PT1659178E

PT1659178E - Processo para a purificação ou produção de uma proteína mage

Info

Publication number: PT1659178E
Application number: PT06075362T
Authority: PT
Inventors: Silva Teresa Cabezon; Joseph Cohen; Moncef Mohamed Slaoui; Bassols Carlota Vinals
Original assignee: Glaxosmithkline Biolog Sa
Priority date: 1998-02-05
Filing date: 1999-02-02
Publication date: 2010-06-28
Also published as: IL137442A0; IL188875A0; NO20091665L; EP1053325B1; DE69929310T2; SI1053325T1; JP4768121B2; CY1111672T1; ATE505542T1; AU2722099A; US20120269835A1; TWI238853B; NO20003958D0; US8597656B2; SI1659179T1; EP1584685A2; CY1110180T1; BR9907691B1; EP1659178A2; NZ506086A

Description

DESCRIÇÃO "PROCESSO PARA A PURIFICAÇÃO OU PRODUÇÃO DE UMA PROTEÍNA MAGE" A presente invenção refere-se a métodos para purificar ou produzir uma proteína MAGE. A presente descrição refere-se a derivados de proteína compreendendo um antigénio associado a um tumor que tem utilidade na terapia de vacina contra o cancro. Em particular, os derivados da descrição incluem proteínas de fusão compreendendo um antigénio codificado pela família de genes de MAGE (e. g., MAGE-3, MAGE-1) , ligadas a um parceiro de fusão imunológico que proporciona epitopos T auxiliares, tais como, por exemplo, a forma lipidada da proteína D de Haemophilus influenzae B; proteínas MAGE modificadas quimicamente, em que as ligações persulfureto do antigénio estão reduzidas e os tióis resultantes bloqueados e proteínas MAGE modificadas geneticamente, dotadas com um marcador de afinidade e/ou modificadas para evitar a formação de ligações persulfureto. Os métodos são também descritos para formular vacinas para o tratamento de uma variedade de cancros, incluindo, mas não limitados a Melanoma, cancro da mama, bexiga, pulmão, NSCLC, cabeça e carcinoma das células escamosas, carcinoma do cólon e carcinoma do esófago.

Os antigénios codificados pela família de genes MAGE são predominantemente, expressos em células de melanoma (incluindo melanoma maligno) e alguns outros cancros, incluindo NSCLC (cancro de células não pequenas do pulmão), carcinoma de células escamosas da cabeça e pescoço, carcinoma de células de transição 1 da bexiga e carcinoma do esófago, mas não são detectáveis em tecidos normais, excepto nos testículos e na placenta (Gaugler, 1994; Weynants, 1994; Patard, 1995). 0 MAG-3 é expresso em 69% dos melanomas (Gaugler, 1994) e podem também ser detectados em 44% de NSCLC (Yoshimatsu, 1988), 48% dos carcinomas de células escamosas da cabeça e pescoço, 34% dos carcinomas de células de transição da bexiga, 57% dos carcinomas do esófago, 32% dos cancros de cólon e 24% de cancros da mama (Van Pel, 1995) ; Inoue, 1995, Fujie 1997; Nishimura, 1997). Os cancros que expressam proteínas MAGE são conhecidos como tumores associados a MAGE. A imunogenicidade das células de melanoma humano tem sido demonstrada elegantemente em experiências que utilizam culturas mistas de células de melanoma e linfócitos autólogos. Estas culturas produzem muitas vezes linfócitos T citotóxicos específicos (CTL), capazes de lisar exclusivamente as células de melanoma autólogas, mas não os fibroblastos autólogos, nem linfócitos B autólogos transformados com EBV, (Knuth, 1984;

Anichini, 1987) . Vários dos antigénios reconhecidos em células de melanoma autólogas por estes clones de CTL são agora identificados, incluindo os da família MAGE. 0 primeiro antigénio que foi possível definir através do seu reconhecimento por CTL específicos em células de melanoma autólogas é designado por MZ2-E (Van den Eynde, 1989) e é codificado pelo gene MAGE-1 (Van der Bruggen, 1991) . Os CTL dirigidos contra MZ2-E reconhecem e lisam células de melanoma positivas para MZ2-E de autólogos, bem como de outros doentes, desde que estas células tenham o alelo HLA.A1. 2 0 gene MAGE-1 pertence a uma família de 12 clones relativamente próximos, MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MAGE 5, MAGE 6, MAGE 7, MAGE 8, MAGE 9, MAGE 10, MAGE 11, MAGE 12, localizados no cromossoma X e que partilham entre si 64 a 85% de homologia na sua sequência codificante (De Plaen, 1994). Estes são muitas vezes conhecidos como MAGE Al, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE AIO, MAGE Al1, MAGE A12 (a família MAGE A). Dois outros grupos de proteínas também fazem parte da família MAGE, embora tenham uma relação mais distante. Estes são o grupo MAGE B e MAGE C. A família MAGE B inclui MAGE BI (também conhecido por MAGE Xpl e DAM 10), MAGE B2 (também conhecido como MAGE Xp2 e DAM 6) MAGE B3 e MAGE B4 - a família MAGE C inclui actualmente MAGE Cl e MAGE C2. Em termos gerais, uma proteína MAGE pode ser definida como contendo uma assinatura de sequência nuclear localizada na extremidade do terminal-C da proteína (por exemplo em relação a MAGE Al, uma proteína de 309 aminoácidos, a assinatura nuclear corresponde aos aminoácidos 195-279). O padrão de consenso da assinatura nuclear é assim descrito como se segue, em que x representa qualquer aminoácido, os resíduos em minúsculas são conservados (são permitidas variantes conservadoras) e os resíduos em maiúsculas são perfeitamente conservados).

Assinatura de sequência nuclear

LixvL(2x)I(3x)g(2x)apEExiWexl(2x)m(3-4x)Gxe(3-4x)gxp(2x)llt(3x)VqexYLxYxqVPxsxP(2x)yeFLWGprA(2x)Et(3x)kv 3

As substituições conservadoras são bem conhecidas e são, geralmente, definidas como matrizes de pontuação por defeito em programas de computador de alinhamento de sequências. Estes programas incluem PAM250 (Dayhoft M.O. et al. (1978) "A model of evolutionary changes in proteins", em "Atlas of Protein sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352, National

Biomedical Research Foundation, Washington e Blosum 62 (Steven Henikoft e Jorja G. Henikoft (1992), "Aminoacid substitution matricies from protein blocks") , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919.

Em termos gerais, as substituições dentro dos seguintes grupos são substituições conservadoras, mas as substituições entre grupos são consideradas não conservadoras. Os grupos são: i) Aspartato/asparagina/glutamato/glutamina ii) Serina/treonina iii) Lisina/arginina iv) Fenilalanina/tirosina/triptofano v) Leucina/isoleucina/valina/metionina vi) Glicina/alanina

Em geral, e no contexto da presente invenção, uma proteína MAGE será, aproximadamente, 50% idêntica na sua região nuclear aos aminoácidos 195 a 279 de MAGE Al.

Foram identificados vários epitopos CTL na proteína MAGE-3. Um destes epitopos, MAGE-3.Al, é uma sequência de nonapéptido, localizada entre os aminoácidos 168 a 176 da proteína MAGE-3, que constitui um epitopo específico para CTL quando apresentado em associação com a molécula HLA.A1 de MHC de classe I. Recentemente, foram identificados dois epitopos adicionais de 4 CTL na sequência peptídica da proteína MAGE-3, pela sua capacidade de desencadear uma resposta de CTL numa cultura mista de células de melanoma e linfócitos autólogos. Estes dois epitopos têm motivos de ligação específica para os alelos HLA.A2 (Van der Bruggen, 1994) e HLA.B44 (Herman, 1996), respectivamente.

Carrel et al., (1996) International Journal of Câncer 67(3), 417-422 divulga a identificação de um antigénio de reacção cruzada de 72 kDa, que é co-expresso com a proteína MAGE-1 em células de melanoma.

De acordo com um primeiro aspecto da invenção, é proporcionado um processo para a purificação ou produção de uma proteína MAGE, compreendendo reduzir as ligações persulfureto da proteína e bloquear o grupo tiol resultante com um grupo bloqueador e compreendendo ainda um ou mais passos cromatográficos, no qual a proteína é solubilizada utilizando um agente caotrópico forte ou um detergente zwiteriónico. A presente descrição proporciona derivados de proteína MAGE. Esses derivados são adequados para utilização em formulações de vacina terapêutica que são adequadas para o tratamento de uma variedade de tipos de tumor.

Numa forma de realização da presente invenção, o derivado é uma proteína de fusão compreendendo um antigénio da família das proteínas MAGE ligado a um parceiro heterólogo. As proteínas podem ser conjugadas quimicamente, mas são expressas, de um modo preferido, como proteínas de fusão recombinantes, permitindo que sejam produzidos níveis aumentados num sistema de expressão, em comparação com proteína não fundida. Desse modo, o parceiro de 5 fusão pode auxiliar a proporcionar epitopos T auxiliares (parceiro de fusão imunológico) , de um modo preferido epitopos T auxiliares reconhecidos por humanos ou auxiliando na expressão da proteina (intensificador de expressão) a níveis mais elevados do que a proteína nativa recombinante. De um modo preferido, o parceiro de fusão será um parceiro de fusão imunológico e também um parceiro de aumento de expressão.

Numa forma preferida da descrição, o parceiro de fusão imunológico é derivado da proteína D, uma proteína de superfície da bactéria gram-negativa, Haemophilus influenza B (W091/18926). De um modo preferido, o derivado de proteína D compreende, aproximadamente, o primeiro 1/3 da proteína, em particular, aproximadamente, os primeiros 100-110 aminoácidos N-terminais. De um modo preferido, o derivado da proteína D é lipidado. De um modo preferido, os primeiros 109 resíduos do parceiro de fusão da Lipoproteína D são incluídos no terminal N para proporcionar o antigénio de candidato de vacina com epitopos de células T exógenas adicionais e aumentar o nível de expressão em E. coli (actuando, desse modo, com um intensificador de expressão). A cauda lipídica assegura a apresentação óptima do antigénio a células apresentadoras de antigénio.

Outros parceiros de fusão incluem a proteína não estrutural do vírus de influenza, NS1 (hemaglutinina). Tipicamente, são utilizados os 81 aminoácidos de terminal-N, embora se possam utilizar fragmentos diferentes, desde que incluam epitopos T auxiliares.

Noutra forma de realização, o parceiro de fusão imunológico é a proteína conhecida por LYTA. De um modo preferido, utiliza-se a porção de terminal-C da molécula. A LYTA é derivada 6 de Streptococcus penumoniae que sintetiza uma N-acetil-L-alanina amidase, amidase LYTA (codificada pelo gene lytA {Gene 43 (1986) páginas 265-272}, uma autolisina que degrada especificamente determinadas ligações no esqueleto de peptidoglicano. 0 domínio de terminal-C da proteína LYTA é responsável pela afinidade para a colina ou para alguns análogos de colina, tal como DEAE. Esta propriedade foi explorada para o desenvolvimento de plasmídeos que expressam C-LYTA em E. coli, úteis para expressão de proteínas de fusão. Foi descrita a purificação de proteínas híbridas contendo o fragmento C-LYTA no seu terminal amino {Biotechnology: 10 (1992) páginas 795-798}. Tal como aqui utilizada, uma forma de realização preferida utiliza a porção repetida da molécula Lyta encontrada na extremidade do terminal-C, começando no resíduo 178. Uma forma particularmente preferida incorpora os resíduos 188-305.

Os parceiros de fusão imunológicos acima referidos também são vantajosos no auxílio da expressão. Em particular, estas fusões são expressas com rendimentos maiores do que as proteínas MAGE recombinantes. A presente requerente demonstrou, numa experiência clínica que estas construções são capazes de tratar o melanoma. Num caso, foram eliminadas as metástases de um doente com um melanoma de fase IV, após duas doses de proteína lipo D 1/3 MAGE 3 His sem adjuvante.

Deste modo, a presente invenção proporciona proteínas de fusão compreendendo um antigénio associado a tumor, da família MAGE, ligados a um parceiro de fusão imunológico. De um modo preferido, o parceiro de fusão imunológico é a proteína D ou um seu fragmento, de um modo mais preferido a lipoproteína D. As 7 proteínas MAGE são, de um modo preferido, MAGE AI ou MAGE A3. A parte da Lipoproteína D compreende, de um modo preferido, o primeiro 1/3 da lipoproteína D.

As proteínas da presente invenção são, de um modo preferido, expressas em E. coli. Numa forma de realização preferida, as proteínas são expressas com um marcador de afinidade tal como, por exemplo, uma cauda de histidina compreendendo entre 5 a 9 e, de um modo preferido, seis resíduos de histidina. Estes são vantajosos no auxílio da purificação. A presente invenção também proporciona um ácido nucleico que codifica para as proteínas de fusão da presente invenção. Estas sequências podem ser inseridas num vector de expressão adequado e utilizadas para vacinação de ADN/ARN ou expressas num hospedeiro adequado. Os vectores microbianos que expressam o ácido nucleico podem ser utilizados como vacinas. Estes vectores incluem, por exemplo, poxvírus, adenovírus, alfavírus, listeria e monarfago.

Uma sequência de ADN que codifica para as proteínas de fusão da presente invenção pode ser sintetizada utilizando técnicas de síntese de ADN convencionais, tais como por ligação enzimática, como descrito por D.M. Roberts et ai. em Biochemistry 1985, 24, 5090-5098, por síntese química, por polimerização enzimática in vitro, ou por tecnologia de PCR, utilizando, por exemplo, uma polimerase estável ao calor, ou por combinação destas técnicas.

A polimerização enzimática de ADN pode ser realizada in vitro utilizando uma polimerase de ADN, tal como a polimerase I de ADN (fragmento Klenow), num tampão adequado contendo os trifosfatos de nucleósido dATP, dCTP, dGTP e dTTP como necessário, a uma temperatura de 10-37 °C, geralmente, num volume de 50 pL ou inferior. A ligação enzimática de fragmentos de ADN pode ser realizada utilizando uma ligase de ADN, tal como a ligase de ADN de T4, num tampão adequado, tal como Tris 0,05 M (pH 7,4), MgCl2 0,01 M, ditiotreitol 0,01 M, espermidina 1 mM, ATP lmM e albumina de soro bovino 0,1 mg/mL, a uma temperatura de 4 °C até à ambiente, em geral, num volume de 50 mL ou inferior. A síntese química do polímero ou fragmentos de ADN pode ser realizada por química convencional de fosfotriéster, fosfito ou fosforamidite, utilizando técnicas de fase sólida, tais como as descritas em "Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual' (ed. H.G. Gassen e A. Lang) , Verlag Chemie, Weinheirn (1982), ou noutras publicações científicas, por exemplo, M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat, e R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sproat, e W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. Matteucci e M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D. Matteucci e M.H. Caruthers, Journal of the

American Chemical Society, 1981, 103, 3185; S.P. Adams et al.,

Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661; N.D. Sinha. J. Biernat. J. McMannus, e H. Koester. Nucleic Acids Research. 1984, 12, 4539; e H.W.D. Matthes et al. EMBO Journal, 1984, 3, 801. O processo da invenção pode ser realizado por técnicas recombinantes convencionais, tais como as descritas em Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989.

Em particular, o processo pode compreender os passos de: 9 i) preparar um vector de expressão replicável ou de integração, capaz de expressar um polímero de ADN numa célula hospedeira, compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica para a proteína ou para um seu derivado imunogénico; ii) transformar uma célula hospedeira com o referido vector; iii) cultivar a referida célula hospedeira transformada sob condições que permitem a expressão do referido polímero de ADN, para produzir a referida proteína; e iv) recuperar a referida proteína. 0 termo "transformar" é aqui utilizado para significar a introdução de ADN estranho numa célula hospedeira. Isto pode ser conseguido, por exemplo, por transformação, transfecção ou infecção com um vector plasmídico ou virai adequado, utilizando, e. g., técnicas convencionais como descritas em Genetic Engineering; Eds. S.M. Kingsman e A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, Inglaterra, 1988. 0 termo "transformado" ou "transformante" será daqui para a frente aplicado à célula hospedeira resultante que contém e expressa o gene estranho de interesse.

Os vectores de expressão são novos e também são parte da invenção.

Os vectores de expressão replicáveis podem ser preparados de acordo com a invenção, clivando um vector compatível com a célula hospedeira, de modo a proporcionar um segmento de ADN linear com um replicão intacto e combinando o referido segmento linear com uma ou mais moléculas de ADN que, juntamente com o referido segmento linear, codificam para o produto desejado, tal 10 como o polímero de ADN que codifica para a proteína da invenção, ou um seu derivado, sob condições de ligação.

Assim, o polímero de ADN pode ser pré-formado ou formado durante a construção do vector, como desejado. A escolha do vector será determinada em parte pela célula hospedeira, que pode ser procariótica ou eucariótica, mas são de um modo preferido células de E. coli ou CHO. Os vectores adequados incluem plasmídeos, bacteriófagos, cosmídeos e vírus recombinantes. A preparação do vector de expressão replicável pode ser realizada de forma convencional com enzimas adequadas para restrição, polimerização e ligação do ADN, por processos descritos, por exemplo, em Maniatis et ai., citado acima. A célula hospedeira recombinante é preparada de acordo com a invenção, transformando uma célula hospedeira com um vector de expressão replicável, da invenção, sob condições de transformação. As condições de transformação adequadas são convencionais e estão descritas em, por exemplo, Maniatis et ai., citado acima, ou "DNA cloning", vol II, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd. 1985. A escolha das condições de transformação é determinada pela célula hospedeira. Assim, um hospedeiro bacteriano, tal como E. coli, pode ser tratado com uma solução de CaCl2 (Cohen et ai., Proc. Nat. Acad. Sei., 1973, 69, 2110) ou com uma solução compreendendo uma mistura de RbCl, MnCl2, acetato de potássio e glicerol e em seguida com ácido 3-[N-morfolino]- propanossulfónico, RbCl e glicerol. As células de mamífero em 11 cultura podem ser transformadas por co-precipitação com cálcio do ADN de vector nas células. A invenção também se estende a uma célula hospedeira transformada com um vector de expressão replicável, da invenção. A cultura da célula hospedeira transformada sob condições que permitem a expressão do polímero de ADN é realizada de forma convencional, como descrito em, por exemplo, Maniatis et al. e "DNA cloning" citado acima. Assim, de um modo preferido, fornecem-se nutrientes à célula e faz-se a cultura a uma temperatura inferior a 50 °C. O produto é recuperado por métodos convencionais de acordo com a célula hospedeira e de acordo com a localização do produto de expressão (intracelular ou segregado para o meio de cultura ou para o periplasma celular). Assim, quando a célula hospedeira é bacteriana, tal como E. coli, ela pode, por exemplo, ser lisada física, química ou enzimaticamente e o produto de proteína pode ser isolado do lisado resultante. Quando a célula hospedeira é de mamífero, o produto pode ser geralmente isolado do meio nutriente ou de extractos isentos de células. As técnicas convencionais de isolamento de células incluem precipitação selectiva, cromatografia de adsorção e cromatograifa de afinidade, incluindo uma coluna de afinidade de anticorpos monoclonais.

As proteínas da presente invenção são proporcionadas quer solúveis numa forma líquida ou na forma liofilizada. É, geralmente, esperado que cada dose humana compreenda de 1 a 1000 pg de proteína e, de um modo preferido, 30-300 pg. 12 A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo uma proteína da presente invenção num excipiente farmaceuticamente aceitável. Uma composição de vacina preferida compreende, pelo menos, Lipoproteína D - MAGE-3. Esta vacina pode conter opcionalmente um ou mais outros antigénios associados a tumor. Por exemplo, outros membros que pertencem às famílias MAGE e CAGE. Outros antigénios associados a tumor adequados incluem proteínas MAGE-1, GAGE-1 ou Tirosinase. A preparação de vacinas está descrita em geral em Vaccine Design ("The subunit and adjuvant approach" (eds. Powell M.F. & Newman M.J.)(1995) Plenum Press Nova Iorque). A encapsulação em lipossomas é descrita por Fullerton, Patente US 4235877.

As proteínas da presente invenção são, de um modo preferido, adicionadas de um adjuvante na formulação de vacina da invenção. Adjuvantes adequados incluem um sal de alumínio, tal como gel de hidróxido de alumínio (alum), ou fosfato de alumínio, mas podem também ser um sal de cálcio, ferro ou zinco ou podem ser uma suspensão insolúvel de tirosina acilada, ou açúcares acilados, polissacáridos derivatizados catiónica ou anionicamente, ou polifosfazenos. Outros adjuvantes conhecidos incluem oligonucleótidos contendo CpG. Os oligonucleótidos caracterizam-se por o dinucleótido CpG ser não metilado.

Estes oligonucleótidos são bem conhecidos e estão descritos, por exemplo, no documento WO96/02555.

Na formulação da invenção é preferido que a composição adjuvante induza uma resposta imunitária, de um modo preferido, do tipo TH1. Os sistemas adjuvantes adequados incluem, por exemplo, uma combinação de Monof osf oril-lípido A, de um modo 13 preferido Monofosforil-lípido A 3-des-0-acilado (3D-MPL) juntamente com um sal de alumínio. Os oligonucleótidos CpG também induzem, de um modo preferido, uma resposta TH1.

Um sistema melhorado envolve a combinação de um Monofosforil-lípido A e um derivado de saponina, em particular, a combinação de QS21 e 3D-MPL, como apresentado no documento WO 94/00153, ou uma composição menos reactiva, em que o QS21 é neutralizado com colesterol, como descrito no documento WO 96/33739.

Uma formulação de adjuvante, particularmente potente, envolvendo QS21, 3D-MPL & tocoferol numa emulsão de óleo em água é descrita no documento WO 95/17210 e é uma formulação preferida.

De acordo com uma forma de realização da presente invenção, proporciona-se uma vacina compreendendo uma proteína da presente invenção, de um modo mais preferido uma Lipoproteína D (ou seu derivado) - MAGE-3, adicionada do adjuvante Monofosforil-lípido A ou um seu derivado.

De um modo preferido, a vacina compreende adicionalmente uma saponina, de um modo mais preferido, QS21.

De um modo preferido, a formulação adicional compreende uma emulsão de óleo em água e tocoferol. A presente invenção também proporciona um método para produzir uma formulação de vacina, compreendendo misturar uma proteína da presente invenção com um excipiente farmaceuticamente aceitável, tal como 3D-MPL. 14

Numa forma de realização da invenção, proporciona-se um processo para purificar uma proteína MAGE produzida de forma recombinante. 0 processo compreende solubilizar a proteína, por exemplo, num agente caotrópico forte (tais como, por exemplo, ureia, cloridrato de guanidínio) ou num detergente zwiteriónico, e. g., (Empigen BB - n-dodecil-N,N-dimetilglicina), reduzindo as ligações dissulfureto intra e intermoleculares da proteína, bloqueando os grupos tiol resultantes para impedir o reacoplamento oxidativo e submetendo a proteína a um ou mais passos cromatográficos.

De um modo preferido, o agente bloqueador é um agente alquilante. Estes agentes bloqueadores incluem, mas não se limitam a alfa-haloácidos ou alfa-haloamidas. Por exemplo, o ácido iodoacético e a iodoacetamida que resultam na carboximetilação ou carboxiamidação (carbamidometilação) da proteína. Podem-se utilizar outros agentes bloqueadores e estão descritos na literatura (ver, por exemplo, The Proteins Vol II Eds H neurath, RL Hill e C-L Boeder, Academic Press 1976 ou Chemical Reagents for Protein Modification Vol I eds. RL Lundblad e CM Noyes, CRC Press 1985). Exemplos típicos destes outros agentes bloqueadores incluem N-etilmaleimida, fosfato de cloroacetilo, O-metilisoueia e acrilonitrilo. A utilização do agente bloqueador é vantajosa, dado que impede a agregação do produto e assegura a estabilidade para purificação a jusante.

Numa forma de realização da invenção, seleccionam-se os agentes bloqueadores para induzir um derivado covalente, estável e irreversível (e. g. alfa-haloácidos ou alfa-haloamidas). No entanto, podem-se seleccionar outros agentes bloqueadores de modo a que após a purificação o agente bloqueador possa ser removido para libertar a proteína não derivada. 15

As proteínas MAGE com resíduos tiol livres derivatizados são novas e constituem um aspecto da invenção. Em particular, os derivados carboxiamidados ou carboximetilados são uma forma de realização preferida da invenção.

Numa forma de realização preferida da invenção, as proteínas da presente invenção são proporcionadas com um marcador de afinidade, tais como CLYTA ou uma cauda de poli-histidina. Nestes casos, a proteína após o passo bloqueador é, de um modo preferido, submetida a cromatografia de afinidade. Para estas proteínas com uma cauda de poli-histidina, pode-se realizar cromatografia de afinidade com um ião metálico imobilizado (IMAC) . 0 ião metálico pode ser qualquer ião adequado, por exemplo, zinco, níquel, ferro, magnésio ou cobre, mas é, de um modo preferido, zinco ou níquel. De um modo preferido, o tampão IMAC contém um detergente zwiteriónico, tal como Empigen BB (daqui para frente Empigen), dado que isso resulta em níveis menores de endotoxina no produto final.

Se a proteína é produzida com uma parte Clyta, a proteína pode ser purificada explorando a sua afinidade para colina ou análogos de colina, tal como DEAE. Numa forma de realização da invenção, as proteínas são proporcionadas com uma cauda de poli-histidina e uma parte Clyta. Estas podem ser purificadas num esquema simples de purificação cromatográfica de afinidade, de dois passos. A invenção será a seguir descrita em relação aos exemplos seguintes: 16 EXEMPLO 1:

Preparação da estirpe de E. coli recombinante que expressa a proteína de fusão Lipoproteína D-MAGE-3-His (LPD l/3-MAGE-3-His ou LpD MAGE-3-His) 1. Sistema de expressão de E. coli

Para a produção da Lipoproteína D, o ADN que codifica para a proteína D foi clonado no vector de expressão pMG 81. Este plasmídeo utiliza sinais do fago lambda de ADN para dirigir a transcrição e tradução de genes estranhos inseridos. 0 vector contém o promotor PL, o operador OL e dois sítios de utilização (NutL e NutR) de lambda PL, para aliviar efeitos de polaridade transcricional quando a proteína N é proporcionada (Gross et ai., 1985. Mol. & Cell. Biol. 5:1015). Os vectores contendo o promotor PL são introduzidos num hospedeiro lisogénico de E. coli para estabilizar o ADN plasmídico. As estirpes de hospedeiro lisogénico contêm o ADN de fago lambda deficiente para a replicação, integrado no genoma (Shatzman et al., 1983;

In Experimental Manipulation of Gene Expression. Inouya (ed) pp 1-14. Academic Press NI). 0 ADN de fago lambda dirige a síntese da proteína repressora cl que se liga ao repressor OL do vector e impede a ligação da ARN polimerase ao promotor PL e, desse modo, a transcrição do gene inserido. O gene cl da estirpe de expressão AR58 contém uma mutação sensível à temperatura, de modo que a transcrição dirigida por PL pode ser regulada por mudança de temperatura, i. e. um aumento na temperatura de cultura inactiva o repressor e a síntese da proteína estranha é iniciada. Este sistema de expressão permite a síntese controlada de proteínas estranhas, em especial as que podem ser tóxicas para a célula (Shimataka & Rosenberg, 1981. Nature 292:128). 17 2. Estirpe de E. Coli AR58: A estirpe de E. coli lisogénica, AR58, utilizada para a produção da proteína LPD-MAGE-3-His é um derivado da estirpe padrão de E. coli K12 NIH, N99 (F-su-galK2, lacZ- thr-) . Esta contém um fago lambda lisogénico deficiente (galE::TN10, 1 Kil-cl857 DH1). 0 fenótipo Kil- prvine que se desligue a síntse macromolecular do hospedeiro. A mutação cI857 confere uma lesão sensível à temperatura ao repressor cl. A eliminação de DH1 remove o operão direito do fago lambda e os loci bio, uvr3 e chlA do hospedeiro. A estirpe AR58 foi produzida por transdução de N99 com uma solução mãe de fago P lambda, previamente crescido num derivado SA500 (galE::TN10, 1 Kil- cI857 DH1). A introdução do lisogénio deficiente em N99 foi seleccionada com tetraciclina, devido à presença de um transposão TN10 que codifica para resistência a tetraciclina no gene galE adjacente. 0 N99 e SA500 são estirpes de E. coli K12 derivadas do laboratório do Dr. Martin Rosenberg no National Institutes of Health. 3. Construção do vector concebido para expressar a proteína recombinante LPD-MAGE-3-His: 0 objectivo era expressar MAGE-3 como uma proteína de fusão, utilizando a terça parte de terminal-N da proteína D lipidada como um parceiro de fusão ligado no terminal-N de MAGE-3 e uma sequência de vários resíduos de histidina (cauda His), colocados no seu terminal-C. 18 A proteína D é uma lipoproteína (uma proteína de ligação à imunoglobulina D, de 42 kDa, exposta na superfície da bactéria Gram-negativa Haemophilus influenzae). A proteína é sintetizada como um precursor com uma sequência de sinal de 18 resíduos de aminoácidos, contendo uma sequência de consenso para a lipoproteína bacteriana (documento WO 91/18926).

Quando a sequência de sinal de uma lipoproteína é processada durante a secreção, a Cys (na posição 19 na molécula precursora) torna-se no resíduo de terminal amino e é concomitantemente modificada pela ligação covalente de ácidos gordos ligados a éster e ligados a amida.

Os ácidos gordos ligados ao resíduo de cisterna do terminal-amino funcionam então como âncora da membrana. 0 plasmídeo que expressa a proteína de fusão foi concebido para expressar uma proteína precursora contendo a sequência de sinal de 18 aminoácidos e os primeiros 109 resíduos da proteína D processada, dois aminoácidos não relacionados (Met e Asp), os resíduos de aminoácido 2 a 314 de MAGE-3, dois resíduos Gly que funcionam como uma região dobradiça, para expor os sete resíduos His subsequentes. A estirpe recombinante produz assim a proteína de fusão de cauda His lipidada, processada, com 432 resíduos de aminoácidos de comprimento (ver Figura 1) com a sequência de aminoácidos descrita na ID No 1 e a sequência codificante descrita na ID N° 2. 19 4. Estratégia de clonagem para a produção da proteína de fusão LPD-MAG-3-His (vector pRITl4477):

Utilizou-se um plasmídeo de ADNc (do Dr Thierry Boon do Ludwig Institute) contendo a sequência codificante do gene MAGE-3 (Gaugler B et ai., 1994) e o vector PRIT 14586, contendo a porção de terminal-N da sequência codificante Lipo-D-1/3 (preparado como descrito na Figura 2) . A estratégia de clonagem incluía os seguintes passos (Figura 3). a) - amplificação por PCR das sequências apresentadas no ADNc plasmídico MAGE 3, utilizando o oligonucleótido de sentido: 5' gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct e o oligonucleótido de anti-sentido: 5' gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa); esta amplificação leva às seguintes modificações no terminal N: alteração dos primeiros cinco codões para utilização de codões de E. coli, substituição do codão de Pro por um codão de Asp na posição 1, instalação de um sítio de Ncol na extremidade 5' e, por último, adição de dois codões de Gly e dos 7 codões de His, seguido de um sítio Xbal no terminal-C. b) - Clonagem no vector de clonagem TA da invitrogen do fragmento amplificado acima e preparação do vector intermediário pRITl46 4 7. c) - Excisão do fragmento Ncol Xbal do plasmídeo pRIT14647 e clonagem no vector pRIT 14586. d) - Transformação da estirpe hospedeira AR58. 20 e) - Selecção e caracterização de transformantes da estirpe de E. coli contendo o plasmideo pRIT 14477, expressando a proteína de fusão LPD-MAGE-3-His. EXEMPLO II:

Preparação do antigénio LPDl/3-MAGE-3-His: 1. Crescimento e indução da expressão de LPDl/3-MAGE-3-His na estirpe bacteriana:

As células de AR58 transformadas com o plasmideo pRIT14477 foram crescidas em frascos de 2 litros contendo, cada, 400 mL de meio LY12 suplementado com extracto de levedura (6,4 g/L) e sulfato de canamicina (50 mg/L). Após incubação num tabuleiro agitador, a 30 °C, durante 8 +/- 1 h, removeu-se uma pequena amostra de cada frasco para análise microscópica. Os conteúdos dos dois frascos foram reunidos, para se obter o inoculo para o fermentador de 20 litros. O inoculo (cerca de 800 mL) foi adicionado a um fermentador de 20 litros (volume total) pré-esterilizado, contendo 7 litros de meio, suplementado com sulfato de canamicina 50 mg/L. O pH foi ajustado e mantido a 6,8, por adição periódica de NH4OH (25% v/v) e a temperatura foi ajustada e mantida a 30 °C. A velocidade de arejamento foi ajustada e mantida a 12 litros de ar/min, a tensão de oxigénio dissolvido foi mantida a 50% de saturação por controlo de retorno da velocidade de agitação. A sobre-pressão no fermentador foi mantida a 500 g/cm2 (0,5 bar) . 21 A cultivação por alimentação-lote foi realizada por adição controlada de uma solução alimentadora de carbono. A solução alimentadora foi adicionada a uma velocidade inicial de 0,04 mL/min e aumentada exponencialmente durante as primeiras 42 horas, para manter uma velocidade de crescimento de 0,1 h_1.

Após 42 h, a temperatura no fermentador foi rapidamente aumentada para 39 °C e a velocidade de alimentação foi mantida constante a 0,005 mL/g DCW/min durante a fase de indução, por mais 22-23 horas, altura em que a expressão intracelular de LPD-MAGE-3-His atingiu um nivel máximo.

Recolheram-se alíquotas (15 mL) de caldo a intervalos regulares ao longo das fases de crescimento/indução e no fim da fermentação, para seguir as cinéticas de crescimento bacteriano e expressão do produto intracelular e, além disso, para se obterem amostras para testes de identificação microbiana/pureza.

No final da fermentação a densidade óptica da cultura era entre 80 e 120 (correspondendo a uma concentração celular entre 48 e 72 g DCW/L) e o volume liquido total era de, aproximadamente, 12 litros. A cultura foi rapidamente arrefecida até entre 6 e 10 °C e as células de ECK32 foram separadas do caldo da cultura por centrifugação a 5000 x g, a 4 °C, durante 30 minutos. As células concentradas de CK32 foram rapidamente armazenadas em sacos de plástico e imediatamente congeladas a -80 °C. 22 2. Extracção da proteína

As células concentradas congeladas de ECK32 foram descongeladas a 4 °C antes de serem ressuspensas no tampão de rompimento de células, a uma densidade óptica final de 60 (correspondendo a uma concentração de células de, aproximadamente, 36 g DCW/L).

As células foram rompidas por duas passagens através de um homogeneizador de pressão elevada (1000 bar) . A suspensão de células rompidas foi centrifugada (10000 x g a 4 °C, durante 30 minutos) e a fracção do sedimento foi lavada duas vezes com Triton X 100 (1% p/v) + EDTA (1 mM) , seguido de uma lavagem com solução salina tamponada com fosfato (PBS) + Tween 20 (0,1% v/v) e, por último, uma lavagem com PBS. Entre cada fase de lavagem, a suspensão foi centrifugada a 10000 x g durante 30 minutos, a 4 °C, o sobrenadante foi desprezado e a fracção do sedimento foi retida.

EXEMPLO III

Caracterização da proteína de fusão Lipo D-MAGE 3: 1. Purificação A LPD-MAGE-3-His foi purificada a partir do homogenato celular utilizando uma sequência de passos descritos a seguir: a) - solubilização da fracção de sedimento lavado a partir do rompimento celular, 23 b) - Redução química de ligações persulfureto intra- e inter-proteína, seguida de bloqueio de grupos tiol para impedir o reacoplamento oxidativo, c) - Microfiltração da mistura reaccional para remoção de partículas e redução de endotoxinas, d) - Captura e purificação primária de LPD-MAGE-3-His por exploração da interacção de afinidade entre a cauda de poli-histidina e a Sepharose quelante carregada com zinco, e) - Remoção de proteínas contaminantes por cromatografia de troca aniónica. A LPD-MAGE-3-His purificada foi submetida a várias fases de aperfeiçoamento: f) - troca de tampão/remoção de ureia por cromatografia de exclusão de tamanhos, utilizando Superdex 75, g) - Filtração no processo, h) - Troca de tampão/dessalinização por cromatografia de exclusão de tamanhos, utilizando Sephadex G25.

Cada destes passos é descrito em maior pormenor a seguir: 1.1) - Solubilização do sedimento do homogenato celular A fracção de sedimento da fase de lavagem final (como descrito acima) foi ressolubilizada durante a noite em 800 mL de uma solução de cloridrato de guanidina (6 M) e fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0), a 4 °C. 24 1.2) - Redução e carboximetilação

Fez-se fluir árgon no material solubilizado (uma suspensão amarelo pálido, turva) para purgar qualquer oxigénio remanescente e adicionou-se uma solução de armazenamento de 2-mercaptoetanol (14 M), para se obter uma concentração final de 4,3 M (que corresponde a 0,44 mL de 2-mercaptoetanol por mL de solução). A solução resultante foi dividida e transferida para dois frascos de vidro que foram ambos aquecidos a 95 °C, num banho de água. Após 15 minutos a 95 °C, os frascos foram removidos do banho de água e deixados arrefecer, sendo, em seguida, os conteúdos reunidos num copo (5 L) coberto com folha de alumínio, colocados em gelo, e adicionou-se iodoacetamida sólida com mistura vigorosa, para se obter uma concentração final de 6 M (que corresponde a 1,11 g de iodoacetamida por mL de solução). A mistura foi mantida em gelo no escuro durante 1 hora, para assegurar a solubilização completa da iodoacetamida, antes de ser neutralizada (mantendo uma mistura vigorosa e monitorização contínua do pH) por adição de, aproximadamente, 1 litro de hidróxido de sódio (5 M) para se obter um pH final de 7,5-7,8. A mistura resultante foi mantida em gelo no escuro, por mais 30 minutos, após o que o pH foi re-ajustado para pH 7,5-7,8. 1.3) - Microfiltração

A mistura foi microfiltrada numa unidade de fluxo tangencial Amicon Proflux M12, equipada com um cartucho de fibra oca Minikos (ref. No. M22M-600-01N; área 5 600 cm2, 0,2 pm) . O 25 material permeado foi retido para purificação cromatográfica subsequente. 1.4) - Cromatografia de quelato metálico (Zn2+) (IMAC) A cromatografia de quelato metálico foi realizada com Sepharose FF quelante (Pharmacia Biotechnology Cat. N° 17-0575-01) empacotada numa coluna BPG 100/500 (Pharmacia Biotechnology Cat. 18-1103-01). As dimensões do leito empacotado eram: diâmetro 10 cm; área de corte transversal 79 cm ; altura do leito 19 cm; volume empacotado 1500 mL. A coluna vazia foi limpa com hidróxido de sódio (0,5 M) e em seguida lavada com água purificada. 0 suporte (fornecido em etanol a 20% v/v) foi lavado com água purificada (8 litros) num funil de Buchner (sob vácuo) e carregado com zinco, passando pelo menos 15 litros de uma solução de ZnCl2 (0,1 M) . O excesso de zinco foi removido por lavagem do suporte com 10 litros de água purificada, até o pH do liquido de saída atingir o pH da solução de ZnCl2 (pH 5,0). O suporte foi então equilibrado com 4 litros de uma solução contendo cloridrato de guanidina (6 M) e fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0) . O material permeado da microfiltração, contendo LPD-MAGE-3-His, foi misturado com o suporte (ligação do lote) antes da carga e empacotamento da coluna BPG com a solução contendo cloridrato de guanidina (6 M) e fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0). 26

As fases seguintes da cromatografia de guelato metálico foram realizadas a uma velocidade de fluxo eluente de 60 mL/min. A coluna foi lavada, primeiro com a solução contendo cloridrato de guanidina (6 M) e fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0), em seguida com a solução contendo ureia (6 M) e fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0), até o eluente da coluna atingir uma absorvência de zero a uma DO280 nm (linha de base) . A fracção de proteina LPD-MAGE-3-His semi-pura foi eluida com 2 volumes de coluna de uma solução contendo ureia (6 M) , fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0) e imidazole (0,5 M) . A condutância desta fracção era, aproximadamente, 16 mS/cm. 1.5) - Cromatografia de troca aniónica

Antes de prosseguir com a cromatografia de troca aniónica, a condutância da fracção de proteína LPD-MAGE-3-His semi-pura foi reduzida para, aproximadamente, 4 mS/cm, por diluição com uma solução contendo ureia (6 M) e Tris-HCl (20 mM, pH 8,0).

Fez-se cromatografia de troca aniónica utilizando Q-Sepharose FF (Pharmacia Biotechnology, Cat. N° 17-0510-01) empacotada numa coluna BPG 200/500 (Pharmacia Biotechnology Cat. N° 18-1103-11). As dimensões do leito empacotado eram: diâmetro 10 cm; área de corte transversal 314 cm2; altura do leito 9 cm; volume empacotado 2900 mL. A coluna foi empacotada (com etanol a 20% v/v) e lavada com 9 litros de água purificada, a uma velocidade de fluxo eluente de 70 mL/min. A coluna empacotada foi lavada com 3 litros de hidróxido de sódio (0,5 M), lavada com 30 litros de água 27

purificada, em seguida equilibrada com 6 litros de uma solução contendo ureia (6 M) e Tris-HCl (20 mM, pH 8,0) . A LPD-MAGE-3-His semi-purificada foi carregada na coluna e, em seguida, lavada com 9 litros de uma solução contendo ureia (6 M), Tris-HCl (20 mM, pH 8,0), EDTA (1 mM) e Tween (0,1%), até a absorvência (280 nm) do eluente cair para zero.

Fez-se outro passo de lavagem com 6 litros de uma solução contendo ureia (6 M) e Tris-HCl (20 mM, pH 8,0). A LPD-MAGE-3-His purificada foi eluída da coluna com uma solução contendo ureia (6 M) , Tris-HCl (20 mM, pH 8,0) e NaCl (0,25 M). 1.6) - Cromatografia de exclusão de tamanhos A remoção de ureia da LPD-MAGE-3-His purificada e a troca de tampão foram ambas realizadas por cromatografia de exclusão de tamanhos. Isto foi realizado utilizando Superdex 75 (Pharmacia Biotechnology Cat. N° 17-1044-01) empacotado numa coluna XK 50/1000 (Pharmacia Biotechnology Cat. N° 18-8753-01). As dimensões do leito empacotado eram: diâmetro 5 cm; área de corte transversal 19,6 cm2; altura do leito 90 cm; volume empacotado 1800 mL. A coluna foi empacotada em etanol (20%) e lavada com 5 litros de água purificada, a uma velocidade de fluxo de eluente de 20 mL/min. A coluna foi lavada com 2 litros de hidróxido de sódio (0,5 M), lavada com 5 litros de água purificada, em seguida equilibrada com 5 litros de solução salina tamponada com fosfato contendo Tween 80 (0,1% v/v). 28 A fracção de LPD-MAGE-3-His purificada (máximo 500 mL/corrida de dessalinização) foi carregada na coluna, a uma velocidade de fluxo eluente de 20 mL/min. A LPD-MAGE-3-His purificada, dessalinizada, foi eluida da coluna com 3 litros de PBS contendo Tween 80 (0,1% v/v). A fracção contendo LPD-MAGE-3-His é eluida no volume morto da coluna. 1.7) - Filtração no processo O volume de LPD-MAGE-3-His da cromatografia de exclusão de tamanhos foi filtrado através de uma membrana de 0,22 μιη numa câmara de fluxo laminar (classe 10000). O volume filtrado foi congelado a -80 °C e armazenado até ao passo de dessalinização. 1.8) - Cromatografia de dessalinização

Uma vez que a osmolaridade do volume final deveria ser inferior a 400 mOsM, era necessário um passo adicional de troca de tampão, para reduzir a concentração de sal. Isto foi realizado por um passo de cromatografia de dessalinização, utilizando Sephadex G25 (Pharmacia Biotechnology

Cat. N° 17-0033-02) empacotado numa coluna BPG 100/950 (Phamacia Biotechnology Cat. N° 18-1103-03). As dimensões do leito empacotado eram: diâmetro 10 cm; área de corte transversal 78,6 cm2; altura do leito 85 cm; volume empacotado 6500 mL. 29 0 Sephadex G25 foi hidratado com 7 litros de água purificada e deixado inchar durante a noite, a 4 °C. 0 gel foi, então, empacotado na coluna com água pura, a uma velocidade de fluxo eluente de 100 mL/min. A coluna foi lavada com 6 litros de hidróxido de sódio (0,5 M) , em seguida, equilibrada com 10 litros de uma solução contendo fosfato de sódio (10 mM, pH 6,8), NaCl (20 mM)e Tween 80 (0,1% v/v). A fracção de LPD-MAGE-3-His purificada (máximo 1500 mL/corrida de dessalinização) foi carregada na coluna a uma velocidade de fluxo eluente de 100 mL/min. A fracção de LPD-MAGE-3-His purificada, dessalinizada, eluída no volume morto da coluna foi filtrada em condições estéreis através de uma membrana de 0,22 pm e armazenada a -80 °C. 0 volume de proteina final é descongelado a +4 °C antes de ser dividido em alíquotas para frascos e liofilizado num excipiente de lactose (3,2%). 2. Análise em gel de SDS-poliacrilamida corado com Coomassie 0 antigénio de LPD-MAGE-3-His purificado foi analisado por SDS-PAGE num gel de acrilamia a 12,5%, em condições redutoras. A carga de proteina era de 50 pg para coloração com azul de Coomassie e 5 pg para coloração com nitrato de prata. O lote 96K19 clínico e o lote 96J22 piloto foram analisados. Visualizou-se uma banda principal correspondendo a um peso 30 molecular de 60 kDa. Também se observaram duas bandas menores adicionais de, aproximadamente, 45 kDa e 35 kDa. 3. Análise de Transferência de Western

Os péptidos revelados por análise de SDS-PAGE da proteína LPD-MAGE-3-His foram identificados por Transferência de Western utilizando anticorpos monoclonais de ratinhos. Estes anticorpos foram desenvolvidos no local, utilizando uma preparação purificada da proteína MAGE-3-His (esta proteína não contém a parte LPD de LPD-MAGE-3-His).

Seleccionaram-se duas preparações de anticorpo monoclonal (Mab 22 e Mab 54) com base na sua adaptabilidade para análise de Transferência de Western e foram utilizadas no teste de identidade para libertação de lote. A Figura 4 mostra os padrões de bandas, obtidos para os lotes 96K19 e 96J22, após coloração com os Mabs 32 e 54. Resolveram-se seiscentas ng de proteína numa SDS-PAGE a 12,5%, transferiu-se para uma membrana de nylon, fez-se reagir com os Mabs 32 e 54 (60 pg/mL) e revelou-se com anticorpos anti-ratinho ligados a peroxidase.

Os péptidos de 60 kDa e 30 kDa detectados por SDS-PAGE são revelados por ambos os Mabs. 31 EXEMPLO IV: 1. Preparação de vacina utilizando a proteína LPD-MAGE-3-HÍS: A vacina utilizada nestas experiências é produzida a partir de um ADN recombinante que codifica para uma Lipoproteina D l/3-MAGE-3-His, expressa em E. coli da estirpe AR58, com adição de adjuvante ou não. Como adjuvante, a formulação compreende uma mistura de monofosforil-lipido A 3 des-O-acilado (3D-MPL) e QS21 numa emulsão de óleo/água. 0 sistema adjuvante SBAS2 foi anteriormente descrito no documento WO 95/17210. 3D-MPL: é um imunoestimulador derivado do lipopolissacárido (LPS) da bactéria Gram-negativa Salmonella minnesota. 0 MPL foi desacilado e não possui um grupo fosfato na unidade de lípido A. Este tratamento químico reduz drasticamente a toxicidade, ao mesmo tempo que preserva as propriedades imuno-estimuladoras (Ribi, 1986) . A Ribi Immunochemistry produz e fornece MPL à SB-Biologicals. Experiências realizadas na Smith Kline Beecham Biologicals mostraram que o 3D-MPL combinado com vários veículos aumenta fortemente a imunidade humoral e a imunidade celular do tipo TH1.

QS21: é uma molécula de saponina natural extraída da casca da árvore sul-americana Quillaja saponaia Molina. Uma técnica de purificação desenvolvida para separar as saponinas individuais dos extractos brutos de casca, permitiu o isolamento de uma saponina particular, QS21 que é um glicósido triterpeno demonstrando uma actividade adjuvante mais forte e uma menor toxicidade em comparação com o componente progenitor. Verificou-se que a QS21 activa CTL restritos a MHC de classe I 32 contra vários Ags de subunidade, e também estimula a proliferação linfocitica especifica de Ag (Kensil, 1992). A Aquila (formalmente Cambridge Biotech Corporation) produz e fornece QS21 para a SB-Biologicals.

Experiências realizadas na SmithKline Beecham Biologicals demonstraram um efeito sinergístico claro de combinações de MPL e QS21 na indução de ambas as respostas imunitárias, humoral e celular tipo TH1. A emulsão óleo/água é composta por uma fase orgânica constituída por 2 óleos (um tocoferol e esqualeno) e uma fase aquosa de PBS contendo Tween 80 como emulsionante. A emulsão compreendia esqualeno a 5%, tocoferol a 5%, Tween 80 a 0,4% e tinha um tamanho de partícula médio de 180 nm e é conhecida como SB62 (ver documento WO 95/17210).

Experiências realizadas na SmithKline Beecham Biologicals demonstraram que a adição desta emulsão O/A a 3D-MPL/QS21 (SBAS2) aumenta ainda mais as propriedades imunoestimuladoras desta, contra vários antigénios de subunidade. 2. Preparação da emulsão SB62 (2 vezes concentrada)

Dissolve-se Tween 80 numa solução salina tamponada com fosfato (PBS) para se obter uma solução a 2% no PBS. Para se obterem 100 mL de emulsão concentrada duas vezes, agitam-se num vortex 5 g de DL alf a-tocof erol e 5 mL de esqualeno, para misturar bem. É adicionado 90 mL de solução de PBS/Tween e misturado exaustivamente. A emulsão resultante é, então, passada através de uma seringa e por fim microfluidizada utilizando uma 33 máquina M110S microfluidics. As gotas de óleo resultantes têm um tamanho de, aproximadamente, 180 nm. 3. Preparação da formulação de óleo em água da Lipoprot. Dl/3—MAGE—3—His QS21/3D MPL (SBAS2) 0 adjuvante é formulado como uma combinação de MPL e QS21, numa emulsão de óleo/água. Esta preparação é fornecida em frascos de 0,7 mL a ser misturados com o antigénio liofilizado (frascos contendo de 30 a 300 pg de antigénio). A composição do diluente adjuvante para a vacina liofilizada é como se segue:

Ingredientes Quantidade (por dose) Adjuvantes Emulsão SB62 250 pL -Esqualeno 10,7 mg -DL a-tocoferol 11,9 mg -Tween 80 4,8 mg Monofosforil-lípido A 100 pg QS21 100 pg Conservante Tiomersal 25 ug Tampão Água para injecção q.b. para 0,5 mL - fosfato de sódio dibásico 5 75 pg - fosfato de potássio monobásico 100 pg - cloreto de potássio 10 0 pg - cloreto de sódio 4, 0 mg 34 A vacina final é obtida após reconstituição da preparaçao de LPD-MAGE-3-His liofilizada com o adjuvante ou com PBS isolado.

Os controlos de adjuvante sem antigénio foram preparados substituindo a proteína por PBS. 4. Antigénio de vacina: Proteína de fusão Lipoproteína Dl/3—MAGE—3—His: A lipoproteína D é uma lipoproteína exposta na superfície da bactéria Gram-negativa Haemophilus influenzae. A inclusão dos primeiros 109 resíduos da proteína D processada como parceiro de fusão é incorporada para se obter o antigénio de vacina com um epitopo de célula-T. Além da unidade LPD, a proteína contém dois aminoácidos não relacionados (Met e Asp), os resíduos de aminoácido 2 a 314 de Mage-3, dois resíduos de Gly que funcionam como região de dobra para expor os sete resíduos de His subsequentes. EXEMPLO V: 1. Imunogenicidade de LPD-MAG-3-His em ratinhos e macacos:

Para testar a antigenicidade e imunogenicidade da proteína MAGE-3 humana, a vacina candidata foi injectada em 2 estirpes de ratinho diferentes (C57BL/6 e Balb/C), variando no seu ruído de fundo genético e alelos de MHC. 35

Para ambas as estirpes, os motivos potenciais de péptidos de MHC de classe I e MHC de classe II foram teoricamente previstos para a parte MAGE da proteína de fusão LPD-MAGE-3-His. a) - Protocolo de imunização

Injectaram-se 5 ratinhos de cada estirpe, duas vezes a intervalos de 2 semanas, na almofada da pata, com 5 pg de LPD-MAGE-3-His, formulados ou não em SBAS2 a 1/10 da concentração utilizada em experiências com humanos. b) - Ensaio de proliferação

Prepararam-se linfócitos moendo o baço ou os nódulos linfáicos popliteais dos ratinhos, 2 semanas após a última injecção. Colocaram-se 2 x 105 células em triplicado em placas de 96 poços e as células foram novamente estimuladas in vitro durante 72 horas, com diferentes concentrações (1-0,1 pg/mL) de His-Mag 3, tal e qual ou revestindo micropérolas de látex.

Observou-se uma actividade linfoproliferativa específica de MAGE - 3 aumentada com ambas, células de baço (ver Figuras 5 e 7) e células de nódulos linfáticos (ver Figuras 6 e 8) de ratinhos C57BL/6 e Balb/C, com a proteína LPD-MAGE-3-His, em comparação com a resposta linfoproliferativa dos ratinhos que receberam a formulação de SBAS-2 isolada ou PBS.

Além disso, obteve-se uma resposta proliferativa significativamente maior com linfócitos de ratinhos imunizados com LPD-MAGE-3-His no adjuvante SBAS2 (ver Figuras 6 e 8). 36 c) - Conclusão: A LPD-MAGE-3-His é imunogénica em ratinhos e esta imunogenicidade pode ser aumentada utilizando a formulação adjuvante de SBAS2. 2. Resposta de anticorpos: a) - Protocolo de imunização

Imunizaram-se ratinhos Balb/C ou C57BL/6 com 2 injecções intra almofada da pata, a intervalos de 2 semanas, ou com PBS, ou SBAS2, ou 5 pg de LPD-MAGE-3-His, ou 5 pg de LPD-MAGE-3-His + SBAS2.

Utilizaram-se três e cinco animais nos grupos de controlo e nos grupos testados, respectivamente. b) - ELISA indirecto:

Duas semanas após a segunda injecção, recolheram-se soros individuais e submeteram-se a um ELISA indirecto.

Utilizaram-se 2 pg/mL de His MAGE 3 purificado, como antigénio revestido. Após saturação durante 1 hora, a 37 °C, em PBS + soro de vitela recém-nascida a 1%, os soros foram diluídos em série (começando a 1/1000) no tampão de saturação e incubados durante a noite a 4 °C, ou 90 minutos a 37 °C. Após lavagem em 37 PBS/Tween 20,01%, utilizou-se IgG total de cabra anti-ratinho, biotinilado (1/1000) ou anti-soros de cabra anti-IgGl, IgG2a, IgG2b de ratinho (1/5000) como segundos anticorpos. Após 90 minutos de incubação, a 37 °C, adicionou-se estreptavidina acoplada a peroxidase e utilizou-se TMB (peróxido de tetrametilbenzidina) como substrato. Após 10 minutos, a reacção foi bloqueada por adição de H2SO4 0,5 M e determinou-se a D.O. c) - Resultados: A Figura 9 compara entre os grupos diferentes de ratinhos (N=5/grupo) , o titulo de soro médio relativo, do ponto médio que consiste na diluição média necessária para atingir o ponto médio das curvas.

Estes resultados mostram que em ambas as estirpes de ratinho testadas se desenvolve uma resposta de Ab fraca após 2 injecções de LPD-MAGE-3-His isolado, mas que se produzem concentrações maiores de Ab anti-MAGE-3 quando se injecta LPD-MAGE-3-His na presença de SBAS2. Assim, apenas 2 injecções de LPD-MAGE-3-His + SBAS2 a intervalos de 2 semanas são suficientes para produzir a resposta de Ab elevada, observada. A melhor resposta de Ab observada no ratinho Balb/c em comparação com a resposta obtida no ratinho C57BL/6 pode ser explicada por diferenças nos haplotipos ou no fundo entre estas 2 estirpes, mesmo apesar de o titulo de Ab conseguido em ratinhos C57BL/6 ser também maior após injecções de LPD-MAGE-3-His + SBAS2 do que após injecções com LPD-MAGE-3-His isolado. 38

As respostas anti-MAGE-3 específicas de subclasses de Ig após vacinação nos diferentes grupos de ratinhos podem ser observadas nas Figuras 10 e 11 que dão uma comparação da diluição média de soro no ponto médio. Não se detectou nem IgA, nem IgM em qualquer amostra de soro, mesmo de ratinhos vacinados com LPD-MAGE-3-His no adjuvante SBAS2.

Pelo contrário, o nível de IgG total era ligeiramente mais elevado nos soros de ratinhos vacinados com LPD-MAGE-3-His isolado e significativamente aumentado nos soros de animais injectados com LPD-MAGE-3-His e SBAS2. A análise das diferentes concentrações de subclasses de IgG mostra que foi induzida uma resposta de Ab mista nos ratinhos, uma vez que os níveis de todas as subclasses de IgG testadas (IgGl, IgG2a, IgG2b) eram mais elevados em ratinhos vacinados com o Ag adicionado de adjuvante, do que em ratinhos injectados com o Ag ou o adjuvante isolado. A natureza desta resposta de Ab mista após vacinação com LipoD-MAGE 3 na presença de SBAS2 parece, no entanto, depender da estirpe de ratinho, uma vez que o IgGl e IgG2b foram encontrados, predominantemente, no soro de ratinhos Balb/c e C57BL/6, respectivamente. 39 3. Imunogenicidade da lipoproteina D 1/3 MAGE3-His + adjuvante SBAS2 em macacos Rhesus

Seleccionaram-se três grupos de cinco animais Rhesus (Macaca Mulatta) . Utilizou-se RTS,S e gpl20 como controlo positivo.

Grupos:

Grupo 1 perna direita: RTS,S/SBAS2 perna esquerda: GP120/SBAS2 Grupo 2 perna direita: RTS,S/SB26T perna esquerda: GP120/SB26T Grupo 3 perna direita: LipoDl/3 Mage 3 His/SBAS2

Os animais receberam a vacina no dia 0 e levaram um reforço nos dias 28 e 84 e foram sangrados para determinar a sua resposta de anticorpos contra ambos os componentes, de MAGE 3 e proteina D. As vacinas foram administradas intramuscularmente, como uma injecção de bólus (0,5 mL) na parte posterior da perna direita.

Recolheram-se pequenas amostras de sangue a cada 14 dias. Recolheram-se amostras de sangue não heparinizado de 3 mL a partir da veia femoral, deixou-se coagular durante, pelo menos, 1 hora e centrifugou-se, à temperatura ambiente, durante 10 minutos, a 2500 rpm.

Removeu-se o soro, congelou-se a -20 °C e enviou-se para determinação dos níveis de anticorpo, por ELISA específico.

As microplacas de 96 poços (maxisorb Nunc) foram ou revestidas com 5 pg de His Mage 3, ou Proteína D durante a 40 noite, a 4 °C. Após 1 hora de saturação, a 37 °C, com PBS NCS a 1%, adicionaram-se diluições em série do soro de coelho durante 1 h 30, a 37 °C, (começando em 1/10), após 3 lavagens em PBS Tween, adicionou-se soro anti-coelho biotinilado (Amersham ref RPN 1004 lote 88) (1/5000). As placas foram lavadas e adicionou-se estreptavidina acoplada a peroxidase (1/5000), durante 30-minutos, a 37 °C. Após lavagem, adicionaram-se 50 pL de TMB (BioRad) durante 7 minutos e a reacção foi parada com H2SO4 0,2 M e mediu-se a DO a 450 nm. Calcularam-se as diluições do ponto médio utilizando SoftmaxPro.

Resposta de anticorpos:

Recolheram-se amostras de sangue a cada 14 dias para seguir a cinética da resposta de anticorpos a Mage 3, por ELISA. Os resultados indicam que após uma injecção de LPD1/3 Mage 3 His + SBAS2, o titulo de Ig total específica para Mage 3 era baixo, observou-se um claro reforço em 3 de entre 5 animais após uma segunda e uma terceira injecções de LipoDl/3 Mage 3 + adjuvante, nos mesmos macacos. Os que respondem fracamente permaneceram negativos, mesmo após 3 injecções.

28 dias pós II ou pós III, os títulos de anticorpo retornaram aos níveis basais. A subclasse destes anticorpos foi determinada como sendo predominantemente IgG e não IgM. A troca para IgG sugere que foi desencadeada uma resposta de T auxiliares. A resposta de anticorpos específicos para proteína D, embora mais fraca, é exactamente equivalente à resposta de anticorpo Mage 3. 41 EXEMPLO VI: 1. LPD-MAGE 1 His

De um modo análogo preparou-se LPD-MAGE 1-His. As sequências de aminoácidos e ADN são apresentadas nas SEQUÊNCIA ID N° 3 e 4. A proteína resultante foi purificada de um modo análogo à proteína LPD-MAGE-3-His. Em resumo, a cultura de células foi homogeneizada e tratada com guanidina HC1 4 M e beta-mercaptoetanol 0,5 M, na presença de detergente Empigen a 0,5%. O produto foi filtrado e o permeado foi tratado com iodoacetamida 0,6 M. As fracções carboxiamidadas foram submetidas a cromatografia IMAC (quelato de zinco-sepharose FF) . A coluna foi, primeiro, equilibrada e lavada com uma solução contendo guanidina.HC1 4 M e fosfato de sódio (20 mM, pH 7,5) e Empigen a 0,5%, em seguida, a coluna foi lavada com uma solução contendo ureia 4 M em fosfato de sódio (20 mM, pH 7,5), tampão Empigen a 0,5%. A proteína foi eluída no mesmo tampão, mas com concentrações crescentes de imidazole (20 mM, 400 mM e 500 mM). O eluato foi diluído com ureia 4 Μ. A coluna de Q-sepharose foi equilibrada e lavada com ureia 4 M em tampão fosfato 20 mM (pH 7,5) na presença de Empigen a 0,5%. Fez-se uma segunda lavagem no mesmo tampão, mas sem detergente. A proteína foi eluída no mesmo tampão mas com concentrações crescentes de imidazole (150 M, 400 mM, 1 M). O eluato foi ultrafiltrado. 42 EXEMPLO VII:

Construção do plasmídeo de expressão pRITl4426 e transformação da estirpe hospedeira AR58 para produzir NS1-MAGE-3 His:

Concepção da proteína A concepção da proteína de fusão NS1, -MAGE-3-His a ser expressa em E. coli está descrita na Figura 12. A estrutura primária da proteína resultante tem a sequência apresentada na ID N° 5. A sequência codificante (ID N° 6) correspondente à concepção de proteína acima indicada foi colocada sob o controlo do promotor XpL num plasmídeo de expressão em E. coli.

Estratégia de clonagem para a produção da proteína de fusão NSi-MAGE-3-His: 0 material de partida era um plasmídeo de ADNc recebido do Dr.Tierry Boon do Ludwig Institute, contendo a sequência codificante para o gene MAGE-3 e o vector PMG81, contendo o aa 81 da região codificante de NSi (proteína não estrutural) de inlfuenza. A estratégia de clonagem descrita na Figura 13 incluiu os seguintes passos: 43 a) amplificação por PCR das sequências apresentadas no plasmídeo de ADNc de MAGe 3, utilizando o olignucleótido de sentido: gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag ccte o oligonucleótido de anti-sentido: 5' gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa.

Esta amplificação leva às seguintes modificações no terminal N: alteração dos primeiros cinco codões para a utilização de codões de E. coli, substituição do codão de Pro por um codão de Asp na instalação 1, inserção de um sítio de Ncol na extremidade 5' e, por fim, adição dos 2 codões de Gly e dos 7 codões de His, seguido de um sítio de Xbal no terminal-C. b) Clonagem no vector de clonagem TA da invitrogen, do fragmento acima amplificado e preparação do vector intermediário pRIT14647. c) Excisão do fragmento Ncol Xbal do plasmídeo pRITl4647 e clonagem no vector pRIT PMG81 d) Transformação da estirpe hospedeira AR58 e) Selecção e caracterização dos transformantes da estirpe de E. coli contendo o plasmídeo pRIT14426 (ver Figura 14) que expressa a proteína de fusão NSl-MAGE-3-His. 44

Caracterização de NSi-MAGE-3-His recombinante (pRITl4426):

As bactérias foram crescidas em meio LB suplementado com canamicina 50 pg/mL a 30 °C. Quando a cultura atingiu uma DO = 0,3 (a 620 nm) , fez-se uma indução pelo calor aumentando a temperatura para 42 °C.

Após 4 horas de indução, as células foram recolhidas, ressuspensas em PBS e lisadas (por desintegração) , prensando três vezes numa prensa francesa. Após centrifugação (60 minutos a 100000 g) o sedimento, sobrenadante e o extracto total foram analisados por SDS-PAGE. As proteínas foram visualizadas em géis corados com Coomasie Bl, em que a proteína de fusão representava cerca de 1% das proteínas totais de E. coli. A proteína recombinante surgiu como uma banda única com um PM aparente de 44,9 K. A proteína de fusão foi identificada por análise de Transferência de Western utilizando anti-NSl monoclonal. EXEMPLO VIII:

Purificação de NSl-MAGE-3-His (E. coli) para Imunização de Coelho/Ratinho

Esquema de purificação:

Utilizou-se o esquema de purificação seguinte para purificar o antigénio: 45

Lise de células + centrifugação

Solubilização de antigénio + centrifugação Ni2 +-NTA agarose

Concentração

Preparação celular

Precipitação com TCA e solubilizaçao com PBS a. Lise

As células bacterianas (23 g) foram lisadas em 203 mL de um tampão P04 50 mM, pH 7 por Rannie (homogeneizador) e o lisado foi centrifugado num rotor JA 20 a 15 000 rpm durante 30 minutos. 0 sobrenadante foi descartado. b. Solubilização do antigénio 1/3 do sedimento foi ressolubilizado O/N a 4 °C em 34 mL de P04 100 mM - GuHCl 6 M, pH 7. Após centrifugação num rotor JA 20 a 15000 rpm durante 30 minutos, o sedimento foi descartado e o sobrenadante foi posteriormente purificado por IMAC. c. cromatografia de afinidade: Ni2+-NTA agarose (Qiagen) volume de coluna: 15 mL (16 mm x 7,5 cm) tampão de empacotamento: P04 0,1 M - GuHCl pH 7 tampão de amostra: idem tampão de lavagem: P04 0,1 M - GuHCl 6 M pH 7 P04 0,1 M - ureia 6 M, pH 7

Eluição: gradiente de imidazole (0—>250 mM) em tampão P04 0,1 M, pH 7 suplementado com ureia 6 M.

Velocidade de fluxo: 2 mL/min a. Concentração:

Reuniram-se as fracções positivas para antigénio do eluato de IMAC (160 mL) e concentraram-se para 5 mL numa célula agitada Amicon numa membrana Filtron (exclusão de 10000 tipo Omega). A pureza nesta fase é de cerca de 70%, como estimado por SDS-PAGE. b. Electroforese preparativa (Prep Cell Biorad)

Ferveram-se 2,4 mL da amostra concentrada em 0,8 mL de tampão de amostra redutor e carregaram-se num gel de acrilamida a 10%. 0 antigénio foi eluído num tampão Tris-Glicina, pH 8,3 suplementado com SDS a 4% e reuniram-se as fracções positivas para NSi-MAGE 3 His. 47 a. Precipitação com TCA: 0 antigénio foi precipitado com TCA e após centrifugação num rotor JA 20 a 15000 rpm, durante 20 minutos, o sobrenadante foi desprezado. O sedimento foi ressolubilizado em tampão PBS, pH 7,4. A proteína é solúvel em PBS após congelação/descongelação, não apresenta qualquer degradação quando armazenada durante 3 horas a 3 7 °C e tem um peso molecular aparente de aproximadamente 50000 daltons, tal como determinado por SDS (PAGE a 12,5%). EXEMPLO IX:

Preparação da estirpe de E. coli que expressa uma proteína de fusão CLYTA-MAGE-l-cauda His 1. Construção do plasmídeo de expressão pRITl4613 e transformação da estirpe hospedeira AR58:

Concepção da proteína: A concepção da proteína de fusão Clyta-Mage-l-His a ser expressa em E. coli é descrita na Figura 15. A estrutura primária da proteína resultante tem a sequência apresentada na sequência ID N° 7. A sequência codificante (ver SEQUÊNCIA ID N° 8) correspondente à concepção de proteína acima indicada foi 48 colocada sob o controlo do promotor ÀpL num plasmídeo de expressão em E. coli.

Clonagem: 0 material de partida foi o vector PCUZl que contém os 117 codões de terminal-C da região codificante de LytA de Streptococcus pneumoniae e o vector pRIT14518, em que foi previamente subclonado o ADNc do gene MAGE-1 de um plasmídeo recebido do Dr. Thiery Boon do Ludwig Institute. A estratégia de clonagem para a expressão da proteína CLYTA-Mage-l-His (ver Figura 16) incluiu os passos seguintes: 2. Preparação do módulo de sequência codificante de CLYTA-Mage-1-Hi s a) 0 primeiro passo foi uma amplificação por PCR destinada a flanquear as sequências de CLYTA com os sítios de restrição de Ndel-AflIII. A amplificação por PCR foi feita utilizando o modelo de plasmídeo PCUZl como molde e como iniciadores o oligonucleótido de sentido: 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac, e o oligonucleótido de anti-sentido: 5' GCC AGA CAT GTC CAA TTC TGG CCT GTC TGC CAG. Isto leva a uma amplificação de uma sequência de CLYTA de 378 nucleótidos de comprimento. o segundo passo foi ligar as sequências de CLYTA às sequências de MAGE-l-His para produzir a sequência codificante para a proteína de fusão. Este passo incluiu a 49 excisão de um fragmento Ndel-AflIII de Clyta e inserção no vector pRIT14518 anteriormente aberto pelas enzimas de restrição Ndel e Ncol (compatível com Ncol e AflIII) e originou o plasmídeo pRIT14613. c) transformação da estirpe hospedeira AR58 d) Selecção e caracterização do transformante de E. coli (resistente a KAN) contendo o plasmideo pRIT14613 (ver Figura 16). 1. Caracterização da proteína recombinante CLYTA—MAGE—l—His(pRIT14613):

As bactérias foram crescidas em Meio LB suplementado com canamicina 50 pg/mL a 30 °C. Quando a cultura atingiu uma DO = 0,3 (a 620 nm), conseguiu-se uma indução pelo calor, aumentando a temperatura para 38 °C.

Após 4 horas de indução as células foram recolhidas, ressuspensas em PBS e lisadas (por desintegração) por um pulso. Após centrifugação o sedimento, sobrenadante e extracto total foram analisados por SDS-PAGE. As proteínas foram visualizadas em geis corados com Coomassie Bl, em que a proteína de fusão representava cerca de 1% das proteínas totais de E. coli. A proteína recombinante surgiu como uma banda única com um PM aparente de cerca de 49 kD. A proteína de fusão foi identificada por análise de Transferência de Western utilizando anticorpos policlonais anti-Mage-1. 50

Reconstituição da unidade de expressão composta pelo promotor XpL longo (útil para indução de ácido nalidixico) e a sequência codificante de CLYTA—Mage-1 pRITl4616):

Preparou-se um fragmento de restrição EcoRI-NCOí contendo o promotor PL longo e uma parte das sequências de CLYTA foi preparada a partir do plasmideo pRIT DV46 e inseriu-se entre os sítios de EcoRI-NCOí do plasmideo pRITl4613.

Obteve-se o plasmideo recombinante pRIT14616.

Utilizou-se o plasmideo recombinante pRIT14616 (ver Figura 17) que codifica para a proteína de fusão CLYTA-Mage-1-His para transformar E. coli AR120. Seleccionou-se e caracterizou-se uma estirpe candidata resistente a Kan.

Caracterização da proteína recombinante:

Cresceram-se bactérias em meio LB suplementado com canamicina 50 mg/mL a 30 °C. Quando a cultura atingiu uma DO = 400 (a 620 nm) adicionou-se ácido nalidixico a uma concentração final de 60 mg/mL.

Após 4 horas de indução, as células foram recolhidas, ressuspensas em PBS e lisadas por desintegração (desintegração de CLS do tipo "um impulso") . Após centrifugação o sedimento, sobrenadante e extracto total foram analisados por SDS-PAGE. As proteínas foram visualizadas em geis corados com azul de Coomasie, em que a proteína de fusão representava cerca de 1% das proteínas totais de E. coli. A proteína de fusão foi identificada por análise de Transferência de Western, utilizando 51 anticorpos policlonais de coelho anti-Mage-1. A proteína recombinante surgiu como uma única banda com um PM aparente de cerca de 49 kD. EXEMPLO X:

CLYTA—MAGE—3—HIS A: antigénio recombinante de rejeição de tumor: uma proteína de fusão CLYTA-Mage-3-His, em que o parceiro de fusão ClytA leva à expressão de uma proteína solúvel, actua como marcador de afinidade e proporciona um T auxiliar útil.

Preparação da estirpe de E. coli que expressa uma proteína de fusão CLYTA-Mage-3-cauda His

Construção do plasmídeo de expressão pRIT14646 e transformação da estirpe hospedeira AR 120:

Concepção da proteína: A concepção da proteína de fusão Clyta-Mage-3-His a ser expressa em E. coli é apresentada na Figura 18. A estrutura primária da proteína resultante tem a sequência descrita na SEQUÊNCIA ID N° 9: e a sequência codificante na sequência ID N° 10 52 A sequência codificante correspondente à concepção de proteína acima descrita foi colocada sob o controlo do promotor ÀpL num plasmídeo de expressão em E. coli.

Clonagem: 0 material de partida era o vector PCUZl que contém os 117 codões de terminal-C da região codificante de LytA de Steptococcus pneumoniae, descritos em Gene 43 (1986) p. 265-272 e o vector pRITl4426 em que foi previamente subclonado o ADNc do gene MAGE-3 de um plasmídeo recebido do Dr. Tierry Boon do Ludwig Institute. A estratégia de clonagem para a expressão da proteína CLYTA-MAGE-3-His (ver o sublinhado Figura 19) incluía os seguintes passos: 1. Preparação do módulo da sequência codificante de CLYTA—MAGE—3—His 1.1. 0 primeiro passo foi uma amplificação por PCR destinada a flanquear as sequências de CLYTA com os sítios de restrição de AflII e AflIII. A amplificação por PCR foi realizada utilizando o modelo do plasmídeo PCUZlas e como iniciadores de síntese o oligonucleótido de sentido: 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac, e o oligonucleótido de anti-sentido: 5' ccc aca tgt cca gac tgc tgg cca att ctg gc tgt ctg cca gtg. Isto leva à amplificação de uma sequência CLYTA de 427 nucleótidos de comprimento. 0 fragmento amplificado acima 53 descrito foi clonado no vector de clonagem TA da Invitrogen, para se obter o vector intermediário pRIT14661. 1.2. 0 segundo passo foi ligar as sequências de CLYTA às sequências de MAGE-3-His para produzir a sequência codificante para a proteína de fusão. Este passo incluiu a excisão de um fragmento Clyta AflII-AflIII e inserção no vector pRIT14426, previamente aberto pelas enzimas de restrição AflII e Ncol (compatível com Ncol e AflII) e originou o plasmídeo pRIT14662. 2. Reconstituição da unidade de expressão composta pelo promotor pL de λ longo (útil para indução com ácido nalidixico) e a sequência codificante de CLYTA-Mage-3:

Preparou-se um fragmento de restrição BglIII-Xbal contendo o promotor pL curto e as sequências codificantes de CLYTA-Mage-3-His a partir do plasmídeo pRIT114662 e inseriu-se entre os sítios BglIII-Xbal do plasmídeo TCM67 (um derivado de pBR322 contendo a resistência a ampicilina e o promotor pL de λ longo, descrito no pedido internacional PCT/EP92/01827) . Obteve-se o plasmídeo pRIT14607.

Utilizou-se o plasmídeo recombinante pRIT14607 que codifica para a proteína Clyta-Mage-3-His para transformar a E. coli AR120 (Mott et al. 1985, Proc. Natl. Acad. Sei. 82:88). Uma estirpe candidata resistente a ampicilina foi seleccionada e caracterizada. 54 3. Preparação do plasmídeo pRITl4646:

Por último, construiu-se um plasmídeo semelhante a pRIT 14607, mas que possui a selecção para canamicina (pRIT 14646) .

Caracterização da proteína recombinante:

As bactérias foram crescidas em Meio LB suplementado com canamicina 50 mg/mL a 30 °C. Quando a cultura atingiu uma DO = 400 (a 600 nm) adicionou-se ácido nalidíxico a uma concentração final de 60?g/mL.

Após 4 horas de indução, as células foram recolhidas, ressuspensas em PBS e lisadas por desintegração -(desintegração CLS do tipo "um impulso") . Após centrifugação, o sedimento, sobrenadante e extracto total foram analisados por SDS-PAGE. As proteínas foram visualizadas em geis corados com azul de Coomassie, em que a proteína de fusão representava cerca de 1% das proteínas totais de E. Coli. A proteína de fusão foi identificada por análise de Transferência de Western, utilizando anticorpos policlonais de coelho anti-Mage-3. A proteína recombinante surgiu como uma única banda, com um PM aparente de cerca de 58 kD. EXEMPLO XI:

Purificação da proteína recombinante CLYTA—Mage—3 His:

Cresceram-se bactérias recombinantes AR120 (pRIT 14646) num fermentador de 20 litros, sob condições de fermentação 55 descontínua com alimentação, a 30 °C. A expressão da proteína recombinante foi induzida adicionando ácido Nalidíxico a uma concentração final de 60 ?g/mL. As células foram recolhidas no final da fermentação e lisadas a 60 DO/600 por duas passagens através de uma prensa francesa (20000 psi) . As células lisadas foram sedimentadas 20 min a 15000 g a 4 °C. O sobrenadante contendo a proteína recombinante foi carregado em resina DEAE Sepharose CL6B (Pharmacia) pré-equilibrada em NaCl 0,3 M, Tris-HCl 20 M, pH 7,6 Tampão A. Após uma lavagem da coluna com tampão A, a proteína de fusão foi eluída por colina a 2% em (tampão A) . Reuniram-se as fracções positivas para antigénio, tal como revelado por análise de Transferência de Western, utilizando um anticorpo anti-Mage-3. O antigénio eluído com DEAE foi ajustado para 0,5% de Empigen BB (um detergente zwiteriónico) e NaCl 50 M antes de carregar numa coluna de cromatografia de Afinidade de Metal Iónico, pré-equilibrada em Empigen BB a 0,5%, NaCl 0,5 M, tampão fosfato 50 mM, pH 7,6 (tampão B). A coluna IMAC foi lavada com tampão B até a absorvência a 280 nm atingir a linha de base. Fez-se uma segunda lavagem em tampão B sem Empigen BB (tampão C) , de modo a eliminar o detergente, antes de eluição do Antigénio por um gradiente de Imidazole 0-250 nM Imidazole em tampão C.

As fracções de imidazole 0,090-0,250 M foram reunidas, concentradas numa membrana Filtron Omega de 10 kDa antes de diálise versus tampão PBS. 56 CONCLUSÃO: A requerente demonstrou que a proteína fundida LPD-MAGE-His é imunogénica em ratinhos e que esta imunogenicidade (a resposta proliferativa e resposta de anticorpo) pode ser, ainda, aumentada por utilização do adjuvante descrito acima. A purificação pode ser melhorada derivatizando os tióis que formam ligações dissulfureto. A requerente também demonstrou que uma melhor resposta de anticorpo foi desencadeada por vacinação com o LPD-MAGE-3-His na presença do adjuvante. 0 facto do isotipo predominante encontrado no soro de C57BL/6 ser IgG2b sugere que se produziu uma resposta imunitária do tipo TH1.

Na experiência clínica de humano, eliminou-se o melanoma de um doente tratado com LPD-MAGE3-His numa formulação sem adjuvante.

REFERÊNCIAS -Anichini A., Fossati G., Parmiani G. lmmunol. Today, 8: 385 (1987). -De Plaen E., Arden K., Traversari C., et al. lmmunogenetics, 40 : 360 (1994) . -Gaugler B., Van den Eynde B., van der Bruggen P., et al. J. Exp. Med., 179: 921 (1994). 57 -Herman J., van der Bruggen P., Immanuel F., et al. Immunogenetics, 43: 377 (1996). -Inoue H., Mori M., Li J., et al. Int. J. Câncer, 63: 523 (1995) . -Kensil C.R., Soltysik 5., Patel U., et al. in: Channock R.M., Ginsburg H.S., Brown F., et al. (eds.), Vaccines 92, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. ) , 36-40: (1992) . -Knuth A., Danowski B., Oettgen H.F., et al. Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 81: 3511 (1984). -Patard J.J., Brasseur F., Gil-Diez 5., et al. Int. J. Câncer, 64: 60 (1995). -Ribi E., et al. em: Levine L., Bonvenue P.F., Morello J., et al. (eds)., American Society for Microbiology, Washington DC, Microbiology 1986, 9-13; (1986). -Van den Eynde B., Hainaut P., Hérin M. et al. Int. J. Câncer, 44: 634 (1989). -Van der Bruggen P., Traversari C., Chomez P., et al. Science, 254: 1643 (1991). -Van der Bruggen P., Bastin J., Gajewski T., et al. Eur. J. Immunol., 24: 3038 (1994). -Van Pel A., van der Bruggen P., Coulie P.G., et al., Immunol. Rev., 145: 229 (1995). 58 -Weynants P., Lethé B., Brasseur F., et al. Int. J. 56: 826 (1994) . -Nishimura S, Fujita M, Terata N, Tani T, Kodama M, Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi 1997. Apr, 20 (2): -Fuijie T et al., Ann Oncol 1997 Apr, 8 (4): 369-72.

LISTAGEM DE SEQUENCIA (1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: SmithKline Beecham Biologicals (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Vacina (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 10

(iv) MORADA PARA CORRESPONDÊNCIA (A) DESTINATÁRIO: SmithKline Beecham (B) RUA: 2 New Horizons Court, Great West Road, (C) CIDADE: Midxx (D) ESTADO:

(E) PAÍS: RU

(F) CÓDIGO POSTAL: TW8 9EP (v) FORMA DE LEITURA POR COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: disquete

(B) COMPUTADOR: PC compatível com IBM

(C) SISTEMA OPERATIVO: DOS (D) SOFTWARE: FastSEQ para Windows versão 2.0 Câncer ltoh K 95-101. (vi) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE PEDIDO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE PEDIDO: (viii) INFORMAÇÃO DO MANDATÁRIO/AGENTE: (A) NOME: Dalton, Marcus J. (B) NÚMERO DE REGISTO: (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/ENTRADA: B45126

(ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES (A) TELEFONE: 0181 9756348 (B) TELEFAX: 0181 9756177 (C) TELEX: (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 1

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 452 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 60 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°.l:

Met Asp Pro Lys Thr Leu Ala Leu Ser Leu Leu Ala Ala Gly Vai Leu 15 10 15

Ala Gly Cys Ser Ser His Ser Ser Asn Met Ala Asn Thr Gin Met Lys 20 25 30

Ser Asp Lys Ile Ile Ile Ala His Arg Gly Ala Ser Gly Tyr Leu Pro

Glu His 35 Thr Leu Tyr 50 Leu Glu Gin 65 Ile His Asp His Pro His Arg His Leu Lys Glu 100 Ile Asp Leu 115 Glu Gin Ala 130 Arg Gly Glu 145 Glu Glu Gin Glu Leu Gly Glu Vai Gin Gly Ala 180 Ser Gin Ser 195 Tyr Glu Phe 210 Pro Asp Leu 225 Ala Glu Leu Val Vai Thr Lys Ala Phe Phe Pro 260 Val Phe Gly 275 Ile Glu Phe 290 Ala Thr Cys 305 Gin Ile Met Pro Ala Arg Glu Gly Ser Vai Leu 340 Glu Pro Lys 355 Lys Leu Tyr 370 Arg Gin Val 385 Gly Pro Arg Ala 40

Glu Ser Lys 55 Ala Asp Leu 70 Ala Met Phe 85 Leu Asp Gly Arg Lys Asp Gly Gin Ser Leu Glu 120 Arg Ser Gin 135 His Ala Leu 150 Gly Leu Ala 165 Ala Ser Ser Pro Ala Ala Glu Ser Leu Pro Thr 200 Asp Ser Ser 215 Asn Glu Ser 230 Glu Phe His 245 Phe Leu Leu Glu Met Leu Gly Ile Phe Ser Lys 280 Leu Met Glu 295 Val Leu Gly 310 Leu Ser Lys 325 Ala Gly Leu Asp Cys Ala Pro Val Phe Glu Gly 360 Leu Thr Gin 375 His Pro Gly 390 Ser Asp Leu 405 Val Glu Thr

Leu Ala Phe Ala 60 Thr Lys Asp 75 Gly Leu Thr 90 Asp Val Arg 105 Tyr Tyr Val Met Thr Glu Asn Cys Lys Pro Glu 140 Val Gly Ala 155 Gin Ser Ser 170 Thr Leu Ser 185 Pro Asp Pro Thr Met Asn Tyr Gin Glu Glu Glu 220 Gin Ala Ala 235 Leu Leu Lys 250 Tyr Arg Ser 265 Val Val Gly Ala Ser Ser Ser Asp Pro Ile Gly 300 Tyr Asp Gly 315 Leu Leu Ile 330 Ile Val Glu 345 Glu Lys Ile Arg Glu Asp Ser Phe Val Gin Glu 380 Pro Ala Cys 395 Tyr Ser Tyr 410 Val Lys 45 Gin Gin Ala Asp Arg Leu Val val 80 Ala Lys Lys 95 Phe Ile Asp 110 Phe Thr Phe 125 Glu Thr Met Glu Gly Leu Glu Ala Pro Ala Thr 160 Val Glu Val 175 Thr Pro Gin 190 Ser Pro Pro 205 Leu Trp Ser Gly Pro Ser Thr Ser Arg Lys Val 240 Ala Arg Glu 255 Pro Asn Trp 270 Gin Tyr Leu 285 Gin Leu Val His Leu Tyr Ile Leu Gly Asp Asn 320 Leu Ala Ile 335 Ile Trp Glu 350 Glu Leu Ile 365 Leu Gly Asp Asn Tyr Leu Glu Glu Phe Leu Trp 400 Val Leu His 415 His 61

Met Vai Lys Ile ser Gly Gly Pro His Ile ser Tyr Pro Pro Leu His 420 425 430

Glu Trp Vai Leu Arg Glu Gly Glu Glu Thr Ser Gly Gly His His His 435 440 445

His His His 450 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 2

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 1353 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N°.2: ATGGATCCAA AAACTTTAGC CCTTTCTTTA TTAGCAGCTG GCGTACTAGC AGGTTGTAGC 60 AGCCATTCAT CAAATATGGC GAATACCCAA ATGAAATCAG ACAAAATCAT TATTGCTCAC 120 CGTGGTGCTA GCGGTTATTT ACCAGAGCAT ACGTTAGAAT CTAAAGCACT TGCGTTTGCA 180 CAACAGGCTG ATTATTTAGA GCAAGATTTA GCAATGACTA AGGATGGTCG TTTAGTGGTT 240 ATTCACGATC ACTTTTTAGA TGGCTTGACT GATGTTGCGA AAAAATTCCC ACATCGTCAT 300 CGTAAAGATG GCCGTTACTA TGTCATCGAC TTTACCTTAA AAGAAATTCA AAGTTTAGAA 360 ATGACAGAAA ACTTTGAAAC CATGGATCTG GAACAGCGTA GTCAGCACTG CAAGCCTGAA 420 GAAGGCCTTG AGGCCCGAGG AGAGGCCCTG GGCCTGGTGG GTGCGCAGGC TCCTGCTACT 480 GAGGAGCAGG AGGCTGCCTC CTCCTCTTCT ACTCTAGTTG AAGTCACCCT GGGGGAGGTG 540 CCTGCTGCCG AGTCACCAGA TCCTCCCCAG AGTCCTCAGG GAGCCTCCAG CCTCCCCACT 600 ACCATGAACT ACCCTCTCTG GAGCCAATCC TATGAGGACT CCAGCAACCA AGAAGAGGAG 660 GGGCCAAGCA CCTTCCCTGA CCTGGAGTCC GAGTTCCAAG CAGCACTCAG TAGGAAGGTG 720 GCCGAATTGG TTCATTTTCT GCTCCTCAAG TATCGAGCCA GGGAGCCGGT CACAAAGGCA 780 GAAATGCTGG GGAGTGTCGT CGGAAATTGG CAGTATTTCT TTCCTGTGAT CTTCAGCAAA 840 GCTTCCAGTT CCTTGCAGCT GGTCTTTGGC ATCGAGCTGA TGGAAGTGGA CCCCATCGGC 900 CACTTGTACA TCTTTGCCAC CTGCCTGGGC CTCTCCTACG ATGGCCTGCT GGGTGACAAT 960 CAGATCATGC CCAAGGCAGG CCTCCTGATA ATCGTCCTGG CCATAATCGC AAGAGAGGGC 1020 GACTGTGCCC CTGAGGAGAA AATCTGGGAG GAGCTGAGTG TGTTAGAGGT GTTTGAGGGG 1080 AGGGAAGACA GTATCTTGGG GGATCCCAAG AAGCTGCTCA CCCAACATTT CGTGCAGGAA 1140 AACTACCTGG AGTACCGGCA GGTCCCCGGC AGTGATCCTG CATGTTATGA ATTCCTGTGG 1200 GGTCCAAGGG CCCTCGTTGA AACCAGCTAT GTGAAAGTCC TGCACCATAT GGTAAAGATC 1260 AGTGGAGGAC CTCACATTTC CTACCCACCC CTGCATGAGT GGGTTTTGAG AGAGGGGGAA 1320 GAGGGCGGTC ATCACCATCA CCATCACCAT TAA 1353 62 2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 3

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 1341 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 3: ATGGATCCAA AAACTTTAGC CCTTTCTTTA TTAGCAGCTG GCGTACTAGC AGGTTGTAGC 60 AGCCATTCAT CAAATATGGC GAATACCCAA ATGAAATCAG ACAAAATCAT TATTGCTCAC 120 CGTGGTGCTA GCGGTTATTT ACCAGAGCAT ACGTTAGAAT CTAAAGCACT TGCGTTTGCA 180 CAACAGGCTG ATTATTTAGA GCAAGATTTA GCAATGACTA AGGATGGTCG TTTAGTGGTT 240 ATTCACGATC ACTTTTTAGA TGGCTTGACT GATGTTGCGA AAAAATTCCC ACATCGTCAT 300 CGTAAAGATG GCCGTTACTA TGTCATCGAC TTTACCTTAA AAGAAATTCA AAGTTTAGAA 360 ATGACAGAAA ACTTTGAAAC CATGGGCTCT CTGGAACAGC GTAGTCTGCA CTGCAAGCCT 420 GAGGAAGCCC TTGAGGCCCA ACAAGAGGCC CTGGGCCTGG TGTGTGTGCA GGCTGCCACC 480 TCCTCCTCCT CTCCTCTGGT CCTGGGCACC CTGGAGGAGG TGCCCACTGC TGGGTCAACA 540 GATCCTCCCC AGAGTCCTCA GGGAGCCTCC GCCTTTCCCA CTACCATCAA CTTCACTCGA 600 CAGAGGCAAC CCAGTGAGGG TTCCAGCAGC CGTGAAGAGG AGGGGCCAAG CACCTCTTGT 660 ATCCTGGAGT CCTTGTTCCG AGCAGTAATC ACTAAGAAGG TGGCTGATTT GGTTGGTTTT 720 CTGCTCCTCA AATATCGAGC CAGGGAGCCA GTCACAAAGG CAGAAATGCT GGAGAGTGTC 780 ATCAAAAATT ACAAGCACTG TTTTCCTGAG ATCTTCGGCA AAGCCTCTGA GTCCTTGCAG 840 CTGGTCTTTG GCATTGACGT GAAGGAAGCA GACCCCACCG GCCACTCCTA TGTCCTTGTC 900 ACCTGCCTAG GTCTCTCCTA TGATGGCCTG CTGGGTGATA ATCAGATCAT GCCCAAGACA 960 GGCTTCCTGA TAATTGTCCT GGTCATGATT GCAATGGAGG GCGGCCATGC TCCTGAGGAG 1020 GAAATCTGGG AGGAGCTGAG TGTGATGGAG GTGTATGATG GGAGGGAGCA CAGTGCCTAT 1080 GGGGAGCCCA GGAAGCTGCT CACCCAAGAT TTGGTGCAGG AAAAGTACCT GGAGTACCGG 1140 CAGGTGCCGG ACAGTGATCC CGCACGCTAT GAGTTCCTGT GGGGTCCAAG GGCCCTCGCT 1200 GAAACCAGCT ATGTGAAAGT CCTTGAGTAT GTGATCAAGG TCAGTGCAAG AGTTCGCTTT 1260 TTCTTCCCAT CCCTGCGTGA AGCAGCTTTG AGAGAGGAGG AAGAGGGAGT CGGCGGTCAT 1320 CACCATCACC ATCACCATTA A 1341 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 4

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 466 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 63 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 4:

Met 1 Aep Pro Lys Ala Gly Cys Ser 20 Ser Asp Lys 35 Ile Glu Hls 50 Thr Leu Tyr 65 Leu Glu Gin Ile His Asp His Pro His Arg His 100 Leu Lys Glu 115 Ile Gly Ser 130 Leu Glu Glu 145 Ala Gin Gin Ser Ser Ser Ser Ala Gly Ser Thr 180 Pro Thr Thr 195 Ile Ser Ser 210 Arg Glu Leu 225 Phe Arg Ala Leu Leu Leu Lys Leu Glu Ser Vai 260 Gly Lys Ala 275 Ser Glu Ala 290 Asp Pro Leu 305 Ser Tyr Asp Gly Phe Leu Ile Ala Pro Glu Glu 340 Asp Gly Arg 355 Glu Gin Asp 370 Leu Vai

Thr 5 Leu Ala Leu Ser His Ser Ser Ile Ile Ala His 40 Glu Ser Lys 55 Ala Asp Leu 70 Ala Met Phe 85 Leu Asp Gly Arg Lys Asp Gly Gin Ser Leu Glu 120 Gin Arg Ser 135 Leu Glu Ala 150 Leu Gly Pro 165 Leu Vai Leu Asp Pro Pro Gin Asn Phe Thr Arg 200 Glu Glu Gly 215 Pro Vai Ile 230 Thr Lys Tyr 245 Arg Ala Arg Ile Lys Asn Tyr Glu Ser Leu Gin 280 Thr Gly His 295 Ser Gly Leu 310 Leu Gly Ile 325 Vai Leu Vai Glu Ile Trp Glu His Ser Ala Tyr 360 Gin Glu Lys 375 Tyr

Ser Leu 10 Leu Ala Asn 25 Met Ala Asn Arg Gly Ala Ser Leu Ala Phe Ala 60 Thr Lys Asp 75 Gly Leu Thr 90 Asp Vai Arg 105 Tyr Tyr Vai Met Thr Glu Asn His Cys Lys Pro 140 Leu Vai Cys 155 Vai Gly Thr 170 Leu Glu Ser 185 Pro Gin Gly Gin Arg Gin Pro Ser Thr Ser Cys 220 Lys Vai Ala 235 Asp Glu Pro 250 Vai Thr Lys 265 His Cys Phe Leu Vai Phe Gly Tyr Vai Leu Vai 300 Asp Asn Gin 315 Ile Met Ile 330 Ala Met Glu 345 Leu Ser Vai Gly Glu Pro Arg Leu Glu Tyr Arg 380

Ala Gly Vai Leu Thr Gin 15 Met Lys Gly 30 Tyr Leu Pro 45 Gin Gin Ala Asp Arg Leu Vai Vai Ala Lys Lys 80 Phe Ile Asp 95 Phe Thr Phe 110 Glu Thr Met 125 Glu Glu Ala Leu Gin Ala Ala Thr Glu Vai Pro 160 Thr Ala Ser 175 Ala Phe Ser 190 Glu Gly Ser 205 Ile Leu Glu Ser Leu Vai Gly Phe Lys Ala Glu 240 Met Pro Glu 255 Ile Phe Ile 270 Asp Vai Lys 285 Thr Cys Leu Gly Met Pro Lys Thr Glu Gly Gly 320 His Met Glu 335 Vai Tyr Lys 350 Leu Leu Thr 365 Gin Vai Pro Asp 64

Ser Asp Pro Ala Arg Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala 385 390 395 400 Glu Thr Ser Tyr Vai 405 Lys Vai Leu Glu Tyr 410 Vai Ile Lys vai Ser 415 Ala Arg Vai Arg Phe 420 Phe Phe Pro Ser Leu 425 Arg Glu Ala Ala Leu 430 Arg Glu Glu Glu Glu Gly Vai Gly Gly His His His His His His His 435 440 445 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 5

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 404 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 5:

Met 1 Asp Pro Asn Thr 5 Val Ser Ser Phe Gin 10 Val Asp Cys Phe Leu 15 Trp His Vai Arg Lys 20 Arg Vai Ala Asp Gin 25 Glu Leu Gly Asp Ala 30 Pro Phe Leu Asp Arg 35 Leu Arg Arg Asp Gin 40 Lys Ser Leu Arg Gly 45 Arg Gly Ser Thr Leu 50 Gly Leu Asp Ile Glu 55 Thr Ala Thr Arg Ala 60 Gly Lys Gin Ile Vai 65 Glu Arg Ile Leu Lys 70 Glu Glu Ser Asp Glu 75 Ala Leu Lys Met Thr 80 Met Asp Leu Glu Gin 85 Arg Ser Gin His Cys 90 Lys Pro Glu Glu Gly 95 Leu Glu Ala Arg Gly 100 Glu Ala Leu Gly Leu 105 Val Gly Ala Gin Ala 110 Pro Ala Thr Glu Glu 115 Gin Glu Ala Ala Ser 120 Ser Ser Ser Thr Leu 125 Val Glu Val Thr Leu 130 Gly Glu Vai Pro Ala 135 Ala Glu Ser Pro Asp 140 Pro Pro Gin Ser Pro 145 Gin Gly Ala Ser Ser 150 Leu Pro Thr Thr Met 155 Asn Tyr Pro Leu Trp 160 65

Ser Gin Ser Tyr Glu 165 Asp Ser Ser Asn Gin 170 Glu Glu Glu Gly Pro Ser 175 Thr Phe Pro Asp 180 Leu Glu Ser Glu Phe 185 Gin Ala Ala Leu Ser 190 Arg Lys Vai Ala Glu 195 Leu Vai His Phe Leu 200 Leu Leu Lys Tyr Arg Ala 205 Arg Glu Pro Vai 210 Thr Lys Ala Glu Met 215 Leu Gly Ser Vai Vai 220 Gly Asn Trp Gin Tyr 225 Phe Phe Pro Vai Ile 230 Phe Ser Lys Ala Ser 235 Ser Ser Leu Gin Leu 240 Vai Phe Gly Ile Glu 245 Leu Met Glu Vai Asp 250 Pro Ile Gly His Leu Tyr 255 Ile Phe Ala Thr 260 Cys Leu Gly Leu Ser 265 Tyr Asp Gly Leu Leu 270 Gly Asp Asn Gin Ile 275 Met Pro Lys Ala Gly 280 Leu Leu Ile Ile Vai Leu 285 Ala Ile Ile Ala 290 Arg Glu Gly Asp Cys 295 Ala Pro Glu Glu Lys 300 Ile Trp Glu Glu Leu 305 Ser Vai Leu Glu Vai 310 Phe Glu Gly Arg Glu 315 Asp Ser Ile Leu Gly 320 Asp Pro Lys Lys Leu 325 Leu Thr Gin His Phe 330 Vai Gin Glu Asn Tyr Leu 335 Glu Tyr Arg Gin 340 Vai Pro Gly Ser Asp 345 Pro Ala Cys Tyr Glu 350 Phe Leu Trp Gly Pro 355 Arg Ala Leu Vai Glu 360 Thr Ser Tyr Vai Lys Vai 365 Leu His His Met 370 Vai Lys Ile Ser Gly 375 Gly Pro His Ile Ser 380 Tyr Pro Pro Leu His 385 Glu Trp Vai Leu Arg 390 Glu Gly Glu Glu Gly 395 Gly His His His His 400

HiS HÍS His (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 6

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 1212 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc 66 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 6

ATGGATCCAA ACACTGTGTC CGAGTTGCAG ACCAAGAACT AAATCCCTAA GAGGAAGGGG GGAAAGCAGA TAGTGGAGCG ATGGATCTGG AACAGCGTAG GAGGCCCTGG GCCTGGTGGG TCCTCTTCTA CTCTAGTTGA CCTCCCCAGA GTCCTCAGGG AGCCAATCCT ATGAGGACTC CTGGAGTCCG AGTTCCAAGC CTCCTCAAGT ATCGAGCCAG GGAAATTGGC AGTATTTCTT GTCTTTGGCA TCGAGCTGAT TGCCTGGGCC TCTCCTACGA CTCCTGATAA TCGTCCTGGC ATCTGGGAGG AGCTGAGTGT GATCCCAAGA AGCTGCTCAC GTCCCCGGCA GTGATCCTGC ACCAGCTATG TGAAAGTCCT TACCCACCCC TGCATGAGTG CATCACCATT AA

AAGCTTTCAG GTAGATTGCT AGGTGATGCC CCATTCCTTG CAGCACTCTT GGTCTGGACA GATTCTGAAA GAAGAATCCG TCAGCACTGC AAGCCTGAAG TGCGCAGGCT CCTGCTACTG AGTCACCCTG GGGGAGGTGC AGCCTCCAGC CTCCCCACTA CAGCAACCAA GAAGAGGAGG AGCACTCAGT AGGAAGGTGG GGAGCCGGTC ACAAAGGCAG TCCTGTGATC TTCAGCAAAG GGAAGTGGAC CCCATCGGCC TGGCCTGCTG GGTGACAATC CATAATCGCA AGAGAGGGCG GTTAGAGGTG TTTGAGGGGA CCAACATTTC GTGCAGGAAA ATGTTATGAA TTCCTGTGGG GCACCATATG GTAAAGATCA GGTTTTGAGA GAGGGGGAAG

TTCTTTGGCA TGTCCGCAAA ATCGGCTTCG CCGAGATCAG TCGAGACAGC CACACGTGCT ATGAGGCACT TAAAATGACC AAGGCCTTGA GGCCCGAGGA AGGAGCAGGA GGCTGCCTCC CTGCTGCCGA GTCACCAGAT CCATGAACTA CCCTCTCTGG GGCCAAGCAC CTTCCCTGAC CCGAATTGGT TCATTTTCTG AAATGCTGGG GAGTGTCGTC CTTCCAGTTC CTTGCAGCTG ACTTGTACAT CTTTGCCACC AGATCATGCC CAAGGCAGGC ACTGTGCCCC TGAGGAGAAA GGGAAGACAG TATCTTGGGG ACTACCTGGA GTACCGGCAG GTCCAAGGGC CCTCGTTGAA GTGGAGGACC TCACATTTCC AGGGCGGTCA TCACCATCAC 60 120 ISO 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1212 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 7

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 445 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 7:

Met 1 Lys Gly Gly Ile 5 Vai His Ser Phe Glu Lys Ile 20 Asn Gly Thr Trp Met Leu Ala 35 Asp Arg Trp Arg Lys 40

Asp Gly Ser Tyr Pro Lys Asp Lys 10 15

Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser Gly Tyr 25 30

His Thr Asp Gly Asn Trp Tyr Trp 45 67

Phe Asp 50 Asn Ser Gly Glu Met 55 Ala Lys 65 Trp Tyr Tyr Phe Asn 70 Glu Glu Lys Tyr Lys Asp Thr 85 Trp Tyr Tyr Vai Ser Asn Ala 100 Phe Ile Gin Ser Leu Lys Pro 115 Asp Gly Thr Leu Ala 120 Ser Leu 130 Glu Gin Arg Ser Leu 135 His Ala 145 Gin Gin Glu Ala Leu 150 Gly Leu Ser Ser Ser Pro Leu 165 Vai Leu Gly Gly Ser Thr Asp 180 Pro Pro Gin Ser Thr Thr Ile 195 Asn Phe Thr Arg Gin 200 Ser Arg 210 Glu Glu Glu Gly Pro 215 Ser Phe 225 Arg Ala Vai Ile Thr 230 Lys Lys Leu Leu Lys Tyr Arg 245 Ala Arg Glu Glu Ser Vai Ile 260 Lys Asn Tyr Lys Lys Ala Ser 275 Glu Ser Leu Gin Leu 280 Ala Asp 290 Pro Thr Gly His Ser 295 Tyr Ser 305 Tyr Asp Gly Leu Leu 310 Gly Asp Phe Leu Ile Ile Vai 325 Leu Vai Met Pro Glu Glu Glu 340 Ile Trp Glu Glu Gly Arg Glu 355 His Ser Ala Tyr Gly 360 Asp Leu 370 Vai Gin Glu Lys Tyr 375 Leu Asp 385 Pro Ala Arg Tyr Glu 390 Phe Leu Thr Ser Tyr Vai Lys 405 Vai Leu Glu Vai Arg Phe Phe 420 Phe Pro Ser Leu Glu Glu Gly 435 Vai Gly Gly His His 440

Thr Gly Trp Lys Lys Ile Ala Asp Gly Ala Met 60 Lys Thr Gly Trp Val Leu Asp 75 Ala Lys Glu Gly Ala 80 Met Ala 90 Asp Gly Thr Gly Trp 95 Tyr Tyr 105 Asp Arg Pro Glu Leu 110 Asp Met Gly Cys Lys Pro Glu 125 Glu Ala Leu Glu Vai Cys Val 140 Gin Ala Ala Thr Ser Thr Leu 155 Glu Glu Val Pro Thr 160 Ala Pro 170 Gin Gly Ala Ser Ala 175 Phe Pro 185 Arg Gin Pro Ser Glu 190 Gly Ser Ser Thr Ser Cys Ile 205 Leu Glu Ser Leu vai Ala Asp 220 Leu Val Gly Phe Leu Pro Val 235 Thr Lys Ala Glu Met 240 Leu His 250 Cys Phe Pro Glu Ile 255 Phe Gly 265 Vai Phe Gly Ile Asp 270 Val Lys Glu Val Leu Val Thr 285 Cys Leu Gly Leu Asn Gin Ile 300 Met Pro Lys Thr Gly Ile Ala 315 Met Glu Gly Gly His 320 Ala Leu 330 Ser Val Met Glu Val 335 Tyr Asp 345 Glu Pro Arg Lys Leu 350 Leu Thr Gin Glu Tyr Arg Gin 365 Val Pro Asp Ser Trp Gly Pro 380 Arg Ala Leu Ala Glu Tyr Val 395 Ile Lys Val Ser Ala 400 Arg Arg 410 Glu Ala Ala Leu Arg 415 Glu Glu 425 His His His His His 445 430 68 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° : 8

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 1338 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 8: ATGAAAGGGG GAATTGTACA TTCAGACGGC TCTTATCCAA AAGACAAGTT TGAGAAAATC 60 AATGGCACTT GGTACTACTT TGACAGTTCA GGCTATATGC TTGCAGACCG CTGGAGGAAG 120 CACACAGACG GCAACTGGTA CTGGTTCGAC AACTCAGGCG AAATGGCTAC AGGCTGGAAG 180 AAAATCGCTG ATAAGTGGTA CTATTTCAAC GAAGAAGGTG CCATGAAGAC AGGCTGGGTC 240 AAGTACAAGG ACACTTGGTA CTACTTAGAC GCTAAAGAAG GCGCCATGGT ATCAAATGCC 300 TTTATCCAGT CAGCGGACGG AACAGGCTGG TACTACCTCA AACCAGACGG AACACTGGCA 360 GACAGGCCAG AATTGGACAT GGGCTCTCTG GAACAGCGTA GTCTGCACTG CAAGCCTGAG 420 GAAGCCCTTG AGGCCCAACA AGAGGCCCTG GGCCTGGTGT GTGTGCAGGC TGCCACCTCC 480 TCCTCCTCTC CTCTGGTCCT GGGCACCCTG GAGGAGGTGC CCACTGCTGG GTCAACAGAT 540 CCTCCCCAGA GTCCTCAGGG AGCCTCCGCC TTTCCCACTA CCATCAACTT CACTCGACAG 600 AGGCAACCCA GTGAGGGTTC CAGCAGCCGT GAAGAGGAGG GGCCAAGCAC CTCTTGTATC 660 CTGGAGTCCT TGTTCCGAGC AGTAATCACT AAGAAGGTGG CTGATTTGGT TGGTTTTCTG 720 CTCCTCAAAT ATCGAGCCAG GGAGCCAGTC ACAAAGGCAG AAATGCTGGA GAGTGTCATC 780 AAAAATTACA AGCACTGTTT TCCTGAGATC TTCGGCAAAG CCTCTGAGTC CTTGCAGCTG 840 GTCTTTGGCA TTGACGTGAA GGAAGCAGAC CCCACCGGCC ACTCCTATGT CCTTGTCACC 900 TGCCTAGGTC TCTCCTATGA TGGCCTGCTG GGTGATAATC AGATCATGCC CAAGACAGGC 960 TTCCTGATAA TTGTCCTGGT CATGATTGCA ATGGAGGGCG GCCATGCTCC TGAGGAGGAA 1020 ATCTGGGAGG AGCTGAGTGT GATGGAGGTG TATGATGGGA GGGAGCACAG TGCCTATGGG 1080 GAGCCCAGGA AGCTGCTCAC CCAAGATTTG GTGCAGGAAA AGTACCTGGA GTACCGGCAG 1140 GTGCCGGACA GTGATCCCGC ACGCTATGAG TTCCTGTGGG GTCCAAGGGC CCTCGCTGAA 1200 ACCAGCTATG TGAAAGTCCT TGAGTATGTG ATCAAGGTCA GTGCAAGAGT TCGCTTTTTC 1260 TTCCCATCCC TGCGTGAAGC AGCTTTGAGA GAGGAGGAAG AGGGAGTCGG CGGTCATCAC 1320 CATCACCATC ACCATTAA 1338 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° : 9

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 454 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples 69 (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 9:

Met 1 Lys Gly Gly Ile 5 Val His Ser Asp Gly 10 Ser Tyr Pro Lys Asp 15 Lys Phe Glu Lys Ile 20 Asn Gly Thr Trp Tyr 25 Tyr Phe Asp Ser Ser 30 Gly Tyr Met Leu Ala 35 Asp Arg Trp Arg Lys 40 His Thr Asp Gly Asn Trp 45 Tyr Trp Phe Asp 50 Asn Ser Gly Glu Met 55 Ala Thr Gly Trp Lys 60 Lys Ile Ala Asp Lys 65 Trp Tyr Tyr Phe Asn 70 Glu Glu Gly Ala Met 75 Lys Thr Gly Trp Val 80 Lys Tyr Lys Asp Thr 85 Trp Tyr Tyr Leu Asp 90 Ala Lys Glu Gly Ala 95 Met Vai Ser Asn Ala 100 Phe Ile Gin Ser Ala 105 Asp Gly Thr Gly Trp 110 Tyr Tyr Leu Lys Pro 115 ASp Gly Thr Leu Ala 120 Asp Arg Pro Glu Leu Ala 125 Ser Met Leu Asp 130 Met Asp Leu Glu Gin 135 Arg Ser Gin His Cys 140 Lys Pro Glu Glu Gly Leu 145 Glu Ala Arg Gly 150 Glu Ala Leu Gly Leu 155 Val Gly Ala Gin Ala 160 Pro Ala Thr Glu Glu 165 Gin Glu Ala Ala Ser 170 Ser Ser Ser Thr Leu 175 Val Glu Vai Thr Leu 180 Gly Glu Val Pro Ala 185 Ala Glu Ser Pro Asp 190 Pro Pro Gin Ser Pro 195 Gin Gly Ala Ser Ser 200 Leu Pro Thr Thr Met Asn 205 Tyr Pro Leu Trp 210 Ser Gin Ser Tyr Glu 215 Asp Ser Ser Asn Gin 220 Glu Glu Glu Gly Pro 225 Ser Thr Phe Pro Asp 230 Leu Glu Ser Glu Phe 235 Gin Ala Ala Leu Ser 240 Arg Lys Vai Ala Glu 245 Leu Val His Phe Leu 250 Leu Leu Lys Tyr Arg 255 Ala Arg Glu Pro Vai 260 Thr Lys Ala Glu Met 265 Leu Gly Ser Val Val 270 Gly Asn Trp Gin Tyr 275 Phe Phe Pro Val Ile 280 Phe Ser Lys Ala Ser Ser 285 Ser Leu Gin Leu 290 Vai Phe Gly Ile Glu 295 Leu Met Glu Val Asp 300 Pro Ile Gly His Leu 305 Tyr Ile Phe Ala Thr 310 Cys Leu Gly Leu Ser 315 Tyr Asp Gly Leu Leu 320 Gly Asp Asn Gin Ile 325 Met Pro Lys Ala Gly 330 Leu Leu Ile Ile Val 335 Leu Ala Ile Ile Ala 340 Arg Glu Gly Asp Cys 345 Ala Pro Glu Glu Lys 350 Ile Trp Glu Glu Leu 355 Ser Vai Leu Glu Val 360 Phe Glu Gly Arg Glu Asp 365 Ser Ile Leu Gly 370 Asp Pro Lys Lys Leu 375 Leu Thr Gin His Phe 380 Val Gin Glu Asn 70

Tyr Leu Glu Tyr Arg Gin Vai Pro 385 390 Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu 405 Leu His His Met Vai Lys Ile Ser 420 Pro Leu His Glu Trp Vai Leu Arg 435 440 His His HiS His His 450

Gly Ser Asp 395 Pro Ala Cys Tyr Glu 400 Vai Glu 410 Thr Ser Tyr Vai Lys 415 Vai Gly 425 Gly Pro His Ile Ser 430 Tyr Pro Glu Gly Glu Glu Gly Gly His 445 His (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N°: 10

(i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA (A) COMPRIMENTO: 1362 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 10:

ATGAAAGGGG GAATTGTACA TTCAGACGGC AATGGCACTT GGTACTACTT TGACAGTTCA CACACAGACG GCAACTGGTA CTGGTTCGAC AAAATCGCTG ATAAGTGGTA CTATTTCAAC AAGTACAAGG ACACTTGGTA CTACTTAGAC TTTATCCAGT CAGCGGACGG AACAGGCTGG GACAGGCCAG AATTGGCCAG CATGCTGGAC AAGCCTGAAG AAGGCCTTGA GGCCCGAGGA CCTGCTACTG AGGAGCAGGA GGCTGCCTCC GGGGAGGTGC CTGCTGCCGA GTCACCAGAT CTCCCCACTA CCATGAACTA CCCTCTCTGG GAAGAGGAGG GGCCAAGCAC CTTCCCTGAC AGGAAGGTGG CCAAGTTGGT TCATTTTCTG ACAAAGGCAG AAATGCTGGG GAGTGTCGTC TTCAGCAAAG CTTCCGATTC CTTGCAGCTG CCCATCGGCC ACGTGTACAT CTTTGCCACC

TCTTATCCAA AAGACAAGTT TGAGAAAATC GGCTATATGC TTGCAGACCG CTGGAGGAAG AACTCAGGCG AAATGGCTAC AGGCTGGAAG GAAGAAGGTG CCATGAAGAC AGGCTGGGTC GCTAAAGAAG GCGCCATGGT AT CAAATGCC TACTACCTCA AACCAGACGG AACACTGGCA ATGGATCTGG AACAGCGTAG TCAGCACTGC GAGGCCCTGG GCCTGGTGGG TG CGCAGGCT TCCTCTTGTA CTCTAGTTGA AGTCACCCTG CCTCCCCAGA GTCCTCAGGG AGCCTCCAGC AGCCAATCCT ATGAGGACTC CAGCAACCAA CTGGAGTCTG AGTTCCAAGC AGCACTCAGT CTCCTCAAGT ATCGAGCCAG GGAGCCGGTC GGAAATTGGC AGTACTTCTT TCCTGTGATC GTCTTTGGCA TCGAGCTGAT GGAAGTGGAC TGCCTGGGCC TCTCCTACGA TGGCCTGCTG 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 71 GCTGACAATC AGATCATGCC CAAGACAGGC TTCCTGATAA TCATCCTGGC CATAATCGCA 1020 AAAGAGGGCG ACTGTGCCCC TGAGGAGAAA ATCTGGGAGG AGCTGAGTGT GTTAGAGGTG 1080 TTTGAGGGGA GGGAAGACAG TATCTTCGGG GATCCCAAGA AGCTGCTCAC CCAATATTTC 1140 GTGCAGGAAA ACTACCTGGA GTACCGGCAG GTCCCCGGCA GTGATCCTGC ATGCTATGAG 1200 TTCCTGTGGG GTCCAAGGGC CCTCATTGAA ACCAGCTATG TGAAAGTCCT GCACCATATG 1260 GTAAAGATCA GTGGAGGACC TCGCATTTCC TACCCACTCC TGCATGAGTG GGCTTTGAGA 1320 GAGGGGGAAG AGGGCGGTCA TCACCATCAC CATCACCATT AA 1362

Lisboa, 22 de Junho de 2010 72

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a purificação ou produção de uma proteína MAGE, compreendendo reduzir as ligações persulfureto da proteína e bloquear o grupo tiol resultante com um grupo bloqueador e compreendendo ainda um ou mais passos cromatográficos, em que a proteína é solubilizada utilizando um agente caotrópico ou um detergente zwiteriónico.

1 IgG Total lgG1 tgG2a lgG2b IgA IgM PBS 807 405 718 22.8 2.8 33.3 SB AS 2 37 137 0 0 0 19 LPD Mg3His 54-71 1343 332 4540 135 5 ILPO Mq3H/S8AS2 11489 2477 2070 8118 55 46

IgG2a

H*REr! #REF! OíREr! BUREr! H*REF! | *REr!j □ »REr! j Q«REr!: 12/19 Figura 12 NS, ASP MAGE-3 Gly-Gly 7 X His 1 81 3 314 13/19 Figura 13 Construção do plasmídeo pRITI 4426 Vector pTZ18R + cDNA Maaer3 (do Ludwiq Institut - Th BOON)

Nco I Gene de Mage 3 de 942 pb ’ba I

1, 2 : 3 : 4 : 5 4 e 7: peso molecular lote 96K19 revelado com Mab 32 lote 96J22 revelado com Mab 32 lote 96K19 revelado com Mab 54 lote 96J22 revelado com Mab 54 5/19 Figura 5 Linfoproliferação em células de baço

72 h de estimulação com His Mage 3 0,1 pg/mL em pesferas Grupos de ratinho Linha de base de incorporação de 3H timidina (CPM): 0,1 pg/mL em pesferas S1 LipoD Mage 3 His não formulado 1284 S2 LipoD Mage His + SBAS2 679 S3 SBAS2 805 S4 meio 1242 índice de estimulação

S1 S2 S3 S4 Grupo de ratinhos 6/19 Figura 6: Imunogenicidade de MAGE-3- em ratinhos C57 BL/6 Linfoproliferação em células do nódulo linfático 72 h de estimulação com His Mage 3 1 pg/mL em pesferas Grupos de ratinho Linha de base de incorporação de 3H timidina (CPM): 1 pg/mL em pesferas LN1 LipoD Mage 3 His não formulado 47 LN2 LipoD Mage His + SBAS2 1025 LN3 SBAS2 251 LN4 meio 110 índice de estimulação

LN1 LN2 LN3 LN4 Grupo de ratinhos 7/19 Figura 7: IMUNOGENICIDADE DE MAGE3 EM RATINHOS (BalbC) Linfoproliferação em células de baço 72 h de estimulação 0,1 pg/mL His Mage 3 (A) His Mage 3 revestido em pesferas (B) Grupos de ratinho Incorporação de 3H timidina: cpm nenhum 1pg/mL pesferas S1 LipoD Mage 3 His não formulado 1002 1329 S2 LipoD Mage 3 His + SBAS2 1738 4997 S3 SBAS2 1685 3393 S4 meio 1535 1129 A B índice de estimulação

SI S2 S3 S4 Grupo de ratinhos índice de estimulação

2 codòes gly 7 codões de His de terminal-C Bgl II XpL KanR

Aflll Nco I NS1 pRIT14426 -His taii -Xbai 14/19 Figura 14 Mapa do plasmídeo de PRIT14426

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o agente caotrópico é ureia ou cloridrato de guanidínio.

3/19 Figura 3: Construção do plasmídeo pRIT 14477 que expressa a proteína de fusão Prot. D 1/3 —MAGE —3 — cauda His

Fragmento de PCR Ncol GenedeMage3de 942 pb Xbal 7 codões deHis de terminal-C

Kan R Figura 4 Análise de proteína monoclonais Mab32 Mab54 St 4/19 Transferência de Western de LPD-MAGE-3-His Anticorpos Anti-MAGE-3 Mab 32 e Mab 54

3. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o detergente zwiteriónico é Empigen BB-n-dodecil-N,N-dimetilglicina.

4. Processo de acordo com qualquer das reivindicações anteriores, em que o agente bloqueador é um agente alquilante.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que o agente bloqueador é haloácido alfa e/ou haloamida alfa.

6. Procsso de acordo com a reivindicação 4 ou 5, em que o agente bloqueador é um ou mais dos seguintes: ácido iodoacético, iodoacetamida; N-etilmaleimida; cloroacetil fosfato; O-metilisoureia; e acrilonitrilo.

7. Processo de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a proteína compreende um marcador de afinidade. 1

8/19 Figura 8: IMDNOGENICIDADE DE M&GE3 EM RATINHOS (BalbC) Linfoproliferação em células de nódulo linfático popliteal 72 h de estimulação 1 pg/mL His Mage 3 (A) His Mage 3 revestido em pesferas (B) Grupos de ratinho Incorporação de 3H timidina: cpm nenhum Ipg/mL pesferas LN1 LipoD Mage 3 His não formulado 309 386 LN2 LipoD Mage 3 His + SBAS2 438 410 LN3 SBAS2 522 637 LN4 meio 318 399 A B índice de estimulação

LN1 LN2 LN3 LN4 Grupo de ratinhos índice de estimulação

LN1 LN2 LN3 LN4 Grupo de ratinhos 9/19 Anticorpos Anti-Mage3 no soro de ratinhos imunizados com LipoD Mage3 His em SBAS2 ou não Ratinhos BALB C

Ratinhos C57BL/6

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, em que a proteína compreende um marcador de afinidade.

9. Processo de acordo com a reivindicação 7 ou 8, em que a proteína compreendendo um marcador de afinidade, após o passo de bloqueamento, é submetido a cromatografia de afinidade.

10/19 lespIlSiSiilil ratinhos B IgG Total lgG1 lgG2a lgG2b IgA IgM PBS 0 0 0 0 0 0 5BAS2 733 719 378 11 0 0 LPD Mg3 His 6182 2049 2058 1835 0 0 LPD Mq3 H /SBAS2 . 44321 267884 31325 12160 0 0

10. Processo de acordo com a reivindicação 9, em que a cromatografia de afinidade é cromatografia de afinidade de ião metálico (IMAC).

11/19

11. Processo de acordo com a reivindicação 10. em que o ião metálico é seleccionado dos seguintes: zinco, níquel, ferro, magnésio ou cobre.

12. Processo de acordo com a reivindicação 9, 10 ou 11, em que a afinidade cromatográfica é realizada utilizando tampão que contém o detergente zwiteriónico Empigen BB.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a proteína é uma proteína de fusão compreendendo o antigénio MAGE e um parceiro de fusão.

14. Processo de acordo com a reivindicação 13, em que o parceiro de fusão é a proteína D ou o seu fragmento de Haemophilus influenzae B, compreendendo o primeiro 1/3 da proteína D, proteína NS1 de influenza ou um seu fragmento compreendendo os 81 aminoácidos N terminais de NS1, ou LytA de Streptococcus pneumonia ou um seu fragmento, compreendendo os resíduos 188-305 de LytA. 2

15/19 CLYTA ASP-Met-Gly MAGE-1 Gly-Gly- His (7) 1 125 2 308 16/19 Figura 16: construção do plasmideo pRIT 14613 β gai

15. Processo como reivindicado na reivindicação 14, em que o parceiro de fusão é a forma lipidada da proteína D.

16. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 8 a 15, em que a proteína compreende LytA ou um seu fragmento compreendendo os resíduos 188-305, e em que a proteína é purificada por cromatografia de afinidade com a colina ou análogos de colina, tal como DEAE.

17/19 Figura 17: construção do plasmídeo pRIT 14614

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o antigénio MAGE é seleccionado do grupo de MAGE Al, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE AIO, MAGE All, MAGE A12, MAGE Bl, MAGE B2, MAGE B3 e MAGE B4, MAGE Cl, MAGE C2.

18. Processo para a produção de uma vacina, compreendendo os passos de produzir e purificar uma proteína MAGE, através do processo de qualquer das reivindicações 1 a 17 e formulando a proteína resultante como uma vacina. Lisboa, 22 de Junho de 2010 3 1/19 Figura 1: LPD-MAGE-3-His 19 127 2 314 Proteina D -Met-Asp- MAGE-3 -Gly-Gly- His (7x) w Ácido gordo 2/19 Figura 2: Construção do vector de expressão pRIT 14586

18/19 Figura 18 CLYTA Ala-Ser-Met-Leu-Asp MAGE-3 Gly-Gly- HIS (7) 19/19 Figura

19: Construção do plasmídeo pRIT 14646 I. Preparação do módulo de sequência codificante de