CN105367781A - 新型阳离子聚合物纳米材料基因载体及制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型阳离子聚合物纳米材料基因载体及制备方法和应用。本发明的载体为共聚物,包括聚乙二醇核芯以及与所述聚乙二醇核芯共价连接的(a)聚赖氨酸嵌段、(b)聚赖氨酸嵌段和聚组氨酸嵌段;或(c)由赖氨酸单体、组氨酸单体和任选的氨基酸单体聚合形成的无规或交替聚合物区段。本发明还公开了共聚物与核酸形成的复合物,用于制备治疗肿瘤的药物。本发明的基因递送载体,不仅可以有效递送DNA,还可有效递送RNA。
Description
技术领域
本发明涉及基因治疗领域,具体涉及一种可高效转染干细胞的新型阳离子聚合物纳米材料基因载体及其构建和应用。
背景技术
随着现代医学与分子生物学的快速发展,基因治疗作为一种新型治疗癌症的手段逐渐走向成熟。基因治疗一般包括三个部分:具有功能性的基因(治疗基因)、携带治疗基因的载体(基因递送系统)和治疗基因的作用位点(靶细胞)。
目前,基因递送系统主要分为病毒载体和非病毒载体两大类。常见的病毒载体主要有:慢病毒、逆转录病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒和腺相关病毒。非病毒基因载体主要包括:脂质体、聚合物和脂质体-聚合物三大类。与病毒基因载体相比,非病毒载体具有明显的优势,基因负载量不受限制(从20bp到100kbp的核苷酸或者质粒都可以有效地负载),生物安全性好,没有潜在的传染性,免疫原性低,合成方法简单,可以大量制备、成本低廉。
在聚合物基因载体中,以阳离子聚合物应用最为广泛,因其结构的正电荷能与带负电荷的基因静电作用而形成稳定复合物,表面正电荷可与细胞膜表面的负电荷发生静电吸附而促进细胞内吞。
阳离子聚合物不仅能携带基因,还能同时携带治疗药物(阿霉素,顺铂,喜树碱等),因此,在癌症治疗中,其应用前景显得尤为突出,它是未来非病毒载体多功能化发展的方向。
pDNA和siRNA是非病毒基因载体系统中常用的两种,其递送载体的设计重点并不完全一致。表现为:pDNA更需要递送载体的致密包裹性能;siRNA则需要大容量的负荷性能和较高的复合体稳定性。而现在大部分已构建的阳离子聚合物基因载体不能同时有效递送pDNA和siRNA。
因此本领域尚需研发新型的阳离子聚合物基因载体,能够有效递送pDNA和siRNA,扩大应用范围。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型的阳离子聚合物基因载体。
本发明的第一方面,提供一种共聚物,所述共聚物包括聚乙二醇核芯以及与所述聚乙二醇核芯共价连接的(a)聚赖氨酸嵌段、(b)聚赖氨酸嵌段和聚组氨酸嵌段;或(c)由赖氨酸单体、组氨酸单体和任选的氨基酸单体聚合形成的无规或交替聚合物区段。
在另一优选例中,所述共聚物的通式为式I:
C-(Z)x(I)
其中,C为聚乙二醇核芯;
Z为A-B或W,其中A为聚赖氨酸嵌段;B为聚组氨酸嵌段;
或者W为由赖氨酸单体、组氨酸单体和任选的氨基酸单体聚合形成的无规或交替聚合物区段;
x为≥1的正整数。
在另一优选例中,所述共聚物具有以下一个或多个特征:
(1)所述聚乙二醇核芯的分子量为1000-5000g/mol。
(2)所述聚赖氨酸嵌段的重复单元数为40-150,较佳地为45-120。
(3)所述聚组氨酸嵌段的重复单元数为0-50,较佳地为10-30。
(4)所述共聚物的粒径为50-100纳米。
(5)所述共聚物的平均水合粒径为190-210纳米。对应的电位在5-20mV。
(6)所述共聚物形成胶束的CMC值为35-50mg/L。
在另一优选例中,所述聚赖氨酸嵌段中,赖氨酸的含量≥80%,较佳地≥90%,更佳地为100%。
在另一优选例中,所述聚组氨酸嵌段中,组氨酸的含量≥80%,较佳地≥90%,更佳地为100%。
在另一优选例中,共聚物的结构如式Ia所示,
式中,n为40-150,m为0-50。在另一优选例中,n为45-120;和/或m为10-30。
应注意的是,上述结构式仅是本发明的共聚物的结构示意,用于说明共聚物中包含有聚乙二醇核芯、n个赖氨酸单体单元和m个组氨酸单体单元,其中赖氨酸单体单元和组氨酸单体单元可以无规排列,交替排列、也可以为嵌段形式排列。
本发明的第二方面,提供第一方面所述的共聚物的制备方法,所述方法包括以下步骤:
(i)mPEG-COOH与胱胺反应生成mPEG-SS-NH2;
(ii)mPEG-SS-NH2和Lys(Cbz)-NCA以及任选的His(Bzl)-NCA发生开环反应,再脱去苄氧羰基保护基得到所述共聚物;
其中,Lys(Cbz)-NCA和His(Bzl)-NCA的结构如下所示:
各式中,R1为R2为
在另一优选例中,所述步骤(ii)在避光和惰性气体保护下进行开环反应。所述惰性气体为氮气、氩气、或氦气。在另一优选例中,所述步骤(ii)在无水有机溶剂中进行开环反应,所述有机溶剂选自选自:四氢呋喃、二氧六环、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺、N-甲基吡咯烷酮。在另一优选例中,所述步骤(ii)的开环反应温度为15-30℃,较佳地为20-25℃。在另一优选例中,所述步骤(ii)的开环反应时间为2-4天。
在另一优选例中,Lys(Cbz)-NCA由ε-苄氧羰基-L-赖氨酸与三光气反应制得。
在另一优选例中,Nα-苄氧羰基-Nim-苄基-L-组氨酸于氯化亚砜反应生成His(Bzl)-NCA·HCl,用碱去除盐酸后得到His(Bzl)-NCA。
在另一优选例中,所述步骤(ii)中,在HBr/HAc作用下脱除苄氧羰基保护基。
本发明的第三方面,提供第一方面所述的共聚物的用途,用于制备基因递送载体。
在另一优选例中,所述基因为pDNA或siRNA。
本发明的第四方面,提供一种复合物,所述复合物包含:
第一方面所述的共聚物;和
核酸。
在另一优选例中,所述复合物的水合粒径为100-220nm。
在另一优选例中,所述核酸为pDNA或siRNA。
在另一优选例中,所述共聚物与所述核酸的质量比为0.01-10,较佳地为0.05-8,更佳地,为0.1-6,甚至为0.5-5。
本发明的第五方面,提供第四方面所述的复合物的制备方法,包括以下步骤:
(a)将第一方面所述的共聚物溶于NaCl溶液或磷酸缓冲盐溶液中得到共聚物溶液;
(b)将核酸(如pDNA或siRNA)与步骤(a)得到的共聚物溶液混合后得到所述复合物。
在另一优选例中,所述NaCl溶液的浓度为100-200mM,较佳地为120-180mM。
在另一优选例中,步骤(a)得到的共聚物溶液的浓度为0.5-5mg/ml,较佳地为08-2mg/ml。
本发明的第六方面,提供第四方面所述的复合物的用途,用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物。
在另一优选例中,所述肿瘤包括(但不限于):肝癌、肺癌、口腔上皮癌、鼻咽癌、甲状腺癌、食道癌、淋巴癌、胸腔癌、消化道癌、胰腺癌、肠癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、肾癌、胆囊癌、胆管癌、中枢神经癌、睾丸癌、膀胱癌、前列腺癌、皮肤癌、黑色素瘤、肉癌、脑癌、血癌、宫颈癌、胶质瘤、胃癌、或腹水瘤。
本发明的第七方面,提供一种药物组合物,包含:
第四方面所述的复合物;以及
药学上可接受的载体。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1为mPEG-SS-Lysn-r-Hism的1HNMR谱图,其中(A)为mPEG-SS-Lys55的谱图;(B)为mPEG-SS-Lys95的谱图;(C)为mPEG-SS-Lys55-r-His20的谱图和(D)为mPEG-SS-Lys95-r-His20的谱图。
图2为mPEG-SS-Lys95-r-His20的透射电镜图。
图3为mPEG-SS-Lys95-r-His20的水合粒径图。
图4为mPEG-SS-Lys55-r-His20/芘的荧光激发波谱。
图5为mPEG-SS-Lys95-r-His20/芘的荧光激发波谱。
图6为缓冲能力实验结果图。
图7为凝胶电泳表征不同质量比的mPEG-SS-Lysn-r-Hism和pDNA制成的复合物的复合能力图,其中(A)为mPEG-SS-Lys55/pDNA;(B)为mPEG-SS-Lys95/pDNA;(C)为mPEG-SS-Lys55-r-His20/pDNA和(D)为mPEG-SS-Lys95-r-His20/pDNA。
图8为凝胶电泳表征不同质量比的mPEG-SS-Lysn-r-Hism和pDNA制成的复合物的抗DNaseI降解能力图,其中(A)为mPEG-SS-Lys55-r-His20/pDNA和(B)为mPEG-SS-Lys95-r-His20/pDNA。
图9为不同质量比的mPEG-SS-Lysn-r-Hism和pDNA制成的复合物的平均水合粒径图。
图10为表面电位图。
图11为复合体暴露于10mMGSH不同时长的水合粒径。
图12为凝胶电泳表征不同质量比的mPEG-SS-Lysn-r-His20和siRNA制成的复合物的复合能力图,其中(A)为mPEG-SS-Lys55-r-His20/siRNA和(B)为mPEG-SS-Lys95-r-His20/siRNA。
图13为细胞毒性实验结果图。
图14为BCA法测定转染效率结果图。
图15为FCM法测定转染效率结果图,其中,统计学表述为:*p<=0.05,**p<=0.01,***p<=0.001,op>0.05。293T细胞组和HepG2细胞组,未标识的两两组之间为***p<=0.001。MSCs组,未标识的两两组之间为op>0.05。
图16为血清转染效率结果图,其中星号含义为:**p<=0.01,***p<=0.001。
图17为FCM法检测细胞吞噬效率结果图,其中,星号含义为:*p<=0.05;**p<=0.01,***p<=0.001。
图18为293T细胞(A)和HepG2细胞(B)中FITC-mPEG-SS-Lys95-r-Hism的吞噬效率图,其统计学分析结果为各组与对照组相比较而得。其中,星号含义为:*p<=0.05,**p<=0.01,***p<=0.001。
图19为mPEG-SS-Lys55-r-His20/VEGF-siRNA和mPEG-SS-Lys95-r-His20/VEGF-siRNA对HepG2细胞的生长抑制结果图。其统计学分析结果为各浓度梯度下与对照组相比较而得。其中,星号含义为:***p<=0.001。
图20为westernblotting实验结果图,其中,(A)为空包对照;(B)为PEI/NC-siRNA;(C)为mPEG-SS-Lys95-r-His20/VEGF-siRNA;(D)为mPEG-SS-Lys55-r-His20/VEGF-siRNA。
图21为BODIPY-mPEG-SS-Lys95-r-His20在荷瘤鼠内的荧光分布。
图22为BODIPY-mPEG-SS-Lys95-r-His20在内脏及肿瘤的荧光分布(A)和荧光强度(B)。
图23为CLSM图像,其中(A)为mPEG-SS-Lys55/pEGFP,(B)为mPEG-SS-Lys95/pEGFP,(C)为mPEG-SS-Lys55-r-His20/pEGFP、(D)为mPEG-SS-Lys95-r-His20/pEGFP和(E)为PEI/pEGFP。Bar:
图24为活体肿瘤生长抑制实验结果图。
具体实施方式
本申请的发明人经过广泛而深入地研究,首次意外研发出一种式I所述的基因递送载体。本发明的新型递送载体可以高效递送和运载各种核酸类物质。试验表明,本发明的递送载体不仅可以有效复合pDNA还可复合siRNA,能够非常有效地递送pDNA和siRNA。在此基础上,完成了本发明。
术语
pDNA
pDNA是环形质粒,大小通常在1~100kb,可以在基因表达区加入任意目的基因,在细胞核内复制后,经过转录和翻译使细胞表达目的基因,从而弥补生物体基因本身的缺陷表达而到治疗目。
本发明中,可以采用现有技术中已知的各种方法在pDNA的基因表达区加入目的基因。
siRNA
siRNA是一种由21-25个核苷酸组成的小RNA分子,由Dicer(RNAaseIII家族中对双链RNA具有特异性的酶)加工而成。siRNA是siRISC的主要成员,激发与之互补目标mRNA的沉默,迅速阻断基因活性,从而阻断目的蛋白翻译表达。
递送载体
本发明递送载体可以高效递送和运载各种核酸类物质,代表性的例子包括(但并不限于):DNA、RNA或DNA/RNA杂合核酸;线性核酸、环状核酸以及各种核酸构建物(如质粒等)。
以miRNA为例,递送时可以直接递送miRNA分子,也可以递送能够产生miRNA前体分子的质粒。
药物组合物
本发明还提供了一种药物组合物,它包含安全有效量范围内的活性成分,以及药学上可接受的载体。
本发明所述的“活性成分”是指本发明所述的共聚物或复合物。
本发明所述的“活性成分”和药物组合物可用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物。
“安全有效量”指的是:活性成分的量足以明显改善病情,而不至于产生严重的副作用。通常,药物组合物含有1-2000mg活性成分/剂,更佳地,含有10-200mg活性成分/剂。
“药学上可接受的载体”指的是:一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质,它们适合于人使用,而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和,而不明显降低活性成分的药效。药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。
本发明的活性成分或药物组合物的施用方式没有特别限制,代表性的施用方式包括(但并不限于):口服、瘤内、直肠、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)等。
用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。
在这些固体剂型中,活性成分与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合,如柠檬酸钠或磷酸二钙,或与下述成分混合:(a)填料或增容剂,例如,淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸;(b)粘合剂,例如,羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶;(c)保湿剂,例如,甘油;(d)崩解剂,例如,琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠;(e)缓溶剂,例如石蜡;(f)吸收加速剂,例如,季胺化合物;(g)润湿剂,例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯;(h)吸附剂,例如,高岭土;和(i)润滑剂,例如,滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠,或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中,剂型也可包含缓冲剂。
所述的固体剂型还可采用包衣和壳材制备,如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂,并且,这种组合物中活性成分的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。
用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性成分外,液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂,如水或其它溶剂,增溶剂和乳化剂,例知,乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油,特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外,组合物也可包含助剂,如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性成分外,悬浮液可包含悬浮剂,例如,乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液,和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
本发明共聚物或复合物可以单独给药,或者与其他治疗药物(如化疗药)联合给药。
使用药物组合物时,是将安全有效量的本发明共聚物或复合物适用于需要治疗的哺乳动物(如人),其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量,对于60kg体重的人而言,日给药剂量通常为1~2000mg,优选20~500mg。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明提到的上述特征,或实施例提到的特征可以任意组合。本案说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用,说明书中所揭示的各个特征,可以被任何提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明,所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
本发明的有益之处在于:
(1)本发明提供了一种新型的还原敏感和pH敏感性的基因递送载体,不仅可以复合pDNA,还可以复合siRNA,能够有效递送pDNA和siRNA。
(2)本发明的基因递送载体,具有较强的质子缓冲能力,能够保护DNA不被DNaseI降解。
(3)本发明的基因递送载体,细胞相容性好,对细胞基本无毒性作用。作用于细胞后数小时后细胞存活率大于80%。
(4)本发明的基因递送载体和复合物,能够有效转染上皮细胞、肿瘤细胞和骨髓基质干细胞,具有较高的转染效率,细胞对复合物也有较佳的吞噬效率。
(5)mPEG-SS-Lysn-r-Hism/pDNA复合物能有效转染大鼠MSCs,转染效率高于阳性对照,具备用于干细胞的潜力。
(6)本发明的复合物能快速聚集到皮下肿瘤部位,较长期的体内转染中,在肿瘤部位基因高表达。
(7)mPEG-SS-Lysn-r-Hism/siRNA复合物能够在体内外对HepG细胞产生生长抑制,不影响裸鼠的生存寿命。肿瘤体积和质量变小说明复合体不仅在体外沉默蛋白表达,也能在体内实现基因沉默。
应理解,在本发明中mPEG-SS-Lysn-r-Hism仅表明本发明的共聚物包含有聚乙二醇核芯、n个赖氨酸单体单元和m个组氨酸单体单元,其中赖氨酸单体单元和组氨酸单体单元可以无规排列,交替排列、也可以为嵌段形式排列。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义,文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外,任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
mPEG-SS-Lysn-r-Hism的构建及表征
制备过程示意如下:
室温下,称取9g胱胺二盐酸(40mmol)溶解于80ml双蒸水,滴加80μl氢氧化钠(1M),磁力搅拌反应1h后将产物于60℃旋蒸,去除所有水分。向旋干后的产物中滴加60ml无水二氯甲烷,磁力搅拌30min,随后滤纸过滤除盐,再于30℃将滤液旋干,去除二氯甲烷。最后将产物置于真空干燥箱干燥过夜。
在氮气保护下活化mPEG-COOH(甲氧基-聚乙二醇-羧基,MW2000g/mol,上海炎怡生物科技有限公司),将mPEG-COOH(2g,1mmol)、N-羟基丁二酰亚胺(0.14g,1.2mmol)和N,N’-二环己基碳二亚胺(0.25g,1.2mmol)溶于40ml无水二氯甲烷中,冰浴、磁力搅拌5h。
将过量的干燥的胱胺(1g,7mmol)溶于10ml无水二氯甲烷中,通过分液漏斗缓慢滴加到上述溶液中,室温下持续搅拌24h。将反应液先抽滤去除析出的氯化钠,再用冷乙醚沉淀两次,最后用截留分子量为1000Da的透析袋在蒸馏水中透析48h。冷冻干燥后得到纯化的mPEG-SS-NH2,其产率为80%。
将干燥的Lys(Cbz)(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸,11.2g,40mmol)和三光气(5g,16.8mol)分别溶于100ml和20ml无水四氢呋喃。将三光气缓慢地加入Lys(Cbz)溶液,此反应在50℃油浴及氮气保护下进行。反应液起先会变成白色浑浊状,约3h之后会变澄清,此时反应完成。将反应粗制品旋蒸浓缩,再加入过量的无水正己烷在-20℃过夜冷冻促结晶。次日,再用四氢呋喃/正己烷(1:1.5,v/v)重结晶纯化两次后抽滤,并将纯化产物Lys(Cbz)-NCA(ε-苄氧羰基-L-赖氨酸-N-糖基-环内酸酐)置于30℃真空干燥箱24h,其产率为90%。
将His(Bzl)-Cbz(Nα-苄氧羰基-Nim-苄基-L-组氨酸,2g,5.3mmol)溶于10ml无水1,4-二氧己环,缓慢滴加2ml氯化亚砜。此反应在氮气保护和室温反应3h。产物在乙醚沉淀下形成晶体,真空干燥过夜后溶于10ml二甲基甲酰胺DMF,并加入1ml三乙胺,磁力搅拌30min在过滤除盐酸三乙胺。滤液经过透析和冻干,得到纯化的His(Bzl)-NCA(Nim-苄基-L-组氨酸-N-羰基-环内酸酐),其产率为70%。
无水DMF作为反应溶剂,加入mPEG-SS-NH2、Lys(Cbz)-NCA和His(Bzl)-NCA,磁力搅拌3天、室温、避光和氮气保护。反应产物用截留分子量为3500Da的透析袋在蒸馏水中透析提纯3天,最后冷冻干燥得到mPEG-SS-Lys(Cbz)n-r-His(Bzl)m共聚物。
将800mg的mPEG-SS-Lys(Cbz)n-r-His(Bzl)m共聚物溶解于8ml三氟乙酸TFA,并在氮气保护下,0℃冰浴、磁力搅拌30min。每隔1h分两次加入4ml33wt%的溴化氢醋酸溶液。反应完成后,将产物旋蒸干燥(55℃),再用DMF溶解,之后用截留分子量为3500Da的透析袋在蒸馏水中透析提纯3天,将透析产物过450nm滤膜后,冷冻干燥。
通过调整不同的投料比,得到四种产物,谱图如图1所示,证明成功合成了mPEG-SS-Lysn-r-Hism随机嵌段共聚物,通过比较化学位移为3.56和1.00-1.99处对应的质子相对积分强度,计算得到每种聚合物中赖氨酸的重复单元数。通过比较化学位移为3.56和7.11-.68及5.03处对应的质子相对积分强度,计算得到每种聚合物中组氨酸的重复单元数。最终确定四种产物分别mPEG-SS-Lys55(产率65%)、mPEG-SS-Lys95(产率66%)、mPEG-SS-Lys55-r-His20(产率71%)和mPEG-SS-Lys95-r-His20(产率69%)。
采用透射显微镜观察形态mPEG-SS-Lys95-r-His20,结果如图2所示,呈球形,大小分布均匀,没有明显的聚集,平均粒径约80nm。进一步地,在动态散射仪上测定纯mPEG-SS-Lys95-r-His20的粒径,结果如图3所示,其平均粒径为208.6nm(PDI:0.301),满足细胞吞噬的要求。
分别在10个5ml的离心管中加入1ml浓度为6×10-6mol/L芘的丙酮溶液,置于60℃的恒温干燥箱中,促进丙酮完全挥发。将2ml从1.95mg/L到500mg/L不同浓度的mPEG-SS-Lys55-r-His20和mPEG-SS-Lys95-r-His20加入到装有芘的离心管中,避光超声5min后,室温避光静置24h,使芘在胶束溶液中达到平衡状态。检测方法为:在发射波长为390nm下,获取240-360nm范围的激发波谱图。激发带宽和发射带宽均设定为4nm。根据芘的激发光谱,I=309时的峰强度被认为是胶束聚合物浓度的函数。CMC值的定义是:荧光强度发生突变时,所对应的胶束聚合物浓度。检测结果如图4和图5所示,结果表明,在聚合物低浓度时,芘的荧光强度变化不大且始终处于低水平。但是当到达某一浓度的时候,芘的荧光强度急速增大,这一急速增大的聚合物浓度范围被认为是胶束形成的浓度范围。经计算,在本实验所检测聚合物浓度范围内,mPEG-SS-Lys55-r-His20形成胶束的CMC值为44.7mg/L,mPEG-SS-Lys95-r-His20形成胶束的CMC值为38.9mg/L。
通过酸碱滴定法测定mPEG-SS-Lysn-r-Hism的缓冲能力(聚合物在酸性溶液中质子化的能力),并以聚乙烯亚胺PEI作为阳性对照,NaCl作为阴性对照。称取6mg各化学物质,分别溶于30mlNaCl(150mM)溶液中配置成0.2mg/ml溶液。然后用0.1M的NaOH溶液将上述溶液的pH调为10.0。随后,用0.1M的HCl溶液一每次5μl的量滴加到上述溶液中,并用pH计测定每次滴加后的pH值。以滴加HCl的量作横坐标,以pH值作纵坐标绘,如图6所示。缓冲能力可作为评价聚合物在细胞的内涵体或溶酶体中是否能保护基因不被内涵体酶或溶酶体酶降解及扩散到细胞质的能力,而这两点是基因有效递送的关键点。如图6所示,PEI因为具有丰富的伯氨基、仲氨基和叔氨基而表现出很强的缓冲能力。在pH为5-6时,mPEG-SS-Lysn-r-His20比mPEG-SS-Lysn的平台期明显,并且曲线明显右移,这表明组氨酸组分的加入,提高了聚合物的缓冲能力,mPEG-SS-Lysn-r-His20的缓冲能力比mPEG-SS-Lysn强。而mPEG-SS-Lysn和mPEG-SS-Lysn-r-His20,其各自缓冲能力曲线近乎重合,从侧面表明缓冲能力和分子量没有直接关系。另外,与NaCl相比,4种mPEG-SS-Lysn-r-Hism聚合物的缓冲能力曲线均整体右移,说明赖氨酸也有部分缓冲能力,但是相当微弱。
实施例2
mPEG-SS-Lysn-r-Hism/pDNA复合物的制备及表征
将mPEG-SS-Lysn-r-His20溶于DMF并透析冻干,取其新鲜冻干样制备复合物。取一定量的mPEG-SS-Lysn-r-Hism或PEI溶于150mM的NaCl溶液(220nm滤膜过滤)中,用220nm滤膜过滤除菌,制备成1mg/ml的溶液,并按照不同的质量比(0、0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5和2),与pDNA混合,轻微涡旋10s后,置于37℃恒温箱30min,以形成稳定的共聚物/基因复合物。
基因递送系统对基因的复合能力是其作为基因载体的一个首要条件。本实验通过凝胶电泳实验观察mPEG-SS-Lysn-r-Hism对pDNA的复合能力。取上述复合物样品,其中,pDNA为0.5μg/样。30min后,在每个样品中加入上样缓冲液,再将复合物按质量比顺序加入混有溴化乙锭的1.0%的琼脂糖凝胶中,并在100V电压下进行凝胶电泳实验,40min(pDNA)或15min(siRNA)后,取出凝胶在凝胶成像仪上通过紫外照射显像,结果如图7所示。在mPEG-SS-Lysn-r-Hism共聚物与pDNA复合时,都表现出良好的复合能力。其中,mPEG-SS-Lys55(A)和mPEG-SS-Lys55-r-His20(C)在质量比为1:1时,可与pDNA有效复合;mPEG-SS-Lys95(B)和mPEG-SS-Lys95-r-His(D)在质量比为0.75:1时,可与pDNA有效复合。
在基因递送过程中,复合体会遭遇核酸酶的降解作用,因此,有必要评价基因递送载体是否能保护基因不被降解。制备好mPEG-SS-Lysn-r-His20/pDNA复合物并在37℃孵育30min后,加入0.5μl的DNaseI(1U/μl)在37℃下共同孵育10min,然后加入1μl的EDTA(25mM)在65℃下共同孵育10min终止DNaseI反应活性,之后同普通琼脂糖凝胶电泳,结果如图8所示。纯pDNA(0E)因被DNaseI完全降解而没有条带踪迹可寻。在质量比为1:1到4:1时,对应的上样孔中(1C对应1CE,以此类推)pDNA条带踪迹可见,并且基本一致。这是由于mPEG-SS-Lysn-r-His20/pDNA可有效复合,因而可以得到结果:添加DNaseI并不能降解mPEG-SS-Lysn-r-His20/pDNA复合物中的pDNA。mPEG-SS-Lysn-r-His20在不同的质量比下均可以有效保护pDNA不受核酸酶降解,确实有提供很好的基因稳定作用。
取上述复合物样品,其中,pDNA为2μg/样,用1ml氯化钠(150mM)稀释混匀,用动态光散射仪测定粒径与电位,结果如图9和图10所示。复合物的粒径和电位是影响细胞吞噬的重要理化参数。当复合物的共聚物和pDNA的质量比大于1:1时,各复合物平均水合粒径趋于稳定。mPEG-SS-Lys55/pDNA、mPEG-SS-Lys95/pDNA、mPEG-SS-Lys55-r-His20/pDNA和mPEG-SS-Lys95-r-His20/pDNA的在不同质量比时,最小平均水合粒径分别为:143.3±29.6nm(w/w=8:1)、195.3±24.2nm(w/w=4:1)、177.0±18.5nm(w/w=1:1)和157.9±31.0nm(w/w=2:1)。图10为对应于图9中各复合物样本的表面电荷。当质量比逐渐增加时,复合物表面电位相应的增加。当质量比大于2:1时,表面电位均大于0,复合物带正电,能与带负电的细胞膜发生静电吸附作用而促进细胞吞噬。在最大质量比时,各复合物的表面电荷均低于25mV,在合理的复合体表面电荷量范围内,不会因电荷过多而引起细胞毒性。
此外,在测定质量比为2:1的复合物的粒径后,加入GSH,使其终浓度为10mM,在0.5h、1h、2h、4h和8h测定其粒径,并以不添加GSH的复合物做粒径稳定性对比,结果如图11所示。双硫键(-S-S-)是一种还原敏感性的化学键,利用细胞内外谷胱甘肽(GSH)的高浓度差,可智能地脱去mPEG保护层。本实验在细胞外水平,通过复合物粒径变化来评价mPEG-SS-Lys95-r-His20的还原敏感性。如图11所示,随着实验时间的延长,暴露于10mMGSH微环境下的mPEG-SS-Lys95-r-His20/pDNA复合物粒径变化非常明显。从0.0h的151.4nm增大到8.0h的870.0nm,并且出现多个分裂峰,表明mPEG保护层被脱去,导致内部带正电荷的复合粒子聚集。相对地,单纯mPEG-SS-Lys95-r-His20/pDNA复合物在8.0h的时间点时,平均水合粒径为154.95nm,与0.0h变化不大。
实施例3
mPEG-SS-Lysn-r-Hism/siRNA复合物的制备及表征
将mPEG-SS-Lysn-r-His20溶于DMF并透析冻干,取其新鲜冻干样制备复合物。取一定量的mPEG-SS-Lysn-r-Hism或PEI溶于150mM的NaCl溶液(220nm滤膜过滤)中,用220nm滤膜过滤除菌,制备成1mg/ml的溶液,并按照不同的质量比(0、0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.5和2),与siRNA混合,轻微涡旋10s后,置于37℃恒温箱30min,以形成稳定的共聚物/基因复合物。
采用实施例2相似的方法检测复合物的复合能力,结果如图12所示,表明mPEG-SS-Lysn-r-His20对siRNA具有较佳的复合能力,如分别在质量比为0.75:1和0.5:1时,mPEG-SS-Lys55-r-His20和mPEG-SS-Lys95-r-His20能与siRNA有效复合。mPEG-SS-Lysn-r-His20对siRNA的稳定性的作用不仅是静电吸附,还有疏水作用。
实施例4
细胞毒性实验
将人胚胎肾上皮细胞(293T细胞)、人肝癌细胞HepG2细胞和MSCs(大鼠骨髓基质干细胞)分别按5×103个/孔的密度接种于96孔板,培养液(293T细胞、HepG2细胞:含10%胎牛血清和1%PS双抗的高糖DMEM培养基;MSCs:含10%胎牛血清和1%PS双抗的低糖DMEM培养基)体积为100μl,置于37℃、5%CO2的培养箱培养。24h后,细胞贴壁,吸弃旧培养基,沿孔壁缓慢加入200μl含有不同浓度mPEG-SS-Lysn-r-Hism和PEI的纯培养基,继续培养24h。实验组mPEG-SS-Lysn-r-Hism和PEI的浓度为:11、17、26、39、59、88、133和200mg/L。各浓度梯度设计有5个平行样。空白对照组只添加200μl纯DMEM培养基。24h后,每孔中加入20μlMTT(5mg/ml),并继续培养4h,然后,吸弃孔内所有液体,每孔中加入150μlDMSO。将96孔板置于摇床上缓慢摇晃10min。最后,将96孔板置于酶标仪测试。吸光度(OD)设置为570nm。细胞相对存活率的计算公式如下:相对存活率%=(ODsample/ODcontrol)×100%,其中,ODsample和ODcontrol分别为处理组的5个复孔平均值和空白对照组的5个复孔平均值。
实验结果如图13所示,(A)、(B)和(C)分别为293T细胞、HepG2细胞和MSCs的相对存活率,以PEI作阳性对照组聚合物4种mPEG-SS-Lysn-r-Hism聚合物对3种细胞的毒性均比较小,即使在最高浓度(200mg/L)时,细胞存活率均在80%以上。而PEI则在浓度为11mg/L时,细胞存活率已降至80%多,在200mg/L时,3种细胞的存活率均已降至20%左右。由此说明,4种mPEG-SS-Lysn-r-Hism聚合物对这3种细胞的毒性远小于PEI。此外,mPEG-SS-Lys55-r-His20和mPEG-SS-Lys95-r-His20相比于mPEG-SS-Lys55和mPEG-SS-Lys95来说,其细胞毒性整体上更小。
实施例5
体外基因转染
将293T细胞、HepG2细胞和MSCs收获、悬浮后,分别按8×104个/孔、6×104个/孔和5×104个/孔的密度接种于24孔板。待细胞增殖至一定的汇合度时(293T细胞和HepG2细胞:50-60%,MSCs:80-90%),可进行体外转染操作。
制备质量比为1:1到6:1的mPEG-SS-Lysn-r-Hism/pEGFP复合物(按照实施例2方法,基因报告质粒pEGFP(购自Invitrogen)每孔含量为0.5μg),溶剂为100μl纯DMEM(293T细胞和HepG2细胞:高糖DMEM,MSCs:低糖DMEM,之后实验均按此对应选用培养基)。复合物孵育30min后,吸弃孔板内旧有培养基,先沿壁缓慢加入400μl纯DMEM培养基,再均匀点加复合物至对应孔中,轻微左右晃匀后置于培养箱,培养4h。然后,吸弃含有基因复合物的培养基,并沿壁缓慢加入500μl全培养基(含10%胎牛血清和1%PS双抗的DMEM培养基),继续于培养箱内培养44h。
BCA蛋白测试方法:吸弃旧有培养基,使用PBS冲洗一遍,加入200μl细胞裂解液,于4℃裂解30min。然后取100μl细胞裂解液加入全黑96孔板,用荧光酶标仪在激发波长为485nm,发射波长为538nm条件下,检测GFP蛋白的荧光强度。剩余的100μl细胞裂解液离心(2000rpm,10min)沉淀细胞大碎片后,使用BCA试剂盒通过测定BCA标准曲线来计算总蛋白浓度。最后荧光强度以荧光强度每毫克蛋白(FluorescentIntensity(A.U.)/mgofprotein)来表达。各复合物质量比设计有3个平行样。
流式细胞仪(FCM)法:收集细胞后,先用500μl流式缓冲液(含2%FBS和2mMEDTA的PBS)悬浮细胞,离心后(2000rpm,5min)吸弃上清,再用流式固定液(含2%多聚甲醛的PBS)固定,送检前避光保存于4℃冰箱。将流式细胞仪检测到表达GFP蛋白的细胞的百分比作为细胞转染效率。各复合物按BCA蛋白测试方法选取最佳转染效率的质量比进行本实验,各实验组设计有3个平行样。
两种方法均以未处理的细胞作为阴性对照,以PEI(w/w=1.3:1)作为阳性对照。
图14(A)、(B)和(C)为通过BCA蛋白浓度测试方法检测的不同质量比的mPEG-SS-Lysn-r-Hism/pEGFP分别在293T细胞、HepG2细胞和MSCs中的转染效率变化。分析得到,在不同质量比时,各mPEG-SS-Lysn-r-Hism/pEGFP的转染效率呈现一定的变化趋势,即存在一个最佳转染效率的质量比。可以归结为:mPEG-SS-Lys55/pEGFP(w/w=4:1)、mPEG-SS-Lys95/pEGFP(w/w=5:1)、mPEG-SS-Lys55-r-His20/pEGFP(w/w=3:1)和mPEG-SS-Lys95-r-His20/pEGFP(w/w=2:1)时,在3种细胞中达到最佳转染效率。另外,从整体来看,在各mPEG-SS-Lysn-r-Hism/pEGFP处于最佳转染质量比时,在3种细胞中,mPEG-SS-Lys55-r-His20/pEGFP和mPEG-SS-Lys95-r-His20/pEGFP组的转染效率明显高于mPEG-SS-Lys55/pEGFP和mPEG-SS-Lys95/pEGFP组,并且其最佳质量比较小。在3种细胞中,转染效率最佳的是mPEG-SS-Lys95-r-His20/pEGFP组,并且其在各质量比下整体转染效率也最佳。
图15为用FCM法测得的mPEG-SS-Lys55/pDNA(w/w=4:1)、mPEG-SS-Lys95/pDNA(w/w=5:1)、mPEG-SS-Lys55-r-His20/pDNA(w/w=3:1)、mPEG-SS-Lys95-r-His20/pDNA(w/w=2:1)和PEI/pDNA(w/w=1.3:1)在各自最佳转染质量比时,转染常规的293T、HepG2和MSC细胞44h后的转染效率,及其两两组之间的统计学比较。从图中可以看出,在293T细胞中,mPEG-SS-Lys95-r-His20/pEGFP复合物和PEI/pEGFP复合物的转染效率并无显著性差异。而在HepG2细胞中,mPEG-SS-Lys95-r-His20/pEGFP复合物转染效率比PEI/pEGFP复合物仍差一些,但是其显著性差异与BCA法相比,更缩小了一些。最后,在MSCs中,mPEG-SS-Lys95-r-His20/pEGFP复合物的转染效率仍保持领先状态。并且,可以看到另外三种mPEG-SS-Lysn-r-Hism/pEGFP复合物的转染效率与PEI/pEGFP复合相比,其显著性差异均变小。
综上,mPEG-SS-Lysn-r-His20/pEGFP复合物比mPEG-SS-Lysn/pEGFP复合物的转染效率要高。另外,在公认的难以转染的MSCs中,mPEG-SS-Lysn-r-His20/pEGFP复合物具有较高的转染效率,甚至高于阳性对照组的PEI/pEGFP复合物。
为了模拟血液环境,在体外细胞转染时,还进行了含血清细胞转染实验。以293T细胞和HepG2细胞为模型细胞,各mPEG-SS-Lysn-r-Hism/pEGFP复合物按BCA蛋白浓度测试方法选取最佳转染效率的质量比进行本实验,各实验组设计有3个平行样。在添加复合物作用的44h期间,不再选用纯DMEM培养基,而选用含10%血清的全培养基。最后用BCA蛋白测试方法评价血清对复合物细胞转染的影响。其余步骤不改变。以PEI(w/w=1.3:1)作为阳性对照。结果如图16所示。mPEG-SS-Lys55/pEGFP(w/w=4:1)、mPEG-SS-Lys95/pEGFP(w/w=5:1)、mPEG-SS-Lys55-r-His20/pEGFP(w/w=3:1)、mPEG-SS-Lys95-r-His20/pEGFP(w/w=2:1)和PEI/pDNA(w/w=1.3:1)在各自最佳转染质量比时,转染细胞44h后,5种基因递送系统的转染效率均有所降低。但是,PEI/pEGFP组的转染效率下降最为明显,在293T细胞和HepG2细胞中分别相差达到3.8倍和3.5倍。而在实验组中,mPEG-SS-Lys55/pEGFP、mPEG-SS-Lys95/pEGFP、mPEG-SS-Lys55-r-His20/pEGFP和mPEG-SS-Lys95-r-His20/pEGFP在293T细胞和HepG2细胞中,转染效率相差倍数分别为1.3、1.4、1.1、1.1和1.3、1.3、1.2、1.1。
实施例6
细胞吞噬效率
首先按照试剂盒的操作流程对pDNA用红色荧光染料作Cy3标记,具体操作方法如下:
1.取10μlpEGFP(1.6μg/μl)、8μlLabelITTrackerTMRegent、16μl10×LabelingBufferA和126μlSterileH2O依次加入1.5ml离心管中,用移液枪吹匀后置于37℃培养箱孵育1h。取出离心管,快速离心(13krpm,30s)后,继续于37℃培养箱孵育1h。
2.依次加入40μlDEPC水、20μlNaCl(过220nm滤膜,5M)和400μl100%冰乙醇,封口膜封口后,避光保存于-20℃2h。
3.高速低温(230krpm,4℃)离心10min,使标记好的质粒成一小球。用移液枪小心移走所有上清,不可破坏小球。加入0.5ml70%乙醇清洗小球一次,再次高速低温离心,再次用移液枪小心移走所有上清,待乙醇挥发完全,用32μl无菌H2O重悬标记好的质粒。
4.用核酸浓度测量仪检测标记好的质粒的浓度(468.8ng/μl)。
CLSM法:
收获HepG2细胞后,以2×105个/孔的密度接种于6孔板内的盖玻片上,待细胞贴壁,增殖至汇合度为60-70%时,制备各mPEG-SS-Lysn-r-Hism/pEGFP复合物最佳转染效率时质量比的复合物(按照实施例2方法,Cy3-pEGFP每孔含量为2μg),孵育30min后,吸弃孔板内旧有培养基,先沿壁缓慢加入1.5ml纯DMEM培养基,再均匀点加复合物至对应孔中,轻微左右晃匀后置于培养箱,培养4h。然后,在避光条件下进行以下操作:吸弃旧有培养基,用PBS轻轻冲洗2遍;用4%多聚甲醛室温静置固定10min,再用PBS冲洗2遍;滴加2滴DAPI细胞核荧光染液(能湿润细胞即可),室温静置固定10min,用PBS冲洗3遍。取出盖玻片晾干后,用甘油封片,最后用指甲油固定盖玻片,送检前于4℃避光暂时保存。
检测结果表明,在PEI/pDNA组中,进入细胞核内的pDNA最多。mPEG-SS-Lys55-r-His20/pDNA和mPEG-SS-Lys95-r-His20/pDNA组中,进入细胞核的pDNA也较多,并且未进入的细胞核的pDNA也主要集中于核周区域。mPEG-SS-Lys55/pDNA和mPEG-SS-Lys95/pDNA组中,pDNA更多地停留在细胞质内。总体来说,mPEG-SS-Lys55/pDNA和mPEG-SS-Lys95/pDNA组细胞摄取的基因复合物比mPEG-SS-Lys55-r-His20/pDNA和mPEG-SS-Lys95-r-His20/pDNA组少。
FCM法:
收获HepG2细胞后,以2×105个/孔的密度接种于6孔板内,待细胞贴壁,增殖至汇合度为60-70%时,制备各mPEG-SS-Lysn-r-Hism/pEGFP复合物最佳转染效率时质量比的复合物(按照实施例2方法,Cy3-pEGFP每孔含量为2μg),孵育30min后,吸弃孔板内旧有培养基,先沿壁缓慢加入1.5ml纯DMEM培养基,再均匀点加复合物至对应孔中,轻微左右晃匀后置于培养箱,培养4h。然后按照实施例5中流式细胞仪的制样方法制样,全程应避光,并尽快送检。各实验组设计有3个平行样。
由图17可以看到,PEI/pDNA复合物的细胞吞噬效率最高,但是,mPEG-SS-Lys95-r-His20/pDNA复合物和PEI/pDNA复合物的细胞吞噬效率没有显著性差异。另外,结合HepG2细胞的转染效率(FCM)和细胞吞噬效率(FCM),可以发现,各基因复合体的细胞吞噬效率高于转染效率。mPEG-SS-Lys55/pDNA(19.94%±2.0,36.2%±3.2,1.8倍),mPEG-SS-Lys95/pDNA(13.4%±2.1,35.4%±4.1,2.6倍),mPEG-SS-Lys55-r-His20/pDNA(28.8%±2.0,41.3%±2.1,1.4倍)、mPEG-SS-Lys95-r-His20/pDNA(32.4%±1.5,48.1%±3.0,1.4倍)和PEI/pDNA(36.2%±2.2,51.9%±3.8,1.4倍)。
实施例7
细胞吞噬途径
本实验通过采用通道抑制剂抑制各细胞吞噬途径的方法,检测mPEG-SS-Lysn-r-Hism进入细胞的途径。所选用的抑制剂和配制工作浓度如下:
网格蛋白途径:氯化铵(50mM)、氯丙嗪(10μg/ml);小窝蛋白途径:M-β-CD(10mM)、染料木素(200μg/ml);巨胞饮途径:渥曼青霉素(100μM);
ATP合成抑制剂:叠氮钠(10mM);肌动蛋白聚合抑制剂:秋水仙素(40μg/ml)。
首先使用FITC标记mPEG-SS-Lys95和mPEG-SS-Lys95-r-His20,具体操作方法如下:将31.2mgmPEG-SS-Lys95或mPEG-SS-Lys95-r-His20、32mgFITC和400μl三乙胺混合于3.2ml无水DMF中室温下,避光磁力搅拌48h。然后用截留分子量为3500的透析袋避光透析2d去除过量的FITC,然后冻干,避光保存。
收获293T细胞和HepG2细胞后,以2×104个/孔的密度接种于96孔板内,待细胞贴壁,增殖至汇合度为60-70%时,吸弃旧有培养液,沿壁缓慢加入上述溶解于纯DMEM的抑制剂(200μl),置于培养箱预处理30min,然后每孔加入5μg的FITC-mPEG-SS-Lys95或FITC-mPEG-SS-Lys95-r-His20,并继续置于培养箱孵育4h。
之后,吸弃旧有培养基,用PBS清洗细胞3次,再用0.4%的台盼蓝(15μl,2min)淬灭细胞外的FITC,并用PBS清洗2次,最后用0.4ml细胞裂解液裂解细胞30min(4℃)。每孔取0.2ml裂解液加入全黑96孔板,并用荧光酶标仪在在激发波长为485nm,发射波长为538nm条件下,检测FITC的荧光强度。整个涉及FITC的实验操作均在严格避光的条件下完成。各实验组设计有5个平行样。本实验以未用通道抑制剂作用下,细胞吞噬FITC-mPEG-SS-Lys95或FITC-mPEG-SS-Lys95-r-His20作阴性对照组。
由图18可知,与小窝蛋白抑制剂(M-β-CD和染料木素)和巨胞饮抑制剂(渥曼青霉素)共孵育后,FITC-mPEG-SS-Lys95的吞噬效率下降与对照组相比有明显的显著性差异,而与网格蛋白抑制剂(氯化铵和氯丙嗪)共孵育后,吞噬效率下降显著性差异较小,说明在293T细胞中,FITC-mPEG-SS-Lys95主要是通过小窝蛋白途径和巨胞饮途径进入细胞的。在293T细胞中,FITC-mPEG-SS-Lys95-r-His20也主要是通过小窝蛋白途径和巨胞饮途径进入细胞的。在HepG2细胞中,FITC-mPEG-SS-Lys95主要是通过小窝蛋白途径和巨胞饮途径进入细胞的;FITC-mPEG-SS-Lys95-r-His20也主要是通过网格蛋白途径和巨胞饮途径进入细胞的。另外,与ATP合成抑制剂(叠氮钠)和肌动蛋白抑制剂(秋水仙素)共孵育后,在2种细胞中,FITC-mPEG-SS-Lys95和FITC-mPEG-SS-Lys95-r-His20的吞噬效率均明显下降,但没有完全被抑制。推测是体外细胞培养时,培养基中的葡萄糖等成分能继续供给能量。
实施例8
细胞生长抑制试验
通过以上利用pEGFP对mPEG-SS-Lysn-r-Hism基因递送载体的各种细胞学行为评价,本实施例继续检测mPEG-SS-Lysn-r-Hism复合siRNA后,在细胞水平上对细胞的生长抑制作用以及通过westernblotting实验,在蛋白质水平上检测其作用。空白对照组为未添加试剂组。阴性对照组选取PEI/NC-siRNA(w/w=1.3:1)复合物处理组。
本实施例选取的可沉默人血管内皮生长因子(VEGF)的siRNA序列及阴性对照序列均由上海吉玛制药技术有限公司合成。
VEGF-siRNA:
正义链:5’-GGAGUACCCUGAUGAGAUCdTdT-3’(SEQIDNO.:1)
反义链:5’-GAUCUCAUCAGGGUACUCCdTdT-3’(SEQIDNO.:2)
NC-siRNA:(阴性对照)
正义链:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’(SEQIDNO.:3)
反义链:5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’(SEQIDNO.:4)
具体实验操作为:
收获HepG2细胞后,以6×104个/孔的密度接种于24孔板内,待细胞贴壁,增殖至汇合度为60-70%时,可进行细胞生长抑制实验。首先,参照mPEG-SS-Lysn-r-Hism/pDNA复合物转染实验得到的最佳转染比,固定mPEG-SS-Lysn-r-Hism/siRNA的质量比,以每孔不同siRNA的质量:0.5、1、2.5、5、7.5μg进行试验。按照实施例3的方法,在100μl纯DMEM培养基中制备mPEG-SS-Lysn-r-His20/siRNA复合物。孵育30min后,吸弃24孔板内旧有培养液,沿壁缓慢加入400μl纯DMEM培养基,然后再均匀点加各复合物,左右轻轻晃匀后,置于培养箱继续培养4h。
然后,吸弃含有基因复合物的培养基,并沿壁缓慢加入500μl全培养基,继续于培养箱内培养44h。之后用MTT法检测细胞生长抑制作用。每孔加50μlMTT,置于培养箱培养4h后,吸弃旧有培养基,加入1mlDMSO,并在摇床上避光缓慢摇10min。每孔取50 l加入96孔板,再用DMSO稀释2倍后用酶标仪检测其在490nm处的吸光度。用相对存活率表示细胞生长抑制作用。
相对存活率%=(ODsample/ODcontrol)×100%
其中,ODsample和ODcontrol分别为处理组的3个复孔平均值和空白对照组的3个复孔平均值。
从图19中可以看出,当VEGF-siRNA的浓度高于2mg/L时,mPEG-SS-Lysn-r-His20/VEGF-siRNA即开始能显著抑制HepG2细胞生长。同时,mPEG-SS-Lys95-r-His20/VEGF-siRNA复合物对HepG2细胞的生长抑制作用比mPEG-SS-Lys55-r-His20/VEGF-siRNA复合物强。
对于蛋白质水平的评价,本实验采用针对VEGF的westernblotting实验,具体实验方案如下:
选取上述细胞生长抑制实验中的10mg/L的siRNA的实验组及空白对照组和阴性对照组作westernblotting实验。
1.细胞中蛋白上清液的制备和浓度测定
A.收集细胞;B.融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,使用前数分钟内加苯甲基磺酰氟(PMSF);C.按照细胞压积加50μl裂解液;D.在振荡器上充分震荡数次;E.充分裂解细胞后,离心(12000rpm,5min),取上清;F.使用BCA试剂盒测定BSA标准曲线后,测定本实验样品的总蛋白浓度。
2.灌胶
A.用蒸馏水清洗灌胶板,竖直晾干;B.配制12%分离胶10ml,加10μlN,N,N',N'-四甲基二乙胺(TEMED)、100μl10%过硫酸铵混匀后立即灌胶,灌至齿梳下缘2-3mm,用异丙醇封闭液去除气泡并隔绝空气,室温静置45min待胶完全聚合;C.分离胶完全聚合后,去除顶部的蒸馏水,滤纸将水吸干;D.配制5%浓缩胶5ml,加5μlTEMED、50μl10%过硫酸铵(APS),混匀后立即灌胶至顶部,并垂直插入Teflon齿梳,室温静置20min待胶聚合;E.胶完全聚合后拔出梳子,把凝胶置于电泳槽中,加入电泳缓冲液,用电泳缓冲液冲洗去除上样孔中的气泡。
3.电泳
A.取各组蛋白提取液,调整蛋白浓度,与等体积2×上样缓冲液混合,即为上样液;B.将上样液于100℃沸水中煮沸5min,使蛋白变性,然后冰上骤冷,离心(3000rpm,1min);C.每孔加上样液40μg,留一孔加10μl预染的Marker。加满电泳缓冲液,盖槽盖,开电源,先用70V恒压电泳,约30min,当溴酚蓝指示剂进入分离胶后改用90V恒压电泳,当溴酚蓝到达距凝胶下端约0.5cm处时关闭电源,取出胶板。
4.转印蛋白及免疫检测
A.在电泳即将结束前,提前将PVDF膜浸泡在甲醇15s,然后用双蒸水漂洗2min,在转移缓冲液中浸泡5min后开始后续操作;B.在水中取胶,修整后将胶浸泡在转移缓冲液中平衡15min;C.按黑面(负极)、海绵、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、海绵、红面(正极)的顺序制备转膜“三明治”,在每层铺好后,先赶走气泡再铺另一层;D.接通正负极,按膜向正极的方向,将转移盒放到电转仪中,并加入转膜缓冲液;E.把电转仪放在冰水中,200mA恒流转膜70min;F.转膜结束后,迅速取出PVDF膜,放到5%BSA中,室温封闭2h;G.取出膜,在摇床上用TBST洗膜3次,每次5min;H.孵育袋中加入用封闭液稀释的VEGF-A(Boster1:200)和GAPDH(Boster1:2000),4℃孵育过夜;I.TBST洗膜3次,每次5min,辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗(Jackson1:2000)和辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠二抗(Jackson1:2000),室温孵育2h;J.TBST洗膜5次,每次15min。将PVDF膜在化学发光检测试剂(试剂A:试剂B=1:1)反应2min,取出膜后甩去多余的液体,保鲜膜包好PVDF膜,在暗室中用X胶片感光、显影、定影。
由图20可知,mPEG-SS-Lys95-r-His20/VEGF-siRNA组表现出最明显的抑制VEGF蛋白质合成的作用,mPEG-SS-Lys55-r-His20/VEGF-siRNA组也有较为明显的抑制VEGF蛋白质合成的作用。而作为阴性对照组没有表现出VEGF蛋白质合成抑制作用。
在蛋白质分子水平上,VEGF的表达也远远低于空白对照组和阴性RNA序列对照组,说明VEGF-siRNA在细胞内有效地进行了转录后调节。这两个实验体现了mPEG-SS-Lysn-r-His20在体外能成功地将治疗性的siRNA递送到细胞。
综上可知,4种mPEG-SS-Lysn-r-Hism均具有良好的生物相容性,对细胞的毒副作用较小,并且均能有效转染上皮细胞、肿瘤细胞和骨髓基质干细胞,尤其是骨髓基质干细胞中的有效转染为干细胞治疗带来极大的优势。细胞对mPEG-SS-Lysn-r-Hism基因复合物也有较好的吞噬效率,从吞噬通道结果来看,进步表明mPEG-SS-Lys95-r-His20是一个性能上比较优越的基因递送载体。mPEG-SS-Lysn-r-His20/VEGF-siRNA复合体在体外能有效的抑制HepG2细胞的生长,并且能有效地在蛋白质水平上下调VEGF的表达。
实施例9体内实验
9.1建立肿瘤模型
本实验使用的BALB/c裸鼠(4–5周龄,雄)均购自上海斯莱克实验动物有限责任公司,均饲养在SPF级动物房内。
收集活力较强的7×106个HepG2细胞后,用100μlPBS悬浮,并尽快用5%的水合氯醛(0.6ml/100g)麻醉裸鼠后,接种于左后肢皮下。7-10d后,肿瘤可生长至50mm3。
9.2体内分布实验
首先用BODIPY荧光染料标记mPEG-SS-Lys95-r-His20基因递送载体:5mgBODIPY溶于0.5ml无水DMSO中备用。整个染色过程严格避光。向100μl溶于碳酸氢钠(100mM)的材料液(1mg)中缓慢滴加BODIPY(按摩尔比为10:1),室温磁力搅拌反应1h。加入0.1ml羟胺溶液(1.5M),室温反应1h终止反应,PBS补至0.5ml(使DMSO含量<10%)。将反应液加入超滤管内离心(14000g,20min)弃去外管中的液体,将内管倒置在新的外管中,离心(1000g,2min),收取溶液(约50μl),PBS补至0.5ml,再次重复此操作。最终获得约50μl标记好的材料,根据理论超滤效率为90%,所得到的50μl溶液中应含有0.9mg材料,浓度为18μg/μl。
提前一夜将HepG2荷瘤裸鼠禁饮禁食。用5%的水合氯醛(0.6ml/100g)麻醉裸鼠后,尾静脉注射150μl溶于PBS的BODIPY-mPEG-SS-Lys95-r-His20基因递送载体(200μg/鼠)然后分别在注射后30min,1h,2h,4h用小动物活体成像仪照相(激发波长589nm,发射波长617nm)。然后用颈椎脱臼法处死裸鼠后,快速取出肝、脾、肺、肾和肿瘤,在PBS中漂洗去表面血液后,在相同条件下,再次用小动物活体成像仪照相。照片均做伪彩处理,同时用未注射基因载体的裸鼠作背景色扣除。内脏器官和肿瘤的荧光强度用Maestroversion2.10.0软件检测。
图21所示为伪彩处理后BODIPY-mPEG-SS-Lys95-r-His20在不同时间点(30min,1h,2h,4h)时,在裸鼠体内的分布。BODIPY-mPEG-SS-Lys95-r-His20基因递送载体在尾静脉注射30min后,即可看到从肿瘤边缘缓慢进入到肿瘤内。并且随着时间的延长,肿瘤内有明显的富集现象。
图22所示为尾静脉注射BODIPY-mPEG-SS-Lys95-r-His204h后,取出的内脏和肿瘤的荧光分布和荧光强度定量分析结果,从左向右依次为:肝、脾、肾、肺、肿瘤。肝脏、肾脏和肿瘤部位有明显的荧光分布,其中肿瘤部位密度最强,肾脏次之,肝脏相对较少。脾和肺部没有明显的荧光分布。以上现象说明BODIPY-mPEG-SS-Lys95-r-His20可以有效地经血循环进入肿瘤部位。
9.3体内转染实验
mPEG-SS-Lys95-r-His20/pEGFP基因复合物(w/w=2:1)通过尾静脉注射到HepG2荷瘤裸鼠体内。7d后,将裸鼠用5%的水合氯醛(0.6ml/100g)麻醉后,通过心脏灌流进行全身固定。
心脏灌流方法为:用固定针固定裸鼠四肢,小心打开胸腔,并暴露腹腔肝脾。剪破右心耳,将输液针插入左心室,不得刺破房室间隔,并用血管钳固定针头。快速推注40mlPBS,可见肝脾变白,表示针头正确插入左心室。再缓慢推注约250ml4%多聚甲醛,可见裸鼠逐渐全身肌肉骨骼关节僵硬,尾部有抽搐行为,说明灌注完全。取出,肝、脾、肺、肾和肿瘤,用4%多聚甲醛继续固定24h,然后换用10%、20%、30%的蔗糖溶液依次进行组织沉底,各约24h。用OCT包埋剂包埋各组织块,冷冻切片机切片,切片厚度为10μm,用处理过的载玻片黏贴切片。最后用CLSM观察样本。
本实验用报告质粒pEGFP来确认mPEG-SS-Lys95-r-His20是否能作为使基因在体内有一个较为长期的表达,图23示出mPEG-SS-Lys95-r-His20/pEGFP基因复合物在HepG2荷瘤裸鼠体内转染7d后的CLSM图像。列1为荧光场、列2为明场、列3为合并图。从图中可以看到,肝脏和肾脏中,GFP表达量较高;脾脏和肺部,GFP表达量较低;在肿瘤部位,GFP表达量也相对较高。大部分肿瘤细胞表达GFP蛋白,说明mPEG-SS-Lys95-r-His20/pEGFP复合物在生物应用方向是很有潜力的基因载体。同时,基因在体内有效地表达说明mPEG-SS-Lys95-r-His20/pEGFP复合物在血循环中具有长循环能力。
9.4活体肿瘤生长抑制实验
在超净台内制备以下基因复合物:mPEG-SS-Lys55-r-His20/VEGF-siRNA(w/w=3:1)、mPEG-SS-Lys95-r-His20/VEGF-siRNA(w/w=2:1)mPEG-SS-Lys95-r-His20/VEGF-siRNA。
15只裸鼠分为3组:PBS组、mPEG-SS-Lys55-r-His20/siRNA组和mPEG-SS-Lys95-r-His20/siRNA。
肿瘤生长抑制实验方案为:每只裸鼠每隔一天注射PBS(150μl)或基因复合物(20μgsiRNA,150μl),注射10次。每次注射前,对裸鼠进行拍照、称体重、测量肿瘤体积。第一次注射药物的时间记为第0天,在第22天,裸鼠在颈椎脱臼处死后,取出肿瘤,称重,拍照并马上做组织westernblotting实验。
组织westernblotting需要先将组织匀浆,其具体操作步骤如下:
A.将肿瘤剪成细小碎片。B.融解RIPA裂解液,混匀。取适当量的裂解液,使用前数分钟内加PMSF。C.按照没20mg肿瘤内加入200 l裂解液的比例加入裂解液。
D.在匀浆机上研磨,直至裂解液中肿瘤块消失。E.充分裂解肿瘤细胞后,离心(12000rpm,5min),取上清。
其后步骤同实施例8。
图24中(A)所示为HepG2荷瘤裸鼠在接受不同处理后的肿瘤体积变化曲线。至注射基因载体22天后,PBS组的肿瘤体积为667.2±15.0mm3,mPEG-SS-Lys55-r-His20组和mPEG-SS-Lys95-r-His20组分别为312.3±18.5mm3、211.7±21.1mm3。另外,从图中可以看到与PBS对照组相比,mPEG-SS-Lys55-r-His20组和mPEG-SS-Lys95-r-His20组,肿瘤体积增长速度明显较小,具有明显的抑制肿瘤生长的作用。其中,mPEG-SS-Lys95-r-His20组肿瘤体积增长速度最小。
图24中(B)所示为HepG2荷瘤裸鼠在接受不同处理后第22天时的肿瘤质量。PBS组的肿瘤质量为2216.7±105.0mg,mPEG-SS-Lys55-r-His20组和mPEG-SS-Lys95-r-His20组分别为1090.0±90.0mg、616.7±97.1mg。PBS组的肿瘤质量明显的高于mPEG-SS-Lysn-r-His20组。与肿瘤体积检测结果相一致,mPEG-SS-Lys55-r-His20组和mPEG-SS-Lys95-r-His20组具有明显的抑制肿瘤生长的作用。
图24中(C)所示为HepG2荷瘤裸鼠在接受不同处理后第22天剥离出肿瘤后的图片,分别为具有代表性的PBS组、mPEG-SS-Lys55-r-His20组和mPEG-SS-Lys95-r-His20组的肿瘤。图中除了可以看到明显的体积差异,还可以看到PBS组肿瘤色泽最鲜红、小血管明显,mPEG-SS-Lys55-r-His20组次之,mPEG-SS-Lys95-r-His20组肿瘤表面只有淡淡的粉红色,无明显可见的血管。因此,可以从宏观的层面认为mPEG-SS-Lys95-r-His20组的VEGF蛋白质合成抑制效果最好,从而有效抑制肿瘤细胞的生长和新生微小血管的形成,使整个肿瘤增大受限。
图24中(D)为对应于24中(C)中肿瘤的westernblotting实验分析。可以看到mPEG-SS-Lys95-r-His20组表现出最明显的VEGF蛋白质合成抑制作用,mPEG-SS-Lys55-r-His20组也有较为明显的VEGF蛋白质合成抑制作用。本发明的复合体不仅能在体外有效沉默VEGF蛋白质表达,也能在体内有效地实现基因沉默效应。
图24中(E)所示为注射基因复合体期间,HepG2荷瘤裸鼠的体重变化曲线。从图中可以发现,整个实验期间,裸鼠的体重均呈缓慢增长状态,符合生物体一般的生长规律。另外,所有裸鼠存活至实验截止点。可以认为mPEG-SS-Lysn-r-His20在生物体内没有近期可见的生物毒性,是一种相对较为安全的生物材料。
综上所述,本发明构建的还原敏感性和pH敏感性的mPEG-SS-Lysn-r-Hism基因递送载体在保持低细胞生物毒性的同时,具有良好的基因递送能力,最重要的是,在公认地难以转染的原始干细胞中,mPEG-SS-Lysn-r-Hism具有相对较高的基因转染能力,因此,mPEG-SS-Lysn-r-Hism会是未来生物体应用基因治疗时的一种可靠而安全的非病毒基因递送载体。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种共聚物,其特征在于,所述共聚物包括聚乙二醇核芯以及与所述聚乙二醇核芯共价连接的(a)聚赖氨酸嵌段、(b)聚赖氨酸嵌段和聚组氨酸嵌段;或(c)由赖氨酸单体、组氨酸单体和任选的氨基酸单体聚合形成的无规或交替聚合物区段。
2.如权利要求1所述的共聚物,所述共聚物的通式为式I:
C-(Z)x(I)
其中,C为聚乙二醇核芯;
Z为A-B或W,其中A为聚赖氨酸嵌段;B为聚组氨酸嵌段;
或者W为由赖氨酸单体、组氨酸单体和任选的氨基酸单体聚合形成的无规或交替聚合物区段;
x为≥1的正整数。
3.如权利要求1或2所述的共聚物,其特征在于,所述共聚物具有以下一个或多个特征:
(1)所述聚乙二醇核芯的分子量为1000-5000g/mol;
(2)所述聚赖氨酸嵌段的重复单元数为40-150,较佳地为45-120;
(3)所述聚组氨酸嵌段的重复单元数为0-50,较佳地为10-30;
(4)所述共聚物的粒径为50-100纳米;
(5)所述共聚物的平均水合粒径为190-210纳米,对应的电位在5-20mV;
(6)所述共聚物形成胶束的CMC值为35-50mg/L。
4.如权利要求1-3任一项所述的共聚物的制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(i)mPEG-COOH与胱胺反应生成mPEG-SS-NH2;
(ii)mPEG-SS-NH2和Lys(Cbz)-NCA以及任选的His(Bzl)-NCA发生开环反应,再脱去苄氧羰基保护基得到所述共聚物;
其中,Lys(Cbz)-NCA和His(Bzl)-NCA的结构如下所示:
各式中,R1为R2为
5.如权利要求1所述的共聚物的用途,其特征在于,用于制备基因递送载体。
6.如权利要求5所述的用途,其特征在于,所述基因为pDNA或siRNA。
7.一种复合物,其特征在于,所述复合物包含:
权利要求1-3任一项所述的共聚物;和
核酸。
8.如权利要求7所述的复合物的制备方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(a)将权利要求1-3任一项所述的共聚物溶于NaCl溶液或磷酸缓冲盐溶液中得到共聚物溶液;
(b)将核酸与步骤(a)得到的共聚物溶液混合后得到所述复合物。
9.如权利要求7所述的复合物的用途,其特征在于,用于制备预防和/或治疗肿瘤的药物。
10.一种药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包含:
权利要求7所述的复合物;以及
药学上可接受的赋形剂。
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108384810A (zh) * | 2018-03-20 | 2018-08-10 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种高转染效率低细胞毒性的阳离子基因载体及其制备方法 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102600474A (zh) * | 2012-02-17 | 2012-07-25 | 上海市肿瘤研究所 | 聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸-聚-l-赖氨酸嵌段聚合物在递送药物或基因中的应用 |
CN102816795A (zh) * | 2012-08-28 | 2012-12-12 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种基因载体系统及其制备方法 |
CN103251561A (zh) * | 2013-05-15 | 2013-08-21 | 同济大学 | 一种双敏感可崩解式纳米囊泡药物载体制剂及其制备方法 |
CN103374128A (zh) * | 2012-04-28 | 2013-10-30 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 两亲性三嵌段共聚物、聚合物纳米载体制剂及制备方法 |
-
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Patent Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102600474A (zh) * | 2012-02-17 | 2012-07-25 | 上海市肿瘤研究所 | 聚乙二醇-聚乳酸羟基乙酸-聚-l-赖氨酸嵌段聚合物在递送药物或基因中的应用 |
CN103374128A (zh) * | 2012-04-28 | 2013-10-30 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 两亲性三嵌段共聚物、聚合物纳米载体制剂及制备方法 |
CN102816795A (zh) * | 2012-08-28 | 2012-12-12 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种基因载体系统及其制备方法 |
CN103251561A (zh) * | 2013-05-15 | 2013-08-21 | 同济大学 | 一种双敏感可崩解式纳米囊泡药物载体制剂及其制备方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
CLAUDIA SCHOLZ ET AL.: ""Therapeutic plasmid DNA versus siRNA delivery: Common and different tasks for synthetic carriers"", 《JOURNAL OF CONTROLLED RELEASE》 * |
JONATHAN M. BENNS ET AL.: ""pH-Sensitive Cationic Polymer Gene Delivery Vehicle: N-Ac-poly(L-histidine)-graft-poly(L-lysine) Comb Shaped Polymer"", 《BIOCONJUGATE CHEM.》 * |
SHIRUI MAO ET AL.: ""Chitosan-based formulations for delivery of DNA and siRNA"", 《ADVANCED DRUG DELIVERY REVIEWS》 * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN108384810A (zh) * | 2018-03-20 | 2018-08-10 | 中国科学院长春应用化学研究所 | 一种高转染效率低细胞毒性的阳离子基因载体及其制备方法 |
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Effective date of registration: 20190829 Address after: 200001 Huangpu District, Beijing East Road, No. 356, Applicant after: Shanghai Stomatological Disease Center Address before: 502, No. 26, Lane 75, Wuchuan Road, Yangpu District, Shanghai, 2004 Applicant before: Liu Shangfeng Applicant before: Li Yongyong |
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