CN104800838A - MUC1-Fc多肽疫苗及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种MUC1-Fc多肽疫苗及其制备方法和应用，本发明所述的多肽疫苗包含带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽，所述多肽的序列如SEQ ID NO:1所示；通过基因工程技术，将所述的带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽序列构建到载体上，然后在大肠杆菌中表达和纯化，再经脂质体等载体包被即可得到本发明的MUC1-Fc多肽疫苗。本发明的MUC1-Fc多肽疫苗同时包含有MHC I和MHC II结合表位，可以突破MHC限制性因素，有效激活细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，对肿瘤细胞具有较强的杀伤作用，可以取得更好的预防和治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及肿瘤DNA疫苗和病毒载体疫苗领域，尤其涉及一种MUC1-Fc多肽疫苗及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤细胞在其发生、发展过程中，由于细胞的基因突变或表达调控会表达一些新的抗原或过表达一些抗原，而这些新抗原作为“非己物质”，可以被机体的免疫系统识别和杀伤，机体可以通过天然和获得性免疫抵抗肿瘤。然而，肿瘤在人体的免疫功能作用下仍然能够发展、转移，表明肿瘤也有自己的保护机制。肿瘤细胞可以通过对自身表明抗原的修饰及改变肿瘤周围的微环境来逃避机体的免疫识别和攻击，即肿瘤的免疫逃逸。而肿瘤疫苗则可以打破自身免疫系统对肿瘤抗原的耐受，活化肿瘤特异性T细胞或诱导产生肿瘤特异的抗体，激活免疫识别，达到杀伤肿瘤的目的。
许多研究表明，肿瘤细胞表面的抗原多肽能够有效激发肿瘤细胞的免疫应答，有学者通过从肿瘤表面洗脱的抗原肽以及来自肿瘤内部特异性的蛋白制备出肽疫苗，其可以通过DC细胞的提呈作用引发CTL反应，另外热休克蛋白-肽复合物具有良好的免疫原性，可诱导抗肿瘤免疫应答，此外HSP70可诱导T细胞进入肿瘤，并诱发TFA-α、IL-2等细胞因子的表达。自1989年第一个人类特异性抗原报道以来，目前已经有许多肿瘤抗原被发现。相对于其他类型的抗原(蛋白质、DNA疫苗、病毒载体抗原等)，来源于肿瘤相关抗原的抗原肽具有特异性高、安全等优势，而且，还可以通过氨基酸置换、改变肽的构象及修饰氨基酸残基等方法提高肽的免疫原性。然而肿瘤细胞表达递呈的抗原多肽，既有优势表位，也存在弱势甚至抑制性表位，而且表面抗原肽的表达量很低，必须通过大量肿瘤细胞的免疫，才能提供足够的抗原。因此不得不探索如何寻找高纯度高效的特异性肿瘤抗原多肽来制备疫苗。
MUC1是由muc1基因表达的一种高糖基化(糖基化大于50％)、高分子量(Mr>200×103)蛋白，又称附膜蛋白，是跨膜分子。它在上皮更新与分化，维持上皮完整性和癌的发生与转移等方面起到重要的作用。MUC1的多肽骨架含有空间结构稳定一致的可变数目重复序列(VNTR)，抗原决定簇主要集中在这一区域。正常细胞表面的MUC1的核心肽被外周糖链掩盖，而在癌变细胞表面，由于畸形糖基化和糖基化不完全等原因，肿瘤细胞的MUC1在糖链上有所改变，导致蛋白核心肽的部分暴露，使新的肿瘤相关抗原表位和糖原表位暴露出来。糖基化不完全的MUC1广泛分布(90％的实体瘤和多种非实体瘤)并异常丰富的表达于癌细胞表面。因此MUC1已经成为一种非常有潜力的治疗性肿瘤疫苗靶标。
然而目前所用的MUC1多肽疫苗由于表位太小，因此只能针对MHC I或MHC II，具有MHC限制性因素，不能有效的激活CTL反应。2011年，以色列的研究人员开发了一种相对较长的MUC1多肽肿瘤疫苗，此多肽疫苗同时包含有MHC I和MHC II结合表位，并且经试验能和超过50％白种人群的CD4+和CD8+T细胞的HLA结合。经体外和小鼠体内实验表明，其能有效的激活CD4+细胞以及CD8+细胞的CTL反应。
发明内容
本发明提供了一种MUC1-Fc多肽疫苗及其制备方法和应用，特别是一种能同时含有MHC I和MHC II结合表位的MUC1+免疫球蛋白Fc段的多肽疫苗及其制备方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种MUC1-Fc多肽疫苗，其包含带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽。
本发明首先利用生物信息学的方法，在MUC1蛋白原始序列基础上进行MUC1肿瘤多肽以及人类白细胞抗原(HLA)结合预测，然后对预测的序列进行化学合成多肽，优化改良，得到效果最好的肽段后将其表达序列与免疫球蛋白Fc段融合表达，最后纯化得到本发明的带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽序列。
本发明中，所述带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽序列如SEQ ID NO:1所示：
SEQ ID NO:1：Kosak序列+MUC1+接头(linker)+Fc段，其序列如下：
GCCACCATGACACCGGGCACCCAGTCTCCTTTCTTCCTGCTGCTGCTCCTCACAGTGCTTACAGTTGTTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGG TTCTGGTGGTGGTGGTTCTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGA
本发明得到的带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽同时包含有MHC I和MHC II结合表位，相比以往的只能针对MHC I或MHC II单一结合表位的多肽疫苗，本发明所制备的多肽疫苗可以突破MHC限制性因素，有效激活CD4+细胞以及CD8+细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，因此能够取得更好的预防和治疗效果。
本发明中，所述疫苗还包括载体；所述载体为生物可降解材料，其具有良好的缓释和生物相容性。
本发明中所述载体可以是聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇(PEG)、水溶性维生素E衍生物(TPGS)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)或1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷(DOTAP)中的任意一种或至少两种的组合，但不限于此。
本发明可以采用脂质体作为载体，尤其可以采用阳离子脂质体载体，例如可以采用1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷(DOTAP)。
本发明利用纳米级生物可降解材料包被所述带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽制成疫苗，可以保护疫苗免于降解，并实现缓释性，提高抗原的生物利用度。
第二方面，本发明还提供了一种如本发明第一方面所述的疫苗的制备方法，其包括以下步骤：
(1)融合免疫球蛋白Fc段到MUC1多肽片段，获得带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽序列，并通过Red/ET同源重组或酶切酶连的方法制备对应的表达载体，再通过生物表达和纯化得到所述带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽；
(2)利用载体包被所述的带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽。
本发明所述制备方法的步骤(1)中，可以利用Red/ET同源重组方法，设计上游同源臂：(HindIII)CTCTAGCGTTTAAACTTAAGCTT；下游同源臂：(BamHI)GGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGA，将带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽序列构建到载体上，然后在大肠杆菌中表达和纯化。
本发明中的步骤(1)，并非局限于上述Red/ET同源重组方法或酶切酶连方法，可以采用本领域熟知的常用的基因工程技术进行载体的构建和表达以及纯化。
本发明中所述载体优选但不限于大肠杆菌载体，例如所述载体可以是pET32a、pET22b、pET28a、pET29a、pET9a或pET3a中的任意一种。
本发明所述制备方法的步骤(2)中，所述载体为聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚乙二醇(PEG)、水溶性维生素E衍生物(TPGS)、聚乳酸(PLA)、聚己内酯(PCL)或1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷(DOTAP)中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述载体为1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷(DOTAP)。
本发明中所述载体为药学上可接受的佐剂，优选但不限于上述载体。
本发明所述制备方法的步骤(2)中，所述包被包括以下步骤：
1)将载体用有机溶剂溶解至浓度为1μM/mL；
2)用氮气恒流将有机溶剂吹干，使载体形成均匀的膜结构并将其干燥过夜；
3)加入用PBS稀释过的所述带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽，使载体被充分水合，超声10-15min，过滤，4℃保存备用。
优选地，所述有机溶剂为氯仿：甲醇＝2:1(体积比)。
本发明中，所述MUC1-Fc多肽疫苗的制备方法，具体包括以下步骤：
(1)融合免疫球蛋白Fc段到MUC1多肽片段，获得获得带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽序列，利用Red/ET同源重组方法，设计上游同源臂：(HindIII)CTCTAGCGTTTAAACTTAAGCTT；下游同源臂：(BamHI)GGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGA，将带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽序列构建到pET32a载体上，然后在大肠杆菌中表达和纯化得到带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽；
(2)将1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷(DOTAP)用有机溶剂溶解至浓度为1μM/mL，其中，所述有机溶剂为氯仿：甲醇＝2:1(体积比)；用氮气恒流将有机溶剂吹干，使1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷形成均匀的膜结构，将其干燥过夜；加入用PBS稀释过的所述带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽，使1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷(DOTAP)被充分水合，水合结束后，在被冰块预冷的超声洗涤槽中，超声10-15min，用0.22μM过滤器过滤3次，4℃保存备用。
第三方面，本发明还提供了一种如本发明第一方面所述的疫苗在制备治疗或预防癌症药物中的应用。
本发明中所述癌症可以为乳腺癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、宫颈癌或食道癌等中的任意一种或至少两种的组合，优选但不限于此。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明的带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽同时包含有MHC I和MHC II结合表位，相比以往的只能针对MHC I或MHC II单一结合表位的多肽疫苗，本发明所制备的多肽疫苗可以突破MHC限制性因素，有效激活CD4+细胞以及CD8+细胞的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应，取得更好的预防和治疗效果；
(2)利用纳米材料技术包被本发明的MUC1多肽疫苗，可保护疫苗免于降解以及实现缓释性，提高抗原生物利用度；
(3)采用经本发明的抗原多肽负载的DC细胞刺激后的T细胞对靶细胞的杀伤率可达到71.6％，相比未经该多肽抗原负载的细胞，杀伤率可提高55％。
附图说明
图1是本发明的MUC1-Fc多肽疫苗的制备过程示意图。
图2是本发明的MUC1-Fc多肽疫苗的细胞杀伤实验评估结果。
具体实施方式
以下将结合附图，通过具体实施方式对本发明进行详细描述。
图1是本发明的MUC1-Fc多肽疫苗的制备过程示意图。
实施例1
带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽的制备方法具体包括以下步骤：
融合免疫球蛋白Fc段到MUC1多肽片段，获得带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽序列，其序列如SEQ ID NO:1所示，利用Red/ET同源重组方法，设计上游同源臂：(HindIII)CTCTAGCGTTTAAACTTAAGCTT；下游同源臂：(BamHI)GGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGA，将带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽序列构建到pET32a载体上，然后在大肠杆菌中表达和纯化即可得到带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽。
实施例2
带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽的制备方法具体包括以下步骤：
融合免疫球蛋白Fc段到MUC1多肽片段，获得带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽序列，其序列如SEQ ID NO:1所示，利用酶切酶连方法，酶切位点(HindIII)AAGCTT；(BamHI)GGATCC，将带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽序列构建到pET29a载体上，然后在大肠杆菌中表达和纯化即可得到带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽。
实施例3
利用1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷(DOTAP)包被实施例1的带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽得到多肽疫苗，其制备方法包括以下步骤：
1)溶剂配制：配制氯仿和甲醇的混合物，其中，氯仿和甲醇的体积比为2:1；
2)溶解1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷(DOTAP)：于圆底瓶中用步骤1)中的溶剂溶解DOTAP，溶解至浓度为1μM/mL；
3)用氮气恒流将溶剂吹干，使DOTAP在容器壁上形成均匀的一层膜结构；
4)待溶剂被吹干后，将其放入真空干燥箱中干燥过夜，使溶剂尽量被去除；
5)加入用PBS稀释过的需要被包被的实施例1的带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽，体积以能浸润DOTAP膜为宜，为保持蛋白活性，将圆底瓶放于冰盒内，冰盒放于水平回旋摇床上过夜，使DOTAP被充分水合；
6)水合结束后，将圆底瓶放于被冰块预冷的超声洗涤槽中，超声10min；
7)然后将所得溶液于超净工作台中，用0.22μM过滤器过滤3次，然后4℃保存备用。
实施例4
利用PLGA-TPGS纳米粒载体包被实施例1的带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽得到多肽疫苗，其制备方法包括以下步骤：
1)纳米材料的溶解：利用丙酮将纳米材料PLGA和Vitamin E TPGS(TPGS)的混合物(TPGS所占质量比为20～50％)完全溶解，溶解至浓度为5～30mg/mL；
2)边搅拌边将实施例1的带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽加入到步骤1)所述溶液中；
3)按照步骤2)所述溶液与去离子水体积比为1:4，在500～1500rpm/min磁力搅拌的状态下将纳米材料与丙酮的溶液加入去离子水中，形成均匀的乳浊液，然后继续搅拌至丙酮挥发；
4)纳米粒的收集：8000～15000rpm/min离心收集制备的纳米材料，然后用去离子水重悬，重复操作2次洗涤纳米材料；
5)然后将所得溶液于超净工作台中，用0.22μM过滤器过滤3次，然后4℃保存备用。
实施例5
将实施例3的多肽疫苗来刺激诱导培养到第5天的DC细胞，然后用培养成熟的DC细胞刺激T细胞，检测该多肽抗原对T细胞杀伤癌细胞能力的提升情况，其中癌细胞采用人乳腺癌细胞MCF，T细胞：MCF-7＝4:1，反应时间为8h。
在3mL的DC细胞培养体系中设置对照组，其中不加实施例3的多肽疫苗；另外设置了分别加入10μL，50μL，100μL，200μL，400μL的实施例3的多肽疫苗溶液，检测结果用3次独立重复实验结果平均值±标准差表示，其杀伤结果如图2所示，其中*代表与对照组T检验比较具有显著差异。
从图2可以看出，采用3mL的对照组以及加入10μL，50μL，100μL，200μL，400μL的实施例3的多肽疫苗溶液，得到的杀伤率分别为46.2％，52.8％，65.2％，71.6％，66.9％，65.4％，从而得出在加入50μL，100μL，200μL，400μL的实施例3的多肽疫苗溶液后，其杀伤率与对照组相比具有显著差异，当多肽疫苗溶液浓度为100μL时可以实现最优的杀伤效果，使刺激产生的T细胞比起对照组对癌细胞MCF-7的杀伤率提高了55％。
通过上述实施例可以看出，本发明的多肽疫苗对T细胞杀伤癌细胞的能力有所提升，相比其它的MUC1多肽疫苗，具有预防和治疗效果好，副作用小，安全性高，成本低，使用方便等特点。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的工艺方法，但本发明并不局限于上述工艺步骤，即不意味着本发明必须依赖上述工艺步骤才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种MUC1-Fc多肽疫苗，其特征在于，其包含带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽。
2.如权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽的序列如SEQ ID NO:1所示。
3.如权利要求1或2所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还包括载体；
优选地，所述载体为生物可降解材料；
优选地，所述载体为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙二醇、水溶性维生素E衍生物、聚乳酸、聚己内酯或1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述载体为1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷。
4.如权利要求1-3任一项所述的疫苗的制备方法，其特征在于，其包括以下步骤：
(1)融合免疫球蛋白Fc段到MUC1多肽片段，获得带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽序列，并通过Red/ET同源重组或酶切酶连的方法制备对应的表达载体，再通过生物表达和纯化得到带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽；
(2)利用载体包被所述的带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，利用Red/ET同源重组方法，设计上游同源臂：(HindIII)CTCTAGCGTTTAAACTTAAGCTT；下游同源臂：(BamHI)GGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGA，将所述带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽序列构建到载体上，然后在大肠杆菌中表达和纯化；
优选地，所述载体为pET32a、pET22b、pET28a、pET29a、pET9a或pET3a中的任意一种。
6.如权利要求4或5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述载体为生物可降解材料；
优选地，所述载体为聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乙二醇、水溶性维生素E衍生物、聚乳酸、聚己内酯或1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述载体为1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷。
7.如权利要求3-6任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述包被包括以下步骤：
1)将载体用有机溶剂溶解至浓度为1μM/mL；
2)用氮气恒流将有机溶剂吹干，使载体形成均匀的膜结构并将其干燥过夜；
3)加入用PBS稀释过的所述带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽，使载体被充分水合，超声10-15min，过滤，4℃保存备用；
优选地，所述有机溶剂为氯仿与甲醇的体积比为2:1。
8.如权利要求3-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)融合免疫球蛋白Fc段到MUC1多肽片段，获得带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽序列，利用Red/ET同源重组方法，设计上游同源臂：(HindIII)CTCTAGCGTTTAAACTTAAGCTT；下游同源臂：(BamHI)GGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGA，将带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽序列构建到pET32a载体上，然后在大肠杆菌中表达和纯化得到带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽；
(2)将1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷用有机溶剂溶解至浓度为1μM/mL，其中，所述有机溶剂为氯仿与甲醇的体积比为2:1；用氮气恒流将有机溶剂吹干，使1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷形成均匀的膜结构并将其干燥过夜；加入用PBS稀释过的所述带免疫球蛋白Fc段的MUC1抗原多肽，使1,2-二油酰基-3-三甲基氨基内烷被充分水合，水合结束后，在被冰块预冷的超声洗涤槽中，超声10-15min，用0.22μM过滤器过滤3次，4℃保存备用。
9.如权利要求1-3任一项所述的疫苗在制备治疗或预防癌症药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述癌症为乳腺癌、胃癌、胰腺癌、结肠癌、前列腺癌、宫颈癌或食道癌中的任意一种或至少两种的组合。
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