CN108653747B - 一种基因与疏水药物共输送的可降解纳米载体及其制法和应用 - Google Patents
一种基因与疏水药物共输送的可降解纳米载体及其制法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种基因与疏水药物共输送的可降解纳米载体及其制法和应用。本发明采用生物相容性良好的小分子量聚乙烯亚胺(LWPEI)为骨架,通过引入交联剂二硫代二丙酸(DTPA)形成二硫键交联的大分子聚乙烯亚胺聚合载体,又通过巯基交换反应引入可降解的巯基‑β‑环糊精来改善聚乙烯亚胺的交联程度;得到的纳米药物载体具有正电荷,通过静电作用搭载基因药物,同时利用化学药物与环糊精的相互作用进行药物包合。并且本发明中所述的纳米共载系统外表面亦可通过静电吸附作用进行负电荷靶向分子的修饰。本发明的纳米载体能有效将疏水药物与基因高效的输送到靶部位协同发挥作用,在肿瘤治疗应用具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物医药类纳米材料制备领域,更具体而言,本发明涉及一种基因与药物共输送的可降解纳米载体及其特定药物联用的抗肿瘤效果。
背景技术
癌症是影响全球发病率和死亡率最主要原因之一。中国每年新增的癌症病患数量已经位居世界前列,且呈现年轻化趋势。目前,临床上恶性肿瘤所采取的主要治疗手段主要还是以外科手术,放射疗法和小分子化疗药物为主,前二者由于肿瘤部位的限制等一些原因,使得化疗药成为运用最为广泛的手段。但由于肿瘤长期暴露在化疗药物的环境下容易对大多数抗癌药物不敏感,产生耐药性,甚至会增加肿瘤干细胞的数量,化疗有效率仍小于15%。加上化疗药物的毒副作用明显,因此单一使用化疗药,疗效并不理想。为了克服癌细胞对化疗药物的耐受,减小用药的毒副作用,基因治疗越来越受到人们关注,治疗基因可以仅在肿瘤细胞中发挥药效而不影响正常细胞,选择性诱导肿瘤细胞的凋亡,具有潜在临床应用价值。
但目前,如何将治疗基因靶向输送至目的病灶成为基因治疗的一大难题。而转染的效率又是另一大难题。病毒载体转染效率高,但存在大量免疫方面和致癌风险问题而无法安全被使用。非病毒载体因其安全,方便的操作得到了广泛的认同和应用。
尽管在开发携载治疗基因的载体中做了巨大的努力,但是,非病载体携载基因的治疗仍然是基因药物领域的一个严峻的挑战。基因治疗肿瘤的障碍有以下几点:1、非病毒载体大多为正电较强的阳离子脂质体或阳离子载体,易产生团聚体,稳定性有待提高;2、载体的生物相容性和可降解性有待提高。3、其靶向细胞或组织的特异性有待被提升,也就是非病毒载体本身的低效性;4、体内循环时需要克服一些生理屏障,故而对其进行遮蔽和修饰是必要的(如PEG化的修饰);5、细胞水平或者动物水平的基因表达效率较低,表达不稳定等。因此,有效的靶向结肠癌细胞或宫颈癌细胞的唯一办法就是成功制备一种载药系统,既可以逃逸屏障而防止被网状内皮细胞和巨噬细胞清除,通过被动的增强渗透与滞留效应EPR效应和纳米载体修饰基团主动的靶向效应又可以到达肿瘤组织,杀死癌细胞。
一般来说,临床应用联合两种或者以上的药物,用以克服不良的毒副作用和增强其治疗效果是一种十分有前景的战略,携载基因的纳米载体搭载化疗药物联合治疗不仅可以靶向作用部位,更可以减小剂量,达到良好疗效。故而本领域迫切需要开发一种新型的可降解纳米载体,实现基因和化学药物的共输送,从而克服单一用药的屏障。
TRAIL是一种肿瘤坏死因子(TNF)相关诱导配体。它可以通过死亡受体结构域DR4和DR5选择性诱导肿瘤细胞的凋亡,而正常细胞上存在的诱骗受体能使得其逃逸TRAIL带来Caspase家族级联放大产生的凋亡作用,具有潜在的临床应用价值。
莫能霉素(Monensin,缩写Mo)是一种天然的聚醚类离子载体抗生素,通过影响pH值或Na+,K+平衡来促使革兰氏阴性菌死亡,是一种常见用于抗球虫的治疗的兽药。莫能霉素还能使细胞1发生去极化,ROS水平增高,并造成内质网压力,抑制细胞内错误折叠的蛋白降解。也有文献报道Wnt通路的过度活跃和多种癌细胞产生有关。莫能霉素可以抑制通路的过度活跃,并且可以稳定DR5蛋白,增强TRAIL的治疗效果。
发明内容
本发明的第一方面提供了一种可降解纳米载体,所述的可降解纳米载体包含具有如式I所示结构的复合物、基因和化学药物:
A-L-(B)n (I)
其中,A为β-环糊精,B为聚乙烯亚胺,L为含有二硫键的连接基团,n为正整数,且1≤n≤5;
并且,所述的基因通过静电作用吸附于所述的复合物,而所述的化学药物包合于β-环糊精腔内。
在另一优选例中,所述的纳米载体粒径为80-300nm,且表面带有正电荷。
在另一优选例中,所述的纳米载体呈均一球形。
在另一优选例中,所述的纳米载体具有良好的水溶性。
在另一优选例中,所述的纳米载体外表还包含负电荷分子修饰层。
在另一优选例中,所述的负电荷分子是天然聚合物,较佳地,为10-100KDa的天然聚合物。
在另一优选例中,所述的负电荷分子是糖类化合物,较佳地,为10-50KDa的糖类大分子。
在另一优选例中,所述的负电荷分子选自下组:γ聚谷氨酸、透明质酸、甘露糖、叶酸、白蛋白、乳铁蛋白、肝素、或其组合。
在另一优选例中,所述的负电荷分子是经多肽或其它小分子修饰后的分子。
在另一优选例中,所述的多肽为穿膜肽,较佳地,为1-3KDa的穿膜肽。
在另一优选例中,所述的多肽为低分子量鱼精蛋白、TAT、HIV-1Rev、ANTP、FHV外壳蛋白及人工合成的小分子寡聚精氨酸[(R)n]和寡聚赖氨酸[(K)n]。
在另一优选例中,所述的多肽为靶向肽。
在另一优选例中,所述的多肽为RGD、T7、FGF、或Trimer。
在另一优选例中,所述的药物为疏水药物或疏水荧光染料。
在另一优选例中,所述的药物为抗肿瘤药物或协同促进基因作用的抗肿瘤药物。
在另一优选例中,所述的药物选自下组:阿霉素、紫杉醇、瑞戈非尼、吉非替尼、莫能霉素、或其组合。
在另一优选例中,所述的疏水荧光染料为香豆素6、尼罗红、CY5、FITC、或其组合。
在另一优选例中,所述的药物为莫能霉素。
在另一优选例中,所述的基因为环状质粒或抑制类发夹RNA(shRNA)、沉默RNA(siRNA)、或其组合。
在另一优选例中,所述的基因选自下组:增强型绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因、P53基因、TRAIL基因、RB-1基因、或其组合。
在另一优选例中,所述的基因为TRAIL基因。
在另一优选例中,所述基因的携载量为5%-50%,和/或所述化学药物的携载量为1%-4%,以所述的可降解纳米载体的总重量计。
本发明的第二方面提供了一种可降解纳米载体的制备方法,包括步骤如下:
(1)在缓冲盐溶液存在下,小分子量聚乙烯亚胺和硫代化合物进行反应,从而形成第一中间产物,即二硫键交联的大分子聚乙烯亚胺(SSPEI);
(2)在缓冲盐溶液中,使用过量的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐处理步骤(1)中得到的第一中间产物,再加入5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)使其与处理后的第一中间产物进行反应,从而得到第二中间产物和游离TNB;和
(3)在缓冲盐溶液和有机溶剂存在下,第二中间产物与巯基化β-环糊精进行反应,从而形成如式I所示结构的复合物:
A-L-(B)n (I)
其中,A为β-环糊精,B为聚乙烯亚胺,L为含有二硫键的连接基团,n为正整数,且1≤n≤5。
在另一优选例中,所述的小分子量聚乙烯亚胺分子量为0.6-2K,优选为0.6k,0.8k或1.8k。
在另一优选例中,所述的二硫代化合物选自下组:二硫代二丙酸、二硫代二丁酸、二硫双[琥珀酰亚胺基丙酸盐]、硫化丙烯、或其组合。
在另一优选例中,所述的二硫代化合物为二硫代二丙酸。
在另一优选例中,所述的小分子量聚乙烯亚胺与二硫代二丙酸的质量比为1:1-5。
在另一优选例中,所述步骤(1)中的盐缓冲液pH值为4-9,较佳地,为5-8.5,更佳地,为5-8。
在另一优选例中,所述步骤(1)中盐缓冲液为PBS磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MES缓冲液、或其组合。
在另一优选例中,所述步骤(1)中的盐缓冲液浓度范围0.1-5mol/L,优选为0.5-3mol/L。
在另一优选例中,所述步骤(1)中的活化试剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸、二环己基碳亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、或其组合。
在另一优选例中,所述步骤(2)中的盐缓冲液pH值为5-9。
在另一优选例中,所述步骤(2)中使用三(2-羰基乙基)磷盐酸盐、β-巯基乙醇、硼氢化钠、二硫苏糖醇,或硫化钠来处理步骤(1)中得到的第一中间产物。
在另一优选例中,所述步骤(3)中的盐缓冲液为加入EDTA的0.1M磷酸钠缓冲液。
在另一优选例中,所述步骤(3)中的有机溶剂为二甲基亚砜(DMSO)、DMF、甲酰胺、无水乙醇、或其组合,和三乙胺溶液。
在另一优选例中,所述的巯基化β-环糊精与第一中间产物的摩尔比为1:10-10:1。
在另一优选例中,本发明第二方面所涉及的方法还包括步骤:
(4)使步骤(3)所得的复合物包合药物后,获得的产物再与基因发生静电吸附作用,从而形成如本发明第一方面所述的纳米载体。
在另一优选例中,所述步骤(4)之后还包括:对所述的纳米载体外表进行负电荷分子修饰。
本发明的第三方面提供了一种如本发明第一方面所述的纳米载体的用途,所述的纳米载体用于治疗肿瘤。
在另一优选例中,所述的肿瘤为皮下肿瘤或原位肿瘤,较佳地,为实体瘤,更佳地,为结肠癌耐药细胞成瘤或宫颈癌肿瘤。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1为根据本发明实验实例制备包裹了负电荷分子材料共载基因和疏水药物的可降解纳米载体的合成示意图(A)以及抗肿瘤作用图(B)。
图2为根据本发明实验实例制备包裹了负电荷分子材料并装载药物和基因的可降解纳米载体(rPGA/SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA)的透射电镜图。
图3为根据本发明制备实例制备可降解纳米载体(SSPEI-beta-CD)与基因在不同比例下的包裹情况。
图4为根据本发明制备实例制备搭载基因的可降解纳米载体等在DNA酶(DNAse)存在的情况对pDNA的保护情况。
图5为根据本发明制备实例制备的可降解纳米载体等在DTT存在的情况下凝胶电泳的情况。
图6为根据本发明制备实例制备的包裹了负电荷分子材料和未包裹的可降解纳米载体在模拟血液环境中对BSA的吸附情况。
图7为根据本发明实验实例制备的可降解纳米载体(SSPEI-beta-CD/pDNA)和双载药可降解纳米载体(γ-PGA/SSPEI-beta-CD/pDNA)的粒径图和电位图。
图8为根据本发明制备实例制备可降解纳米载体的热重分析仪(TGA)测定其组成,并计算SSPEI与巯基化β-环糊精的比例。
图9为根据本发明制备实例制备载有疏水药物莫能霉素的可降解纳米载体,其中对包载莫能霉素的定量。
图10为根据本发明制备实例制备装载疏水药物莫能霉素的可降解纳米载体释放药物的规律曲线。
图11为根据本发明制备实例制备纳米复合物在PBS+10%FBS和含有DTT的PBS+10%FBS内的稳定性。
图12为根据本发明实验实例中的共载的可降解纳米载体(SSPEI-beta-CD/Mo/pDNA)和包裹了负电荷的共载可降解纳米载体纳米载体(γ-PGA/SSPEI-beta-CD/Mo/pDNA)等的细胞摄取效果图。其中,图12(A)为在Hela细胞上,PGA/SSPEI-beta-CD/Mo/pDNA被摄取后,pDNA在细胞内的分布(染料为YoYo-1,绿色);图12(B)左为在HCT8/T细胞上,γ-PGA/SSPEI-beta-CD/Mo/pDNA被摄取后,pDNA在细胞内的分布(染料为YoYo-1,绿色);右为同一细胞上,疏水药物(荧光染料为C6,绿色)在细胞内的分布。
图13为根据本发明实验实例中的共载的可降解纳米载体(γ-PGA/SSPEI-beta-CD/Mo/pDNA)的细胞摄取抑制试验;其中,右图为细胞给予纳米粒前分别加入5ug,2ug,1ug,0ugγ-PGA组和空白组(不给予纳米粒)后,细胞内pDNA(YoYo-1)的流式荧光强度检测;左图为右图的定量分析。
图14为根据本发明实验实例中共载的可降解纳米载体和包裹了负电荷的共载可降解纳米载体对Hela和Hct8/T细胞进行转染;其中,图14(A)为不同纳米复合物中pEGFP在Hela细胞的表达;图14(B)为不同纳米复合物中pEGFP在Hct8/T细胞的表达;图14(C)为图14(A)中转染荧光强度的定量。
图15为根据本发明实验实例中共载药物的可降解纳米载体等对肿瘤细胞的抑制作用(MTT法);其中,图15(A)为材料和空载体在Hela细胞上的毒性考察,PEI25k为毒性对照;图15(B)为材料和空载体在Hct8/T细胞上的毒性考察,PEI25k为毒性对照;图15(C)为不同纳米复合物在Hela细胞上的毒性实验。
图16为根据本发明实验实例中共载药物的可降解纳米载体等对肿瘤细胞凋亡作用的测定;其中,图16(A)为不同纳米复合物在Hela细胞上的凋亡分析图;图16(B)为图16(A)的定量分析柱状图;图16(C)为不同纳米复合物在Hct8/T细胞上的凋亡分析图;图16(D)为图16(B)的定量分析柱状图。
图17为根据本发明实验实例中共载药物的可降解纳米载体等给予肿瘤细胞后细胞周期的测定;其中,图17(A)为不同纳米复合物处理Hct8/T细胞后,细胞周期检测;图17(B)为图17(A)中细胞周期检测的定量柱状图。
具体实施方式
本发明的目的在于:①提供一种集基因,化学药物输送于一体的可降解纳米载体;②开发了一种由上所述方法制备的双药共输送纳米载体。③以及这种双药共输送纳米载体在包载靶向或穿膜类型的负电荷大分子后在肿瘤治疗中的应用。不仅能减少体内非特异性互相作用,同时能把药物和基因高效地输送到肿瘤靶点部位协同发挥疗效。基于此其载药系统,本发明还优选了TRAIL基因与化学药物莫能霉素共输送联合治疗肿瘤的应用。
本发明主要以可还原降解的二硫键交联的LWPEI作为主要载体材料,采用巯基化β-环糊精通过巯基交换反应进行进一步的交联得到可以同时共载基因和化学药物的纳米载体。其环糊精腔内装载疏水药物,优选为化疗药物或协同基因作用的药物,利用纳米载体所带较强正电荷静电吸附基因,优选为治疗基因质粒或者沉默RNA质粒(如siRNA),再在载药体系外层包裹修饰后的负电荷分子,提高药物靶向作用。该双载药纳米载体的粒径在100-300nm左右,首先利用外层负电荷分子主动靶向和EPR被动靶向作用到达靶组织,然后进入内体小泡,接着进入溶酶体,通过PH改变,负电荷外壳脱落,又因肿瘤细胞内高分布的谷胱甘肽酶(GSH)还原性降解交联PEI变为LWPEI,首先释放出所携带的基因药物,之后环内疏水药物缓慢释放协同发挥疗效。
本发明的可降解纳米载体的制备方法
将相对分子质量为600或者1800的小分子聚乙烯亚胺溶解在1-10ml超纯水中形成pH较高的溶液,与二硫代二丙酸混合,比例为1:1-5。该混合液逐滴加入pH范围为4-9,优选为5-8.5的缓冲盐溶液中(所述盐溶液的浓度范围0.1-5mol/L,优选为0.5-3mol/L)混匀后,加入摩尔比为2-5倍过量EDC,NHS,反应温度范围20-50℃,优选为25-40℃,氮气保护,磁力搅拌,反应时间优选为12-48h,更优选为20-30h,形成微黄较粘稠液体。
将上述微黄较粘稠液体于2k-8k的透析袋内,透析溶液一开始选用30-70mM的NaCl溶液透析,随后RO水彻底透析2-5天,得到产物SSPEI,冷冻干燥成干粉低温保存。
将产物SSPEI溶于1-10ml pH 5-9的含EDTA的磷酸盐缓冲液中(盐溶液的浓度范围0.1-0.5mol/L),并用过量的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐处理1h,切断产品中的二硫键,随后加入5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应,转子搅拌,反应避光,持续时间为1-3h。得到的溶液在RO水中彻底透析2天除去多余的TNB和盐类并冷冻干燥。将得到的干粉再次溶于pH在5-9的含EDTA缓冲盐溶液(盐溶液的浓度范围0.1-0.5mol/L)中,β环糊精溶于DMSO中,逐滴加入体系,再加入优选为10-100ul的三乙胺溶液进入反应体系,反应避光,反应时间优选为4-16h,得到β环糊精内嵌的聚合大分子聚乙烯亚胺-β环糊精(SSPEI-beta-CD)纳米载体溶液。得到的纳米载体SSPEI-beta-CD溶液于2k-8k透析袋内彻底透析2-5天,随后冷冻干燥后低温保存。
使用2-10倍摩尔比过量的疏水性药物,优选地,所述药物为自阿霉素、紫杉醇、瑞戈非尼、吉非替尼、莫能霉素中的一种。用优选为50-200ul的有机相溶解后加入纳米载体水溶液中制成药物储备液在磁子搅拌的过程中逐滴加入到反应体系中。黑暗下磁力搅拌,反应时间3-15h,优选时间为4-8h,随后离心4000-8000转,去除微量沉淀,收集上清液体,过0.45水系滤膜,随后冻干,获得载有疏水药的纳米载体干粉。
将上述载药的纳米载体溶于超纯水中,可降解疏水药载体与DNA的质量比例为0.5-50:1,所述的DNA优选为环状质粒和抑制类发夹RNA(shRNA),如报告基因增强型绿色荧光蛋白(EGFP)质粒,治疗型基因如P53,TRAIL或沉默RNA;将一定体积的DNA以涡旋的方式逐滴加入到等体积的载体溶液中,涡旋时间优选为10-20s,孵育时间为20-40分钟,室温反应,得到携载基因和药物的纳米载体。
上述携载基因和药物的纳米载体通过静电吸附,与包裹负电荷分子结合,负电荷分子优选为10-100KDa的天然聚合物(如γ聚谷氨酸,聚精氨酸)或者为10-100KDa的糖类大分子(如透明质酸);带负电荷的分子溶于水溶液,体积与携载基因和药物的纳米载体溶液相同,并将纳米载体溶液逐滴涡旋加入到负电荷分子水溶液中,涡旋时间优选为3-10s,更优选为5-8s,室温下静置孵育15-30分钟。上述携载基因和药物的纳米载体复合物冷冻干燥成冻干粉,长期低温保存。
多肽或其他小分子修饰负电荷分子的方法
以γ聚谷氨酸(γ-PGA)上修饰RGD环肽为实例,具体步骤如下:
称取50mg的γ-PGA溶解于5ml的RO水中,称取0.5mg和0.7mg的NHS和EDC,溶解后加入到γ-PGA溶液中,反应转子搅拌,室温活化1h。称取7.5mg的c(RGDfK)溶于RO水中,待溶解完全后,将c(RGDfK)逐滴加入到活化后的γ-PGA溶液内,调节PH至6.5-8.5范围内,室温搅拌5-10h,反应终止。产物通过FPLC分子筛进行纯化,检测波长为280nm,流速为1ml/min。首先将Desalting和FPLC进行连接,使用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.2)作为流动相平衡柱子约4-5个柱体积,即40-50ml,然后将反应产物注入到进样环中,将紫外基线调为零后以1ml/min的速度样品进入到Desalting中,约3min后通过程序设定仪器收集洗脱出来的紫外峰,等待紫外基线恢复到零后,依次进行下一针的纯化。即获得修饰了RGD的γ-PGA。
本发明的主要优点
(1)合成的可降解纳米载体具有良好的稳定性,可以同时共载基因和疏水药物,原料价格低廉,无需专门设备制作,操作简单。
(2)聚合的PEI通过可还原性降解生成LWPEI毒性低,避免了传统阳离子载体PEI25k不能降解所带来的毒性和副作用,环糊精也具有可降解性,故空载的可降解纳米载体对细胞毒性低,安全可靠。
(3)合成的可降解纳米载体搭载疏水药物,不仅可以提高难溶性药物的溶解度,还可以降低其引起的毒副反应。
(4)最外层包裹的负电荷分子可以选用pH响应的智能材料如γ-PGA或者是可在靶组织的特定环境中降解的透明质酸,使得可降解纳米载体所载疏水药物释放具有智能的pH响应性或酶响应性。
(5)纳米载体对所载基因具有保护作用,外层负电荷分子屏蔽血液环境中被网状内皮细胞的捕获,共载体系靶向到达肿瘤细胞后能有效被摄取,siRNA沉默目的基因表达,DNA得到有效转录,表达目的基因。
(5)共载基因和疏水药物,可以使用有协同效应,能相互作用药物,降低化疗药物的剂量的同时亦可达到增效减毒的效果,能有望实现逆转肿瘤多药耐药性。
(6)合成的可降解纳米载体不仅能作为药物和基因共输送的载体,而且还能搭载超声成像的造影剂或荧光小分子探针用于成像。
(7)本发明结合实例,联合使用治疗基因TRAIL和聚醚类离子载体莫能霉素,利用莫能霉素使细胞ROS水平增高,DR5的mRNA和蛋白表达增多,协助TRAIL发挥作用,共同对抗肿瘤。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数按重量计算。
试剂和药品
小分子枝状聚乙烯亚胺(PEI1800k)(Alter listur公司);3,3'-二硫代二丙酸(国药集团化学试剂有限公司);二硫双(琥珀酰亚胺基丙酸盐)(美国ProteoChem公司);二水磷酸二氢钠、十二水磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、盐酸、氢氧化钠、乙二胺四乙酸二钠、琼脂糖(国药集团化学试剂有限公司);MES试剂(Sigma-Aldrich,美国);DTNB(Sigma-Aldrich,美国);三(2-羰基乙基)磷盐酸盐(百灵威科技有限公司):七(6-巯基-6-去氧)-β-环糊精(CAS:160661-60-9,山东滨州智源生物科技有限公司);莫能霉素标准品(Monensin,Mo)(大连美仑生物技术有限公司);c(RGDfK)(上海丽昂化学有限公司);γ-聚谷氨(γ-PGA)(Mw20kD)(南京赛泰斯有限公司)3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT),Hoechest 33258,3500mw透析袋(Sigma-Aldrich,美国);透析袋MD24(Spectrum美国);DNA酶(上海捷瑞生物工程有限公司);1640细胞培养基(Gibco,Invitrogen,USA);澳洲血源胎牛血清(上海熠晨生物有限公司);0.25%胰蛋白酶(上海碧云天生物技术有限公司);Gel-red(BiotiumHayward,USA);二甲基亚砜、N,N-二甲基甲酰胺(国药集团化学试剂有限公司);pTRAIL,pEGFP和pDsRFP等质粒在DH5alpha大肠杆菌菌株中扩增,无内毒素质粒抽提试剂盒Mega(Qiagen,Hilden,Germany)抽提。
基因与药物共输送的可降解纳米载体
(1)共载基因和药物的可降解纳米载体由小分子PEI与巯基β-环糊精通过二硫键交联聚合而成,环糊精疏水腔内部装载协同TRAIL基因作用的蛋白质转运抑制剂莫能霉素,通过正电性吸附逆转抗癌基因质粒TRAIL。合成示意图如图1(A)所示,抗肿瘤作用如图1(B)所示。
(2)该共输送纳米载体粒径大小在100-300nm范围内,呈均一球形,在水溶液状态下分散良好。
(3)纳米载体通过EPR效应和外层靶向负分子双向靶向肿瘤部位,
到达肿瘤组织后,有效被肿瘤细胞摄取,进入溶酶体后在PH较低的情况下,外层负电分子γ-PGA首先改变二级结构与载体分离,接着PEI与γ-PGA共同的质子海绵效应使溶酶体涨破,胞内高浓度GSH降解载体释放出所携载基因,治疗基因TRAIL表达,莫能霉素也从环内释放,二者协同发挥相应疗效。
制备实施例1:共载药可降解纳米体系的制备
1.小分子聚乙酰亚胺和环糊精交联的复合物(SSPEI-beta-CD)的制备
将相对分子质量为1800的小分子聚乙烯亚胺溶解在3ml超纯水中形成PH较高的溶液,与二硫代二丙酸混合,比例为1:1-5。该混合液逐滴加入MES缓冲液(浓度范围0.1-5mol/L,优选为0.5-3mol/L)混匀后,加入摩尔比为2.5倍过量EDC,NHS,35℃反应,氮气保护,磁力搅拌,反应时间为30h,形成微黄较粘稠液体;将液体于3500k的透析袋内,透析溶液一开始选用30-70mM的NaCl溶液透析,随后RO水彻底透析2-5天,得到产物SSPEI,冷冻干燥成干粉低温保存。
得到的产品SSPEI溶于4ml pH为8的含EDTA的0.1M磷酸钠缓冲液中,并与等体积的过量三(2-羰基乙基)磷盐酸盐溶液混合反应1h,切断产品中的二硫键(无需除去,不影响下一部反应),随后加入2倍摩尔比过量的5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)反应,转子搅拌,反应避光,反应1h。得到的溶液在RO水中彻底透析2天除去多余的TNB和盐类并冷冻干燥。将得到的干粉再次溶于pH为8的含EDTA缓冲盐溶液(盐溶液的浓度范围0.1-0.5mol/L)中,β环糊精溶于100ul DMSO中,逐滴加入体系,再加入50ul的三乙胺溶液进入反应体系,反应避光,反应时间优选为4-16h,得到β环糊精内嵌的聚合大分子聚乙烯亚胺-β环糊精(SSPEI-beta-CD)纳米载体溶液。得到的纳米载体SSPEI-beta-CD溶液于MWCO为7000透析袋内彻底透析2-5天,随后冷冻干燥后低温保存。
2.双载药纳米载体(SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA)的制备
莫能霉素3倍摩尔比过量,用200ul的甲醇溶解后在磁子搅拌的过程中逐滴加入纳米载体水溶液中制成药物储备液。黑暗下磁力搅拌,反应时间4h,随后离心5000转,去除微量沉淀,收集上清液体,过0.45水系滤膜,随后冻干,获得载有疏水药的纳米载体干粉。
将上述载药的纳米载体溶于超纯水中配制成1mg/ml的储备液,可降解疏水药载体与质粒DNA(pDNA)的质量比例为20:1;将一定体积的基因以涡旋的方式逐滴加入到等体积的载体溶液中,涡旋时间15s,孵育30分钟,室温反应,得到携载基因和药物的纳米载体。
3.小分子靶向肽c(RGDfK)修饰的γ-PGA的合成
称取50mg的γ-PGA溶解于5ml的RO水中,称取0.5mg和0.7mg的NHS和EDC,溶解后加入到γ-PGA溶液中,反应转子搅拌,室温活化1h。称取7.5mg的c(RGDfK)溶于RO水中,待溶解完全后,将c(RGDfK)逐滴加入到活化后的γ-PGA溶液内,调节pH至6.5-8.5范围内,室温搅拌5h,反应终止。产物通过FPLC分子筛进行纯化,检测波长为210nm,流速为1ml/min。首先将Desalting和FPLC进行连接,使用0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.2)作为流动相平衡柱子约4-5个柱体积,即40-50ml,然后将反应产物注入到进样环中,将紫外基线调为零后以1ml/min的速度样品进入到Desalting中,约3min后通过程序设定仪器收集洗脱出来的紫外峰,等待紫外基线恢复到零后,依次进行下一针的纯化。即获得有修饰了RGD的γ-PGA。冷冻干燥后4度长期保存,并配制成1mg/ml的溶液备用。
4.包裹γ-PGA的双载药纳米载体(rPGA/SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA)的制备
上述携载基因和药物的纳米载体通过静电吸附,与包裹负电荷分子γ-PGA结合;带负电荷的分子溶于水溶液配制成0.4mg/ml的溶液,以相同体积与携载基因和药物的纳米载体溶液混合,涡旋5-8s,室温下静置孵育25分钟。将获得的包裹γ-PGA的双载药纳米载体(rPGA/SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA)冷冻干燥成冻干粉,长期低温保存。
测试实施例1:双载药可降解纳米载体(SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA)和包裹γ-PGA的双载药可降解纳米载体(rPGA/SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA)的体外表征实验
(1)粒径和电位
取基因质量为10ug pEGFP质粒的载莫能霉素纳米载体和包裹γ-PGA的双载药可降解纳米载体等,用纯化水稀释到终体积为1ml,使用马尔文粒径仪进行粒径和电位的测定,结果如图7所示。
结果:随着组成的增多和药物的搭载,纳米复合物的粒径逐渐增大,电位由正负电荷材料交替吸附而显现上下动荡,客观上说明纳米载体合成的成功。
(2)TEM
将包裹γ-PGA的双载药可降解纳米载体和双载药可降解纳米载体分别滴加到预先水化后的铜网上,2min后吸干,滴加醋酸釉负染1min后50℃加热灯照射20分钟晾干。采用透射电镜进行测定分析,rPGA/SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA的分析结果如图2所示。
结果:粒度仪测定的是水合粒径,TEM能看出纳米载体的实际尺寸。从图2中可以看出包裹γ-PGA的双载药可降解纳米载体为形态约为100nm左右均一的球形。
(3)琼脂糖凝胶电泳阻滞实验
利用琼脂糖凝胶电泳实验考察不同比例纳米载体与固定质量的质粒DNA(pDNA)作用的状态。称取0.8g琼脂糖于250ml锥形瓶中,加入100ml 1×TEA缓冲液中,微波高火加热5min至琼脂糖完全溶解,制成0.8%琼脂糖凝胶溶液,待冷却至60℃左右,按1000x稀释方法加入gel-red混合均匀,倒入制胶槽中,插上电泳梳,室温静置30min至琼脂糖凝胶完全凝固后轻轻拔去电泳梳。将装有凝胶的小槽放入电泳槽中,槽中为1×TEA缓冲液。缓冲液浸没凝胶。取新鲜制备的复合物与上样loading混合均匀,每孔20ul样品跑电泳。电泳电压为80V、时间45min,电泳结束后置于凝胶成像系统进行分析,观察裸EGFP(pDNA)被复合物包裹的情况,结果如图3所示。
第1道:裸EGFP
第2道:SSPEI-β-CD/pDNA 1:1
第3道:SSPEI-β-CD/pDNA 5:1
第4道:SSPEI-β-CD/pDNA 10:1
第5道:SSPEI-β-CD/pDNA 50:1
第6道:SSPEI-β-CD/pDNA 100:1
确定了质粒和纳米载体的质量比后,为观察纳米载体可降解性,将新鲜的pDNA,γ-PGA/PEI25k/pDNA,SSPEI-beta-CD/pDNA,SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA和γ-PGA/SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA纳米载体与终浓度为15mM的DTT等体积混合。放置于摇床上100r,在37℃下孵育2h。随后,与上样loading混合均匀,每孔20ul样品跑电泳。电泳电压为80V、时间45min,电泳结束后置于凝胶成像系统进行分析,观察pDNA被纳米载体包裹的情况,结果如图5所示。
结果:材料与pDNA在质量比为1:1的时候就能够将pDNA包裹起来阻滞在孔中。为提高包裹pDNA的稳定性和转染效率并结合实验室早期试验,我们采用γ-PGA:纳米载体:pDNA为2:10:1作为最佳质量比,进行后续实验;为了确定小分子PEI和环糊精交联的纳米载体是谷胱甘肽响应的可降解材料,图5可以看出加入DTT之后,pDNA正在逐步被释放。
第0道:裸EGFP
第1道:PEI25k/DNA3:1
第2道:rPGA/SSPEI-β-CD/DNA 2:10:1
第3道:SSPEI-β-CD-Mo/DNA 2:10:1
第4道:rPGA/SSPEI-β-CD-Mo/DNA 2:10:1
第5道:RGD-rPGA/SSPEI-β-CD-Mo/DNA 2:10:1
(4)共载药纳米载体抗核酸酶的能力
为了检测共载药纳米载体抗核酸酶的能力,将pDNA,SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA和γ-PGA/SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA纳米复合物与DNAase(1unit/μg of DNA)混合,对照组用等体积的水替代DNAase作用。样品置于37℃恒温摇床,80rpm,反应30min。然后,加入适量EDTA·2Na溶液至终浓度为500nmol/L,置室温下孵育15min终止消化,之后加入肝素钠溶液释放出纳米复合物中质粒DNA(100units/ug DNA)。取20ul样品与上样缓冲液混合,0.8%预制琼脂糖凝胶内上样,电泳条件:80V、45min,实验完毕后采用凝胶成像系统进行分析,观察DNA,结果如图4所示。
结果:1为裸EGFP(pDNA),
2泳道为SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA,
3泳道为γ-PGA/SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA;
可以发现,裸pDNA由于没有载体保护,很快被降解,2和3中的载体包裹pDNA,使得其得到了保护,不被DNase所破坏,解离纳米复合物后仍然较好的保持了pDNA的完整性。
(5)模拟血清蛋白测定载体吸附蛋白情况。
1.制样。取含有20ug(0.2ug/ul)pEGFP的SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA和γ-PGA/SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA纳米复合物溶液与0.2mg/ml牛血清白蛋白溶液等体积混合,置于37℃的摇床中孵育1h,然后用超高速离心机室温100,000rpm离心2h,纳米复合物沉降在离心管底部。弃去上清,用滤纸吸收离心管壁上残余液体。将沉降的纳米复合物与30ul含有SDS和巯基乙醇的上样缓冲液混合均匀,置于沸水浴煮10min,使得纳米复合物上吸附的白蛋白解离和变性,置于-20℃保存备用。
2.制胶。洗净制胶板,吹干,置胶夹中卡紧,垂直放置在制胶架上。配置5ml浓度为12%的商品化下层胶(额外添加10%过硫酸铵和TEMED),用移液器吸取加入到玻璃板之间,接着加入2ml无水乙醇压胶,室温放置30min待胶完全凝固后倒掉上层乙醇,用滤纸吸干残余液体。配置3ml商品化浓缩胶(额外添加10%过硫酸铵和TEMED),用移液器吸取加入到玻璃板之间,立即将制胶梳插入到浓缩胶中,室温放置30min,凝固后备用。
3.上样电泳。制好的12%聚丙烯酰胺凝胶置于电泳槽中,内槽加满新鲜缓冲液,轻轻拔出梳子。接着,将30μl样品上样到胶孔中进行蛋白电泳,电压为150V,电泳1h,接着SDS-PAGE凝胶放在摇床上90r,加入固定液(醋酸和异丙醇)固定15min后倒走固定液,加入考马斯亮蓝G-250染色直至显色后用脱色剂脱色,实验完毕后采用凝胶成像系统观察吸附情况。结果如图6所示。
结果:相比于吸附很多BSA的SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA,包裹了的γ-PGA的SSPEI-beta-CD-Mo纳米复合物能有效减少BSA的吸附,体现其类似PEG的屏蔽效果,表现出其优越的血管内稳定性。
第1道:蛋白maker
第2道:SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA,
第3道:γ-PGA/SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA
(6)可降解纳米载体的热重分析。
1.设置好控制程序。将热重分析仪设置为起始温度30℃,结束温度600℃;温度升高速度为每分钟20℃。
2.坩埚用酒精灯灼烧干净后,用载物台将其悬挂于挂钩上,点击闭合按钮,仪器对坩埚进行称重,调节天平到平衡位置,并点击去皮,此时仪器显示原始坩埚基本质量为0。
3.点击打开按钮,取下空坩堝,分别称取5-10mg全巯基β环糊精,PEI1800k,可降解纳米载体SSPEI-beta-CD放在其中,轻轻振动,使之自然堆积。然后将坩埚用载物台仍挂回天平挂钩上,点击闭合按钮。
4.等待仪器内的坩埚在天平上平衡,仪器显示的质量数值基本没有波动后,点击称重按钮,仪器记录数值,再点击开始,之后将y轴的模式调节为百分比显示。样品将按设定好的程序进行热重分析。
5.得到的三种样品的热重数据作图进行分析,结果如图8所示。
结果:从反应物和产物的曲线上看,产物的特征曲线在两种反应物之间,表明新物质的生成且与两个反应物相关,两种反应物PEI1800k和和全巯基-β-CD的热重曲线在0~600度分别是一个重量为0,一个还剩总的32%,而产物剩余质量为9%左右,由此可以算出SSPEI与beta-CD的质量比约为7.2:2.8,根据相对分子质量,其摩尔比约为2:1。
(7)共载药体系中莫能霉素的定量。
香草醛和莫能霉素在酸性条件衍生下生成有色络合物。70℃水浴中显色20分钟,快速冷却,用紫外分光光度计在400-800nm波长下扫普得到吸收峰在560nm。
1.做0-500ug/ml莫能霉素标曲:取莫能霉素标准品,用无水甲醇配制成1mg/ml的溶液后,与无水甲醇以不同的比例分别配制成浓度为0,50,100,200,300,400,500,600ug/ml的莫能霉素标准溶液,每个浓度平均重复三组。分别取2ml不同浓度的莫能霉素标准品溶于10ml容量瓶中,加入2ml现配的衍生试剂(3g香草醛,100ml无水甲醇,1ml浓硫酸于棕瓶内),再用无水甲醇定容至10ml,水浴锅恒温75℃,孵育20min,快速冷却至室温后,将每个浓度的莫能霉素溶液平行重复五个复孔,用多功能酶标仪测定560nm吸光度的值。标曲线性良好,R2=0.9986,结果如图9所示。
2.SSPEI1.8k-CD-莫能霉素的测定:称取5mg配制成1mg/ml的溶液。在1.5mlEP管内加入100ul上述溶液,继续加入900ul甲醇,涡旋20s后进行超声。超声时间为20分钟。随后,用离心机离心10000r,10分钟,萃取材料中的莫能霉素。得到的液体在70℃水浴中显色20分钟,快速冷却,用分光光度计在400-800nm波长下扫普得到吸收峰在560nm。进行衍生化处理后紫外检测得到材料中的莫能霉素的量约为10.5-40ug/ml。载药量为1%-4%之间,符合实验需求。。
(8)莫能霉素的释放
由pH敏感和GSH介导的γ-PGA/SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA与SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA的药物释放实验分别在pH7.4和pH5.0的0.1MPBS中进行。
精密称取5mg冻干后的SSPEI-beta-CD-Mo,按照上述制备实例制备两种纳米复合物。最终分别溶解在5ml,0.1M的PBS溶液里,其中PBS的pH为7.4和5.0的。
将纳米载体溶液放入mwco为3500的透析袋内,接着将透析袋塞入50ml离心管内,离心管内预先含有20ml相应pH值得PBS缓冲液,DTT组分别加入为不同浓度DTT的PBS缓冲液(0mM,10mM)。
把离心管放入震荡培养箱,为37℃恒温水浴震荡,转速为120r/min。分别在30min,1h,2h,4h,6h,8h,12h,24h,36h进行取样,同时补充1ml的对应PH和GSH的释放介质。不同组分别取1ml的释放介质用衍生法测定释放的莫能霉素的浓度。结果如图10所示DTT
(9)可降解纳米复合物体外稳定性的测定
新鲜制备出的SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA纳米复合物和γ-PGA/SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA复合物分别溶解于终浓度为10%FBS的150mM PBS中(pH7.4),对照组添加10mM的DTT放置于37℃中,在设定的时间点(0,5,10,20,40,80,160,320,640,1280min)取1ml进行粒径的测定。结果如图11所示。
结果:可以看出,在150mM PBS+10%FBS的条件下,纳米复合物稳定性良好;加入DTT后,材料开始解聚,纳米复合物变得不稳定,粒径明显增大,600min以后已无法检测,产生沉淀。
(10)细胞摄取实验
考察可降解纳米复合物在Hela细胞和HCT8/T上中的摄取情况。
将消化好的细胞种在24孔板中,每孔加入50μl密度为2×106个/ml的细胞悬液,再用含血清1640培养基补齐液体至500ul,置于细胞培养箱中培养12h,汇合程度约为70%-80%。
弃去与加入纳米载体同体积的培养基,将预先用YoYo-1标记好的pDNA制备出的γ-PGA/SSPEI-beta-CD/pDNA-YoYo1或者是疏水药物用染料香豆素6(C6)代替的γ-PGA/SSPEI-beta-CD-C6/pDNA,加入到不同细胞的对应孔内,各自孔中孵育3h,然后将培养上清弃去,加YoYo-1组用台盼蓝孵育5min淬灭胞外荧光,接着用PBS洗三遍。之后加入4%多聚甲醛37℃固定10min,弃去多聚甲醛,用PBS洗三遍后,加入DAPI孵育10min,用PBS清洗三遍后,加入少量PBS浸润细胞,置于荧光显微镜下观察。如图13所示。为了定量考察两种细胞对纳米复合物的摄取情况,使用流式细胞仪进行检测。具体操作步骤同上,分别给予预先用YoYo-1标记好的pDNA制备出的新鲜纳米复合物,孵育3h后,先用台盼蓝淬灭,再用PBS清洗3遍,胰酶消化并收集细胞,1000rpm离心5min后,用PBS再洗两遍,加入500μl PBS置于流式细胞仪上检测。结果如图12所示。
摄取抑制实验:为验证γ-PGA存在的主动靶向作用介导的内吞是摄取提高的原因,利用文献报道的γ-PGA抑制剂GGsTop对细胞进行预处理1h,并设置抑制剂的不同浓度作对比,再给予新鲜制备的标记YoYo-1的γ-PGA-PEI25k/EGFP,共孵育4h后如上述步骤所示,消化细胞,利用流式细胞仪进行绿色荧光的分析。结果如图13所示。
结果:在两种细胞上,纳米复合物都能被有效的摄取,基因进入溶酶体,疏水药进入细胞浆,且有γ-PGA的纳米载体组摄取略强于普通纳米载体组;细胞摄取抑制发现,随着GGsTop的增加,摄取抑制效果也逐渐增加,呈现出浓度依赖性,表现出了γ-PGA的促进摄取的作用。
(11)细胞转染实验
采用pEGPF作为报告基因考察纳米复合物的体外转染效率。
HeLa和Hct8/T(耐药)细胞的转染(定性):培养的细胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打均匀,细胞计数后,将细胞以1×105细胞/孔的密度均匀接种到12孔的培养板中,培养24h至细胞汇合度70-80%。转染前弃去培养基并加入新鲜培养基。从板里吸走与制备纳米复合物相同体积的培养基后,将新鲜制备的纳米复合物加到各孔(3μg pEGFP/孔)中,每组设置三个复孔。继续培养至48h。培养结束后,弃去培养液,用PBS漂洗两次。用4%多聚甲醛固定细胞10min后,加入DAPI浸没各孔并孵育10min,再用PBS洗三遍,置于荧光显微镜下观察绿色荧光的分布与强度,并拍照。
HeLa和Hct8/T(耐药)细胞的转染(定量):采用流式细胞仪测定绿色荧光蛋在各种细胞中表达的细胞数目。将培养的细胞用胰酶消化后吹打均匀,细胞计数后,将细胞以1×105细胞/孔的密度均匀接种到12孔的培养板中,培养24h至细胞汇合度70-80%。转染前弃去培养基并加入新鲜培养基。从板里吸走与制备纳米复合物相同体积的培养基后,将新鲜制备的纳米复合物加到各孔(3μg pEGFP/孔)中,每组设置三个复孔。继续培养至48h。培养结束后,用0.25%胰蛋白酶消化细胞,1000rpm离心5min收集细胞,用冰PBS漂洗两次,最终将细胞重悬于500ul PBS溶液中,转移到流式细胞管,立即用流式细胞仪FL-1通道测定有绿色荧光的细胞数目,每个样品均收集10,000个细胞。采用Flow Jo软件分析处理实验结果。结果如图14所示。
结果:在Hela和Hct8/T上,各组与黄金标准PEI25k复合的纳米载体的转染效果进行对比,SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA组已经展现出了低毒且相似的转染效果,而γ-PGA/SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA组转染好于SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA和PEI25k组也说明了γ-PGA展现出的效果。
测试实施例2:共载药可降解纳米载体的体外联合治疗效果
(1)MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴蓝,商品名:噻唑蓝)法,测定可降解纳米材料的材料毒性,单载药及共载药体系的抗肿瘤作用。
空载体,单载药,共载药纳米复合物处理48h小时后细胞的存活率,从而考察载药纳米复合物的抗肿瘤能力。培养的细胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打均匀,细胞计数后,将HeLa细胞以5000个每孔的密度接种到96孔培养板中,每孔100ul培养液,细胞在培养箱中培养24h。空载体毒性以PEI的浓度(ug/mL)为横坐标,单载药和双载药纳米复合物以治疗基因TRAIL的浓度(ug/mL)为横坐标。考察载药纳米粒的细胞抑制率时,我们制备新鲜的γ-PGA/SSPEI-beta-CD-Mo/pDNA等纳米复合物,按100ul/孔给药,并使其终浓度为对应的药物浓度。药物浓度等比梯度稀释。继续培养48h。设置空白孔和对照孔,每组六个复孔。给药结束后在各孔中加入20μl MTT溶液(5mg/ml),并继续在二氧化碳培养中孵育4h。随后,用注射器小心吸掉培养上清液,各孔中加入150μl的DMSO(二甲基亚砜),用锡纸包裹平放在不动的摇床上37℃孵育10min,最后将96孔板放入酶标仪孵育并震荡1min以溶解甲臜晶体,测量各孔在570nm处的吸光值。使用以下公式计算细胞存活率(%):
Cell Viability(%)=[(AE-AB)/(AC-AB)]×100%
AE,AC和AB分别代表实验组的吸光值,空白组的吸光值和对照的吸光值。结果如图16所示。(A实验组-A空白组)/(A对照组-A空白组)
结果:A图为hela细胞,B图为Hct8/T上纳米材料毒性的MTT,与PEI25k相比,其展现出低毒的优越性。而载药后的纳米载体展现出了优越的细胞杀伤抑制效果。如图15所示。
(2)细胞凋亡测定
采用流式细胞仪定量检测可降解纳米复合物诱导肿瘤细胞凋亡的能力。
将HeLa和Hct8/T细胞分别以5×105个/孔的密度接种到6孔培养板中,培养约24h后,细胞汇合度70-80%,转染前弃去培养基并加入2ml新鲜培养基。各孔先吸出与纳米复合物溶液相同体积的培养基,再加入含有相当于4μg TRAIL的纳米复合物。除去给药组之外,同时参照说明书,用细胞凋亡阳性对照试剂处理细胞,设置早期凋亡和晚期凋亡两个阳性对照组
细胞在培养箱中孵育48h后,小心将培养上清收集在离心管中,用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞,Hela在37℃孵育3min,Hct8/T在37℃孵育3min,随后加入先前取出的培养上清液加入对应孔内轻轻吹打下贴壁细胞,加入到对应离心管中,3000rpm离心5min收集细胞,弃上清,再以同样的方法,用冷PBS漂洗三次,最终将试剂盒里的10×Annexin V-FITC结合液稀释至1×,用100ul 1×Annexin V-FITC 1×结合液轻轻重悬细胞,细胞浓度约为1×107个细胞/ml。设置单染组,双染组后,样品每管中加入1μl 100μg/ml Annexin V-FITC溶液和1μl 100μg/ml碘化丙啶溶液,黑暗下室温下共孵育15min后,再加入400μl 1×AnnexinV-FITC结合液,吹打混匀。
立即加入流式管,用流式细胞仪根据两个阳性样品:单染和双染调节参数和补偿使其处在正确位置,然后横轴为FL-1通道检测阳性细胞绿色荧光的分布情况,纵轴为FL-2通道测定细胞红色荧光的分布情况。每个样品均收集10,000个细胞。
结果:包裹了γ-PGA的双药联用组效果十分明显,晚期凋亡比例大于普通双药联用组,证明了γ-PGA的靶向性,双药组比单药组凋亡效果也要明显也证明了联用的成功。A,B:Hela凋亡及定量分析,C,D:Hct8/T凋亡及定量分析。
(3)细胞周期测定
采用经典的碘化丙啶染色(PI)方法进行细胞周期分析。
培养的细胞用0.25%胰蛋白酶消化后吹打均匀,细胞计数后,将细胞以5×105细胞/孔的密度接种到6孔培养板中。培养24h至细胞汇合度70-80%左右,转染前弃去培养基并加入2ml新鲜培养基。各孔先吸出与纳米复合物溶液相同体积的培养基,再加入含有相当于4μg TRAIL的纳米复合物,细胞培养箱中共孵育48h。
小心将培养上清液收集到2ml离心管中,用0.25%胰蛋白酶消化贴壁细胞,Hela在37℃孵育3min,Hct8/T在37℃孵育6min,分别加入之前取出的培养上清液加入对应孔轻轻吹打下贴壁细胞,加入离心管中,3000rpm离心5min收集细胞,小心弃去上清,用冰PBS漂洗三次。最后在细胞内加入75%乙醇,轻轻吹打混匀,置于4℃固定12h以上。也可长期保存在-20℃中。
3000rpm离心5min,小心弃去酒精,用冷PBS漂洗两遍。配制100×PI工作液(包含10mg/ml RNase,PI母液,用PBS稀释补齐刻度)用时稀释成1×,加入至对应细胞,轻轻吹散细胞混匀,室温下避光放置30min,随后3000rpm离心5min,弃上清液,用冰PBS漂洗两遍。最后用500μl PBS重悬细胞,随即采用流式细胞仪测定。
结果:A:Hct8/T的周期图。双药组明显subG1期高于任一组。
综上,本发明的修饰有γ-PGA的SSPEI-β-CD纳米载体可以有效地共载携载质粒(或者小分子干扰RNA)和疏水莫能霉素,主动靶向细胞,并穿透进入细胞内部,释放药物,有效表达基因,具有显著的肿瘤杀伤效果。对肿瘤细胞的体外的生长抑制作用都表现出了明显的作用。同时,本发明的二硫键交联可降解纳米载体也显著降低了毒性,并保留PEI25k的高转染效率。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (8)
1.一种可降解纳米载体,其特征在于,所述的可降解纳米载体包含具有如式I所示结构的复合物、基因和化学药物:
A-L-(B)n(I)
其中,A为β-环糊精,B为聚乙烯亚胺,L为含有二硫键的连接基团,n为正整数,且1≤n≤5;
并且,所述的基因通过静电作用吸附于所述的复合物,而所述的化学药物包合于β-环糊精腔内;
所述的纳米载体外表还包含负电荷分子修饰层;
所述的负电荷分子选自下组:γ聚谷氨酸、透明质酸、或其组合。
2.如权利要求1中所述的纳米载体,其特征在于,所述的纳米载体粒径为80-300nm,且表面带有正电荷。
3.如权利要求1中所述的纳米载体,其特征在于,所述的负电荷分子为γ聚谷氨酸。
4.如权利要求1中所述的纳米载体,其特征在于,所述的化学药物为疏水药物或疏水荧光染料。
5.如权利要求1中所述的纳米载体,其特征在于,所述的基因选自下组:增强型绿色荧光蛋白基因、红色荧光蛋白基因、P53基因、TRAIL基因、RB-1基因、或其组合。
6.如权利要求1中所述的纳米载体,其特征在于,所述基因的携载量为5%-50%,所述化学药物的携载量为1%-4%,以所述的可降解纳米载体的总重量计。
7.一种权利要求1所述可降解纳米载体的制备方法,其特征在于,包括步骤如下:
(1)在缓冲盐溶液存在下,小分子量聚乙烯亚胺和硫代化合物进行反应,从而形成第一中间产物,即二硫键交联的大分子聚乙烯亚胺(SSPEI);
(2)在缓冲盐溶液中,使用过量的三(2-羰基乙基)磷盐酸盐处理步骤(1)中得到的第一中间产物,再加入5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)使其与处理后的第一中间产物进行反应,从而得到第二中间产物和游离TNB;和
(3)在缓冲盐溶液和有机溶剂存在下,第二中间产物与巯基化β-环糊精进行反应,从而形成如式I所示结构的复合物:
A-L-(B)n(I)
其中,A为β-环糊精,B为聚乙烯亚胺,L为含有二硫键的连接基团,n为正整数,且1≤n≤5;
(4)使步骤(3)所得的复合物包合化学药物后,获得的产物再与基因发生静电吸附作用;
(5)对所述的纳米载体外表进行负电荷分子修饰,从而形成如权利要求1中所述的纳米载体;
所述的负电荷分子选自下组:γ聚谷氨酸、透明质酸、或其组合。
8.一种如权利要求1中所述的纳米载体的用途,其特征在于,所述的纳米载体用于制备用于治疗肿瘤的药物。
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