CN101433718A - 可生物降解的载有血红蛋白的聚肽囊泡及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种载有血红蛋白的聚肽囊泡及其制备方法。该囊泡中包裹有血红蛋白，囊泡的壁由聚赖氨酸－聚苯丙氨酸两嵌段共聚肽构成。首先以正己胺为引发剂，进行N－苄氧羰基(Z)赖氨酸N－羰基羧酸酐的开环聚合得到聚(Z－赖氨酸)，接着用聚(Z－赖氨酸)的端氨基引发苯丙氨酸N－羰基羧酸酐开环聚合得到聚(Z－赖氨酸)－聚苯丙氨酸，将其脱保护后，在水溶液中进行自组装形成囊泡并包裹血红蛋白，得到载有血红蛋白的囊泡。由于该囊泡是由两亲性嵌段共聚肽在水溶液中直接组装形成的，不需要使用有机溶剂，较好地保持了血红蛋白的生物活性。

Description

可生物降解的载有血红蛋白的聚肽囊泡及其制备方法

技术领域

本发明涉及可生物降解载有血红蛋白的聚肽囊泡及其制备方法，特别是血红蛋白的可生物降解的两亲性嵌段共聚肽囊泡及其制备方法，属于生物医用材料领域。

背景技术

输血对于临床手术、抗灾和战场救护是不可缺少的医疗手段。靠人献血不仅面临血源短缺问题，而且由于血型复杂，输血必须进行严格的配型，同时血液要低温储存，保存期短，运输不便，更为严重的是肝炎、艾滋病等病毒的污染使输血安全受到威胁。近年来，血液需求量不断增高，而安全有效的血源却日益紧缺。因此，近几十年来血液代用品一直是国际科学界和企业界关注的研究开发热点。血液代用品，是指具有血红细胞功能的人工制剂。理想的血液代用品应当具有天然红细胞的传递氧功能、生物相容性、安全性和稳定性。即：1)具有较高的携氧能力，氧分压在正常生理范围内，能有效向组织供氧；2)与血液所有组分具有良好的生物相容性；3)能维持血液渗透压、酸碱平衡、粘稠度和血容量；4)无免疫原性(无致敏原性)、无血液病原微生物污染、无热源；5)体内循环半寿期在24h以上，在正常灌注条件下不产生肾毒性等副作用；6)在低温条件下，产品保质期大于6个月；7)具有预期的可清除性。

研究血液代用品的关键是如何取得血液中红细胞的输送氧的功能。由于红细胞中的血红蛋白具有高效的载氧能力和维持胶体渗透压的功能，当前各国都将研制基于血红蛋白的携氧剂作为血液代用品研究开发的主攻方向。血红蛋白是一个四聚体，由四个亚基(2个α链，2个β链)组成，整个分子外形像一个四面体，呈C2点群对称。血红素辅基位于分子表面的孔穴内，每个亚基一个。四个氧的结合部位彼此保持一定的距离，两个最近的铁原子之间距离为2.5nm。四个亚基凹凸互补，形成一个长宽高分别为6.4nm、5.5nm、5nm的四面体(结构见图2)。但未经修饰的血红蛋白不能作为血液代用品，因为游离的血红蛋白分子容易经由血管壁渗出，也容易与血管内皮细胞的松弛因子NO相吸附，引起血管收缩，造成血压增高、代谢异常以及轻度的神经性副作用。基于血红蛋白的血液代用品的发展过程分为三代。第一代是用小分子修饰血红蛋白。第二代为血红蛋白分子与超氧化物歧化酶等红细胞内的酶交联形成的偶联物。这两种经过修饰的血红蛋白以单个的血红蛋白分子为基本单元，因而无法避免单纯血红蛋白的缺点，输入体内后往往造成血液渗透压升高和大量高铁血红蛋白的形成，还可能与NO结合造成血管收缩、血压升高，循环半衰期也太短(10～20h)。从90年代初期到现在，研究者们致力于第三代红血球代用品的开发，它们与第一代和第二代明显的区别是在携氧单元外面用膜包覆，使之更加接近红细胞的实际结构，避免携氧单元与免疫系统直接接触，这种体系被称作HbV(HemeglobinVehicle)。用于HbV的膜材目前主要是脂质体和白蛋白，其中又以脂质体的研究最多。近年来，用生物降解聚合物作为HbV膜材的研究受到了越来越多的重视。与脂质体相比，生物降解聚合物有着独特的优点。首先，聚合物具生物可降解性，在完成输氧任务后，最终可降解为对人体无害的水和CO₂排出体外；其次，聚合物的结构容易控制，可以通过控制聚合物的结构来调控HbV的大小和聚集方式等；最后，聚合物在强度上也优于磷脂膜，所以在相同条件下聚合物膜材的用量要少于磷脂膜。白蛋白也是一种可生物降解的材料，但作为一种天然蛋白质，它的免疫原性和排异反应难以解决。最近申请的中国专利(申请号200810050914.3，“一种生物降解的键合了血红蛋白分子的纳米粒子及制法”)披露了一种以聚乙二醇-聚碳酸酯-聚乳酸为载体的红血球替代物，其中的血红蛋白分子化学键合在聚碳酸酯嵌段上，因而在水体系中以纳米胶束的形式存在，血红蛋白处于胶束的亲水外壳和疏水内核之间，虽然有携氧功能，但在整体构造上同血红蛋白仍有一定差距。

发明内容

本发明利用聚赖氨酸和聚苯丙氨酸的两嵌段共聚肽囊泡来包裹血红蛋白，试图将血红蛋白包裹在囊泡之中，以求在整体结构上更接近于人体的血红细胞。

本发明目的之一是提供的可生物降解载有血红蛋白的聚肽囊泡。其为一种载有血红蛋白的可生物降解的两亲性嵌段共聚肽囊泡。如附图1所示，该囊泡的内部水相中含有CO保护的血红蛋白，囊泡的壁由可生物降解的聚赖氨酸-聚苯丙氨酸两嵌段共聚肽构成；其中聚赖氨酸段的分子量在5000～10000范围，聚苯丙氨酸段的分子量在800～2000范围，囊泡的直径大小在0.5～10μm范围，血红蛋白在囊泡中的质量百分数为10～50％。

本发明的另一目的是提供这种载有血红蛋白的可生物降解的两亲性嵌段共聚肽囊泡的制备方法，包括以下步骤：

1)合成端氨基的聚(N-苄氧羰基赖氨酸)

以正己胺为引发剂，引发N-苄氧羰基赖氨酸N-羰基羧酸酐开环聚合得到聚(N-苄氧羰基赖氨酸)，所用的聚合溶剂为甲苯、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或二氧六环，其用量是N-苄氧羰基赖氨酸N-羰基羧酸酐单体质量的5～30倍，反应24～120小时，聚合温度为25～40℃；

2)合成聚(N-苄氧羰基赖氨酸)和聚苯丙氨酸的两嵌段共聚物

以端氨基的聚(N-苄氧羰基赖氨酸)为引发剂，引发苯丙氨酸N-羰基羧酸酐开环聚合得到目标物；所用聚合溶剂为甲苯、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或二氧六环，其用量是聚(N-苄氧羰基赖氨酸)和苯丙氨酸N-羰基羧酸酐单体总质量的10～50倍，反应12～72小时，聚合温度为25～40℃；

3)将侧基保护的两嵌段共聚肽脱保护得到聚赖氨酸和聚苯丙氨酸的两嵌段共聚物

将含侧基保护的两嵌段共聚肽溶于四氢呋喃、二氧六环、三氟乙酸、硝基甲烷、苯、二氧化硫或它们的混合溶剂中，侧基保护的两嵌段共聚肽的质量浓度为2～20％，通入溴化氢气体，鼓泡反应10～30分钟，继续冰浴搅拌反应1～12小时，然后用乙醚沉降，过滤，真空干燥，得到聚赖氨酸和聚苯丙氨酸的两嵌段共聚物；

4)在缓冲溶液中用得到的聚赖氨酸和聚苯丙氨酸的两嵌段两嵌段共聚肽形成的囊泡包裹CO保护的血红蛋白，形成载有血红蛋白的囊泡，其具体步骤是：

①将血红蛋白溶于pH值为6.8～4.0的PBS缓冲溶液中，浓度1～5mg/ml；

②取上述血红蛋白溶液，置于三口容器中，加入摩尔浓度为0.05～0.5mol/l的抗坏血酸(L-Asc)/PBS溶液，使抗坏血酸与血红蛋白的摩尔比为4～20；

③在搅拌条件下，在液面上方通过一氧化碳气流，或者直接在溶液中通CO气体鼓泡，持续1～4小时，待紫外检测550nm左右的峰不再变化为止，得到鲜红色的CO保护血红蛋白(CO-Hb)溶液；

④取CO-Hb溶液，浓度为1～5mg/ml，将pH值调到6.8～4.0，再加入所述的两嵌段共聚肽，该两嵌段共聚肽的质量为溶液中CO-Hb质量的0.5～2倍，搅拌12～24小时，整个过程中体系用氮气保护；

⑤将步骤④的得到的溶液离心分离，离心转速5000～10000转/分，时间5～30分钟，并用PBS溶液洗涤，洗涤后取上层清液用紫外光谱扫描，至洗出液在400～600nm无吸收峰为止，将离心下来的胶束仍分散于PBS溶液中避光保存备用。

有益效果：本发明使用聚赖氨酸和聚苯丙氨酸的两嵌段共聚物作为囊体材料。它具有两亲性，又能够直接溶解在水溶液中，因而容易自组装成为微米级的囊泡，克服了以往囊泡制备过程中需要有机溶剂的缺点，较好地保持了蛋白质的生物活性。它有较低的临界胶束浓度，稳定性比脂质体包裹血红蛋白的体系要好得多。

本发明使用的囊体材料本身是聚氨基酸，具有与蛋白质相类似的化学结构，和细胞、组织以及其它生物成分具有良好的相容性；同时易受酶的作用，降解生成无毒的多肽或氨基酸，被人体吸收，因而具有优良的生物降解性；另外通过改变材料的组成不仅可以改变材料的降解速度，而且可以改变所形成的囊泡的大小。所形成的囊泡具有中空结构，对其中的血红蛋白起隔离和保护作用，避免了血红蛋白被血液中的其它氧化剂氧化，或者被免疫系统攻击，因而可能有较长体内循环时间。

本发明中包裹在囊泡中的血红蛋白仍然有结合氧气的能力，并且可以与一氧化碳循环。如附图3所示，上述CO-Hb在光照下通入氧气，其紫外光谱中吸收峰从419nm移到405nm，再通入一氧化碳，则发生相反的光谱变化，证明包裹血红蛋白的囊泡可以作为携氧单元使用。

附图说明

图1：载有血红蛋白的两嵌段共聚肽囊泡的结构示意图。

图2：血红蛋白的结构示意图。

图3：携氧能力测试的紫外光谱图。图中，在包裹有CO-Hb的囊泡溶液中光照下通入氧气，紫外光谱吸收峰从419nm移到405nm。

图4：聚赖氨酸和聚苯丙氨酸的两嵌段共聚物的核磁氢谱。

具体实施方式

实施例1：端氨基聚(N-苄氧羰基赖氨酸)(PZLL)的合成

将2.0g的N-苄氧羰基赖氨酸NCA放入用火焰烘烤过的安瓶内，用氮气换气三次，密封后用注射器加入20ml DMF，溶解之后，按比例加入正己胺的DMF溶液，搅拌下在30℃油浴中反应72h。反应物用过量的乙醚沉降后，得到透明粘性的PZLL，将此粘性物质重新溶解在氯仿中，用过量的乙醚沉降，得白色固体。40℃下真空干燥24小时即得到纯的末端氨基的PZLL。

实施例2：聚(Z-赖氨酸)-聚苯丙氨酸两嵌段共聚肽(PZLL-b-PPA)的合成

将末端氨基的聚(Z-赖氨酸)和苯丙氨酸NCA按比例加入到用火焰烘烤过的安瓶内，用氮气换气三次，密封后用注射器加入DMF(2wt％)，搅拌下在30℃油浴中反应24h，之后处理过程如实施例1所示。

实施例3：PZLL-b-PPA的脱保护

PZLL-b-PPA的脱保护是用溴化氢来实现的。PZLL-b-PPA溶于三氟乙酸(0.04g/ml)中，再通入溴化氢气体，鼓泡反应30分钟，继续冰浴搅拌反应12小时，用过量乙醚沉降，得到脱保护后的产物。40℃下真空干燥24小时即得到聚赖氨酸-聚苯丙氨酸(PLL-b-PPA)，其核磁氢谱见附图4。

实施例4：载有CO保护的血红蛋白的囊泡的制备方法，步骤如下：

(1)500mg血红蛋白溶于250ml PBS缓冲溶液中，取100ml置于三口瓶中，加入250μl的L-Asc抗坏血酸溶液(0.1mol/l的PBS溶液)，缓慢搅拌下在液面上方通过一氧化碳气流，持续大约2h左右，至紫外检测550nm左右的峰不再变化为止，得到鲜红色的CO保护血红蛋白溶液(CO-Hb)。

(2)先取CO-Hb溶液(2mg/ml PBS，pH5.8)1ml，加入2.5mg的聚合物，搅拌12h。整个过程中体系需用氮气保护。结束后将此混合溶液以10000r/min转速离心分离，并用PBS溶液洗涤数次，每次洗涤后取上层清液用紫外光谱扫描，至洗出液在400～600nm无吸收峰为止。将离心下来的囊泡仍分散于PBS溶液中避光保存备用。

实施例5：端氨基聚(N-苄氧羰基赖氨酸)(PZLL)的合成

将2.0g的N-苄氧羰基赖氨酸NCA放入用火焰烘烤过的安瓶内，用氮气换气三次，密封后用注射器加入60ml二氯甲烷，溶解之后，按比例加入正己胺的二氯甲烷溶液，搅拌下在40℃油浴中反应120h。反应物用过量的乙醚沉降后，得到透明粘性的PZLL，将此粘性物质重新溶解在氯仿中，用过量的乙醚沉降，得白色固体。40℃下真空干燥24小时即得到纯的末端氨基的PZLL。

实施例6：聚(Z-赖氨酸)-聚苯丙氨酸两嵌段共聚肽(PZLL-b-PPA)的合成

将末端氨基的聚(Z-赖氨酸)和苯丙氨酸NCA按比例加入到用火焰烘烤过的安瓶内，用氮气换气三次，密封后用注射器加入二氯甲烷(10wt％)，搅拌下在40℃油浴中反应72h。反应物用过量的乙醚沉降后，得到PZLL-b-PPA，将此粘性物质重新溶解在氯仿中，用过量的乙醚沉降，得白色固体。40℃下真空干燥24小时即得到纯的末端氨基的PZLL-b-PPA。

实施例7：PZLL-b-PPA的脱保护

PZLL-b-PPA溶于二氧六环(0.2g/ml)中，再通入溴化氢气体，鼓泡反应10分钟，继续冰浴搅拌反应1小时，用过量乙醚沉降，得到脱保护后的产物。40℃下真空干燥24小时即得到聚赖氨酸-聚苯丙氨酸(PLL-b-PPA)。

实施例8：载有CO保护的血红蛋白的囊泡的制备方法，步骤如下：

(1)500mg血红蛋白溶于100ml PBS缓冲溶液中，取100ml置于三口瓶中，加入250μl的L-Asc抗坏血酸溶液(0.5mol/l的PBS溶液)，缓慢搅拌下在液面上方通过一氧化碳气流，持续大约4h左右，至紫外检测550nm左右的峰不再变化为止，得到鲜红色的CO保护血红蛋白溶液(CO-Hb)。

(2)先取CO-Hb溶液(5mg/ml PBS，pH6.8)1ml，加入2.0mg的聚合物，搅拌24h。整个过程中体系需用氮气保护。结束后将此混合溶液以12000r/min转速离心分离，并用PBS溶液洗涤数次，每次洗涤后取上层清液用紫外光谱扫描，至洗出液在400～600nm无吸收峰为止。将离心下来的囊泡仍分散于PBS溶液中避光保存备用。

实施例9：端氨基聚(N-苄氧羰基赖氨酸)(PZLL)的合成

将2.0g的N-苄氧羰基赖氨酸NCA放入用火焰烘烤过的安瓶内，用氮气换气三次，密封后用注射器加入40ml二氧六环，溶解之后，按比例加入正己胺的二氧六环溶液，搅拌下在25℃油浴中反应24h。反应物用过量的乙醚沉降后，得到PZLL，将此粘性物质重新溶解在氯仿中，用过量的乙醚沉降，得白色固体。40℃下真空干燥24小时即得到纯的末端氨基的PZLL。

实施例10：聚(Z-赖氨酸)-聚苯丙氨酸两嵌段共聚肽(PZLL-b-PPA)的合成

将末端氨基的聚(Z-赖氨酸)和苯丙氨酸NCA按比例加入到用火焰烘烤过的安瓶内，用氮气换气三次，密封后用注射器加入二氧六环(5wt％)，搅拌下在25℃油浴中反应12h。反应物用过量的乙醚沉降后，得到PZLL-b-PPA，将此粘性物质重新溶解在氯仿中，用过量的乙醚沉降，得白色固体。40℃下真空干燥24小时即得到纯的末端氨基的PZLL-b-PPA。

实施例11：PZLL-b-PPA的脱保护

PZLL-b-PPA溶于三氟乙酸(0.02g/ml)中，再通入溴化氢气体，鼓泡反应20分钟，继续冰浴搅拌反应6小时，用过量乙醚沉降，得到脱保护后的产物。40℃下真空干燥24小时即得到聚赖氨酸-聚苯丙氨酸(PLL-b-PPA)。

实施例12：载有CO保护的血红蛋白的囊泡的制备方法，步骤如下：

(1)500mg血红蛋白溶于500ml PBS缓冲溶液中，取100ml置于三口瓶中，加入250μl的L-Asc抗坏血酸溶液(0.05mol/l的PBS溶液)，向液体底部通入一氧化碳气流，鼓泡反应2h左右，至紫外检测550nm左右的峰不再变化为止，得到鲜红色的CO保护血红蛋白溶液(CO-Hb)。

(2)先取CO-Hb溶液(2mg/ml PBS，pH5.8)1ml，加入1mg的聚合物，搅拌18h。整个过程中体系用氮气保护。结束后将此混合溶液以10000r/min转速离心分离，并用PBS溶液洗涤数次，每次洗涤后取上层清液用紫外光谱扫描，至洗出液在400～600nm无吸收峰为止。将离心下来的囊泡仍分散于PBS溶液中避光保存备用。

实施例13：反应条件同实施例1、2、3和4，但实施例1、2中所用的溶剂改为二甲亚砜。

实施例14：反应过程同实施例1、2、3和4，但实施例4中溶解血红蛋白所用的磷酸缓冲液的pH值为3.8。

Claims (2)

1、载有血红蛋白的聚肽囊泡，其特征在于，其为一种载有血红蛋白的可生物降解的两亲性嵌段共聚肽囊泡；该囊泡的内部水相中含有CO保护的血红蛋白，囊泡的壁由可生物降解的聚赖氨酸-聚苯丙氨酸两嵌段共聚肽构成；其中聚赖氨酸段的分子量在5000～10000范围，聚苯丙氨酸段的分子量在800～2000范围，囊泡的直径大小在0.5～10μm范围，血红蛋白在囊泡中的质量百分数为10～50％。

2、如权利要求1所述的载有血红蛋白的聚肽囊泡的制备方法，其步骤和条件如下：

1)合成端氨基的聚(N-苄氧羰基赖氨酸)

以正己胺为引发剂，引发N-苄氧羰基赖氨酸N-羰基羧酸酐开环聚合得到聚(N-苄氧羰基赖氨酸)，所用的聚合溶剂为甲苯、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或二氧六环，其用量是N-苄氧羰基赖氨酸N-羰基羧酸酐单体质量的5～30倍，反应24～120小时，聚合温度为25～40℃；

2)合成聚(N-苄氧羰基赖氨酸)和聚苯丙氨酸的两嵌段共聚物

以端氨基的聚(N-苄氧羰基赖氨酸)为引发剂，引发苯丙氨酸N-羰基羧酸酐开环聚合得到目标物；所用聚合溶剂为甲苯、氯仿、二氯甲烷、四氢呋喃、N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或二氧六环，其用量是聚(N-苄氧羰基赖氨酸)和苯丙氨酸N-羰基羧酸酐单体总质量的10～50倍，反应12～72小时，聚合温度为25～40℃；

3)将侧基保护的两嵌段共聚肽脱保护得到聚赖氨酸和聚苯丙氨酸的两嵌段共聚物

将含侧基保护的两嵌段共聚肽溶于四氢呋喃、二氧六环、三氟乙酸、硝基甲烷、苯、二氧化硫或它们的混合溶剂中，侧基保护的两嵌段共聚肽的质量浓度为2～20％，通入溴化氢气体，鼓泡反应10～30分钟，继续冰浴搅拌反应1～12小时，然后用乙醚沉降，过滤，真空干燥，得到聚赖氨酸和聚苯丙氨酸的两嵌段共聚物；

4)在缓冲溶液中用得到的聚赖氨酸和聚苯丙氨酸的两嵌段两嵌段共聚肽形成的囊泡包裹CO保护的血红蛋白，形成载有血红蛋白的囊泡，其具体步骤是：

①将血红蛋白溶于pH值为6.8～4.0的PBS缓冲溶液中，浓度1～5mg/ml；

②取上述血红蛋白溶液，置于三口容器中，加入摩尔浓度为0.05～0.5mol/l的抗坏血酸(L-Asc)/PBS溶液，使抗坏血酸与血红蛋白的摩尔比为4～20；

③在搅拌条件下，在液面上方通过一氧化碳气流，或者直接在溶液中通CO气体鼓泡，持续1～4小时，待紫外检测550nm左右的峰不再变化为止，得到鲜红色的CO保护血红蛋白(CO-Hb)溶液；

④取CO-Hb溶液，浓度为1～5mg/m1，将pH值调到6.8～4.0，再加入所述的两嵌段共聚肽，该两嵌段共聚肽的质量为溶液中CO-Hb质量的0.5～2倍，搅拌12～24小时，整个过程中体系用氮气保护；

⑤将步骤④的得到的溶液离心分离，离心转速5000～10000转/分，时间5～30分钟，并用PBS溶液洗涤，洗涤后取上层清液用紫外光谱扫描，至洗出液在400～600nm无吸收峰为止，将离心下来的胶束仍分散于PBS溶液中避光保存备用。

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