CN101306196B - 一种生物降解的键合了血红蛋白分子的纳米粒子及制法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于一种生物降解的键合了血红蛋白分子的纳米粒子及制备方法。使用侧链含有羧基、氨基、羟基、叁键等活性官能团的聚乙二醇-聚酯类共聚物，通过先自组装成胶束再键合血红蛋白分子，或者先键合血红蛋白分子然后自组装的方法得到化学键合血红蛋白的纳米粒子体系。本发明所制得的纳米粒子，粒径在80-800nm，血红蛋白含量相对于纳米粒子重量100-500wt％，溶液黏度1-4MPs，盐浓度50-200mM，pH值7.0-7.6，氧气亲和度6-50mmHg，血红蛋白稳定半衰期15-24hr。所制得的键合血红蛋白的纳米粒子可用做人工氧气传输体，红血球模拟物，应用于临床输血以及心脑血管疾病的治疗。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物降解的键合了血红蛋白分子的纳米粒子及制法。
技术背景
输血作为一种生命救治和人体机能维持的重要手段，已经广泛应用于临床实践当中。然而传统的输血措施存在着较大弊端。诸如血型的测试昂贵耗时，寻找相同血型的献血者有时很困难；医院库存的新鲜血液通常只能在4℃下保存3个星期；献血者日趋减少，血库存血严重短缺；更为严重的是，通过输血和其他血液制品造成的病毒传染，如艾滋病毒，肝炎病毒等。因此，制造一种安全，高效，并且能被迅速应用于紧急突发事件的人造血液，已经成为一个紧迫的任务。
在红血球细胞膜内包含着浓度为35％的血红蛋白(Hemoglobin，Hb)，这是氧气传输的核心物质。纯粹精制的血红蛋白分子不能直接用于人体输血，因为它在血液循环过程中会解离为分子量更小的两个亚基单元，从而引起严重的肾脏损害。为此，曾对血红蛋白分子进行分子内交联、分子间聚合或表面PEG修饰(Transfusion，1990，30，516-520；Artificial Organs，2004，28，800-806)。这样的改进可以有效地减少对肾脏的损害，然而，由于血红蛋白分子同血管内皮细胞分泌的血管舒张因子(NO)有较强的吸附作用，引起NO含量减少，从而导致血压升高、代谢异常等副作用。
近年来，模拟红细胞的结构特征，开发以高分子材料包裹血红蛋白的细胞型人造红血球成为了该领域研究的主流。加拿大的TMSChang曾报道了使用聚乙二醇-聚乳酸胶囊包裹的血红蛋白分子(Aritf Cells Blood Substit Immobil Biotechnol，2003，31，231-247)，胶囊直径100nm左右，血液中的半衰期接近24小时，但必须对胶囊进行交联。日本的土田英俊(Tsuchida Eishun)等推出了细胞型血红蛋白载体(血红蛋白胶囊HbV)。它主要利用磷脂双分子膜包裹高浓度的血红蛋白分子形成250nm左右的细胞状微粒(Bioconjugate Chem，2000，11，372-379)。HbV不会从血管渗出，也没有血型，还可在室温长期保存。从目前来看，胶囊型人造红血球价格上不具备优势，尤其是磷脂价格昂贵，工艺也比较复杂，物理包裹的形式也无法避免血红蛋白的突释现象。
双亲性的嵌段共聚物或接枝共聚物通过自组装可以形成纳米至微米尺度的胶束、胶囊(囊泡)以及形状、结构各异的其它聚集体。控制共聚物中亲水链段和疏水链段的结构和长度，可以获得很低的临界胶束浓度，因而相对于小分子胶束或胶囊，如脂质体，这些高分子聚集体在人体条件下不需要特殊的稳定化措施就能够稳定存在。许多生物降解的高分子及其共聚物独有这种自组装功能，因而这些组装体在人体条件下可以完全生物降解，无毒性，无残留，也无免疫原性，适合在体内使用。
发明内容
本发明是模拟红血球的细胞结构，用乳酸类嵌段共聚物做血红蛋 白的载体，构筑聚合物/血红蛋白纳米胶束或胶囊。与脂质体胶囊相比，共聚物胶束或胶囊的力学强度高，稳定性好，在血液循环的条件下，破损少，寿命长，而且可以生物降解。血红蛋白无论处于胶束的内核/外壳界面还是包裹在胶囊之中，都得到有效保护。化学键合将大大提高血红蛋白稳定性，减少单个血红蛋白分子的逃逸或渗出，减轻肾脏、肝脏以及血压增高的负担。保持血红素的局部化学和生理环境不变，从而保留它在原始红血球中的氧气结合和释放功能，成为红血球的有效替代物。
本发明的目的是提供一种生物降解的键合了血红蛋白分子的纳米粒子及制法。
一种生物降解的键合了血红蛋白分子的纳米粒子，其成分和质量配比如下：
聚乙二醇∶聚酯∶聚碳酸酯∶聚氨基酸∶血红蛋白为1-13∶1-20∶0-10∶0-10∶2-165；
所述的聚乙二醇分子量为800-10000；
所述的聚酯为聚乳酸或聚己内酯，分子量为600-10000；
所述的聚碳酸酯为侧链含有叁键、羧基、氨基、羟基的环状碳酸酯聚合物；
所述的聚氨基酸为通过α-氨基酸-N-羧基内酸酐(N-carboxyanhydride，NCA)开环聚合得到的聚氨基酸；α-氨基酸包括谷氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或精氨酸；
血红蛋白与纳米粒子载体的质量比为1-5∶1；
所述的血红蛋白分子与聚乙二醇-聚酯-聚碳酸酯-聚氨基酸共聚物之间利用叁键、羧基、氨基、羟基连接；所述的血红蛋白分子固定在事先自组装的纳米胶束表面；或者，将血红蛋白分子键合在双亲性可降解高分子的侧链上，然后通过自组装得到纳米胶束或胶囊。
所述的纳米粒子可以以溶液形式或冻干粉形式保存。
所述的纳米粒子可以可逆的结合和解离氧气，其氧气结合态半衰期为15-24小时，氧气亲和度为6-50mmHg(室温)。
本发明的配方含有的血红蛋白、聚乙二醇、聚乳酸、聚己内酯、聚碳酸酯、聚α-氨基酸、磷酸-生理盐水缓冲溶液，可以以溶液或冷冻干粉的形式保存。
本发明中使用血红蛋白为氧气传输的主体，选用精制的人血红蛋白、牛血红蛋白、猪血红蛋白、马血红蛋白以及鼠血红蛋白等其他动物性血红蛋白分子，以及其他蛋白质如人血清白蛋白等。血红蛋白在使用前需通过一氧化碳气体来保护其中的铁原子不被氧化。
本发明中使用的高分子载体以聚乙二醇-聚酯类共聚物为主体。聚乙二醇为高亲水性聚合物，无毒可降解，具有极高的生物相容性。在本发明中，聚乙二醇除了为纳米粒子提供亲水外层、增加纳米粒子水溶性以外，还可以在血液循环过程中防止其他蛋白质、酶、多肽等生物活性物质对纳米粒子的吸附，同时，聚乙二醇的存在可以有效地屏蔽人体网状内皮系统(RES)对纳米粒子的吞噬和排异，延长纳米 粒子在血液中的循环时间。
本发明中，聚酯类聚合物用作纳米粒子的内核，主要选用聚乳酸或聚己内酯等具有高度生物相容性的生物可降解的聚酯化合物，采取均聚或共聚的方式来调节聚酯嵌段的柔性以及降解速率。
本发明使用六元环状碳酸酯为聚酯嵌段的共聚组分，主要为聚酯类聚合物引入反应性侧链。环状碳酸酯由具有1，3丙二醇结构的小分子单体与氯甲酸乙酯反应得到，其环上分别带有被保护的羧基、羟基、氨基，以及叁键等活性官能团。共聚反应结束后，脱去保护集团后，即可得到含有羧基、羟基、氨基和叁键的聚乙二醇-聚酯共聚物。
本发明使用多官能团的聚α-氨基酸为聚酯嵌段另一种共聚组分，主要为聚酯类聚合物引入反应性侧链。多官能团的α-氨基酸包括谷氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、精氨酸，经与光气反应获得α-氨基酸-N-羧基内酸酐(N-carboxy anhydride，NCA)，然后通过开环聚合连接到聚酯末端，脱去α位置外的官能团保护，得到侧链含有羧基、氨基以及羟基的聚乙二醇-聚酯共聚物。
本发明的一种生物降解的键合了血红蛋白分子的纳米粒子的制法的步骤和条件如下：
按配比，使用分子量800-10000的单末端羟基的聚乙二醇，交酯或内酯单体、环状碳酸酯单体以及α-氨基酸-N-羧基内酸酐，质量配比为：聚乙二醇∶交酯、内酯单体∶环状碳酸酯单体∶α-氨基酸-N-羧基内酸酐＝1-13∶1-20∶0-10∶0-10，在二乙基锌或辛酸亚锡金属有机催化剂的催化下，反应温度为室温到120度，反应时间为12-48小时，制得聚乙二醇-聚酯共聚物；
将该共聚物溶于有机溶剂四氢呋喃或DMF，通过对水透析或者滴加的方式获得自组装的纳米粒子溶液，使用架桥试剂二环己基碳二亚胺(DCC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCl)或-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)与一氧化碳化的血红蛋白磷酸缓冲溶液混合，在室温下反应，将经过叠氮化的血红蛋白分子与纳米粒子表面的叁键连接，最终获得表层键合血红蛋白的纳米粒子；或者通过点击化学反应(click reaction)，将经过叠氮化的血红蛋白分子与共聚物的叁键连接，然后将连接有血红蛋白分子的聚乙二醇-聚酯共聚物溶液通过透析或者滴加的方式获得自组装的纳米粒子。
共聚物的化学结构和组成采用红外光谱、核磁共振波谱来鉴定和计算；共聚物的分子量和分子量分布使用凝胶渗透色谱装置测定；纳米粒子大小和分布使用动态光散射装置测定；纳米粒子的形态采用场发射扫描电镜来观察和记录；血红蛋白的浓度采用紫外光谱来计算，以409和419nm处的特征吸收峰值为计算标准；键合血红蛋白的纳米粒子的结合氧气的半衰期(100％被氧气饱和的血红蛋白在被氧化到50％的时间)采用室温下结合了氧气的血红蛋白的纳米粒子随时间进程的紫外光谱的变化曲线来测定，选取409nm处的特征吸收峰值为计算标准；键合血红蛋白的纳米粒子的氧气亲和度(p50，体系中50％的血红蛋白被氧气饱和时的氧气分压)采用不同的氧气分压下纳米粒 子的紫外光谱变化曲线来测定，不同的氧气分压使用气体质量流量计混合氮气和氧气来控制，选取409nm处的特征吸收峰值为计算标准。
有益效果：本发明所制得的纳米粒子可采用冷冻干燥的方法以粉末形式保存，或者溶解于磷酸-生理盐水缓冲溶液(pH 7.0-7.6)。在密封避光的状态，纳米粒子可以在常温长期保存。溶于缓冲溶液后，键合了血红蛋白的纳米粒子粒径为80-800nm，可以可逆的结合与解离氧气，体系中血红蛋白浓度为100-500wt％(相对于纳米粒子重量)，溶液黏度1-4MPs，盐(氯化钠)浓度50-200mM，pH值7.0-7.6，氧气亲和度(p50，体系中50％的血红蛋白被氧气饱和时的氧气分压)6-50mmHg，血红蛋白稳定半衰期(100％被氧气饱和的血红蛋白在被氧化到50％的时间)为15-24小时。本发明所制得的键合了血红蛋白的纳米粒子可以作为人红血球的替代材料，应用于临床输血、脏器保存、心脑血管疾病治疗、肿瘤增感治疗等领域。
具体实施方式
实施例1：将1.0g PEG800置于聚合反应瓶中，用30ml甲苯共沸除水后，加入2.5g 5-甲基-5-炔丙氧羰基-1，3-二氧六环-2-酮(MPC)单体，氮气保护下加入单体总量1/200摩尔数的乙基锌作为催化剂，120℃聚合12h，然后在无水无氧条件下再向反应瓶中加入20.0g丙交酯单体，120℃聚合12h，反应结束后将反应瓶冷却至室温，抽干甲苯，用氯仿溶解聚合物，用冷的甲醇沉降，洗涤，真空干燥即可得到三嵌段的PML共聚物。0.1gPML聚合物溶于10ml四氢呋喃中，以每分钟0.05ml的速度滴加40ml二次水，滴加完后用旋转蒸发抽去四 氢呋喃，即得到PML胶束的水溶液，冻干可得PML胶束冻干粉。将50mg牛血红蛋白溶于5mlPBS溶液中，加入6mmol NaN3，20℃振荡过夜，得到叠氮化的血红蛋白溶液，在该溶液中加入50mgPML胶束冻干粉，再分别加入6mmol的硫酸铜，抗坏血酸钠和组氨酸，继续于20℃振荡24h，键合胶束与反应溶液在15000g下离心分离，用PBS溶液洗涤至上层清液在400-600nm区域无吸收为止。
所得溶液中，纳米粒子直径约为800nm，pH值为7.3，血红蛋白含量为500％(每克胶束)，盐浓度70mM，血红蛋白半衰期为18hr，氧气亲和度为40mmHg(室温)。
实施例2：将1.0g PEG10000置于聚合反应瓶中，用30ml甲苯共沸除水后，加入4.0g 5-甲基-5-炔丙氧羰基-1，3-二氧六环-2-酮(MPC)单体，氮气保护下加入单体总量1/200摩尔数的乙基锌作为催化剂，120℃聚合12h，然后在无水无氧条件下再向反应瓶中加入1.0g丙交酯单体，120℃聚合12h，反应结束后将反应瓶冷却至室温，抽干甲苯，用氯仿溶解聚合物，用冷的甲醇沉降，洗涤，真空干燥即可得到三嵌段的PML共聚物。将50mg猪血红蛋白溶于5mlPBS溶液中，加入6mmol NaN3，20℃振荡过夜，得到叠氮化的血红蛋白溶液，在该溶液中加入50mgPML共聚物，再分别加入6mmol的硫酸铜，抗坏血酸钠和组氨酸，继续于20℃振荡24h，反应溶液在15000g下离心分离，用PBS溶液洗涤至上层清液在400-600nm区域无吸收为止。将0.1g结合了血红蛋白的PML聚合物溶于10ml四氢呋喃中，以每分钟0.05ml的速度滴加40ml二次水，滴加完后用旋转蒸发抽去 四氢呋喃，即得到结合了血红蛋白的PML胶束的水溶液，冻干可得PML胶束冻干粉。
所得溶液中，纳米粒子直径约为400nm，pH值为7.3，血红蛋白含量为300％(每克胶束)，盐浓度70mM，血红蛋白半衰期为15hr，氧气亲和度为12mmHg(室温)。
实施例3：将6.5g PEG5000置于聚合反应瓶中，用30ml甲苯共沸除水后，加入0.6g 5-甲基-5-苄氧羰基-1，3-二氧六环-2-酮(MBC)单体，氮气保护下加入单体总量1/200摩尔数的乙基锌作为催化剂，120℃聚合12h，然后在无水无氧条件下再向反应瓶中加入0.5g己内酯单体，120℃聚合12h，反应结束后将反应瓶冷却至室温，抽干甲苯，用氯仿溶解聚合物，用冷的甲醇沉降，洗涤，真空干燥即可得到三嵌段的PBC共聚物。得到的聚合物0.5g溶解于30ml四氢呋喃和甲醇的混合溶液中(体积比为4∶1)加入到250ml的反应釜中，然后再加入0.02g的氢化还原催化剂氢氧化钯/碳(氢氧化钯的质量含量为20％)，充入氢气至压力大约为1MPa。密封加热至50℃，剧烈搅拌反应48h。收集产物，过滤掉不溶的催化剂，并用四氢呋喃和甲醇洗涤三次，用乙醚沉降，过滤，洗涤，35℃下真空干燥至恒重，即得到带有羧基的聚合物DPBC。0.1gDPBC聚合物溶于10ml四氢呋喃中，以每分钟0.05ml的速度滴加40ml二次水，滴加完后用旋转蒸发抽去四氢呋喃，即得到DPBC胶束的水溶液。将50mg人血清白蛋白溶于5mlPBS溶液中，加入50mg DPBC胶束冻干粉，待完全溶解后再分别加入3mmolEDC(1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐 酸盐)，3mmolNHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，4℃振荡24h，键合胶束与反应溶液在15000g下离心分离，用PBS溶液洗涤至上层清液在280nm左右无吸收为止。
所得溶液中，纳米粒子直径约为80nm，pH值为7.3，白蛋白含量为100％(每克胶束)，盐浓度70mM。
实施例4：将1.0g PEG5000置于聚合反应瓶中，用30ml甲苯共沸除水后，氮气保护下加入单体总量1/200摩尔数的乙基锌作为催化剂，然后在无水无氧条件下再向反应瓶中加入1.0g丙交酯单体，120℃聚合12h，反应结束后将反应瓶冷却至室温，抽干甲苯，用氯仿溶解聚合物，用冷的甲醇沉降，洗涤，真空干燥即可得到两嵌段的PEG-PLA共聚物。1.0gPEG-PLA聚合物溶于10ml1，4-二氧六环溶液中，加入等摩尔的丁二酸酐、三乙胺和DMAP(4-二甲氨基吡啶)，室温下搅拌1天，滤去混浊后，用乙醚沉降清洗得到末端羧基化的PEG-PLA共聚物。将0.1g聚合物溶于10ml四氢呋喃中以每分钟0.05ml的速度滴加40ml二次水，滴加完后用旋转蒸发抽去四氢呋喃，即得到PEG-PLA胶束的水溶液，冻干可得PEG-PLA胶束冻干粉。将50mg牛血红蛋白溶于5mlPBS溶液中，加入50mg PEG-PLA胶束冻干粉，待完全溶解后再分别加入3mmolEDC，3mmolNHS，4℃振荡24h，键合胶束与反应溶液在15000g下离心分离，用PBS溶液洗涤至上层清液在400-600nm区域无吸收为止。
所得溶液中，纳米粒子直径约为100nm，pH值为7.3，血红蛋白含量为150％(每克胶束)，盐浓度70mM，血红蛋白半衰期为15hr，氧 气亲和度为9mmHg(室温)。
实施例5：将1.0g PEG2000置于聚合反应瓶中，用30ml甲苯共沸除水后，氮气保护下加入单体总量1/200摩尔数的乙基锌作为催化剂，然后在无水无氧条件下再向反应瓶中加入1.0g丙交酯单体，120℃聚合12h，反应结束后将反应瓶冷却至室温，抽干甲苯，用氯仿溶解聚合物，用冷的甲醇沉降，洗涤，真空干燥即可得到两嵌段的PEG-PLA共聚物。1.0gPEG-PLA聚合物溶于10ml1，4-二氧六环溶液中，加入等摩尔的DMAP，DCC(1，3-二环己基碳化二亚胺)和N-Boc-苯丙氨酸，室温下搅拌2天，滤去混浊后，用乙醚沉降。聚合物溶于二氧六环/氯仿溶液后，通入HCl/HBr脱去氨基保护。将聚合物再溶于氯仿溶液，加入十个当量的苄氧羰基保护羧基的谷氨酸NCA(N-羧酸酐)，于室温下反应1到两天，用醋酸/甲醇溶液沉降清洗干燥。得到的聚合物0.5g溶解于30ml四氢呋喃和甲醇的混合溶液中(体积比为4∶1)加入到250ml的反应釜中，然后再加入0.02g的氢化还原催化剂氢氧化钯/碳(氢氧化钯的质量含量为20％)，充入氢气至压力大约为1MPa。密封加热至50℃，剧烈搅拌反应48h。收集产物，过滤掉不溶的催化剂，并用四氢呋喃和甲醇洗涤三次，用乙醚沉降，过滤，洗涤，35℃下真空干燥至恒重，即得到带有羧基的三嵌段共聚物聚合物PLG。将0.1gPLG聚合物溶于10ml四氢呋喃中以每分钟0.05ml的速度滴加40ml二次水，滴加完后用旋转蒸发抽去四氢呋喃，即得到共聚物胶束的水溶液，冻干可得胶束冻干粉。将50mg人血清白蛋白溶于5mlPBS溶液中，加入50mg PLG胶束冻干粉，待 完全溶解后再分别加入6mmolEDC，6mmolNHS，4℃振荡24h，键合胶束与反应溶液在15000g下离心分离，用PBS溶液洗涤至上层清液在280nm区域无吸收为止。
所得溶液中，纳米粒子直径约为120nm，pH值为7.3，白蛋白含量为300％(每克胶束)，盐浓度70mM。
实施例6：将2.0g PEG5000置于聚合反应瓶中，用30ml甲苯共沸除水后，加入0.6g 2-苄氧酰胺基三亚甲基碳酸酯(BAC)单体，氮气保护下加入单体总量1/200摩尔数的乙基锌作为催化剂，120℃聚合12h，然后在无水无氧条件下再向反应瓶中加入2.0g己内酯单体，120℃聚合12h，反应结束后将反应瓶冷却至室温，抽干甲苯，用氯仿溶解聚合物，用冷的甲醇沉降，洗涤，真空干燥即可得到三嵌段的共聚物。得到的聚合物0.5g溶解于30ml四氢呋喃和甲醇的混合溶液中(体积比为4∶1)加入到250ml的反应釜中，然后再加入0.02g的氢化还原催化剂氢氧化钯/碳(氢氧化钯的质量含量为20％)，充入氢气至压力大约为1MPa。密封加热至50℃，剧烈搅拌反应48h。收集产物，过滤掉不溶的催化剂，并用四氢呋喃和甲醇洗涤三次，用乙醚沉降，过滤，洗涤，35℃下真空于燥至恒重，即得到带有氨基的聚合物。0.1g该聚合物溶于10ml四氢呋喃中，以每分钟0.05ml的速度滴加40ml二次水，滴加完后用旋转蒸发抽去四氢呋喃，即得到胶束的水溶液。将50mg牛血红蛋白溶于5mlPBS溶液中，加入50mg胶束冻干粉，待完全溶解后再分别加入3mmolEDC，3mmolNHS，4℃振荡24h，键合胶束与反应溶液在15000g下离心分离，用PBS溶 液洗涤至上层清液在400-600nm左右无吸收为止。
所得溶液中，纳米粒子直径约为200nm，pH值为7.3，血红蛋白含量为250％(每克胶束)，盐浓度70mM，血红蛋白半衰期为18hr，氧气亲和度为15mmHg(室温)。
实施例7：将2.0g PEG5000置于聚合反应瓶中，用30ml甲苯共沸除水后，加入0.6g 2-甲基-2-苄氧甲基-三亚甲基碳酸酯(MBTMC)单体，氮气保护下加入单体总量1/200摩尔数的乙基锌作为催化剂，120℃聚合12h，然后在无水无氧条件下再向反应瓶中加入2.0g丙交酯单体，120℃聚合12h，反应结束后将反应瓶冷却至室温，抽干甲苯，用氯仿溶解聚合物，用冷的甲醇沉降，洗涤，真空干燥即可得到三嵌段的共聚物。得到的聚合物0.5g溶解于30ml四氢呋喃和甲醇的混合溶液中(体积比为4∶1)加入到250ml的反应釜中，然后再加入0.02g的氢化还原催化剂氢氧化钯/碳(氢氧化钯的质量含量为20％)，充入氢气至压力大约为1MPa。密封加热至50℃，剧烈搅拌反应48h。收集产物，过滤掉不溶的催化剂，并用四氢呋喃和甲醇洗涤三次，用乙醚沉降，过滤，洗涤，35℃下真空干燥至恒重，即得到带有羟基的聚合物。0.1g该聚合物溶于10ml四氢呋喃中，以每分钟0.05ml的速度滴加40ml二次水，滴加完后用旋转蒸发抽去四氢呋喃，即得到胶束的水溶液。将50mg牛血红蛋白溶于5mlPBS溶液中，加入50mg胶束冻干粉，待完全溶解后再分别加入3mmolEDC，3mmolNHS，4℃振荡24h，键合胶束与反应溶液在15000g下离心分离，用PBS溶液洗涤至上层清液在400-600nm左右无吸收为止。
所得溶液中，纳米粒子直径约为180nm，pH值为7.3，血红蛋白含量为280％(每克胶束)，盐浓度70mM，血红蛋白半衰期为18hr，氧气亲和度为19mmHg(室温)。
实施例8：将1.0g PEG2000置于聚合反应瓶中，用30ml甲苯共沸除水后，氮气保护下加入单体总量1/200摩尔数的乙基锌作为催化剂，然后在无水无氧条件下再向反应瓶中加入1.0g丙交酯单体，120℃聚合12h，反应结束后将反应瓶冷却至室温，抽干甲苯，用氯仿溶解聚合物，用冷的甲醇沉降，洗涤，真空干燥即可得到两嵌段的PEG-PLA共聚物。1.0gPEG-PLA聚合物溶于10ml1，4-二氧六环溶液中，加入等摩尔的DMAP，DCC和N-Boc-苯丙氨酸，室温下搅拌2天，滤去混浊后，用乙醚沉降。聚合物溶于二氧六环/氯仿溶液后，通入HCl/HBr脱去氨基保护。将聚合物再溶于氯仿溶液，加入十个当量的苄氧羰基保护羧基的天冬氨酸NCA，于室温下反应1到两天，用醋酸/甲醇溶液沉降清洗干燥。得到的聚合物0.5g溶解于30ml四氢呋喃和甲醇的混合溶液中(体积比为4∶1)加入到250ml的反应釜中，然后再加入0.02g的氢化还原催化剂氢氧化钯/碳(氢氧化钯的质量含量为20％)，充入氢气至压力大约为1MPa。密封加热至50℃，剧烈搅拌反应48h。收集产物，过滤掉不溶的催化剂，并用四氢呋喃和甲醇洗涤三次，用乙醚沉降，过滤，洗涤，35℃下真空干燥至恒重，即得到带有羧基的三嵌段共聚物聚合物。将0.1g聚合物溶于10ml四氢呋喃中以每分钟0.05ml的速度滴加40ml二次水，滴加完后用旋转蒸发抽去四氢呋喃，即得到共聚物胶束的水溶液，冻干可得胶束冻干 粉。将50mg牛血红蛋白溶于5mlPBS溶液中，加入50mg胶束冻干粉，待完全溶解后再分别加入3mmolEDC，3mmolNHS，4℃振荡24h，键合胶束与反应溶液在15000g下离心分离，用PBS溶液洗涤至上层清液在400-600nm左右无吸收为止。
所得溶液中，纳米粒子直径约为120nm，pH值为7.3，血红蛋白含量为150％(每克胶束)，盐浓度70mM，血红蛋白半衰期为14hr，氧气亲和度为14mmHg(室温)。
实施例9：将2.0g PEG2000置于聚合反应瓶中，用30ml甲苯共沸除水后，氮气保护下加入单体总量1/200摩尔数的乙基锌作为催化剂，然后在无水无氧条件下再向反应瓶中加入2.0g丙交酯单体，120℃聚合12h，反应结束后将反应瓶冷却至室温，抽干甲苯，用氯仿溶解聚合物，用冷的甲醇沉降，洗涤，真空干燥即可得到两嵌段的PEG-PLA共聚物。1.0gPEG-PLA聚合物溶于10ml1，4-二氧六环溶液中，加入等摩尔的DMAP，DCC和N-Boc-苯丙氨酸，室温下搅拌2天，滤去混浊后，用乙醚沉降。聚合物溶于二氧六环/氯仿溶液后，通入HCl/HBr脱去氨基保护。将聚合物再溶于氯仿溶液，加入五个当量的苄氧羰基保护羟基的丝氨酸NCA，于室温下反应1到两天，用醋酸/甲醇溶液沉降清洗干燥。得到的聚合物0.5g溶解于30ml四氢呋喃和甲醇的混合溶液中(体积比为4∶1)加入到250ml的反应釜中，然后再加入0.02g的氢化还原催化剂氢氧化钯/碳(氢氧化钯的质量含量为20％)，充入氢气至压力大约为1MPa。密封加热至50℃，剧烈搅拌反应48h。收集产物，过滤掉不溶的催化剂，并用四氢呋喃 和甲醇洗涤三次，用乙醚沉降，过滤，洗涤，35℃下真空干燥至恒重，即得到带有羟基的三嵌段共聚物聚合物。将0.1g聚合物溶于10ml四氢呋喃中以每分钟0.05ml的速度滴加40ml二次水，滴加完后用旋转蒸发抽去四氢呋喃，即得到共聚物胶束的水溶液，冻干可得胶束冻干粉。将50mg牛血红蛋白溶于5mlPBS溶液中，加入50mg胶束冻干粉，待完全溶解后再分别加入3mmolEDC，3mmolNHS，4℃振荡24h，键合胶束与反应溶液在15000g下离心分离，用PBS溶液洗涤至上层清液在400-600nm左右无吸收为止。
所得溶液中，纳米粒子直径约为100nm，pH值为7.3，血红蛋白含量为120％(每克胶束)，盐浓度70mM，血红蛋白半衰期为14hr，氧气亲和度为13mmHg(室温)。
实施例10：将2.0g PEG2000置于聚合反应瓶中，用30ml甲苯共沸除水后，氮气保护下加入单体总量1/200摩尔数的乙基锌作为催化剂，然后在无水无氧条件下再向反应瓶中加入2.0g丙交酯单体，120℃聚合12h，反应结束后将反应瓶冷却至室温，抽干甲苯，用氯仿溶解聚合物，用冷的甲醇沉降，洗涤，真空干燥即可得到两嵌段的PEG-PLA共聚物。1.0gPEG-PLA聚合物溶于10ml1，4-二氧六环溶液中，加入等摩尔的DMAP，DCC和N-Boc-苯丙氨酸，室温下搅拌2天，滤去混浊后，用乙醚沉降。聚合物溶于二氧六环/氯仿溶液后，通入HCl/HBr脱去氨基保护。将聚合物再溶于氯仿溶液，加入五个当量的苄氧羰基保护羟基的苏氨酸NCA，于室温下反应1到两天，用醋酸/甲醇溶液沉降清洗干燥。得到的聚合物0.5g溶解于30ml四氢 呋喃和甲醇的混合溶液中(体积比为4∶1)加入到250ml的反应釜中，然后再加入0.02g的氢化还原催化剂氢氧化钯/碳(氢氧化钯的质量含量为20％)，充入氢气至压力大约为1MPa。密封加热至50℃，剧烈搅拌反应48h。收集产物，过滤掉不溶的催化剂，并用四氢呋喃和甲醇洗涤三次，用乙醚沉降，过滤，洗涤，35℃下真空干燥至恒重，即得到带有羟基的三嵌段共聚物聚合物。将0.1g聚合物溶于10ml四氢呋喃中以每分钟0.05ml的速度滴加40ml二次水，滴加完后用旋转蒸发抽去四氢呋喃，即得到共聚物胶束的水溶液，冻干可得胶束冻干粉。将50mg牛血红蛋白溶于5mlPBS溶液中，加入50mg胶束冻干粉，待完全溶解后再分别加入3mmolEDC，3mmolNHS，4℃振荡24h，键合胶束与反应溶液在15000g下离心分离，用PBS溶液洗涤至上层清液在400-600nm左右无吸收为止。
所得溶液中，纳米粒子直径约为110nm，pH值为7.3，血红蛋白含量为120％(每克胶束)，盐浓度70mM，血红蛋白半衰期为13hr，氧气亲和度为14mmHg(室温)。
实施例11：将2.0g PEG2000置于聚合反应瓶中，用30ml甲苯共沸除水后，氮气保护下加入单体总量1/200摩尔数的乙基锌作为催化剂，然后在无水无氧条件下再向反应瓶中加入2.0g丙交酯单体，120℃聚合12h，反应结束后将反应瓶冷却至室温，抽干甲苯，用氯仿溶解聚合物，用冷的甲醇沉降，洗涤，真空干燥即可得到两嵌段的PEG-PLA共聚物。1.0gPEG-PLA聚合物溶于10ml1，4-二氧六环溶液中，加入等摩尔的DMAP，DCC和N-Boc-苯丙氨酸，室温下搅拌2 天，滤去混浊后，用乙醚沉降。聚合物溶于二氧六环/氯仿溶液后，通入HCl/HBr脱去氨基保护。将聚合物再溶于氯仿溶液，加入十个当量的苄氧羰基保护羟基的酪氨酸NCA，于室温下反应1到两天，用醋酸/甲醇溶液沉降清洗干燥。得到的聚合物0.5g溶解于30ml四氢呋喃和甲醇的混合溶液中(体积比为4∶1)加入到250ml的反应釜中，然后再加入0.02g的氢化还原催化剂氢氧化钯/碳(氢氧化钯的质量含量为20％)，充入氢气至压力大约为1MPa。密封加热至50℃，剧烈搅拌反应48h。收集产物，过滤掉不溶的催化剂，并用四氢呋喃和甲醇洗涤三次，用乙醚沉降，过滤，洗涤，35℃下真空干燥至恒重，即得到带有羟基的三嵌段共聚物聚合物。将0.1g聚合物溶于10ml四氢呋喃中以每分钟0.05ml的速度滴加40ml二次水，滴加完后用旋转蒸发抽去四氢呋喃，即得到共聚物胶束的水溶液，冻干可得胶束冻干粉。将50mg牛血红蛋白溶于5mlPBS溶液中，加入50mg胶束冻干粉，待完全溶解后再分别加入3mmolEDC，3mmolNHS，4℃振荡24h，键合胶束与反应溶液在15000g下离心分离，用PBS溶液洗涤至上层清液在400-600nm左右无吸收为止。
所得溶液中，纳米粒子直径约为160nm，pH值为7.3，血红蛋白含量为180％(每克胶束)，盐浓度70mM，血红蛋白半衰期为17hr，氧气亲和度为16mmHg(室温)。
实施例12：将2.0g PEG2000置于聚合反应瓶中，用30ml甲苯共沸除水后，氮气保护下加入单体总量1/200摩尔数的乙基锌作为催化剂，然后在无水无氧条件下再向反应瓶中加入2.0g丙交酯单体， 120℃聚合12h，反应结束后将反应瓶冷却至室温，抽干甲苯，用氯仿溶解聚合物，用冷的甲醇沉降，洗涤，真空干燥即可得到两嵌段的PEG-PLA共聚物。1.0gPEG-PLA聚合物溶于10mll，4-二氧六环溶液中，加入等摩尔的DMAP，DCC和N-Boc-苯丙氨酸，室温下搅拌2天，滤去混浊后，用乙醚沉降。聚合物溶于二氧六环/氯仿溶液后，通入HCl/HBr脱去氨基保护。将聚合物再溶于氯仿溶液，加入十个当量的苄氧羰基保护氨基的赖氨酸NCA，于室温下反应l到两天，用醋酸/甲醇溶液沉降清洗干燥。得到的聚合物0.5g溶解于30ml四氢呋喃和甲醇的混合溶液中(体积比为4∶1)加入到250ml的反应釜中，然后再加入0.02g的氢化还原催化剂氢氧化钯/碳(氢氧化钯的质量含量为20％)，充入氢气至压力大约为1MPa。密封加热至50℃，剧烈搅拌反应48h。收集产物，过滤掉不溶的催化剂，并用四氢呋喃和甲醇洗涤三次，用乙醚沉降，过滤，洗涤，35℃下真空干燥至恒重，即得到带有氨基的三嵌段共聚物聚合物。将0.1g聚合物溶于10ml四氢呋喃中以每分钟0.05ml的速度滴加40ml二次水，滴加完后用旋转蒸发抽去四氢呋喃，即得到共聚物胶束的水溶液，冻干可得胶束冻干粉。将50mg牛血红蛋白溶于5mlPBS溶液中，加入50mg胶束冻干粉，待完全溶解后再分别加入3mmolEDC，3mmolNHS，4℃振荡24h，键合胶束与反应溶液在15000g下离心分离，用PBS溶液洗涤至上层清液在400-600nm左右无吸收为止。
所得溶液中，纳米粒子直径约为180nm，pH值为7.3，血红蛋白含量为200％(每克胶束)，盐浓度70mM，血红蛋白半衰期为16hr，氧 气亲和度为20mmHg(室温)。
实施例13：将2.0g PEG2000置于聚合反应瓶中，用30ml甲苯共沸除水后，氮气保护下加入单体总量1/200摩尔数的乙基锌作为催化剂，然后在无水无氧条件下再向反应瓶中加入2.0g丙交酯单体，120℃聚合12h，反应结束后将反应瓶冷却至室温，抽干甲苯，用氯仿溶解聚合物，用冷的甲醇沉降，洗涤，真空干燥即可得到两嵌段的PEG-PLA共聚物。1.0gPEG-PLA聚合物溶于10ml1，4-二氧六环溶液中，加入等摩尔的DMAP，DCC和N-Boc-苯丙氨酸，室温下搅拌2天，滤去混浊后，用乙醚沉降。聚合物溶于二氧六环/氯仿溶液后，通入HCl/HBr脱去氨基保护。将聚合物再溶于氯仿溶液，加入十个当量的硝基保护侧链胍基的精氨酸NCA，于室温下反应1到两天，用醋酸/甲醇溶液沉降清洗干燥。得到的聚合物0.5g溶解于30ml四氢呋喃和甲醇的混合溶液中(体积比为4∶1)加入到250ml的反应釜中，然后再加入0.02g的氢化还原催化剂氢氧化钯/碳(氢氧化钯的质量含量为20％)，充入氢气至压力大约为1MPa。密封加热至50℃，剧烈搅拌反应48h。收集产物，过滤掉不溶的催化剂，并用四氢呋喃和甲醇洗涤三次，用乙醚沉降，过滤，洗涤，35℃下真空干燥至恒重，即得到带有氨基的三嵌段共聚物聚合物。将0.1g聚合物溶于10ml四氢呋喃中以每分钟0.05ml的速度滴加40ml二次水，滴加完后用旋转蒸发抽去四氢呋喃，即得到共聚物胶束的水溶液，冻干可得胶束冻干粉。将50mg牛血红蛋白溶于5mlPBS溶液中，加入50mg胶束冻干粉，待完全溶解后再分别加入3mmolEDC，3mmolNHS，4℃振荡24h， 键合胶束与反应溶液在15000g下离心分离，用PBS溶液洗涤至上层清液在400-600nm左右无吸收为止。
所得溶液中，纳米粒子直径约为180nm，pH值为7.3，血红蛋白含量为250％(每克胶束)，盐浓度70mM，血红蛋白半衰期为17hr，氧气亲和度为19mmHg(室温)。
Claims (2)
1.一种可完全生物降解的键合了血红蛋白分子的纳米粒子，其特征在于，其成分及质量配比如下：聚乙二醇∶聚酯∶聚碳酸酯∶聚氨基酸∶血红蛋白为1-13∶1-20∶0-10∶0-10∶2-165；
所述的聚乙二醇分子量为800-10000；
所述的聚酯为聚乳酸或聚己内酯，分子量为600-10000；
所述的聚碳酸酯为侧链含有叁键、羧基、氨基、羟基的环状碳酸酯聚合物；
所述的聚氨基酸为通过α-氨基酸-N-羧基内酸酐开环聚合得到的聚氨基酸；α-氨基酸包括谷氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、天冬氨酸或精氨酸；
血红蛋白与纳米粒子载体的质量比为1-5∶1；
所述的血红蛋白分子与聚乙二醇-聚酯-聚碳酸酯-聚氨基酸共聚物之间利用叁键、羧基、氨基、羟基连接；所述的血红蛋白分子固定在事先自组装的纳米粒子表面；或者，将血红蛋白分子键合在双亲性可降解高分子的侧链上，然后通过自组装得到纳米粒子。
2.如权利要求1所说的一种可完全生物降解的键合了血红蛋白分子的纳米粒子的制备方法，其特征在于，按配比，使用分子量800-10000的单末端羟基的聚乙二醇，交酯或内酯单体、环状碳酸酯单体以及α-氨基酸-N-羧基内酸酐，质量配比为：聚乙二醇∶交酯、内酯单体∶环状碳酸酯单体∶α-氨基酸-N-羧基内酸酐＝1-13∶1-20∶0-10∶0-10，在二乙基锌或辛酸亚锡金属有机催化剂的催化下，于室温到120度反应12-48小时，制得聚乙二醇-聚酯共聚物；
将该共聚物溶于有机溶剂四氢呋喃或DMF，通过对水透析或者滴加的方式获得自组装的纳米粒子溶液，使用架桥试剂二环己基碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐或-羟基硫代琥珀酰亚胺与一氧化碳化的血红蛋白磷酸缓冲溶液混合，在室温下反应，将经过叠氮化的血红蛋白分子与纳米粒子表面的叁键连接，最终获得表层键合血红蛋白的纳米粒子；或者通过点击化学反应，将经过叠氮化的血红蛋白分子与共聚物的叁键连接，然后将连接有血红蛋白分子的聚乙二醇-聚酯共聚物溶液通过透析或者滴加的方式获得自组装的纳米粒子。
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