CN105997942A - 一种人血清白蛋白负载美登素类药物的纳米颗粒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种人血清白蛋白负载美登素类药物的纳米颗粒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种白蛋白负载美登素类药物纳米颗粒制备方法及其应用。采用去溶剂法成功制备了白蛋白载药纳米粒，该法简单、易操作，重复性好。制备的白蛋白载药纳米粒仍然保留了高效抑制肿瘤细胞增殖的能力，证实白蛋白载美登素药物纳米粒具有广阔的抗肿瘤应用前景。

Description

一种人血清白蛋白负载美登素类药物的纳米颗粒及其制备方 法和应用
技术领域
本发明属于抗肿瘤药物领域，具体涉及白蛋白载抗肿瘤药物纳米颗粒的制备方法和应用。
背景技术
科学家们在恶性肿瘤的防治中付出了巨大的努力，临床目前常规的治疗方法主要为手术治疗、放射治疗和药物治疗等，其中化学药物治疗仍占据主要的地位。近几十年来，随着新的抗癌药物的不断问世，肿瘤的化疗疗效有了显著改善。然而，传统的给药方式缺乏靶向性，药物在体内不具备选择性，在杀伤肿瘤细胞的同时不可避免的损害了正常细胞，因此毒副作用大，病人在接受治疗期间生活质量下降。此外，这些小分子化疗药物还存在水溶性差、生物稳定差的缺点，药物在达到肿瘤组织之前会被代谢、分解，只有少部分的药物到达肿瘤病灶，致使药物的利用率较低。再者，低剂量的重复给药容易产生耐药。这些因素成为限制药物用量和疗效发挥的重要原因。
长期的探索和研究发现，以纳米技术为核心的载药系统在肿瘤治疗研究领域具有独特的优势：1)粒径200nm以下的纳米粒可通过实体瘤血管的高通透和淋巴回流的滞留性(EPR效应)被动靶向到肿瘤组织；2)利用纳米技术可提高难溶性药物在水溶液中的溶解性，达到增溶的目的；3)被长循环的纳米粒包裹后的药物降低了跟血液接触的机会，使得药物在血液循环中的半衰期得以提高。因此，纳米载体及药物已经在抗肿瘤研究中取得了良好的应用前景，特别是在传递水难溶性药物中展示了独特的优势。
组成纳米粒的各种物质对最终制剂的性质有很大影响，因此制备纳米时应考虑所用的单体、聚合物及赋形剂的生物相容性、毒性等问题，优先使用毒性低、内源性或可被生物降解成具有良好生理相容性的材料。白蛋白是人或动物血浆中的一种重要组成成分，具有很高的生物利用度、生物相容性、生物降解能力。结合了纳米粒载体和白蛋白性质两方面优势白蛋白纳米载药系统近年来受到广泛的关注，为难溶性药物制剂的开发提供了新的思路。目前，白蛋白载药纳米粒的最典型代表为是由一种美国生物科学公司开发的，不含Cremophor-EL的、白蛋白结合型的纳米粒形式的紫杉醇蛋白纳米粒注射液，它于2005年1月获得美国FDA的批准上市，主要用于化疗失败的乳腺癌患者的治疗。是第一个上市的以nab技术为基础的药物。临床研究显示，该紫杉醇蛋白纳米粒比其聚氧乙烯蓖麻油制剂有更高的治疗指数和安全性，并且避免了使用皮质类固醇的术前给药，显示了人血清白蛋白作为静脉应用载体的广阔前景。因此，以蛋白质为基础的纳米医学已迅速成为药物递送系统研究的最新热点，具有非常重要的临床应用价值。
美登素(maytansine)是一种具有抗肿瘤作用的天然产生的柄型大环内脂(S.Remillard,L.I.Rebhun,G.A.Howie,S.M.Kupchan.Antimitotic activity of thepotent tumor inhibitor maytansine[J].Science,1975,189,1002-1005.)具有中期阻滞抗有丝分裂的特征，是一类比阿霉素和长春碱类等传统抗癌药物活性高1000多倍的强效抗癌药。但由于它的毒副作用大以及对肿瘤细胞特异性差，已被临床上禁止使用。近年来，美登素衍生物作为抗体偶联药物的“弹头”药物成为关注的焦点，应用较多的是其衍生物DM1和DM4。2013年，Genentech/ImmunoGen联合开发的抗体偶联药物trastuzumabemtansine(商品名Kadcyla，临床上又称T-DM1)被FDA批准用于HER2(人表皮生长因子受体2)阳性乳腺癌。T-DM1是将抗体(曲妥珠单抗)和细胞毒性药物(DM1)偶联，利用抗体的靶向作用将细胞毒性药物靶向肿瘤部位，起到抑制肿瘤细胞增长的作用，同时降低药物非特异性造成的全身毒性。
发明内容
本发明提供了一种内含美登素类衍生物的白蛋白载药纳米粒的制备方法。
本发明还提供了一种白蛋白载药纳米粒在制备抗癌药物中的应用。使用本发明的人血清白蛋白包裹后的纳米药物，仍具有较好的抑制肿瘤细胞增殖的能力。
一种白蛋白载药纳米粒的制备方法，向含有抗肿瘤药物和白蛋白的混合溶液中加入无水乙醇，再加入交联剂，透析后获得白蛋白载药纳米粒；
所述的抗肿瘤药物为美登素类抗肿瘤药物。
作为优选，所述的白蛋白为人血清白蛋白。
作为优选，所述的药物为包括美登醇、美登素DM1、美登素DM4等，进一步优选为美登素DM1。
作为优选，所述的交联剂为戊二醛，进一步优选为8％戊二醛溶液。
作为优选，所述的抗肿瘤药物与白蛋白的摩尔比为5:1～1:20。
作为优选，所述的无水乙醇体积是混合溶液体积的1～5倍。
作为优选，每毫克白蛋白中加入的交联剂体积在0.2～1.5μL之间。
所述白蛋白载药纳米粒具体制备方法为：
(1)在人血清白蛋白与抗肿瘤药物或药物的混合溶液中，滴加无水乙醇；该步骤中，无水乙醇为混合溶液的体积的1～5倍，进一步优选为3倍。
(2)在步骤(1)后，加入8％戊二醛溶液；该步骤中戊二醛溶液的体积与人血清白蛋白质量的比例为(0.2～1.5)μL:1mg，进一步优选为1.4μL/mg。
(3)步骤(2)反应后溶液，经高速离心去除多余戊二醛和无水乙醇，得到白蛋白载抗肿瘤药物或抗肿瘤药物前药的纳米粒溶液。
本发明还提供了一种所述的制备方法得到的白蛋白载药纳米粒。
本发明还提供了一种所述白蛋白载药纳米粒在制备抗肿瘤药物中的应用。
同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
本发明通过将美登素类衍生物与白蛋白共组装形成纳米颗粒，然后经过细胞实验显示，经过载药纳米颗粒对肿瘤细胞的增殖具有抑制作用，可以作为一种潜在的抗肿瘤药物使用。
附图说明
图1为实施例3中制备的纳米粒电镜图
图2为实施例4中制备的纳米粒电镜图
图3为实施例5中制备的纳米粒电镜图
图4为实施例1中制备的纳米粒MTT(Bcap37)
图5为实施例1中制备的纳米粒MTT(Lovo)
图6为实施例2中制备的纳米粒MTT(Bcap37)
图7为实施例2中制备的纳米粒MTT(Lovo)
图8为实施例3中制备的纳米粒MTT(Bcap37)
图9为实施例3中制备的纳米粒MTT(Lovo)
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明，但本发明并不受其限制。
实施例1
制备HSA-DM1纳米粒(HSA与DM1摩尔比5:1)
配制12.5mg/mL HSA，取0.5mL，加入DM1(20mg/mL溶于DMSO)，HSA与DM1摩尔比5:1，加入1.5mL无水乙醇，再加入14μL 8％戊二醛溶液，搅拌过夜，3000r，5min离心，取上清液，100000g，40min超速离心，弃上清，底部沉淀为纳米微粒，加蒸馏水500μL，超声溶解。
实施例2
制备HSA-DM1纳米粒(HSA与DM1摩尔比2:1)
配制12.5mg/mL HSA，取0.5mL，加入DM1(20mg/mL溶于DMSO)，HSA与DM1摩尔比2:1，加入1.5mL无水乙醇，再加入14μL 8％戊二醛溶液，搅拌过夜，3000r，5min离心，取上清液，100000g，40min超速离心，弃上清，底部沉淀为纳米微粒，加蒸馏水500μL，超声溶解。
实施例3
制备HSA-DM1纳米粒(HSA与DM1摩尔比1:2)
配制12.5mg/mL HSA，取0.5mL，加入DM1(20mg/mL溶于DMSO)，HSA与DM1摩尔比1:2，加入1.5mL无水乙醇，再加入14μL 8％戊二醛溶液，搅拌过夜，3000r，5min离心，取上清液，1×105g，40min超速离心，弃上清，底部沉淀为纳米微粒，加蒸馏水500μL，超声溶解。制备的纳米粒透射电镜图如图1所示。
实施例4
制备HSA-DM1纳米粒(HSA与DM1摩尔比1:10)
配制12.5mg/ml HSA，取0.5ml，加入DM1(20mg/mL溶于DMSO)，HSA与DM1摩尔比1:10，加入1.5mL无水乙醇，再加入14μL 8％戊二醛溶液，搅拌过夜，3000r，5min离心，取上清液，100000g，40min超速离心，弃上清，底部沉淀为纳米微粒，加蒸馏水500μL，超声溶解。制备的纳米粒透射电镜图如图2所示。
实施例5
制备HSA-DM1纳米粒(HSA与DM1摩尔比1:20)
配制12.5mg/mL HSA，取0.5mL，加入DM1(20mg/mL溶于DMSO)，HSA与DM1摩尔比1:20，加入1.5mL无水乙醇，再加入14μL 8％戊二醛溶液，搅拌过夜，3000r，5min离心，取上清液，100000g，40min超速离心，弃上清，底部沉淀为纳米微粒，加蒸馏水500μL，超声溶解。制备的纳米粒透射电镜图如图3所示。
实施例6
考察实施例1、2、3中HSA-DM1纳米粒对肿瘤细胞(肠癌细胞Lovo、乳腺癌细胞Bcap37)增殖的抑制作用，具体方法如下：
取对数生长期细胞，接种于96孔培养板(5000个细胞/孔)。放入在37℃细胞培养箱中恒温培养24h后，加入HSA-DM1纳米粒，以DM1作为对照组，每种药每个浓度4个重复值，加完药后将96孔细胞板放入细胞培养箱中培养72h后，在96孔板的每孔内加入30μL的四甲基偶氮唑蓝(MTT)，继续放入细胞培养箱中培养4h后，吸弃培养基，每孔加入100μL二甲亚砜，用酶标仪检测490nm处的吸光值。计算细胞存活率，绘制出细胞存活曲线，得到药物对细胞生长的IC50(半数抑制浓度)。HSA-DM1对各种肿瘤细胞的体外毒性结果见表1。细胞实验结果如图4-9所示。
表1实施例1、2、3中纳米粒对肿瘤细胞的IC50(nM)
表1结果显示，与肠癌细胞系Lovo共培养72h后，各实验组对肿瘤细胞的存活率都有一定的影响。其中，实施例1、2、3中制备的HSA-DM1-NPs对Lovo细胞的IC50值分别77.1、149.9和122.8nM；与乳腺癌细胞Bcap37共培养72h后，实施例1、2、3中制备的HSA-DM1-NPs对细胞的IC50值分别54.5、94.7和35.3nM。

Claims (8)

1.一种白蛋白载药纳米粒的制备方法，其特征在于，向含有抗肿瘤药物和白蛋白的混合溶液中加入无水乙醇，再加入交联剂，获得白蛋白载药纳米粒；
所述的抗肿瘤药物为美登素类抗肿瘤药物。
2.根据权利要求1所述的白蛋白载药纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的白蛋白为人血清白蛋白。
3.根据权利要求1所述的白蛋白载药纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的交联剂为戊二醛。
4.根据权利要求1所述的白蛋白载药纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的抗肿瘤药物与白蛋白的摩尔比为5:1～1:20。
5.根据权利要求1所述的白蛋白载药纳米粒的制备方法，其特征在于，所述的无水乙醇体积是混合溶液体积的1～5倍。
6.根据权利要求1所述的白蛋白载药纳米粒的制备方法，其特征在于，每毫克白蛋白中加入的交联剂体积在0.2～1.5μL之间。
7.一种由权利要求1～6任一项所述的制备方法得到的白蛋白载药纳米粒。
8.一种如权利要求7所述的白蛋白载药纳米粒在制备抗癌药物中的应用。
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