CN102188439A - 一种程序性释放多种药物的纳米粒脂质体及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种程序性释放多种药物的纳米粒脂质体及其制备与应用，所述纳米粒脂质体主要由如下质量配比的组分制成：19.34～50.79份聚乳酸羟基乙酸共聚物、5.78～25.73份双氢青蒿素磷脂复合物、0.01～25.27份磷脂、0.01～15.38份双十二烷基二甲基溴铵、0.01～20.0份胆固醇和0.01～10.16份阿霉素；所述的聚乳酸羟基乙酸共聚物分子量为0.5～30万，所述磷脂为天然磷脂或合成磷脂；本发明所述负载不同性质药物的纳米粒脂质体可用于对阿霉素耐药的乳腺癌，白血病的治疗，逆转肿瘤的耐药性，可提高药物的利用率，减少病人痛苦和医疗成本。
Description
(一)技术领域
本发明涉及一种纳米粒脂质体及其制备与应用，特别涉及一种程序性释放多种药物的纳米粒脂质体及其制备与应用。
(二)背景技术
肿瘤的多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是指一种药物对肿瘤的长时间作用产生的耐药性，并会由此引起对其他抗肿瘤药物的交叉耐药性，这种肿瘤细胞产生的多药耐药性，涉及临床常用的多用抗肿瘤药物，是肿瘤治疗能否成功的关键，所以一直以来都是肿瘤治疗研究的热点，但目前还没有行之有效的解决方法。
青蒿素是我国药学工作者1971年从菊科植物黄花蒿叶中提取分离到的一种过氧桥的倍半萜内酯类化合物，双氢青蒿素(Dihydroartemisinin，DHA)是青蒿素类药物在体内的最终活性代谢产物，并一直以来作为抗疟药使用；随着技术进步以及临床的需要，青蒿素以及其衍生物的其他药理活性得到了广泛的关注。尤其是青蒿素及其衍生物的抗肿瘤作用方面，各国药物学家进行了广泛的研究，其抗肿瘤作用的机理可以分成三个作用包括协同、增效作用，逆转肿瘤的多药耐药性，以及抑制肿瘤血管生长和转移的作用，双氢青蒿素磷脂复合物为已申请专利“一种双氢青蒿素磷脂复合物脂质体制剂及其应用”中所制备的磷脂复合物制剂，其与阿霉素联用可有效的增加阿霉素的细胞毒性，并逆转阿霉素的多药耐药性达33倍，本发明中，拟以双氢青蒿素磷脂复合物与阿霉素联用，制备具有逆转阿霉素多药耐药性的制剂。
聚乳酸羟基乙酸共聚物(poly(D，L-lactide-co-gly-colide)，PLGA)又名聚乙丙交酯，丙交酯乙交酯共聚物，是近些年来常采用的控释给药系统的载体材料之一如用于骨科固定和组织修复材料，手术缝合线等等，并已获得美国FDA认可，其具有易于合成，生物可降解、降解速度可调节性和良好的可塑性等特点，因此本发明中通过调节PLGA中丙交酯乙交酯的比例和分子量控制其降解速度，从而控制阿霉素的释放速度。
纳米粒脂质体(lipoparticle)是一类将纳米粒子与脂质体通过范德华力、亲疏水性、电荷的相互作用等作用力，将纳米粒子与脂质体自组装形成的一类复合体系，其可将多种药物通过不同的装载方法包载于同一个纳米粒的复方纳米粒。中国专利“纳米细胞传递系统”(专利号：200580013065.9)涉及了以脂质囊泡包裹PLGA纳米粒的形式，并对其两种制剂的先后起作用进行了权利保护，但其实施例只涉及到血管抑制剂卡布他汀与化疗药物的协同治疗作用，其并未涉及逆转肿瘤多药耐药性的应用，此外本发明中以双十二烷基二甲基溴铵(DMAB)为黏合剂进行纳米粒脂质体的自组装制剂的制备，这种制备方式可以解决阳离子纳米粒的注射毒性问题，具有较好的应用前景，目前尚未见报道，另外也未发现将双氢青蒿素磷脂复合物与阿霉素共同包载制备纳米粒脂质体，用于抗耐药抗肿瘤作用的研究。
(三)发明内容
本发明目的是提供一种程序性释放多种药物的纳米粒脂质体及其制备与应用，以双氢青蒿素磷脂复合物与阿霉素联用，以双十二烷基二甲基溴铵(DMAB)为黏合剂制备具有逆转阿霉素多药耐药性的制剂，可有效的增加阿霉素的细胞毒性，并提高逆转阿霉素的多药耐药性，具有较好的应用前景。
为实现本发明目的，本发明采用的技术方案是：
一种程序性释放药物的纳米粒脂质体，所述的纳米粒脂质体主要由以下质量配比的组分制成：
所述的聚乳酸羟基乙酸共聚物分子量为0.5～30万，所述双氢青蒿素磷脂复合物为双氢青蒿素与磷脂以质量比1∶0.1～10的复合物；所述磷脂为天然磷脂或合成磷脂。
本发明所述的聚乳酸羟基乙酸共聚物为丙交酯与乙交酯质量比1∶0.1～5的共聚物。
本发明所述的纳米粒脂质体主要由以上质量配比的组分制成，“主要”的含义是本发明不排除制剂时再添加一些药用辅料，少量合理药用辅料的添加不会影响本发明的技术效量。
进一步，本发明所述的纳米粒脂质体优选由以下质量配比的组分制成：
所述的聚乳酸羟基乙酸共聚物分子量为0.8～6万。
本发明的纳米粒脂质体中，双氢青蒿素磷脂复合物中的磷脂及纳米粒脂质体中的磷脂，可以相同或不同，所述的磷脂各自独立为下列之一：大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱或二棕榈酰磷脂酰乙醇胺。
本发明所述的程序性释放药物的纳米粒脂质体的制备方法按照以下步骤进行：
(1)阿霉素纳米粒的制备：取组方量双十二烷基二甲基溴铵配制质量浓度0.01％～5％的双十二烷基二甲基溴铵水溶液，加入组方量的聚乳酸羟基乙酸共聚物及组方量的阿霉素溶于有机溶剂A中，7000～29000r/min乳化均质15～30分钟，加水将乳化体系分散，分散后旋转蒸发除去有机溶剂，然后30000～100000r/min离心20～60min，除去多余的双十二烷基二甲基溴铵，弃去上清液，用蒸馏水洗涤，冷冻干燥，即得阿霉素纳米粒；所述的有机溶剂A为乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇或丙酮；所述的有机溶剂A与双十二烷基二甲基溴铵水溶液体积之比为0.2～1∶1；
(2)程序性释放药物的纳米粒脂质体的制备：取组方量的双氢青蒿素磷脂复合物与组方量的磷脂及组方量的胆固醇共混，加入有机溶剂B至混合液澄清，旋转蒸发成膜，再与步骤(1)制得的阿霉素纳米粒共混，以缓冲溶液充分水化，并均质，过碳酸酯膜，制得纳米粒脂质体溶液，然后以10000r/min离心10～30分钟，离心除去未融合的脂质体纳米粒，冷冻干燥，即得程序性释放药物的纳米粒脂质体，所述的有机溶剂B为乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇或丙酮。
本发明方法中所述的缓冲溶液为药典中允许的药用缓冲液，通常可用磷酸盐缓冲溶液、蒸馏水、硼酸缓冲溶液、生理盐水或5％葡萄糖注射液。
本发明推荐pH值为5.0～7.4磷酸盐缓冲溶液。
本发明提供另一种制备所述的程序性释放药物的纳米粒脂质体的方法，所述的方法按照以下步骤进行：
a)阿霉素纳米粒的制备：取组方量双十二烷基二甲基溴铵配制质量浓度0.01％～5％的双十二烷基二甲基溴铵水溶液，取组方量的聚乳酸羟基乙酸共聚物及组方量的阿霉素溶于有机溶剂C中，7000～29000r/min乳化均质15～30分钟，加水将乳化体系分散，分散后旋转蒸发除去有机溶剂，然后30000～100000r/min离心20～60min，除去多余的双十二烷基二甲基溴铵，弃去上清液，用蒸馏水洗涤，冷冻干燥，即得阿霉素纳米粒；所述的有机溶剂C为乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇或丙酮，所述的有机溶剂C与双十二烷基二甲基溴铵水溶液体积之比为0.2～1∶1；
b)程序性释放药物的纳米粒脂质体的制备：取组方量的双氢青蒿素磷脂复合物与组方量的磷脂及组方量的胆固醇共混，加入有机溶剂D至混合液澄清，旋转蒸发成膜，缓冲液充分水化，并均质，过碳酸酯膜，均一粒径为50～300nm，制得双氢青蒿素磷脂复合物脂质体溶液，然后将双氢青蒿素磷脂复合物脂质体溶液与步骤a)制得的阿霉素纳米粒共混，加热至30～70℃，孵育30～90分钟，以10000转离心10～30分钟，离心除去未融合的纳米粒脂质体，冷冻干燥，即得程序性释放药物的纳米粒脂质体，所述的有机溶剂D为乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇或丙酮。
同第一种制备方法相同，该方法优选的缓冲溶液为pH5.0～7.4磷酸盐缓冲溶液。
本发明还提供程序性释放药物的纳米粒脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用，所述应用为纳米粒脂质体对人乳腺癌MCF-7细胞阿霉素敏感株、耐药株的敏感性及耐药性、纳米粒脂质体释药行为及对荷S180肉瘤小鼠的治疗，详见本发明实施例。
本发明所述的一种程序性释放药物的纳米粒脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用，所述的纳米粒脂质体的用量以纳米粒脂质体中阿霉素的含量计为10.01～10.16mg/mg阿霉素，阿霉素用量为2～10mg/kg体重。
所述的双氢青蒿素磷脂复合物的制备方法为：所述双氢青蒿素磷脂复合物为双氢青蒿素与磷脂以摩尔比1∶0.1～10的复合物；所述磷脂为天然磷脂或合成磷脂，按照配比量，将双氢青蒿素与磷脂加入有机溶剂中，30～60℃反应0.5～4h至反应液澄清，将反应液30～60℃减压旋蒸，除去有机溶剂，干燥，即得双氢青蒿素磷脂复合物；所述的有机溶剂为下列之一：氯仿、乙酸乙酯、四氢呋喃、二氯甲烷、三氯甲烷、正己烷、环己烷、甲醇、乙醇、异丙醇、正丁醇或丙酮，所述有机溶剂的用量通常以能够溶解双氢青蒿素及磷脂并澄清为准。
本发明所述的程序性释放多种药物的纳米粒脂质体优选负载双氢青蒿素及阿霉素的纳米粒脂质体。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
(1)本发明所述负载不同性质药物的纳米粒脂质体可用于静脉注射，皮下注射等，如可用于对阿霉素耐药的乳腺癌，白血病的治疗，逆转肿瘤的耐药性；(2)本发明纳米粒脂质体可以同时负载两种以上的药物，并程序性释放药物；(3)本发明程序性释放多种药物的纳米粒脂质体可以改变阳离子纳米粒的表面形状，降低阳离子纳米粒的细胞毒性，是用于制备注射制剂的有效方法；(4)本发明纳米粒脂质体可提高药物的利用率，减少病人痛苦和医疗成本。
(四)附图说明
图1为实施例7所制备的纳米粒脂质体的透射电镜图；
图2为实施例7所制备的纳米粒脂质体的扫描电镜图；
图3为空白纳米粒，空白的脂质体和空白纳米粒脂质体的zeta电位图，图3-1为实施例5方法制备的空白纳米粒的zeta电位图、图3-2为实施例15方法制备的空白脂质体zeta电位图，图3-3为实施例16方法制备的空白纳米粒脂质体zeta电位图；
图4为实施例10方法所制备的双氢青蒿素磷脂复合物/阿霉素纳米粒脂质体中药物释放图；
图5为实施例20纳米粒脂质体的对荷S180肉瘤小鼠的肿瘤抑制率：Blank为空白纳米粒脂质体组，DHA-P为双氢青蒿素磷脂复合物组，DOX为阿霉素组，DOX-N为阿霉素纳米粒组，DOX-N+DHA-P为双氢青蒿素磷脂复合物/阿霉素纳米粒组，LNP为双氢青蒿素/阿霉素纳米粒脂质体组。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述的碳酸聚酯膜为粒径200nm，连续过膜均化10～20次进行均质化处理。
实施例1：DMAB修饰阿霉素纳米粒的制备
取100mg双十二烷基二甲基溴铵配制质量浓度为0.5％的双十二烷基二甲基溴铵水溶液20mL，将聚乳酸羟基乙酸共聚物中丙交酯和乙交酯的质量比50∶50，分子量为8000的聚乳酸羟基乙酸共聚物200mg，10mg阿霉素溶解于10mL乙酸乙酯中，7000r/min乳化均质15分钟，加入蒸馏水定容至100mL，将乳化体系分散，分散后旋转蒸发，除去有机溶剂，30000r/min离心30min，除去多余的双十二烷基二甲基溴铵，弃去上清液，蒸馏水洗涤三遍后，冷冻干燥，即得负载阿霉素纳米粒120mg。
实施例2：DMAB修饰阿霉素纳米粒的制备
取200mg双十二烷基二甲基溴铵配制浓度为1％的双十二烷基二甲基溴铵水溶液20mL，将聚乳酸羟基乙酸共聚物中丙交酯和乙交酯的质量比75∶25，分子量为60000聚乳酸羟基乙酸共聚物300mg，10mg阿霉素溶解于10mL丙酮中，10000r/min乳化均质15分钟，加入蒸馏水定容至100mL，将乳化体系分散，分散后旋转蒸发，除去有机溶剂，30000r/min离心45min，除去多余的双十二烷基二甲基溴铵，弃去上清液，蒸馏水洗涤三遍后，冷冻干燥，即得阿霉素纳米粒210mg。
实施例3：DMAB修饰阿霉素纳米粒的制备
取800mg双十二烷基二甲基溴铵配制浓度为2％的双十二烷基二甲基溴铵水溶液40mL，将聚乳酸羟基乙酸共聚物中丙交酯和乙交酯的质量比25∶75，分子量为100000聚乳酸羟基乙酸共聚物2300mg，10mg阿霉素溶解于20mL丙酮中，15000r/min乳化均质15分钟，加入蒸馏水定容至250mL，将乳化体系分散，分散后旋转蒸发，除去有机溶剂，60000r/min离心，除去多余的双十二烷基二甲基溴铵，弃去上清液，蒸馏水洗涤三遍后，冷冻干燥，即得阿霉素纳米粒1.5g。
实施例4：DMAB修饰阿霉素纳米粒的制备
取1000mg双十二烷基二甲基溴铵配制浓度为5％的双十二烷基二甲基溴铵水溶液20mL，将聚乳酸羟基乙酸共聚物中丙交酯和乙交酯的质量比50∶50，分子量为20000聚乳酸羟基乙酸共聚物2000mg，10mg阿霉素溶解于10mL乙酸乙酯中，29000r/min乳化均质15分钟，加入蒸馏水定容至100mL，将乳化体系分散，分散后旋转蒸发，除去有机溶剂，100000r/min离心，除去多余的双十二烷基二甲基溴铵，弃去上清液，蒸馏水洗涤三遍后，冷冻干燥，即得阿霉素纳米粒90mg。
实施例5：空白纳米粒的制备
取200mg双十二烷基二甲基溴铵(DMAB)配制浓度为1％的双十二烷基二甲基溴铵水溶液20mL，将聚乳酸羟基乙酸共聚物中丙交酯和乙交酯的质量比75∶25，分子量为10000聚乳酸羟基乙酸共聚物300mg溶解于10mL丙酮中，10000r/min乳化均质15分钟，加入蒸馏水定容至100mL，将乳化体系分散，分散后旋转蒸发，除去有机溶剂，30000r/min离心45min，除去多余的双十二烷基二甲基溴铵，弃去上清液，蒸馏水洗涤三遍后，冷冻干燥，即DMAB修饰的空白纳米粒200mg。
实施例6双氢青蒿素磷脂复合物的制备
称取双氢青蒿素0.50g，大豆磷脂2.56g，加入乙酸乙酯40mL，40℃反应1h至反应液澄清，30℃减压旋转蒸发去除溶剂，20℃真空干燥12小时，即得粉末状双氢青蒿素磷脂复合物3.06g，密封包装，放入4℃冰箱保存。
实施例7：双氢青蒿素/阿霉素纳米粒脂质体的制备
取实施例6方法制备的双氢青蒿素磷脂复合物200mg，与200mg大豆卵磷脂，100mg胆固醇共混，溶于氯仿中至反应液澄清，旋转蒸发成膜，与200mg实施例4方法所制备的阿霉素纳米粒共混，以pH7.4的PBS缓冲溶液分水化，过碳酸酯膜，均一粒径，制得纳米粒脂质体溶液，然后以10000r/min离心10min，除去未融合的脂质体，即得程序性释放多种药物的纳米粒脂质体制剂300mg，其透射电镜图如图1所示，扫描电镜图见图2。
实施例8：双氢青蒿素/阿霉素纳米粒脂质体的制备
取实施例6方法制备的双氢青蒿素磷脂复合物400mg，与200mg蛋黄卵磷脂，200mg胆固醇共混，溶于氯仿中至反应液澄清，旋转蒸发成膜，与300mg实施例3方法所制备的阿霉素纳米粒共混，以pH7.4的PBS缓冲液充分水化，过碳酸酯膜，均一粒径，制得纳米粒脂质体的溶液，然后以10000r/min离心10分钟，除去未融合的脂质体，即得程序性释放多种药物的纳米粒脂质体制剂500mg。
实施例9：双氢青蒿素/阿霉素纳米粒脂质体的制备
取实施例6方法制备的双氢青蒿素磷脂复合物200mg，与200mg二肉豆蔻酰磷脂酰甘油，100mg胆固醇共混，溶于丙酮中至反应液澄清，旋转蒸发成膜，与200mg实施例4所制备的阿霉素纳米粒共混，以pH7.4的PBS缓冲溶液充分水化，并均质，过碳酸酯膜，均一粒径，制得纳米粒脂质体的溶液，然后以10000r/min离心10分钟，除去未融合的脂质体，即得程序性释放多种药物的纳米粒脂质体制剂350mg。
实施例10：双氢青蒿素/阿霉素纳米粒脂质体的制备
取实施例6方法所制备的双氢青蒿素磷脂复合物200mg，与200mg二棕榈酰磷脂酰胆碱，100mg胆固醇共混，溶于乙酸乙酯中至反应液澄清，旋转蒸发成膜，与200mg实施例1方法所制备的纳米粒共混，以pH7.4的PBS缓冲溶液充分水化，并均质，过碳酸酯膜，均一粒径，制得纳米粒脂质体的溶液，然后以10000r/min离心10分钟，除去未融合的脂质体，即得程序性释放多种药物的纳米粒脂质体制剂300mg。
实施例11：双氢青蒿素/阿霉素纳米粒脂质体的制备
取实施例6方法制备的双氢青蒿素磷脂复合物200mg，与200mg大豆卵磷脂，100mg胆固醇共混，溶于二氯甲烷中至反应液澄清，旋转蒸发成膜，以pH7.4的PBS缓冲溶液充分水化，过碳酸酯膜，均一粒径，制得双氢青蒿素脂质体的溶液，然后加入实施例4方法制备的阿霉素纳米粒100mg与上述双氢青蒿素脂质体溶液共混加热至40℃，孵育30分钟，然后以10000r/min离心10分钟，离心除去未融合的脂质体，即得程序性释放多种药物的纳米粒脂质体制剂150mg。
实施例12：双氢青蒿素/阿霉素纳米粒脂质体的制备
取实施例6方法所制备的双氢青蒿素磷脂复合物400mg，与200mg蛋黄卵磷脂，200mg胆固醇共混，溶于丙酮中至反应液澄清，旋转蒸发成膜，以pH7.4的PBS缓冲溶液充分水化，并均质，过碳酸酯膜，均一粒径，制得双氢青蒿素脂质体的溶液，然后加入实施例4方法制备的阿霉素纳米粒200mg与上述双氢青蒿素脂质体溶液共混，加热至40℃，孵育30分钟，然后以10000r/min离心10分钟，离心除去未融合的脂质体，即得程序性释放多种药物的纳米粒脂质体制剂300mg。
实施例13：双氢青蒿素/阿霉素纳米粒脂质体的制备
取实施例6方法制备的双氢青蒿素磷脂复合物200mg，与200mg二肉豆蔻酰磷脂酰甘油，100mg胆固醇共混，溶于丙酮中至混合液澄清，旋转蒸发成膜，以5％葡萄糖溶液充分水化，并均质，过碳酸酯膜，均一粒径，制得双氢青蒿素脂质体的溶液，然后加入实施例4方法制备的阿霉素纳米粒100mg与上述双氢青蒿素脂质体溶液加热至45℃，孵育30分钟，然后以10000r/min离心10分钟，离心除去未融合的脂质体，即得程序性释放多种药物的纳米粒脂质体制剂200mg。
实施例14：双氢青蒿素/阿霉素纳米粒脂质体的制备
取实施例6方法制备的双氢青蒿素磷脂复合物200mg，与200mg二棕榈酰磷脂酰胆碱，100mg胆固醇共混，溶于乙酸乙酯中至混合液澄清，旋转蒸发成膜，以生理盐水充分水化，并均质，过碳酸酯膜，均一粒径，制得双氢青蒿素脂质体的溶液，然后加入实施例4制备的阿霉素纳米粒300mg与上述双氢青蒿素脂质体溶液加热至50℃，孵育30分钟，然后以10000r/min离心10分钟，除去未融合的脂质体，即得程序性释放多种药物的纳米粒脂质体制剂450mg。
实施例15：空白脂质体的制备
取200mg蛋黄卵磷脂，200mg胆固醇共混，溶于丙酮中至混合液澄清，旋转蒸发成膜，以pH7.4的PBS缓冲溶液充分水化，过碳酸酯膜，均一粒径，制得空白脂质体的溶液。
实施例16：空白纳米粒脂质体的制备
取实施例5制备的空白纳米粒与实施例15制备的空白脂质体共混，40℃孵育30min，10000r/min离心除去未融合的脂质体，即得空白的纳米粒脂质体。
实施例17：双氢青蒿素/阿霉素纳米粒脂质体对人乳腺癌MCF-7细胞耐药株和敏感株的作用
(1)药液的配制：
1)双氢青蒿素阿霉素纳米粒脂质体药液的配制：取实施例11所制备的程序性释放多种药物的纳米粒脂质体制剂，其中双氢青蒿素与阿霉素的质量百分比为5∶2，用1640培养液(杭州吉诺生物有限公司)，配制成负载有双氢青蒿素和阿霉素纳米粒脂质体样品液。
5mg/mLMTT液的配制：上海生物工程技术服务有限公司
(2)取对数生长期的MCF-7细胞，用含10％胎牛血清的1640培养液制成一定浓度的细胞悬液，加入96孔培养板中，每孔细胞数为0.5×104，在细胞培养箱中37℃培养24h，细胞贴壁后，除去培养液，加入100uL于不同的组中，设置培养液空白组，不加药细胞空白组，每组设六个平行孔，置于37℃恒温培养箱中，培养24小时，每孔加入5mg/mLMTT液20uL继续培养4小时，去上清后，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)200uL，于上述恒温培养箱放置10分钟，酶标仪检测570nm下光密度值(OD值)，实验重复4次。测试内容包括：测定阿霉素浓度为0.05、0.5、1、4和8ug/mL的双氢青蒿素阿霉素纳米粒脂质体(其中双氢青蒿素∶阿霉素重量比恒定为5∶2)对MCF-7细胞(中科院上海细胞所)的抑制率，并依据抑制率(IR)计算IC50(即细胞生长抑制率为50％时的药物浓度)。
各组数值均以
图示。P＜0.05为差异有统计学意义。P＜0.01为差异有显著统计学意义。
对比双氢青蒿素/阿霉素纳米粒脂质体对MCF-7细胞敏感株与耐药株的抑制率，试验结果见表1。
表1纳米粒脂质体对MCF-7敏感株与耐药株的生长抑制率
注：纳米粒脂质体(双氢青蒿素∶阿霉素重量比为5∶2)对MCF-7敏感株的IC50为0.028±0.010ug/mL
纳米粒脂质体(双氢青蒿素∶阿霉素重量比为5∶2)对MCF-7耐药株的IC50为0.147±0.051ug/mL。
从表1可看到纳米粒脂质体(双氢青蒿素∶阿霉素重量比为5∶2)对MCF-7敏感株和耐药株的细胞毒性没有选择性，阿霉素对MCF-7敏感株和耐药株的IC50分别为0.221±0.045ug/mL和47.53±2.53ug/mL，由此可见双氢青蒿素阿霉素纳米粒脂质体具有抗肿瘤增效和逆转阿霉素多药耐药的作用。
实施例18：空白纳米粒、空白脂质体，空白纳米粒脂质体对MCF-7细胞的抑制试验
(1)药品的配制
取实施例5制备的空白纳米粒(DMAB修饰的纳米粒)，实施例15方法制备的空白脂质体以及实施例16方法制备的空白纳米粒脂质体以1640培养液配置成所需浓度。
实验操作同实施例17，根据各药品在570nm下光密度值(OD值)计算各药品对MCF-7敏感株和耐药株的抑制率。
分别将0.5mg/mL、5mg/mL和50mg/mL的空白纳米粒，空白脂质体，空白纳米粒脂质体与MCF-7的耐药株和敏感株作用，考察其载体对MCF-7细胞的抑制率，结果见表2和表3。
表2空白纳米粒，空白脂质体，空白纳米粒脂质体对MCF-7敏感株的抑制率
表3空白纳米粒，空白脂质体，空白纳米粒脂质体对MCF-7耐药株的抑制率
从表2与表3可以看出，高中低浓度的空白脂质体对两种细胞的毒性均没有较明显的抑制作用，空白纳米粒在高中浓度时具有较强的毒性，但这种DMAB阳离子修饰的纳米粒，经过脂质体的复合之后，毒性显著下降，在低浓度时无明显的毒性，因此以纳米粒脂质体作为载体给药时，其载体的毒性低于10％，是一种可行的方法。此外，磷脂层可以与正电性DMAB阳离子修饰的纳米粒形成黏合，从而掩盖了纳米粒的正电性，所以使其细胞穿孔作用下降，而使整体毒性降低，DMAB修饰的空白纳米粒、空白脂质体及空白纳米粒脂质体的zeta电位的变化见图3。
实施例19：纳米粒脂质体释药行为研究
将实施例10所制备的双氢青蒿素磷脂复合物/阿霉素纳米粒脂质体，置于装有20mL磷酸盐缓冲溶液(PBS，pH7.4)的试管中，在37℃恒温振荡箱中振荡，DHA释放完全前每隔2h，DHA释放完全后每隔10h将试管中的溶液取出，并加入在恒温振荡箱中预热的磷酸盐缓冲液，利用高效液相色谱测定各时间点的药物浓度，比较双氢青蒿素及阿霉素的释放情况，结果如图4所示。
图4为负载阿霉素、双氢青蒿素磷脂复合物两种药物的纳米粒脂质体的体外释放，可看出，双氢青蒿素的释放速度较快，并在6小时左右达到最大值，阿霉素在前12小时的释放较少，只有少量吸附在纳米粒子表面的阿霉素释放出来；在双氢青蒿素释放完毕之后，阿霉素才缓慢释放。
实施例20：纳米粒脂质体的对荷S180肉瘤小鼠的治疗效果
取传代7d的荷S180肉瘤细胞的ICR小鼠腹腔液，用生理盐水稀释，细胞浓度1×107个/mL接种于小鼠右腋下，每只0.2mL，建立ICR小鼠S180肉瘤腋下接种模型。将接种后小鼠随机分为7组，每组10只，组内编号，分别为生理盐水对照组(NaCl)，空白纳米粒脂质体组(Blank)，阿霉素组(DOX)，双氢青蒿素磷脂复合物组(DHA-P)，阿霉素纳米粒组(DOX-N)，双氢青蒿素磷脂复合物/阿霉素纳米粒组(DOX-N+DHA-P)，双氢青蒿素/阿霉素纳米粒脂质体组(LNP)。所述的空白纳米粒脂质体组(Blank)为实施例16方法所制备，DHA-P组以实施例6方法所制备，DOX-N组为实施例1方法所制备，DOX-N+DHA-P组以实施例11的方法制备，但没有加热孵育的过程，为直接混合给药，LNP组以实施例11的方法制备。造模后第4d开始尾静脉注射相应药物，每2d给药1次，连续给药4次，阿霉素每次给药2mg/kg，其他组每次给药剂量相当含有阿霉素2mg/kg，双氢青蒿素DHA剂量为20mg/kg，给药后记录每天小鼠体重，游标卡尺测量肿瘤大小，在第15d将动物处死，称体重，剥离肿瘤并称其质量，计算各组平均瘤重，求出肿瘤抑制率，用下式(1)计算肿瘤抑制率：抑瘤率％＝(1-给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％，结果见图5。
图5可以看出，双氢青蒿素磷脂复合物/阿霉素纳米粒组抑瘤率要高于双氢青蒿素或者阿霉素的单独给药组，这说明双氢青蒿素与阿霉素的联合给药可以有效的抑制肿瘤的生长，具有协同治疗的作用；而双氢青蒿素磷脂复合物/阿霉素纳米粒脂质体的制备与双氢青蒿素磷脂复合物和阿霉素纳米粒直接的物理混合物相比，进一步提高了制剂在动物体内的作用，这说明双氢青蒿素与阿霉素的程序性释放可以改善两种药物的协同作用，进一步提高肿瘤的治疗效果，这可能与双氢青蒿素具有血管生长抑制的作用有关系，这都说明这种双氢青蒿素/阿霉素的纳米粒脂质体制剂具有良好的抗肿瘤作用。
Claims (10)
1.一种程序性释放多种药物的纳米粒脂质体，其特征在于所述的纳米粒脂质体主要由如下质量配比的组方制成：
所述的聚乳酸羟基乙酸共聚物分子量为0.5～30万，所述双氢青蒿素磷脂复合物为双氢青蒿素与磷脂以质量比1∶0.1～10的复合物；所述磷脂为天然磷脂或合成磷脂。
2.如权利要求1所述的纳米粒脂质体，其特征在于所述的纳米粒脂质体由以下质量配比的组方制成：
所述的聚乳酸羟基乙酸共聚物分子量为0.8～6万。
3.如权利要求1或2所述的纳米粒脂质体，其特征在于所述的双氢青蒿素磷脂复合物中的磷脂或纳米粒脂质体中的磷脂各自独立为下列之一：大豆卵磷脂、蛋黄卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二硬脂酰磷脂酰胆碱、二硬脂酰磷脂酰甘油、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰胆碱或二棕榈酰磷脂酰乙醇胺。
4.一种制备如权利要求1所述的程序性释放多种药物的纳米粒脂质体的方法，其特征在于所述的方法按照以下步骤进行：
(1)阿霉素纳米粒的制备：取组方量双十二烷基二甲基溴铵配制质量浓度0.01％～5％的双十二烷基二甲基溴铵水溶液，加入组方量的聚乳酸羟基乙酸共聚物及组方量的阿霉素溶于有机溶剂A中，7000～29000r/min乳化均质15～30分钟，加水将乳化体系分散，分散后旋转蒸发除去有机溶剂，然后30000～100000r/min离心20～60min，除去多余的双十二烷基二甲基溴铵，弃去上清液，用蒸馏水洗涤，冷冻干燥，即得阿霉素纳米粒；所述的有机溶剂A为乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇或丙酮；所述的有机溶剂A与双十二烷基二甲基溴铵水溶液体积之比为0.2～1∶1；
(2)程序性释放药物的纳米粒脂质体的制备：取组方量的双氢青蒿素磷脂复合物与组方量的磷脂及组方量的胆固醇共混，加入有机溶剂B至混合液澄清，旋转蒸发成膜，再与步骤(1)制得的阿霉素纳米粒子共混，以缓冲溶液充分水化，并均质，过碳酸酯膜，制得纳米粒脂质体溶液，然后以10000r/min离心10～30分钟，离心除去未融合的脂质体纳米粒，冷冻干燥，即得程序性释放药物的纳米粒脂质体；所述的有机溶剂B为乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇或丙酮。
5.如权利要求4所述的程序性释放药物的纳米粒脂质体的制备方法，其特征在于所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、蒸馏水、硼酸缓冲溶液、生理盐水或5％葡萄糖注射液。
6.如权利要求5所述的程序性释放药物的纳米粒脂质体的制备方法，其特征在于所述的缓冲溶液为pH值为5.0～7.4磷酸盐缓冲溶液。
7.一种制备如权利要求1所述的程序性释放多种药物的纳米粒脂质体的方法，其特征在于所述的方法按照以下步骤进行：
a)阿霉素纳米粒的制备：取组方量双十二烷基二甲基溴铵配制质量浓度0.01％～5％的双十二烷基二甲基溴铵水溶液，取组方量的的聚乳酸羟基乙酸共聚物及组方量的阿霉素溶于有机溶剂C中，7000～29000r/min乳化均质15～30分钟，加水将乳化体系分散，分散后旋转蒸发除去有机溶剂，然后30000～100000r/min离心20～60min，除去多余的双十二烷基二甲基溴铵，弃去上清液，用蒸馏水洗涤，冷冻干燥，即得阿霉素纳米粒；所述的有机溶剂C为乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇或丙酮；所述的有机溶剂C与双十二烷基二甲基溴铵水溶液体积之比为0.2～1∶1；
b)程序性释放药物的纳米粒脂质体的制备：取组方量的双氢青蒿素磷脂复合物与组方量的磷脂及组方量的胆固醇共混，加入有机溶剂D至混合液澄清，旋转蒸发成膜，缓冲液充分水化，并均质，过碳酸酯膜，均一粒径为50～300nm，制得双氢青蒿素磷脂复合物脂质体溶液，然后将双氢青蒿素磷脂复合物脂质体溶液与步骤a)制得的阿霉素纳米粒共混，加热至30～70℃，孵育30～90分钟，以10000转离心10～30分钟，离心除去未融合的纳米粒脂质体，冷冻干燥，即得程序性释放药物的纳米粒脂质体，所述的有机溶剂D为乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇、乙醇或丙酮。
8.如权利要求7所述的程序性释放药物的纳米粒脂质体的制备方法，其特征在于所述的缓冲溶液为磷酸盐缓冲溶液、蒸馏水、硼酸缓冲溶液、生理盐水或5％葡萄糖注射液。
9.如权利要求7所述的程序性释放药物的纳米粒脂质体的制备方法，其特征在于所述的缓冲溶液为pH5.0～7.4磷酸盐缓冲溶液。
10.如权利要求1所述的程序性释放多种药物的纳米粒脂质体在制备抗肿瘤药物中的应用。
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