CN114028539B - 粘蛋白1在抑制冠状病毒中的应用 - Google Patents

粘蛋白1在抑制冠状病毒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了粘蛋白1的应用。该应用为粘蛋白1在如下任一中的应用：(A1)制备抑制冠状病毒的产品，或抑制冠状病毒；(A2)制备治疗和/或预防由冠状病毒感染所致疾病的产品，或治疗和/或预防由冠状病毒感染所致疾病；(A3)制备改善由冠状病毒感染所致症状的产品，或改善由冠状病毒感染所致症状；(A4)制备治疗和/或预防由所述冠状病毒复制导致的疾病的产品，或治疗和/或预防由所述冠状病毒复制导致的疾病。本发明实施例表明，粘蛋白1可以抑制冠状病毒的粘附和进入，同时还抑制冠状病毒感染后复制。

Description

粘蛋白1在抑制冠状病毒中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及粘蛋白1在抑制冠状病毒中的应用。
背景技术
2019新型冠状病毒(2019-nCoV或者SARS-CoV-2，引发新型冠状病毒肺炎COVID-19)是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒，其余6种分别是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。其中，HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63和HCoV-HKU1的致病性较低，一般引起呼吸道症状，类似普通感冒或肺炎。而其他三种冠状病毒的致病性且传染性均非常高，它们导致的疾病包括严重急性呼吸综合征(SARS，2002-2004年)，中东呼吸综合征(MERS，2012-至今)以及新型冠状病毒疾病(COVID-19)。因此，如何阻断冠状病毒的传播、预防感染及开发新的有效药物是亟待解决的技术问题。
尽管最近有研究报道显示，多种设计的候选疫苗在动物实验及I期、II期和III期临床实验过程中表现良好的安全性和有效性，以及一系列的药物分子候选物具有一定的抑制病毒的能力，但是还需要加大药物的筛选和研究，寻找疗效更好和安全性更佳的药物。
发明内容
本发明的目的之一在于提供粘蛋白1的应用。
本发明提供了粘蛋白1在如下任一中的应用：
(A1)制备抑制冠状病毒的产品，或抑制冠状病毒；
(A2)制备治疗和/或预防由冠状病毒感染所致疾病的产品，或治疗和/或预防由冠状病毒感染所致疾病；
(A3)制备改善由冠状病毒感染所致症状的产品，或改善由冠状病毒感染所致症状；
(A4)制备治疗和/或预防由所述冠状病毒复制导致的疾病的产品，或治疗和/或预防由所述冠状病毒复制导致的疾病。
本文中，粘蛋白1可以为人源或者为动物或植物来源，也可以是重组蛋白，具体可为如下任一种蛋白质：
1)氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的蛋白质；
2)在SEQ ID No.1所示的蛋白质的羧基末端或/和氨基末端连接蛋白标签得到的融合蛋白；
3)将1)或2)所示的蛋白质经过一个以上氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与1)或2)所示的蛋白质具有90％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质。
上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签、Fc标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
可选地，根据上述的应用，所述由所述冠状病毒复制导致的疾病为由所述冠状病毒吸附细胞导致的疾病、由所述冠状病毒进入细胞导致的疾病和/或由所述冠状病毒在细胞中的复制导致的疾病。
可选地，根据上述的应用，所述冠状病毒选自HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2中的至少一种。
可选地，根据上述的应用，所述由冠状病毒感染所致疾病选自肺炎、呼吸道感染、普通感冒、严重急性呼吸综合征(SARS)、中东呼吸综合征(MERS)和2019新型冠状病毒肺炎(COVID-19)中的至少一种。
可选地，根据上述的应用，所述呼吸道感染选自上呼吸道感染、下呼吸道感染、气管炎和支气管炎的急性和慢性阶段中的至少一种。
可选地，根据上述的应用，所述产品为药品。
可选地，根据上述的应用，所述药品为液体制剂或固体制剂。
本发明提供了一种产品，活性成分包括粘蛋白1；所述产品具有如下任一用途：
(a1)抑制冠状病毒；
(a2)治疗和/或预防由冠状病毒感染所致疾病；
(a3)改善由冠状病毒感染所致症状；
(a4)治疗和/或预防由所述冠状病毒复制导致的疾病。
可选地，根据上述的产品，所述产品为药品。所述药品可以配制成各种适合的药物制剂形式，例如，可以为液体制剂形式，也可以为固体制剂形式。例如，粘蛋白1可以单独使用，或者将其与药用辅料(例如赋形剂、稀释剂等)混合，配制成口服给药的片剂、胶囊剂、颗粒剂或糖浆剂等或注射给药的粉针剂、溶液剂等。
本发明实施例表明，粘蛋白1可以抑制冠状病毒的粘附和进入，同时还可抑制冠状病毒感染后复制。以粘蛋白1为例，用SARS-CoV-2 Luc假病毒测试，其在细胞水平的EC50＝0.09μg/ml，同时利用SARS-CoV-2感染复制系统(trVLP)测试，其在细胞水平的EC50＝0.04μg/ml。SARS-CoV-2进入细胞靠刺突蛋白spike识别受体血管紧张素转化酶ACE2及其他辅助受体，因此spike为病毒复制过程中的关键因子，而随着粘蛋白1浓度的增加，spike介导的感染进入效率降低，以及其相对表达量降低。所以，针对spike和病毒复制关键因子的粘蛋白1可应用于针对COVID-19的治疗。
附图说明
图1为重组粘蛋白1抑制SARS-CoV-2假病毒的感染的抑制率。
图2为重组粘蛋白1抑制SARS-CoV-2复制子trVLP的抑制率。
图3为重组粘蛋白1抑制SARS-CoV-2假病毒和trVLP复制子感染的抑制率随剂量的变化情况。
图4为重组粘蛋白1抑制SARS-CoV-2假病毒和trVLP复制子的吸附、进入和感染后复制的实验结果。
图中粘蛋白1即为下述实施例中所述的重组粘蛋白1。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
采用GraphPad 8统计软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，采用非对称T检验检验。
实验例1、粘蛋白1抑制冠状病毒感染
检测原理：
新冠复制子模型是将新冠病毒基因组的部分基因替换为表达绿色荧光蛋白基因，在特定细胞系稳定表达被替换的病毒基因，从而实验病毒的复制。
使用了SARS-CoV-2复制子病毒模型(trVLP)，避免P3实验室操作实验的风险与繁琐。trVLP可在普通P2实验室进行培养，可以作为理想的抗SARS-CoV-2病毒的替代模型，大量基础实验可在该病毒模型上探索后用SARS-CoV-2病毒验证。
实验材料与仪器：
细胞：Vero E6，购自ATCC。
Huh7.5，洛克菲勒大学Charles M Rice教授馈赠，记载于Luna JM，Scheel TK，Danino T，et al.Hepatitis C virus RNA functionally sequesters miR-122.Cell.2015；160(6)：1099-1110.doi：10.1016/j.cell.2015.02.025。
Caco-2-N，清华大学丁强教授馈赠，记载于Ju X，Zhu Y，Wang Y，et al.A novelcell culture system modeling the SARS-CoV-2life cycle.PLoS Pathog.2021；17(3)：e1009439.doi：10.1371/journal.ppat.1009439。
上述细胞采用高糖DMEM+10％胎牛血清，在37℃，5％CO2培养箱中培养。
病毒：SARS-CoV-2 Luc假病毒，中国食品药品检定所王佑春研究员惠赠。记载于Nie J，Li Q，Wu J，et al.Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by apseudotyped virus-based assay.Nat Protoc.2020；15(11)：3699-3715.doi：10.1038/s41596-020-0394-5。
SARS-CoV-2 GFP假病毒，由厦门大学夏宁邵教授惠赠。记载于Xiong HL，Wu YT，Cao JL，et al.Robust neutralization assay based on SARS-CoV-2 S-protein-bearing vesicular stomatitis virus(VSV)pseudovirus and ACE2-overexpressingBHK21 cells.Emerg Microbes Infect.2020；9(1)：2105-2113.doi：10.1080/22221751.2020.1815589。
trVLP SARS-CoV-2复制子(下述简称trVLP复制子)，由清华大学丁强教授惠赠，记载于Ju X，Zhu Y，Wang Y，et al.A novel cell culture system modeling the SARS-CoV-2 life cycle.PLoS Pathog.2021；17(3)：e1009439.doi：10.1371/journal.ppat.1009439。
样品：MUC1(重组粘蛋白1)，购自novoprotein，货号：CS58，存储条件-20℃。该重组粘蛋白1是在粘蛋白1(序列如SEQ ID No.1)的C端连接Fc标签获得的重组蛋白。
检测试剂：如表1所示。
表1试剂来源
检测方法具体如下。
qRT-PCR(real-time RT-PCR)：按照制造商的说明，使用RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒进行RNA提取。反转录使用RevertAid First Strand cDNASynthesis Kit，qPCR的扩增体系如下，
引物：
bjmu-00737-SARS-CoV-2 RNA-F：CGAAAGGTAAGATGGAGAGCC，
bjmu-00738-SARS-CoV-2 RNA-R：TGTTGACGTGCCTCTGATAAG，
bjmu-00061-RPS11-F：GCCGAGACTATCTGCACTAC，
bjmu-00062-RPS11-R：ATGTCCAGCCTCAGAACTTC，
各1μl，10μM；
POWRUP SYBR MASTER MIX(2X)5μl(厂商：Thermo Scientific货号：A25742)；
cDNA 3μl；
共10μl扩增体系。
qPCR的扩增程序表2。
表2 qPCR扩增程序
qRT-PCR使用QuantStudio 1 Real-Time PCR detection system(Appliedbiosystems，Foster City，CA，USA)进行检测。
荧光素酶表达水平的检测：采用Luciferase Cell Culture Lysis Reagent，5X(用ddH2O稀释至1X使用)裂解液将细胞进行裂解获得细胞裂解液，按照Luciferase AssaySystem试剂制造商的说明书，20μl细胞裂解液与100μl反应液进行混合，之后加入对应的96孔板化学发光检测板中，置于化学发光检测仪中读取发光值。
1、重组粘蛋白1抑制SARS-CoV-2感染
1)重组粘蛋白1抑制SARS-CoV-2假病毒的感染和复制
Vero E6细胞接种到96孔板中，每孔中Vero E6细胞的量为20000个，次日，用SARS-CoV-2 Luc假病毒感染细胞，650TCID50/孔(假病毒制备和TCID50测定，见参考文献：Nie J，Li Q，Wu J，et al.Quantification of SARS-CoV-2 neutralizing antibody by apseudotyped virus-based assay.Nat Protoc.2020；15(11)：3699-3715.doi：10.1038/s41596-020-0394-5)，并分别加入不同浓度的重组粘蛋白1(重组粘蛋白1在体系中的浓度为2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.125ug/ml、0.0625ug/ml)，阴性对照为PBS。37℃，5％CO2培养箱培养24小时。利用Luciferase Assay System检测细胞裂解液中的荧光蛋白酶的表达量，并统计抑制率。抑制率计算方法：实验中有一组别为只加入等量假病毒，无重组粘蛋白1而加入等量的PBS，该组为阴性对照组；各组利用Luciferase Assay System检测得到数值，加入重组粘蛋白1组数值除以阴性对照组数值，乘以100％，从而得到相应加入重组粘蛋白1组的感染率，相应加入重组粘蛋白1组的抑制率(％)＝100％-感染率(％)。每组重复3次。
Vero E6和Huh7.5细胞分别接种到96孔板中，每孔中细胞的量为20000个，次日，用SARS-CoV-2GFP假病毒感染细胞，每孔加入量为MOI＝0.05，并分别加入不同浓度的重组粘蛋白1(重组粘蛋白1在体系中的浓度为2ug/ml、0.25ug/ml、0ug/ml)。37℃，5％CO2培养箱培养48小时。利用荧光显微镜观测GFP的表达情况。每组重复3次。
2)重组粘蛋白1抑制trVLP的感染进入
Caco-2-N细胞接种到24孔板中，每孔中细胞的量为100000个，次日，细胞用trVLP病毒感染，每孔加入量为MOI＝0.05，并分别加入不同浓度的重组粘蛋白1(重组粘蛋白1在体系中的浓度为2ug/ml、0.2ug/ml、0.02ug/ml)。37℃，5％CO2培养箱培养96小时。利用荧光显微镜观测GFP的表达情况。每组重复3次。
Caco-2-N细胞接种到6孔板中，每孔中细胞的量为400000个，次日，细胞用trVLP病毒感染，MOI＝0.05，并分别加入不同浓度的重组粘蛋白1(重组粘蛋白1在体系中的浓度为2ug/ml、0.4ug/ml、0.08ug/ml)。37℃，5％CO2培养箱培养96小时。阴性对照为加入等量trVLP病毒，不加入重组粘蛋白1而加入等量PBS的处理组。
利用western blot检测Spike蛋白的表达量，所使用的抗体如下：
Spike一抗：SARS-CoV-2/2019-nCoV Spike Antibody，Rabbit PAb，40589-T62，Sino Biological；
Spike二抗：Goat anti-Rabbit IgG(H+L)-HRP，BE0101-100，EASYBIO；
Actin一抗：Beta Actin Monoclonal antibody，60008-1-Ig，Proteintech；
Actin二抗：Goat anti-Mouse IgG(H+L)-HRP，BE0102-100，EASYBIO。
利用qRT-PCR检测病毒RNA表达量。
每组重复3次。
3)结果
结果见图1和图2所示。
图1中A为重组粘蛋白1对SARS-CoV-2Luc假病毒感染的抑制率统计结果，重组粘蛋白1在体系中的浓度为2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.125ug/ml、0.0625ug/ml的实验组的抑制率平均值分别为78％、60％、85％、64％、40％和32％。图1中B为重组粘蛋白1对SARS-CoV-2GFP假病毒感染的GFP表达情况，在不加入重组粘蛋白1的实验组中，可见GFP均匀明显表达，0.25μg/ml重组粘蛋白1作用下，GFP减少，2μg/ml重组粘蛋白1作用下，几乎无GFP表达，显著阻断病毒的感染，表明重组粘蛋白1对SARS-CoV-2 Luc假病毒、SARS-CoV-2GFP假病毒具有显著的抑制作用。
图2中A为步骤2)GFP的表达情况，2μg/ml重组粘蛋白1作用下，几乎无GFP表达，蛋白浓度下降到0.2μg/ml，GFP表达显著增加，且呈片状分布；蛋白浓度下降到0.02μg/ml，GFP表达进一步增加，也呈片状分布，表明有细胞融合发生。图2中B为步骤2)病毒核酸RNA相对表达量统计(相对表达量＝2-ΔCt(实验组RNA表达量)/2-ΔCt(对照组RNA表达量))，当重组粘蛋白1用量达到2ug/ml时，病毒RNA表达量很低，随着重组粘蛋白1浓度降低，病毒RNA的表达量上升，甚至达到相对表达量为30。图2中C为重组粘蛋白1步骤2)Spike蛋白(刺突蛋白)western blot中电泳照片。SARS-CoV-2进入细胞靠刺突蛋白识别受体血管紧张素转化酶ACE2及其他辅助受体，因此为病毒复制过程中的关键因子。随着重组粘蛋白1浓度的增加，刺突蛋白的相对表达量降低，表明重组粘蛋白1还对SARS-CoV-2复制子活病毒具有显著抑制作用。
2、重组粘蛋白1抑制SARS-CoV-2 Luc假病毒和trVLP的EC50和CC50测定
1)Vero E6细胞和Caco-2-N细胞以2.0×104个/孔的密度接种到96孔板(ThermoFisher)或者1.0×105个/孔的密度接种到24孔板中，在37℃，5％CO2培养箱中培养。
2)重组粘蛋白1抑制SARS-CoV-2Luc假病毒的EC50和CC50测定。
Vero E6细胞接种到24孔板中，次日，细胞培养孔中分别加入在体系中浓度为2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.125ug/ml、0.0625ug/ml、0.03125ug/ml和0.015625μg/ml的重组粘蛋白1，随后加入病毒SARS-CoV-2 Luc，650TCID50/孔。2小时后，弃去上清，并加入PBS缓冲液清洗3次以便去除未进入细胞的病毒颗粒，然后细胞培养孔中再次分别加入在体系中浓度为2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.125ug/ml、0.0625ug/ml、0.03125ug/ml和0.015625μg/ml重组粘蛋白1。阴性对照组为Vero E6细胞接种到24孔板中，次日，细胞培养孔中加入与重组粘蛋白1等量的PBS，随后加入病毒SARS-CoV-2 Luc，650TCID50/孔。2小时后，弃去上清，并加入PBS缓冲液清洗3次以便去除未进入细胞的病毒颗粒。将病毒感染的24h后通过Luciferase Assay System的方法对细胞内荧光素酶进行定量并统计抑制率。抑制率计算方法：各组利用Luciferase Assay System检测得到数值，加入重组粘蛋白1组数值除以阴性对照组数值，乘以100％，从而得到相应加入重组粘蛋白1组的感染率，抑制率(％)＝100％-感染率(％)。重组粘蛋白1对Vero E6的细胞毒性用CCK8活性检测来测量。
3)重组粘蛋白1抑制trVLP复制子的EC50和CC50测定
Caco-2-N细胞接种到24孔板中，次日，细胞培养孔中分别加入在体系中浓度为2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.125ug/ml、0.0625ug/ml、0.03125ug/ml和0.015625μg/ml的重组粘蛋白1，随后加入病毒trVLP复制子，每孔加入量为MOI＝0.05。2小时后，除去上清，并加入PBS缓冲液清洗3次以去除未进入细胞的病毒颗粒，然后在细胞培养孔中再次加入在体系中浓度为2ug/ml、1ug/ml、0.5ug/ml、0.25ug/ml、0.125ug/ml、0.0625ug/ml、0.03125ug/ml和0.015625μg/ml的重组粘蛋白1。阴性对照组为Caco-2-N细胞接种到24孔板中，次日，细胞培养孔中加入与重组粘蛋白1等量的PBS，随后加入病毒trVLP复制子，每孔加入量为MOI＝0.05。2小时后，除去上清，并加入PBS缓冲液清洗3次以去除未进入细胞的病毒颗粒。病毒感染的96h后通过qRT-PCR的方法对细胞内病毒RNA进行定量检测。所使用引物为
bjmu-00737-SARS-CoV-2 RNA-F：CGAAAGGTAAGATGGAGAGCC；
bjmu-00738-SARS-CoV-2 RNA-R：TGTTGACGTGCCTCTGATAAG；
bjmu-00061-RPS11-F：GCCGAGACTATCTGCACTAC；
bjmu-00062-RPS11-R：ATGTCCAGCCTCAGAACTTC。
抑制率计算方法：(抑制率＝[1-2-ΔCt(实验组RNA表达量)/2-ΔCt(对照组RNA表达量)]x100％)，重组粘蛋白1对Caco-2-N的细胞毒性用CCK8活性检测来测量。
4)结果：
结果如图3所示。图3A为重组粘蛋白1抑制SARS-CoV-2Luc假病毒的EC50测定结果，EC50值为0.09816μg/mL，重组粘蛋白1在最高实验浓度2μg/ml细胞活性仍大于90％，故无法有效估计CC50，表明MUCl对Vero E6细胞毒性小，可忽略。图3B为重组粘蛋白1抑制trVLP复制子的EC50，EC50值为0.04227μg/mL，重组粘蛋白1在最高实验浓度2μg/ml细胞活性仍大于90％，故无法有效估计CC50，表明MUC1毒性很小，可忽略。重组粘蛋白1对SARS-CoV-2 Luc假病毒及trVLP复制子的抑制作用随浓度增加而增强，表明重组粘蛋白1抑制SARS-CoV-2假病毒及trVLP复制子病毒感染复制具有剂量依赖性。
3、重组粘蛋白1抑制病毒的粘附、进入及复制实验
为了研究重组粘蛋白1对SARS-CoV-2假病毒和trVLP复制子感染细胞的各个感染阶段的抑制效果，做了不同处理的实验。Vero E6、Huh7.5和Caco-2-N细胞接种到24孔板或96孔板上，并在病毒感染的不同阶段加入重组粘蛋白1，探索重组粘蛋白1对病毒感染全周期、入胞及入胞后复制的抑制作用。
1)实验方法如下：
Caco-2-N细胞接种到24孔板，接种量为100 000个；Huh7.5和Vero E6细胞分别接种到96孔板中，接种量为20 000个。
①吸附实验：
Caco-2-N实验组：药物重组粘蛋白1和病毒trVLP复制子在4℃预混1h获得药物病毒混合物，同时Caco-2-N细胞提前预冷1小时，然后药物病毒混合物加到细胞上，加入量为每孔500μl，其中trVLP复制子0.05MOI，重组粘蛋白1加入后浓度为1μg/ml，4℃处理2h，PBS洗3遍。
Caco-2-N阴性对照组：Caco-2-N细胞提前预冷1小时，然后trVLP复制子加到细胞上，加入量为每孔0.05MOI，500μl，4℃处理2h，PBS洗3遍。
Caco-2-N阳性对照组：1mg/ml的乳清蛋白混合物A17(记载于Fan H，Hong B，LuoY，et al.The effect of whey protein on viral infection and replication ofSARS-CoV-2 and pangolin coronavirus in vitro.Signal Transduct TargetTher.2020；5(1)：275.Published 2020Nov 24.doi：10.1038/s41392-020-00408-z)和病毒0.05MOI trVLP复制子在4℃预混1h获得混合物，同时Caco-2-N细胞提前预冷1小时，然后混合物加到细胞上，加入量为每孔500μl，其中trVLP复制子0.05MOI，乳清蛋白混合物A17加入后浓度为1mg/ml，4℃处理2h，PBS洗3遍。
Caco-2-N实验组、Caco-2-N阴性对照组和Caco-2-N阳性对照组用荧光显微镜观察GFP表达，并用Luciferase Cell Culture Lysis Reagent，5X(用ddH2O稀释至1X使用)裂解液收细胞(其中含粘附在细胞表面的病毒)，后续提取RNA，进行qRT-PCR检测SARS-CoV-2-RNA。
Vero E6或者Huh7.5实验组：药物重组粘蛋白1和病毒SARS-CoV-2 Luc假病毒在4℃预混1h获得药物病毒混合物，同时Vero E6或者Huh7.5细胞提前预冷1小时，然后药物病毒混合物加到细胞上，加入量为每孔100μl，其中SARS-CoV-2 Luc假病毒650TCID50，重组粘蛋白1加入后浓度为1μg/ml，4℃处理2h，PBS洗3遍，更换新的10％FBS的高糖DMEM培养基，放入培养箱培养24h。
Vero E6或者Huh7.5阴性对照组：Vero E6或者Huh7.5细胞提前预冷1小时，然后650TCID50/孔SARS-CoV-2 Luc假病毒加到细胞上，加入量为每孔100μl，4℃处理2h，PBS洗3遍，更换新的10％FBS的高糖DMEM培养基，放入培养箱培养24h。
Vero E6或者Huh7.5阳性对照组：乳清蛋白混合物A17和病毒SARS-CoV-2Luc假病毒在4℃预混1h获得混合物，同时Vero E6或者Huh7.5细胞提前预冷1小时，然后混合物加到细胞上，加入量为每孔100μl，其中SARS-CoV-2 Luc假病毒650TCID50，乳清蛋白混合物A17加入后浓度为1mg/ml，4℃处理2h，PBS洗3遍，更换新的10％FBS的高糖DMEM培养基，放入培养箱培养24h。
Vero E6或者Huh7.5实验组、Vero E6或者Huh7.5阴性对照组和Vero E6或者Huh7.5阳性对照组用Luciferase Assay System检测。
每组重复3次。
②入胞实验：
Caco-2-N实验组：将trVLP复制子加到Caco-2-N细胞上，加入量为每孔0.05MOI，4℃预处理2h，达到吸附程度一致，PBS洗3遍，将药物重组粘蛋白1加至培养该细胞的培养基并混合，重组蛋白1在该培养基中的浓度为1μg/ml，然后在37℃反应1h(药物阻断在入胞的阶段)，PBS洗3遍，而后换上无病毒无药物的10％FBS的高糖DMEM培养基培养。
Caco-2-N阴性对照组：将trVLP复制子加到Caco-2-N细胞上，加入量为每孔0.05MOI，4℃预处理2h，达到吸附程度一致，PBS洗3遍，而后换上无病毒的10％FBS的高糖DMEM培养基培养。
Caco-2-N阳性对照组：将trVLP复制子加到Caco-2-N细胞上，加入量为每孔0.05MOI，4℃预处理2h，达到吸附程度一致，PBS洗3遍，将药物乳清蛋白混合物A17加至培养该细胞的培养基并混合，乳清蛋白混合物A17在该培养基中的浓度为1mg/ml，然后在37℃反应1h(药物阻断在入胞的阶段)，PBS洗3遍，而后换上无病毒无药物的10％FBS的高糖DMEM培养基培养。
Caco-2-N实验组、Caco-2-N阴性对照组和Caco-2-N阳性对照组培养48h，用Luciferase Cell Culture Lysis Reagent，5X(用ddH2O稀释至1X使用)裂解液收细胞(其中含粘附在细胞表面的病毒)，后续提取RNA，进行qRT-PCR检测，同时在荧光显微镜下观察GFP的表达情况。
Vero E6或者Huh7.5实验组：将SARS-CoV-2Luc假病毒加到Vero E6或者Huh7.5细胞上，650TCID50/孔，4℃预处理2h，达到吸附程度一致，PBS洗3遍，将药物1μg/ml重组粘蛋白1加至培养该细胞的培养基并混合，在37℃反应1h(药物阻断在入胞的阶段)，PBS洗3遍，而后换上无病毒无药物的10％FBS的高糖DMEM培养基培养。
Vero E6或者Huh7.5阴性对照组：将SARS-CoV-2Luc假病毒加到Vero E6或者Huh7.5细胞上，650TCID50/孔，4℃预处理2h，达到吸附程度一致，PBS洗3遍，而后换上无病毒的10％FBS的高糖DMEM培养基培养。
Vero E6或者Huh7.5阳性对照组：将SARS-CoV-2Luc假病毒加到Vero E6或者Huh7.5细胞上，650TCID50/孔，4℃预处理2h，达到吸附程度一致，PBS洗3遍，将1mg/ml的乳清蛋白混合物A17加至培养该细胞的培养基并混合，在37℃反应1h(药物阻断在入胞的阶段)，PBS洗3遍，而后换上无病毒无药物的10％FBS的高糖DMEM培养基培养。
Vero E6或者Huh7.5实验组、Vero E6或者Huh7.5阴性对照组和Vero E6或者Huh7.5阳性对照组培养24h时，用Luciferase Assay System进行检测。
每组重复3次。
③进入后实验：
Caco-2-N实验组：将病毒trVLP复制子加到Caco-2-N细胞上，每孔0.05MOI，在37℃反应1h，病毒充分进入细胞，PBS洗3遍，然后将药物重组粘蛋白1加至培养该细胞的培养基并混合，重组粘蛋白1在培养基中的浓度为1μg/ml，放入培养箱在37℃培养。
Caco-2-N阴性对照组：将病毒trVLP复制子加到Caco-2-N细胞上，每孔0.05MOI，在37℃反应1h，病毒充分进入细胞，PBS洗3遍，放入培养箱在37℃培养。
Caco-2-N阳性对照组：将病毒trVLP复制子加到Caco-2-N细胞上，每孔0.05MOI，在37℃反应1h，病毒充分进入细胞，PBS洗3遍，然后将药物乳清蛋白混合物A17加至培养该细胞的培养基并混合，乳清蛋白混合物A17在培养基中的浓度为1mg/ml，放入培养箱在37℃培养。
Caco-2-N实验组、Caco-2-N阴性对照组和Caco-2-N阳性对照组在培养48h、72h和96h三个时间段用Luciferase Cell Culture Lysis Reagent，5X(用ddH2O稀释至1X使用)裂解液收集细胞，后续提取RNA，进行qRT-PCR检测，同时用DAPI染细胞核用于在荧光显微镜下收集trVLP复制子GFP表达情况结果。
Vero E6或者Huh7.5实验组：将病毒SARS-CoV-2Luc假病毒加到Vero E6或者Huh7.5细胞上，650TCID50/孔，在37℃反应1h，病毒充分进入细胞，PBS洗3遍，然后将药物重组粘蛋白1加至培养该细胞的培养基并混合，重组粘蛋白1在该培养基中的浓度为1μg/ml，然后放入培养箱，在37℃培养。
Veto E6或者Huh7.5阴性对照组：将病毒SARS-CoV-2Luc假病毒加到Veto E6或者Huh7.5细胞上，650TCID50/孔，在37℃反应1h，病毒充分进入细胞，PBS洗3遍，然后放入培养箱，在37℃培养。
Vero E6或者Huh7.5阳性对照组：将病毒SARS-CoV-2 Luc假病毒加到Vero E6或者Huh7.5细胞上，650TCID50/孔，在37℃反应1h，病毒充分进入细胞，PBS洗3遍，然后将药物乳清蛋白混合物A17加至培养该细胞的培养基并混合，乳清蛋白混合物A17在该培养基中的浓度为1mg/ml，然后放入培养箱，在37℃培养。
Vero E6或者Huh7.5实验组、Veto E6或者Huh7.5阴性对照组和Vero E6或者Huh7.5阳性对照组在培养24h时利用Luciferase Assay System检测得到数值。
每组重复3次。
上述实验数据处理方法如下。
SARS-CoV-2 RNA相对表达量计算方法：
Caco-2-N实验组、Caco-2-N阴性对照组和Caco-2-N阳性对照组：通过qRT-PCR检测SARS-CoV-2和RPS11(内参)RNA表达量，将阴性对照组的检测结果标化为1。
抑制率计算方法：
Vero E6或者Huh7.5实验组、Vero E6或者Huh7.5阴性对照组和Vero E6或者Huh7.5阳性对照组：利用Luciferase Assay System检测得到数值，Vero E6或者Huh7.5实验组或Vero E6或者Huh7.5阳性对照组的数值除以Vero E6或者Huh7.5阴性对照组的数值，乘以100％，从而得到相应处理组的感染率，相应处理组的抑制率(％)＝100％-感染率(％)。
2)结果分析
结果如图4所示。
图4A和图4B为Caco-2-N实验组、Caco-2-N阴性对照组和Caco-2-N阳性对照组的实验结果，其中，粘蛋白1(1μg/ml)为Caco-2-N实验组结果，阴性对照(trVLP)为Caco-2-N阴性对照组结果，阳性对照为Caco-2-N阳性对照组结果。吸附实验中，具体数据如表2所示，Caco-2-N阳性对照组的RNA相对表达量平均值为1；Caco-2-N实验组RNA相对表达量平均值为0.047，Caco-2-N阳性对照组RNA相对表达量平均值为0.077。入胞实验中，具体数据如表3所示，Caco-2-N阳性对照组的RNA相对表达量平均值为1；Caco-2-N实验组RNA相对表达量平均值为0.189，Caco-2-N阳性对照组RNA相对表达量平均值为0.005。进入后实验中，具体数据如表4所示，Caco-2-N阳性对照组48h、72h和96h三个时间段的RNA相对表达量平均值依次为0.002、0、0；Caco-2-N实验组48h、72h和96h三个时间段的RNA相对表达量平均值依次为0.04、1.33、16.4，Caco-2-N阳性对照组48h、72h和96h三个时间段的RNA相对表达量平均值依次为1、5.07、20.7。
在吸附实验和入胞实验中，相较于阴性对照组，实验组病毒SARS-CoV-2RNA的相对表达量明显降低，在进入后实验中，在48h、72h和96h三个时间段，实验组的GFP表达都少于阴性对照组，但GFP也在逐步增多，表明进入后抑制效果有但不显著，尤其是在96h时，病毒RNA表达量无显著性差异。说明重组粘蛋白1可抑制trVLP SARS-CoV-2复制子活病毒感染细胞的吸附和进入，但进入后抑制效果不佳。
表2吸附实验RNA相对表达量
重复 Caco-2-N阳性对照组 Caco-2-N实验组 Caco-2-N阳性对照组
1 0.84 0.03 0.05
2 1.17 0.05 0.08
3 0.987 0.06 0.09
表3入胞实验RNA相对表达量
重复 Caco-2-N阳性对照组 Caco-2-N实验组 Caco-2-N阳性对照组
1 1.17 0.19 0.005
2 0.94 0.23 0.004
3 0.88 0.15 0.005
表4入胞后实验RNA相对表达量(Caco-2-N细胞结果)
图4C为Vero E6或者Huh7.5实验组、Vero E6或者Huh7.5阴性对照组和Vero E6或者Huh7.5阳性对照组的实验结果，其中，粘蛋白1(1μg/ml)为Vero E6(Vero)或者Huh7.5实验组结果，阴性对照(SARS-CoV-2Luc假病毒)为Vero E6(Vero)或者Huh7.5阴性对照组结果，阳性对照为Vero E6(Vero)或者Huh7.5阳性对照组结果，进入后实验为进入后24h的实验结果。吸附实验的具体数据见表5，Huh7.5实验组的平均抑制率为91％，Vero E6实验组的平均抑制率为98％，Huh7.5阴性对照组的平均抑制率为-3％，Vero E6阴性对照组的平均抑制率为0％，Huh7.5阳性对照组的平均抑制率为96％，Vero E6阳性对照组的平均抑制率为99％。入胞实验的具体数据见表6，Huh7.5实验组的平均抑制率为52％，Vero E6实验组的平均抑制率为68％，Huh7.5阴性对照组的平均抑制率为0％，Vero E6阴性对照组的平均抑制率为0％，Huh7.5阳性对照组的平均抑制率为100％，Vero E6阳性对照组的平均抑制率为100％。进入后实验的具体数据见表7，Huh7.5实验组的平均抑制率为100％，Vero E6实验组的平均抑制率为97％，Huh7.5阴性对照组的平均抑制率为0％，Vero E6阴性对照组的平均抑制率为0％，Huh7.5阳性对照组的平均抑制率为99％，Vero E6阳性对照组的平均抑制率为99％。表明重组粘蛋白1可抑制SARS-CoV-2假病毒感染细胞的吸附和进入。
表5吸附实验抑制率(％)
表6入胞实验抑制率(％)
表7进入后实验抑制率(％)
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 北京大学
<120> 粘蛋白1在抑制冠状病毒中的应用
<130> 212149
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 145
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Ala Pro Lys Pro Ala Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser
1 5 10 15
Thr Pro Gly Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val
20 25 30
Pro Ser Ser Thr Glu Lys Asn Ala Phe Asn Ser Ser Leu Glu Asp Pro
35 40 45
Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu Leu Gln Arg Asp Ile Ser Glu Met Phe
50 55 60
Leu Gln Ile Tyr Lys Gln Gly Gly Phe Leu Gly Leu Ser Asn Ile Lys
65 70 75 80
Phe Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala Phe Arg Glu
85 90 95
Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn Gln Tyr Lys
100 105 110
Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp Val Ser Val
115 120 125
Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala Gly Val Pro
130 135 140
Gly
145

Claims (5)

1.粘蛋白1在如下任一中的应用：
（A1）制备抑制冠状病毒感染的产品；
（A2）制备治疗和/或预防由冠状病毒感染所致疾病的产品；
所述冠状病毒为SARS-CoV-2。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述冠状病毒感染为SARS-CoV-2吸附和/或进入细胞。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述由冠状病毒感染所致疾病为2019新型冠状病毒肺炎。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述产品为药品。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述药品为液体制剂或固体制剂。
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