2)称取处方量的大豆油和中链甘油三酯(MCT)、大豆卵磷脂、油酸、胆固醇和TM-2于30-80℃下搅拌分散均匀，得到澄清的含药油相。
(3)在高速组织捣碎机搅拌下，将载药油相加入水相中，以10000转/分搅拌3-5分钟。
(4)初乳冷却至室温，用注射用水定容至全量，用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至4.0-9.0，转移至高压均质机中，以冰水浴控制均质温度在30-80℃，以20-80MPa压力均质4-15次。
(5)装瓶，封罐氮气，旋转式高压蒸汽灭菌，取出后于冷水浴中迅速冷却。灯检合格后，包装，于4-10℃贮存。
实施例9
制备TM-2脂质微球注射液，规格：1mg/ml
制备方法：
(1)称取处方量甘油、泊洛沙姆188和聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物加入适量注射用水中，至磁力搅拌器中30-80℃加热搅拌使分散均匀得水相。
(2)称取处方量的中链甘油三酯(MCT)、大豆卵磷脂、油酸、胆固醇和TM-2于30-80℃下搅拌分散均匀，得到澄清的含药油相。
(3)在高速组织捣碎机搅拌下，将载药油相加入水相中，以9000转/分搅拌3-5分钟。
(4)初乳冷却至室温，用注射用水定容至全量，用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至4.0-9.0，转移至高压均质机中，以冰水浴控制均质温度在30-80℃，以20-80MPa压力均质4-15次。
(5)装瓶，封罐氮气，旋转式高压蒸汽灭菌，取出后于冷水浴中迅速冷却。灯检合格后，包装，于4-10℃贮存。
实施例10
制备TM-2脂质微球注射液，规格：4mg/ml
制备方法：
(1)称取处方量甘油、泊洛沙姆188和聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物加入适量注射用水中，至磁力搅拌器中30-80℃加热搅拌使分散均匀得水相。
(2)称取处方量的大豆油和中链甘油三酯(MCT)、大豆卵磷脂、油酸、胆固醇和TM-2于30-80℃下搅拌分散均匀，得到澄清的含药油相。
(3)在高速组织捣碎机搅拌下，将载药油相加入水相中，以10000转/分搅拌3-5分钟。
(4)初乳冷却至室温，用注射用水定容至全量，用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至4.0-9.0，转移至高压均质机中，以冰水浴控制均质温度在30-80℃，以20-80MPa压力均质4-15次。
(5)装瓶，封罐氮气，旋转式高压蒸汽灭菌，取出后于冷水浴中迅速冷却。灯检合格后，包装，于4-10℃贮存。
实施例11
TM-2脂质微球注射液与紫杉醇脂质微球注射液药效学对比研究
1.细胞毒性研究
1.1 细胞模型：耐长春新碱人口腔上皮癌细胞(KBv)
1.2 给药方案：分为四组：第一组为空白对照组，第二组为TM-2溶液组，第三组为阳性对照紫杉醇脂质微球注射液组，第四组为TM-2脂质微球注射液组，各组药物浓度范围相同。
1.3 实验方法
细胞毒分析采用MTT法。分别将KB细胞和KBv细胞以1×104cells/Pore的密度接种到96孔培养板中，培养24h后，按以上实验方案给予含药溶液、对照组和TM-2脂质微球注射液组，平行操作三份。在常规培养条件下直接培养72h。培养结束后，每孔加5mg/mL的MTT 20μL，37℃继续培养4h后，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加200μL的DMSO，避光振荡10min使结晶物充分溶解。以酶标仪检测570nm处的吸光度值(A)。按以下公式计算：细胞生长抑制率＝(空白对照组平均A值-实验组平均A值)/空白对照组平均A值×100％。结果如图1所示；结果可见，对KBv肿瘤细胞的生长抑制作用由弱到强的顺序为：空白对照<阳性对照<TM-2溶液<TM-2脂质微球注射液，后两者作用效果接近。说明TM-2脂质微球注射液对耐药KBv细胞的活性要明显好于紫杉醇。
2.人口腔上皮癌细胞(KBv)皮下肿瘤模型
2.1.实验动物：BALB/c小鼠，体重(20±2)g，雄性。
2.2 给药方案：分为四组：第一组为生理盐水对照组，第二组为TM-2溶液组(10mg/kg)，第三组为阳性对照紫杉醇脂质微球注射液组(10mg/kg)，第四组为TM-2脂质微球注射液组(10mg/kg)。
2.3 实验方法
将KBv细胞长到80％～90％融合度时，制备5×106/mL的单细胞悬液，接种到裸鼠的右腋皮下，每只接种0.2mL。当肿瘤长至50-100mm3(记作0天)时，将荷瘤小鼠随机分成4组，每组5只，分别按上述方案给药，于0、4、8天进行给药，每两天测量皮下肿瘤的长短径和小鼠体重的变化，于第28天处死小鼠，绘制肿瘤生长曲线和体重变化曲线。结果如图2所示：
结果可见，动物实验结果与细胞实验一致，给予TM-2脂质微球注射液组小鼠肿瘤生长速度明显慢于阳性对照组(紫杉醇脂质微球注射液)，没有完全抑制肿瘤生长与给药剂量有关，可以通过调整给药剂量进一步控制肿瘤生长。从体重变化曲线看，四组给药方案小鼠体重变化没有显著性差异，制剂毒性较低。
实施例12
TM-2脂质微球注射液大鼠血浆药代动力学试验
TM-2脂质微球注射液大鼠血浆药代动力学试验采用以TM-2的Tween-80注射液为对照，考察了TM-2的脂质微球注射液的在大鼠体内的药代动力学，计算各时间点下两种不同制剂的经时血药浓度，如图3所示：
对比可知，本制剂在体内可保持相对较高的血药浓度，在一定程度上增强药物对肿瘤细胞的杀伤作用，且体内谢速率适中，与对照制剂相比，延长了药物的作用时间(半衰期延长了2.13倍)。
实施例13
TM-2脂质微球注射液稳定性试验
由于本品是热力学不稳定体系，属于对热敏感的剂型。按照中国药典2010版原料药与药物制剂稳定性试验指导原则的说明：对热敏感的药物加速试验在25±2℃条件下放置6个月；在6±2℃条件下放置12个月，考察物理化学稳定性的变化。本实验仅对上述实施例3，4，9进行考察，具体如下表所示。
表1 实施例3样品25±2℃加速6个月试验结果
表2 实施例3样品6±2℃长期留样12个月试验结果
表3 实施例4样品25±2℃加速6个月试验结果
表4 实施例4样品6±2℃长期留样12个月试验结果
表5 实施例9样品25±2℃加速6个月试验结果
表6实施例9样品6±2℃长期留样12个月试验结果
加速及长期放置稳定性试验结果：TM-2脂质微球注射液经25±2℃加速试验6个月和6±2℃长期试验12个月各项考察指标的检验结果均在合格范围之内。
结果表明，TM-2脂质微球注射液具有较好的物理和化学稳定性，在6±2℃条件下保存，有效期应不低于1年。
Claims (8)
1.一种紫杉烷衍生物TM-2的脂质微球注射液，其特征在于该注射液由TM-2、注射用油、乳化剂、胆固醇、聚乙二醇聚氨基酸、辅助乳化剂、稳定剂、等渗调节剂及注射用水组成；各组成成分按质量百分比为：TM-2 0.001％-1％、注射用油5-25％、乳化剂0.8-8％、胆固醇0.03％-0.15％、聚乙二醇-聚天冬氨酸共聚物0.05％-1％、辅助乳化剂0.2-0.8％、稳定剂0.02-0.2％、等渗调节剂1.5-3.5％，余量为注射用水；
所述的稳定剂为油酸。
2.根据权利要求1所述的紫杉烷衍生物TM-2的脂质微球注射液，其特征在于所述TM-2结构式为：
3.根据权利要求1所述的紫杉烷衍生物TM-2的脂质微球注射液，其特征在于所述注射用油选自红花油、大豆油、玉米油、中链脂肪酸甘油三酯、薏芢油、沙棘油、紫苏油、橄榄油、蓖麻油或鸦胆子油中的一种或几种混合。
4.根据权利要求1所述的紫杉烷衍生物TM-2的脂质微球注射液，其特征在于所述的乳化剂选自天然磷脂或合成磷脂中的一种或几种；其中所述天然磷脂为蛋黄卵磷脂、大豆磷脂；所述合成磷脂为磷脂酰甘油酯或二硬脂酰磷脂酰胆碱。
5.根据权利要求1所述的紫杉烷衍生物TM-2的脂质微球注射液，其特征在于所述聚乙二醇-聚氨基酸材料为亲水性的聚乙二醇与疏水性的聚天冬氨酸构成的嵌段共聚物，所述亲水性的聚乙二醇的分子量为2000-10000Da，所述疏水性的聚天冬氨酸分子量为1000-5000Da。
6.根据权利要求1所述的紫杉烷衍生物TM-2的脂质微球注射液，其特征在于所述的辅助乳化剂选自泊洛沙姆188和聚山梨酯-80中的一种或几种的混合物。
7.根据权利要求1所述的紫杉烷衍生物TM-2的脂质微球注射液，其特征在于所述等渗调节剂为甘油，山梨醇，甘露醇，葡萄糖中的一种或其混合物。
8.一种如权利要求1所述的紫杉烷衍生物TM-2的脂质微球注射液的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将处方量TM-2、乳化剂、稳定剂、胆固醇分散在适量注射用油中，置磁力搅拌器中加入60～80℃至混合均匀，作为油相；
(2)将处方量的辅助乳化剂、等渗调节剂、聚乙二醇-聚天冬氨酸材料加入适量注射用水中，置磁力搅拌器中加入60～80℃至混合均匀，作为水相；
(3)利用组织捣碎机，缓慢将水相加入油相或将油相加入水相中，以每分钟8,000～20,000转搅拌3～5分钟，即得初乳，将出初乳冷却，用氢氧化钠或盐酸溶液调节pH值至4-7，用注射用水定容至全量；
(4)将初乳转移至高压乳匀机中，在20-80MPa，30℃～60℃条件下匀化4-15次；
(5)装瓶，封罐氮气，旋转式高压蒸汽灭菌，冷水浴迅速降温即得。
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