KR102472026B1 - 사이징제를 함유하는 나노명반 입자 - Google Patents

사이징제를 함유하는 나노명반 입자 Download PDF

Info

Publication number
KR102472026B1
KR102472026B1 KR1020187034581A KR20187034581A KR102472026B1 KR 102472026 B1 KR102472026 B1 KR 102472026B1 KR 1020187034581 A KR1020187034581 A KR 1020187034581A KR 20187034581 A KR20187034581 A KR 20187034581A KR 102472026 B1 KR102472026 B1 KR 102472026B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
composition
nanoalum
particles
alum
sizing agent
Prior art date
Application number
KR1020187034581A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20190015255A (ko
Inventor
닐 반 호벤
트레이시 미카사
크리스토퍼 비. 폭스
안와르 아니야즈
마크 티. 오르
아밋 콴드할
Original Assignee
액세스 투 어드밴스드 헬스 인스티튜트
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 액세스 투 어드밴스드 헬스 인스티튜트 filed Critical 액세스 투 어드밴스드 헬스 인스티튜트
Priority to KR1020227041252A priority Critical patent/KR20220165789A/ko
Publication of KR20190015255A publication Critical patent/KR20190015255A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102472026B1 publication Critical patent/KR102472026B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5115—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/39—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the immunostimulating additives, e.g. chemical adjuvants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/10—Dispersions; Emulsions
    • A61K9/127—Liposomes
    • A61K9/1271—Non-conventional liposomes, e.g. PEGylated liposomes, liposomes coated with polymers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5138—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyvinyl pyrrolidone, poly(meth)acrylates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5161—Polysaccharides, e.g. alginate, chitosan, cellulose derivatives; Cyclodextrin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5192—Processes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B82—NANOTECHNOLOGY
    • B82Y—SPECIFIC USES OR APPLICATIONS OF NANOSTRUCTURES; MEASUREMENT OR ANALYSIS OF NANOSTRUCTURES; MANUFACTURE OR TREATMENT OF NANOSTRUCTURES
    • B82Y5/00—Nanobiotechnology or nanomedicine, e.g. protein engineering or drug delivery
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55505—Inorganic adjuvants

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Addiction (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

알루미늄염 및 사이징제를 포함하는 나노명반 입자가 본 명세서에 제공되고, 여기서 입자의 크기는 약 1㎚ 내지 450㎚의 범위이다. 이러한 나노명반 입자는 안정하고 바이알 투입 전에 최종 무균화 단계에 수정 가능하다. 나노명반 입자를 포함하는 조성물 및 나노명반 입자를 제조하고 사용하는 것이 또한 제공된다.

Description

사이징제를 함유하는 나노명반 입자
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2016년 6월 1일에 제출된 미국 가출원 제62/344,347호(본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)의 이익을 주장한다.
기술분야
본 발명은 약제학적 및 백신 제제의 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 명세서에 기재된 실시형태는 나노명반 입자, 나노명반 입자를 포함하는 조성물, 및 나노명반 입자를 제조하고 사용하는 방법에 관한 것이다.
알루미늄염(총체적으로 명반이라 칭함)은 이의 양호한 안전성 프로필 및 흡착된 백신 항원에 대한 증대된 면역 반응을 유도하는 이의 능력으로 인해 80년 넘게 백신에서 사용되고 있다[1, 2]. 미국 FDA에 의해 허가된 애쥬번트의 몇 종류 중 하나로서, 알루미늄염은 더 신규한 애쥬번트 제제와 반대로 조절 경로를 확립하였다[1]. 수성 용액 중에 분산될 때, 알루미늄염은 약 0.5 내지 10 마이크론(㎛ 크기)의 불균질한 응집체 미립자를 형성하고, 이는 단분산성 크기 집단을 갖는 제제, 예컨대 수중유 에멀션과 비교하여 품질 조절에 대해 규명하기 어렵게 만든다. 이 복잡함은 인산알루미늄, 알루미늄 하이드록시포스페이트 설페이트 및 알루미늄 옥시하이드록사이드를 포함하는 명확한 특성에 의해 이용 가능한 알루미늄염의 다수의 형태가 존재한다는 사실에 의해 악화된다.
몇몇 연구는 애쥬번트 제제의 평균 입자 크기가 백신의 생물학적 활성에 영향을 미칠 수 있는 중요한 인자라는 것을 제안한다(1). 최근에, 신규한 합성 접근법은 명반 나노입자를 함유하는 새로운 합성 제제를 새로 제조하기 위해 알루미늄염을 사용하여 이용되고 있다. 이 합성 나노입자는, 마이크로입자와 비교할 때 주사 부위에서의 염증을 감소시키면서, 더 강한 면역 반응을 생성시키는 것으로 기재되어 있다[1, 4, 5]. 그럼에도 불구하고, 이 연구의 각각에서, 상향식 합성 접근법은 알루미늄 입자를 제조하기 위해 이용되고, 임상 알루미늄염 애쥬번트, 예컨대 알하이드로겔(Alhydrogel)(등록상표)에 비교가 이루어지지 않고, 이는 임상적으로 허가된 재료에 대해 신규한 제제의 가치를 해석하는 것을 어렵게 만든다.
추가적으로, 조절 관점으로부터, 임상 알루미늄계 마이크로입자는 0.45 또는 0.20 마이크론 필터를 통한 여과에 의해 최종 무균화될 수 없고, 방사선 또는 오토클레이브에 의해 오직 무균화 가능하여서, 항원 또는 애쥬번트와 조합될 때 이의 제조가 최종 무균화 단계로 수정 가능하지 않게 한다. 응집이 없거나 아주 적거나, 감소한 응집을 나타내고, 바이알 투입되기 전에 최종 무균화될 수 있는 알루미늄계 나노입자를 제공할 필요가 존재한다.
관련 선행기술 문헌
미국 특허출원공개공보 US2014/0234422호
본 개시내용은 나노명반 입자, 나노명반 입자를 포함하는 조성물, 및 나노명반 입자를 제조하고 사용하는 방법을 제공한다. 나노명반 입자는 약제학적 및/또는 백신 제제의 분야에서 유용하다. 알루미늄염 및 사이징제(sizing agent)를 포함하는 복수의 나노명반 입자를 포함하는 조성물(제제 포함)이 본 명세서에 제공되고, 조성물 내의 입자의 크기는 1㎛ 미만이다. 용어 나노명반 입자는 입자가 알루미늄을 포함하고, 통상적으로 1㎚ 내지 약 450㎚의 나노미터로 측정된 크기를 갖는다는 것을 나타내도록 본 명세서에서 사용된다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 FDA 규제(예컨대, 0.45 이하의 마이크론 필터의 사용)에 따른 제품에 대해 필터에 의한 최종 무균화를 위한 것이다. 몇몇 실시형태에서, 조성물에 존재하는 입자의 크기는 약 1㎚ 내지 약 450㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 조성물 내의 입자의 평균 크기는 약 1㎚ 내지 약 450㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 조성물 내의 입자의 평균 크기는 약 1㎚ 내지 약 200㎚의 범위이다. 여기에 기재된 나노명반 조성물은 마이크로유동화, 음파처리 및 고전단 혼합(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 당해 분야에 공지된 표준 기법에 의해 사이징제의 존재 하에 수산화알루미늄을 가공 또는 밀링함으로써 제조될 수 있다. 고전단 혼합은 고전단 혼합기를 사용하여 수행될 수 있다. 실베르손(Silverson)은 본 방법에서 사용될 수 있는 고전단 혼합기를 제조하는 하나의 회사이다.
조성물 내의 나노명반 입자는 안정하고, 응집이 없거나 아주 적거나, 감소한 응집을 나타내고, 바이알 투입되기 전에 최종 무균화 단계로 수정 가능하다. 본 명세서에 제공된 나노명반 입자는 개인에 대한 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 같은 물질의 전달에 유용하다. 오직 예로서, 본 명세서에 제공된 나노명반 입자는 면역 반응을 생성하기 위해 숙주에 대한 항원 및/또는 애쥬번트의 전달에 유용하다.
본 개시내용은 (a) 알루미늄염; 및 (b) 사이징제를 포함하는 나노명반 입자를 제공하고, 입자의 크기는 약 1㎚ 내지 약 450㎚의 범위이다.
소정의 실시형태에서, 입자의 평균 크기는 동적 광 산란에 의해 결정된 바대로 Z-평균이다.
소정의 실시형태에서, 알루미늄염은 수산화알루미늄, 수산화알루미늄 겔, AlPO4, AlO(OH), Al(OH)(PO4) 및 KAl(SO4)2로 이루어진 군으로부터 선택된다.
소정의 실시형태에서, 사이징제는 표 1에 제시된 사이징제로부터 선택된다. 사이징제는 PAA, PEG 및 지질에 연결된 PEG로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 사이징제는 키토산, 덱스트란(예를 들어, 황산덱스트란) 또는 폴리(알릴아민)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 사이징제는 PAA, PEG, 지질에 연결된 PEG, 키토산, 황산덱스트란 또는 폴리(알릴아민)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
소정의 실시형태에서, 사이징제는 인지질에 연결된 PEG이다. 소정의 실시형태에서, 사이징제는 PEG이고, PEG의 평균 분자량은 약 750달톤 내지 약 5000달톤의 범위이다. 소정의 실시형태에서, 사이징제는 지질(임의로 인지질)에 연결된 PEG이고, PEG의 평균 분자량은 약 750달톤 내지 약 5000달톤의 범위이다. 소정의 실시형태에서, 지질은 DSPE, DPPE 및 DMPE로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, 사이징제는 PAA이고, PAA의 평균 분자량은 약 750달톤 내지 약 7000달톤의 범위이다.
사이징제가 키토산일 때, 이것은 저분자량 키토산(예를 들어, 약 15kDa 내지 약 190kDa의 분자량), 중분자량 키토산(예를 들어, 약 190kDa 내지 약 700kDa의 분자량) 또는 고분자량 키토산(예를 들어, 약 700kDa 내지 약 1000kDa의 분자량)일 수 있다. 키토산(DDA)의 탈아세틸화의 정도는 정제의 방법 및 반응 조건에 따라 변할 것이다. 키토산의 탈아세틸화의 정도는 통상적으로 약 70% 내지 약 90%의 DDA를 통상적으로 갖는 상업용 키토산에 의해 약 40% 내지 약 90%의 범위이지만, 90% 초과 또는 40% 미만의 DDA를 갖는 키토산을, 약 40% 내지 약 90%, 바람직하게는 약 70% 내지 약 90%의 DDA를 갖는 키토산일 수 있는 것처럼, 본 방법에서 사용할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 키토산의 C2 탄소에서의 적어도 하나의 1차 아민기는 공유 접합을 위한 부위로서 사용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 키토산은 만노실화된 키토산 또는 형광성으로 표지된 키토산(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 키토산 접합체를 포함한다. 본 방법에서 사용하기 위한 키토산은 SIGMA-ALDRICH(상표명)를 포함하는 많은 공급원으로부터 상업적으로 구입 가능하다.
사이징제가 덱스트란일 때, 이것은 1000달톤 이상의 분자량을 갖는 임의의 클래스 1, 2 또는 3 덱스트란일 수 있다. 사이징제로서 사용하기에 특히 바람직한 덱스트란은 황산덱스트란이다. 황산덱스트란은 통상적으로 이의 나트륨염으로서 판매되고, 따라서, 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 황산덱스트란은 또한 이의 나트륨염 형태를 포함하는 이의 염 형태를 포함한다. 키토산에서처럼, 사이징제가 황산덱스트란일 때, 이것은 저분자량(예를 들어, 5000달톤 내지 100kDa), 중분자량(예를 들어, 100kDa 내지 500kDa) 또는 고분자량 황산덱스트란(예를 들어, 500kDa 내지 1000 또는 심지어 2000kDa)일 수 있다. 바람직한 황산덱스트란은 약 20kDa 내지 약 80kDa의 분자량을 갖는다.
폴리(알릴아민)은 본 명세서에 기재된 바와 같은 사이징제로서 사용될 수 있는 유리 1차 아미노기를 갖는 수용성 양이온성 중합체이다. 폴리(알릴아민)은 바람직하게는 약 5kDa 내지 약 100kDa, 가장 바람직하게는 약 5kDa 내지 약 50kDa, 가장 바람직하게는 약 5kDa 내지 약 25kDa의 분자량을 갖는다. 폴리(알릴아민)의 유리 염기 형태 또는 임의의 이의 염 형태(예를 들어, 염산염)가 사용될 수 있다. 당업자는 100kDa 초과의 분자량을 갖는 폴리(알릴아민) 중합체가 본 명세서에 기재된 방법에서 사용될 수 있고, 추가적으로, 폴리(알릴아민)의 염 형태가 사용될 때, 이의 분자량이 증가한다는 것을 이해할 것이다.
소정의 실시형태에서, 나노명반 입자는 필터 무균화된 액체 제제 중에 있다. 소정의 실시형태에서, 나노명반 입자는 적어도 약 1개월, 적어도 약 6개월 또는 적어도 약 1년 동안 약 0℃ 내지 약 8℃에서 액체 제제 중에 안정적이다. 소정의 실시형태에서, 나노명반 입자는 적어도 약 1개월 동안 약 37℃에서 액체 제제 중에 안정적이다. 소정의 실시형태에서, 사이징제는 알루미늄염과 연관된다.
본 개시내용은 알루미늄염을 사이징제의 존재 하에 고에너지원으로 처리하여서, 나노명반 입자가 제조되는 단계를 포함하는 나노명반 입자를 제조하는 방법(여기서, 나노명반 입자의 크기는 약 1㎚ 내지 약 450㎚의 범위임)을 제공한다.
당업자에 의해 이해되는 것처럼, 본 발명의 나노명반 입자는 마이크로미터 크기의 더 큰 입자로부터 제조될 수 있다. 따라서, 본 개시내용은 0.5㎛ 내지 20㎛ 크기 또는 0.5㎛ 내지 10㎛ 크기인 전구체 알루미늄염 입자로부터 기재된 나노명반 입자를 제조하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 (a) 알루미늄염을 고에너지원으로 처리하여 약 1㎚ 내지 약 450㎚의 크기를 갖는 나노명반 입자를 제조하는 단계 및 (b) 단계 (a) 후 약 30분 내에 사이징제를 나노명반 입자와 혼합하는 단계를 포함하는 나노명반 입자를 제조하는 방법을 제공한다.
소정의 실시형태에서, 고에너지원은 마이크로유동화기, 압출기, 음파처리기, 고전단 혼합기(예를 들어, 실베르손 혼합기) 또는 균질화기로부터 생성된다. 2개 이상의 고에너지원을 사용할 수 있다. 예를 들어, 고에너지원은 마이크로유동화기 및 고전단 혼합기로부터 생성될 수 있고, 알루미늄염 및 사이징제를 포함하는 혼합물은 1회 이상의 통과(예를 들어, 1회 통과 내지 약 30회 이상의 통과) 동안 마이크로유동화기를 통해 통과할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 고에너지원은 마이크로유동화기로부터 생성되고, 알루미늄염 및 사이징제를 포함하는 혼합물은 1회 통과 내지 약 15회 통과로 마이크로유동화기를 통해 통과한다. 소정의 실시형태에서, 알루미늄염은 수산화알루미늄, 수산화알루미늄 겔, AlPO4, AlO(OH), Al(OH)(PO4) 및 KAl(SO4)2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, 사이징제는 PAA, PEG 및 지질에 연결된 PEG로 이루어진 군으로부터 선택된다. 대안적으로, 사이징제는 표 1에 제시된 사이징제로부터 또는 키토산, 덱스트란 또는 폴리(알릴아민)으로부터 선택될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 사이징제는 PEG이고, PEG의 평균 분자량은 약 750달톤 내지 약 5000달톤의 범위이다. 소정의 실시형태에서, 사이징제는 지질(임의로 인지질)에 연결된 PEG이고, PEG의 평균 분자량은 약 750달톤 내지 약 5000달톤의 범위이다. 소정의 실시형태에서, 지질은 DSPE, DPPE 및 DMPE로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, 사이징제는 PAA이고, PAA의 평균 분자량은 약 750달톤 내지 약 7000달톤의 범위이다. 소정의 실시형태에서, 상기 방법은 나노명반 입자를 필터 무균화하는 단계를 추가로 포함한다. 소정의 실시형태에서, 알루미늄염 대 PEG의 비율은 약 2:1 내지 약 7.5:1이다. 사이징제가 키토산 또는 폴리(알릴아민)인 실시형태에서, 알루미늄염은 포스페이트 리간드 교환을 통해 표면 개질을 겪을 것이다.
본 개시내용은 본 명세서에 개시된 방법에 의해 얻을 수 있거나 제조된 나노명반 입자를 제공하고, 나노명반 입자의 크기는 약 1㎚ 내지 약 450㎚의 범위이다.
본 개시내용은 본 명세서에 개시된 나노명반 입자를 포함하는 조성물을 제공한다.
소정의 실시형태에서, 조성물은 생물활성제를 추가로 포함한다. 소정의 실시형태에서, 생물활성제는 조성물 내의 나노명반 입자와 연관된다. 소정의 실시형태에서, 약 75% 초과의 생물활성제는 겔 전기영동에 의해 결정된 바대로 조성물 내의 나노명반 입자와 연관된다. 소정의 실시형태에서, 생물활성제는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 항원, 애쥬번트, 진단제, 치료제 또는 유기체이다. 소정의 실시형태에서, 생물활성제는 폴리펩타이드이다. 소정의 실시형태에서, 폴리펩타이드는 항원, 융합 단백질, 전장 단백질, 펩타이드 또는 펩타이드 모방체이다. 소정의 실시형태에서, 항원은 Rig I 작용제이다. 소정의 실시형태에서, 생물활성제는 폴리뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 DNA이다. 소정의 실시형태에서, DNA는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, DNA는 올리고뉴클레오타이드이다. 소정의 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 RNA이다. 소정의 실시형태에서, RNA는 레플리콘 RNA, mRNA, tRNA, siRNA, shRNA 및 마이크로RNA로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, RNA는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 애쥬번트를 추가로 포함한다. 소정의 실시형태에서, 애쥬번트는 AS-2, 모노포스포릴 지질 A, 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A, IFA, QS21, CWS, TOM, AGPs, CpG 함유 올리고뉴클레오타이드, 톨 유사 수용체(TLR) 작용제, Leif, 사포닌, 사포닌 모방체, 생물학적 및 합성 지질 A, 이미퀴모드, 가르디퀴모드, 레시퀴모드, polyI:C, 플라겔린, GLA, SLA, STING, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
소정의 실시형태에서, 조성물은 액체 제제이다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 0.20 마이크론 크기의 필터 또는 0.45 마이크론 크기의 필터를 통해 여과될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 바이알 투입 전에 최종 무균화될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 적어도 약 1개월, 적어도 약 6개월 또는 적어도 약 1년 동안 약 0℃ 내지 약 8℃에서 안정적이다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 적어도 약 1개월 동안 약 37℃에서 안정적이다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 리포솜을 추가로 포함한다. 소정의 실시형태에서, 조성물 내의 입자의 평균 크기는 약 1㎚ 내지 약 450㎚이다.
본 개시내용은 본 명세서에 개시된 조성물을 함유하는 제1 바이알을 포함하는 키트를 제공한다. 소정의 실시형태에서, 키트는 또 다른 물질을 함유하는 제2 바이알을 추가로 포함한다.
본 개시내용은 본 명세서에 개시된 조성물을 대상체에게 투여하여서, 대상체에서 면역 반응을 유도하는 단계를 포함하는 대상체에서 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
소정의 실시형태에서, 면역 반응은 비특이적 면역 반응이다. 소정의 실시형태에서, 면역 반응은 항원 특이적 면역 반응이다. 소정의 실시형태에서, 면역 반응은 B 세포의 활성화, T 세포의 활성화, 항체의 제조 또는 사이토카인의 방출을 수반한다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 단일치료에 사용된다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 알레르기, 중독, 암 또는 자가면역의 치료에 사용된다. 소정의 실시형태에서, 조성물의 투여의 경로는 경구, 정맥내, 피내, 경피, 비강, 피하 또는 항문이다. 소정의 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 소정의 실시형태에서, 대상체는 비인간 포유류이다. 소정의 실시형태에서, 비인간 포유류는 개, 고양이, 소 또는 말이다.
본 개시내용은 (a) 알루미늄염 및 사이징제를 포함하는 나노명반 입자(여기서, 입자의 크기는 약 1㎚ 내지 약 450㎚의 범위임) 및 (b) 생물활성제를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하여서 대상체에서 세포에 생물활성제를 전달하는 단계를 포함하는 대상체에서 세포에 생물활성제를 전달하는 방법을 제공한다.
소정의 실시형태에서, 생물활성제는 세포로 전달된다. 소정의 실시형태에서, 생물활성제는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 RNA이고, 폴리펩타이드는 세포에 의해 발현된다. 소정의 실시형태에서, 조성물은 대상체에서 면역 반응을 발생시킨다.
본 개시내용은 본 명세서에 개시된 나노명반 입자를 생물활성제와 혼합하는 단계를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 (a) 알루미늄염을 사이징제의 존재 하에 고에너지원으로 처리하는 단계(이로써, 나노명반 입자가 제조되고, 나노명반 입자의 크기는 약 1㎚ 내지 약 450㎚의 범위임); 및 (b) 단계 (a)에서 제조된 나노명반 입자를 생물활성제와 혼합하는 단계를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 개시내용은 (a) 알루미늄염을 고에너지원으로 처리하여 약 1㎚ 내지 약 450㎚의 범위의 크기를 갖는 나노명반 입자를 제조하는 단계; (b) 단계 (a) 후 약 30분 내에 사이징제를 나노명반 입자와 혼합하는 단계; 및 (c) 단계 (b) 동안에 또는 후에 나노명반 입자를 생물활성제와 혼합하는 단계를 포함하는 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 이들 및 다른 양태는 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조 시 명확해질 것이다. 또한, 더 자세히 본 발명의 소정의 양태를 기재하는 다양한 참고문헌은 본 명세서에서 기재되어 있고, 따라서 그 전문이 참고로 포함된다.
도 1a 내지 도 1f: PAA 및 PEG 사이징제를 갖는 나노명반 제제 및 나노명반 제제의 안정성 분석. 도 1a는 30K PSI에서 3회 또는 6회 통과로 처리된 사이징제로서의 PAA2000의 존재 하에 가공되거나 밀링된 나노명반 제제가 대략 0.25 내지 0.3의 다분산성으로 대략 100㎚의 평균 입자 크기를 갖는다는 것을 입증한다. 10회 내지 15회 통과로 밀링의 증가는 다분산성의 증가 없이 대략 78 내지 87㎚의 나노명반 제제를 발생시켰다. 도 1b 내지 도 1c는 시간에 따른 사이징제로서 PEG 인지질(2:1 비율의 PEG 5000-DSPE 대 명반) 또는 PAA를 갖는 나노명반 제제의 입자 직경을 도시한다. 대략 78㎚의 초기 입자 크기를 갖는 제제를 1년까지 4℃에서 저장하고, 표시된 시점에서 입자 크기 및 다분산성에 대해 시험하였다. 샘플을 3회 취했다. 도 1d 내지 도 1f: 나노명반 제제의 열안정성. 상이한 PEG 길이(5000, 2000 및 750) 및 또는 상이한 아실 사슬 길이(18개, 16개 또는 14개 탄소)의 페길화된 지질에 의해 제제화된 100㎚ 미만의 입자 크기의 나노명반 제제를 0, 2 또는 4주 동안 25℃, 37℃ 또는 60℃에서 열안정성에 대해 평가하였다. QG194는 PEG5000-DSPE이고; QG195는 PEG2000-DMPE이고; QG196은 PEG2000-DPPE이고; QG197은 PEG750-DSPE이고; QG198은 PEG2000-DSPE이다.
도 2: 다양한 사이징제를 갖는 나노명반 제제는 예측된 명반 함량을 함유한다. 다양한 아실 사슬 길이의 인지질에 연결된 상이한 길이의 PEG 사이징제에 의해 제조된 나노명반 제제는 예측된 명반 함량을 갖는다. 18C(DSPE) 및 5000(샘플 1), 2000(샘플 4) 및 750(샘플 5)의 다양한 PEG 길이의 인지질을 갖는 사이징제로 이루어진 나노명반 제제는 PEG750-DSPE(샘플 5)에 대해 3.9㎎/㎖ 내지 PEG2000-DPPE(샘플 3)에 대해 4.5㎎/㎖의 범위의 ICP-OES 시험에 의해 측정된 바와 같은 예측된 4㎎/㎖의 명반 출발 값의 거의 동등한 양을 함유한다.
도 3a 내지 도 3d: 마우스를 단독의 또는 명반, PAA, 나노명반 PAA, 나노명반 PEG 또는 TLR4 작용제 GLA-SE에 애쥬번트된 2.5㎍의 ID97에 의해 면역화하였다. 면역화 후 1주에, 비장세포를 단리하고, 37℃에서 8시간 동안 브레펠딘(Brefeldin) A의 존재 하에 ID97 단백질에 의해 자극하거나 비자극하였다. 이후, 세포를 CD4, CD8 및 CD44의 표면 발현, 및 CD154, IFN-γ, TNF-α, IL-2, GM-CSF, IL-5 및 IL-17A의 세포내 발현에 대해 염색하였다. 항원 특이적 반응은 반응을 만드는 CD4+ T 세포의 빈도로서 ID97 자극된 샘플 - 비자극된 샘플에서 계산되었다. 도 3a는 ID97에 특이적인 각각의 반응을 만드는 CD4+T 세포의 빈도를 보여준다. 혈청을 면역화 후 1주에 면역화된 동물로부터 수집하고, IgG 아이소유형(도 3b) 및 IgG1(도 3c) 및 IgG2 하위종류(도 3d)에 대해 ELISA에 의해 ID97 결합 항체 역가에 대해 평가하였다. 데이터는 나노명반 PAA가 Th1 반응을 증대시킨다는 것을 입증한다. 도 3b에 대한 범례는 도 3a에 대해 동일하고, 도 3c에 대한 범례는 도 3d에 대해 동일하다.
도 4a 내지 도 4c: 암컷 마우스를 식염수, 명반, 나노명반 PAA 또는 나노명반 PEG에 의해 근육내로 면역화하였다. 1일 후, 배수 림프절을 제거하고 Luminex 검정에 의해 분비된 사이토카인 및 케모카인에 대해 분석하였다. 데이터는 나노명반 PAA가 마우스의 배수 림프절에서 Th1 왜곡 사이토카인을 증대시킨다는 것을 입증한다.
도 5: 야생형 마우스 및 IL-18R-/- 마우스를 2.5㎍의 ID97 및 1㎍의 PE 재조합 항원 애쥬번트된 나노명반 PAA에 의해 면역화하였다. 면역화 1주 후, 비장세포를 단리하고, 37℃에서 8시간 동안 브레펠딘 A의 존재 하에 ID97 단백질에 의해 자극하거나 비자극하였다. 이후, 세포를 CD4, CD8 및 CD44의 표면 발현, 및 CD154, IFN-γ, TNF, IL-2, GM-CSF, IL-5 및 IL-17A의 세포내 발현에 대해 염색하였다. 항원 특이적 반응은 반응을 만드는 CD4 T 세포의 빈도로서 ID97 자극된 샘플 - 비자극된 샘플에서 계산되었다. 데이터는 나노명반 PAA가 IL-18R 의존적 매커니즘을 통해 Th1 반응을 증대시킨다는 것을 입증한다.
도 6a 내지 도 6c: 마우스를 나노명반에 의해 제제화된 RNA 레플리콘 발현 벡터에 의해 면역화하였다. 데이터는 주사 후 24시간에 비제제화된 RNA(30㎍)보다 낮은 용량 30배 및 300배(1 또는 0.1㎍)에서 양이온성 에멀션과 혼합된 RNA 레플리콘이 비제제화된 RNA와 동등한 발현을 나타내는 한편, PAA 나노명반이 더 낮은 발현을 나타낸다는 것을 입증한다(도 6a). 그러나, 주사 후 4일 및 7일에 대조군 양이온성 에멀션 또는 PAA 나노명반과 혼합된 RNA는 1㎍(mcg) 및 0.1㎍(mcg) 용량 둘 다에서 대략 동등한 발현을 나타낸다(도 6b 및 도 6c).
도 7A 내지 도 7D: 나노명반 RNA에 의해 제제화된 RNA 레플리콘 벡터의 발현이 나노명반 제제에서의 사이징제로 인하지 않는다. 도 7A 내지 도 7D에서, 제제에 따라 및 24시간에 전달된 레플리콘 벡터의 용량(+로서 도시된 비제제화된 mcg) 각각 1㎍(mcg) 및 0.1㎍(mcg))에 의해 그룹화된 데이터는 PAA 단독(상부 오른쪽 패널)이 0.1 또는 1.0㎍의 용량에서 RNA 레플리콘의 발현 가능한 수준을 전달하고/하거나, 유도하지 않는 한편, 대조군 양이온성 에멀션 또는 PAA 나노명반에 의해 제제화되거나 혼합된 동일한 용량의 RNA 레플리콘이 검출 가능한 루시퍼라제 발현을 나타낸다는 것을 입증한다.
도 8a 내지 도 8c: 나노명반에 의해 제제화된 mRNA에 의해 면역화된 마우스는 생체내 RNA 코딩된 유전자 생성물을 발현한다. 데이터는 나노명반 제제가 비제제화된 mRNA와 비교하여 mRNA의 전달 및 이로부터의 발현을 할 수 있고, 용량 절약 특성을 갖는다는 것을 입증한다. 도 8a는 루시퍼라제를 코딩하는 mRNA에 의해 주사된 동물에서 관찰되고 루시퍼라제 유전자의 발현을 위해 영상화된 상대 발광을 도시한다. 비제제화된 mRNA는 주사 후 24시간에 접근될 때 0.1㎍에서가 아니라 10㎍ 및 1㎍ 둘 다에서 검출 가능한 발현을 입증한다(왼쪽 그룹). 그러나, 대조군 양이온성 제제 및 PAA 나노명반 제제(중간 및 꽤 오른쪽 그룹) 둘 다는 서로 비교할 때 모든 용량(10㎍, 1㎍ 및 0.1㎍)에서 mRNA 코딩된 유전자의 동등한 수준을 발현할 뿐만 아니라, 이들은 또한 비제제화된 mRNA와 비교하여 1㎍ 용량에서 발현의 증가된 수준(30배 초과)을 나타내고, 0.1㎍ 용량에서 발현의 검출 가능한 수준을 가지고, 이것은 나노명반 제제의 용량 절약 특성을 입증한다. 도 8b는 주사 후 5일에 mRNA의 발현에 대해 영상화된 동물의 상대 면역형광을 도시한다. 비제제화된 mRNA는 더 낮은 용량(1㎍ 및 0.1㎍)에서가 아니라 10㎍에서 mRNA 코딩된 유전자의 검출 가능한 발현을 나타내고, 대조군 양이온성 제제에서 제제화된 mRNA는, 주사 후 5일에 평가될 때, 임의의 전달된 용량(10㎍, 1㎍, 0.1㎍)에서 검출 불가능한 발현을 나타낸다(왼쪽 및 중간 그룹). PAA 나노명반 제제(꽤 오른쪽 그룹)는 10㎍ 용량에서 mRNA에 의해 코딩된 루시퍼라제의 10배 초과의 더 높은 수준을 발현하고, 10㎍의 비제제화된 mRNA에 의해 관찰된 수준과 거의 동등한 1㎍ 용량에서 검출 가능한 발현을 보여주어서, mRNA의 전달 후 5일에도 나노명반 제제의 용량 절약 특성을 나타낸다. 도 8c는 비제제화된, 대조군 양이온성 에멀션 제제 또는 PAA 나노명반으로서 혼합하고 생체내 주사된 후 6시간, 24시간 및 5일에 mRNA 코딩된 루시퍼라제 유전자의 상대 생체내 발현을 입증한다. 데이터는 나노명반 제제에 의해 제제화된 mRNA에 의해 면역화된 동물이 발현의 신속한 감소를 갖는 비제제화된 mRNA(●) 또는 대조군 양이온성 에멀션 제제화된 mRNA(△)와 비교하여 5일(□)에 걸쳐 mRNA 코딩된 루시퍼라제 유전자의 발현의 증가되고 비교적 일정한 수준을 갖는다는 것을 입증한다.
도 9a 내지 도 9e: 나노명반 제제는 RNA를 안정화시킨다. 이 도면은 나노명반 제제(중간 그룹, PAA 나노명반)가 RNA와 혼합되고, 1시간, 4시간, 또는 24시간 동안 4℃에서 단일 바이알 제제로서 저장되고, 후속하여 마우스를 면역화하도록 사용될 때, 혼합된 제제가 레플리콘 RNA 작제물을 전달할 수 있어서, 복제하는 RNA로부터의 루시퍼라제 발현의 수준이 1일(도 9a 중간 그룹) 또는 5일(도 9b 중간 그룹)에서 분석될 때 혼합되고 시간 0에 즉시 투여된 제제와 동등하거나 크다는 것을 입증한다. 비제제화된 RNA 레플리콘은 유전자 발현이 투여 후 24시간 또는 5일에 측정될 때 4 또는 24시간 동안 저장 이후에 검출 불가능한 발현을 나타내지만, 혼합 직후 또는 1시간에 투여되는 경우 검출 가능한 발현을 나타낸다. 유사하게, 대조군 양이온성 제제는 혼합되고 1, 4 또는 24시간 동안 4℃에서 저장될 때 RNA 레플리콘의 보호를 나타내고, 유전자 발현은 주사 후 1일 또는 5일에 측정되었다. 도 9c-e는 각각 대조군 양이온성 제제, PAA 나노명반 및 비제제화된 레플리콘을 직접적으로 비교하는 데이터의 산란 선도이다. 레플리콘 RNA와 혼합 직후 투여된(T=0, 왼쪽 패널 9c), 혼합 및 4℃에서의 저장 후 4시간에 투여된(T=1h, 중간 패널 9d) 또는 4℃에서 24시간 동안 혼합되고 저장될 때(T=24h, 오른쪽 패널 9e)의 RNA. 유전자 발현을 상대 발광 단위에 의해 동물에 대한 투여 후 5일에 측정하였다. 루시퍼라제 발현 수준은 나노명반 제제화된 RNA가 비제제화된 RNA와 비교하여 24시간까지 4℃에서 단일 바이알 제제로서 혼합될 때 안정적이다는 것을 입증한다.
도 10a 내지 도 10e: 나노명반에 의해 제제화된 리슈마니아증 융합 단백질을 코딩하는 RNA 레플리콘 발현 벡터에 의해 면역화된 마우스는 생체내 RNA를 발현하고, 용량 절약 항원 특이적 면역 반응을 유발한다. 이 도면은 EMCH인 리슈마니아증 융합 폴리뉴클레오타이드를 코딩하는 RNA 레플리콘 벡터에 의해 면역화된 마우스가 항원 특이적 반응을 생성한다는 것을 입증한다. 도 10a 내지 도 10d는 대조군 양이온성 에멀션 또는 PAA 나노명반에 의해 제제화된 EMCH RNA의 100배 더 낮은 용량에 의한 면역화가 0.1㎍의 비제제화된 RNA 레플리콘의 투여 이후에 아주 적거나 무의 사이토카인 유도와 비교하여 10㎍의 비제제화된 RNA와 CD4+ CD44 고 CD154, IFN γ, IL-2 또는 TNFα 사이토카인 생성 T 세포의 대략 동등한 백분율을 생성한다는 것을 입증한다. 도 10e: 보호성 리슈마니아증 면역 반응의 특징은 다수의 사이토카인을 분비하는 다작용성 항원 특이적 T 세포의 존재를 포함한다. 다작용성 T 세포 반응에 대해 CD4+ CD44 고 T 세포를 추가로 분석하였다. 데이터는 PAA 나노명반(빗금 막대)에 의해 제제화되거나 대조군 양이온성 에멀션(사선 슬래시 막대)에 의해 제제화된 100ng의 EMCH RNA 레플리콘에 의해 면역화된 마우스가 10㎍의 비제제화된 RNA(실선 검정 막대) 면역화된 동물에 대해 삼중 양성 CD44 고 IFN-γ+IL-2+TNFα+ CD4+ T 세포의 동등한 수를 갖는다는 것을 입증한다. IFN-γ 및 IL-2 또는 IL-2 및 TNFα를 발현하는 이중 양성 세포가 또한 존재한다. 데이터는 PAA 나노명반 제제가 관련 항원 특이적 면역 반응을 생성하기에 충분한 수준에서 발현된 RNA를 전달할 수 있다는 것을 입증한다.
도 11a 내지 도 11b는 TB 융합 펩타이드 ID93에 흡착된 400㎚, 130㎚ 또는 75㎚의 나노명반 입자 크기를 갖는 나노명반 제제에 의해 면역화된 마우스가 항원 특이적 면역 반응을 유발한다는 것을 입증한다. 도 11a는 나노명반 제제가 Th2 바이어스를 나타내는 항원 특이적 IgG1 항체 역가를 유발한다는 것을 입증한다. 도 11b는 나노명반 제제와 SLA인 TLR4 작용제가 Th1 바이어스를 나타내는 항원 특이적 IgG2c 항체 역가를 유발한다는 것을 입증한다.
도 12a 내지 도 12c는 상이한 PEG 길이 또는 상이한 아실 사슬 길이의 인지질에 연결된 동일한 PEG 길이를 갖는 PEG화된 인지질 사이징제를 포함하고, TB 융합 펩타이드 ID93과 TLR4 작용제 SLA와 혼합된 PEG 나노명반 제제에 의해 면역화된 마우스가 항원 특이적 면역 반응을 유발한다는 것을 입증한다.
도 13a 내지 도 13b. 도 13a는 AdjuPhos(등록상표) 전구체 및 75-85% DD를 갖는 120kDa 키토산을 사용하여 합성된 나노명반의 수력학 크기에 대한 30,000psi에서 마이크로유동화 통과의 횟수에 대한 효과를 입증한다. 도 13b는 전구체로서의 AdjuPhos(등록상표) 애쥬번트 및 75% 내지 85% DD를 갖는 다양한 양의 120kDa 키토산을 사용하여 제조된 나노명반의 수력학 직경 및 PDI를 입증한다. 샘플을 22회 별개의 통과 동안 30,000psi에서 마이크로유동화하였다.
도 14a 내지 도 14b. 도 14a는 40kDa 황산덱스트란에 의해 안정화된 알하이드로겔(등록상표)-유래된 나노명반(0.2% w/v Al)의 입자 크기를 제공한다. 마이크로유동화를 30,000psi에서 수행하였다. 도 14b는 5℃, 25℃ 및 37℃에서 저장된 나노명반-덱스트란 로트 QG774(0.2% w/v 알루미늄 + 0.22% 황산덱스트란-40kDa)에 대한 입자 크기 안정성 데이터를 나타낸다.
도 15a-b: 도 15a는 67mM 포스페이트를 함유하는 PBS 완충제에 의한 처리 전 및 후의 네이티브 알하이드로겔(등록상표) 애쥬번트의 제타 전위를 제공한다. 도 15b는 다양한 양의 키토산에 의해 안정화된 알하이드로겔(등록상표)-유래된 나노명반(0.2% w/v Al 또는 2㎎ Al/㎖)의 입자 직경(Z-평균) 및 크기 분포를 입증한다. 크기 데이터를 마이크로유동화 직후에 및 무균 여과 전에 수집하였다.
도 16은 PE-알하이드로겔(등록상표)로부터 합성된 나노명반의 입자 크기 및 크기 분포에 대한 폴리(알릴아민)(PAH) 분획의 효과를 입증한다.
본 명세서에 기재된 본 개시내용은 나노명반 입자, 나노명반 입자를 포함하는 조성물, 및 나노명반 입자를 제조하고 사용하는 방법을 제공한다.
I. 정의
하기 용어는, 달리 표시되지 않는 한, 하기 의미를 갖는다. 임의의 비정의된 용어는 이의 분야 인정된 의미를 갖는다.
본 명세서에서, 용어 "약" 및 "본질적으로 이루어진"은, 달리 표시되지 않는 한, 표시된 범위, 값 또는 구조의 ±20%를 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 용어 "약" 및 "본질적으로 이루어진"은, 달리 표시되지 않는 한, 표시된 범위, 값 또는 구조의 ±15%; ±10%; 또는 ±5%를 의미한다.
대안(예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다 또는 임의의 이들의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "포함한다", "갖는다" 및 "함유한다"는 동의어로 사용되고, 이 용어 및 이의 변형은 비제한적으로 해석되는 것으로 의도된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 첨부된 청구항에서, 단수 형태 "일", "하나" 및 "이"는, 문맥이 명확히 달리 표시하지 않는 한, 복수 지시어를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "생물활성제"는 본 개시내용의 나노명반 제제에 의해 전달되는 임의의 재료를 의미하고, 제한 없이 거대분자, 펩타이드, 단백질, 펩티도모방체, 핵산, 올리고뉴클레오타이드, 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, mRNA, RNAi, RigI, 레플리콘 RNA, 애쥬번트, 예를 들어 TLR 작용제(예를 들어, TLR2, TLR3, TLR4, TLR 7, TLR8, 및 TLR9 작용제), 사포닌, 전체 바이러스 입자, 바이러스 단편, 세포 단편을 포함한다. 용어 내에 생물활성제, 예를 들어 압타머, 탄수화물, 접합된 탄수화물 및 바이러스 유사 입자가 또한 포함된다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 "거대분자"는 생물학적 또는 합성 기원의 펩타이드, 단백질, 올리고뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드(이들로 제한되지는 않음)에 의해 예시된 큰 분자를 의미한다. 용어 내에 거대분자, 예를 들어 탄수화물이 또한 포함된다.
용어 "폴리펩타이드", "펩타이드" 및 "단백질"은 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 의미하도록 본 명세서에서 상호 호환되어 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이것은 변형된 아미노산을 포함할 수 있고, 이것은 비아미노산에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 또한 천연으로 또는 중재, 예를 들어 이황화 결합 형성, 글라이코실화, 지질화, 아세틸화, 포스포릴화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지 성분에 의한 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 정의 내에 예를 들어 아미노산의 하나 이상의 유사체(예를 들어, 비천연 아미노산 등 포함)를 함유하는 폴리펩타이드, 및 비천연 아미노산을 사용하여 구조 변형에 의해 펩타이드 및 단백질로부터 유래된 펩티도모방체 화합물을 포함하는 당해 분야에 공지된 다른 변형이 또한 포함된다.
용어 "단리된"은 이의 천연 환경으로부터 제거된 분자를 의미한다.
"정제된"은 분자가 순도에서 증가하여서, 이것이 이의 천연 환경에 존재하는 것보다 및/또는 실험실 조건 하에 초기에 합성되고/되거나 증폭될 때 더 순수한 형태로 존재한다는 것을 의미한다. 순도는 상대 용어이고, 반드시 절대 순도를 의미하지 않는다. 몇몇 실시형태에서, 정제된은 이것이 이의 천연 환경에 존재하는 것보다 및/또는 실험실 조건 하에 초기에 합성되고/되거나 증폭될 때 99%, 98%, 97%, 96%, 95%, 90%, 85% 또는 80% 더 순수하다는 것을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 상호 호환되어 사용되는 바와 같은 "폴리뉴클레오타이드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오타이드의 중합체를 의미하고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오타이드는 데옥시리보뉴클레오타이드, 리보뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 또는 염기 및/또는 이의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 중합효소에 의해, 또는 합성 반응에 의해 중합체로 도입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 메틸화 뉴클레오타이드 및 이의 유사체를 포함할 수 있다. 존재하는 경우, 뉴클레오타이드 구조에 대한 변형은 중합체의 어셈블리 전에 또는 후에 부여될 수 있다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드(예를 들어, 당해 분야에 널리 공지된 용어로서 RNA, RNAi, tRNA 및 mRNA) 및 당해 분야에 공지된 데옥시리보뉴클레오타이드(DNA)를 포함하고, 단일 또는 이중 가닥 분자일 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "올리고뉴클레오타이드"는 일반적으로, 반드시는 아니지만 일반적으로 약 200개 미만의 뉴클레오타이드 길이의, 간단히 일반적으로 단일 가닥의 일반적으로 합성 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 용어 "올리고뉴클레오타이드" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 상호 배타적이 아니다. 폴리뉴클레오타이드에 대한 상기 설명은 올리고뉴클레오타이드에 동등하게 및 완전히 적용 가능하다. 예는 Rig I 작용제를 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "레플리콘"은 임의의 유전자 요소, 예를 들어 플라스미드, 코스미드, 박미드(bacmid), 파지 또는 주로 그 자체의 제어 하에 복제할 수 있는 바이러스를 포함한다. 레플리콘은 RNA 또는 DNA일 수 있고, 단일 또는 이중 가닥일 수 있다.
"개인" 또는 "대상체"는 임의의 포유류이다. 포유류는 인간, 영장류, 농장 동물, 스포츠 동물, 애완동물(예컨대, 고양이, 개, 말) 및 설치류를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
"알킬"은 직쇄 또는 분지쇄 포화 탄화수소이다. 예를 들어, 알킬기는 1개 내지 30개의 탄소 원자(즉, (C1-C30)알킬) 또는 1개 내지 20개의 탄소 원자(즉, (C1-C20 알킬) 또는 1개 내지 10개의 탄소 원자(즉, (C1-C10)알킬) 또는 1개 내지 8개의 탄소 원자(즉, (C1-C8)알킬) 또는 1 내지 6개의 탄소 원자(즉, (C1-C6)알킬) 또는 1개 내지 4개의 탄소 원자(즉, (C1-C4)알킬)를 가질 수 있다. 이 용어는 예로서 직쇄 및 분지쇄 하이드로카빌기, 예컨대 메틸(CH3-), 에틸(CH3CH2-), n-프로필(CH3CH2CH2-), 아이소프로필((CH3)2CH-), n-뷰틸(CH3CH2CH2CH2-), 아이소뷰틸((CH3)2CHCH2-), sec-뷰틸((CH3)(CH3CH2)CH-), t-뷰틸((CH3)3C-), n-펜틸(CH3CH2CH2CH2CH2-), 네오펜틸((CH3)3CCH2-) 및 n-헥실(CH3(CH2)5-)을 포함한다.
"할로" 또는 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 및 요오도를 의미한다.
"하이드록시" 또는 "하이드록실"은 -OH 기를 의미한다.
"알콕시"는 -O-알킬(여기서, 알킬은 본 명세서에 정의된 바와 같음) 기를 의미한다. 알콕시는, 예로서, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 아이소프로폭시, n-뷰톡시, t-뷰톡시, sec-뷰톡시, n-펜톡시 등을 포함한다.
"카복시 에스터" 또는 "카복시 에스터"는 -C(O)O-알킬 및 -C(O)O-치환된 알킬(여기서, 알킬 및 치환된 알킬은 본 명세서에 정의된 바와 같음) 기를 의미한다.
II. 일반 기법
본 개시내용의 실행은, 달리 표시되지 않는 한, 당해 분야의 기술 내인 분자 생물학, 재조합 DNA, 생화학 및 화학의 종래의 기법을 이용할 것이다. 이러한 기법은 문헌에 완전히 설명되어 있다. 예를 들어 문헌[Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., Sambrook et al., ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al., 미국 특허 제4,683,195호; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); B. Perbal, A Practical Guide 내지 Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); 및 Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)]을 참조한다.
III. 나노명반 입자
본 명세서에 제공된 나노명반 입자는 알루미늄염(상호 호환되어 명반이라 칭해짐) 및 사이징제를 포함하고, 입자의 크기는 약 1㎚ 내지 450㎚의 범위이다. 알루미늄염 및 사이징제의 설명은 하기 제공된다.
A. 알루미늄염
본 명세서에 기재된 조성물은 본 명세서에서 명반이라 칭해질 수 있는 알루미늄염을 포함할 수 있다. 적합한 알루미늄염은 수산화알루미늄, 알루미늄 3수화물, 알루미늄 옥시하이드록사이드, 인산알루미늄, 알루미늄 하이드록시포스페이트, 알루미늄 하이드록시포스페이트 설페이트 및 칼륨 알루미늄 설페이트를 포함한다. 알루미늄염은 Al(OH)3, AlH3O3, AlH6O3, AlO(OH), Al(OH)(PO4) 및 KAl(SO4)2의 식에 의해 또한 칭해질 수 있다. 당업자는 알루미늄 하이드록시포스페이트가 비화학량론적이고, 이것이 본 명세서에서 Al(OH)(PO4)로 표시되지만, 표면 하이드록실 대 포스페이트의 비율이 제조 조건에 따라 변하고, 그러므로 Al(OH)x(PO4)y의 식에 의해 더 정확히 표시된다는 것을 이해할 것이다.
동시애쥬번트로서 사용되는 알루미늄염은 양호한 안전성 기록을 갖고, 항체 반응을 증대시키고, 항원을 안정화시키고, 대규모 제조에 비교적 단순하므로 유리하다. (Edelman 2002 Mol. Biotechnol. 21:129-148; Edelman, R. 1980 Rev. Infect. Dis. 2:370-383.)
소정의 실시형태에서, 알루미늄염은 알하이드로겔(등록상표), 수산화알루미늄 또는 알루미늄 옥시하이드록사이드이다. 알하이드로겔(등록상표)은 전체 양전하를 갖고, 음으로 하전된 모이어티를 용이하게 흡수할 수 있다. 알하이드로겔(등록상표)은 암포젤(Amphojel); 수산화알루미늄 겔; 수화된 알루미나; 알루미늄 트라이하이드록사이드; 또는 알루겔리바이(Alugelibye)라 또한 칭해질 수 있다.
소정의 실시형태에서, 알루미늄염은 AdjuPhos(등록상표), 인산알루미늄이다. AdjuPhos(등록상표)는 전체 음전하를 갖고, 양으로 하전된 모이어티를 용이하게 흡착할 수 있다.
당업자는 사용되는 알루미늄염 및 사이징제가 동일한 표면 전하를 갖는 실시형태에서 이의 전하가 역전될 수 있어서 사이징제와 알루미늄염 사이의 인력을 허용하도록 알루미늄염을 표면 개질로 처리하는 것이 바람직하다는 것을 이해할 것이다. 예로서, 알루미늄염이 양이온성 표면 전하를 갖고(예를 들어, ALO(OH), 사이징제가 양이온성 표면 전하(예를 들어, 키토산, 폴리(알릴아민))를 가질 때, 리간드 교환(예를 들어, 포스페이트 리간드 교환)은 알루미늄염의 표면 전하를 음이온성으로 바꾸도록 작용하여서, 사이징제와 알루미늄염 사이의 상호작용을 허용한다.
B. 사이징제
몇몇 실시형태에서, 사이징제가 사이징제의 부재 하의 알루미늄염을 포함하는 나노명반과 비교할 때 가공된 또는 밀링된 알루미늄염의 응집을 감소시키거나 차단하거나 지연시키므로, 나노명반 입자의 크기는 유지된다.
몇몇 실시형태에서, 사이징제는 원하는 나노명반 입자 크기를 달성하도록 고에너지 유입, 예컨대 음파처리 또는 마이크로유동화에 의해 알루미늄염을 가공하는 동안 첨가된다. 몇몇 실시형태에서, 사이징제는 원하는 나노명반 입자 크기를 달성하도록 고에너지 유입, 예컨대 음파처리 또는 마이크로유동화에 의해 알루미늄염을 가공한 후 첨가된다. 몇몇 실시형태에서, 사이징제가 원하는 나노명반 입자 크기를 달성하도록 고에너지 유입, 예컨대 음파처리 또는 마이크로유동화에 의해 알루미늄염을 가공한 후 첨가될 때, 사이징제는 가공 후 즉시 또는 원하는 나노명반 입자 크기를 달성하기 위해 알루미늄염을 가공한 후 약 0.5분, 0.5분 내지 1.0분, 1.0분 내지 1.5분, 1.5분 내지 2.0분, 2.0분 내지 2.5분, 2.5분 내지 3.0분, 3.0분 내지 3.5분, 3.5분 내지 4.0분, 4.0분 내지 4.5분, 4.5분 내지 5.0분, 5.05분 내지 5.5분, 5.5분 내지 6.0분, 6.0분 내지 6.5분, 6.5분 내지 7.0분, 7.0분 내지 7.5분, 7.5분 내지 8.0분, 8.0분 내지 8.5분, 8.5분 내지 9.0분, 약 10분, 약 12분, 약 14분, 약 16분, 약 18분, 약 20분, 약 22분, 약 24분, 약 26분, 약 28분, 약 30분 후 첨가된다.
몇몇 실시형태에서, 사이징제는 알루미늄염의 표면 특성을 변경하는 것이다. 몇몇 실시형태에서, 사이징제는 알루미늄염의 크기를 안정화시키는 것이다.
몇몇 실시형태에서, 사이징제는 생물활성제를 안정화시키거나 보호하는 것이다. 생물활성제의 예는 항원, 애쥬번트, TLR 작용제, 펩타이드 모방체, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드, RNA, DNA, 전체 바이러스 게놈 및 전체 바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 생물활성제는 본 개시내용의 나노명반 제제에 의해 전달될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 사이징제는 산화로부터 생물활성제를 보호하거나 차폐한다. 몇몇 실시형태에서, 사이징제는 열 온도 및 시간의 인자를 포함할 수 있는 열 스트레스로부터 생물활성제를 보호하거나 차폐한다. 몇몇 실시형태에서, 사이징제는 차가운 온도 및 시간의 인자를 포함할 수 있는 추위 스트레스로부터 생물활성제를 보호하거나 차폐한다. 몇몇 실시형태에서, 사이징제는 분해로부터 생물활성제를 보호하거나 차폐한다. 몇몇 실시형태에서, 사이징제는 혈청 또는 혈액 성분에 노출될 때 분해 또는 불활성화로부터 본 개시내용의 나노명반 제제에 의해 전달되는 생물활성제를 차폐하거나 보호하는 것이다. 몇몇 실시형태에서, 사이징제는 생물활성제를 보호하거나 차폐하여서, 생물활성제는 안정한 단일 바이알 제제로서 나노입자에 의해 제제화될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 사이징제의 존재는, 사이징제의 부재 하에 형성된 나노명반 입자와 비교하여, 적어도 5%, 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%로 알루미늄염의 응집 또는 재응집을 감소시키거나 차단하거나 지연시키거나, 심지어 알루미늄염의 응집 또는 재응집을 거의 100% 차단한다.
본 명세서에 제공된 나노명반 입자에서, 사이징제는 알루미늄염과 연관된다. 몇몇 실시형태에서, 사이징제는 알루미늄염에 직접적으로 결합된다. 몇몇 실시형태에서, 사이징제는 나노명반 입자에 흡착된다. 몇몇 실시형태에서, 사이징제는 리간드 교환에 의해 알루미늄염과 연관된다. 몇몇 실시형태에서, 사이징제는 전하/정전기 상호작용에 의해 알루미늄염과 연관된다. 몇몇 실시형태에서, 사이징제는 사이징제에서 발견된 포스페이트 헤드 기를 통해 알루미늄염과 연관된다. 몇몇 실시형태에서, 사이징제는 지질에 추가로 연결된다. 몇몇 실시형태에서, 사이징제는 인지질에 추가로 연결된다.
표 1은 본 명세서에 제공된 나노명반 입자에서의 포함을 위한 사이징제의 비제한적인 목록을 제공한다.
Figure 112018119035798-pct00001
Figure 112018119035798-pct00002
Figure 112018119035798-pct00003
몇몇 실시형태에서, 사이징제는 폴리아크릴산(PAA)이다. 몇몇 실시형태에서, PAA의 평균 분자량은 약 500 내지 7000; 1000 내지 7000; 1500 내지 7000; 2000 내지 7000; 2500 내지 7000; 3000 내지 7000; 3500 내지 7000; 4000 내지 7000; 4500 내지 7000; 5000 내지 7000; 5500 내지 7000; 6000 내지 7000; 또는 6500 내지 7000의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, PAA의 평균 분자량은 약 500 내지 1000; 500 내지 1500; 500 내지 2000; 500 내지 2500; 500 내지 3000; 500 내지 3500; 500 내지 4000; 500 내지 4500; 500 내지 5000; 500 내지 5500; 500 내지 6000; 500 내지 6500; 또는 500 내지 7000의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, PAA의 평균 분자량은 약 1000 내지 3000 또는 1500 내지 2500의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, PAA의 평균 분자량은 약 7000, 6500, 6000, 5500, 5000, 4500, 4000, 3500, 3000, 2500, 2400, 2300, 2200, 2100, 2000, 1900, 1800, 1700, 1600, 1500, 1400, 1300, 1250, 1200, 1100, 1000 또는 500이다. 몇몇 실시형태에서, PAA의 평균 분자량은 약 5000, 2000, 1250, 1200 또는 1000이다. 몇몇 실시형태에서, PAA의 평균 분자량은 약 2000이다.
몇몇 실시형태에서, 사이징제는 폴리에틸렌 글라이콜(PEG)이다. 몇몇 특정한 실시형태에서, PEG의 평균 분자량 또는 PEG 길이는 약 500달톤 내지 약 6000달톤의 범위이다. 몇몇 특정한 실시형태에서, PEG의 평균 분자량 또는 PEG 길이는 약 750달톤 내지 약 5000달톤의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, PEG의 평균 분자량 또는 PEG 길이는 약 750 내지 1000; 750 내지 1500; 750 내지 2000; 750 내지 2500; 750 내지 3000; 750 내지 3500; 750 내지 4000; 750 내지 4500; 또는 750 내지 5000달톤의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, PEG의 평균 분자량 또는 PEG 길이는 약 4500 내지 5000; 4000 내지 5000; 3500 내지 5000; 3000 내지 5000; 2500 내지 5000; 2000 내지 5000; 1500 내지 5000; 1000 내지 5000; 또는 750 내지 5000달톤의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, PEG의 평균 분자량 또는 PEG 길이는 약 500 내지 1000; 500 내지 750; 또는 750 내지 1000달톤의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, PEG의 평균 분자량 또는 PEG 길이는 약 1500 내지 2500; 1500 내지 2000; 또는 2000 내지 2500달톤의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, PEG의 평균 분자량 또는 PEG 길이는 약 4500 내지 5500; 4500 내지 5000; 또는 5000 내지 5500달톤의 범위이다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 사이징제는 PEG750이다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 사이징제는 PEG2000이다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 사이징제는 PEG5000이다.
C. 사이징제에 연결된 지질
몇몇 실시형태에서, 사이징제는 지질 또는 인지질에 추가로 연결된다. 표 2는 사이징제에 연결될 수 있는 지질의 비제한적인 목록을 제공한다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 사이징제는 PEG이고, PEG는 DSPE에 연결된다. 소정의 실시형태에서, 사이징제는 PEG이고, PEG는 DPPE에 연결된다. 소정의 실시형태에서, 사이징제는 PEG이고, PEG는 DMPE에 연결된다.
소정의 실시형태에서, 지질은 인지질 또는 4차 암모늄염 지질이다. 소정의 실시형태에서, 지질은 포스파티딜콜린 또는 포스포글라이세라이드인 인지질이다. 소정의 실시형태에서, 지질은 임의의 하기 모이어티를 포함한다:
Figure 112018119035798-pct00004
(여기서, X-는 알칼리 금속 반대이온이고, Y+는 할라이드 반대이온임).
소정의 실시형태에서, 계면활성제는 폴록사머이다:
Figure 112018119035798-pct00005
(여기서, a는 2-130이고, b는 15-67임).
소정의 실시형태에서, 지질은 C10-20 알킬 사슬을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 지질은 C12-18 알킬 사슬을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 지질은 음이온성이다. 소정의 실시형태에서, 지질은 양이온성이다. 소정의 실시형태에서, 지질은 전체 중성 하전된다. 소정의 실시형태에서, 지질은 쌍성이온이다.
소정의 실시형태에서, 적합한 지질은 표 2에 기재되어 있다.
Figure 112018119035798-pct00006
Figure 112018119035798-pct00007
소정의 실시형태에서, 지질은 폴록사머 188이다.
소정의 실시형태에서, 지질은 DLPG, DMPG, DPPG, DSPG, DOPG, DSTAP 및 DPTAP로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, 지질은 DLPG, DMPG, DPPG, DSPG 및 DOPG로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, 지질은 DSTAP 및 DPTAP로부터 선택된다.
소정의 실시형태에서, 지질은 DSPG이다. 소정의 실시형태에서, 지질은 DSTAP이다. 소정의 실시형태에서, 지질은 DPTAP이다.
소정의 실시형태에서, 지질은 DSPG, DSTAP 및 폴록사머 188로부터 선택된다.
소정의 실시형태에서, 지질은 DLPC, DMPC, DPPC, DSPC, DOPC 및 POPC로부터 선택된다. 소정의 실시형태에서, 지질은 DLPC, DSPC 및 DOPC로부터 선택된다.
소정의 실시형태에서, 지질은 DSPE이다. 예시적인 실시형태에서, 사이징제 PEG는 나노명반 입자 내에 DSPE에 연결된다.
소정의 실시형태에서, 지질은 DPPE이다. 예시적인 실시형태에서, 사이징제 PEG는 나노명반 입자 내에 DPPE에 연결된다.
소정의 실시형태에서, 지질은 DMPE이다. 예시적인 실시형태에서, 사이징제 PEG는 나노명반 입자 내에 DMPE에 연결된다.
소정의 실시형태에서, 지질은 DLPE이다. 예시적인 실시형태에서, 사이징제 PEG는 나노명반 입자 내에 DLPE에 연결된다.
D. 나노명반 입자를 제조하는 방법
알루미늄염 및 사이징제를 포함하는 나노명반 입자가 본 명세서에 제공되고, 나노명반 입자의 크기는 약 1㎚ 내지 450㎚의 범위이다. 본 개시내용은 이러한 나노명반 입자를 제조하는 방법을 제공한다.
나노명반 입자를 제조하는 방법은 알루미늄염을 사이징제의 존재 하에 고에너지원 또는 고에너지 전단 힘으로 처리하는 단계를 포함하고, 이로써 알루미늄염의 크기는 감소하고, 나노명반 입자가 제조되고, 나노명반 입자의 크기는 약 1㎚ 내지 450㎚의 범위이다.
소정의 실시형태에서, 명반은 사이징제의 존재 하에 가공되거나 밀링되거나, 사이징제는 가공 후 적어도 초, 분 또는 시간에 밀링된 명반에 첨가된다. 몇몇 실시형태에서, 명반은 가공되고, 즉시 동결건조되거나 건조되고, 사이징제는 재구성 시 또는 재구성의 초, 분 또는 시간 내에 첨가된다. 가공 또는 밀링은 음파처리, 고전단 혼합(예를 들어, 실베르손 혼합) 및 마이크로유동화를 포함하는 당해 분야에 공지된 표준 기법을 이용하여 발생한다. 본 방법에서 사용될 수 있는 당해 분야에 공지된 또 다른 표준 기법은 고압 균질화이다.
몇몇 실시형태에서, 고에너지원은 적어도 5000 PSI, 적어도 10,000 PSI, 적어도 15,000 PSI 적어도 20,000 PSI, 적어도 25,000 PSI, 적어도 30,000 PSI, 적어도 35,000 PSI, 적어도 40,000 PSI, 적어도 45,000 PSI, 또는 적어도 50,000 PSI를 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 고에너지원은 약 5000 내지 50000; 5000 내지 10000; 5000 내지 15000; 5000 내지 20000; 5000 내지 25000; 5000 내지 30000; 5000 내지 35000; 5000 내지 40000; 5000 내지 45000; 또는 5000 내지 50000 PSI를 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 고에너지원은 약 45000 내지 50000; 40000 내지 50000; 35000 내지 50000; 30000 내지 50000; 25000 내지 50000; 20000 내지 50000; 15000 내지 50000; 10000 내지 50000; 또는 5000 내지 50000 PSI를 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 고에너지원은 약 25000 내지 35000; 25000 내지 30000; 또는 30000 내지 35000 PSI를 제공한다. 몇몇 실시형태에서, 고에너지원은 약 30000 PSI를 제공한다.
몇몇 실시형태에서, 고에너지원은 고전단 공급원이다.
몇몇 실시형태에서, 고에너지원은 마이크로유동화기이다. 마이크로유동화는 조성물이 고전단 힘에 노출되는 공정을 기재하도록 이용된다. 본 개시내용의 몇몇 실시형태에서, 조성물은 마이크로유동화기(등록상표)로 공지된 장비 또는 장치에 의해 가공된다.
몇몇 실시형태에서, 고에너지원은 압출기이다.
몇몇 실시형태에서, 고에너지원은 음파처리기이다.
몇몇 실시형태에서, 고에너지원은 균질화기이다.
몇몇 실시형태에서, 알루미늄염 및 사이징제는 고전단 힘의 적어도 1회, 2회, 3회, 4회, 5회, 6회, 7회, 8회, 9회, 10회, 15회, 20회, 25회, 30회, 50회 또는 100회 통과로 처리된다. 몇몇 실시형태에서, 알루미늄염 및 사이징제는 고전단 힘의 1회 내지 5회, 6회 내지 10회, 11회 내지 15회, 16회 내지 20회, 21회 내지 30회, 31회 내지 40회, 41회 내지 50회, 51회 내지 60회, 61회 내지 70회, 71회 내지 80회, 81회 내지 90회 또는 91회 내지 100회 통과로 처리된다. 몇몇 실시형태에서, 알루미늄염 및 사이징제는 고전단 힘의 3회, 6회 또는 10회 통과로 처리된다.
몇몇 실시형태에서, 본 개시내용의 나노명반 입자를 제조하는 방법은 0℃, 4℃, 25℃, 30℃, 50℃ 또는 60℃에서 수행된다. 몇몇 실시형태에서, 본 개시내용의 나노명반 입자를 제조하는 방법은 0 내지 4℃, 5 내지 10℃, 11 내지 15℃, 16 내지 20℃, 21 내지 25℃, 26 내지 30℃, 31 내지 35℃, 36 내지 40℃, 41 내지 45℃, 46 내지 50℃, 51 내지 55℃ 또는 56 내지 60℃에서 수행된다. 몇몇 실시형태에서, 본 개시내용의 나노명반 입자를 제조하는 방법은 4℃에서 수행된다.
몇몇 실시형태에서, 알루미늄염의 출발 농도는 10㎎/㎖이다. 몇몇 실시형태에서, 알루미늄염의 출발 농도는 4㎎/㎖이다. 몇몇 실시형태에서, 알루미늄염의 출발 농도는 2㎎/㎖이다. 몇몇 실시형태에서, 알루미늄염의 출발 농도는 0.5 내지 10㎎/㎖, 1 내지 10㎎/㎖, 0.5 내지 5㎎/㎖; 1 내지 5㎎/㎖; 0.5 내지 4㎎/㎖; 0.5 내지 3㎎/㎖; 또는 0.5 내지 3㎎/㎖이다.
몇몇 실시형태에서, 알루미늄염의 출발 크기는 1㎛이다. 몇몇 실시형태에서, 알루미늄염의 출발 크기는 0.5 내지 5㎛; 0.5 내지 4㎛; 0.5 내지 3㎛; 0.5 내지 2㎛; 또는 0.5 내지 1㎛이다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 나노명반 입자는 사이징제의 존재 하에 본 명세서에 기재된 방법에 따라 분쇄 또는 가공에 의해 제조되고, 1 내지 450㎚의 평균 입자 크기를 갖는다. 소정의 실시형태에서, 합성 나노명반은 안정한 수성 나노명반 제제를 생성하도록 본 개시내용의 사이징제가 첨가되는 적절한 명반 입자 크기를 제조하도록 신생 합성된 당해 분야에 기재된 바와 같은 합성 명반을 포함할 수 있다. 제제의 나노명반 입자는 나노명반 조성물 또는 제제를 제조하도록 당해 분야에 공지된 약제학적으로 허용 가능한 부형제와 혼합될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "밀링", "사이징" 또는 "가공"은 나노 크기 입자를 달성하기 위해 명반의 용액을 처리하는 공정을 의미한다. 상기 공정은 0.5 내지 10㎛ 미만의 감소된 평균 입자 크기에 의해 측정된 바대로 명반 입자의 응집을 감소시키도록 고에너지원 또는 유입을 통해 명반 조성물(제제 포함)을 가공하는 것을 포함한다. 나노명반 조성물을 달성하기 위한 에너지 유입의 적합한 예는 고전단 혼합(예컨대, 실베르손 고전단 혼합기에 의한 초음파처리 또는 고전단 혼합), 압출, 균질화 및 마이크로유동화를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시형태에서, 고전단 혼합은 1분, 2분, 5분 또는 10분 동안 1000, 2000, 5000 또는 10,000rpm에서 수행된다. 몇몇 실시형태에서, 마이크로유동화기는 다이아몬드 F12Y 상호작용 챔버, 이어서 세라믹 H30Z 보조제 가공 모듈이 구비된 Microfluidics M110P(매사추세츠주 뉴턴)이다. 몇몇 실시형태에서, 명반 조성물은 3,000 PSI 5,000PSI, 10,000 PSI, 15,000 PSI 또는 30,000 PSI의 압력에서 마이크로유동화된다. 몇몇 실시형태에서, 명반의 용액은 나노명반 조성물을 달성하기 위해 60℃, 40℃, 20℃ 또는 4℃의 온도에서 재순환 물을 갖는 마이크로유동화기에 의해 가공된다. 몇몇 실시형태에서, 명반의 용액은 1 내지 450㎚ 크기의 평균 입자 크기를 갖는 본 개시내용의 나노입자를 재현 가능하게 달성하도록 적어도 약 1, 3, 6, 10, 15, 20 또는 30회 통과로 밀링되거나 가공된다. 몇몇 실시형태에서, 명반의 용액은 가공 동안 온도 증가를 방지하기 위해 재순환하는 4℃ 물에 의해 30,000 PSI에서 10회 통과까지 마이크로유동화된다. 몇몇 실시형태에서, 명반의 용액은 사이징제의 존재 하에 가공된다. 몇몇 실시형태에서, 사이징제 대 명반의 비율은 30:1, 20:1, 15:1, 10:1, 7.5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1.5:1, 0.5:1 또는 0.25:1이다. 몇몇 실시형태에서, 사이징제 대 명반의 비율은 7.5:1, 4:1, 3:1, 2:1 또는 1:1이다.
소정의 변수가 실시형태의 나노명반 입자를 제조하는 방법에서 제어될 수 있는 것으로 이해된다. 소정의 변수는 사이징제, 고에너지원의 유형, 고에너지원이 발휘하는 압력, 고에너지원을 통한 혼합물의 통과의 횟수, 공정이 발생하는 온도, 사이징제의 농도, 사이징제가 알루미늄에 첨가되는 방법에서의 지점 및 알루미늄염 대 사이징제의 중량비를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
Figure 112018119035798-pct00008
Figure 112018119035798-pct00009
소정의 변수 및 이들의 조합이 표 3에 기재된 것과 같은 실시형태의 나노명반 입자를 제조하는 방법에 관여할 수 있는 것으로 이해된다.
소정의 실시형태에서, 사이징제가 PEG5000인 나노명반 입자를 제조하는 방법에 대해, 상기 방법은 하기 특징 중 임의의 하나 이상을 가질 수 있다:
a) 고에너지원의 유형은 마이크로유동화기임;
b) 고에너지원이 발휘한 압력은 약 30kpsi임;
c) 고에너지원을 통한 혼합물의 통과의 횟수는 1회 내지 10회, 예컨대 3회, 6회 또는 10회 통과임;
d) 공정이 발생하는 온도는 약 4℃임;
e) 명반의 농도는 약 4㎎/㎖임;
f) 사이징제의 농도는 about 8㎎/㎖임; 및
g) 알루미늄염 대 사이징제의 비율은 약 1:2임.
일 변형에서, 상기 방법은 특징 (a) 내지 (g) 중 적어도 하나에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 2개 이상의(및 소정의 변형에서, 모든) 특징 (a) 내지 (g)에 부합한다. 특정한 변형에서, 상기 방법은 특징 (a)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b) 및 (c)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c 및 (d)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c), (d) 및 (e)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c), (d) 및 (f)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c), (d) 및 (g)에 부합한다.
소정의 실시형태에서, 사이징제가 PEG2000인 나노명반 입자를 제조하는 방법에 대해, 상기 방법은 하기 특징 중 임의의 하나 이상을 가질 수 있다:
a) 고에너지원의 유형은 마이크로유동화기임;
b) 고에너지원이 발휘한 압력은 약 30kpsi임;
c) 고에너지원을 통한 혼합물의 통과의 횟수는 1회 내지 10회, 예컨대 3회, 6회 또는 10회임;
d) 공정이 발생하는 온도는 약 4℃임;
e) 명반의 농도는 4㎎/㎖임;
f) 사이징제의 농도는 약 10㎎/㎖임; 및
g) 알루미늄염 대 사이징제의 비율은 약 1:2.5임.
일 변형에서, 상기 방법은 특징 (a) 내지 (g) 중 적어도 하나에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 2개 이상의(및 소정의 변형에서, 모든) 특징 (a) 내지 (g)에 부합한다. 특정한 변형에서, 상기 방법은 특징 (a)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b) 및 (c)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c) 및 (d)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c), (d) 및 (e)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c), (d) 및 (f)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c), (d) 및 (g)에 부합한다.
소정의 실시형태에서, 사이징제가 PEG750인 나노명반 입자를 제조하는 방법에 대해, 상기 방법은 하기 특징 중 임의의 하나 이상을 가질 수 있다:
a) 고에너지원의 유형은 마이크로유동화기임;
b) 고에너지원이 발휘한 압력은 약 30kpsi임;
c) 고에너지원을 통한 혼합물의 통과의 횟수는 1회 내지 10회, 예컨대 3회, 6회 또는 10회임;
d) 공정이 발생하는 온도는 약 4℃임;
e) 명반의 농도는 4㎎/㎖임;
f) 사이징제의 농도는 약 30㎎/㎖임; 및
g) 알루미늄염 대 사이징제의 비율은 약 1:7.5임.
일 변형에서, 상기 방법은 특징 (a) 내지 (g) 중 적어도 하나에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 2개 이상의(및 소정의 변형에서, 모든) 특징 (a) 내지 (g)에 부합한다. 특정한 변형에서, 상기 방법은 특징 (a)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b) 및 (c)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c) 및 (d)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c), (d) 및 (e)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c), (d) 및 (f)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c), (d) 및 (g)에 부합한다.
소정의 실시형태에서, 사이징제가 PEG750인 나노명반 입자를 제조하는 방법에 대해, 상기 방법은 하기 특징 중 임의의 하나 이상을 가질 수 있다:
a) 고에너지원의 유형은 마이크로유동화기임;
b) 고에너지원이 발휘한 압력은 약 30kpsi임;
c) 고에너지원을 통한 혼합물의 통과의 횟수는 1회 내지 10회, 예컨대 3회, 6회 또는 10회임;
d) 공정이 발생하는 온도는 약 4℃임;
e) 명반의 농도는 4㎎/㎖임;
f) 사이징제의 농도는 약 20㎎/㎖임; 및
g) 알루미늄염 대 사이징제의 비율은 약 1:5임.
일 변형에서, 상기 방법은 특징 (a) 내지 (f) 중 적어도 하나에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 2개 이상의(및 소정의 변형에서, 모든) 특징 (a) 내지 (f)에 부합한다. 특정한 변형에서, 상기 방법은 특징 (a)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b) 및 (c)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c) 및 (d)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c), (d) 및 (e)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c), (d) 및 (f)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c), (d) 및 (g)에 부합한다.
소정의 실시형태에서, 사이징제가 PAA인 나노명반 입자를 제조하는 방법에 대해, 상기 방법은 하기 특징 중 임의의 하나 이상을 가질 수 있다:
a) 고에너지원의 유형은 마이크로유동화기임;
b) 고에너지원이 발휘한 압력은 약 30kpsi임;
c) 고에너지원을 통한 혼합물의 통과의 횟수는 1회 내지 10회, 예컨대 3회, 6회 또는 10회임;
d) 공정이 발생하는 온도는 약 4℃임;
e) 명반의 농도는 1.6㎎/㎖임;
f) 사이징제의 농도는 약 4.8㎎/㎖임; 및
g) 알루미늄염 대 사이징제의 비율은 약 1:3임.
일 변형에서, 상기 방법은 특징 (a) 내지 (f) 중 적어도 하나에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 2개 이상의(및 소정의 변형에서, 모든) 특징 (a) 내지 (f)에 부합한다. 특정한 변형에서, 상기 방법은 특징 (a)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b) 및 (c)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c) 및 (d)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c), (d) 및 (e)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c), (d) 및 (f)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c), (d) 및 (g)에 부합한다.
Figure 112018119035798-pct00010
Figure 112018119035798-pct00011
소정의 변수 및 이들의 조합이 표 4에 기재된 것과 같은 실시형태의 나노명반 입자를 제조하는 방법에 관여할 수 있는 것으로 이해된다.
소정의 실시형태에서, 사이징제가 DSPE-18C를 갖는 PEG5000인 나노명반 입자를 제조하는 방법에 대해, 상기 방법은 하기 특징 중 임의의 하나 이상을 가질 수 있다:
a) 고에너지원의 유형은 마이크로유동화기임;
b) 고에너지원이 발휘한 압력은 약 30kpsi임;
c) 고에너지원을 통한 혼합물의 통과의 횟수는 1회 내지 10회, 예컨대 3회, 6회 또는 10회임;
d) 사이징제의 농도는 about 8㎎/㎖임; 및
e) 알루미늄염 대 사이징제의 비율은 약 1:2임.
일 변형에서, 상기 방법은 특징 (a) 내지 (e) 중 적어도 하나에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 2개 이상의(및 소정의 변형에서, 모든) 특징 (a) 내지 (e)에 부합한다. 특정한 변형에서, 상기 방법은 특징 (a)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b) 및 (c)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c) 및 (d)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c) 및 (e)에 부합한다.
소정의 실시형태에서, 사이징제가 DSPE-18C를 갖는 PEG2000인 나노명반 입자를 제조하는 방법에 대해, 상기 방법은 하기 특징 중 임의의 하나 이상을 가질 수 있다:
a) 고에너지원의 유형은 마이크로유동화기임;
b) 고에너지원이 발휘한 압력은 약 30kpsi임;
c) 고에너지원을 통한 혼합물의 통과의 횟수는 1회 내지 10회, 예컨대 3회, 6회 또는 10회임;
d) 사이징제의 농도는 약 10㎎/㎖임; 및
e) 알루미늄염 대 사이징제의 비율은 약 1:2.5임.
일 변형에서, 상기 방법은 특징 (a) 내지 (e) 중 적어도 하나에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 2개 이상의(및 소정의 변형에서, 모든) 특징 (a) 내지 (e)에 부합한다. 특정한 변형에서, 상기 방법은 특징 (a)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b) 및 (c)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c) 및 (d)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c) 및 (e)에 부합한다.
소정의 실시형태에서, 사이징제가 DPPE-16C를 갖는 PEG5000인 나노명반 입자를 제조하는 방법에 대해, 상기 방법은 하기 특징 중 임의의 하나 이상을 가질 수 있다:
a) 고에너지원의 유형은 마이크로유동화기임;
b) 고에너지원이 발휘한 압력은 약 30kpsi임;
c) 고에너지원을 통한 혼합물의 통과의 횟수는 1회 내지 10회, 예컨대 3회, 6회 또는 10회임;
d) 사이징제의 농도는 약 1㎎/㎖ 내지 about 8㎎/㎖, 예컨대 4 또는 8㎎/㎖임; 및
e) 알루미늄염 대 사이징제의 비율은 약 1:1 또는 1:2임.
일 변형에서, 상기 방법은 특징 (a) 내지 (e) 중 적어도 하나에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 2개 이상의(및 소정의 변형에서, 모든) 특징 (a) 내지 (e)에 부합한다. 특정한 변형에서, 상기 방법은 특징 (a)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b) 및 (c)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c) 및 (d)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c) 및 (e)에 부합한다.
소정의 실시형태에서, 사이징제가 DPPE-16C를 갖는 PEG2000인 나노명반 입자를 제조하는 방법에 대해, 상기 방법은 하기 특징 중 임의의 하나 이상을 가질 수 있다:
a) 고에너지원의 유형은 마이크로유동화기임;
b) 고에너지원이 발휘한 압력은 약 30kpsi임;
c) 고에너지원을 통한 혼합물의 통과의 횟수는 1회 내지 10회, 예컨대 3회, 6회 또는 10회임;
d) 사이징제의 농도는 약 10㎎/㎖임; 및
e) 알루미늄염 대 사이징제의 비율은 약 1:2.5임.
일 변형에서, 상기 방법은 특징 (a) 내지 (e) 중 적어도 하나에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 2개 이상의(및 소정의 변형에서, 모든) 특징 (a) 내지 (e)에 부합한다. 특정한 변형에서, 상기 방법은 특징 (a)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b) 및 (c)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c) 및 (d)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c) 및 (e)에 부합한다.
소정의 실시형태에서, 사이징제가 DMPE-14C를 갖는 PEG2000인 나노명반 입자를 제조하는 방법에 대해, 상기 방법은 하기 특징 중 임의의 하나 이상을 가질 수 있다:
a) 고에너지원의 유형은 마이크로유동화기임;
b) 고에너지원이 발휘한 압력은 약 30kpsi임;
c) 고에너지원을 통한 혼합물의 통과의 횟수는 1회 내지 10회, 예컨대 3회, 6회 또는 10회임;
d) 사이징제의 농도는 약 10㎎/㎖임; 및
e) 알루미늄염 대 사이징제의 비율은 약 1:25임.
일 변형에서, 상기 방법은 특징 (a) 내지 (e) 중 적어도 하나에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 2개 이상의(및 소정의 변형에서, 모든) 특징 (a) 내지 (e)에 부합한다. 특정한 변형에서, 상기 방법은 특징 (a)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b) 및 (c)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c) 및 (d)에 부합한다. 또 다른 변형에서, 상기 방법은 특징 (a), (b), (c) 및 (e)에 부합한다.
소정의 실시형태에서, 사이징제가 키토산이고, 알루미늄염이 Al(OH)(PO4)(예를 들어, AdjuPhos(등록상표))인 나노명반 입자를 제조하는 방법에 대해, 상기 방법은 하기 특징 중 임의의 조합을 가질 수 있다:
a) 고에너지원의 유형은 고전단 혼합기, 이어서 마이크로유동화기임;
b) 고에너지원이 발휘한 압력은 약 30kpsi임;
c) 마이크로유동화기를 통한 혼합물의 통과의 횟수는 1회 내지 30회, 바람직하게는 10회 내지 30회임;
d) 고전단 혼합기는 약 5,000rpm에서 혼합됨;
e) 명반의 농도는 약 2㎎ 알루미늄/㎖임;
f) 사이징제의 농도는 약 2㎎/㎖임; 및
g) 알루미늄염 대 사이징제의 몰비는 약 1:1임;
h) 사이징제는 저분자량 키토산이다.
소정의 실시형태에서, 사이징제가 덱스트란(예를 들어, 황산덱스트란 나트륨염)이고, 알루미늄염이 AlO(OH)(예를 들어, 알하이드로겔(등록상표))인 나노명반 입자를 제조하는 방법에 대해, 상기 방법은 하기 특징 중 임의의 조합을 가질 수 있다:
a) 고에너지원의 유형은 고전단 혼합기, 이어서 마이크로유동화기임;
b) 고에너지원이 발휘한 압력은 약 30kpsi임;
c) 마이크로유동화기를 통한 혼합물의 통과의 횟수는 1회 내지 30회, 바람직하게는 10회 내지 30회임;
d) 고전단 혼합기는 약 5,000rpm에서 혼합됨;
e) 명반의 농도는 약 2㎎ 알루미늄/㎖임;
f) 사이징제의 농도는 약 0.5㎎/㎖(예를 들어, 0.44㎎/㎖)이다; 및
g) 알루미늄염 대 사이징제의 몰비는 약 4.5:1임;
h) 사이징제는 저분자량 황산덱스트란 나트륨염이다.
소정의 실시형태에서, 사이징제가 키토산이고, 알루미늄염이 AlO(OH)(예를 들어, 알하이드로겔(등록상표))인 나노명반 입자를 제조하는 방법에 대해, 상기 방법은 하기 특징 중 임의의 조합을 가질 수 있다:
a) 고에너지원의 유형은 고전단 혼합기, 이어서 마이크로유동화기임;
b) 고에너지원이 발휘한 압력은 약 30kpsi임;
c) 마이크로유동화기를 통한 혼합물의 통과의 횟수는 1회 내지 30회, 바람직하게는 10회 내지 30회임;
d) 고전단 혼합기는 약 5,000rpm에서 혼합됨;
e) 명반의 농도는 약 2㎎ 알루미늄/㎖임;
f) 사이징제의 농도는 약 1㎎/㎖임; 및
g) 알루미늄염 대 사이징제의 몰비는 약 2:1임;
h) 사이징제는 저분자량 키토산임;
i) 알루미늄염 및 사이징제의 혼합 전에, 알루미늄염은 리간드 교환(예를 들어, 포스페이트 리간드 교환)으로 처리된다.
소정의 실시형태에서, 사이징제가 폴리(알릴아민)이고, 알루미늄염이 AlO(OH)(예를 들어, 알하이드로겔(등록상표))인 나노명반 입자를 제조하는 방법에 대해, 상기 방법은 하기 특징 중 임의의 조합을 가질 수 있다:
a) 고에너지원의 유형은 고전단 혼합기, 이어서 마이크로유동화기임;
b) 고에너지원이 발휘한 압력은 약 30kpsi임;
c) 마이크로유동화기를 통한 혼합물의 통과의 횟수는 1회 내지 30회, 바람직하게는 10회 내지 30회임;
d) 고전단 혼합기는 약 5,000rpm에서 혼합됨;
e) 명반의 농도는 약 2㎎ 알루미늄/㎖임;
f) 사이징제의 농도는 약 0.5㎎/㎖임; 및
g) 알루미늄염 대 사이징제의 몰비는 약 4:1임;
h) 사이징제는 약 15kDa임;
i) 알루미늄염 및 사이징제의 혼합 전에, 알루미늄염은 리간드 교환(예를 들어, 포스페이트 리간드 교환)으로 처리된다.
E. 나노명반 입자의 크기
본 명세서에 제공된 바대로, 알루미늄염 및 사이징제를 포함하는 나노명반 입자의 크기는 약 1㎚ 내지 450㎚의 범위이다.
몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자의 크기는 약 50㎚ 내지 75㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자의 크기는 약 50㎚ 내지 100㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자의 크기는 약 50㎚ 내지 150㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자의 크기는 약 50㎚ 내지 200㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자의 크기는 약 50㎚ 내지 300㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자의 크기는 약 50㎚ 내지 400㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자의 크기는 약 50㎚ 내지 450㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자의 크기는 약 20㎚ 내지 100㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자의 크기는 약 20㎚ 내지 50㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자의 크기는 약 10㎚ 내지 200㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자의 크기는 약 10㎚ 내지 100㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자의 크기는 약 10㎚ 내지 50㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자의 크기는 약 1㎚이거나, 약 5㎚이거나, 약 10㎚이거나, 약 15㎚이거나, 약 20㎚이거나, 약 25㎚이거나, 약 30㎚이거나, 약 35㎚이거나, 약 40㎚이거나, 약 45㎚이거나, 약 50㎚이거나, 약 55㎚이거나, 약 60㎚이거나, 약 65㎚이거나, 약 70㎚이거나, 약 75㎚이거나, 약 80㎚이거나, 약 85㎚이거나, 약 90㎚이거나, 약 95㎚이거나, 약 100㎚이거나, 약 105㎚이거나, 약 110㎚이거나, 약 115㎚이거나, 약 120㎚이거나, 약 125㎚이거나, 약 130㎚이거나, 약 135㎚이거나, 약 140㎚이거나, 약 145㎚이거나, 약 150㎚이거나, 약 155㎚이거나, 약 160㎚이거나, 약 165㎚이거나, 약 170㎚이거나, 약 175㎚이거나, 약 180㎚이거나, 약 185㎚이거나, 약 190㎚이거나, 약 195㎚이거나, 약 200㎚이거나, 약 210㎚이거나, 약 220㎚이거나, 약 240 ㎚이거나, 약 250㎚이거나, 약 260㎚이거나, 약 280㎚이거나, 약 200㎚이거나, 약 300㎚이거나, 약 320㎚이거나, 약 340㎚이거나, 약 350㎚이거나, 약 360㎚이거나, 약 380㎚이거나, 약 400㎚이거나, 약 420㎚이거나, 약 440㎚이거나, 약 450㎚이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자의 크기는 약 1㎚ 이하, 약 5㎚ 이하, 약 10㎚ 이하, 약 15㎚ 이하, 약 20㎚ 이하, 약 25㎚ 이하, 약 30㎚ 이하, 약 35㎚ 이하, 약 40㎚ 이하, 약 45㎚ 이하, 약 50㎚ 이하, 약 55㎚ 이하, 약 60㎚ 이하, 약 65㎚ 이하, 약 70㎚ 이하, 약 75㎚ 이하, 약 80㎚ 이하, 약 85㎚ 이하, 약 90㎚ 이하, 약 95㎚ 이하, 약 100㎚ 이하, 약 105㎚ 이하, 약 110㎚ 이하, 약 115㎚ 이하, 약 120㎚ 이하, 약 125㎚ 이하, 약 130㎚ 이하, 약 135㎚ 이하, 약 140㎚ 이하, 약 145㎚ 이하, 약 150㎚ 이하, 약 155㎚ 이하, 약 160㎚ 이하, 약 165㎚ 이하, 약 170㎚ 이하, 약 175㎚ 이하, 약 180㎚ 이하, 약 185㎚ 이하, 약 190㎚ 이하, 약 195㎚ 이하, 약 199㎚ 이하, 약 210㎚ 이하, 약 230㎚ 이하, 약 250㎚ 이하, 약 270㎚ 이하, 약 290㎚ 이하, 약 310㎚ 이하, 약 330㎚ 이하, 약 350㎚ 이하, 약 370㎚ 이하, 약 390㎚ 이하, 약 410㎚ 이하, 약 430㎚ 이하, 약 440㎚ 이하, 또는 약 449㎚ 이하, 또는 약 450㎚ 이하이다.
몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자는 적어도 0.45 마이크론 필터를 통해 여과될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자는 0.45 마이크론 또는 더 작은 기공 크기 필터를 통해 여과될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자는 0.45 마이크론 필터를 통해 여과될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자는 0.20 마이크론 필터를 통해 여과될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자는 0.22 마이크론 필터를 통해 여과될 수 있다.
F. 안정성
본 명세서에 제공된 몇몇 실시형태에서, 450㎚ 미만의 나노명반 입자의 크기가 유지되고, 사이징제의 부재 하에 알루미늄염과 비교할 때 알루미늄염이 감소된 응집 또는 무 응집을 나타낸다는 점에서, 알루미늄염 및 사이징제를 포함하는 1 내지 450㎚ 나노명반 입자의 크기는 안정적이다.
몇몇 실시형태에서, "안정한"은 나노명반 제제 또는 "응집"하지 않는 나노명반 입자로 이루어진 조성물이 응집이 없거나 아주 적거나, 감소한 응집을 나타내고/내거나, 초기 입자 크기와 비교하여 시간에 걸쳐 제제의 평균 입자 크기 또는 다분산성의 무의 또는 아주 적은 전체 증가를 나타낸다는 것을 의미한다.
나노명반 입자의 안정성은 당업자에게 친숙한 기법에 의해 측정될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 안정성은 시각적으로 관찰된다. 시각 검사는 미립자, 응집물 또는 응집체에 대한 검사를 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 안정성은 나노명반 입자의 크기에 의해 결정된다. 예를 들어, 크기는 x선 및 레이저 회절, 동적 광 산란(DLS), CryoEM 또는 Malvern Zetasize(이들로 제한되지는 않음)를 포함하는 당해 분야에 공지된 기법에 의해 평가될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자의 크기는 Z-평균 직경을 의미한다. 몇몇 실시형태에서, 안정성은 나노명반 입자에서의 알루미늄염의 응집(%)을 평가함으로써 결정된다. 몇몇 실시형태에서, 안정성은 특정한 크기의 필터, 예를 들어 0.20, 0.22 또는 0.45 마이크론 필터를 통해 통과하는 나노명반 입자의 능력에 의해 평가된다. 몇몇 실시형태에서, 안정성은 pH에 의해 결정된다. 몇몇 실시형태에서, 안정성은 예를 들어 동적 광 산란(DLS) 기법의 사용에 의해 다분산성 지수(PdI)의 측정에 의해 결정된다.
몇몇 실시형태에서, 나노입자의 Z-평균 직경은 평가되는 시간 기간에 걸쳐 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 12% 미만, 10% 미만, 7% 미만, 5% 미만, 3% 미만 또는 1% 미만으로 증가한다. 몇몇 실시형태에서, 나노입자의 다분산성 지수(PdI)는 평가되는 시간 기간에 걸쳐 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 25% 미만, 20% 미만, 15% 미만, 12% 미만, 10% 미만, 7% 미만, 5% 미만 또는 3% 미만으로 증가한다.
몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자는 0 내지 8℃에서 안정적이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자는 적어도 1분 동안, 적어도 5분 동안, 적어도 10분 동안, 적어도 15분 동안, 적어도 20분 동안, 적어도 25분 동안, 적어도 30분 동안, 적어도 35분 동안, 적어도 40분 동안, 적어도 45분 동안, 적어도 50분 동안, 적어도 55분 동안, 적어도 1시간 동안, 적어도 2시간 동안, 적어도 6시간 동안, 적어도 12시간 동안, 적어도 18시간 동안, 적어도 24시간 동안, 적어도 48시간 동안, 적어도 72시간 동안, 적어도 1주 동안, 적어도 2주 동안, 적어도 3주 동안, 적어도 1개월 동안, 적어도 2개월 동안, 적어도 3개월 동안, 적어도 4개월 동안, 적어도 5개월 동안, 적어도 6개월 동안, 적어도 7개월 동안, 적어도 8개월 동안, 적어도 9개월 동안, 적어도 10개월 동안, 적어도 11개월 동안, 적어도 1년 동안, 적어도 2년 또는 적어도 5년 동안 0℃, 1℃, 2℃, 3℃, 4℃, 5℃, 6℃, 7℃ 또는 8℃에서 안정적이다.
몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자는 20 내지 30℃에서 안정적이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자는 적어도 1분 동안, 적어도 5분 동안, 적어도 10분 동안, 적어도 15분 동안, 적어도 20분 동안, 적어도 25분 동안, 적어도 30분 동안, 적어도 35분 동안, 적어도 40분 동안, 적어도 45분 동안, 적어도 50분 동안, 적어도 55분 동안, 적어도 1시간 동안, 적어도 2시간 동안, 적어도 6시간 동안, 적어도 12시간 동안, 적어도 18시간 동안, 적어도 24시간 동안, 적어도 48시간 동안, 적어도 72시간 동안, 적어도 1주 동안, 적어도 2주 동안, 적어도 3주 동안, 적어도 1개월 동안, 적어도 2개월 동안, 적어도 3개월 동안, 적어도 4개월 동안, 적어도 5개월 동안, 적어도 6개월 동안, 적어도 7개월 동안, 적어도 8개월 동안, 적어도 9개월 동안, 적어도 10개월 동안, 적어도 11개월 동안, 적어도 1년 동안, 적어도 2년 또는 적어도 5년 동안 25℃에서 안정적이다.
몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자는 35 내지 40℃에서 안정적이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자는 적어도 1분 동안, 적어도 5분 동안, 적어도 10분 동안, 적어도 15분 동안, 적어도 20분 동안, 적어도 25분 동안, 적어도 30분 동안, 적어도 35분 동안, 적어도 40분 동안, 적어도 45분 동안, 적어도 50분 동안, 적어도 55분 동안, 적어도 1시간 동안, 적어도 2시간 동안, 적어도 6시간 동안, 적어도 12시간 동안, 적어도 18시간 동안, 적어도 24시간 동안, 적어도 48시간 동안, 적어도 72시간 동안, 적어도 1주 동안, 적어도 2주 동안, 적어도 3주 동안, 적어도 1개월 동안, 적어도 2개월 동안, 적어도 3개월 동안, 적어도 4개월 동안, 적어도 5개월 동안, 적어도 6개월 동안, 적어도 7개월 동안, 적어도 8개월 동안, 적어도 9개월 동안, 적어도 10개월 동안, 적어도 11개월 동안, 적어도 1년 동안, 적어도 2년 또는 적어도 5년 동안 35℃, 36℃, 37℃, 38℃, 39℃ 또는 40℃에서 안정적이다.
몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자는 57 내지 62℃에서 안정적이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자는 적어도 1분 동안, 적어도 5분 동안, 적어도 10분 동안, 적어도 15분 동안, 적어도 20분 동안, 적어도 25분 동안, 적어도 30분 동안, 적어도 35분 동안, 적어도 40분 동안, 적어도 45분 동안, 적어도 50분 동안, 적어도 55분 동안, 적어도 1시간 동안, 적어도 2시간 동안, 적어도 6시간 동안, 적어도 12시간 동안, 적어도 18시간 동안, 적어도 24시간 동안, 적어도 48시간 동안, 적어도 72시간 동안, 적어도 1주 동안, 적어도 2주 동안, 적어도 3주 동안, 적어도 1개월 동안 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃ 또는 62℃에서 안정적이다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 나노명반 입자는 적어도 2년 동안 4℃에서 안정적이다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 나노명반 입자는 4℃ 적어도 4년 동안 4℃에서 안정적이다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 나노명반 입자는 적어도 5년 동안 4℃에서 안정적이다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 나노명반 입자는 적어도 1개월 동안 25℃에서 안정적이다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 나노명반 입자는 적어도 2주 동안 37℃에서 안정적이다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 나노명반 입자는 적어도 2주 동안 60℃에서 안정적이다.
몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자는 1회 내지 4회 동결 해동 후 안정적이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자는 1회, 2회, 3회 또는 4회 동결 해동 후 안정적이다.
IV. 나노명반 입자 조성물
나노명반 입자를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공되고, 나노명반 입자는 알루미늄염 및 사이징제를 포함하고, 나노명반 입자의 크기는 약 1㎚ 내지 450㎚의 크기이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 조성물의 평균 크기는 약 50㎚ 내지 75㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 조성물의 평균 크기는 약 50㎚ 내지 100㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 조성물의 평균 크기는 약 50㎚ 내지 150㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 조성물의 평균 크기는 약 50㎚ 내지 200㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 조성물의 평균 크기는 약 50㎚ 내지 300㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 조성물의 평균 크기는 약 50㎚ 내지 400㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 조성물의 평균 크기는 약 50㎚ 내지 450㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 조성물의 평균 크기는 약 20㎚ 내지 100㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 조성물의 평균 크기는 약 20㎚ 내지 50㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 조성물의 평균 크기는 약 10㎚ 내지 200㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 조성물의 평균 크기는 약 10㎚ 내지 100㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 조성물의 평균 크기는 약 10㎚ 내지 50㎚의 범위이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 조성물의 평균 크기는, DLS에 의해 측정될 때, 약 1㎚이거나, 약 5㎚이거나, 약 10㎚이거나, 약 15㎚이거나, 약 20㎚이거나, 약 25㎚이거나, 약 30㎚이거나, 약 35㎚이거나, 약 40㎚이거나, 약 45㎚이거나, 약 50㎚이거나, 약 55㎚이거나, 약 60㎚이거나, 약 65㎚이거나, 약 70㎚이거나, 약 75㎚이거나, 약 80㎚이거나, 약 85㎚이거나, 약 90㎚이거나, 약 95㎚이거나, 약 100㎚이거나, 약 105㎚이거나, 약 110㎚이거나, 약 115㎚이거나, 약 120㎚이거나, 약 125㎚이거나, 약 130㎚이거나, 약 135㎚이거나, 약 140㎚이거나, 약 145㎚이거나, 약 150㎚이거나, 약 155㎚이거나, 약 160㎚이거나, 약 165㎚이거나, 약 170㎚이거나, 약 175㎚이거나, 약 180㎚이거나, 약 185㎚이거나, 약 190㎚이거나, 약 195㎚이거나, 약 200㎚이거나, 약 210㎚이거나, 약 220㎚이거나, 약 240㎚이거나, 약 약 250㎚이거나, 약 260㎚이거나, 약 280㎚이거나, 약 200㎚,is 약 300㎚이거나, 약 320㎚이거나, 약 340㎚이거나, 약 350㎚이거나, 약 360㎚이거나, 약 380㎚,is 약 400㎚이거나, 약 420㎚이거나, 약 440㎚이거나, 약 450㎚이다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 조성물의 평균 크기는 약 1㎚ 이하, 약 5㎚ 이하, 약 10㎚ 이하, 약 15㎚ 이하, 약 20㎚ 이하, 약 25㎚ 이하, 약 30㎚ 이하, 약 35㎚ 이하, 약 40㎚ 이하, 약 45㎚ 이하, 약 50㎚ 이하, 약 55㎚ 이하, 약 60㎚ 이하, 약 65㎚ 이하, 약 70㎚ 이하, 약 75㎚ 이하, 약 80㎚ 이하, 약 85㎚ 이하, 약 90㎚ 이하, 약 95㎚ 이하, 약 100㎚ 이하, 약 105㎚ 이하, 약 110㎚ 이하, 약 115㎚ 이하, 약 120㎚ 이하, 약 125㎚ 이하, 약 130㎚ 이하, 약 135㎚ 이하, 약 140㎚ 이하, 약 145㎚ 이하, 약 150㎚ 이하, 약 155㎚ 이하, 약 160㎚ 이하, 약 165㎚ 이하, 약 170㎚ 이하, 약 175㎚ 이하, 약 180㎚ 이하, 약 185㎚ 이하, 약 190㎚ 이하, 약 195㎚ 이하, 약 199㎚ 이하, 약 210㎚ 이하, 약 230㎚ 이하, 약 250㎚ 이하, 약 270㎚ 이하, 약 290㎚ 이하, 약 310㎚ 이하, 약 330㎚ 이하, 약 350㎚ 이하, 약 370㎚ 이하, 약 390㎚ 이하, 약 410㎚ 이하, 약 430㎚ 이하, 약 440㎚ 이하, 또는 약 449㎚ 이하이다.
몇몇 실시형태에서, 조성물은 여과 가능하고, 바이알 투입 전에 최종 무균화 가능하다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 0.45 마이크론 필터를 통해 여과될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 0.20 마이크론 필터를 통해 여과될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 0.22 마이크론 필터를 통해 여과될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 조성물은 수성 제제로서 유지된다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 동결건조 제제로서 유지된다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 분무 건조된 제제로서 유지된다.
몇몇 실시형태에서, 조성물은 나노명반 및 에멀션을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물의 에멀션은 유중수 에멀션이다. 몇몇 실시형태에서, 조성물의 에멀션은 피커링 에멀션(pickering emulsion)이다. 몇몇 실시형태에서, 조성물의 에멀션은 수중유 에멀션이다. 몇몇 실시형태에서, 에멀션의 오일은 생분해성 오일이다. 추가의 실시형태에서, 오일은 스쿠알렌이다. 다른 실시형태에서, 오일은 합성 생분해성 오일이다.
리포솜 및 리포솜은 당해 분야에 공지된 나노베시클 유래이고[8], 본 개시내용의 나노명반과 사용될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 나노명반 입자를 함유하는 리포솜을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 나노명반 및 리포솜을 포함하고, 리포솜은 양이온성 리포솜이다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 나노명반 및 리포솜을 포함하고, 리포솜은 음이온성 리포솜이다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 나노명반 및 리포솜을 포함하고, 리포솜은 중성 리포솜이다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 나노명반 및 리포솜을 포함하고, 리포솜은 아르카에솜(archaeosome)이다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 나노명반 및 리포솜을 포함하고, 리포솜은 비로솜(virosome)이다.
A. 생물활성제
몇몇 실시형태에서, 조성물은 하나 이상의 생물활성제를 추가로 포함하고, 예를 들어 생물활성제는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 항원, 애쥬번트, 진단제, 치료제, 유기체, 바이러스, 바이러스 게놈일 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 조성물은 2개 이상의 생물활성제를 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 생물활성제는 나노명반 입자와 연관된다. 몇몇 실시형태에서, 생물활성제는 리간드 교환에 의해 및/또는 정전기(전하 기반) 상호작용에 의해 나노명반 입자와 연관된다. 몇몇 실시형태에서, 조성물에 존재하는 생물활성제의 적어도 25%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 97%, 적어도 99%는 나노명반 입자와 연관된다. 몇몇 실시형태에서, 생물활성제와 나노명반 입자의 연관의 백분율은 겔 전기영동 또는 UV 분광법에 의해 결정된다. 회합의 백분율을 결정하는 하나의 예시적인 방법은 실시예에서 입증된다.
i. 거대분자
몇몇 실시형태에서, 생물활성제는 거대분자이다. 거대분자는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드 또는 항원을 포함할 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시형태에서, 거대분자는 천연 발생이다. 몇몇 실시형태에서, 거대분자는 합성이다. 몇몇 실시형태에서, 거대분자는 표지되거나 태그화된다.
a. 폴리뉴클레오타이드
단백질, 단백질 아단위 및 불활성화된 병원균은 항체 반응(체액 면역)의 효율적인 자극제이고, 체액 면역이 보호의 강한 연관성인 다수의 감염성 질환에 대한 성공적인 백신으로서 성공적으로 개발되었다. 그러나, 몇몇 만성 감염성 질환 또는 암에 대해, 체액 반응 이외에, 전통적인 세포 또는 세포용해 T 세포 반응은 필요할 수 있다. 세포 면역 반응의 전통적인 생성은 주요 조직접합성 분자의 상황에서 항원의 내인성 또는 세포내 제시로부터 생긴다. 이것은 세포내 항원을 코딩하기 위한 핵산의 전달이 만성 감염 및 암에 대한 더 성공적인 백신접종 전략을 발생시킬 수 있다는 것을 조사자들이 이론화하게 하였다. RNA 백신은 이론적으로 숙주의 주요 조직접합성 분자의 상황에서 더 효율적으로 제시되는 RNA에 의해 전사되는 단백질의 능력에 기초하는 핵산 전달에 대한 특히 매력적이다. 당해 분야에서의 RNA 백신의 전달은 예를 들어 알파바이러스 작제물로부터 발현된 메신저 RNA 및 복제 RNA 작제물의 전달을 포함하고, 이들 듈 다는 세포에서의 RNA 코딩된 단백질의 전달 및 발현에 의존한다. 이 접근법이 이론상 유망한 것으로 보이지만, 실제는 현재까지, RNA 백신의 개발은 RNA를 제조하는 비용, 생체내 RNA의 비효율적인 상대 전달, 네이키드 RNA의 불안정성 및 RNA의 발현의 생체내 상대 수준에 의해 제한된다. 단순하게, 모든 이들 제한은 생체내 RNA의 효율적인 전달의 부족에 기인할 수 있다. 최근에, 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드의 도입, ARCA 캡 및 신장된 폴리(A) 꼬리를 포함하는 RNA 구조의 변형 및 네이키드 RNA로부터 양이온성 지질 및 중합체성 전달 비히클에 이르는 RNA에 대한 전달 전략의 평가를 포함하는 이 제한을 해결하도록 다수의 전략이 이용되었다(1-5). 아마도, RNA의 전달에 대한 가장 잘 연구된 제제는 양이온성 지질, DOTAP, DOTAP, 소르비탄 트라이올레에이트, 폴리소르비탄 및 스쿠알렌으로 이루어진 양이온성 에멀션이다(5). 이 양이온성 리포솜이 입자의 코어에서 캡슐화된 RNA를 갖는 합성 지질 나노입자로 자가 조립하는 것으로 입증되었다. 이 양이온성 리포솜이 RNA 백신을 전달하고 면역 반응을 유도하는 능력을 입증하지만, 이 제제의 제조는 더 복잡하고 비싸다. 당해 분야에서 필요한 것은 RNA 및 DNA를 포함하는 폴리뉴클레오타이드의 전달을 위한 최종 무균화 제제를 포함하는 안정하고 저렴하고 대규모 제조에 수정 가능한 것이다.
몇몇 실시형태에서, 생물활성제는 폴리뉴클레오타이드이다. 폴리뉴클레오타이드는 DNA, RNA, 압타머 및 올리고뉴클레오타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 DNA이다. 몇몇 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 RNA이다. 몇몇 실시형태에서, DNA 또는 RNA는 단일 가닥 또는 이중 가닥이다. 몇몇 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 비코딩 RNA이다. 몇몇 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 코딩 RNA이다. 몇몇 실시형태에서, RNA는 레플리콘 RNA, mRNA, tRNA, siRNA, shRNA, Rig I 및 마이크로RNA로 이루어진 군으로부터 선택된다.
몇몇 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 폴리펩타이드를 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 하기 추가로 기재된 바와 같이 항원이거나 항원을 포함하는 폴리펩타이드를 코딩한다. 몇몇 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 폴리펩타이드는 융합 단백질이다. 몇몇 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 폴리펩타이드는 ID93이다.
구체적인 일 실시형태에서, 나노입자는 PEG 사이징제를 포함하고, 물질은 RNA이다.
구체적인 일 실시형태에서, 나노입자는 PAA 사이징제를 포함하고, 물질은 RNA이다.
1. 재조합 발현 작제물
본 명세서에서 개시된 소정의 실시형태에 따라, 본 명세서에 기재된 조성물은 핵산 폴리펩타이드를 코딩하는 서열에 작동 가능하게 연결된 촉진자를 포함하는 적어도 하나의 재조합 발현 작제물을 함유할 수 있다. 소정의 추가의 실시형태에서, 재조합 발현 작제물은 바이러스 벡터, 예컨대 아데노바이러스, 아데노 연관된 바이러스, 헤르페스바이러스, 렌티바이러스, 폭스바이러스 또는 레트로바이러스 벡터에 존재한다. 이러한 발현 작제물 및 벡터를 제조하고 사용하기 위한 조성물 및 방법은 예를 들어 문헌[Ausubel et al. (Eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 2006 John Wiley & Sons, NY]에 따라 본 명세서에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드 항원의 발현을 위해 당해 분야에 공지되어 있다. 재조합 발현 작제물의 비제한적인 예는 일반적으로 소정의 현재 개시된 실시형태에서 사용하기 위한 본 명세서에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드 항원의 발현에 적용될 수 있는 교시내용으로, 예를 들어 미국 특허 제6,844,192호; 제7,037,712호; 제7,052,904호; 제7,001,770호; 제6,106,824호; 제5,693,531호; 제6,613,892호; 제6,875,610호; 제7,067,310호; 제6,218,186호; 제6,783,981호; 제7,052,904호; 제6,783,981호; 제6,734,172호; 제6,713,068호; 제5,795,577호 및 제6,770,445호, 및 그 외에서 발견될 수 있다.
2. 대안적인 뉴클레오사이드간 연결 및 핵산 유사체
몇몇 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 대안적인 뉴클레오사이드간 연결 또는 핵산 유사체를 포함한다. 예를 들어, 일 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 포스포로다이티오에이트 또는 포스포로티오에이트 결합을 포함하지만, 포스포다이에스터 및 다른 뉴클레오타이드간 결합은 혼합된 뉴클레오타이드간 연결을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 본 개시내용의 범위 내에 있다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드 또는 포스포로다이티오에이트를 제조하는 방법은 미국 특허 제5,666,153호, 제5,278,302호 및 제WO95/26204호에 기재되어 있다.
3. 레플리콘
몇몇 실시형태에서, 폴리뉴클레오타이드는 레플리콘이다. 몇몇 실시형태에서, 레플리콘은 플라스미드, 코스미드, 박미드, 파지 또는 주로 그 자체의 제어 하에 복제할 수 있는 바이러스이다. 몇몇 실시형태에서, 레플리콘은 RNA 또는 DNA이다. 몇몇 실시형태에서, 레플리콘은 단일 또는 이중 가닥이다. 몇몇 실시형태에서, 레플리콘은 RNA 바이러스로부터 유래된다.
b. 폴리펩타이드
몇몇 실시형태에서, 생물활성제는 폴리펩타이드이다. 따라서, 이 실시형태에서, 기재된 조성물은 본 명세서에 제공된 나노명반 입자를 포함하고, 폴리펩타이드를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 폴리펩타이드는 전장 단백질 또는 이의 단편이다. 몇몇 실시형태에서, 폴리펩타이드는 펩타이드이다. 몇몇 실시형태에서, 폴리펩타이드는 융합 단백질이다. 몇몇 특정한 실시형태에서, 융합 단백질은 개인에 대한 투여 시 면역 반응을 유발할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 폴리펩타이드는 하기 추가로 기재된 바대로 항원이다.
c. 항원
몇몇 실시형태에서, 생물활성제는 항원이다. 몇몇 실시형태에서, 항원은 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 폴리펩타이드이다. 몇몇 실시형태에서, 항원은 폴리뉴클레오타이드에 의해 코딩된 폴리펩타이드이다. 몇몇 실시형태에서, 항원은 폴리펩타이드를 코딩하는 본 개시내용의 나노명반 제제에 의해 전달된 DNA 폴리뉴클레오타이드이다. 몇몇 실시형태에서, 항원은 폴리펩타이드를 코딩하는 본 개시내용의 나노명반 제제에 의해 전달된 RNA 폴리뉴클레오타이드이다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 기재된 조성물은 본 명세서에 제공된 나노명반 입자 중 임의의 하나를 포함하고, 나노명반 입자의 항원이 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드로서 제공된 항원을 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 항원은 알레르기, 암 또는 감염성 질환에 관여하거나 이로부터 유래된다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 백신접종 목적에 유용하고, 백신 제제(백신 조성물)로서 제공된다.
항원은 임의의 표적 에피토프, 분자(생물분자), 분자 복합체(생물분자를 함유하는 분자 복합체 포함), 세포이하 어셈블리, 대상체가 원하는 면역반응성의 유발 또는 증대에 대항한 세포 또는 조직일 수 있다. 흔히, 용어 항원은 관심 대상의 폴리펩타이드 항원을 의미할 것이다. 그러나, 본 명세서에 사용된 바와 같은 항원은 또한 관심 대상의 폴리펩타이드 항원을 코딩하는 재조합 작제물(예를 들어, 발현 작제물)을 의미할 수 있다. 소정의 실시형태에서, 항원은 감염성 병원균 및/또는 에피토프, 생물분자, 감염, 암, 자가면역 질환, 알레르기, 자폐증 또는 항원 특이적 면역 반응의 자극이 바람직하거나 유리한 임의의 다른 병태와 연관된 세포 또는 조직일 수 있거나, 이들로부터 유래될 수 있거나, 이들과 면역학적으로 교차반응성일 수 있다.
따라서, 소정의 실시형태는 적어도 하나의 감염성 병원균, 예컨대 박테리아, 바이러스 또는 진균, 예를 들어 악티노박테륨(Actinobacterium), 예컨대 엠. 투베르큘로시스(M. tuberculosis) 또는 엠. 레프라에(M. leprae) 또는 또 다른 마이코박테륨; 박테리아, 예컨대 살모넬라(Salmonella), 네이세리아(Neisseria), 보렐리아(Borrelia), 클라마이디아(Chlamydia) 또는 보르데텔라(Bordetella) 속의 구성원; 바이러스, 예컨대 단순 포진 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스(human immunodeficiency virus: HIV), 고양이 면역결핍 바이러스(feline immunodeficiency virus: FIV), 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus), 바리셀라 조스터 바이러스(Varicella Zoster Virus), 간염 바이러스, 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr Virus: EBV), 호흡기 세포융합 바이러스(respiratory syncytial virus), 인간 유두종 바이러스(human papilloma virus: HPV) 및 사이토메갈로바이러스; HIV, 예컨대 HIV-1 또는 HIV-2; 진균, 예컨대 아스퍼질러스(Aspergillus), 블라스토마이세스(Blastomyces), 코시디오이데스(Coccidioides) 및 뉴모사이스티(Pneumocysti) 또는 효모, 예를 들어 킨디다(Candida) 종, 예컨대 씨. 알비칸스(C. albicans), 씨. 글라브라타(C. glabrata), 씨. 크루세이(C. krusei), 씨. 루시타니아에(C. lusitaniae), 씨. 트로피칼리스(C. tropicalis) 및 씨. 파랍실로시스(C. parapsilosis); 기생충, 예컨대 원생동물, 예를 들어 플라스모듐(Plasmodium) 종, 예를 들어 피. 팔시파룸(P. falciparum), 피. 비박스(P. vivax), 피. 말라리아에(P. malariae) 및 피. 오발레(P. ovale); 또는 또 다른 기생충, 예컨대 아칸타모에바(Acanthamoeba), 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 안지오스트론길루스(Angiostrongylus), 스키스토소마 만소니(Schistosoma mansonii), 스키스토소마 하에마토비움(Schistosoma haematobium), 스키스토소마 야포니쿰(Schistosoma japonicum), 크립토스포리듐(Cryptosporidium), 안킬로스토마(Ancylostoma), 엔타모에바 히스톨리티카(Entamoeba histolytica), 엔타모에바 콜리(Entamoeba coli), 엔타모에바 디스파르(Entamoeba dispar), 엔타모에바 하르트마니(Entamoeba hartmanni), 엔타모에바 폴레키(Entamoeba polecki), 우체레리아 반크로프티(Wuchereria bancrofti), 기아르디아(Giardia) 및 리슈마니어(Leishmania)로부터 유래된 항원을 고려한다.
예를 들어, 소정의 실시형태에서, 항원은 보렐리아 종으로부터 유래된다, 항원은 핵산, 병원균 유래된 항원 또는 항원성 제제, 재조합으로 제조된 단백질 또는 펩타이드 및 키메라 융합 단백질을 포함할 수 있다. 하나의 이러한 항원은 OspA이다. OspA는 숙주 세포에서 이의 생합성에 의해 지질화된 형태의 완전 성숙 단백질(Lipo-OspA)일 수 있거나, 대안적으로 비지질화된 유도체일 수 있다. 이러한 비지질화된 유도체는 인플루엔자 바이러스의 비구조적 단백질(NS1)의 처음의 81 N 말단 아미노산을 갖는 비지질화된 NS1-OspA 융합 단백질 및 완전한 OspA 단백질을 포함하고, 또 다른 MDP-OspA는 3개의 추가적인 N 말단 아미노산을 보유하는 OspA의 비지질화된 형태이다.
소정의 실시형태에서, 항원은 바이러스, 예컨대 HIV-1, (예컨대, tat, nef, gp120 또는 gp160), 인간 헤르페스 바이러스, 예컨대 gD 또는 이의 유도체 또는 즉시 초기 단백질, 예컨대 HSV1 또는 HSV2 유래의 ICP27, 사이토메갈로바이러스(특히, 인간)(예컨대, gB 또는 이의 유도체), 로타바이러스(생 약동화 바이러스 포함), 엡스타인 바 바이러스(예컨대, gp350 또는 이의 유도체), 바리셀라 조스터 바이러스(예컨대, gpl, II 및 IE63), 또는 간염 바이러스, 예컨대 B형 간염 바이러스(예를 들어, B형 간염 표면 항원 또는 이의 유도체), A형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스 및 E형 간염 바이러스, 또는 다른 바이러스 병원균, 예컨대 파라믹소바이러스: 호흡기 세포융합 바이러스(예컨대, F 및 G 단백질 또는 이의 유도체), 파라인플루엔자 바이러스, 홍역 바이러스, 볼거리 바이러스, 인간 유두종 바이러스(예를 들어, HPV6, 11, 16, 18 등), 플라비바이러스(예를 들어, 황열 바이러스, 뎅기 바이러스, 진드기 매개 뇌염 바이러스, 일본 뇌염 바이러스, 웨스트 나일 바이러스, 지카 바이러스, 포와산 바이러스(Powassan virus)) 또는 인플루엔자 바이러스(난 또는 MDCK 세포에서 성장한 완전 생 또는 불활화된 바이러스, 스플릿 인플루엔자 바이러스, 또는 완전 플루 비로솜(문헌[Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920]에 의해 기재된 바와 같음) 또는 이의 정제된 또는 재조합 단백질, 예컨대 HA, NP, NA 또는 M 단백질, 또는 이들의 조합)로부터 유래된다.
소정의 다른 실시형태에서, 항원은 하나 이상의 박테리아 병원균, 예컨대 네이세리아 종, 예를 들어 엔. 고노레아(N. gonorrhea) 및 엔. 메닌기티디스(N. meningitidis)(예를 들어, 피막 다당류 및 이의 접합체, 트랜스페린 결합 단백질, 락토페린 결합 단백질, PilC, 부착소); 에스. 피요게네스(S. pyogenes)(예를 들어, 엠 단백질 또는 이의 단편, C5A 프로테아제, 리포테이코산), 에스. 아갈락티아에(S. agalactiae), 에스. 뮤탄스(S. mutans): 에이치. 두크레이(H. ducreyi); 모락셀라 종, 예를 들어 브란하멜라 카타랄리스(Branhamella catarrhalis)로도 공지된 엠. 카타랄리스(예를 들어, 고분자량 및 저분자량 부착소 및 인바신); 보르데텔라 종, 예를 들어 비. 페르투시스(B. pertussis)(예를 들어, 페르탁틴, 페르투시스 독소 또는 이의 유도체, 섬모성 적혈구응집원, 아데닐레이트 시클라제, 핌브리아에(fimbriae)), 비. 파라페르투시스(B. parapertussis) 및 비. 브론키셉티카(B. bronchiseptica); 마이코박테륨 종, 예를 들어 엠. 투베르큘로시스(예를 들어, ESAT6, 항원 85A, -B 또는 -C), 엠. 보비스, 엠. 레프라에, 엠. 아비움, 엠. 파라투베르큘로시스, 엠. 스메그마티스; 레지오넬라 종, 예를 들어 엘. 뉴모필라; 에스체리치아 종, 예를 들어 장독소 이. 콜라이(예를 들어, 콜로니화 인자, 열 불안정 독소 또는 이의 유도체, 열 안정 독소 또는 이의 유도체), 장출혈 이. 콜라이, 장병원성 이. 콜라이(예를 들어, 쉬가 독소 유사 독소 또는 이의 유도체); 비브리오 종, 예를 들어 브이. 콜레라(예를 들어, 콜레라 독소 또는 이의 유도체); 쉬겔라 종, 예를 들어 에스. 손네이(S. sonnei), 에스. 디센테리아에(S. dysenteriae), 에스. 플렉스네리(S. flexnerii); 예르시니아 종, 예를 들어 와이. 엔테로콜리티카(예를 들어, Yop 단백질), 와이. 페스티스(Y. pestis), 와이. 슈도투베르큘로시스(Y. pseudotuberculosis); 캄필로박터 종, 예를 들어 씨. 제주니(예를 들어, 독소, 부착소 및 인바신) 및 씨. 콜리; 살모넬라 종, 예를 들어 에스. 티피(S. typhi). 에스. 파라티피(S. paratyphi), 에스. 콜레라에수이스(S. choleraesuis ), 에스. 엔테리티디스(S. enteritidis); 리스테리아 종, 예를 들어 엘. 모노사이토게네스; 헬리코박터 종, 예를 들어 에이치. 파일로리(예를 들어, 우레아제, 카탈라제, 공포형성 독소); 슈도모나스 종, 예를 들어 피. 아에루기노사; 스타필로코커스 종, 예를 들어 에스. 아우레우스(S. aureus), 에스. 에피데르미디스(S. epidermidis); 엔테로코커스 종, 예를 들어 이. 파에칼리스(E. faecalis), 이. 파에슘(E. faecium); 클로스트리듐 종, 예를 들어 씨. 테타니(C. tetani)(예를 들어, 파상풍 독소 및 이의 유도체), 씨. 보툴리늄(예를 들어, 보툴리늄 독소 및 이의 유도체), 씨. 디피실(예를 들어, 클로스트리듐 독소 A 또는 B 및 이의 유도체); 바실러스 종, 예를 들어 비. 안트라시스(예를 들어, 보툴리늄 독소 및 이의 유도체); 코리네박테륨 종, 예를 들어 씨. 디프테리아에(예를 들어, 디프테리아 독소 및 이의 유도체); 보렐리아 종, 예를 들어 비. 부르그도르페리(예를 들어, OspA, OspC, DbpA, DbpB), 비. 가리니(B. garinii)(예를 들어, OspA, OspC, DbpA, DbpB), 비. 아프젤리(B. afzelii)(예를 들어, OspA, OspC, DbpA, DbpB), 비. 안데르소니(B. andersonii)(예를 들어, OspA, OspC, DbpA, DbpB), 비. 헤름시(B. hermsii); 엘리키아 종(Ehrlichia spp .), 예를 들어 이. 에퀴(E. equi) 및 인간 과립구 에를리히아증의 물질; 리켓치시아 종(Rickettsia spp), 예를 들어 알. 리켓치(R. rickettsii); 클라마이디아 종(Chlamydia spp .), 예를 들어 씨. 트라초마티스(C. trachomatis)(예를 들어, MOMP, 헤파린 결합 단백질), 씨. 뉴모니아에(예를 들어, MOMP, 헤파린 결합 단백질), 씨. 프시타시(C. psittaci); 렙토스피라 종(Leptospira spp .), 예를 들어 엘. 인테로간스(L. interrogans); 트레포네마 종(Treponema spp .), 예를 들어 티. 팔리듐(T. pallidum)(예를 들어, 희귀 외막 단백질), 티. 덴티콜라(T. denticola), 티. 하이오디센테리에(T. hyodysenteriae); 또는 다른 박테리아 병원균으로부터 유래된다.
소정의 다른 실시형태에서, 항원은 하나 이상의 기생충(예를 들어, 문헌[John, D.T. and Petri, W.A., Markell and Voge's Medical Parasitology-9th Ed., 2006, WB Saunders, Philadelphia; Bowman, D.D., Georgis' Parasitology for Veterinarians-8th Ed., 2002, WB Saunders, Philadelphia] 참조), 예컨대 플라스모듐 종(Plasmodium spp.), 예를 들어 피. 팔시파룸(P. falciparum); 톡소플라스마 종(Toxoplasma spp .), 예를 들어 티. 곤디(T. gondii)(예를 들어, SAG2, SAG3, Tg34); 엔타모에바 종, 예를 들어 이. 히스톨리티카(E. histolytica); 바베시아 종(Babesia spp.), 예를 들어 비. 마이크로티(B. microti); 트리파노소마 종(Trypanosoma spp.), 예를 들어 티. 크루지(T. cruzi); 기아르디아 종(Giardia spp.), 예를 들어 지. 람블리아(G. lamblia); 레슈마니아 종, 예를 들어 엘. 메이저(L. major); 뉴모사이스티스 종(Pneumocystis spp .), 예를 들어 피. 카리니(P. carinii); 트리초모나스 종, 예를 들어 티. 바기날리스(T. vaginalis); 또는 포유류를 감염시킬 수 있는 연충, 예컨대 (i) 선충 감염(엔테로비우스 베르미쿨라리스(Enterobius vermicularis), 아스카리스 룸브리코이데스(Ascaris lumbricoides), 트리추리스 트리추리아(Trichuris trichuria), 네카터 아메리카누스(Necator americanus), 안사일로스토마 듀오데날레(Ancylostoma duodenale), 우체레리아 반크로프티(Wuchereria bancrofti), 브루기아 말라위(Brugia malayi), 온쵸세르카 볼불루스(Onchocerca volvulus), 드라칸쿨루스 메디넨시스(Dracanculus medinensis), 트리치넬라 스피랄리스(Trichinella spiralis) 및 스트론길로이데스 스테르코랄리스(Strongyloides stercoralis)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않음); (ii) 흡충 감염(스키스토소마 만소니, 스키스토소마 헤마토비움, 스키스토소마 야포니쿰, 스키스토소마 메콘기(Schistosoma mekongi), 오피스토르치스 시넨시스(Opisthorchis sinensis), 파라고니무스 종(Paragonimus sp), 패시올라 헤파티카(Fasciola hepatica), 패시올라 마그나(Fasciola magna), 패시올라 기간티카(Fasciola gigantica)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않음); 및 (iii) 촌충 감염(타에니아 사기나타(Taenia saginata) 및 타에니아 솔리움(Taenia solium)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않음)으로부터 유래된다. 소정의 실시형태에서, 항원은 스키스토소마 종, 스키스토소마 만소니, 스키스토소마 헤마토비움, 및/또는 스키스토소마 야포니쿰으로부터 유래되거나, 효모, 예컨대 킨디다 종, 예를 들어 씨. 알비칸스; 크립토코커스 종, 예를 들어 씨. 네오포르만스로부터 유래된다.
다른 특이적 항원은 엠. 투베르큘로시스, 예를 들어 Th Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 및 hTCC1(WO 99/51748)로부터 유래된다. 엠. 투베르큘로시스에 대한 단백질은 또한 융합 단백질 및 엠. 투베르큘로시스의 적어도 2개, 3개 또는 4개 또는 이것 초과의 폴리펩타이드가 더 큰 단백질로 융합된 이의 변이체를 포함한다. 소정의 융합은 Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI(WO 99151748)를 포함한다. 사용될 수 있는 다른 항원은 US 제2010/0129391호 및 WO 제2008/124647호에 기재된 항원, 항원의 조합 및 융합 단백질을 포함한다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 융합 단백질은 ID93이다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 융합 단백질은 ID91이다.
다른 특이적 항원은 리슈마니어로부터 유래되고, 예를 들어 본 개시내용의 리슈마니어 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 임의의 다양한 절차를 이용하여 임의의 다양한 리슈마니어 종, 예를 들어 엘. 도노보니, 엘. 샤가시, 엘. 인판툼, 엘. 메이저, 엘. 아마조넨시스, 엘. 브라질리엔시스, 엘. 파나멘시스, 엘. 멕시키나, 엘. 트로픽스 및 엘. 구이아넨시스(이들로 제한되지는 않음)를 사용하여 제조되거나 단리될 수 있다. 이러한 종은 예를 들어 미국 균주 협회(American Type Culture Collection: ATCC)(메릴랜드주 록빌)로부터 이용 가능하다. 리슈마니어에 대한 단백질은 또한 융합 단백질 및 리슈마니어의 적어도 2개, 3개 또는 4개 또는 이것 초과의 폴리펩타이드가 WO 2009/012166, WO 2014/160987, WO 2014/160985에 기재된 바대로 더 큰 단백질로 융합된 이의 변이체를 포함하고, 하나의 예시적인 실시형태에서, 융합 단백질은 본 명세서에 기재된 바와 같은 EMCH이다.
다른 특이적 항원은 클라마이디아로부터 유래되고, 예를 들어 고분자량 단백질(HWMP)(WO 99/17741), ORF3(EP 366 412) 및 추정상 막 단백질(Pmps)을 포함한다. 다른 클라마이디아 항원은 WO 99128475에 기재된 군으로부터 선택될 수 있다. 소정의 항원은 스트렙토코커스 종, 예를 들어 에스. 뉴모니아에(예를 들어, 피막 다당류 및 이의 접합체, PsaA, PspA, 스트렙톨리신, 콜린 결합 단백질) 및 단백질 항원 뉴몰리신(Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins et al., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342), 및 이의 돌연변이체 해독된 유도체(WO 90/06951; WO 99/03884)로부터 유래될 수 있다. 다른 박테리아 백신은 헤모필루스 종, 예를 들어 에이치. 인플루엔자에 B형(예를 들어, PRP 및 이의 접합체), 비피막형 에이치. 인플루엔자에, 예를 들어 OMP26, 고분자량 부착소, P5, P6, 단백질 D 및 지단백질 D, 및 핌브린 및 핌브린 유래된 펩타이드(미국 특허 제5,843,464호) 또는 다수의 카피 변이체 또는 이의 융합 단백질로부터 유래된 항원을 포함한다.
다른 특이적 항원은 B형 간염으로부터 유래된다. B형 간염 표면 항원의 유도체는 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 특히 유럽 특허 출원 EP-A414 374; EP-A-0304 578 및 EP 198474에 기재된 PreS1, Pars2 S 항원을 포함한다. 일 양태에서, 항원은 특히 CHO 세포에서 발현될 때 HIV-1 gp120이다. 추가의 실시형태에서, 항원은 gD2t이다.
다른 실시형태에서, 항원은 곤지름의 원인인 것으로 생각되는 인간 유두종 바이러스(HPV)(HPV 6 또는 HPV 11 및 기타), 및 자궁경부암의 원인인 HPV 바이러스(HPV16, HPV18 및 기타)로부터 유래된다. 특정한 항원은 L1 입자 또는 캡소머, 및 HPV 6 및 HPV 11 단백질 E6, E7, L1 및 L2로부터 선택된 하나 이상의 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함한다. 융합 단백질의 소정의 형태는 WO 96/26277에 개시된 L2E7 및 GB 9717953.5(PCT/EP98/05285)에 개시된 단백질D(1/3)-E7을 포함한다. 추가적인 가능한 항원은 HPV 16 또는 18 항원을 포함한다. 예를 들어, L1 또는 L2 항원 단량체, 또는 L1 또는 L2 항원은 바이러스 유사 입자(VLP)로서 함께 제시되거나, L1 단독 단백질은 VLP 또는 캡소머 구조에서 단독으로 제시된다. 이러한 항원, 바이러스 유사 입자 및 캡소머는 특히 공지되어 있다. 예를 들어 WO94/00152, WO94/20137, WO94/05792 및 WO93/02184를 참조한다.
다른 실시형태에서, 항원은 융합 단백질이다. 융합 단백질은 예를 들어 단독으로 또는 융합 단백질, 예컨대 E7, E2 또는 F5로서 포함될 수 있고, 특정한 실시형태는 L1E7 융합 단백질을 포함하는 VLP를 포함한다(WO 96/11272). 특정한 HPV 16 항원은 HPV 16으로부터 단백질 D-E6 또는 E7 융합을 형성하기 위한 단백질 D 운반체와 융합된 초기 단백질 E6 또는 F7, 또는 이들의 조합; 또는 E6 또는 E7과 L2의 조합(WO 96/26277)을 포함한다. 대안적으로, HPV 16 또는 18 초기 단백질 E6 및 E7은 단일 분자, 예를 들어 단백질 D-E6/E7 융합에서 제시될 수 있다. 조성물은 예를 들어 단백질 D-E6 또는 단백질 D-E7 융합 단백질 또는 단백질 D E6/E7 융합 단백질의 형태로 HPV 18 앞에 E6 및 E7 단백질 중 어느 하나 또는 둘 다를 임의로 함유할 수 있다. 조성물은 다른 HPV 균주, 예를 들어 균주 HPV 31 또는 33으로부터의 항원을 추가적으로 포함할 수 있다.
항원은 또한 말라리아를 야기하는 기생충으로부터 유래될 수 있다. 예를 들어, 플라스모디아 팔시파룸으로부터의 항원은 RTS,S 및 TRAP를 포함한다. RTS는 B형 간염 표면 항원의 preS2 부분의 4개의 아미노산을 통해 B형 간염 바이러스의 표면(S) 항원에 연결된 피. 팔시파룸의 포자소체(circumsporozoite: CS) 단백질의 C 말단 부분을 실질적으로 모두 포함하는 하이브리드 단백질이다. 이의 완전한 구조는 영국 특허 출원 제9124390.7호로부터의 우선권을 주장하는 WO 93/10152로서 공개된 국제 특허 출원 제PCT/EP92/02591호에 개시되어 있다. 효모에서 발현될 때, RTS는 지단백질 입자로서 제조되고, 이것이 HBV로부터의 S 항원과 동시발현될 때, 이것은 RTS,S로서 공지된 혼합된 입자를 제조한다.
TRAP 항원은 WO 90/01496으로서 공개된 국제 특허 출원 제PCT/GB89/00895호에 기재되어 있다. 본 개시내용의 실시형태는 항원 제제가 RTS,S 및 TRAP 항원의 조합을 포함하는 말라리아 백신이다. 아마도 다단계 말라리아 백신의 성분인 후보인 다른 플라스모디아 항원은 플라스모듐 종에서 피. 파시파룸 MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, 세쿼스트린(Sequestrin), PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27125, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 및 이들의 유사체이다.
일 실시형태에서, 항원은 암의 면역치료적 치료에 유용할 수 있는 것처럼 암 세포로부터 유래된다. 예를 들어, 항원은 종양 거부 항원, 예컨대 전립선, 유방, 결장직장, 폐, 췌장, 신장 또는 흑색종 암에 대한 것일 수 있다. 예시적인 암 또는 암 세포 유래된 항원은 MAGE 1, 3 및 MAGE 4 또는 다른 MAGE 항원, 예컨대 WO99/40188에 개시된 것, PRAME, BAGE, Lage(NY Eos 1로도 공지됨) SAGE 및 HAGE(WO 99/53061) 또는 GAGE(Robbins and Kawakami, 1996 Current Opinions in Immunology 8, pps 628-636; Van den Eynde et al., International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997 & 1998); Correale et al. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, p. 293)를 포함한다. 암 항원의 이 비제한적인 예는 넓은 범위의 종양 유형, 예컨대 흑색종, 폐 암종, 육종 및 방광 암종에서 발현된다. 예를 들어, 미국 특허 제6,544,518호를 참조한다.
다른 종양 특이적 항원은, 많은 암의 치료에 유용한, 단백질을 운반하기 위한 종양 특이적 또는 종양 연관된 강글리오사이드, 예컨대 GM2 및 GM3 또는 이들의 접합체; 또는 자가 펩타이드 호르몬, 예컨대 전장 고나도트로핀 호르몬 방출 호르몬(GnRH, WO 95/20600), 짧은 10개 아미노산 길이의 펩타이드를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 또 다른 실시형태에서, 전립선 항원, 예컨대 전립선 특이적 항원(PSA), PAP, PSCA(예를 들어, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95(4) 1735-1740 1998), PSMA 또는, 일 실시형태에서 프로스타제(Prostase)로도 공지된 항원을 사용한다. (예를 들어, Nelson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96: 3114-3119; Ferguson, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. 96, 3114-3119; WO 98/12302; 미국 특허 제5,955,306호; WO 98/20117; 미국 특허 제5,840,871호 및 제5,786,148호; WO 00/04149.) 다른 전립선 특이적 항원은 WO 98/137418 및 WO/004149로부터 공지되어 있다. 기타는 STEAP(PNAS 96 14523 14528 7-12 1999)이다.
본 개시내용의 맥락에서 유용한 다른 종양 연관된 항원은 Plu -1(J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999), HASH-1, HasH-2, 크립토(Cripto)(Salomon et al Bioessays 199, 21:61-70, 미국 특허 제5,654,140호) 및 크립틴(Criptin)(미국 특허 제5,981,215호)을 포함한다. 추가적으로, 암의 치료에서 백신에 특히 관련된 항원은 또한 타이로시나제 및 서비빈을 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물에서 사용된 물질은 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)과 같은 병태의 예방 및 치료를 위해 호흡기 질환, 예컨대 박테리아 감염(예를 들어, 뉴모코커스)에 의해 야기되거나 악화된 것과 연관된 항원을 포함한다. COPD는 만성 기관지염 및/또는 폐기종을 갖는 환자에서 비가역적인 또는 부분적으로 가역적인 기도 폐쇄의 존재에 의해 생리학적으로 정의된다(Am J Respir Crit Care Med. 1995 Nov;152(5 Pt 2):S77-121). COPD이 악화는 대개 박테리아(예를 들어, 뉴모코커스) 감염에 의해 생긴다(Clin Microbiol Rev. 2001 Apr;14(2):336-63).
ii. 애쥬번트
몇몇 실시형태에서, 물질은 애쥬번트이고, 이에 따라 본 명세서에 기재된 임의의 나노명반 입자를 포함하는 조성물은 항원의 존재 또는 부재 하에 애쥬번트를 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 애쥬번트는 AS-2, 모노포스포릴 지질 A, 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A, IFA, QS21, CWS, TOM, AGPs, CpG 함유 올리고뉴클레오타이드, 톨 유사 수용체(TLR) 작용제, Leif, 사포닌, 사포닌 모방체, 생물학적 및 합성 지질 A, 이미퀴모드, 가르디퀴모드, 레시퀴모드, polyI:C, 플라겔린, GLA, SLA, STING, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
하나의 예시적인 실시형태에서, 애쥬번트는 GLA이다. 하나의 예시적인 실시형태에서, 애쥬번트는 SLA이다.
a. TLR 작용제
본 명세서에 기재된 바대로, 본 개시내용의 소정의 실시형태는 본 명세서에 기재된 바와 같은 나노명반 입자의 포함을 고려하고, 하나 이상의 톨 유사 수용체 작용제(TLR 작용제)를 추가로 포함한다. 톨 유사 수용체(TLR)는, 다수의 감염성 병원균 내에 또는 상에 존재할 수 있는 것처럼, 다양한 보존된 미생물 분자 구조에 대한 숙주 세포에 초반 인식 능력을 부여하는 선천성 면역계의 세포 표면 막관통 수용체를 포함한다. (예를 들어, Armant et al., 2002 Genome Biol. 3(8):reviews3011.1-3011.6; Fearon et al., 1996 Science 272:50; Medzhitov et al., 1997 Curr. Opin. Immunol. 9:4; Luster 2002 Curr. Opin. Immunol. 14:129; Lien et al. 2003 Nat. Immunol. 4:1162; Medzhitov, 2001 Nat. Rev. Immunol. 1:135; Takeda et al., 2003 Ann Rev Immunol. 21:335; Takeda et al. 2005 Int. Immunol. 17:1; Kaisho et al., 2004 Microbes Infect. 6:1388; Datta et al., 2003 J. Immunol. 170:4102).
선천성 면역계를 통해 면역 반응의 개시를 강화시키기 위한 TLR 매개된 신호 전달의 유도는 세포 표면 TLR을 체결시키는 TLR 작용제에 의해 실행될 수 있다. 예를 들어, 리포다당류(LPS)는 TLR2 또는 TLR4를 통한 TLR 작용제일 수 있고(Tsan et al., 2004 J. Leuk. Biol. 76:514; Tsan et al., 2004 Am. J. Physiol. Cell Phsiol. 286:C739; Lin et al., 2005 Shock 24:206); 폴리(이노신-사이티딘)(폴리l:C)은 TLR3을 통한 TLR 작용제일 수 있고(Salem et al., 2006 Vaccine 24:5119); CpG 서열(비메틸화된 사이토신-구아노신 또는 "CpG" 다이뉴클레오타이드 모티프를 함유하는 올리고데옥시뉴클레오타이드, 예를 들어 CpG 7909, Cooper et al., 2005 AIDS 19:1473; CpG 10101 Bayes et al. Methods Find Exp Clin Pharmacol 27:193; Vollmer et al. Expert Opinion on Biological Therapy 5:673; Vollmer et al., 2004 Antimicrob. Agents Chemother. 48:2314; Deng et al., 2004 J. Immunol. 173:5148)은 TLR9를 통한 TLR 작용제일 수 있고(Andaloussi et a., 2006 Glia 54:526; Chen et al., 2006 J. Immunol. 177:2373); 펩티도글라이칸은 TLR2 및/또는 TLR6 작용제일 수 있고(Soboll et al., 2006 Biol. Reprod. 75:131; Nakao et al., 2005 J. Immunol. 174:1566); 3M003(4-아미노-2-(에톡시메틸)-α,α-다이메틸-6,7,8,9-테트라하이드로-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-에탄올 수화물(분자량 318Da), 또한 관련 화합물 3M001 및 3M002의 공급원인 3M Pharmaceuticals(미네소타주 세인트 폴)로부터; Gorden et al., 2005 J. Immunol. 174:1259)은 TLR7 작용제(Johansen 2005 Clin. Exp. Allerg. 35:1591) 및/또는 TLR8 작용제(Johansen 2005)일 수 있고; 플라겔린은 TLR5 작용제(Feuillet et al., 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:12487)일 수 있고; C형 간염 항원은 TLR7 및/또는 TLR9를 통한 TLR 작용제로서 작용할 수 있다(Lee et al., 2006 Proc. Nat. Acad. Sci. USA 103:1828; Horsmans et al., 2005 Hepatol. 42:724). 다른 TLR 작용제가 공지되어 있고(예를 들어, Schirmbeck et al., 2003 J. Immunol. 171:5198), 소정의 현재 기재된 실시형태에 따라 사용될 수 있다.
b. TLR7/8 작용제
본 명세서에 기재된 조성물에서 사용될 수 있는 TLR7/8 작용제가 본 명세서에 제공된다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "TLR7/8 작용제"는 TLR7, TLR8, 또는 둘 다와의 이의 상호작용을 통해 이의 생물학적 활성에 영향을 미치는 작용제를 의미한다. 이러한 생물학적 활성은 선천성 면역계를 통한 면역 반응의 저해를 강화하기 위한 TLR7 및/또는 TLR8 매개된 신호 전달의 유도를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
c. TLR4 작용제
본 명세서에 기재된 조성물에서 사용될 수 있는 TLR4 작용제가 본 명세서에 제공된다. 소정의 실시형태에서, 본 명세서에서 조성물에서 사용되는 TLR4 작용제는 글루코피라노실 지질 애쥬번트(GLA), 예컨대 미국 특허 공보 US2007/021017, US2009/045033, US2010/037466 및 US 2010/0310602(이의 내용은 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 기재된 것을 포함한다.
예를 들어, 소정의 실시형태에서, TLR4 작용제는 화학식 (IV)의 하기 구조를 갖는 합성 GLA 애쥬번트 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염이다:
Figure 112018119035798-pct00012
(식 중,
L1, L2, L3, L4, L5 및 L6은 동일하거나 상이하고, 독립적으로 -O-, -NH- 또는 -(CH2)-이고;
L7, L8, L9 및 L10은 동일하거나 상이하고, 독립적으로 부재하거나 -C(=O)-이고;
Y1은 산 작용기이고;
Y2 및 Y3은 동일하거나 상이하고, 독립적으로 -OH, -SH 또는 산 작용기이고;
Y4는 -OH 또는 -SH이고;
R1, R3, R5 및 R6은 동일하거나 상이하고, 독립적으로 C8-13 알킬이고;
R2 및 R4는 동일하거나 상이하고, 독립적으로 C6-11 알킬임).
합성 GLA 구조의 몇몇 실시형태에서, R1, R3, R5 및 R6은 C10 알킬이고; R2 및 R4는 C8 알킬이다. 소정의 실시형태에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C9 알킬이다.
예를 들어, 소정의 실시형태에서, TLR4 작용제는 화학식 (V)의 하기 구조를 갖는 합성 GLA 애쥬번트이다:
Figure 112018119035798-pct00013
.
구체적인 실시형태에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C12-C20 알킬이다.
또 다른 구체적인 실시형태에서, GLA는 R1, R3, R5 및 R6이 C11 알킬이고; R2 및 R4가 C13 알킬인 상기 기재된 화학식을 갖는다.
또 다른 구체적인 실시형태에서, GLA는 R1, R3, R5 및 R6이 C10 알킬이고; R2 및 R4가 C8 알킬인 상기 기재된 화학식을 갖는다.
또 다른 구체적인 실시형태에서, GLA는 R1, R3, R5 및 R6이 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4가 C9-C20 알킬인 상기 기재된 화학식을 갖는다. 소정의 실시형태에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C9 알킬이다.
소정의 실시형태에서, TLR4 작용제는 화학식 (V)의 하기 구조를 갖는 합성 GLA 애쥬번트이다:
Figure 112018119035798-pct00014
상기 GLA 구조의 소정의 실시형태에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C9-C20 알킬이다. 소정의 실시형태에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C9 알킬이다.
소정의 실시형태에서, TLR4 작용제는 화학식 (VI)의 하기 구조를 갖는 합성 GLA 애쥬번트이다:
Figure 112018119035798-pct00015
상기 GLA 구조의 소정의 실시형태에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C9-C20 알킬이다. 소정의 실시형태에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C9 알킬이다.
소정의 실시형태에서, TLR4 작용제는 화학식 (VI)I의 하기 구조를 갖는 합성 GLA 애쥬번트이다:
Figure 112018119035798-pct00016
상기 GLA 구조의 소정의 실시형태에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11-C20 알킬이고; R2 및 R4는 C9-C20 알킬이다. 소정의 실시형태에서, R1, R3, R5 및 R6은 C11 알킬이고; R2 및 R4는 C9 알킬이다.
소정의 실시형태에서, TLR4 작용제는 하기 구조(SLA)를 갖는 합성 GLA 애쥬번트이다:
Figure 112018119035798-pct00017
소정의 실시형태에서, TLR4 작용제는 하기 구조를 갖는 합성 GLA 애쥬번트이다:
Figure 112018119035798-pct00018
소정의 실시형태에서, TLR4 작용제는 하기 구조를 갖는 합성 GLA 애쥬번트이다:
Figure 112018119035798-pct00019
또 다른 실시형태에서, 약독화된 지질 A 유도체(ALD)는 본 명세서에 기재된 조성물로 도입된다. ALD는 분자가 지질 A의 더 적거나 상이한 부작용을 나타내도록 변경되거나 구성된 지질 A 유사 분자이다. 이 부작용은 발열원성, 국소 Shwarzman 반응성 및 병아리 배아 50% 치사 용량 검정(CELD50)에서 평가된 바대로 독성을 포함한다. 본 개시내용에 따라 유용한 ALD는 모노포스포릴 지질 A(MLA) 및 3-데아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MLA)를 포함한다. MLA 및 3D-MLA는 공지되어 있고, 본 명세서에서 자세히 기재될 필요가 없다. 예를 들어, 모노포스포릴 지질 A 및 이의 제조를 개시하는, Ribi ImmunoChem Research, Inc.에 1984년 5월 13일에 양도된 미국 특허 제4,436,727호를 참조한다. Ribi ImmunoChem Research, Inc.에 또한 양도된 미국 특허 제4,912,094호 및 재심사 증명서 B1 미국 특허 제4,912,094호(Myers 등)는 3-데아실화 모노포스포릴 지질 A 및 이의 제조 방법을 구현한다. MLA 및 3D-MLA에 관한 이들 특허의 각각의 개시내용은 본 명세서에 참조로 포함된다.
상기 TLR4 작용제 화합물에서, 전체 전하는 분자에서의 작용기에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 포스페이트기는 포스페이트기의 이온화 상태에 따라 음으로 하전되거나 중성일 수 있다.
d. CpG 뉴클레오타이드
일 실시형태에서, 애쥬번트는 탈메틸화된 CpG 다이뉴클레오타이드를 함유하는 면역자극 올리고뉴클레오타이드(예를 들어, 미국 특허 제6,544,518호)이다. 비메틸화된 CpG 다이뉴클레오타이드("CpG")를 함유하는 면역자극 올리고뉴클레오타이드는 애쥬번트인 것으로 공지되어 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 개시내용의 CpG 올리고뉴클레오타이드는 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개 또는 적어도 6개 또는 이것 초과의 뉴클레오타이드에 의해 분리된 2개 이상의 다이뉴클레오타이드 CpG 모티프를 함유할 수 있다.
CpG 올리고뉴클레오타이드 서열의 예는 하기 공보에 개시되어 있다; 소정의 본 명세서에서 개시된 실시형태에 대해, 서열은 포스포로티오에이트 변형된 뉴클레오타이드간 연결을 함유할 수 있다:
CPG 7909: Cooper et al., "CPG 7909 adjuvant improves hepatitis B virus vaccine seroprotection in antiretroviral-treated HIV-infected adults." AIDS, 2005 Sep 23;19(14):1473-9.
CpG 10101: Bayes et al., "Gateways to clinical trials." Methods Find. Exp. Clin. Pharmacol. 2005 Apr;27(3):193-219.
Vollmer J., "Progress in drug development of immunostimulatory CpG oligodeoxynucleotide ligands for TLR9." Expert Opinion on Biological Therapy. 2005 May; 5(5): 673-682
대안적인 CpG 올리고뉴클레오타이드는 이들이 이에 대한 중요하지 않은 뉴클레오타이드 서열 치환, 삽입, 결실 및/또는 부가를 갖는다는 점에서 다른 상기 언급된 공보에 기재된 서열의 변이체를 포함할 수 있다. 본 개시내용의 소정의 실시형태에서 사용된 CpG 올리고뉴클레오타이드는 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 합성될 수 있다(예를 들어, EP 468520). 편리하게는, 이러한 올리고뉴클레오타이드는 자동화 합성장치를 사용하여 합성될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 통상적으로 데옥시뉴클레오타이드이다. 일 실시형태에서, 올리고뉴클레오타이드에서의 뉴클레오타이드간 결합은 포스포로다이티오에이트 또는 포스포로티오에이트 결합이지만, 포스포다이에스터는 또한 현재 고려되는 실시형태의 범위 내에 있다. 상이한 뉴클레오타이드간 연결을 포함하는 올리고뉴클레오타이드, 예를 들어 혼합된 포스포로티오에이트 포스포다이에스터가 또한 고려된다. 올리고뉴클레오타이드를 안정화시키는 다른 뉴클레오타이드간 결합을 또한 사용할 수 있다.
iii. 유기체 및 바이러스
몇몇 실시형태에서, 물질은 유기체이다. 따라서, 이 실시형태에서, 기재된 조성물은 본 명세서에 제공된 나노명반 입자를 포함하고, 유기체를 추가로 포함한다.
예를 들어, 박테리아 마이코박테륨 투베르큘로시스는 결핵(TB)을 야기한다. 현재, 생 박테리아에 의한 백신접종은 결핵에 대해 보호 면역을 유도하는 가장 효율적인 방법이다. 이 목적에 사용되는 가장 흔한 마이코박테륨은 마이코박테륨 보비스의 무독력 균주인 바실러스 칼메트-게랑(Bacillus Calmette-Guerin: BCG)이다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 조성물은 나노명반 입자 및 마이코박테륨을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 물질은 바이러스 또는 바이러스 게놈이다. 따라서, 이 실시형태에서, 기재된 조성물은 본 명세서에 제공된 나노명반 입자를 포함하고, 바이러스 입자, 단리된 바이러스 엔벨로프 또는 바이러스 게놈을 추가로 포함한다.
B. 나노명반 입자와의 회합
본 명세서에 제공된 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물의 물질은 나노명반 입자와 회합한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물의 물질은 나노명반 입자에 결합한다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 조성물의 물질은 나노명반 입자에 흡착된다. 이러한 결합 또는 흡착은 통상적으로 생화학적, 생리학적 및/또는 화학적 상호작용(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 특이적 또는 비특이적 결합 또는 상호작용으로 인해 상호 친화도 또는 결합 역량을 나타내는 분자 또는 이의 부분 사이의 상호작용을 의미한다. 소정의 실시형태에서, 나노명반 입자에 대한 결합은 UV 분광법 또는 겔 전기영동에 의해 결정될 수 있다.
나노명반 입자에 대한 흡착은 일반적으로 정전기 상호작용 및 리간드 교환의 기전(이들로 제한되지는 않음)에 의해 발생할 수 있다. 정전기 상호작용은 소정의 용액 조건 하에 성분에 반대의 전하의 존재를 이용한다. 리간드 교환은 또 다른 성분의 하이드록실기와의 교환으로 성분 중 하나에서 포스페이트기를 사용한다. 리간드 교환을 위해, 성분에서의 접근 가능한 포스페이트기 및 하이드록실기를 사용한다. 몇몇 실시형태에서, 물질, 항원 또는 애쥬번트를 갖는 조성물을 제조하기 위해, 물질에서 포스페이트기 및 하이드록실기의 존재 및 전하의 고려가 있다.
i. 리간드 교환
리간드 교환 기전과 관련한 소정의 실시형태에서, 물질과 알루미늄염 사이에 리간드 교환이 존재할 수 있다.
소정의 실시형태에서, 애쥬번트 물질과 알루미늄염 사이에 리간드 교환이 존재할 수 있다. 애쥬번트 조성물 내의 소정의 성분은 포스페이트기를 포함하는 한편, 다른 소정의 성분은 하이드록실기를 포함하여서, 리간드 교환이 가능하게 한다. 예를 들어, 소정의 TLR4 작용제는 포스페이트기를 포함한다. AdjuPhos(등록상표)는 포스페이트기를 포함한다. 하이드록실기는 적어도 항원, TLR 작용제, 지질/계면활성제 및 알하이드로겔(등록상표)의 성분 중에 존재한다.
ii. 정전기 상호작용
정전기 상호작용 기전과 관련한 소정의 실시형태에서, 물질과 알루미늄염 사이에 리간드 교환이 존재할 수 있다.
정전기 상호작용 기전과 관련한 소정의 예시적인 실시형태에서, 백신 조성물은 거의 생리학적 pH에서 실질적으로 중성으로 하전된다. 백신 조성물에 대한 항원이 하전되면, 애쥬번트 조성물에 대한 성분은 실질적으로 중성으로 하전된 백신 조성물을 제공하도록 항원의 전하를 중화시키도록 선택될 수 있다. 백신 조성물에 대한 항원이 실질적으로 중성으로 하전되면, 애쥬번트 조성물에 대한 성분은 실질적으로 중성으로 하전된 백신 조성물을 제공하도록 항원의 실질적으로 중성인 전하를 유지하도록 선택될 수 있다.
상기 기재된 바대로, 조성물 내의 각각의 성분은 음으로 하전, 양으로 하전 또는 중성으로 하전되는 것을 특징으로 할 수 있다.
C. 용량 절약
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 나노명반 입자를 포함하고 물질을 추가로 포함하는 조성물은 생체내 발현의 용량 절약 및/또는 높은 수준을 나타낸다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 나노명반 입자 중 임의의 하나를 포함하는 조성물의 사용은 물질의 적어도 5% 미만, 적어도 10% 미만, 적어도 20% 미만, 적어도 25% 미만, 적어도 30% 미만, 적어도 40% 미만, 적어도 50% 미만, 적어도 60% 미만, 적어도 75% 미만, 적어도 80% 미만, 적어도 90% 미만, 적어도 95% 미만 또는 심지어 적어도 99% 미만의 사용을 허용하고, 동일한 생물학적 및/또는 생리학적 효과를 달성하도록 사용되는 물질의 양과 비교하여, 절단에 사용되지 않는 본 명세서에 제공된 나노명반 입자 중 임의의 하나를 포함하는 조성물을 갖는다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 나노명반 입자 중 임의의 하나를 포함하는 조성물의 사용은 생물학적 및/또는 생리학적 효과를 달성하도록 물질의 약 10㎍, 5㎍, 2㎍, 1㎍, 10ng 또는 1ng의 용량의 사용을 허용한다. 하나의 특정한 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 나노명반 입자 중 임의의 하나를 포함하는 조성물의 사용은 원하는 생물학적 및/또는 생리학적 효과를 달성하도록 물질의 약 10㎍, 5㎍, 2㎍, 1㎍, 10ng 또는 1ng의 폴리펩타이드의 용량의 사용을 허용한다. 하나의 특정한 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 나노명반 입자 중 임의의 하나를 포함하는 조성물의 사용은 면역 반응을 달성하기 위해 물질의 약 10㎍, 5㎍, 2㎍, 1㎍, 10ng 또는 1ng의 폴리펩타이드의 용량의 사용을 허용한다. 하나의 특정한 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 나노명반 입자 중 임의의 하나를 포함하는 조성물의 사용은 원하는 생물학적 및/또는 생리학적 효과를 달성하도록 물질의 약 10㎍, 5㎍, 2㎍, 1㎍, 10ng 또는 1ng의 폴리뉴클레오타이드의 용량의 사용을 허용한다. 하나의 특정한 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 나노명반 입자 중 임의의 하나를 포함하는 조성물의 사용은 면역 반응을 달성하기 위해 물질의 약 10㎍, 5㎍, 2㎍, 1㎍, 또는 10ng, 1ng의 폴리뉴클레오타이드의 용량의 사용을 허용한다. 하나의 특정한 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 나노명반 입자 중 임의의 하나를 포함하는 조성물의 사용은 면역 반응을 달성하기 위해 RNA 물질의 약 100ng, 50ng, 30ng, 10ng 또는 1ng의 RNA 폴리뉴클레오타이드의 용량의 사용을 허용한다. 하나의 특정한 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 나노명반 입자 중 임의의 하나를 포함하는 조성물의 사용은 면역 반응을 달성하기 위해 물질의 약 10㎍, 5㎍, 2㎍, 1㎍, 10ng 또는 1ng의 레플리콘 RNA 벡터 폴리뉴클레오타이드의 용량의 사용을 허용한다. 하나의 특정한 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 나노명반 입자 중 임의의 하나를 포함하는 조성물의 사용은 면역 반응을 달성하기 위해 물질의 약 10㎍, 5㎍, 2㎍, 1㎍, 10ng 또는 1ng의 mRNA 벡터 폴리뉴클레오타이드의 용량의 사용을 허용한다.
일 실시형태에서, 용량 절약은 비제제화된 RNA와 비교하여 면역 반응을 생성하기 위해 폴리펩타이드 항원의 발현을 달성하도록 RNA 폴리뉴클레오타이드를 전달하는 데 필요한 300배 더 적은 RNA에 의해 달성된다. 일 실시형태에서, 용량 절약은 비제제화된 RNA와 비교하여 면역 반응을 생성하기 위해 폴리펩타이드 항원의 발현을 달성하도록 RNA 폴리뉴클레오타이드를 전달하는 데 필요한 100배 더 적은 RNA에 의해 달성된다. 일 실시형태에서, 용량 절약은 비제제화된 RNA와 비교하여 면역 반응을 생성하기 위해 폴리펩타이드 항원의 발현을 달성하도록 RNA 폴리뉴클레오타이드를 전달하는 데 필요한 50배 더 적은 RNA에 의해 달성된다. 일 실시형태에서, 용량 절약은 비제제화된 RNA와 비교하여 면역 반응을 생성하기 위해 폴리펩타이드 항원의 발현을 달성하도록 RNA 폴리뉴클레오타이드를 전달하는 데 필요한 30배 더 적은 RNA에 의해 달성된다. 일 실시형태에서, 용량 절약은 비제제화된 RNA와 비교하여 면역 반응을 생성하기 위해 폴리펩타이드 항원의 발현을 달성하도록 RNA 폴리뉴클레오타이드를 전달하는 데 필요한 10배 더 적은 RNA에 의해 달성된다.
D. 약제학적 조성물
나노명반 입자를 포함하는 약제학적 조성물 및 본 명세서에 기재된 조성물이 본 명세서에 제공된다. 몇몇 실시형태에서, 나노명반 입자를 포함하는 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 백신 조성물이다. 본 명세서에 기재된 조성물은 임의의 치료학적 또는 진단학적 목적을 위해 대상체에게 투여될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 대상체에서의 면역 반응(비특이적 반응 및 항원 특이적 반응 포함)을 자극하도록 사용된다. 본 명세서에 제공된 실시형태에서, 대상체는 포유류(예를 들어, 농장 동물(소, 돼지, 염소, 말 등), 애완동물(고양이, 개 등) 및 설치류(래트, 마우스 등)를 포함하는 동물, 또는 인간)이다. 특히, Th1 면역 반응을 촉진하는 본 발명의 제제 및 조성물은 대상체에서 이러한 반응을 자극하기 위해 사용될 수 있다.
약제학적 조성물은 일반적으로 본 명세서에 기재된 조성물을 포함하고, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 조합되어 항원, 추가적인 작용제 또는 재조합 발현 작제물로부터 선택된 본 명세서에 제공된 바와 같은 하나 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 제공된 실시형태에서, 약제학적 조성물은 0.45 마이크론 필터를 통해 여과될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 0.20 마이크론 필터를 통해 여과될 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물은 0.22 마이크론 필터를 통해 여과될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 TLR7/8 작용제 또는 TLR4 작용제를 포함하는 나노명반 입자를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 이러한 조성물은 "단일치료"에 사용될 수 있고, 여기서 본 명세서에 기재된 바와 같은 TLR7/8 작용제 또는 TLR 4 작용제는 조성물에서 제제화되고, 조성물은 실질적으로 다른 항원이 없고, 질환 또는 다른 병태, 예컨대 유기체에 의한 감염의 진단, 치료 또는 예방의 목적을 위해 면역 반응, 예를 들어 비특이적 면역 반응 또는 항원 특이적 면역 반응을 자극하기 위해 대상체에게 투여된다.
다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기재된 조성물 및 항원 둘 다를 포함하는 백신 조성물이고, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제와 조합되어 본 명세서에 제공된 바와 같은 하나 이상의 성분을 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 담체는 사용되는 투약량 및 농도에서 수혜자에게 비독성일 것이다.
예시적인 담체는 사용되는 투약량 및 농도에서 수혜자에게 비독성일 것이다.
본 명세서에 제공된 실시형태에서, 약제학적 조성물의 약 1ng/kg 내지 약 1㎎/kg의 투약량이 투여된다. 본 명세서에 제공된 실시형태에서, 약제학적 조성물의 약 1ng 내지 약 1㎎의 투약량이 투여된다. 몇몇 실시형태에서, 약제학적 조성물의 약 500㎍, 200㎍, 100㎍, 50㎍, 25㎍, 20㎍, 15㎍, 10㎍, 5㎍, 2㎍, 1㎍, 10ng 또는 1ng의 투약량이 투여된다. 투여의 수 및 빈도가 대상체의 반응에 따라 달라질 것이라는 것이 당해 분야의 당업자에게 명확할 것이다. 치료학적 사용을 위한 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 약제학적 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985)]에 기재되어 있다. 예를 들어, 생리학적 pH에서의 무균 식염수 및 인산염 완충 식염수를 사용할 수 있다. 보존제, 안정화제, 염료 및 심지어 향료는 약제학적 조성물에서 제공될 수 있다. 예를 들어, 나트륨 벤조에이트, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스터를 보존제로서 사용할 수 있다. Id. at 1449. 또한, 항산화제 및 현탁제를 사용할 수 있다. Id.
"약제학적으로 허용 가능한 염"은 이러한 화합물 및 유기 또는 무기 산(산 부가염) 또는 유기 또는 무기 염기(염기 부가염)의 조합으로부터 유래된 본 개시내용의 화합물의 염을 의미한다. 본 개시내용의 조성물은 유리 염기 또는 염 형태로 사용될 수 있고, 형태 둘 다는 본 개시내용의 범위 내인 것으로 생각된다.
약제학적 조성물은 조성물이 환자에게 투여되게 허용하는 임의의 형태일 수 있다. 예를 들어, 조성물은 고체, 액체 또는 가스(에어로졸)의 형태일 수 있다. 투여의 통상적인 경로는, 제한 없이, 경구, 국소, 비경구(예를 들어, 설하 또는 협측), 설하, 직장, 질내 및 비강내(예를 들어, 스프레이로서)를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같은 용어 비경구는 이온영동성(예를 들어, U.S. 7,033,598; 7,018,345; 6,970,739), 초음파영동성(예를 들어, U.S. 4,780,212; 4,767,402; 4,948,587; 5,618,275; 5,656,016; 5,722,397; 6,322,532; 6,018,678), 열적(예를 들어, U.S. 5,885,211; 6,685,699), 수동적 경피(예를 들어, U.S. 3,598,122; 3,598,123; 4,286,592; 4,314,557; 4,379,454; 4,568,343; 5,464,387; 영국 특허 명세서 제2232892호; U.S. 6,871,477; 6,974,588; 6,676,961), 미량주사(예를 들어, U.S. 6,908,453; 5,457,041; 5,591,139; 6,033,928) 및 제트 주사 투여 및 또한 피하 주사, 정맥내, 근육내, 흉골내, 해면체내, 척추강내, 외요도구내, 요도내 주사 또는 점적주사 기법을 포함한다. 특정한 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물(백신 및 약제학적 조성물 포함)은 이온영동, 미세공동, 초음파영동 또는 미량주사로부터 선택된 기법에 의해 피내로 투여된다.
약제학적 조성물은 대상체에 대한 조성물의 투여 시 여기에 함유된 활성 성분이 생물학적으로 이용 가능하도록 제제화될 수 있다. 대상체에게 투여되는 조성물은 하나 이상의 투약량 단위의 형태를 위하고, 여기서 예를 들어 정제는 단일 투약량 단위일 수 있고, 에어로졸 형태의 본 개시내용의 하나 이상의 화합물의 용기는 복수의 투약량 단위를 보유할 수 있다.
경구 투여를 위해, 부형제 및/또는 결합제가 존재할 수 있다. 예는 수크로스, 카올린, 글라이세린, 전분 덱스트린, 나트륨 알기네이트, 카복시메틸셀룰로스 및 에틸 셀룰로스이다. 착색제 및/또는 향료가 존재할 수 있다. 코팅 쉘을 사용할 수 있다.
조성물은 액체, 예를 들어 엘릭시르, 시럽, 용액, 에멀션 또는 현탁액의 형태일 수 있다. 액체는 2개의 예로서 경구 투여를 위한 또는 주사에 의한 전달을 위한 것일 수 있다. 경구 투여에 의도될 때, 조성물은 감미료, 보존제, 염료/착색제 및 향 인핸서 중 하나 이상을 함유할 수 있다. 주사에 의해 투여되도록 의도된 조성물에서, 계면활성제, 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁제, 완충제, 안정화제 및 등장화제 중 하나 이상이 포함될 수 있다.
용액, 현탁액의 형태 또는 다른 유사한 형태이든, 본 명세서에 사용된 바와 같은, 액체 약제학적 조성물은 하기 담체 또는 부형제 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 무균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수 용액, 바람직하게는 생리학적 식염수, 링거액, 등장성 염화나트륨, 고정유, 예컨대 스쿠알렌, 스쿠알렌, 광유, 만니드 모노올레에이트, 콜레스테롤, 및/또는 합성 모노 또는 다이글라이세라이드(용매 또는 현탁 매질로서 작용할 수 있음), 폴리에틸렌 글라이콜, 글라이세린, 프로필렌 글라이콜 또는 다른 용매; 항세균제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌다이아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세테이트, 시트레이트시트레이트스페이트 및 등장성의 조정을 위한 물질, 예컨대 염화나트륨 또는 덱스트로스. 비경구 제제는 유리 또는 플라스틱으로 만든 앰플, 일회용 주사기 또는 다용량 바이알에 밀폐될 수 있다. 주사용 약제학적 조성물은 바람직하게는 무균이다.
또 다른 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 에어로졸화될 수 있는 방식으로 제제화된다.
약제학적 조성물 내에 다른 성분, 예컨대 알루미늄염, 유중수 에멀션, 생분해성 오일 비히클, 수중유 에멀션, 생분해성 마이크로캡슐 및 리포솜(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 전달 비히클을 포함하는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이러한 비히클에서 사용하기 위한 추가적인 면역자극 물질(코-애쥬번트)의 예는 또한 상기 기재되어 있고, N-아세틸무라밀-L-알라닌-D-아이소글루타민(MDP), 글루칸, IL-12, GM-CSF, 감마 인터페론 및 IL-12를 포함할 수 있다.
당해 분야의 당업자에게 공지된 임의의 적합한 담체가 본 개시내용의 약제학적 조성물에 사용될 수 있지만, 담체의 유형은 투여의 방식 및 지속된 방출이 원해지는지에 따라 달라질 것이다. 비경구 투여, 예컨대 피하 주사를 위해, 담체는 물, 식염수, 알코올, 지방, 왁스 또는 완충제를 포함할 수 있다. 경구 투여를 위해, 임의의 상기 담체 또는 고체 담체, 예컨대 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산마그네슘, 나트륨 사카린, 탤컴, 셀룰로스, 글루코스, 수크로스 및 탄산마그네슘을 사용할 수 있다. 본 개시내용의 약제학적 조성물에 대한 담체로서 생분해성 마이크로구(예를 들어, 폴리락트산 갈락타이드)를 또한 사용할 수 있다. 적합한 생분해성 마이크로구는 예를 들어 미국 특허 제4,897,268호 및 제5,075,109호에 개시되어 있다. 이와 관련하여, 마이크로구가 대략 25마이크론보다 큰 것이 바람직하다.
약제학적 조성물은 희석제, 예컨대 완충제, 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 저분자량(약 10개의 잔기 미만의) 폴리펩타이드, 단백질, 아미노산, 탄수화물, 예를 들어 글루코스, 수크로스 또는 덱스트린, 킬레이트화제, 예컨대 EDTA, 글루타티온 및 다른 안정화제 및 부형제를 또한 함유할 수 있다. 천연 완충 식염수 또는 비특정한 혈청 알부민과 혼합된 식염수는 예시적인 적절한 희석제이다. 예를 들어, 생성물은 희석제로서 적절한 부형제 용액(예를 들어, 수크로스)을 사용하여 동결건조물로서 제제화될 수 있다.
상기 기재된 바대로, 소정의 실시형태에서 본 개시내용은 원하는 항원을 코딩하는 핵산 분자를 전달할 수 있는 조성물을 포함한다. 이러한 조성물은 재조합 바이러스 벡터(예를 들어, 레트로바이러스(WO 90/07936, WO 91/02805, WO 93/25234, WO 93/25698 및 WO 94/03622 참조), 아데노바이러스(문헌[Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Li et al., Hum. Gene Ther. 4:403-409, 1993; Vincent et al., Nat. Genet. 5:130-134, 1993; 및 Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994] 참조), 폭스 바이러스(미국 특허 제4,769,330호; 미국 특허 제5,017,487호; 및 WO 89/01973 참조), 다중양이온성 분자와 복합체화된 재조합 발현 작제물 핵산 분자(WO 93/03709 참조) 및 리포솜과 연관된 핵산(문헌[Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7851, 1987] 참조)을 포함한다. 소정의 실시형태에서, DNA는 사멸된 또는 불활성화된 아데노바이러스에 연결될 수 있다(문헌[Curiel et al., Hum. Gene Ther. 3:147-154, 1992; Cotton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6094, 1992] 참조). 다른 적합한 조성물은 DNA-리간드(문헌[et al., J. Biol. Chem. 264:16985-16987, 1989] 참조) 및 지질-DNA 조합(문헌[Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:7413-7417, 1989] 참조)을 포함한다.
소정의 실시형태에서, 비경구 또는 경구 투여에 의도되는 액체 조성물은 적합한 투약량이 얻어지는 백신 조성물의 양을 함유해야 한다. 통상적으로, 이 양은 조성물 내의 적어도 0.01중량%의 항원이다. 경구 투여에 의도될 때, 이 양은 조성물의 0.1 내지 약 70중량%인 것으로 변할 수 있다. 경구 조성물은 약 4% 내지 약 50%의 항원을 함유할 수 있다. 조성물 및 제제는 비경구 투약량 단위가 0.01 내지 1중량%의 활성 조성물을 함유하도록 제조될 수 있다.
약제학적 조성물은 국소 투여에 의도될 수 있고, 이러한 경우에 담체는 적합하게 용액, 에멀션, 연고 또는 겔 기제를 포함할 수 있다. 기제는 예를 들어 하기 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 페트롤라튬, 라놀린, 폴리에틸렌 글라이콜, 비즈왁스, 광유, 희석제, 예컨대 물 및 알코올, 및 유화제 및 안정화제. 점증제는 국소 투여를 위해 약제학적 조성물 중에 존재할 수 있다. 경피 투여에 의도되는 경우, 조성물은 경피 패치 또는 이온영동 장치를 포함할 수 있다. 국소 제제는 항원(예를 들어, GLA-항원 백신 조성물) 또는 GLA(예를 들어, 면역학적 애쥬번트 조성물의 농도를 함유할 수 있고; GLA는 Avanti Polar Lipids, Inc.(알라바마주 알라바스터); 예를 들어, 약 0.1 내지 약 10% w/v(단위 용량당 중량)의 제품 번호 699800)로부터 구입 가능하다.
조성물은 예를 들어 직장에서 용융하고 약물을 방출하는 좌제의 형태로 직장 투여에 의도될 수 있다. 직장 투여를 위한 조성물은 적합한 비자극 부형제로서 유질 기제를 함유할 수 있다. 이러한 기제는, 제한 없이, 라놀린, 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글라이콜을 포함한다. 본 개시내용의 방법에서, 백신 조성물/ 애쥬번트는 인서트(들), 비드(들), 지효성 제제(들), 패치(들) 또는 속효성 제제(들)의 사용을 통해 투여될 수 있다.
V. 나노명반 입자 및 조성물의 사용
A. 치료제
몇몇 실시형태에서, 물질은 치료학적 목적에 유용하다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 기재된 조성물은 본 명세서에 제공된 나노명반 입자를 포함하고, 질환, 병태 또는 장애의 치료를 위한 물질을 추가로 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 물질은 알레르기, 암, 감염성 질환, 자가면역 또는 중독의 치료 또는 예방에 유용하다.
본 명세서에서 개시된 실시형태에서, 조성물을 암 항원을 포함한다. 몇몇 실시형태에서, 백신 조성물은 종양 연관된 항원 발현, 예컨대 HER-2/neu 발현을 특징으로 하는 임의의 암에 대해 유용한 암 항원 또는 다른 암 특이적 또는 암 연관된 항원을 포함한다.
본 개시내용의 소정의 실시형태에 따른 조성물 및 방법은 숙주 또는 대상체의 면역계가 "자가" 조직, 세포, 생물분자(예를 들어, 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 당단백질, 지단백질, 프로테오지질, 지질, 글라이코지질, 핵산, 예컨대 RNA 및 DNA, 올리고사카라이드, 다당류, 프로테오글라이칸, 글라이코사미노글라이칸 등, 및 대상체의 세포 및 조직의 다른 분자 성분) 또는 에피토프(예를 들어, 특이적인 면역학적으로 한정된 인식 구조, 예컨대 항체 가변 영역 상보성 결정 영역(CDR) 또는 T 세포 수용체 CDR에 의해 인식되는 것)에 대항하여 지향된 면역 반응을 해롭게 매개하는 질환, 병태 또는 장애를 포함하는 자가면역 질환의 예방 또는 치료에 또한 사용될 수 있다.
자가면역 질환은 따라서, 어느 경우에 정상의 자가유리 조직에 대항하여 지향된, 세포 또는 항체를 수반하는 비정상 면역 반응을 특징으로 한다. 포유류에서의 자가면역 질환은 일반적으로 2개의 상이한 분류 중 하나에서 분류될 수 있다: 세포 매개된 질환(즉, T 세포) 또는 항체 매개된 장애. 세포 매개된 자가면역 질환의 비제한적인 예는 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 하시모토 갑상선염, I형 진성 당뇨병(연소성 발병 당뇨병) 및 자가면역 포도막망막염을 포함한다. 항체 매개된 자가면역 장애는 중증 근무력증, 전신 홍반성 낭창(또는 SLE), 그레이브병, 자가면역 용혈성 빈혈, 자가면역 혈소판감소증, 자가면역 자폐증, 저온글로불린혈증, 혈소판 감소성 자반병, 원발성 담도 경화증 및 악성 빈혈을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 전신 홍반성 낭창과 연관된 항원(들)은 작은 핵 리보핵산 단백질(snRNP)이고; 그레이브병은 타이로트로핀 수용체, 타이로글로불린 및 갑상선 상피 세포의 다른 성분이고(Akamizu et al., 1996; Kellerman et al., 1995; Raju et al., 1997; 및 Texier et al., 1992); 천포창은 카드헤린 유사 천포창 항원, 예컨대 데스모글레인 3 및 다른 접착 분자이고(Memar et al., 1996: Stanley, 1995; Plott et al., 1994; and Hashimoto, 1993); 혈소판 감소성 자반병은 혈소판의 항원이다. (예를 들어, 미국 특허 6,929,796; 문헌[Gorski et al. (Eds.), Autoimmunity, 2001, Kluwer Academic Publishers, Norwell, MA; Radbruch and Lipsky, P.E. (Eds.) Current Concepts in Autoimmunity and Chronic Inflammation (Curr. Top. Microbiol. and Immunol.) 2001, Springer, NY.] 참조)
자가면역은 1형 당뇨병, 다발성 경화증, 루푸스, 류마티스성 관절염, 피부경화증 및 갑상선 질환을 포함하는 80개 초과의 상이한 질환에서 역할을 한다. 대부분의 자가면역 질환에 대한 이환율의 활발한 정량적 예상치는 부족하다. 1990년대 후기에 수행된 대부분의 최근의 연구는 자가면역 질환이 미국에서 제3의 가장 흔한 주요 질병이고; 가장 흔한 자가면역 질환은 850만 명 초과의 미국인에게 영향을 미친다는 것을 밝혀냈다. 질환의 이환율의 현재의 예상치는 미국 집단의 5 내지 8%의 범위이다. 대부분의 자가면역 질환은 불균형적으로 여성에게 영향을 미친다. 여성은 남성보다 자가면역 질환을 아마도 2.7배 더 획득할 것이다. 여성은 자가면역 질환에 더 감수성이고; 남성은 여성보다 자연 살해 세포 활성의 더 높은 수분을 가지는 것으로 보인다. (Jacobsen et al, Clinical Immunology and Immunopathology, 84:223-243, 1997.)
예를 들어, 결핵에 대해 보호 면역을 유도하기 위해 사용될 수 있는 본 명세서에 제공된 조성물은 하나 이상의 마이코박테륨 단백질의 적어도 하나의 면역원성 부분을 함유하는 폴리펩타이드 및 이러한 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 및 RNA 분자의 사용을 포함한다. 또한, 이러한 화합물은 마이코박테륨 감염에 대한 면역화를 위해 백신 및/또는 약제학적 조성물로 제제화될 수 있다. (미국 특허 제6,949,246호 및 제6,555,653호).
소정의 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 신장 투석 중인 대상체, 화학치료 및/또는 방사선 치료 중인 대상체, 이식 수혜자 등을 포함하는 노인 및/또는 면역억제자의 치료에서 특히 적용 가능할 것이다. 이러한 개인은 일반적으로 백신에 대한 감소한 면역 반응을 나타내고, 따라서 본 개시내용의 조성물의 사용은 이러한 대상체에서 달성된 면역 반응을 증대시킬 수 있다.
다른 실시형태에서, 본 개시내용의 조성물은 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD)과 같은 병태의 예방 및 치료를 위해 호흡기 질환, 예컨대 박테리아 감염(예를 들어, 뉴모코커스)에 의해 야기되거나 악화된 것과 연관된 항원을 포함한다.
직접적인 생체내 절차 이외에, 세포가 숙주로부터 제거되고, 변형되고, 동일한 또는 또 다른 숙주 동물에 위치하는 생체외 절차를 이용할 수 있다. 생체외 상황에서 조직 세포로 항원 코딩 핵산 분자의 도입을 위해 상기 기재된 임의의 조성물을 사용할 수 있다는 것이 명확할 것이다. 바이러스, 흡수의 물리적 및 화학적 방법에 대한 프로토콜은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
따라서, 본 개시내용은 숙주, 환자 또는 세포 배양물에서 면역 반응을 증대시키거나 유발하는 데 유용하다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 용어 "대상체"는 임의의 포유류를 의미한다. 환자는 감염성 질환, 암, 예컨대 유방암, 또는 자가면역 질환에 의해 영향을 받을 수 있거나, 정상(즉, 검출 가능한 질환 및/또는 감염의 부재)일 수 있다. "세포 배양물"은 면역능력 세포 또는 면역계의 단리된 세포(T 세포, 대식세포, 단핵구, B 세포 및 수지상 세포(이들로 제한되지는 않음) 포함)를 함유하는 임의의 제제이다. 이러한 세포는 당해 분야의 당업자에게 널리 공지된 임의의 다양한 기법(예를 들어, 피콜-하이페이크 밀도 원심분리)에 의해 단리될 수 있다. 세포는 암에 의해 영향을 받는 환자로부터 단리될 수 있고(그러나 그럴 필요는 없음), 치료 후 환자로 재도입될 수 있다.
B. 백신
본 개시내용은 따라서 면역 반응을 시작할 수 있는 숙주에서 면역 반응을 변경하기 위한(즉, 당해 분야의 당업자에게 친숙한 바대로, 예를 들어 적절한 대조군에 비해 통계학적으로 유의미한 방식으로 증가시키거나 감소시키기 위한) 조성물을 제공한다. 당해 분야에서 보통의 지식을 갖는 사람에게 공지된 것처럼, 면역 반응은, 숙주 면역 상태의 유지 및/또는 조절에 참여하는 하나 이상의 조직, 장기, 세포 또는 분자의 구조 또는 기능에서의 임의의 변경을 포함할 수 있는, 숙주의 면역 상태의 임의의 활성 변경일 수 있다. 통상적으로, 면역 반응은 가용성 면역글로불린 또는 항체; 가용성 매개자, 예컨대 사이토카인, 림포카인, 케모카인, 호르몬, 성장 인자 등, 및 다른 가용성 작은 펩타이드, 탄수화물, 뉴클레오타이드 및/또는 지질 매개자; 면역계의 세포의 변경된 기능 또는 구조 특성, 예를 들어 세포 증식, 변경된 운동성, 특수 활성, 예컨대 특이적 유전자 발현 또는 세포용해 거동의 유도에 의해 결정되는 것과 같은 세포 활성화 상태 변경; 면역계의 세포에 의한 세포 분화, 예를 들어 변경된 표면 항원 발현 프로필 또는 아폽토시스(프로그래밍된 세포사)의 개시; 또는 면역 반응의 존재가 검출될 수 있는 임의의 다른 기준의 생체내 또는 시험관내 결정(이들로 제한되지는 않음)을 포함하는 임의의 다양한 널리 공지된 매개변수에 의해 검출될 수 있다.
본 개시내용의 조성물에 의한 면역 반응의 유도의 결정은 당해 분야에서 보통의 지식을 갖는 사람이 쉽게 친숙한 임의의 다수의 널리 공지된 면역학적 검정에 의해 확립될 수 있다. 이러한 검정은 가용성 항체; 가용성 매개자, 예컨대 사이토카인, 림포카인, 케모카인, 호르몬, 성장 인자 등, 및 다른 가용성 작은 펩타이드, 탄수화물, 뉴클레오타이드 및/또는 지질 매개자; 면역계의 세포의 변경된 기능 또는 구조 특성, 예를 들어 세포 증식, 변경된 운동성, 특수 활성, 예컨대 특이적 유전자 발현 또는 세포용해 거동의 유도에 의해 결정되는 것과 같은 세포 활성화 상태 변경; 면역계의 세포에 의한 세포 분화, 예를 들어 변경된 표면 항원 발현 프로필 또는 아폽토시스(프로그래밍된 세포사)의 개시의 생체내 또는 시험관내 결정을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이들 및 유사한 검정을 수행하기 위한 절차는 널리 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Lefkovits(Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998]에서 발견될 수 있고; 또한 문헌[Current Protocols in Immunology; see also, e.g., Weir, Handbook of Experimental Immunology, 1986 Blackwell Scientific, Boston, MA; Mishell and Shigii (eds.) Selected Methods in Cellular Immunology, 1979 Freeman Publishing, San Francisco, CA; Green and Reed, 1998 Science 281:1309] 및 여기 인용된 문헌 참조을 참조한다.
항원 반응성 T 세포의 증식의 검출은 다양한 공지된 기법에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어, T 세포 증식은 DNA 합성의 속도를 측정함으로써 검출될 수 있고, 항원 특이성은 후보 항원 반응성 T 세포가 노출되는 자극(예를 들어, 특이적 원하는 항원- 또는 대조군 항원-펄스화 항원 제시 세포 등)을 제어함으로써 결정될 수 있다. 증식하도록 자극되는 T 세포는 DNA 합성의 증가된 속도를 나타낸다. DNA 합성의 속도를 측정하기 위한 통상적인 방식은 예를 들어 새로 합성된 DNA로 도입된 뉴클레오사이드 전구체인 삼중수소화 타이미딘에 의해 T 세포의 배양물의 펄스 표지화에 의한다. 도입된 삼중수소화 타이미딘의 양은 액체 섬광 분광광도계를 사용하여 결정될 수 있다. T 세포 증식을 검출하기 위한 다른 방식은 인터류킨-2(IL-2) 제조, Ca2+ 유입 또는 염료 흡수, 예컨대 3-(4,5-다이메틸티아졸-2-일)-2,5-다이페닐-테트라졸륨의 증가를 측정하는 것을 포함한다. 대안적으로, 림포카인(예컨대, 인터페론-감마)의 합성은 측정될 수 있거나, 특정한 항원에 반응할 수 있는 T 세포의 상대 수는 정량화될 수 있다.
항원 특이적 항체 제조의 검출은 예를 들어 시험관내 방법론, 예컨대 방사선면역검정(RIA), 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA), 평형 투석 또는 고상 면역블로팅, 예를 들어 웨스턴 블로팅을 이용하여 본 개시내용에 따른 백신에 의해 치료된 숙주로부터 샘플(예를 들어, 면역글로불린 함유 샘플, 예컨대 혈청, 혈장 또는 혈액)을 평가함으로써 달성될 수 있다. 실시형태에서, ELISA 검정은 예를 들어 검정의 감수성을 증대시키기 위해 항원에 특이적인 고상 단일클론 항체에 의한 표적 항원의 항원 포획 부동화를 추가로 포함할 수 있다. 가용성 매개자(예를 들어, 사이토카인, 케모카인, 림포카인, 프로스타글란딘 등)의 복잡함은 예를 들어 상업적 공급원(예를 들어, Sigma(미주리주 세인트 루이스); 또한 R & D Systems 2006 카탈로그, R & D Systems(미네소타주 미니애폴리스) 참조)으로부터 용이하게 이용 가능한 방법, 장치 및 시약을 이용하여 효소 연결 면역흡착 검정(ELISA)에 의해 또한 용이하게 결정될 수 있다.
당해 분야에 널리 공지된 일상적 검정을 이용하여 임의의 수의 다른 면역학적 매개변수를 모니터링할 수 있다. 이것은 널리 확립된 마커 항원 시스템, 면역조직화학 또는 다른 관련 검정을 이용한 예를 들어 항체 독립적 세포 매개 세포독성(ADCC) 검정, 2차 시험관내 항체 반응, 다양한 말초 혈액 또는 림프구 단핵 세포 하위집단의 흐름 면역세포 형광분석을 포함할 수 있다. 이들 및 다른 검정은 예를 들어 문헌[Rose et al. (Eds.), Manual of Clinical Laboratory Immunolog, 5th Ed., 1997 American Society of Microbiology, Washington, DC]에서 발견될 수 있다.
따라서, 본 명세서에 제공된 조성물이 Th1형 T 림프구 반응, TH2형 T 림프구 반응, 세포독성 T 림프구(CTL) 반응, 항체 반응, 사이토카인 반응, 림포카인 반응, 케모카인 반응 및 염증성 반응으로부터 선택된 적어도 하나의 면역 반응을 숙주에서 유발하거나 증대시킬 수 있다는 것이 고려된다. 소정의 실시형태에서, 면역 반응은 사이토카인이 인터페론-감마(IFN-γ), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α)로부터 선택된 하나 또는 복수의 사이토카인의 제조, 인터류킨이 IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-16, IL-18 및 IL-23으로부터 선택된 하나 또는 복수의 인터류킨의 제조, 케모카인이 MIP-1α, MIP-1β, RANTES, CCL4 및 CCL5로부터 선택된 하나 또는 복수의 케모카인의 제조 및 기억 T 세포 반응, 기억 B 세포 반응, 효과기 T 세포 반응, 세포독성 T 세포 반응 및 효과기 B 세포 반응으로부터 선택된 림프구 반응 중 적어도 하나를 포함할 수 있다. 예를 들어 WO 94/00153; WO 95/17209; WO 96/02555; U.S. 6,692,752; U.S. 7,084,256; U.S. 6,977,073; U.S. 6,749,856; U.S. 6,733,763; U.S. 6,797,276; U.S. 6,752,995; U.S. 6,057,427; U.S. 6,472,515; U.S. 6,309,847; U.S. 6,969,704; U.S. 6,120,769; U.S. 5,993,800; U.S. 5,595,888; Smith et al., 1987 J Biol Chem. 262:6951; Kriegler et al., 1988 Cell 53:45 53; Beutler et al., 1986 Nature 320:584; U.S. 6,991,791; U.S. 6,654,462; U.S. 6,375,944를 참조한다.
본 발명의 나노명반 제제는 질환, 예컨대 백일해, 결핵, 한센병, 말라리아, HIV, 리슈마니아증 및 인플루엔자의 치료 또는 예방에 유용하다. 특히, Th1 면역을 증대시키는 나노명반 제제의 능력은 이러한 점에서 이들이 특히 유용하게 한다.
C. 진단제
몇몇 실시형태에서, 물질은 진단제이다. 따라서, 이 실시형태에서, 기재된 조성물은 본 명세서에 제공된 나노명반 입자를 포함하고, 진단제를 추가로 포함하고, 임의의 질환, 병태 또는 장애의 진단에 유용하다.
몇몇 실시형태에서, 진단제는 암의 검출에 유용하다. 조성물 및 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같이 암을 갖거나 암을 발생시킬 위험에 있는 것으로 의심되는 대상체를 확인하기 위해 당해 분야에 공지되어 있다. 암을 갖거나 가질 위험에 있는 것으로 의심되는 대상체에서의 암의 진단은 임상 제시, 암의 진행의 정도, 암의 유형 및 다른 인자를 포함하는 다양한 인자에 따라 달라질 수 있는 임의의 넓은 범위의 분야 인정된 방법론에 의해 달성될 수 있다. 암 진단학의 예는 환자 샘플(예를 들어, 혈액, 피부 생검, 다른 조직 생검, 수술 견본 등)의 조직병리학적, 조직세포화학적, 면역조직세포화학적 및 면역조직병리학적 검사, 한정된 유전적(예를 들어, 핵산) 마커에 대한 PCR 시험, 순환 암 연관된 항원 또는 이러한 항원을 보유하는 세포, 또는 한정된 특이성의 항체에 대한 혈청학적 시험, 또는 당해 분야의 숙련자가 친숙한 다른 방법론을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 제6,734,172호; 제6,770,445호; 제6,893,820호; 제6,979,730호; 제7,060,802호; 제7,030,232호; 제6,933,123호; 제6,682,901호; 제6,587,792호; 제6,512,102호; 제7,078,180호; 제7,070,931호; JP5-328975호; 문헌[Waslylyk et al., 1993 Eur. J Bioch. 211(7):18]을 참조한다. 이들 진단제 중 임의의 하나 이상은 본 명세서에 기재된 나노명반 입자를 포함하는 조성물에 포함될 수 있다.
몇몇 실시형태에서, 진단제는 자가면역 질환의 검출에 유용하다. 자가항체의 검출은 따라서 자가면역 질환의 존재 또는 이를 발생시킬 위험의 초기 발견 또는 인식을 허용한다. 이 발견에 기초하여, 자가항원에 대항한 다양한 자가항체가 개발되었고, 자가항원에 대항한 자가항체가 임상 시험에서 측정되는 한편(예를 들어, 미국 특허 제6,919,210호, 제6,596,501호, 제7,012,134호, 제6,919,078호), 다른 자가면역 진단학은 관련 대사물질의 검출(예를 들어, 미국 특허 제4,659,659호) 또는 면역학적 반응성(예를 들어, 미국 특허 제4,614,722호 및 제5,147,785호, 제4,420,558호, 제5,298,396호, 제5,162,990호, 제4,420,461호, 제4,595,654호, 제5,846,758호, 제6,660,487호)을 수반할 수 있다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 나노명반 입자 중 임의의 하나를 포함하는 조성물은 자가항원의 검출에 유용한 자가항체를 추가로 포함한다.
일 실시형태에서, 진단제는 감염성 질환의 검출에 유용하다. 조성물 및 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 감염성 병원균에 의한 감염을 갖거나 이를 가질 위험에 있는 것으로 의심되는 대상체를 확인하기 위해 당해 분야에 공지되어 있다.
예를 들어, 박테리아 마이코박테륨 투베르큘로시스는 결핵(TB)을 야기한다. 따라서, 몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 나노명반 입자를 포함하는 조성물은 결핵을 진단하기 위한 물질을 추가로 포함한다. 이러한 폴리펩타이드 또는 DNA 서열 및 적합한 검출 시약을 함유하는 진단 키트는 환자 및 생물학적 샘플에서 마이코박테륨 감염의 검출에 사용될 수 있다. 이러한 폴리펩타이드에 지향된 항체가 또한 제공된다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 나노명반 입자를 포함하는 조성물은 하기 기재된 진단제 중 임의의 하나를 사용하여 말라리아를 진단하기 위한 물질을 추가로 포함한다. 폴리펩타이드 조성물과 접촉하는 개인으로부터 취한 조직 또는 생물학적 유체를 배치하는 단계를 포함하는, 개인에서의 말라리아에 대한 시험관내 진단 방법이 공지되어 있고, 여기서 상기 분자 또는 폴리펩타이드 조성물은 형성된 항원-항체 복합체의 시험관내 검출, 및 조직 또는 생물학적 유체에 존재할 수 있는 항체와 상기 조성물 사이에 시험관내 면역학적 반응이 생기게 하는 조건 하에 피. 팔시파룸의 감염성 활성으로부터 생긴 단백질의 하나 이상의 T 에피토프의 전부 또는 일부를 보유하는 하나 이상의 펩타이드 서열을 포함한다(예를 들어, 미국 특허 제7,087,231호 참조).
재조합 플라스모듐 팔시파룸(3D7) AMA-1 엑도도메인의 발현 및 정제는 기재되어 있다. 이전의 방법은 네이티브 분자의 폴딩 및 다이설파이드 브릿징을 보유하는 고도로 정제된 단백질을 제조하였다. 재조합 AMA-1은 진단 시약으로서, 및 항체 제조에서, 및 말라리아를 예방하기 위한 단독으로 사용하기 위한 단백질로서, 또는 백신의 일부로서 유용하다(미국 특허 제7,029,685호).
이들 항원에 지향된 단일클론 또는 다중클론 항체를 가지면서, 감염 후 감수성인 포유류 숙주의 혈장으로 분비된 단백질 또는 단백질의 단편인 종 특이적 피. 비박스 말라리아 펩타이드 항원을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 당해 분야에 기재되어 있다. 펩타이드 항원, 단일클론 항체, 및/또는 다중클론 항체는 말라리아를 진단하기 위해, 및 플라스모듐 비박스가 감염의 원인이 되는 종인지를 결정하기 위해 이용되는 검정에서 사용된다. (미국 특허 제6,706,872호) 이들 항원에 지향된 단일클론 또는 다중클론 항체를 가지면서, 감염 후 감수성인 포유류 숙주의 혈장으로 분비된 단백질 또는 단백질의 단편인 종 특이적 피. 비박스 말라리아 펩타이드 항원이 또한 보고되어 있다. 펩타이드 항원, 단일클론 항체, 및/또는 다중클론 항체는 말라리아를 진단하기 위해, 및 플라스모듐 비박스가 감염의 원인이 되는 종인지를 결정하기 위해 이용되는 검정에서 사용된다(예를 들어, 미국 특허 제6,231,861호 참조).
재조합 플라스모듐 팔시파룸(3D7) AMA-1 엑토도메인은 네이티브 분자의 폴딩 및 다이설파이드 브릿징을 보유하는 고도로 정제된 단백질을 제조하는 방법에 의해 또한 발현되었다. 재조합 AMA-1은 진단 시약으로서, 항체 제조에서 사용하기에 및 백신으로서 유용하다. (미국 특허 제7,060,276호) 네이티브 분자의 폴딩 및 다이설파이드 브릿징을 보유하는 재조합 플라스모듐 팔시파룸(3D7) MSP-142의 발현 및 정제가 유사하게 공지되어 있다. 재조합 MSP-142는 진단 시약으로서, 항체 제조에서 사용하기에 및 백신으로서 유용하다. (미국 특허 제6,855,322호)
말라리아 감염성 병원균에 의한 감염을 갖거나 이를 가질 위험에 있는 것으로 의심되는 대상체를 확인하기 위한 인간 말라리아 감염의 검출을 위한 진단 방법은 따라서 이들 및 관련 개시내용에 따라 공지되어 있다. 구체적으로, 예를 들어 혈액 샘플은 3-아세틸 피리딘 아데닌 다이뉴클레오타이드(APAD)를 함유하는 시약, 기질(예를 들어, 락테이트 염 또는 락트산) 및 완충제와 조합된다. 시약은 말라리아 기생충에 의해 제조된 고유한 해당 효소의 존재를 검출하도록 설계된다. 이 효소는 기생충 락트산 탈수효소(PLDH)로서 공지되어 있다. PLDH는 상기 기재된 시약을 사용하여 숙주 LDH로부터 용이하게 구별 가능하다. 시약과 기생충 있는 혈액 샘플의 조합은 APAD를 감소시킨다. 그러나, APAD는 숙주 LDH에 의해 감소되지 않는다. 이후, 감소된 APAD는 스펙트럼, 형광측정, 전기영동 또는 비색 분석을 포함하는 다양한 기법에 의해 검출될 수 있다. 상기 방식에서의 감소된 APAD의 검출은 말라리아 감염의 양성 표시를 제공한다(예를 들어, 미국 특허 제5,124,141호). 말라리아를 진단하기 위한 또 다른 방법론에서, 플라스모듐 팔시파룸 항원 GLURP로부터 유래된 특징적인 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드는 폴리펩타이드에 대해 길러지거나 이와 반응성인 특정한 항체에서 시험 샘플에서 인식된다. (미국 특허 제5,231,168호).
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 나노명반 입자를 포함하는 조성물은 하기 기재된 진단제 중 임의의 하나를 사용하여 리슈마니아증을 진단하기에 유용한 물질을 추가로 포함한다. 리슈마니아증은 인도 아대륙, 아프리카 및 라틴 아메리카에서 흔한 전염병으로 널리 퍼진 기생충 질환이고, 백신 개발을 위한 세계 보건 기구 우선사항이다. 리슈마니어 기생충인 상이한 질환의 복합은 내부 장기의 치명적인 감염 및 심각한 피부 질환을 야기한다. 리슈마니아증의 가장 재앙적인 형태 중 하나는 코 및 입의 흉한 감염이다. 리슈마니아증의 사례의 수는 증가하고, 이것은 많은 지역에서 현재 통제 밖이다. 리슈마니아증은 또한 HIV 감염의 결과로서 몇몇 선진국, 구체적으로 서유럽에서 증가하고 있다. 이용 가능한 약물은 독성이고, 비싸고, 장기간 매일의 주사를 요한다.
리슈마니어는 면역계의 대식세포 또는 백혈구에 서식하는 원생동물 기생충이다. 기생충은 행성의 광범위한 영역에 거주하면서 방제하기 어려운 작은 혈액을 빠는 곤충(응애)의 물림에 의해 전파된다.
내장 리슈마니아증은 질환의 3가지 표출 중 가장 위험하다. 내장 형태의 약 500,000개의 새로운 사례(칼라아자르 또는 "살해 질환")가 매년 생기는 것으로 추정된다. 20000만 명 초과의 사람이 현재 내장 리슈마니아증에 걸릴 위험에 있다. 내장 리슈마니아증 사례의 90% 초과는 인도, 방글라데시, 수단, 브라질 및 네팔에서 생긴다. 대부분의 사망은 어린이에서 일어난다. 피하 형태를 갖는 사람은 대개 영구적으로 흉하게 있게 된다.
리슈마니어 감염은 진단하기 어렵고, 통상적으로 조직 생검 견본의 조직병리학적 분석을 수반한다. 그러나, 몇몇 혈청학적 및 면역학적 진단 검정이 개발되었다. (미국 특허 제7,008,774호; Senaldi et al., (1996) J. Immunol. Methods 193:9 5; Zijlstra, et al., (1997) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 91:671 673; Badaro, et al., (1996) J. Inf. Dis. 173:758 761; Choudhary, S., et al., (1992) J. Comm. Dis. 24:32 36; Badaro, R., et al., (1986) Am. J. Trop. Med. Hyg. 35:72 78; Choudhary, A., et al., (1990) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 84:363 366; 및 Reed, S. G., et al., (1990) Am. J. Trop. Med. Hyg. 43:632 639). 전편모충은 순화 배지를 제조하기 위해 배양 배지로 대사 생성물을 방출한다. 이 대사 생성물은 숙주에 면역원성이다. 문헌[Schnur, L. F., et al., (1972) lsrl. J. Med. Sci. 8:932 942; Sergeiev, V. P., et al., (1969) Med. Parasitol. 38:208 212; El-On, J., et al., (1979) Exper. Parasitol. 47:254 269; 및 Bray, R. S., et al., (1966) Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 60:605 609]; 미국 특허 제6,846,648, 미국 특허 제5,912,166호; 미국 특허 제5,719,263호; 미국 특허 제5,411,865호를 참조한다.
몇몇 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 임의의 나노명반 입자를 포함하는 조성물은 하기 기재된 진단제 중 임의의 하나를 사용하에 HIV를 진단하기에 유용한 물질을 추가로 포함한다. 바이러스 배양, 환자 견본으로부터의 한정적 핵산 서열의 PCR 및 환자 혈청에서의 항-HIV 항체의 존재에 대한 항체 시험을 포함하는, HIV 감염을 진단하는 방법이 공지되어 있다. (예를 들어, 미국 특허 제6,979,535, 제6,544,728호, 제6,316,183호, 제6,261,762호, 제4,743,540호 참조.).
VI. 키트
소정의 실시형태에서, 하나 이상의 컨테이너에 제공될 수 있는 나노명반 입자를 포함하는 본 명세서에 기재된 조성물을 포함하는 키트가 또한 고려된다. 일 실시형태에서, 조성물의 모든 성분은 단일 컨테이너에서 함께 존재하지만, 실시형태는 그렇게 제한되도록 의도되지 않고, 예를 들어 면역학적 애쥬번트 조성물이 항원 성분으로부터 별개이고 이와 접촉하지 않는 2개 이상의 컨테이너를 또한 고려한다. 비제한적인 이론의 방식으로, 몇몇 경우에 오직 면역학적 애쥬번트 조성물의 투여가 유리하게 수행될 수 있는 한편, 다른 경우에 이러한 투여가 항원의 투여로부터 시간적으로 및/또는 공간적으로(예를 들어, 상이한 해부학적 부위에서) 유리하게 분리될 수 있는 한편, 더욱 다른 경우에 대상체에 대한 투여가 본 명세서에 기재된 바와 같은, 항원 및 애쥬번트 조성물 둘 다, 및 또한 임의로 다른 본 명세서에서 기재된 성분을 함유하는 백신 조성물로 유리하게 수행된다고 믿어진다.
몇몇 실시형태에서, 키트의 바이알은 나노명반 입자를 포함하는 조성물을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 키트의 하나의 바이알은 나노명반 입자를 포함하는 조성물을 포함하고, 키트의 제2 바이알은 생물활성제를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 키트는 애쥬번트를 함유하는 제3 바이알을 포함한다.
몇몇 실시형태에서, 키트의 하나의 바이알은 나노명반 입자를 포함하는 조성물을 포함하고, 키트의 제2 바이알은 애쥬번트를 함유한다. 몇몇 실시형태에서, 키트는 생물활성제를 함유하는 제3 바이알을 포함한다.
본 개시내용의 키트는 본 명세서에 기재된 바와 같은 용도를 위한 설명서 또는 바이알에 함유된 재료를 혼합하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다. 몇몇 실시형태에서, 바이알 내의 재료는 건조이거나 동결건조된다. 몇몇 실시형태에서, 바이알 내의 재료는 액체이다.
이러한 키트 실시형태에 따른 컨테이너는 임의의 적합한 컨테이너, 용기, 바이알, 앰플, 관, 컵, 박스, 병, 플라스크, 단지, 접시, 단일 웰 또는 다중 웰 장치의 웰, 저장소, 탱크 등, 또는 본 명세서에 개시된 조성물이 배치, 저장 및/또는 수송되고, 내용물을 제거하도록 접근될 수 있는 다른 장치일 수 있다. 통상적으로, 이러한 컨테이너는 의도된 용도에 알맞고, 함유된 내용물의 회수가 용이하게 달성될 수 있는 재료로 제조될 수 있다. 이러한 컨테이너의 비제한적인 예는 유리 및/또는 플라스틱 밀봉된 또는 재밀봉 가능한 관 및 앰플, 예를 들어 고무 격막을 갖는 것 또는 침 및 주사기를 사용한 내용물의 배출에 알맞은 다른 실링 수단을 포함한다. 이러한 컨테이너는, 예를 들어 컨테이너로부터의 재료의 효율적인 회수를 허용하고/하거나, 예를 들어 분해 조건, 예컨대 자외선 또는 온도 극한, 또는 미생물 오염물질을 포함하는 원치 않는 오염물질의 도입으로부터 재료를 보호하는 재료로 제조될 수 있거나 이에 의해 코팅될 수 있는, 유리 또는 화학적으로 상용성인 플라스틱 또는 수지에 의해 제조될 수 있다. 컨테이너는 바람직하게는 무균 또는 살균 가능성이고, 임의의 담체, 부형제, 용매, 비히클 등과 상용성이고, 예컨대 본 명세서에 기재된 백신 조성물 및/또는 면역학적 애쥬번트 조성물 및/또는 항원 및/또는 재조합 발현 작제물 등을 현탁시키거나 용해시키기 위해 사용될 수 있는, 재료로 제조된다.
하기 실시예는 제한이 아니라 예시로 제공된다.
실시예
실시예 1 PEG 및 PAA 나노명반 제제의 제조
나노명반 제제의 제조. 수산화알루미늄 2% 또는 Al(OH)3, 수산화알루미늄, 알루미늄 옥시하이드록사이드 2%(알하이드로겔(등록상표) 85)는 습식 겔 현탁액으로서 EM Sargeant로부터 구입되었다. 하기 지질을 Corden Pharma(스위스 리스탈)로부터 구입하였다: 다이스테아로일글라이세로포스포에탄올아민(DSPE), N-카보닐-메톡시폴리에틸렌글라이콜-750)-1.2-다이스테아로일-sn-글라이세로-3-포스포에탄올아민(mPEG750-DSPE), N-(카로닐-메톡시폴리에틸렌글라이콜-2000)-1,2-다이스테아로일-sn-글라이세로-3-포스포에탄올아민(mPEG2000-DSPE), N-(카보닐-메톡시폴리에틸렌글라이콜-5000)-1,2-다이스테아로일-sn-글라이세로-3-포스포에탄올아민(mPEG5000-DSPE), 1,2-다이팔미토일-sn-글라이세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글라이콜)-2000](mPEG2000-DPPE), 1,2-다이팔미토일-sn-글라이세로-3-포스포에탄올아민-N-[메톡시(폴리에틸렌 글라이콜)-5000](mPEG5000-DPPE), N-(카보닐-메톡시폴리에틸렌글라이콜-2000)-1.2-다이미리스토일-sn-글라이세로-3-포스포에탄올아민(mPEG2000-DMPE) 및 N-(카보닐-메톡시폴리에틸렌글라이콜-5000)-1,2-다이미리스토일-sn-글라이세로-3-포스포에탄올아민(mPEG5000-DMPE). 알하이드로겔(등록상표) '85'는 EM Sergeant Pulp 및 Chemical Company(뉴저지주 클리프턴)로부터 구입되고, Brenntag(독일 물하임 데어 루어)에 의해 제조되었다. 폴리(아크릴산)(PAA)은 Sigma Aldrich로부터 구입되었다.
나노명반 제제의 제조. 간단히, 40㎖의 알하이드로겔(등록상표)(10㎎/㎖의 알루미늄)을 60㎖의 물로 희석하고 Crest Powersonic CP230D(뉴저지주 트렌톤) 수욕에서 약 60℃에서 2시간 동안 가열함으로써 PEG 나노명반을 제조하였다. DSPE 또는 PEG화된 DSPE 인지질을 약 0.5 내지 30㎎/㎖의 인지질의 범위의 표시된 농도에서 가열된 알하이드로겔(등록상표) 용액에 첨가하였다(표 3). 모든 제제를 약 60℃ 수욕으로 돌려놓아서 가시적인 인지질 응집체를 용해시켰다. 다이아몬드 F12Y 상호작용 챔버, 이어서 세라믹 H30Z 보조제 가공 모듈이 구비된 Microfluidics M110P(매사추세츠주 뉴턴)를 가공 동안 온도 증가를 막도록 재순환하는 차가운 물에 의한 10회 통과까지 30,000psi에서 제제를 가공하도록 사용하였다. 동적 광 산란에 의한 입자 크기 규명을 위해 선택된 통과 사이에 50㎕의 분취량을 제거하였다. 남은 제제를 제10회 통과 후 수집하고, 안정성 스케줄에 놓아서 입자 크기를 모니터링하였다. 110P 마이크로유동화기에서 제조된 선택된 제제를 생체내 생물학적 활성 평가 전에 0.2㎛의 Supor 막을 통해 여과시켰다. 선택된 제제를 마이크로유동화 대신에 실베르손 고전단 혼합기(매사추세츠주 이스트 롱매도우)를 사용하여 5000rpm에서 5분 동안 가공하였다.
PAA 나노명반 제제에 대해, 평균 분자량이 2000인 PAA는 Sigma Aldrich로부터 구입되었다. 물 스톡 용액 중의 50중량%를 물 중에 희석하여 물 중의 30중량%를 생성하였다. 16g의 30중량%의 PAA를 160g의 스톡 10㎎/㎖의 알하이드로겔(등록상표) 용액과 합하고, 10M NaOH에 의해 pH를 6.6으로 조정하였다. 제제를 1, 3, 6, 10, 15 또는 20 통과 동안 30k PSI, 4℃에서 110P 마이크로유동화기를 사용하여 가공하였다.
나노명반 제제의 입자 분석. Malvern Instruments(영국 우스터셔) Zetasizer Nano-S 또는 Nano-ZS를 사용하여 동적 광 산란(DLS)에 의해 및 Beckman Coulter(캘리포니아주 브레아) LS230을 사용하여 레이저 회절 입자 분석에 의해 입자 크기에 대해 제제를 규명하였다. 침전 분석 및 cryoTEM(하기 기재)에 의해 입자 크기 정보를 또한 얻었다. DLS 분석을 위해, 명반 제제를 1.5㎖의 폴리스타이렌 일회용 큐벳 내에서 물 중에 1:100배 희석하였다. DLS 측정을 3회 하고, 산란 강도 기반 평균 입자 직경(Z-평균)으로서 값을 보고하였다. DLS에서 실행된 샘플을 60 및 200㎚의 폴리스타이렌 표준품(폴리스타이렌 굴절률 = 1.55 내지 1.59)에 대해 측정하고; 알루미늄은 1.24의 굴절률을 갖는다. 레이저 회절 기반 측정에 대해, 명반 샘플을 직접적으로 물 충전된 샘플 챔버에 넣고, 50%±5% 사이의 분극 강도 시차 산란(Polarization Intensity Differential Scattering: PIDS) 값이 도달되었다. 오프셋(레이저가 꺼지면서 회로의 전압을 측정함으로써 전기 노이즈 기준선을 확립) 옵션을 60초로 설정하고, 배경 측정치를 90초로 설정하고, 실행 길이를 90초 간격으로 설정하고, 펌프 속도를 50%로 설정하였다. 샘플 분석 전에 및 사이에, LS230을 3회 탈버블링하였다.
침전 분석. 파장 470㎚, 630㎚ 및 870㎚의 3개의 레이저가 구비된 LUM GmbH(콜로라도주 볼더) LUMiReader를 사용하여 레이저 산란 광학 프로파일링을 수행하였다. 입자 침강 속도를 샘플 큐벳의 수직 단면으로부터 레이저 광 투과 프로필의 변화에 기초하여 결정하였다. 4㎖의 비희석된 제제를 분석을 위해 원통형 유리 셀에 직접적으로 첨가하였다. 샘플을 30°의 최대 기울기 각도에서 25℃에서 2 내지 4시간 동안 측정하고, 측정 스캔을 60초마다 수집하였다. 더구나, 다중파장 분석 방법(2)에 기초하여, 입자 침강 속도를 이용하여 약 0.5㎛ 초과의 입자에 대해 용적 기반 입자 크기 분포를 계산할 수 있었다.
항원 흡착. 나노명반 제제에 대한 항원 결합을 은-염색 SDS-PAGE에 의해 평가하였다. 원심분리 전에, 샘플을 하기 순서로 혼합하였다: 명반 제제, TLR 리간드, 항원 및 희석제(식염수 또는 글라이세롤 용액). 이후, 샘플을 35,000 x g에서 4℃에서 30분 동안 Beckman Coulter(캘리포니아주 브레아) Optima Max-XP Ultra Centrifuge에서 원심분리하였다. 30㎕의 샘플을 10㎕의 4X 환원된 LDS 샘플 완충제와 혼합하고, 이후 20㎕를 8㎕의 SeeBlue2 Prestained 표준품을 갖는 12 레인 SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 각각의 겔을 190V에서 55분 동안 실행하고, 이후 최소 2시간 이상 내지 밤새 동안 50:40:10의 EtOH:CH3COOH:H2O의 고정 용액에 배치하였다. 이후, 겔을 Sigma-Aldrich(미주리주 세이트 루이스) ProteoSilver Plus Silver Stain Kit에 의해 제공된 지시에 따라 염색하였다.
TLR 리간드 흡착. 나노명반 제제에 대한 TLR-9 리간드 결합을 동일한 원심분리 및 희석 제제, 겔 조건 및 염색 키트를 사용하여 은-염색 SDS-PAGE에 의해 평가하였다. 3 내지 6kDa 범위 사이의 어두운 갈색 밴드의 존재는 TLR-9 리간드가 겔에 존재한다는 것을 나타낸다. TLR-4 리간드를 나노명반 제제에 의해 원심분리하고 이동상 A(75:15:10 [v:v:v] 메탄올:클로로폼:물과 20mM 암모늄 아세테이트 및 1% 아세트산)로 1:5 희석된 비결합 TLR-4 리간드의 존재에 대해 상청액을 시험함으로써 나노명반 제제에 대한 TLR-4 리간드 결합을 평가하였다. 각각의 상청액 샘플을 50㎕ 용적에서 Agilent Model 1100 HPLC(캘리포니아주 산타 클라라)에 부착된 Waters Co.(매사추세츠주 밀포드) Xbridge BEH Shielf RP18 칼럼에 주입하였다. 이동상 A 및 B(1:1 [v:v] 메탄올:클로로폼과 20mM 암모늄 아세테이트 및 1% 아세트산)로 이루어진 구배를 25분에 걸쳐 실행하였다. 검출을 ESA Biosciences(매사추세츠주 첼름스퍼드) Coronoa Charged Aerosol Detector(CAD)에 의해 수행하였다. 정량화를 이동상 B에서 상이한 용적에서 감염된 GLA 표준품을 사용하여 수행하여 표준 곡선을 생성한다.
XRD. Triclinic Labs(인디애나주 웨스트 라피엣)로 보내진 4개의 샘플에서 x선 분말 회절 분석을 수행하여 동일한 PEG화된 지질/알하이드로겔(등록상표) 조성물에서 다양한 가공의 효과를 결정하였다. 샘플을 초원심분리하고, x선 분말 회절(XRPD) 분석을 정지-습식 고체 및 상청액 액체로부터 수행하였다. Rigaku Smart-Lab x선 회절 시스템(텍사스주 더 우드랜즈)은 선 광원 x선 빔을 이용하여 반사 Bragg-Brentano 기하구조에 대해 구성되었다. S선 광원은 40kV 및 444mA에서 조작되는 구리 롱 파인 포커스 관이다. 이 광원은 높은 각도에서의 좁은 선으로부터 낮은 각도에서의 넓은 직사각형으로 변하는 샘플에서의 입사 빔 프로필을 제공한다. 빔 컨디셔닝 슬릿을 선 x선 광원에서 사용하여 최대 빔 크기가 선을 따라 및 선에 직각으로 둘 다 10mm 미만이라는 것을 보장한다. Bragg-Brentano 기하구조는 수동 발산 및 수용 슬릿에 의해 제어되는 파라-포커싱 기하구조이고, 샘플 자체는 광학의 포커싱 부품으로서 작용한다. Bragg-Brentano 기하구조의 고유 해상도는 부분적으로 사용된 수용 슬릿의 폭 및 회절계 반경에 의해 지배된다. 통상적으로, Rigaku Smart-Lab은 0.1°2θ 이하의 피크 폭을 제공하도록 조작된다. x선 빔의 축 발산은 입사 및 회절 빔 경로 둘 다에서 5.0° Soller 슬릿에 의해 제어된다. 샘플은 광 수동 압력을 이용하여 저배경, 실리콘 홀더에 배치하여 샘플 표면이 평평하고 홀더의 기준 표면과 고르도록 유지시킨다. 각각의 샘플을 0.02°2θ의 실행된 단 크기에 의해 분당 6°2θ의 연속 스캔을 이용하여 2 내지 40°2θ로 분석하였다. 설정된 각각의 데이터를 디지털로 여과하여 저빈도 반응을 제거한다. 생성된 패턴의 검사는 2개의 명확하게 상이한 결정질 반응의 확인을 허용하였다: 가우스 스타일 피크 및 로렌츠 스타일 피크. 가우스 스타일 피크는 보통 미결정질 재료와 연관되고, 결정질 및 비결정질 영역 둘 다를 함유하는 재료를 지칭하도록 사용된다. 로렌츠 스타일 피크는 보통 나노결정질 재료와 연관되고, 나노미터 크기인 결정물을 함유한다.
나노명반 제제의 CryoEM 분석
NanoImaging Services에 의해 CryoEM 분석을 실행하였다. 간단히, EM 분석을 위한 샘플을 400-메쉬 구리 그리드에서 구멍이 많은 탄소 필름에 의해 지지된 유리화된 얼음에서 보존하였다. 3㎕ 방울의 샘플 현탁액을 깨끗한 그리드에 도포하고, 필터 종이에 의해 블롯팅하고, 즉시 액체 에탄 중에 유리화에 의해 진행시킴으로써 각각의 샘플을 제조하였다. 그리드를 영상화를 위해 전자 현미경으로 옮기기까지 액체 질소 하에 저장하였다. 전자 현미경검사를 FEI Eagle 4k x 4k CCD 카메라가 구비된 120keV에서 조작되는 FEI Tecnai T12 전자 현미경을 사용하여 수행하였다. 유리 같은 얼음 그리드를 -170℃ 미만의 온도에서 그리드를 유지시키는 크리오스테이지(cryostage)를 사용하여 전자 현미경으로 옮겼다. 각각의 그리드의 영상을 다중 스케일에서 획득하여 견본의 전체 분포를 평가하였다. 저배율에서 영상화하기에 잠재적으로 적합한 표적 면적을 확인한 후, 110,000x(0.10㎚/화소), 52,000x(0.21㎚/화소) 및 21,000x(0.50㎚/화소)의 공칭 배율에서 고배율 영상을 획득하였다. -2㎛(110,000x), -3㎛ 내지 -2㎛(52,000x) 및 -5㎛(21,000x)의 공칭 언더포커스 및 약 9-42e/Å2의 전자 용량에서 용상을 획득하였다.
나노명반 제제의 생성 - 사이징제 PEG 나노명반 - 페길화된 인지질 사이징제의 개발
용액 중의 알루미늄 옥시하이드록사이드(명반)는 일반적으로 더 큰 통상적인 결정질 어레이 또는 시트로 응집한다. 비가공된 알하이드로겔(등록상표)은 비가공된 명반 제제에서 1마이크론 이상의 수산화알루미늄 분자의 더 큰 통상적인 결정질 어레이 또는 시트를 형성한다. 기재되지 않은 데이터에서, 다양한 조건 하에 수산화알루미늄 용액 단독의 마이크로유동화에 의해 밀링 또는 가공이 나노명반 제제를 발생시키는지를 결정하기 위해 실험을 수행하였고, 그러나 본 발명자들은 스톡 수산화알루미늄 단독의 마이크로유동화가 안정한 나노명반 제제를 생성시키는 조건을 결정할 수 없었다.
이론에 구속되고자 바라지 않으면서, 수산화알루미늄 분자의 응집을 방지하거나 파괴하기 위해 사이징제 또는 안정화제의 첨가가 필요할 수 있다는 것이 이론화되었다. 인지질은 일상적으로 수성 용액 중에 마이크로구의 유화제 및 안정화제로서 첨가되고, 명반 용액의 밀링 또는 가공 동안 사이징제, 예컨대 인지질의 포함이 나노명반 제제를 발생시키는지를 시험하기 위해 사이징제 초기 실험이 수행되면서 초기에 선택되었다. 각각 18개, 16개 및 14개 탄소의 상이한 아실 사슬 길이를 갖는 단일 인지질 종 DSPE, DPPE 및 DMPE의 포함에서 실험을 수행하였다. 기재되지 않은 데이터에서, 시험된 인지질은 효과적인 사이징제인 것으로 발견되지 않았고, 명반 분자의 응집을 방지하지 않았다.
인지질에 연결된 폴리에틸렌 글라이콜 모이어티의 첨가가 효과적인 사이징제를 생성시키는지를 결정하기 위해 추가적인 실험을 수행하였다. 사이징제의 포함이 나노명반 제제를 제조하도록 명반 분자의 응집을 파괴시키는지를 평가하기 위해, PEG5000-DSPE 스톡 용액을 10회 통과 동안 30k PSI에서 마이크로유동화에 의해 밀링하고, 스톡 수산화알루미늄 용액과 즉시 벤치 탑 혼합하여, 8㎎/㎖의 PEG5000-DSPE:4㎎/㎖의 알하이드로겔(등록상표) 제제를 생성하였다. 혼합된 마이크로유동화된 페길화된 인지질:수산화알루미늄 제제의 CryoEM 분석은 수산화알루미늄과 마이크로유동화된 페길화된 지질의 혼합이 명반의 더 큰 결정질 응집체의 형성을 파괴하지 않고 나노명반 제제를 제조하지 않는다는 것을 입증한다.
나노명반 제제가 스톡 명반 제제의 밀링 또는 가공 동안 사이징제의 첨가에 의해 제조되는지를 결정하기 위해 후속하는 실험을 수행하였다. 일련의 실험을 수행하여서, 명반의 밀링 또는 가공 동안 사이징제의 첨가가 나노명반 제제를 제조하는지를 결정하기 위해 수행되는 다양한 조건 하에 밀링 또는 사이징 공정 동안 스톡 명반 제제와 혼합된 상이한 아실 사슬 길이를 갖는 다양한 인지질(각각 18개 탄소, 16개 탄소 및 14개 탄소의 아실 사슬 길이를 갖는 DSPE, DPPE, DMPE)에 연결된 일련의 분자량 폴리에틸렌 글라이콜 모이어티(750-5000kD Mr의 범위)를 갖는 DSPE, DPPE 및 DMPE 페길화된 인지질을 평가하였다. 제제를 Malvern 분석 및 cryoEM 분석에 의해 입자 크기에 대해 분석하였다. 사이징제, 예컨대 페길화된 인지질의 존재 하의 명반의 밀링 또는 가공은 대략 400 내지 70㎚의 범위의 입자 크기를 갖는 나노명반 제제를 제조하였다(표 4 및 데이터 제시 생략).
제시된 데이터의 분석은 사이징제의 존재 하에 명반을 밀링하기 위해 사용된 방법 또는 조건이 상이한 한정된 입자 크기를 갖는 나노명반 제제를 제조할 수 있다는 것을 입증한다. 비가공된 명반은 대략 1000 내지 10,000㎚의 크기를 갖는다(표 4). 실베르손 혼합기에 의해 5000rpm에서 5분 동안 사이징제로서의 5000kD 분자량 PEG-DSPE의 존재 하의 명반의 혼합(예를 들어, 8㎎:4㎎ 사이징제:명반)은 대략 400㎚의 평균 입자 크기를 갖는 나노명반 제제를 제조한다(표 3 및 데이터 제시 생략). 5000kD 분자량 PEG-DSPE 혼합된 명반(예를 들어, 8㎎:4㎎ 사이징제:명반)의 1회 통과 동안 10k PSI에서의 마이크로유동화는 대략 120 내지 130㎚의 평균 입자 크기를 갖는 나노명반 제제를 제조한다. 6회, 10회, 15회 또는 20회 이하 통과 동안 혼합된 명반 5000kD 분자량 PEG-DSPE 용액의 가공은 70㎚의 평균 입자 크기를 갖는 나노명반 제제를 제조한다(표 3 및 데이터 제시 생략). 표 4에서의 데이터, 및 제시되지 않은 데이터는 밀링 또는 사이징 장비(예를 들어, 실베르손 혼합기 또는 마이크로유동화기) 또는 사이징제의 존재 하의 명반의 밀링의 조건(예를 들어, 마이크로유동화기에 대해 PSI 또는 통과의 횟수를 변경함으로써)을 변경함으로써 가공을 변경하는 것이 일련의 나노입자 크기(400㎚, 120㎚, 70㎚)를 갖는 나노명반 제제를 제조할 수 있다는 것을 입증한다. 제시된 데이터에 기초하여, 숙련자는 원하는 크기 범위의 나노명반 제제를 달성하기 위해 널리 인식된 기법 및 장비, 예컨대 고에너지원 또는 고에너지 유입을 이용하여 사이징제, 예컨대 페길화된 지질의 존재 하에 명반을 밀링하거나 가공할 수 있다.
표 4에서의 데이터 및 비기재된 데이터의 추가의 분석은 DSPE 인지질에 연결된 넓은 범위의 분자량의 PEG 모이어티가 효과적인 사이징제를 제조한다는 것을 입증한다. 표 4 및 비기재된 데이터에 입증된 바대로, 750 내지 2000 내지 5000kD의 PEG 길이의 변경(표 3 및 비기재된 데이터)은, 70㎚ 입자 크기 나노명반 제제를 제조하기 위해 결정된 밀링 조건 하에 밀링될 때, 나노명반 제제의 입자 크기에 영향을 미치지 않았다. 따라서, 본 개시내용의 페길화된 인지질 사이징제는 넓은 범위의 분자량의 폴리에틸렌 글라이콜 모이어티를 포함할 수 있다.
명반 대 페길화된 인지질 사이징제의 비율의 변경이 나노명반 제제의 입자 크기를 제어하도록 사용될 수 있는지를 결정하기 위해 실험을 수행하였다.
표 4에 제시된 데이터는 사이징제 대 명반의 비율의 변경이 나노명반 제제의 입자 크기에 영향을 미치도록 사용될 수 있다는 것을 나타낸다. 예를 들어, DSPE-PEG5000 사이징제에 대해 대략 300 내지 400㎚의 평균 입자 크기를 갖는 나노명반을 재현 가능하게 제조하기 위해 1:1의 명반 대 사이징제의 비율에서 제조될 수 있는 한편, 사이징제를 1:1.5 또는 1:2로 증가시키는 것은 각각 대략 100㎚ 또는 70 내지 80㎚의 나노명반을 재현 가능하게 제조한다. DSPE- PEG2000 사이징제와 비교하여, DPPE- PEG-5000 또는 PAA200 사이징제는 1:2 내지 1:3의 범위에서 명반 대 사이징제의 최적 비율이 70 내지 80㎚ 명반의 나노명반을 재현 가능하게 제조한다는 것을 입증한다. 또한, 표 4에서의 데이터 및 비기재된 데이터는 페길화된 인지질의 아실 사슬 길이가 원하는 크기 범위의 나노명반을 제조하는 사이징제의 능력에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다. 명반 제제와 혼합되고 동일한 공정에 의해 밀링될 때 페길화된 인지질의 18개 탄소(18C DSPE), 16개 탄소(16C DPPE) 및 14개 탄소(14C DMPE)의 다양한 아실 사슬 길이가 모두 동일한 입자 크기를 갖는 나노명반 제제를 제조하였다(표 4 및 비기재된 데이터). 따라서, 본 개시내용의 페길화된 인지질 사이징제는 상이한 아실 사슬 길이를 갖는 인지질을 포함할 수 있다.
농축 HCL , HNO 3 및 프로피온산을 통한 pH 감소
5분 동안 초음파처리를 통해 밀링으로 처리될 때 농축 산을 사용한 명반의 pH의 극적인 감소는 본 개시내용의 나노명반 제제를 제조하였다. 1.0의 최종 pH를 달성하기 위해 첨가된 농축 염산 및 질산 둘 다는 시험되었고, 둘 다 높은 다분산성으로 324㎚의 나노명반 제제를 제조하였다(데이터 제시 생략). 따라서, 농축 산 용액은 본 개시내용의 소정의 양상에 대해 나노명반 제제를 제조하기 위한 사이징제로서 적합할 수 있다. 그러나, 나노명반 제제에 대해 1.0의 최종 pH가 단백질, 펩타이드 및 핵산의 전달을 포함하는 본 개시내용의 모든 양상에 유리하지 않을 수 있으므로, 더 낮은 전체 pH 프로필을 갖는 추가적인 산을 추가로 평가하였다.
간단히, 4mM 올레산을 물과 혼합하여 30㎖의 에멀션을 얻었다. 이 혼합물을 10분 동안 (40% 파워에서) 초음파 프로브에 의해 처리하였다. 동일한 용적의 1.6% 용적 중량 알하이드로겔(등록상표) 스톡 용액을 동일한 용적의 유화된 올레산 용액과 혼합하여 알하이드로겔(등록상표):올레산 제제 0.8v%:2mM 올레산을 제조하고, 이것을 40% 파워에서 초음파 프로브를 사용하여 10분 동안 추가로 음파처리하였다. 생성된 나노명반은 194㎚의 입자 크기 및 2.4의 최종 pH를 가졌다. 따라서, 소정의 양상에 대해, 올레산은 나노명반 제제에 대한 적합한 사이징제이다.
pH가 6.1, 5.1 또는 4.5로 조정될 때까지 교반 및 5% 아세트산의 첨가에 의해 상기 기재된 바대로 명반을 음파처리하였다. 사이징제로서의 아세트산은 대략 100 내지 130㎚의 평균 입자 크기를 갖는 효과적인 나노명반 제제를 제조하였다. 또한, 제제의 나노입자는 제타 전위에 의한 측정치로서 양으로 하전되었다. 따라서, 본 개시내용의 몇몇 양상에 대해, 아세트산은 본 개시내용의 나노명반을 제조하기 위한 효과적인 사이징제일 수 있다.
사이징제로서의 PAA 나노명반 - 폴리아크릴산 ( PAA )
초기 실험을 위해, 나노명반을 제조하기 위한 사이징제로서의 PAA의 사용은 강한 교반 하에 40g의 0.4중량%의 명반을 20중량%의 PAA의 용액과 혼합함으로써 평가하고, pH를 농축 수산화암모늄에 의해 pH 6.0으로 조정하여 제타 전위에 의해 측정된 바대로 음으로 하전된 나노입자에 의해 대략 140㎚의 입자 크기의 나노명반을 생성하였다.
후속하는 실험을 위해, 간단히 20중량%의 PAA를 스톡 명반 용액과 혼합하고, pH를 수산화나트륨에 의해 6.6으로 조정하고, 110P 마이크로유동화기를 사용하여 밀링하였다. PEG 나노명반 제제의 개발로부터의 데이터에 기초하여, 제제를 4℃ 재순환에 의해 마이크로유동화를 통해 밀링하고, 각각 3회, 6회, 10회 및 15회 통과에 대해 30k psi에서 평가하였다. 3회 또는 6회 통과는 대략 100㎚의 입자 크기를 갖는 나노명반을 생성시키고, 3회 내지 6회 통과 사이에 입자 크기에서의 주목할만한 효과가 관찰되지 않았다. 10회 내지 15회의 통과의 횟수의 증가는 지속적으로 대략 70 내지 85㎚ 입자 크기 및 우수한 다분산성의 나노명반을 제조한다. 후속하는 실험을 위해, 10회 통과를 이용하였다. 데이터는 PAA가 나노명반 제제에 대한 효과적인 사이징제라는 것을 나타낸다.
나노명반 제제의 안정성 및 규명
데이터는 나노명반 제제가 적합한 사이징제, 예컨대 페길화된 지질 및 폴리아크릴산의 존재 하에 밀링에 의해 생성될 수 있다는 것을 보여준다. 그러나, 약물 또는 생물제에 대한 전달 제제로서의 상업화를 위해, 제제의 바람직한 특징은 입자 크기가 시간이 지나면서 안정해야 한다는 것이다. 수성 PEG 나노명반 또는 PAA 나노명반 제제가 안정하고 초기 입자 크기를 유지하거나, 70㎚ 초기 입자 크기로 밀링될 때 크기를 증가시키거나 200㎚의 평균 크기를 넘어 응집하지 않는지를 결정하기 위해 실험을 수행하였다. 간단히, PEG 나노명반 제제 및 PAA 나노명반을 이전에 기재된 바대로 제조하고, 표시된 바대로 4℃에서 저장하였다. 3중 샘플을 제조 후 1주, 2주, 1개월, 3개월, 6개월, 9개월 및 12개월에 제거하고, 본 명세서에 기재된 바대로 입자 크기 및 다분산성에 대해 평가하였다. PAA 나노명반 제제에 대한 도 1b에서의 데이터는 PAA 나노명반 제제가 엄청나게 안정하고 시험된 바대로 1개월, 3개월 및 6개월에 걸쳐 및 12개월을 넘어 대략 75㎚의 평균 입자 크기를 유지한다는 것을 입증한다(데이터 제시 생략). 유사하게, 도 1c에 도시된 PEG 나노명반 제제는 또한 현저히 안정하고, Malvern Zetasizer에 의해 동적 광 산란에 의해 측정될 때 1개월, 3개월, 6개월, 9개월 및 12개월까지의 기간 동안 대략 75㎚의 평균 입자 크기를 유지한다.
2 내지 8℃에서의 장기간 안정성은 백신 제제에 중요한 특징이지만, 저온 유통 저장의 유지는 세계 건강에 대한 백신의 전달에 대한 제한 인자일 수 있다. 본 발명자들은 본 개시내용의 나노명반 제제가 4주의 시간 기간에 걸쳐 일련의 온도(25℃, 37℃ 및 65℃)에 걸쳐 열안정적인지를 시험하였다. 간단히, 3중 샘플을 원하는 온도에서 저장하고, Malvern Zetasizer를 사용하여 동적 광 산란에 의해 측정된 바대로 평균 입자 크기 및 다분산성의 변화에 대해 평가하였다. 본 발명자들은 PEG5000-DSPE(18개 탄소 아실 사슬 길이), PEG2000-DMPE(14개 탄소 아실 사슬 길이), PEG2000-DPPE(16개 탄소 아실 사슬 길이) PEG750-DSPE(18개 탄소 아실 사슬 길이) 및 PEG200-DSPE(18개 탄소 아실 사슬 길이)를 평가함으로써 PEG 길이 및 아실 사슬 길이가 수성 나노명반 제제의 열안정성에 갖는 효과를 추가로 분석하였다. 도 1d-f에서의 데이터는 PEG2000-DSPE가 0주, 2주 또는 4주에 응집 또는 입자 크기 변경이 없거나 거의 없으면서 25℃ 및 37℃까지의 온도에서 극도로 안정하고, 심지어 60℃에서 2주까지 안정적이다는 것을 입증한다. 심지어 4주에서 60℃에 PEG2000-DSPE 나노명반 제제는 입자 크기의 오직 약간의 증가를 나타내고, 114㎚의 평균 입자 크기를 여전히 가져서, 사이징제를 함유하는 나노명반이 저온 유통 저장을 요하지 않을 수 있다는 것을 나타낸다. PEG5000-DSPE(PEG 길이 5000 및 18C의 아실 사슬 길이), PEG2000-DPPE(PEG 길이 2000 및 16C의 아실 사슬 길이) 및 PEG750-DSPE(PEG 길이 750 및 18C의 아실 사슬 길이)의 나노명반 제제는 0주, 2주 및 4주 동안 25℃ 및 37℃에서 열안정성을 나타내지만, 60℃에서 열불안정하고, 2주 및 4주에 2000㎚ 초과의 평균 입자 크기에 의해 입자 응집을 나타냈다. 흥미롭게도, 나노명반 제제 PEG2000-DMPE(PEG 길이 2000 및 14C의 아실 사슬 길이)는 4주까지 25℃에서 및 2주 동안 37℃에서 안정하지만, 37℃ 및 60℃에서 안정하지 않고, 2000㎚ 초과의 평균 입자 크기에 의해 입자 응집을 나타냈다. 따라서, 본 개시내용의 나노명반 제제는 증대된 열안정성을 나타낸다. 나노명반 제제의 열안정성은 표시된 저온 유통 저장 없이 구역에 대한 더 큰 전반적 접근을 허용할 수 있을 뿐만 아니라, 제제의 전체 비용을 감소시킬 수 있다. 도면 범례에서, QG194는 PEG5000-DSPE이고; QG195는 PEG2000-DMPE이고; QG196은 PEG2000-DPPE이고; QG197은 PEG750-DSPE이고; QG198은 PEG2000-DSPE이다.
나노명반의 안정성을 추가로 평가하기 위해, 본 발명자들은 명반 및 나노명반 제제의 콜로이드 안정성에 대한 동결-해동 사이클링의 효과를 평가하였다. 명반 제제에 대해 Horiba LA-960 및 나노명반 제제에 대해 Malvern Zetasizer를 사용하여 제제의 예비-동결 입자 크기를 측정하였다. 제제를 드라이 아이스/아세톤 배취에서 동결시키고, 이후 37℃ 수욕에서 해동하였다. 입자 크기를 측정하고, 동결-해동 사이클 전 및 후를 비교하였다. 알하이드로겔(등록상표) 85(명반)의 평균 입자 크기는 1회 동결-해동 사이클 후 160% 증가하였고, 이것은 콜로이드 안정성의 실패를 나타낸다. (나노명반-폴리(아크릴산))의 평균 입자 크기는 3회 동결-해동 사이클 후 무의미한 입자 크기 변화를 나타냈다. 나노명반-PEG의 평균 입자 크기는 1회 동결-해동 사이클 후 273% 증가하였고, 이것은 콜로이드 안정성의 실패를 나타낸다. 알하이드로겔(등록상표) 85 애쥬번트는 1회 동결-해동 사이클 후 콜로이드상 불안정하고, 이것은 동결의 탈안정화 효과에 대한 불량한 저항을 제시한다. 다른 한편, 폴리(아크릴산)에 의해 안정화된 나노명반은 반복된 동결-해동 사이클 후 훌륭한 안정성을 나타내고, 이것은 나노명반-PAA 제제의 장기간 냉동보존을 수월하게 할 수 있다.
명반은 정전기 상호작용(Al3+ 이온 또는 음으로 하전된 반대이온을 수반)[11], 금속 이온 배위 및 물 분자 및 하이드록실기와의 수소 결합[9], [10] 및 [12]; 및 몇몇 경우에 소수성 상호작용[13]을 통해 단백질 항원에 결합하거나 흡착하는 것으로 기재된 매력적인 애쥬번트이다. 단백질 흡착이, 있다 하더라도, 명반의 애쥬번트 특성에 필요한 정도에 관해 분야에서 약간의 논쟁이 있다. 본 발명자들은 명반과 비교하여 훨씬 더 작은 표면적 및 입자 크기를 갖는 본 개시내용의 나노명반이 항원을 효율적으로 흡착하는지를 시험하였다. 간단히, 원심분리 전에, 샘플을 하기 순서로 혼합하였다: 명반 제제, TLR 리간드(GLA 또는 CpG 5㎍), 항원(TB 융합 단백질 ID93(0.5㎍) 및 희석제(식염수 또는 글라이세롤 용액). 샘플을 35,0000 x g에서 4℃에서 30분 동안 원심분리하고, 비펠릿화된 상청액으로부터의 30㎕의 샘플을 10㎕의 4X 환원된 LDS 샘플 완충제와 혼합하였다. 20㎕를 8㎕의 SeeBlue2 Prestained 표준품을 갖는 12 레인 SDS-PAGE 겔로 로딩하였다. 각각의 겔을 190V에서 55분 동안 실행하고, 이후 최소 2시간 이상 내지 밤새 동안 50:40:10의 EtOH:CH3COOH:H2O의 고정 용액에 배치하였다. 이후, 겔을 ProteoSilver Plus Silver Stain Kit에 의해 염색하여, ID93이 상청액에 존재하거나 명반에 대한 흡착으로 인해 펠릿화되는지를 결정하였다. 데이터는 나노명반 제제에 존재하는 사이징제가 항원 또는 애쥬번트의 결합 또는 회합을 방해하지 않고, 본 개시내용의 생물활성제에 대한 전달 비히클로서 적합하다는 것을 입증하였다(데이터 제시 생략). PEG-5000 DSPE인 사이징제가 일반적으로 명반에 대한 단백질 흡착을 방해하거나 검정을 방해하지 않는다는 것을 확인하기 위해, ID93 융합 단백질을 TLR4 애쥬번트, GLA 및 명반과 혼합하였다. 겔에서의 62Kd ID93 밴드의 부재는 DSPE-PEG5000이 마이크론(0.5 내지 1.0 마이크론) 크기의 명반 입자에 대한 항원의 흡착을 차단하지 않는다는 것을 확인시켜준다. 5000, 2000 또는 750의 상이한 PEG 길이 또는 18개 탄소(DSPE), 16개 탄소(DPPE) 또는 14개 탄소(DMPE)의 상이한 아실 사슬 길이의 인지질에 연결된 2000의 고정된 PEG 길이의 사이징제 PEG DSPE를 함유하는 100㎚ 미만의 입자 크기를 갖는 본 개시내용의 나노명반 제제는 겔에서의 62Kd ID93 밴드의 부재(데이터 제시 생략)에 의해 입증된 바대로 융합 단백질 ID93을 동등하게 흡착할 수 있다. 따라서, 나노명반 제제의 평균 표면적 또는 입자 크기의 감소는 단백질 항원의 감소된 흡착을 발생시키지 않아서, 이들이 백신에 대해 특히 유용한 제제이게 만든다.
본 발명자들은 다음에 본 개시내용의 나노명반 입자에 존재하는 수산화알루미늄의 농도를 규명하였다. 간단히, 다양한 PEG 길이(5000, 2000, 750)의 사이징제 또는 다양한 아실 사슬 길이를 갖는 인지질(18 C-DSPE, 16C-DPPE 또는 14C DMPE)을 함유하는 나노명반 제제를 본 명세서에 기재된 바대로 가공하고, 알루미늄 함량을 ICP-OES 시험에 의해 평가하였다(도 2). 도 2에서의 데이터는 다양한 사이징제를 포함하는 나노명반 제제가 다양한 아실 사슬 길이의 인지질에 연결된 상이한 PEG 길이의 PEG 사이징제에 의해 제조될 때 예측된 명반 함량을 함유한다는 것을 입증한다. 스톡 4㎎/㎖의 명반 제제로부터 제조된 18C의 인지질(DSPE) 및 5000(샘플 1), 2000(샘플 2-4) 및 750(샘플 5)의 다앙한 PEG 길이를 갖는 사이징제 및 30,000psi에서 4℃에서 10회 통과 동안 마이크로유동화에 의해 밀링된 표시된 사이징제로 이루어진 나노명반 제제는 PEG750-DSPE(샘플 5)에 대해 3.9㎎/㎖ 내지 PEG2000-DPPE(샘플 3)에 대해 4.5㎎/㎖의 범위의 ICP-OES 시험에 의해 측정된 바대로 예측된 4㎎/㎖ 출발 값의 거의 동등한 양을 함유한다. 흥미롭게도, 사이징제의 부재 하에 밀링된 명반, 및 비가공된 명반 둘 다는 더 낮은 명반 함량(각각 샘플 6에 대해 3.2㎎/㎖ 및 샘플 7에 대해 3.4㎎/㎖)을 함유하였다.
데이터는 적절한 사이징제의 존재 하의 수산화알루미늄(알하이드로겔(등록상표))의 가공 또는 밀링이 본 개시내용의 물질의 전달에 적합한 안정한 나노명반 제제를 제조할 수 있다는 것을 입증한다. 본 개시내용의 사이징제는 제한 없이 페길화된 인지질 및 PAA를 포함한다.
실시예 2. 면역 반응을 자극하기 위한 단백질 또는 펩타이드(예를 들어, ID97)의 전달을 위한 PEG5000 및 PAA 나노명반 제제의 사용
Th1-왜곡된 면역 반응을 촉진하기 위해 100㎚의 규모에서 더 작은 명반 입자를 발생시키는 수산화알루미늄(알하이드로겔(등록상표))에 대한 변형에 대한 가능성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 1개는 폴리아크릴산(PAA)에 기초하고 1개는 PEG5000에 기초한 2개의 나노명반 애쥬번트를 생성하였다. 이 후보의 애쥬번트 가능성을 시험하기 위해, 본 발명자들은 ID97인 재조합 항원에 의해 Jackson Laboratory로부터 구입한 8주령 암컷 C57Bl/6 마우스(그룹마다 5마리)를 면역화하였다 - 마이코박테륨 투베르큘로시스로부터 4개의 단백질의 재조합 융합: Rv1886, Rv3478, Rv3619 및 Rv2875. ID97은 단독으로 또는 Th1 유도를 위한 양성 대조군으로서 명반(100㎍), PAA, 나노명반 PAA 1:1(100㎍의 명반, 70㎚ 입자 크기), 나노명반 PEG(100㎍의 명반, 70㎚ 입자 크기) 또는 TLR4 작용제 애쥬번트 GLA-SE와 애쥬번팅되어 전달되었다. 마우스를 근육내로 1회 면역화하였다. 면역화 후 7일에, 본 발명자들은 골지 저해제 브레펠딘 A의 존재 하에 ID97에 의해 비장세포를 자극함으로써 ID97 특이적 CD4+ T 세포 반응 또는 비자극된 남은 세포를 평가하였다. 이후, 세포를 CD4, CD8 및 CD44의 표면 발현, 및 CD154, IFN-γ, TNF, IL-2, GM-CSF, IL-5 및 IL-17A의 세포내 발현을 위해 염색하였다. 항원 특이적 반응은 반응을 만드는 CD4+ T 세포의 빈도로서 ID97 자극된 샘플 마이너스 비자극된 샘플에서 계산되었다. 도 3a는 각각의 그룹에서 Th1 반응에 대한 결과를 보여준다. 예상된 바대로, 비애쥬번팅된, 명반 애쥬번팅된 및 PAA 애쥬번팅된 그룹은 CD154(항원 특이성이지만 Th1, TH2 또는 Th17 헌신에 특이적이지 않은 마커)의 리콜 발현에 기초하여 ID97 특이적 CD4+ T 세포의 낮은 빈도를 보여준다. 놀랍게도, PAA 기반 나노명반은 Th1 특징 사이토카인 IFN-γ, TNF 및 IL-2의 제조를 특징으로 하는 튼튼한 CD4+ T 세포 반응을 유도하였다. 반응의 수준은 양성 대조군 애쥬번트 GLA-SE에 의해 달성된 것과 유사하였다. 체액 반응의 품질은 또한 면역화 후 7일에 평가되었다. 오직 PAA 기반 나노명반 및 양성 대조군 GLA-SE는 ID97 특이적 IgG2c 및 IgG 역가를 증대시켰다(도 3b 내지 도 3d). IgG2c로의 클래스 스위칭은 IFN-γ 생성 Th1 세포의 유도에 의해 영향을 받아서, 이 왜곡은 Th1 반응을 증대시키는 PAA 기반 나노명반을 지지한다. 놀랍게도, PAA 기반 나노명반은 또한 GLA-SE와 달리 IgG1 항체 역가를 증대시켜서, 이것이 고유한 행동 방식을 가질 수 있다는 것을 제안한다. PAA 나노명반은 TH1 반응을 프로그래밍하기 위한 고유하고 놀라운 애쥬번트 특성을 갖는다. 추가로, 이 반응은, 홀로 Th1 애쥬번트 활성을 갖지 않는 것처럼, 단지 PAA 성분의 특성이 아니다.
PAA 기반 나노명반이 백신 항원에 대한 Th1 면역을 증대시키는 기전을 설명하기 위해, 본 발명자들은 근육내 면역화 후 1일에 면역화된 마우스의 배수 림프절에서 중요한 Th1 증대 사이토카인의 농도를 평가하였다(도 4a 내지 도 4c). IL-12p70 및 IL-18은 둘 다 IFN-γ를 유도하는 데 중요하고, IP-10은 초기 IFN-γ- 유도성 사이토카인이다. 식염수 또는 명반 면역화와 비교하여, PAA 기반 나노명반은 면역화 후 1일에 IL-18 및 IL-12p70 둘 다의 발현을 증대시켰다. 이것은 아마도 PAA 기반 나노명반이 주어진 동물에서 IP-10 발현이 또한 증가하면서 IFN-γ의 초기 발현을 증대시켰다. PEG 기반 나노명반은 또한 IL-12p70 또는 IP-10 발현이 아니라 IL-18을 증가시켰고, 이것은 PAA 기반 나노명반의 고유한 특성을 추가로 나타낸다. 이 초기 IL-18 유도가 Th1 프로그래밍에 대해 중요한지를 결정하기 위해, 본 발명자들은 야생형 C57Bl/6 마우스 및 IL-18에 비민감한 IL-18R-/- 마우스에서 Th1CD4+ T 세포 프로필을 결정하였다. 야생형 마우스와 비교하여, PAA 기반 나노명반은 ID97 항원에 대한 Th1 반응을 유도하지 못했다(도 5).
종합하면, 이 데이터는 PAA 기반 나노명반 애쥬번트 및 잠재적으로 다른 나노입자 명반 기반 애쥬번트가 명반과 비교하여 고유한 애쥬번트 특성을 갖는다는 발견을 지지한다. 이 특성은 구체적으로 IL-18 및 IL-12p70 및 IFN-γ 반응성 사이토카인, 예컨대 IP-10을 포함하는 Th1 면역을 프로그래밍하는 선천성 사이토카인의 유도를 포함한다. 추가로 명반과 비교하여, PAA 기반 나노명반 및 잠재적으로 다른 나노명반은 Th1 프로필(항원 자극 시 IFN-γ, TNF 및 IL-2 분비)을 갖는 CD4+ T 세포의 유도 및 IgG2c 클래스 스위칭 및 항원 특이적 항체 역가의 증대를 증대시킨다. 이 과정은 IL-18:IL18R 신호전달 축의 활성화에 따라 달라진다. 백신 항원에 대한 Th1 반응의 증대는 공지된 톨 유사 수용체(TLR) 작용제, 예컨대 MPL, GLA, SLA, CpG, polyIC:LC 또는 Pam2CSK4의 포함에 주로 의존한다. 본 발명자들의 지식에 의해, 이것은 Th1 면역을 튼튼하게 촉진할 수 있는 제1의 비-TLR 함유 애쥬번트이다. 이것은 백일해, 결핵, 한센병, 말라리아, HIV, 리슈마니아증 및 인플루엔자와 같은 질환에 대한 백신을 포함하는 많은 잠재적인 백신 애쥬번트 분야를 갖는다.
기재되지 않은 데이터에서, TB 백신 항원 ID93을 갖는 PAA 나노명반 제제는 또한 비가공된 명반과 비교하여 증대된 Th1형 애쥬번트 활성을 입증하였다.
실시예 3. 핵산 물질을 전달하기 위한 PAA 나노명반 제제의 사용.
본 개시내용의 나노명반의 개선된 안정성, 저렴한 및 최종 무균화 가능한 대규모 수정 가능한 제조에 기초하여, 본 발명자들은 나노명반 제제가 RNA의 효율적인 전달을 할 수 있는지를 평가하였다. 본 발명자들은 당해 분야에 기재된 양이온성 에멀션에 대해 나노명반 제제의 성능을 벤치마킹하였다. 간단히, 양이온성 에멀션을 생성된 에멀션 0.5% w/vol Span 85, 5.0% v/vol 스쿠알렌, 0.4% w/vol DOTAP 및 0.5% w/vol Tween 80으로 당해 분야에 기재된 바대로 제조하였다(5). 레플리콘 RNA는 캡시드를 포함하는 구조 단백질 및 E 당단백질(C-E3-E2-6K-E1)이 제거되고, 루시퍼라제 유전자에 의해 대체된 변형된 알파바이러스 게놈으로부터 유래되었다. 간단히, RNA 발현 벡터는 캡시드를 포함하는 구조 단백질 및 E 당단백질(C-E3-E2-6K-E1)이 결여되지만 세포에서 RNA의 복제 및 발현에 필요한 모든 구조적 유전자(ns1-ns5)를 함유하는 변형된 알파바이러스 게놈으로부터 작제된 하위게놈 촉진자에 의해 추진된 루시퍼라제를 발현하는 레플리콘 RNA 벡터이었다. RNA 레플리콘 및 PAA 나노명반에 의해 전달된 바와 같이 생체내 루시퍼라제를 분석하기 위해, C57/BL6 마우스를 마취시키고, 면도하고, 250㎕의 표시된 제제 플러스 및 마이너스 표시된 용량에서의 RNA로 넓적다리에서 근육내로(i.m.) 면역화하였다. RNA 용량(농도)은 Nanodrop 분광광도계를 사용한 측정에 의해 주사 전에 확인되었다. 면역화된 마우스를 마취로 처리하고, 면도하고, 주사 후 24시간, 4일 및 7일에 60초 동안 IVIS Illumina II 영상장치를 사용하여 RNA 발현을 평가하였다. 동물을 영상화하고, 대규모에서의 상대 발광 단위가 얻어졌다. 본 명세서에 제시된 실시예는 PAA 나노명반 제제를 사용하지만, 본 명세서에 개시된 나노명반에 대한 범위에서 제한으로 해석되지 않아야 한다.
나노명반에 의해 제제화된 RNA 레플리콘 발현 벡터에 의해 면역화된 마우스는 생체내 RNA를 발현한다. RNA를 전달하는 나노명반의 능력을 평가하기 위해, 마우스에 본 명세서에 기재된 바와 같은 250㎕의 1:3 PAA 나노명반 제제 또는 대조군 양이온성 에멀션 제제 및 1㎍ 또는 0.1㎍의 용량에서의 레플리콘 RNA를 주사하였다(그룹마다 3마리의 마우스). 대조군은 30㎍, 1㎍ 또는 0.1㎍의 용량에서의 식염수 비히클, 양이온성 에멀션, PAA 나노명반 또는 네이키드 레플리콘 RNA를 포함한다. 비제제화된 레플리콘 RNA 발현은 30㎍의 루시퍼라제 레플리콘 RNA의 가장 높은 용량을 받는 1마리의 동물에서를 제외하고 24시간에 검출 가능하지 않았다(데이터 제시 생략). 그러나, 4일 및 7일에, 30㎍의 비제제화된 루시퍼라제 레플리콘 RNA 벡터에 의해 면역화된 모든 동물은 비히클(식염수) 대조군과 비교하여 검출 가능한 발현을 가졌다(데이터 제시 생략). 1㎍ 또는 0.1㎍의 네이키드 레플리콘 RNA를 받는 동물은 임의의 검출 가능한 발현을 갖지 않았다. 대조군 양이온성 에멀션 제제와 혼합된 RNA의 30배 더 낮은 용량(1㎍의 RNA 레플리콘)에서 전달 후 24시간, 4일 또는 7일에 모든 3마리의 동물은 검출 가능한 루시퍼라제 발현을 가져서(데이터 제시 생략), 양이온성 에멀션이 RNA 레플리콘의 전달을 증대시켜서, 비제제화된 재료와 비교하여 RNA 레플리콘의 동등하거나 더 높은 발현을 갖는 효과에 의해 정의된 바대로 용량 절약을 발생시킨다는 것을 입증한다. PAA 나노명반 제제와 혼합된 RNA의 동일한 30배 더 낮은 용량(1㎍의 RNA 레플리콘)은 또한 24시간에 3마리 중 1마리의 동물에서 및 각각 4일 및 7일에서 모든 면역화된 동물에서 루시퍼라제 발현을 입증한다(데이터 제시 생략). 대조군 양이온성 제제와 혼합된 RNA의 300배 더 낮은 용량(100ng의 RNA 레플리콘)에서, 4일 또는 7일에 24시간에 3마리 중 3마리의 동물 및 3마리 중 2마리의 동물은 검출 가능한 루시퍼라제를 발현하였다(데이터 제시 생략). PAA 나노명반 제제와 혼합된 RNA의 300배 더 낮은 용량(100ng의 RNA 레플리콘)에서, 24시간에 3마리 중 1마리의 동물 및 4일 또는 7일에 3마리 중 2마리의 동물은 검출 가능한 루시퍼라제를 발현하였다(데이터 제시 생략).
상기 기재된 영상 데이터는 Living Image 소프트웨어로부터의 Circular ROI를 통해 정량화되고, 도 6a 내지 도 6c에 그래프로 제시된다. 상대 발광 데이터는 로그 규모로 표시되고, 제제(각각 꽤 왼쪽, 중간 및 꽤 오른쪽 패널에서 비제제화된, 대조군 양이온성 에멀션 및 PAA 나노명반)에 따라 및 24시간(도 6a), 4일(도 6b) 및 7일(도 6c)에 각각 0㎍(mcg), 1㎍(mcg) 및 0.1㎍(mcg) 전달된 레플리콘 벡터의 용량에 의해 그룹화하였다. 데이터는 주사 후 24시간에 비제제화된 RNA(30㎍)보다 낮은 30배 및 300배(1 또는 0.1㎍)의 용량에서 양이온성 에멀션과 혼합된 RNA 레플리콘이 비제제화된 RNA와 동등한 발현을 나타낸다는 것을 입증한다. 24시간에, 비제제화된 RNA(30㎍)보다 낮은 30배 및 300배(1 또는 0.1㎍)의 동일한 용량에서의 PAA 나노명반 제제화된 레플리콘 RNA가 양이온성 에멀션과 비교하여 더 낮은 발현(도 6a)을 입증하지만, 주사 후 4일 및 7일에 대조군 양이온성 에멀션 또는 PAA 나노명반과 혼합된 RNA는 1㎍(mcg) 및 0.1㎍(mcg) 용량 둘 다에서 대략 동등한 발현(도 6b 및 도 6c)을 나타낸다. 데이터는 PAA 나노명반 제제가 레플리콘 RNA 벡터의 전달 및 발현을 할 수 있고, 비제제화된 RNA와 비교하여 용량 절약 특성을 갖는다는 것을 입증한다.
본 발명자들은 다음에 나노명반 제제 내의 PAA인 사이징제가 RNA 레플리콘 벡터의 전달 또는 발현에 영향을 미치는지를 시험하였다(도 7). PAA 단독이 RNA 레플리콘 벡터로부터의 루시퍼라제 발현의 원인인지를 결정하기 위해, 마우스를 비제제화된 레플리콘에 대해 30㎍ 또는 제제화된 RNA 레플리콘에 대해 1㎍ 및 100ng의 용량에서 비제제화된 RNA 레플리콘(도 7A), PAA 단독과 RNA 레플리콘(도 7B), 대조군 양이온성 에멀션과 RNA 레플리콘(도 7C) 또는 PAA 나노명반과 RNA 레플리콘(도 7D)에 의해 면역화하였다. 루시퍼라제 발현을 IVIS Illumina II 영상장치를 사용하여 평가하고, 영상 데이터를 주사 후 24시간에 기재된 바대로 Circular ROI를 통해 정량화하였다. 데이터는 PAA 단독(도 7B)이 0.1 또는 1.0㎍의 용량에서 RNA 레플리콘의 발현 가능한 수준을 전달하고/하거나 유도하지 않는 한편, 대조군 양이온성 에멀션 또는 PAA 나노명반에 의해 제제화되거나 혼합된 RNA 레플리콘의 동일한 용량이 비제제화된 RNA 레플리콘의 30배 내지 300배 더 높은 전달과 거의 동등한 수준에서 검출 가능한 루시퍼라제 발현을 나타낸다는 것을 입증한다. 데이터는 PAA인 사이징제 단독이 RNA 레플리콘으로부터의 단백질의 발현 가능한 수준을 전달하고/하거나 유도할 수 없다는 것을 입증한다.
이전의 실험은 본 개시내용의 나노명반 제제가 발현 가능한 RNA 레플리콘을 전달할 수 있다는 것을 입증하고, 네이키드 RNA 레플리콘과 비교할 때 용량 절약 특성을 입증한다. 본 발명자들은 다음에 나노명반 제제가 메신저 RNA를 효과적으로 전달할 수 있는지를 결정하였다(도 8). 이를 시험하기 위해, 본 발명자들은, 포유류 시스템에 대해 최적화되고 Trilink Biotechnologies로부터 완전히 가공된 성숙 mRNA(Luc mRNA)를 모방하는 슈도유리딘 및 5-메틸사이티딘에 의해 변형된, 캡핑된(Cap 0) 및 폴리아데닐화된 mRNA FLuc mRNA를 구입하였다. mRNA는 포티누스 피랄리스(Photinus pyralis)인 반딧불이로부터 원래 단리된 루시퍼라제 단백질을 발현한다. 간단히, 마우스(그룹마다 3마리)를 비제제화된 RNA, PAA 나노명반에 의해 제제화된 mRNA 또는 10㎍, 1㎍ 또는 0.1㎍의 RNA 용량에서의 대조군 양이온성 에멀션에 의해 제제화된 mRNA 및 RNA에 의해 기재된 바대로 면역화하였다. RNA 발현을 6시간, 24시간(도 8a) 및 5일(도 8b)에 IVIS Illumina II 영상장치를 사용하여 평가하고, 영상화된 데이터를 Circular ROI를 통해 정량화하였다. 주사 후 24시간에 도 8a에서의 데이터는 비제제화된 mRNA(왼쪽 그룹)를 받는 동물이 0.1㎍이 아니라 10㎍ 및 1㎍ mRNA 용량 수준 둘 다에서 검출 가능한 루시퍼라제 발현을 갖는다는 것을 입증한다. 그러나, 대조군 양이온성 제제 및 PAA 나노명반 제제(도 8a 중간 및 꽤 오른쪽 그룹) 둘 다는 서로와 비교할 때 모든 용량(10㎍, 1㎍ 및 0.1㎍)에서 mRNA의 동등한 수준을 발현할 뿐만 아니라, 이들은 또한 비제제화된 mRNA와 비교하여 1㎍ 용량에서 발현의 증가된 수준(30배 초과)을 나타내고, 0.1㎍ RNA 용량에서 발현의 검출 가능한 수준을 가져서, 나노명반 제제의 용량 절약 특성을 입증한다. 주사 후 5일에(도 8b), 비제제화된 mRNA는 더 낮은 수준이지만 10㎍ RNA 용량에서 LUC의 검출 가능한 발현을 나타내지만, 1㎍ 및 0.1㎍의 더 낮은 용량에서 루시퍼라제 mRNA 발현이 검출되지 않았다. 흥미롭게도, 주사 후 5일에 대조군 양이온성 제제화된 mRNA를 받는 마우스는 10㎍, 1㎍, 0.1㎍인 임의의 전달된 용량에서 mRNA의 검출 가능한 발현을 나타내지 않는다(왼쪽 그룹 및 중간). 그러나, PAA 나노명반 제제화된 mRNA를 받는 마우스(꽤 오른쪽 그룹)는 10㎍ 용량에서 mRNA의 10배 초과의 더 높은 수준을 발현할 뿐만 아니라, 1㎍ 용량에서 검출 가능한 발현을 나타내어서, mRNA의 전달 후 5일에도 나노명반 제제의 용량 절약 특성을 입증한다. 이후, 본 발명자들은 생체내 전달 후 6시간, 24시간 및 5일에 비제제화된, 제제화된 양이온성 에멀션 또는 mRNA의 10㎍ 용량에서의 PAA 나노명반 제제화된 mRNA를 받는 동물의 발현 역동학을 비교하였다(도 8c). 데이터는 나노명반 제제에 의해 제제화된 mRNA에 의해 면역화된 동물이 발현의 신속한 감소를 갖는 비제제화된 mRNA(●) 또는 대조군 양이온성 에멀션 제제화된 mRNA(△)와 비교하여 5일(□)에 걸쳐 mRNA의 발현의 증가되고 비교적 일정한 수준을 갖는다는 것을 입증한다.
5일에 mRNA 발현의 감소는 대조군 양이온성 리포솜에 의해 전달될 때 문헌에 보고되어 있고 예상되었다. 그러나, 비제제화된 mRNA 또는 나노명반 제제화된 mRNA의 지속적인 발현은 놀랍고 흥미로웠고, 5일에 10배 용량 절약 효과가 여전히 관찰되었다. 10㎍의 용량의 발현의 상대 수준은 나노명반 제제화된 mRNA에 대해 거의 동등한 1㎍의 RNA 용량이었다. 이론에 의해 구속되고자 함이 없이, 본 발명자들은 본 개시내용의 나노명반 제제가 mRNA 작제물을 안정화시킬 수 있다는 것을 가정하였다.
본 개시내용의 나노명반과 제제화된 mRNA의 생체내 발현의 놀라운 안정성에 기초하여, 본 발명자들은 본 개시내용의 나노명반이 시험관내 RNA를 안정화시켰는지를 추가로 조사하였다. 이것을 시험하기 위해, 본 발명자들은 1㎍의 RNA 레플리콘을 대조군 양이온성 또는 PAA 제제와 혼합하고, 1시간, 4시간 또는 24시간 동안 4℃에서 단일 바이알 제제로서 이 혼합물을 저장하였다. 1시간, 4시간 또는 24시간 4℃에서 저장된 비제제화된 레플리콘 RNA는 대조군으로서 작용하였다. 이후, 이 혼합된 단일 바이알 제제를 사용하여 마우스(그룹마다 3마리)를 면역화하고, RNA 발현을 IVIS Illumina II 영상장치를 사용하여 평가하고, 데이터를 생체내 전달 후 1일(도 9a) 및 5일(도 9b)에 Circular ROI를 통해 정량화하였다. 데이터는 생체내 전달 후 24시간 또는 5일에 평가되든 비제제화된 RNA 레플리콘이 혼합 후 4시간 또는 24시간 동안 4℃에서 저장될 때 검출 가능한 발현을 갖지 않는다는 것을 입증한다. 그러나, 검출 가능한 발현은, 비제제화된, 양이온성 리포솜에 의해 제제화된 또는 PAA 나노명반에 의해 제제화된, 생체내 전달 후 24시간 또는 5일에 평가될 때 4℃에서의 저장 후 즉시(시간 0) 또는 1시간에 투여되는지가 입증된다. 비제제화된 RNA는 문헌에 보고된 바대로 RNA의 상대 불안정성으로 인해 4℃에서 4시간 또는 24시간 동안 저장될 때 검출 가능한 발현을 가졌다. 비제제화된 RNA 레플리콘에 대한 데이터를 혼합되고 생체내 투여 전에 1, 4 또는 24시간 동안 4℃에서 단일 바이알로서 저장될 때 대조군 양이온성 또는 나노명반 제제화된 RNA 레플리콘 RNA 레플리콘에 대한 데이터와 비교하는 것은 1일(도 9a) 또는 5일(도 9b)에 측정된 바와 같은 거의 동등한 발현을 입증하였다. 본 발명자들은 각각 대조군 양이온성 제제, PAA 나노명반 및 비제제화된 레플리콘 RNA에 대한 데이터를 직접적으로 비교하는 산란 선도(도 9c 내지 도 9e)를 분석함으로써 데이터를 추가로 분석하였다. RNA는, 레플리콘 RNA과 혼합 직후 투여되거나(T=0, 도 9c), 혼합 및 4℃에서의 저장 후 4시간에 투여되거나(T=1h, 도 9d), 4℃에서 24시간(T=24h, 도 9e) 동안 혼합되고 저장될 때, 투여 후 5일에 발현의 필적하는 수준을 가져서, 나노명반 제제화된 RNA가 24시간까지 4℃에서 단일 바이알 제제로서 혼합될 때 안정적이다는 것을 입증한다.
본 명세서에 제시된 실시예에서 리포터 유전자를 코딩하는 RNA를 이용하여, 본 발명자들은 본 개시내용의 나노명반이 (1) 전달된 RNA 형태가 mRNA 또는 발현 벡터 RNA 작제물이든, 폴리뉴클레오타이드 물질 및 구체적으로 RNA 물질의 생체내 발현 가능한 형태의 전달을 할 수 있고; (2) 나노명반 제제가 RNA 벡터의 용량 절약 전달을 허용하고(이는 RNA의 동등한 발현이 비제제화된 RNA보다 적어도 30배 내지 300배 더 낮은 RNA의 용량에서 나노명반 제제에 대해 달성된다는 것을 의미함); (3) 본 개시내용의 나노명반 제제가 생체내 및 시험관내 둘 다에서 RNA 물질의 안정성을 증대시킨다는 것을 입증한다. RNA의 나노제제 전달의 특성이 개발되고 규명되면서, 본 발명자들은 숙주에서 면역 반응의 자극을 발생시키는 RNA를 전달하는 나노명반 제제의 능력을 평가하였다.
본 실시형태의 나노명반 제제에 의해 전달된 RNA 항원의 능력을 평가하기 위해, 본 발명자들은 본 개시내용의 나노명반에 의해 제제화된 EMCH 융합 폴리펩타이드를 발현하는 RNA 레플리콘에 의해 면역화된 마우스에서 면역 반응을 분석하였다.
EMCH 융합 폴리펩타이드의 작제. 추정상 미토콘드리아 HSP70(8E 또는 8) 폴리펩타이드의 카복시 말단의 단편의 5' 말단에 첨가된 메티오닌 개시 코돈(ATG)을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 오픈 리딩 프레임, 말레에이트 탈수효소폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 오픈 리딩 프레임의 카복시 말단 단편, 시스테인 단백분해효소 B 폴리펩타이드(CpB, CPB 또는 C)의 카복시 말단 단편, 및 히스톤 H2BN 폴리펩타이드(H2BN, h2Bn 또는 H)의 아미노 말단의 단편을 코딩하는 폴리뉴클레오타이드의 오픈 리딩 프레임의 탠덤 연결에 의해 EMCH라 칭해지는 융합 폴리펩타이드를 생성하였다. EMCH는 엘. 인판툼 폴리뉴클레오타이드로부터 추정상 미토콘드리아 HSP70(8E 또는 8) 폴리펩타이드의 카복시 말단의 509번 내지 660번 아미노산을 코딩하는 2,631개의 폴리뉴클레오타이드 서열, 엘. 인판툼으로부터 말레에이트 탈수효소 유전자의 카복시 말단의 1번 내지 322번 아미노산을 코딩하는 460 내지 1425, 시스테인 단백분해효소 B 폴리펩타이드(B)의 카복시 말단 단편의 154번 내지 443번 아미노산을 코딩하는 1426번 내지 2295번 폴리뉴클레오타이드, 및 엘. 인판툼으로부터 히스톤 H2BN(H) 폴리펩타이드의 아미노 말단의 1번 내지 111번 아미노산을 코딩하는 2297번 내지 2631번 폴리뉴클레오타이드를 갖는다. 877개의 아미노산 융합 폴리펩타이드는 이. 콜라이로부터 발현되고, 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 핵산 성분 및 제조 및 사용 방법은 WO2014/160985(모든 목적을 위해 본 명세서에 그 전문이 참고로 포함됨)에 더 완전히 기재되어 있다.
간단히, 마우스를 비제제화된 네이키드 RNA 대조군, 대조군 양이온성 리포솜과 혼합된 RNA 레플리콘 또는 시간 0에 RNA PAA 나노명반 제제와 혼합된 RNA 레플리콘으로서, EMCH인, 리슈마니어 융합 RNA 폴리뉴클레오타이드를 코딩하는 10㎍ 또는 0.1㎍의 알파바이러스 RNA 레플리콘 벡터에 의해 면역화하고, 모든 그룹을 3주 후 부스팅하였다. 비장세포를 수확하고, 마지막 부스트 후 4주에 EMCH 폴리펩타이드에 의한 생체내 자극 후 세포내 사이토카인 염색에 의해 결정된 바대로 리콜 항원 특이적 T 세포 반응에 대해 분석하였다. 면역화된 마우스 비장세포로부터의 사이토카인 생성을 유세포분석법에 의해 측정된 바대로 EMCH 특이적 CD44hi CD4+ 기억 T 세포에 대해 분석하였다. 항원 자극된 비장세포를 CD3 및 CD4 발현에 기초한 세포내 사이토카인 염색에 의해 확인하고, CD44 고 세포에서 추가로 게이팅하였다. CD44 고 CD4+ T 세포를 세포내 CD154, IFN-γ, IL2, TNFα, GM-CSF, IL-17 및 IL-5에 대해 추가로 염색하였다. EMCH 특이적 CD44 고 CD4+ T 세포는 항원 특이적 리슈마니어 반응에 통상적인 IFN-γ, TNFα 및 IL-2에 양성인 다작용성 T 세포 반응을 나타냈다. 데이터(도 10a 내지 도 10d)는 대조군 양이온성 리포솜 또는 PAA 나노명반에 의해 제제화된, 0.1㎍인, EMCH RNA의 100배 더 낮은 용량에 의한 면역화가 10㎍의 비제제화된 RNA로서 CD4+ CD44 고 CD154, IFN-γ, IL-2 또는 TNFα 단일 양성 사이토카인 염색 T 세포의 대략 동등한 백분율을 생성한다는 것을 입증한다. 비제제화된 RNA 레플리콘의 0.1㎍의 용량은 없거나 거의 없는 검출 가능한 염색을 나타낸다. 따라서, 본 개시내용의 나노명반 제제는 백신접종된 숙주에서 면역 반응을 자극하는 백신 제제로서 병원균의 항원을 코딩하는 RNA의 전달을 할 수 있다.
본 발명자들은 전달될 때 본 개시내용의 나노명반에 의해 제제화된 RNA 벡터에 의해 발현된 리슈마니어 폴리펩타이드에 대한 면역 반응의 품질을 추가로 규명하였다. 보호성 리슈마니아증 면역 반응의 특징은 다수의 사이토카인을 분비하는 다작용성 항원 특이적 T 세포의 존재를 포함한다. 본 발명자들은 다작용성 T 세포 반응에 대해 CD4+ CD44 고 T 세포를 분석하였다. 데이터(도 10e)는 PAA 나노명반(빗금 막대)에 의해 제제화되거나 대조군 양이온성 에멀션(사선 슬래시 막대)에 의해 제제화된 100ng의 EMCH RNA 레플리콘에 의해 면역화된 마우스가 10㎍의 비제제화된 RNA(실선 검정 막대) 면역화된 동물과 비교하여 삼중 양성 IFN, IL-2 및 TNFα CD4+ CD44 고 T 세포의 동등한 수를 갖는다는 것을 입증한다. IFN-γ 및 IL-2 또는 IL-2 및 TNFα를 발현하는 이중 양성 세포가 또한 존재한다. 데이터는 PAA 나노명반 제제가 백신에 특징적인 상대 항원 특이적 면역 반응을 생성하기에 충분한 수준에서 발현된 RNA를 전달할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 4. 면역 반응을 자극하기 위한 단백질 또는 펩타이드(ID93)의 전달을 위한 PEG 나노명반 제제(다양한 길이의 PEG)의 사용
본 개시내용의 나노명반 제제가 숙주에서 면역 반응을 자극하기 위해 단독의 또는 다른 물질(구체적으로 TLR 작용제)과 조합된 단백질 또는 폴리펩타이드를 전달할 수 있는지를 시험하기 위해 실험을 수행하였다.
동물 모델. 간단히, 실험 동물 및 6-8주령 암컷 CB57BL/6 마우스를 Jackson Laboratory 또는 Charles River로부터 구입하고, 특정한 비병원균 조건에서 유지시켰다.
ID93은 이전에 기재된 바대로 제조된 4개의 엠. 투베르큘로시스 펩타이드 Rv1813, Rv2620, Rv2608, 및 Rv3619를 도입하는 융합 단백질이다 [14].
비장세포를 치료 섭생에 따라 4마리 내지 5마리의 동물로부터 단리하였다. 적혈구를 적혈구 용해 완충제(eBioscience)를 사용하여 용해시키고, RPMI 1640, 10% FBS 중에 재현탁시켰다. 전체 생존가능 세포를 PCA 시스템(Guava Technologies)에 의해 ViaCount 검정을 이용하여 수를 세고, 96웰 플레이트에서 2x106개의 세포/웰에서 플레이팅하고, 37℃에서 배지 또는 ID93(10㎍/㎖)에 의해 2시간 동안 자극하였다. GolgiPlug(BD Biosciences)를 첨가하고, 세포를 37℃에서 추가적인 8시간 동안 항온처리하였다. 세포를 세척하고, 4℃에서 20분 동안 항-마우스 CD16/32의 존재 하에 CD4(클론 GK1.5), CD44(클론 IM7) 및 CD8(클론 53-6. 7)(BioLegend 및 eBioscience)에 대한 형광색소 표지된 항체에 의해 표면 염색하였다. 세포를 세척하고, 실온에서 20분 동안 Cytofix/Cytoperm(BD Biosciences)에 의해 투과시켰다. 세포를 Perm/Wash(BD Biosciences)에 의해 2회 세척하고, 실온에서 20분 동안 CD154(클론 MR1) IFN-γ(클론 XMG-1.2), TNF(MP6-XT22), GM-CSF(MP1-22E9), IL-17A(클론 TC11-18H10) 및 IL-5(TRFK5)(BioLegend 및 eBioscience)에 대한 형광색소 표지된 항체에 의해 세포내 염색하였다. 세포를 세척하고, PBS 중에 재현탁시켰다. 106까지의 사건을 4개 레이저 LSRFortessa 유세포분석장치(BD Biosciences)에서 수집하였다. 세포를 싱글렛 > 림프구 > CD4+ CD8- > CD44hi > 사이토카인 양성으로서 게이팅하였다. ID93 특이적 반응 빈도는 매칭된 샘플에서 ID93 자극된 세포로부터 비자극된 세포의 반응 양성의 빈도를 공제함으로써 결정되었다.
항체 반응
마우스 혈청을 microtainer 혈청 수집 관(VWR International(펜실베니아주 웨스트 체스터))으로 안구뒤 혈액의 수집에 의해 제조한 후, 10,000rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 이후, 각각의 혈청 샘플을 항체 포획 ELISA에 의해 분석하였다. 간단히, ELISA 플레이트(Nunc(뉴욕주 로체스터))를 0.1M 바이카보네이트 완충제 중에 2㎍/㎖의 재조합 항원 ID93에 의해 코팅하고, 1% BSA-PBS에 의해 차단하였다. 이후, 연속 순서로 및 세척 이후에 PBS/Tween20에서, 연속하여 희석된 혈청 샘플, 항-마우스 IgG1 또는 IgG2c-HRP(모두 Southern Biotech(알라바마주 버밍햄)) 및 ABTS-H2O2(Kirkegaard and Perry Laboratories(메릴랜드주 게이더스버그))를 플레이트에 첨가하였다. 플레이트를 405㎚에서 분석하였다(ELX808, Bio-Tek Instruments Inc(버몬트주 위노스키)). 중점 역가를 Prism 소프트웨어(GraphPad Software, Inc.)를 이용하여 계산하여, 최소 제곱 피트 방법을 이용하여 S자형 용량 반응 곡선을 결정하였다.
마이코박테륨 투베르큘로시스 모델에서의 이전에 공개된 데이터는 GLA/SE에 의해 제제화된 융합 폴리펩타이드 ID93에 의해 면역화된 마우스가 Th1 바이어싱된 반응을 나타내는 더 큰 ID-93 특이적 IgG2c 반응을 유도한다는 것을 입증하였다(Baldwin 2012). 공개된 데이터는 또한 명반 제제를 나타내지만, 일반적으로 더 큰 IgG1 항체 반응에 의해 입증된 바대로 더 큰 Th2 반응을 유도하였다. 본 발명자들은 나노명반 제제의 평균 입자 크기의 변경이 ID93 융합 폴리펩타이드에 생성된 면역 반응의 품질에 영향을 미치는지를 평가하였다. 이를 평가하기 위해, 동물을 0일에 대조군 제제로서 작용하는 100㎍의 마이크론 명반(예를 들어, 상업적으로 구입 가능한 비가공된 명반)과 혼합된 0.5㎍의 ID93 또는 100g의 PEG 나노명반 제제(생성된 제제가 400㎚, 130㎚ 또는 75㎚의 평균 입자 크기를 가지도록 밀링된 사이징제로서의 PEG 5000-DSPE) 플러스 또는 마이너스 5㎍의 TLR4 작용제 SLA와 혼합된 0.5㎍의 ID93으로 사두근에서 근육내로 0일에 면역화하였다. 면역화 후 21일에, 동물을 사혈시키고, 혈청을 수집하고, 기재된 바대로 ID93 특이적 항체 반응에 대해 분석하였다. 21일에 ID93 특이적 IgG1에 대한(도 11a) 및 IgG2c(도 11b)에 대한 항체 중점 역가는 SLA-SE 제제와 혼합된 ID93에 의해 면역화된 동물이 본 발명자들이 이전에 기재한 바대로 Th1 반응을 나타내는 IgG2c 역가의 약간의 증가로 ID93 특이적 IgG1 및 IgG2c 항체 역가 둘 다를 생성한다는 것을 입증한다. ID93 융합 폴리펩타이드 단독에 의한 마우스의 면역화는 예상된 바대로 측정 가능한 IgG1 또는 IgG2c 항체 역가를 발생시키지 않았다. 1 내지 10마이크론의 입자 크기를 갖는 명반 제제에 의한 면역화는 문헌에서 예측된 바대로 높은 IgG1 항체 역가 및 낮은 역가 IgG2c 역가에 의해 표시된 바대로 Th2 반응에 대한 현저한 바이어스를 입증한다. 이들 대조군을, 각각 400㎚, 130㎚ 또는 75㎚ 입자 크기의 나노명반을 제조하기 위해 실시예 1에 기재된 바대로, 방법(5분 동안 5000rpm에서 실베르손 혼합, 1회 통과에 대해 10k PSI 또는 10회 통과에 대해 30k PSI에서의 마이크로유동화)을 변경함으로써 밀링되거나 사이징된 사이징제로서 PEG-5000 DSPE를 포함하는 PEG 나노명반 제제와 비교하였다. 데이터는 400㎚ PEG 나노명반 제제가 비가공된 알루미늄 제제와 동일한 종점 IgG1 역가를 유도한다는 것을 입증한다(도 11a). 130㎚ 및 75㎚ 입자 크기의 PEG 나노명반 제제는 또한 명반 또는 400㎚ 입자 크기 PEG 나노명반과 비교하여 거의 절반으로 감소하더라도 높은 21일 IgG1 중점 역가를 생성하였다. 데이터는 시험된 PEG 나노명반 제제가 면역화된 마우스에서 측정 가능한 IgG2c ID93 항체 역가를 생성시키지 않는다는 것을 입증한다. 혼합된 나노명반 제제에 대한 TLR4 작용제의 첨가가 IgG2c에 의해 측정된 바대로 Th1 반응을 생성하도록 반응을 바이어스하는지를 결정하기 위해, 마우스를 또한 SLA인 TLR 4 작용제와 ID93 항원 및 PEG 나노명반 제제에 의해 면역화하였다. 데이터는 TLR4 작용제 SLA와 명반 제제 또는 400㎚ 입자 크기 PEG 나노명반 제제의 혼합이 ID93 특이적 IgG1 반응의 중점 역가에 무시할만한 효과를 갖지만, SLA와 130㎚ 또는 75㎚ 입자 크기의 PEG 나노명반의 혼합이 중점 ID93 특이적 IgG1 반응의 증가에 대한 경향이 있다는 것을 입증한다. 유사하게, ID93 항원 특이적 IgG2c 21일 중점 역가를 분석하는 도 11b에 제시된 데이터는 SLA의 부재 하에 ID93/PEG 나노명반에 의해 면역화된 동물에서 검출 불가능한 역가와 비교하여 SLA가 400㎚, 130㎚ 또는 75㎚ 입자 크기 PEG 나노명반 제제에 첨가될 때 ID93 IgG2c 역가가 유도된다는 것을 입증한다. 데이터는 PEG 나노명반이 Th2 바이어싱된 면역 반응을 유발할 수 있지만, 130㎚ 이하의 입자 크기를 갖는 PEG 나노명반 제제가 명반 또는 400㎚ PEG 나노명반과 비교하여 거의 절반으로 감소된 ID93 IgG1 역가를 갖는다는 것을 나타낸다. 흥미롭게도, SLA인 TLR 4 작용제의 첨가는 전통적인 명반 제제의 것에 대한 Th2 바이어싱된 반응의 규모를 거의 회복하였다. 또한, ID93PEG 나노명반에 의해 면역화된 마우스에 대해 ID93 특이적 IgG2c 항체 역가가 검출되지 않았지만, ID93/PEG 나노명반 백신 조성물에 대한 SLA인 TLR4 작용제의 첨가는 IgG2c를 생성하여서, SLA에 의한 Th1에 대한 반응의 약간의 바이어싱을 나타낸다.
상이한 아실 사슬 길이의 인지질에 연결되고 TB 융합 펩타이드 ID93과 TLR4 작용제 SLA와 혼합된 상이한 PEG 길이 또는 동일한 PEG 길이를 갖는 페길화된 인지질 사이징제를 포함하는 PEG 나노명반 제제에 의해 면역화된 마우스는 항원 특이적 면역 반응을 유발한다. 표 5는 PEG-5000 DSPE(밀링 또는 가공 없이)와 5㎍의 TLR4 작용제 SLA와 혼합된 100㎍의 전통적인 1 내지 10㎛ 입자 크기의 명반 제제 벤치에 대한 0.5㎍의 융합 단백질 ID93의 흡착을 0.5㎍의 융합 단백질 ID93과 5㎍의 SLA에 흡착된 5000, 2000 또는 750의 상이한 PEG 길이를 갖는 사이징제 PEG-DSPE를 포함하는 마이크로유동화된 나노명반 제제 및 2000의 한정된 PEG 길이를 갖는 페길화된 인지질 사이징제 및 18개 탄소(DSPE), 16개 탄소(DPPE) 및 14개 탄소(DMPE)의 상이한 아실 사슬 길이의 인지질을 갖는 나노명반 제제와 비교하는 실험 그룹의 표를 제시한다.
Figure 112018119035798-pct00020
5000, 2000, 또는 750의 PEG 길이 및 대략 70㎚의 입자 크기를 갖는 100㎍의 PEG 나노명반 제제(사이징제로서의 PEG-DSPE)에 흡착된, 0.5㎍의 ID93 융합 단백질 및 5㎍의 TLR 작용제 SLA의 용량에 의해 면역화된 마우스는 21일에 중점 역가에 의해 측정된 ID93 항원 특이적 IgG1 항체 역가를 유발한다. 도 12a는 동등한 IgG1 역가가 18개 탄소(DSPE) 또는 16개 탄소(DPPE)의 인지질 아실 사슬 길이에 연결된 5000, 2000 또는 750의 PEG 길이 또는 2000의 PEG 길이를 갖는 사이징제 PEG-DSPE를 포함하는 70㎚ 나노명반 제제 및 전통적인 1 내지 10㎛ 입자 크기의 명반 제제에 의해 면역화된 마우스에서 유발된다는 것을 입증한다. 14개 탄소(DMPE)의 아실 사슬 길이를 갖는 인지질 및 2000의 PEG 길이를 갖는 나노명반 제제는 다른 나노명반 제제와 비교하여 거의 절반으로 IgG1 역가를 감소시켰다. 도 12b는 0.5㎍의 ID93과 5㎍의 SLA인 TLR4 작용제에 흡착된 18개 탄소(DSPE) 또는 16개 탄소(DPPE)의 인지질 아실 사슬 길이에 연결된 5000, 2000 또는 750의 PEG 길이 또는 2000의 PEG 길이를 갖는 사이징제 PEG-DSPE를 포함하는 100㎍의 70㎚ 입자 크기의 나노명반 제제의 용량이, 반응이 1 내지 10㎛ 입자 크기의 명반 제제에 의해 보인 것의 거의 절반이더라도, Th1 바이어스를 나타내는 항원 특이적 IgG2c 항체 역가를 유발한다는 것을 입증한다. 14개 탄소의 아실 사슬 길이(DMPE)를 갖는 인지질 및 2000의 PEG 길이를 갖는 나노명반 제제는 임의의 현저한 ID93 IgG2c를 나타내지 않는다. 도 12c는 ID93 나노명반 제제가 항원 특이적 CD4+ T 세포를 유도한다는 것을 입증한다. 면역화된 마우스로부터의 사이토카인 제조를 유세포분석법에 의해 측정된 바대로 ID93 특이적 CD44hi CD4+ 기억 T 세포에 대해 분석하였다. GolgiStop 및 ID93 자극된 비장세포의 존재 하에 12시간 동안 ID93에 의해 자극된 백신접종된 마우스로부터의 비장세포를 CD3 및 CD4 발현에 기초한 세포내 사이토카인 염색에 의해 확인하고, CD44 고 세포에서 추가로 게이팅하였다. CD44 고 CD4+ T 세포를 세포내 CD154, IFN-γ, TNF, GM-CSF, IL-17 및 IL-5에 대해 추가로 염색하였다. ID93 특이적 CD44 고 CD4+ T 세포는 항원 특이적 ID93 반응에 통상적인 TNFα 및 IL-5에 양성인 다기능성 T 세포 반응을 나타내어서, 이 나노명반이 ID93 항원에 대한 Th1 면역을 유도하기 위해 TLR4 작용제 SLA에 대한 효과적인 비히클일 수 있다는 것을 입증한다.
실시예 4. 키토산-, 덱스트란- 및 폴리 ( 알릴아민 )- 나노명반 제제의 생성.
1920년대 중반 이후로 인간 및 동물에서 알루미늄 함유 애쥬번트를 투여하였다. 용어 명반은 백신에서 사용되는 임의의 알루미늄계 애쥬번트를 일반적으로 분류하도록 광범위하게 사용되지만, 화학적으로 이것은 주로 알루미늄 옥시하이드록사이드(AlO(OH)) 또는 인산알루미늄(AlPO4, Al(OH)x(PO4)y라고도 칭함)이다. AlO(OH)는 이의 x선 회절(XRD) 패턴으로부터 입증된 바대로 불량하게 결정질이고, 결정 구조는 안정한 커런덤 (α-Al2O3) 상의 많은 준안정한 상 중 하나인 슈도베마이트이다. AlO(OH)의 표면은 양이온성이고, 이에 따라 음이온성 항원의 흡착에 가장 적합하다. TEM 영상화는 4.5 x 2.2 x 10㎚의 계산된 평균 치수를 갖는 섬유성 나노입자를 보여주고, 이것은 현탁액 중의 5 내지 10마이크론의 넓은 크기 분포로 응집체를 형성한다. 이의 명칭과 반대로 인산알루미늄은 비화학량론적 양으로 포스페이트 및 하이드록사이드 반대이온 둘 다로 이루어지고, 순 음의(양이온성) 표면 전하를 갖고, 이에 따라 양이온성 항원의 흡착에 가장 적합하다. AlO(OH)와 달리, 인산알루미늄은 x선에 무수이고, 중앙 직경에서 대략 4㎛의 헐거운 응집체를 형성하는 약 50㎚ 디스크 형상의 입자로 이루어진다. 출발 재료로서 상업적으로 구입 가능한 마이크론 크기의 명반(예를 들어, 알하이드로겔(등록상표) 또는 AdjuPhos(등록상표))을 사용하고, 안정화제의 존재 하에 이것을 마이크로유동화함으로써 제조된 알루미늄계 나노입자 애쥬번트(나노명반)의 예가 본 명세서에 기재된다.
AdjuPhos (등록상표)( Al(OH) x (PO 4 ) y ) 애쥬번트를 사용한 나노명반 -키토산. 하기는 명반 전구체로서의 AdjuPhos(등록상표) 및 안정화제로서의 75% 내지 85% 정도의 탈아세틸화(DD)를 갖는 저분자량 키토산(25℃에서 1% 아세트산 중의 1중량% 용액의 20 내지 300cP의 점도에 기초한 50,000 내지 190,000Da)을 사용하여 나노명반을 합성하기 위한 일반 방법을 기재한다.
Figure 112018119035798-pct00021
AdjuPhos(등록상표) 애쥬번트 농도(5㎎ Al/㎖에서의 10㎖; 50㎎ Al)를 일정하게 유지시키고, 다양한 양의 키토산에 의해 안정화시켰다. 혼합 전에, 미리 결정된 키토산을 40㎖의 약하게 산성인 0.12M 나트륨 아세테이트/0.02M 아세트산 완충제(pH = 5.4) 중에 용해시켰다. 완전히 용해시킨 후, 키토산 용액(40㎖)을 10㎖의 AdjuPhos(등록상표)(50㎎ 알루미늄)과 혼합하고, 실베르손 고전단 혼합기에서 5,000rpm에서 5분 동안 혼합하고, 이후 22회 별개의 통과를 위해 LM20 고전단 마이크로유동화기(Microfluidics)에서 30,000psi에서 마이크로유동화하였다. 마이크로유동화된 재료는 시각적으로 혼탁하지만 반투명하였다. 키토산에 의해 안정화된 다양한 Adjuphos(등록상표)-유래된 나노명반의 조성은 하기 표 6에 제공된다. 수력학 직경은 도 13a에 도시된 바대로 통과의 횟수에 의해 감소하였다. 동일한 균질화 공정을 위해, 수력학 직경은 증가하는 키토산 분획(13B)에 의해 더 낮은 경향이었다. 대체로, 나노명반-키토산 제제의 제타 전위는 +20mV이었다.
Figure 112018119035798-pct00022
알하이드로겔 (등록상표)( AlO (OH)) 애쥬번트를 사용한 나노명반 -덱스트란. 하기는 명반 전구체로서의 알하이드로겔(등록상표) 및 안정화제로서의 황산덱스트란(40,000Da)을 사용하여 나노명반을 합성하기 위한 일반 방법을 기재한다.
Figure 112018119035798-pct00023
알하이드로겔(등록상표) 애쥬번트 농도(10㎎ Al/㎖에서의 10㎖; 100㎎ 알루미늄)를 일정하게 유지시키고, 다양한 양의 황산덱스트란에 의해 안정화시켰다. 혼합 전에, 미리 결정된 황산덱스트란을 40㎖의 DI수 중에 용해시켰다. 10㎖의 알하이드로겔(등록상표)(100㎎ Al)을 40㎖의 황산덱스트란 용액에 첨가하고, 실베르손 고전단 혼합기에서 5,000rpm에서 5분 동안 혼합하고, 이후 15회 별개의 통과를 위해 LM20 고전단 마이크로유동화기(Microfluidics)에서 30,000psi에서 마이크로유동화하였다. 마이크로유동화된 재료는 투명 내지는 반투명하고, 이것을 200㎚ PES 막에 의해 무균 여과시켰다. 황산덱스트란에 의해 안정화된 다양한 알하이드로겔(등록상표)-유래된 나노명반의 조성은 하기 표 7에 제공된다. 수력학 직경은 도 14a에 도시된 바대로 통과의 횟수에 의해 감소하였다. 대체로, 나노명반-덱스트란 제제의 제타 전위는 -40mV이었다. 이 보고의 시기에 이용 가능한 입자 안정성 데이터는 제조 일자 후 3개월까지 나노명반-덱스트란(예로서 표시된 로트 QG774)의 크기의 무의미한 변화를 보여준다(도 14b).
Figure 112018119035798-pct00024
알하이드로겔 (등록상표)( AlO (OH)) 애쥬번트를 사용한 나노명반 -키토산. 하기는 명반 전구체로서의 알하이드로겔(등록상표) 및 안정화제로서의 키토산(15,000Da, 최소 85% DD)을 사용하여 나노명반을 합성하기 위한 일반 방법을 기재한다.
Figure 112018119035798-pct00025
네이티브 알하이드로겔(AlO(OH))은 양이온성 표면 전하를 갖고, 이에 따라 또한 양이온성인 키토산을 정전기적으로 반발시킨다. 키토산을 알하이드로겔(등록상표)에 흡착시키기 위해, 후자는 포스페이트 리간드 교환을 통해 표면 개질을 겪어야 한다. 포스페이트 교환을 위해, 알하이드로겔(등록상표)(10㎎ Al/㎖)을 1:2 용적비로 10x PBS와 혼합하고, 오비탈 진탕기에서 37℃에서 24시간 내지 48시간 동안 반응되게 하였다. 포스페이트 교환된 알하이드로겔(등록상표)(PE-알하이드로겔(등록상표))을 2500rpm에서 15분 동안 원심분리하고, 깨끗한 상청액을 경사여과시켰다. 이후, 펠릿화된 PE-알하이드로겔(등록상표)을 DI수 중에 분산시키고, 원심분리-경사여과 단계를 3회 반복하여 포스페이트 완충제를 세척하였다. 최종 세척된 PE-알하이드로겔(등록상표) 펠릿을 10㎎ Al/㎖의 농도에서 DI수 중에 분산시키고, 실온에서 저장하였다. 포스페이트 교환 전의 및 후의 알하이드로겔(등록상표)의 제타 전위 측정은 표면 전하가 양이온성으로부터 음이온성으로 성공적으로 변환된다는 것을 확인시켜주었다(도 15a). 1% v/v 아세트산 중의 2% w/v 키토산 용액을 PE-알하이드로겔(등록상표)과의 혼합을 위해 스톡 용액으로서 제조하였다. 10㎖의 PE-알하이드로겔(등록상표)(100㎎ Al)을 DI수에 의해 2% 스톡 키토산 용액을 희석함으로써 제조된 다양한 양의 키토산과 혼합하였다. 예시적인 혼합 조건은 표 8에 기재되어 있다.
Figure 112018119035798-pct00026
각각의 50㎖의 PE-알하이드로겔(등록상표) 및 키토산 혼합물을 실베르손 고전단 혼합기에 의해 5,000rpm에서 5분 동안 균질화시키고, 이후 M110P 마이크로유동화기(Microfluidics)를 사용하여 연속 모드로 30,000psi에서 110㎖/분에서 5분 동안 마이크로유동화하였다. 마이크로유동화된 재료는 젖빛이고 거의 투명하였다. 합성된 예시적인 로트의 조성은 표 9에 제공된다. DLS로부터 예비 여과된 나노명반-키토산 재료의 입자 크기는 도 15b에 도시되어 있다. 일반적으로, Z-평균 직경은 사용된 키토산의 양과 양으로 관련된다. 제제를 여과가 가능할 때 200㎚ PES 막에 의해 여과시키고, 4℃에서 저장하였다. 대체로, 나노명반-키토산 제제의 제타 전위는 +20mV이었다.
Figure 112018119035798-pct00027
z-평균 수력학 직경은 시간에 따라 증가하지만, 사용된 키토산의 양에 따라, 대략 300 내지 500㎚에서 플레토에 있다. 둘째로, 크기 증가의 속도는 온도 의존적(크기는 더 높은 온도에서 더 신속히 증가함)이고, 이것은 크기 증가가 흡열성이고 잠재적으로 엔탈피의 증가에 의해 추진된다는 것을 제안한다.
알하이드로겔 (등록상표)( AlO (OH) 애쥬번트를 사용한 나노명반 - 폴리 ( 알릴아민 ). 하기는 명반 전구체로서의 알하이드로겔(등록상표) 및 안정화제로서의 폴리(알릴아민)(15,000Da)을 사용하여 나노명반을 합성하기 위한 일반 방법을 기재한다.
Figure 112018119035798-pct00028
네이티브 알하이드로겔(등록상표)(AlO(OH))은 양이온성 표면 전하를 갖고, 이에 따라 또한 양이온성인 폴리(알릴아민)을 정전기적으로 반발시킨다. 폴리(알릴아민)을 알하이드로겔(등록상표)에 흡착시키기 위해, 후자는 포스페이트 리간드 교환을 통해 표면 개질을 겪어야 한다. 포스페이트 교환을 위해, 알하이드로겔(등록상표)(10㎎ Al/㎖)을 1:2 용적비로 10x PBS와 혼합하고, 오비탈 진탕기에서 37℃에서 24시간 내지 48시간 동안 반응되게 하였다. 포스페이트 교환된 알하이드로겔(등록상표)(PE-알하이드로겔(등록상표))을 2500rpm에서 15분 동안 원심분리하고, 깨끗한 상청액을 경사여과시켰다. 이후, 펠릿화된 PE-알하이드로겔(등록상표)을 DI수 중에 분산시키고, 원심분리-경사여과 단계를 3회 반복하여 포스페이트 완충제를 세척하였다. 최종 세척된 PE-알하이드로겔(등록상표) 펠릿을 10㎎ Al/㎖의 농도에서 DI수 중에 분산시키고, 실온에서 저장하였다. 포스페이트 교환 전의 및 후의 알하이드로겔(등록상표)의 제타 전위 측정은 표면 전하가 양이온성으로부터 음이온성으로 성공적으로 변환된다는 것을 확인시켜주었다. 폴리(알릴아민)에 의해 안정화된 나노명반을 합성하기 위해, 10㎖의 PE-알하이드로겔(100㎎ Al)을 다양한 양의 15% w/v 폴리(알릴아민)과 혼합하고; 예시적인 혼합 비율은 표 10에 요약되어 있다. 폴리(알릴아민)의 유리 염기가 사용되므로, PE-알하이드로겔 및 폴리(알릴아민) 혼합물의 pH는 8 내지 11이고, 이에 따라 6M HCl을 사용하여 7로의 조정을 요했다.
Figure 112018119035798-pct00029
안정한 나노명반을 제조하기 위해, PE-알하이드로겔(등록상표) 및 폴리(알릴아민) 혼합물을 실베르손 고전단 혼합기를 사용하여 5분 동안 5,000rpm에서 혼합하고, 이후 M110P 마이크로유동화기(Microfluidics)를 사용하여 110㎖/분에서 5분 동안 30,000psi에서 마이크로유동화하였다. 마이크로유동화된 재료는 거의 투명하고, 이것을 200㎚ PES 막에 의해 무균 여과시켰다. 도 16에 도시된 나노명반 입자 크기는 폴리(알릴아민) 함량에 따라 증가하였다. 대체로, 나노명반-폴리(알릴아민) 제제의 제타 전위는 대략 +20mV이었다. 제조된 예시적인 나노명반-폴리(알릴아민) 제제의 조성은 표 11에 제공된다.
Figure 112018119035798-pct00030
RNA 기반 백신을 제제화하기 위한 나노명반 - 폴리 ( 알릴아민 ). RNA와 복합체화하는 나노명반-폴리(알릴아민)의 상용성을 평가하기 위해, 본 발명자들은 지카 항원을 코딩하는 1㎍의 10kb 자가 복제 RNA를 1㎎/㎖(로트 QG860), 2㎎/㎖(로트 QG859) 또는 20㎎/㎖(로트 QG854) 폴리(알릴아민)을 함유하는 희석된 나노명반-폴리(알릴아민) 제제와 혼합하였다. 네이키드 RNA 대조군과 함께 나노명반 복합체화된 RNA 샘플을 겔 저지 검정(GRA)에서 평가하여 RNA에 결합하는 각각의 제제의 능력 및 로딩 역량을 평가하였다. QG859(비희석된 2㎎/㎖ 폴리(알릴아민))는 1/200 희석(0.01㎎/㎖ 폴리(알릴아민))에서 100%의 RNA에 결합하였다. 유사하게, QG860(비희석된 1㎎/㎖ 폴리(알릴아민))은 1/100 희석(0.01㎎/㎖ 폴리(알릴아민))에서 100%의 RNA에 결합하였다. 제제 둘 다는 폴리(알릴아민)의 양과 상관되는 유사한 결합 특징을 보여주었다. 다른 한편, QG854(비희석된 20㎎/㎖ 폴리(알릴아민))는 심지어 1/4000 희석(0.005㎎/㎖ 폴리(알릴아민))에서 거의 100% RNA에 결합하였다.
참고문헌
Figure 112018119035798-pct00031

Claims (87)

  1. (a) Al(OH)x(PO4)y 또는 AlO(OH)이며, 0.5㎛ 내지 20㎛ 크기의 입자로 구성되는 알루미늄염; 및
    (b) 폴리아크릴산(PAA)의 사이징제(sizing agent)를 포함하는 나노명반 입자로서,
    상기 입자의 크기는 70㎚ 내지 85㎚의 범위이고,
    상기 알루미늄염 대 사이징제의 중량비는 1:2 내지 1:3인, 나노명반 입자.
  2. 제1항에 있어서, 상기 입자의 평균 크기는 동적 광 산란에 의해 결정된 바대로 Z-평균인, 나노명반 입자.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제1항에 있어서, 상기 PAA의 평균 분자량은 750 달톤 내지 7000 달톤의 범위인, 나노명반 입자.
  15. 제1항, 제2항 및 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 나노명반 입자는 필터 무균화된 액체 제제인, 나노명반 입자.
  16. 제1항에 있어서, 상기 나노명반 입자는 적어도 1년 동안 0℃ 내지 8℃에서 액체 제제 중에 안정한, 나노명반 입자.
  17. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 나노명반 입자는 반복된 동결-해동 사이클 후 안정한, 나노명반 입자.
  18. 제1항에 있어서, 상기 나노명반 입자는 적어도 1개월 동안 37℃에서 액체 제제 중에 안정한, 나노명반 입자.
  19. 제1항에 있어서, 상기 사이징제는 상기 알루미늄염과 연관된, 나노명반 입자.
  20. Al(OH)x(PO4)y 또는 AlO(OH)이며, 0.5㎛ 내지 20㎛ 크기의 입자로 구성되는 알루미늄염을 PAA의 사이징제의 존재 하에서 산성 pH에서 고에너지원으로 처리하는 단계를 포함함으로써 나노명반 입자가 제조되는, 나노명반 입자를 제조하는 방법으로서, 여기서 상기 나노명반 입자의 크기는 70㎚ 내지 85㎚의 범위이고, 상기 알루미늄염 대 사이징제의 중량비는 1:2 내지 1:3인, 나노명반 입자를 제조하는 방법.
  21. (a) Al(OH)x(PO4)y 또는 AlO(OH)이며, 0.5㎛ 내지 20㎛ 크기의 입자로 구성되는 알루미늄염을 산성 pH에서 고에너지원으로 처리하여 70㎚ 내지 85㎚의 범위의 크기를 갖는 나노명반 입자를 제조하는 단계 및 (b) PAA의 사이징제를 단계 (a) 이후 30분 이내에 상기 나노명반 입자와 혼합하는 단계를 포함하는, 나노명반 입자를 제조하는 방법으로서, 여기서, 상기 알루미늄염 대 사이징제의 중량비는 1:2 내지 1:3인, 나노명반 입자를 제조하는 방법.
  22. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 고에너지원은 마이크로유동화기, 압출기, 음파처리기, 고전단 혼합기 또는 균질화기로부터 생성된, 나노명반 입자를 제조하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 고에너지원은 2개 이상의 마이크로유동화기, 압출기, 음파처리기, 고전단 혼합기 또는 균질화기로부터 생성된, 나노명반 입자를 제조하는 방법.
  24. 제20항에 있어서, 상기 고에너지원은 마이크로유동화기 및 고전단 혼합물로부터 생성되고, 상기 알루미늄염 및 사이징제를 포함하는 상기 혼합물은 1회 통과 내지 30회 통과로 상기 마이크로유동화기를 통해 통과되는, 나노명반 입자를 제조하는 방법.
  25. 제20항에 있어서, 상기 고에너지원은 마이크로유동화기로부터 생성되고, 상기 알루미늄염 및 사이징제를 포함하는 상기 혼합물은 1회 통과 내지 15회 통과로 상기 마이크로유동화기를 통해 통과되는, 나노명반 입자를 제조하는 방법.
  26. 삭제
  27. 삭제
  28. 삭제
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 삭제
  32. 삭제
  33. 삭제
  34. 삭제
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 PAA의 평균 분자량은 750 달톤 내지 7000 달톤의 범위인, 나노명반 입자를 제조하는 방법.
  39. 제20항 또는 제21항에 있어서, 상기 나노명반 입자를 필터-무균화하는 단계를 추가로 포함하는, 나노명반 입자를 제조하는 방법.
  40. 삭제
  41. 제1항에 따른 나노명반 입자를 포함하는, 대상체에서 면역반응을 자극하기 위한 조성물.
  42. 제41항에 있어서, 생물활성제를 추가로 포함하는, 조성물.
  43. 제42항에 있어서, 상기 생물활성제는 상기 조성물 내에 나노명반 입자와 연관된, 조성물.
  44. 제42항에 있어서, 75% 초과의 상기 생물활성제는 겔 전기영동에 의해 결정된 바대로 상기 조성물 내에 나노명반 입자와 연관된, 조성물.
  45. 제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 생물활성제는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 항원, 애쥬번트, 진단제, 치료제 또는 유기체인, 조성물.
  46. 제45항에 있어서, 상기 생물활성제는 폴리펩타이드인, 조성물.
  47. 제46항에 있어서, 상기 폴리펩타이드는 항원, 융합 단백질, 전장 단백질, 펩타이드 또는 펩타이드 모방체인, 조성물.
  48. 제47항에 있어서, 상기 항원은 Rig-I 작용제 또는 ID97인, 조성물.
  49. 제45항에 있어서, 상기 생물활성제는 폴리뉴클레오타이드인, 조성물.
  50. 제49항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 DNA인, 조성물.
  51. 제50항에 있어서, 상기 DNA는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는, 조성물.
  52. 제50항에 있어서, 상기 DNA는 올리고뉴클레오타이드인, 조성물.
  53. 제49항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 RNA인, 조성물.
  54. 제53항에 있어서, 상기 RNA는 레플리콘 RNA, mRNA, tRNA, siRNA, shRNA 및 마이크로RNA로 이루어진 군으로부터 선택되거나, 압타머 RNA인, 조성물.
  55. 제53항에 있어서, 상기 RNA는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는, 조성물.
  56. 제41항에 있어서, 상기 조성물은 애쥬번트를 추가로 포함하는, 조성물.
  57. 제56항에 있어서, 상기 애쥬번트는 AS-2, 모노포스포릴 지질 A, 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A, IFA, QS21, CWS, TOM, AGPs, CpG 함유 올리고뉴클레오타이드, 톨 유사 수용체(TLR) 작용제, Leif, 사포닌, 사포닌 모방체, 생물학적 및 합성 지질 A, 이미퀴모드, 가르디퀴모드, 레시퀴모드, polyI:C, 플라겔린, GLA, SLA, STING, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된, 조성물.
  58. 제41항에 있어서, 상기 조성물은 액체 제제인, 조성물.
  59. 제41항에 있어서, 상기 조성물은 0.45 마이크론 크기의 필터를 통해 여과될 수 있는, 조성물.
  60. 제41항에 있어서, 상기 조성물은 0.20 마이크론 크기의 필터를 통해 여과될 수 있는, 조성물.
  61. 제41항에 있어서, 상기 조성물은 바이알 투입(vialing) 전에 최종 무균화될 수 있는, 조성물.
  62. 제41항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 1년 동안 0℃ 내지 8℃에서 안정한, 조성물.
  63. 제41항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 1개월 동안 37℃에서 안정한, 조성물.
  64. 제41항에 있어서, 상기 조성물은 리포솜을 추가로 포함하는, 조성물.
  65. 삭제
  66. 제41항의 조성물을 함유하는 제1 바이알을 포함하는 키트.
  67. 제66항에 있어서, 또 다른 물질을 함유하는 제2 바이알을 추가로 포함하는, 키트.
  68. 비인간 포유류의 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법으로서, 제41항의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함함으로써 상기 대상체에서 면역 반응을 자극하는, 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 면역 반응은 비특이적 면역 반응인, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  70. 제68항에 있어서, 상기 면역 반응은 항원 특이적 면역 반응인, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  71. 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 면역 반응은 주로 TH1 면역 반응인, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  72. 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 면역 반응은 주로 TH2 면역 반응인, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  73. 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 면역 반응은 TH1 및 TH2 면역 반응 둘 다인, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  74. 제69항 또는 제70항에 있어서, 상기 면역 반응은 B 세포의 활성화, T 세포의 활성화, 항체의 제조 또는 사이토카인의 방출을 수반하는, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  75. 제68항에 있어서, 상기 조성물은 단일치료에 사용되는, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  76. 제68항에 있어서, 상기 조성물은 알레르기, 중독, 암 또는 자가면역의 치료에 사용되는, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  77. 제68항에 있어서, 상기 조성물의 투여 경로는 경구, 정맥내, 피내, 경피, 비강, 피하 또는 항문인, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  78. 삭제
  79. 삭제
  80. 제68항에 있어서, 상기 비인간 포유류는 개, 고양이, 소 또는 말인, 대상체에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  81. 비인간 포유류의 대상체에서 세포에 생물활성제를 전달하는 방법으로서,
    (a) Al(OH)x(PO4)y 또는 AlO(OH)이며, 0.5㎛ 내지 20㎛ 크기의 입자로 구성되는 알루미늄염 및 PAA의 사이징제를 포함하는 나노명반 입자로서, 상기 입자의 크기는 70㎚ 내지 85㎚의 범위이고, 상기 알루미늄염 대 사이징제의 중량비는 1:2 내지 1:3인 나노명반 입자, 및
    (b) 생물활성제를 포함하는 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함함으로써, 상기 대상체에서 상기 세포에 상기 생물활성제를 전달하는, 방법.
  82. 제81항에 있어서, 상기 생물활성제는 상기 세포로 전달되는, 대상체에서 세포에 생물활성제를 전달하는 방법.
  83. 제82항에 있어서, 상기 생물활성제는 폴리펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하는 RNA이고, 상기 폴리펩타이드는 상기 세포에 의해 발현되는, 대상체에서 세포에 생물활성제를 전달하는 방법.
  84. 제81항 내지 제83항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 상기 대상체에서 면역 반응을 생성하는, 대상체에서 세포에 생물활성제를 전달하는 방법.
  85. 제1항의 나노명반 입자를 생물활성제와 혼합하는 단계를 포함하는, 조성물을 제조하는 방법.
  86. 조성물을 제조하는 방법으로서, (a) Al(OH)x(PO4)y 또는 AlO(OH)이며, 0.5㎛ 내지 20㎛ 크기의 입자로 구성되는 알루미늄염을 PAA의 사이징제의 존재 하에 산성 pH에서 고에너지원으로 처리하는 단계로서, 이로써 나노명반 입자가 제조되고, 여기서, 상기 알루미늄염 대 사이징제의 중량비는 1:2 내지 1:3이며, 상기 나노명반 입자의 크기는 70㎚ 내지 85㎚의 범위인, 상기 처리하는 단계, 및 (b) 단계 (a)에서 제조된 나노명반 입자를 생물활성제와 혼합하는 단계를 포함하는, 조성물을 제조하는 방법.
  87. 조성물을 제조하는 방법으로서, (a) Al(OH)x(PO4)y 또는 AlO(OH)이며, 0.5㎛ 내지 20㎛ 크기의 입자로 구성되는 알루미늄염을 고에너지원으로 처리하여 70㎚ 내지 85㎚의 범위의 크기를 갖는 나노명반 입자를 제조하는 단계; (b) 상기 나노명반 입자를 포함하는 용액의 pH를 산성 pH로 조정하는 단계; (c) 단계 (a) 후 30분 내에 PAA의 사이징제를 상기 나노명반 입자와 혼합하는 단계로서, 여기서 상기 알루미늄염 대 사이징제의 중량비는 1:2 내지 1:3인, 상기 단계; 및 (d) 단계 (c) 동안에 또는 후에 상기 나노명반 입자를 생물활성제와 혼합하는 단계를 포함하는, 조성물을 제조하는 방법.
KR1020187034581A 2016-06-01 2017-05-31 사이징제를 함유하는 나노명반 입자 KR102472026B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020227041252A KR20220165789A (ko) 2016-06-01 2017-05-31 사이징제를 함유하는 나노명반 입자

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201662344347P 2016-06-01 2016-06-01
US62/344,347 2016-06-01
PCT/US2017/035314 WO2017210364A1 (en) 2016-06-01 2017-05-31 Nanoalum particles containing a sizing agent

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227041252A Division KR20220165789A (ko) 2016-06-01 2017-05-31 사이징제를 함유하는 나노명반 입자

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20190015255A KR20190015255A (ko) 2019-02-13
KR102472026B1 true KR102472026B1 (ko) 2022-11-30

Family

ID=59054279

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020187034581A KR102472026B1 (ko) 2016-06-01 2017-05-31 사이징제를 함유하는 나노명반 입자
KR1020227041252A KR20220165789A (ko) 2016-06-01 2017-05-31 사이징제를 함유하는 나노명반 입자

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227041252A KR20220165789A (ko) 2016-06-01 2017-05-31 사이징제를 함유하는 나노명반 입자

Country Status (13)

Country Link
US (2) US11173126B2 (ko)
EP (1) EP3463300A1 (ko)
JP (3) JP7140684B2 (ko)
KR (2) KR102472026B1 (ko)
CN (1) CN109195587A (ko)
AU (2) AU2017273650B2 (ko)
BR (2) BR112018074352B1 (ko)
CA (1) CA3023271A1 (ko)
IL (3) IL298227B1 (ko)
MX (2) MX2018014399A (ko)
RU (1) RU2753874C2 (ko)
WO (1) WO2017210364A1 (ko)
ZA (1) ZA201807107B (ko)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
TW201718638A (zh) * 2015-07-21 2017-06-01 現代治療公司 傳染病疫苗
US11364292B2 (en) 2015-07-21 2022-06-21 Modernatx, Inc. CHIKV RNA vaccines
EP3364950A4 (en) 2015-10-22 2019-10-23 ModernaTX, Inc. VACCINES AGAINST TROPICAL DISEASES
UA124397C2 (uk) * 2016-12-26 2021-09-08 Могам Інстітьют Фор Байомедікал Рісерч Вакцинна композиція проти оперізувального герпесу
WO2019055807A1 (en) 2017-09-14 2019-03-21 Modernatx, Inc. RNA VACCINES AGAINST ZIKA VIRUS
EP3628735A1 (en) * 2018-09-25 2020-04-01 Centre National De La Recherche Scientifique Antisense rna targeting pmp22 for the treatment of charcot-marie-tooth 1a disease
US11679163B2 (en) 2019-09-20 2023-06-20 Hdt Bio Corp. Compositions and methods for delivery of RNA
WO2021158939A1 (en) * 2020-02-07 2021-08-12 The Johns Hopkins University Compositions of alum nanoparticles for immunomodulation and methods for producing the same
CA3172489A1 (en) 2020-03-23 2021-09-30 Amit KHANDHAR Nanoemulsion compositions and methods for delivery of nra
CN111658611B (zh) 2020-04-13 2021-06-01 四川大学 一种基于微乳的疫苗递送系统及其制备方法和应用
KR20230148148A (ko) 2020-12-23 2023-10-24 액세스 투 어드밴스드 헬스 인스티튜트 솔라네솔 백신 보조제 및 이의 제조 방법
CN113940994B (zh) * 2021-11-09 2023-09-15 南华大学 壳聚糖-Pickering乳液白细胞介素12佐剂体系的制备方法及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140234422A1 (en) * 2011-07-13 2014-08-21 Sanofi Pasteur Vaccine Composition With Aluminium Hydroxide Nanoparticles

Family Cites Families (172)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3598123A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3598122A (en) 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US4286592A (en) 1980-02-04 1981-09-01 Alza Corporation Therapeutic system for administering drugs to the skin
US4314557A (en) 1980-05-19 1982-02-09 Alza Corporation Dissolution controlled active agent dispenser
US4420558A (en) 1981-02-12 1983-12-13 Janssen Pharmaceutica N.V. Bright field light microscopic method of enumerating and characterizing subtypes of white blood cells and their precursors
US4379454A (en) 1981-02-17 1983-04-12 Alza Corporation Dosage for coadministering drug and percutaneous absorption enhancer
US4769330A (en) 1981-12-24 1988-09-06 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus and methods for making and using the same
US4420461A (en) 1982-05-26 1983-12-13 Ortho Diagnostic Systems Inc. Agglutination-inhibition test kit for detecting immune complexes
US4436727A (en) 1982-05-26 1984-03-13 Ribi Immunochem Research, Inc. Refined detoxified endotoxin product
US4743540A (en) 1983-09-27 1988-05-10 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Method for diagnosis of subclassifications of common varied immunodeficiency disease group
US5147785A (en) 1983-11-01 1992-09-15 Amtl Corporation Method and apparatus for measuring the degree of reaction between a foreign entity and white blood cells
US4614722A (en) 1983-11-01 1986-09-30 Pasula Mark J Method and apparatus for measuring the degree of reaction between antigens and leukocyte cellular antibodies
US4595654A (en) 1983-11-07 1986-06-17 Immunomedics Inc. Method for detecting immune complexes in serum
US4855238A (en) 1983-12-16 1989-08-08 Genentech, Inc. Recombinant gamma interferons having enhanced stability and methods therefor
US4568343A (en) 1984-10-09 1986-02-04 Alza Corporation Skin permeation enhancer compositions
US4659659A (en) 1985-01-22 1987-04-21 Monsanto Company Diagnostic method for diseases having an arthritic component
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
GB8508845D0 (en) 1985-04-04 1985-05-09 Hoffmann La Roche Vaccinia dna
FI861417A0 (fi) 1985-04-15 1986-04-01 Endotronics Inc Hepatitis b ytantigen framstaelld med rekombinant-dna-teknik, vaccin, diagnostiskt medel och cellinjer samt foerfaranden foer framstaellning daerav.
US6544728B1 (en) 1986-01-22 2003-04-08 Institut Pasteur Methods and kits for diagnosing human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2), proteins of HIV-2, and vaccinating agents for HIV-2
US6514691B1 (en) 1986-01-22 2003-02-04 Institut Pasteur Peptides of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2), antibodies against peptides of HIV-2, and methods and kits for detecting HIV-2
US5310651A (en) 1986-01-22 1994-05-10 Institut Pasteur DNA probes of human immunodeficiency virus type 2 (HIV-2), and methods employing these probes for dectecting the presence of HIV-2
US6054565A (en) 1986-03-03 2000-04-25 Institut Pasteur Nucleic Acids of HIV-2, Diagnostic Test Kit and Method using Nucleic Acid Probes of HIV-2
US5169763A (en) 1986-04-08 1992-12-08 Transgene S.A., Institut Pasteur Viral vector coding glycoprotein of HIV-1
US4767402A (en) 1986-07-08 1988-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transdermal drug delivery
US4948587A (en) 1986-07-08 1990-08-14 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transbuccal drug delivery
US5075109A (en) 1986-10-24 1991-12-24 Southern Research Institute Method of potentiating an immune response
FR2672290B1 (fr) 1991-02-05 1995-04-21 Pasteur Institut Sequences peptidiques specifiques des stades hepatiques de p. falciparum porteuses d'epitopes capables de stimuler les lymphocytes t.
EP0294071A3 (en) * 1987-06-03 1990-08-01 Merck & Co. Inc. Hepatitis b vaccines made with pre-formed aluminum hydroxide gels, and processes thereof
EP1088830A3 (en) 1987-06-22 2004-04-07 Medeva Holdings B.V. Hepatitis b surface antigen particles
US4780212A (en) 1987-07-31 1988-10-25 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enchancement of membrane permeability
US4897268A (en) 1987-08-03 1990-01-30 Southern Research Institute Drug delivery system and method of making the same
WO1989001973A2 (en) 1987-09-02 1989-03-09 Applied Biotechnology, Inc. Recombinant pox virus for immunization against tumor-associated antigens
GB2232892B (en) 1988-02-23 1991-07-24 John Mark Tucker Occlusive body for administering a physiologically active substance
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US6093406A (en) 1988-06-02 2000-07-25 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Vaccine for induction of immunity to malaria
US4912094B1 (en) 1988-06-29 1994-02-15 Ribi Immunochem Research Inc. Modified lipopolysaccharides and process of preparation
GB8819209D0 (en) 1988-08-12 1988-09-14 Research Corp Ltd Polypeptide & dna encoding same
US5231168A (en) 1988-09-16 1993-07-27 Statens Seruminstitut Malaria antigen
US4999403A (en) 1988-10-28 1991-03-12 Exxon Chemical Patents Inc. Graft polymers of functionalized ethylene-alpha-olefin copolymer with polypropylene, methods of preparation, and use in polypropylene compositions
WO1990006951A1 (en) 1988-12-16 1990-06-28 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezondheid En Cultuur Pneumolysin mutants and pneumococcal vaccines made therefrom
JP2752788B2 (ja) 1989-01-23 1998-05-18 カイロン コーポレイション 感染および過剰増殖障害の為の組換え療法
EP0414374B1 (en) 1989-07-25 1997-10-08 Smithkline Biologicals S.A. Novel antigens and methods for their preparation
EP1645635A3 (en) 1989-08-18 2010-07-07 Oxford Biomedica (UK) Limited Replication defective recombinant retroviruses expressing a palliative
US6120769A (en) 1989-11-03 2000-09-19 Immulogic Pharmaceutical Corporation Human T cell reactive feline protein (TRFP) isolated from house dust and uses therefor
US5298396A (en) 1989-11-15 1994-03-29 National Jewish Center For Immunology And Respiratory Medicine Method for identifying T cells disease involved in autoimmune disease
US5256643A (en) 1990-05-29 1993-10-26 The Government Of The United States Human cripto protein
US5124141A (en) 1990-06-14 1992-06-23 Flow Incorporated Method for diagnosing malaria
US5162990A (en) 1990-06-15 1992-11-10 The United States Of America As Represented By The United States Navy System and method for quantifying macrophage phagocytosis by computer image analysis
EP0468520A3 (en) 1990-07-27 1992-07-01 Mitsui Toatsu Chemicals, Inc. Immunostimulatory remedies containing palindromic dna sequences
US6277969B1 (en) 1991-03-18 2001-08-21 New York University Anti-TNF antibodies and peptides of human tumor necrosis factor
CA2113712C (en) 1991-07-19 2007-06-12 Ian Frazer Papilloma virus vaccine
US5464387A (en) 1991-07-24 1995-11-07 Alza Corporation Transdermal delivery device
US6197311B1 (en) 1991-07-25 2001-03-06 Idec Pharmaceuticals Corporation Induction of cytotoxic T-lymphocyte responses
CA2115364A1 (en) 1991-08-16 1993-03-04 Philip L. Felgner Composition and method for treating cystic fibrosis
WO1993010152A1 (en) 1991-11-16 1993-05-27 Smithkline Beecham Biologicals S.A. HYBRID PROTEIN BETWEEN CS FROM PLASMODIUM AND HBsAG
US6057427A (en) 1991-11-20 2000-05-02 Trustees Of Dartmouth College Antibody to cytokine response gene 2(CR2) polypeptide
JPH05328975A (ja) 1992-06-02 1993-12-14 Takara Shuzo Co Ltd Ｅ１ａ−ｆ遺伝子
JPH07507689A (ja) 1992-06-08 1995-08-31 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 特定組織のターゲティング方法及び組成物
WO1993025698A1 (en) 1992-06-10 1993-12-23 The United States Government As Represented By The Vector particles resistant to inactivation by human serum
EP0647140B1 (en) 1992-06-25 2007-12-12 Georgetown University Papillomavirus vaccines
DE69327599T2 (de) 1992-06-25 2000-08-10 Smithkline Beecham Biolog Adjuvantien enthaltende Impfstoffzusammensetzung
US5786148A (en) 1996-11-05 1998-07-28 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Polynucleotides encoding a novel prostate-specific kallikrein
GB2269175A (en) 1992-07-31 1994-02-02 Imperial College Retroviral vectors
US5437951A (en) 1992-09-03 1995-08-01 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins
US5411865A (en) 1993-01-15 1995-05-02 Iasys Corporation Method of detecting anti-leishmania parasite antibodies
DE05075889T1 (de) 1993-03-09 2006-10-05 The University Of Rochester Herstellung von menschlichem Papilloma-Virus HBV-11-Capsid-Protein L1 und virusähnlichen Teilchen
US5532133A (en) 1993-06-02 1996-07-02 New York University Plasmodium vivax blood stage antigens, PvESP-1, antibodies, and diagnostic assays
US6106824A (en) 1993-08-13 2000-08-22 The Rockefeller University Expression of growth associated protein B-50/GAP-43 in vitro and in vivo
EP0895293B1 (en) 1993-11-02 2006-06-14 Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. Semiconductor device comprising an aggregate of semiconductor micro-needles
US5458140A (en) 1993-11-15 1995-10-17 Non-Invasive Monitoring Company (Nimco) Enhancement of transdermal monitoring applications with ultrasound and chemical enhancers
US5885211A (en) 1993-11-15 1999-03-23 Spectrix, Inc. Microporation of human skin for monitoring the concentration of an analyte
US5814599A (en) 1995-08-04 1998-09-29 Massachusetts Insitiute Of Technology Transdermal delivery of encapsulated drugs
US5693531A (en) 1993-11-24 1997-12-02 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Vector systems for the generation of adeno-associated virus particles
GB9326253D0 (en) 1993-12-23 1994-02-23 Smithkline Beecham Biolog Vaccines
US5688506A (en) 1994-01-27 1997-11-18 Aphton Corp. Immunogens against gonadotropin releasing hormone
WO1995026204A1 (en) 1994-03-25 1995-10-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Immune stimulation by phosphorothioate oligonucleotide analogs
US5457041A (en) 1994-03-25 1995-10-10 Science Applications International Corporation Needle array and method of introducing biological substances into living cells using the needle array
US5591139A (en) 1994-06-06 1997-01-07 The Regents Of The University Of California IC-processed microneedles
EP1167377B2 (en) 1994-07-15 2012-08-08 University of Iowa Research Foundation Immunomodulatory oligonucleotides
US7037712B2 (en) 1994-07-26 2006-05-02 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation DNA encoding ovine adenovirus (OAV287) and its use as a viral vector
GB9415319D0 (en) 1994-07-29 1994-09-21 Medical Res Council HSV viral vector
DK0809700T3 (da) 1994-10-07 2006-09-18 Univ Loyola Chicago Papillomaviruslignende partikler, fusionsproteiner samt fremgangsmåde til fremstilling heraf
FR2727689A1 (fr) 1994-12-01 1996-06-07 Transgene Sa Nouveau procede de preparation d'un vecteur viral
JP3844501B2 (ja) 1995-02-08 2006-11-15 タカラバイオ株式会社 癌の制御
EP0812358A1 (en) 1995-02-24 1997-12-17 Cantab Pharmaceuticals Research Limited Polypeptides useful as immunotherapeutic agents and methods of polypeptide preparation
US5912166A (en) 1995-04-21 1999-06-15 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis of leishmaniasis
US5843464A (en) 1995-06-02 1998-12-01 The Ohio State University Synthetic chimeric fimbrin peptides
US5993800A (en) 1995-06-05 1999-11-30 Bristol-Myers Squibb Company Methods for prolonging the expression of a heterologous gene of interest using soluble CTLA4 molecules and an antiCD40 ligand
US5981215A (en) 1995-06-06 1999-11-09 Human Genome Sciences, Inc. Human criptin growth factor
US6309847B1 (en) 1995-07-05 2001-10-30 Yeda Research And Development Co. Ltd. Method for detecting or monitoring the effectiveness of treatment of T cell mediated diseases
US6458366B1 (en) 1995-09-01 2002-10-01 Corixa Corporation Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis
US5666153A (en) 1995-10-03 1997-09-09 Virtual Shopping, Inc. Retractable teleconferencing apparatus
US5618275A (en) 1995-10-27 1997-04-08 Sonex International Corporation Ultrasonic method and apparatus for cosmetic and dermatological applications
US5843462A (en) 1995-11-30 1998-12-01 Regents Of The University Of Minnesota Diphtheria toxin epitopes
US5846758A (en) 1995-11-30 1998-12-08 His Excellency Ghassan I. Shaker Method for diagnosing autoimmune diseases
US5656016A (en) 1996-03-18 1997-08-12 Abbott Laboratories Sonophoretic drug delivery system
US6093800A (en) 1996-09-06 2000-07-25 The Regents Of The University Of California E25a protein, methods for production and use thereof
US5955306A (en) 1996-09-17 1999-09-21 Millenium Pharmaceuticals, Inc. Genes encoding proteins that interact with the tub protein
US6797276B1 (en) 1996-11-14 2004-09-28 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Use of penetration enhancers and barrier disruption agents to enhance the transcutaneous immune response
US7033598B2 (en) 1996-11-19 2006-04-25 Intrabrain International N.V. Methods and apparatus for enhanced and controlled delivery of a biologically active agent into the central nervous system of a mammal
DE19654221B4 (de) 1996-12-23 2005-11-24 Telefonaktiebolaget Lm Ericsson (Publ) Leitungsanschlußschaltkreis
US5840871A (en) 1997-01-29 1998-11-24 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Prostate-associated kallikrein
US6977073B1 (en) 1997-02-07 2005-12-20 Cem Cezayirli Method for stimulating an immune response
BR9807734A (pt) 1997-02-25 2000-10-31 Corixa Corp Composto para imunodiagnose de câncer de próstata e métodos para o uso dos memos
US6541212B2 (en) 1997-03-10 2003-04-01 The Regents Of The University Of California Methods for detecting prostate stem cell antigen protein
US6555653B2 (en) 1997-05-20 2003-04-29 Corixa Corporation Compounds for diagnosis of tuberculosis and methods for their use
US6358508B1 (en) 1997-06-11 2002-03-19 Human Genome Sciences, Inc. Antibodies to human tumor necrosis factor receptor TR9
JP2001510031A (ja) 1997-07-21 2001-07-31 ノース・アメリカン・ヴァクシン・インコーポレーテッド ワクチンとしての修飾された免疫原ニューモリシン組成物
US6749856B1 (en) 1997-09-11 2004-06-15 The United States Of America, As Represented By The Department Of Health And Human Services Mucosal cytotoxic T lymphocyte responses
US7459524B1 (en) 1997-10-02 2008-12-02 Emergent Product Development Gaithersburg Inc. Chlamydia protein, sequence and uses thereof
EP1021168A4 (en) * 1997-10-09 2006-08-30 Univ Vanderbilt MICRO AND NANOAPARTICULAR, POLYMERIC ADMINISTRATION SYSTEM
AU754264B2 (en) 1997-11-28 2002-11-07 Genset S.A. Chlamydia trachomatis genomic sequence and polypeptides, fragments thereof and uses thereof, in particular for the diagnosis, prevention and treatment of infection
US7012134B2 (en) 1998-01-26 2006-03-14 Human Genome Sciences, Inc. Dendritic enriched secreted lymphocyte activation molecule
AU737337B2 (en) 1998-02-05 2001-08-16 Smithkline Beecham Biologicals (Sa) Tumor-associated antigen derivatives from the mage family, and nucleic acid sequences encoding them, used for the preparation of fusion proteins and of compositions for vaccination
US6596501B2 (en) 1998-02-23 2003-07-22 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method of diagnosing autoimmune disease
FR2775601B1 (fr) 1998-03-03 2001-09-21 Merial Sas Vaccins vivants recombines et adjuves
KR100692227B1 (ko) 1998-04-07 2007-03-09 코릭사 코포레이션 마이코박테리움 튜베르쿨로시스 항원의 융합 단백질 및이의 용도
GB2336310B (en) 1998-04-14 2003-09-10 Stowic Resources Ltd Method of manufacturing transdermal patches
JP2002511266A (ja) 1998-04-15 2002-04-16 ルードヴィッヒ インスティテュート フォー キャンサー リサーチ 腫瘍関連核酸及びその使用
US6680175B2 (en) 1998-05-05 2004-01-20 Adherex Technologies, Inc. Methods for diagnosing and evaluating cancer
US6322532B1 (en) 1998-06-24 2001-11-27 3M Innovative Properties Company Sonophoresis method and apparatus
CZ2001149A3 (cs) 1998-07-14 2002-02-13 Corixa Corporation Prostředky a způsoby pro terapii a diagnostiku karcinomu prostaty
US6692752B1 (en) 1999-09-08 2004-02-17 Smithkline Beecham Biologicals S.A. Methods of treating human females susceptible to HSV infection
US6375944B1 (en) 1998-09-25 2002-04-23 The Wistar Institute Of Anatomy And Biology Methods and compositions for enhancing the immunostimulatory effect of interleukin-12
US7001770B1 (en) 1998-10-15 2006-02-21 Canji, Inc. Calpain inhibitors and their applications
US6734172B2 (en) 1998-11-18 2004-05-11 Pacific Northwest Research Institute Surface receptor antigen vaccines
US6512102B1 (en) 1998-12-31 2003-01-28 Chiron Corporation Compositions and methods of diagnosis and treatment using casein kinase I
US6770445B1 (en) 1999-02-26 2004-08-03 Pacific Northwest Research Institute Methods and compositions for diagnosing carcinomas
US6599710B1 (en) 1999-03-10 2003-07-29 The General Hospital Corporation Treatment of autoimmune disease
GB9906177D0 (en) 1999-03-17 1999-05-12 Oxford Biomedica Ltd Anti-viral vectors
EP1167974B1 (en) 1999-04-07 2006-09-13 Hiroshi Okamoto METHOD FOR JUDGING AUTOIMMUNE DISEASE, METHOD FOR DETECTING ANTI-Reg PROTEIN AUTOANTIBODY AND DIAGNOSTICS FOR AUTOIMMUNE DISEASES
JP2002542203A (ja) 1999-04-19 2002-12-10 スミスクライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム ワクチン
US6685699B1 (en) 1999-06-09 2004-02-03 Spectrx, Inc. Self-removing energy absorbing structure for thermal tissue ablation
EP1206533A1 (en) 1999-08-26 2002-05-22 Pharmacia AB Novel response element
US7084256B2 (en) 1999-09-24 2006-08-01 Large Scale Biology Corporation Self antigen vaccines for treating B cell lymphomas and other cancers
JP4162813B2 (ja) 1999-10-28 2008-10-08 久光製薬株式会社 イオントフォレーシス装置
US6218186B1 (en) 1999-11-12 2001-04-17 Trustees Of The University Of Pennsylvania HIV-MSCV hybrid viral vector for gene transfer
US20020064801A1 (en) 1999-12-01 2002-05-30 Ryan Jeffrey R. Novel and practical serological assay for the clinical diagnosis of leishmaniasis
US6974588B1 (en) 1999-12-07 2005-12-13 Elan Pharma International Limited Transdermal patch for delivering volatile liquid drugs
US6587792B1 (en) 2000-01-11 2003-07-01 Richard A. Thomas Nuclear packing efficiency
AU2001233132A1 (en) 2000-01-31 2001-08-07 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The National Institutes Of Health Hybrid adeno-retroviral vector for the transfection of cells
EP1122542A1 (en) 2000-02-01 2001-08-08 Anda Biologicals S.A. Method for the rapid detection of whole microorganisms on retaining membranes by use of chaotropic agents
DE60140052D1 (de) 2000-05-31 2009-11-12 Human Gene Therapy Res Inst Methode und zusammensetzungen für effizienten gentransfer durch transcomplementierende vektoren
US6969704B1 (en) 2000-08-25 2005-11-29 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Methods for suppressing early growth response—1protein (Egr-1) to reduce vascular injury in a subject
US7060802B1 (en) 2000-09-18 2006-06-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Tumor-associated marker
AU2002248392A1 (en) 2001-01-26 2002-08-06 Walter Reed Army Institute Of Research Recombinant plasmodium falciparum merozoite protein-1/42 vaccine
US6893820B1 (en) 2001-01-31 2005-05-17 The Ohio State University Research Foundation Detection of methylated CpG rich sequences diagnostic for malignant cells
US7029685B2 (en) 2001-03-26 2006-04-18 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Plasmodium falciparum AMA-1 protein and uses thereof
WO2002077195A2 (en) 2001-03-26 2002-10-03 Walter Reed Army Institute Of Research Plasmodium falciparum ama-1 protein and uses thereof
US6933123B2 (en) 2001-04-05 2005-08-23 Yao Xiong Hu Peptides from the E2, E6, and E7 proteins of human papilloma viruses 16 and 18 for detecting and/or diagnosing cervical and other human papillomavirus associated cancers
US6844192B2 (en) 2001-06-29 2005-01-18 Wake Forest University Adenovirus E4 protein variants for virus production
US7078180B2 (en) 2001-09-05 2006-07-18 The Children's Hospital Of Philadelphia Methods and compositions useful for diagnosis, staging, and treatment of cancers and tumors
US6752995B2 (en) 2002-04-15 2004-06-22 Board Of Regents, The University Of Texas System Nucleic acid and polypeptide sequences useful as adjuvants
US6908453B2 (en) 2002-01-15 2005-06-21 3M Innovative Properties Company Microneedle devices and methods of manufacture
US6676961B1 (en) 2002-03-06 2004-01-13 Automated Carrier Technologies, Inc. Transdermal patch assembly
US7018345B2 (en) 2002-12-06 2006-03-28 Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. Iontophoresis system
DE102005032175A1 (de) 2005-07-09 2007-01-18 Krones Ag Behälter-Behandlungsmaschine und Verfahren zum Laden und Entladen einer Behälter-Behandlungsmaschine
EP1611926B1 (de) 2005-07-19 2008-01-16 Gebrüder Holzapfel GmbH & Co. KG Auftriebshilfe
US20100226932A1 (en) * 2006-02-22 2010-09-09 Novavax, Inc. Adjuvant and Vaccine Compositions
DK2066344T3 (da) * 2006-09-07 2011-09-05 Glaxosmithkline Biolog Sa Inaktiveret Poliovirus kombinationsvaccine
CN104815324A (zh) 2007-04-04 2015-08-05 传染性疾病研究院 包含结核分枝杆菌多肽及其融合的免疫原性组合物
WO2009012166A1 (en) 2007-07-13 2009-01-22 Infectious Disease Research Institute Leishmania sterol 24-c-methyltransferase compositions for the prevention, treatment and diagnosis of leishmaniasis
FR2922767B1 (fr) 2007-10-24 2009-12-18 Seppic Sa Procede de preparation d'une composition vaccinale comprenant au moins un antigene et au moins un adjuvant.
ES2524699T3 (es) * 2008-06-05 2014-12-11 Immunovaccine Technologies Inc. Composiciones que comprenden liposomas, un antígeno, un polinucleótido y un vehículo que comprende una fase continua de una sustancia hidrófoba
US8793881B2 (en) 2008-08-15 2014-08-05 Stanley Black & Decker, Inc. Utility knife with blade lock
CN102481312B (zh) 2009-06-05 2015-07-15 传染性疾病研究院 合成的吡喃葡萄糖脂佐剂
US9909114B2 (en) 2013-03-28 2018-03-06 Infectious Disease Research Institute Vaccines comprising leishmania polypeptides for the treatment and diagnosis of leishmaniasis
EP2981287A4 (en) 2013-03-28 2017-03-08 Infectious Disease Research Institute Vaccines comprising leishmania polypeptides for the treatment and diagnosis of leishmaniasis
FR3011255B1 (fr) * 2013-09-30 2015-09-11 Saint Gobain Adfors Tissu comprenant un revetement transparent resistant au feu
CN104055736A (zh) * 2014-07-08 2014-09-24 安徽医科大学 包封纳米铝的载体及其应用
CN104587464B (zh) 2015-01-23 2018-05-22 四川大学 一种基于氢氧化铝纳米粒的疫苗载体

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20140234422A1 (en) * 2011-07-13 2014-08-21 Sanofi Pasteur Vaccine Composition With Aluminium Hydroxide Nanoparticles

Also Published As

Publication number Publication date
BR112018074352B1 (pt) 2021-11-30
ZA201807107B (en) 2019-06-26
KR20220165789A (ko) 2022-12-15
CA3023271A1 (en) 2017-12-07
BR112018074352A2 (pt) 2019-03-06
JP7439171B2 (ja) 2024-02-27
AU2022263559B2 (en) 2024-06-27
WO2017210364A1 (en) 2017-12-07
IL298227B1 (en) 2024-05-01
IL262877B2 (en) 2023-05-01
CN109195587A (zh) 2019-01-11
AU2017273650A1 (en) 2018-11-22
IL262877A (en) 2018-12-31
IL262877B1 (en) 2023-01-01
RU2018137841A3 (ko) 2020-07-24
MX2018014399A (es) 2019-06-06
KR20190015255A (ko) 2019-02-13
RU2753874C2 (ru) 2021-08-24
AU2017273650B2 (en) 2022-08-18
JP7140684B2 (ja) 2022-09-21
JP2019521960A (ja) 2019-08-08
EP3463300A1 (en) 2019-04-10
RU2018137841A (ru) 2020-07-09
US11173126B2 (en) 2021-11-16
AU2022263559A1 (en) 2022-12-15
US20200085757A1 (en) 2020-03-19
IL311086A (en) 2024-04-01
IL298227A (en) 2023-01-01
MX2021010105A (es) 2022-06-16
US20220016042A1 (en) 2022-01-20
JP2024063036A (ja) 2024-05-10
BR132022001907E2 (pt) 2022-11-16
JP2022130524A (ja) 2022-09-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102472026B1 (ko) 사이징제를 함유하는 나노명반 입자
JP6463808B2 (ja) 合成アジュバントを含むワクチン組成物
JP6741580B2 (ja) 単一バイアルのワクチン製剤
KR102392974B1 (ko) Tlr 작용제를 함유하는 제제 및 사용 방법
RU2816240C2 (ru) Наноструктурированные липидные носители и стабильные эмульсии и их применения

Legal Events

Date Code Title Description
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
X701 Decision to grant (after re-examination)