HU228467B1 - Tumor-associated antigen derivatives from the mage family, and nucleic acid sequences encoding them, used for the preparation of fusion proteins and of compositions for vaccination - Google Patents

Description

A MAGE-család tumorral összefüggő antigénszármazékai és azokat kódoló nukleinsavszekvenciak,. továbbá ezek. alkalmazása vakcinázásra használható fúziós fehérjék és készítmények előállításában

A találmány tárgyét képezik tumorral összefüggd antigént tartalmazó £ ehérj ^származékok., amelyek alkalmazhatóak rákellenes vakeinaterápiáfoan. Közelebbről, a találmány tárgyát képezik a következő: származékok: olyan fúziós fehérjék, amelyek egy „segítő (helper) T-sejt-epitőpot biztosító íwunolőgiai. fúziós partnerhez, például a Haemcph.ii.ius influenzáé «-bői származó protein-D lipidált formájához fcapcsoiőőó, MAGE-géncealéd által kódolt antigént tartalmaznak; továbbá kémiailag módosított hSAGE-·fehérjék, amelyek esetében az antigén díszülfid-hídjai redukáltak és az Így kapott tiolesöpörtök blokkoltak; valamint affinitást toldalékkal ellátott, genetikailag módos itott és/vagy a disz..:1fzd-hid kialakításának megelőzése céljából genetikailag módosított MAGÉ-fehérjék . A b.GGE-fehér jók tiszti fáséra és egy

Aktaszámunk: 927ő8~3ö72A/őu t ϊ sor rákfajta, többek között, efe nem kizárólag a «elsnoffia, a mellrák, a hőiyagrák, a tüdőrák, a nea kissejtes tüdőrák („NSCLC), a fej és nyak pikkelysejtes rákja, a bélrák és a nyelöcsőrák kezelésére szolgáié vakcinák formulázására szolgáló eljárásokat is feltárunk a leírásban.

A MAGÉ-gáncsaIád által kódolt antigének nagyobbrészt melanomasejteken expresszáródnak, (többek között rosszinöuy latú. meianomák sejtjein) és néhány más rákféle, többed között a nem kissejtes tüdőrák („non smali cell láng cárcinoma „NSCLC), a fej és nyak pikkelysejtes rákja, a hólyag átmeneti sejtes rákja, a nyelőcsőrák sejtjein, de nem mutathatóak ki a normái szövetekben, a herék és a placenta kivételével (Gaugler (1994) ? Weynants .(19.94) ; Patard (1995)}. A MAGE-3 a meianomák áüi-ában kifejeződik [Gaugler (1.994) j, es kimutatható az NSCLC-k 44%-ában (Yoshirfiat.su (198-8)’), a fej és nyak pikkeiysejtes rákja 48%-ában, a hólyag átmeneti sejtes rákjánál 34%-ban, a nyelöcsőrák sváéban, a béirákos esetek 32%-ában és a mellrákos esetek lilában (Van Pel (1995); Inoue (1995); Fujié (199?); Nishimora (1997)j . A MAGE-fehérje expressziójával jellemezhető rákfajtákat MAGÉ-val Összefüggő tumorokként ismerjük.

A humán eredetű meianomasejtek immunogenicitását a melanom.ase j tek és autoiőg limfociták kevert tenyészeteit alkalmazó kísérletben mutatták ki elegáns módon„ Az ilyen tenyészetek gyakran termelnek olyan specifikus citoto.xikus T-limfocitákat („Cin-eket), amelyek kizárólag az: autoiőg melanomasejtek lizísét okozzák, de az autoiőg f ibroblasztokat és az autoiög /SBV-transzformáit 8iimfocitákat nem li2álják [Knuih (1984); Anichini Í19Ö7) ] . Az autolőg melanomsseíleken az ilyen CTL-klonok által felismert antigén körül néhányat sár azonosítottak, többek késet t a MAGE-családba tartozókat.

As első antigént, amelyet as antoióg melanomasejteken a specifikus CTL-ek általi felismerés alapján meghatároztak, Aik2-S~nek nevezték [Van den Eynde (1989)] el, és as azt kódoló gén a MAG-1 [Van dér Bruggen (1991)]. Az HZ2-E ellen irányuló CTL-ek az antoióg, valamint a más betegekből származó M22-E-pozitív melanomasejkeket ismerik fel és lízálják, feltéve, hogy azok a sejtek rendelkeznek a HLA

Ai-ailéi iái .

A MAGE-l a X. kromoszómán lokalizáló-dó és a kódoló szekvenciájukban 64~«5%--os homológiát mutató, közeli rokonságban álló 12 gén, a MAGE--1, MAGE-2, MAGE-3, MAGÉ-4, MAGE5, MAGE-6, MAGE-7, MAGE-8, MAGÉ-9, MAGÉ-10, MA.GE-11, MAGÉ12, gén családjához tartozik [be Piáén (1994)]. Ezeket időnként a MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGS-A4, MAGE-A5., MAGS-A6, MAGE-A7, KA3E-AÖ, MAGE-A9, MAGE-AXO, MAGS-A11. és MAGE-A.12 néven említik (a MAGÉ-A család) . Másik, két fehérjecsoport (a MAGE-A és a MAGE-B) szintén része a MAGÉ-családnak, azonban csak a távolabbi rokonsági szinten. A MAGE-3-csaiádhoz tartozik a MAGE-B1 (MAGÉ Xpl-ként és DAMlö-ként ís ismert), a MAGE-B2 (mint MAGE-Xp2 és DAM-6) , a MAGE-33 és a MAGE-E4 ~ jelenleg a MAGÉ-C-családhoz tartozik a MAGÉ-Cl és a MAGE-C2.. Általános értelemben egy MAGÉfehérjét égy def iniáihatjufc, hogy a fehérje tartalmazza a C-f ermmá 1 is részén .Lokalizált „magszekvencía-szignakúrát •ί * * « (,,core sequence signature} (például a MA.GE-A1. egy 309 aradnosavböl álló fehérje, amelynek magszígn.atürájának s 195279. aminosavak feleinek meg.

A magszignatúra konszenzus-mintázatát igy a következőképp Írhatjuk le, ahol x bármely amínosavat jelképezheti, a kisbetűkkel, jelzett csoportok konzerváltak (konzervatív változatok megengedettek;, és a nagybetűkkel jelölt csoportok tökéletesen konzerváltak.

Magszekvencia-szignatűra

Lixvb (2x> 1 Í3x? G (2x) apESvíWexi (Pxjmí 3-4x) Gxe (3~4x) gxp (2x} üt (3x) VqexYLxixqVPxsxP (ixüCSxiyföFLW'GprAlzxj st (3x) kv

Konzervatív helyettesítések jöl ismertek; ezeket álfáiéban; számitógépes illesztési programok hibaponhozási mátrixai alapján építik be. Ilyen program többek között alvWEóű (Dayhofty M.O. és mtsai. „A model of evoiutlonary changes in proteins, Atlss of Protein sequence and structnre 5 (3) 345-15? szerk.: Dayhoft, M.O. kiad.; National Biomedical Research Foundation, Washington ilöipj]; és a Blosum dd íHenikft, Steven ;s Kenikoft, dórja G., ..Amino acid sonstitution. matricás from protein blocks Proo. háti. Acad. Sci. USA 99 (Biochemistry) : 10915-10319 (1992)].

Általános értelemben az alábbi csoportokon belüli, helyettesítést konzervatív helyettesitésnek, a csoportok közötti helyettesítést nem konzervatív helyettesítésnek tartjuk:

Az aminosavak csoportjai:

1; Aszparaginsav/aszparagio/gintamínsav/glutamin

2; Szerin/freonin

3; Lizin/arginín

4; Fenilalanin/tirczin/tríptofán

5} Lencin/ izoieucin/vaiin/metionin

6}Giiciu/alanin

Általános ér tel erőben _f és a találmánnyal kapcsolatban egy XAGE-í ehér je a fenti „mag-régiót tekintve körülbelül

50%-ban azonos a MAGE-A1 195-279. amínosavával.

A MAGÉ-3-fehérjén azonosítottak néhány CTL-epilöpot. Az egyik ilyen epifcóp, a MAGE-3.A1, a HAGE~s-fehérje 163176. aminosavai között elhelyezkedő nonspeptiö, amely a CTL-ekre specifikus epitöpot alkot, amikor a HLA.Al I. osztályú hLHC-moLekulávai kapcsoltan kerül bemutatásra. Újabban két további CTL-epitépot azonosítottak. a MAoF-3-fehérje peptidszekvenciáján, annak alapján, hogy CTL-választ képes kiváltani meianomasejtek és autológ límfociták kevert tenyészetében. Ez a két epifcóp a HLA.A2-re [Van dér Bruggen Ál 994 j1 és a HLA,B44-re [Hermán {1996}J specifikus kötömotívumokkal rendelkezik.

A találmány tárgyát képezik a MAGÉ-fehérje származékai. Az ilyen származékok alkalmasak egy sor tumorrajta kezelésére szolgáló, terápiás célé vakcinaformulákban történő alkalmazásra.

A találmány egyik megvalósítási módja szerint a származék egy fúziós fehérje, amely heterolog partnerhez kap«·.♦ » esőit ΜΑ-GB-fehérjeosaiádból szánaazó antigént tartalmaz. A fehérjék lehetnek kémiailag konjugálva, azonban előnyösek as olyan rekombináns fúziós fehérjeként expresszált fehérjék, amelyek az adott expressziős rendszerben a nem fúziós fehérjéhez viszonyítva magasabb termelődésí szintet tesznek, lehetővé, tgy a fúziós partner elősegítheti a 'T-helperepitopok, előnyösen az ember által felismerésre kerülő Thelper-epitópok biztosítását (immunológiai fúziós partner), vagy elősegíthetik a fehérje natív rekombináns fehérjéhez viszonyított magasabb szintű expresszióját (expresszién „en'nancer) . Előnyösen a fúziós partner immunológiai fúziós partner és expressziős „.enhancer is.

A találmány előnyös megvalósítási módja szerint a fúziós partner a D-fehérjéből („protein-D), a Gram-negativ nuemophiius influenza B [lásd a WO91/1SS2Ú. számú nemzetközi közzétételi iratot) egyik felszíni fehérjéjéből származik. Előnyösen a D-fehérje származéka megközelítőleg a fehérje első 1/3-át tartalmazza, közelebbről körülbelül az htermlnális első 100-110 aminosavat. Előnyösen a D~fehérje származéka lípidált formában van. Előnyösen a üpoprotein-D tiipidáit D-fehérje) fúziós partner az N-terminálrson helyezkedik el abból a célból, hogy a vakcínajelölt antigént további exogén T-sejt-epitoppal lássuk el és (Így expressziős „enhancer-ként hatást kifejtve) növeljük az expressziös szintet áh ooii-ban. A Irpidvégzödés az antigén antigénprezentáló sejtek felé történő optimális bemutatását biztos ltja.

* ♦

Egy másik fúziós partner többek között as influenzáé influenzavírusból származó Ami, egy nem szerkezeti fehérje (hemaggiut.inin') . Jellemzően az N-terminális 81 aminosavat alkalmazzák, habár különböző fragmensek alkalmazhatóak, amennyiben tartalmaznak Y-heiper-epítopok.

A találmány egy másik megvalósítási módja szerint az immunológiai fúziós partner a ΑΥΤΑ-kéné ismert fehérje. Előnyösen a molekula C-terminális részét alkalmazzuk. A őYTő a otreptococcas pneumoniae-bői származik; ez szintetizál egy N-acetii-L-aianin-amidázt, a <lytA-g.én által kódolt) LYYA-amidázt (Gene 43:265-272 {1986}.], egy olyan aotolizint, amely specifikusan lebont néhány kötést a pepiidoglikán-láncon.. A LYTA-fehérje C-terminális doménje felelős a kői In vagy néhány koiinanalőg, mint a .DEAE iránti affinitásért. Ezt a tuiajdonságat használjuk ki a fúziós fehérjék expresszáiására alkalmas a. coli C-LYTh-t expresszáló piazmid kifejlesztésekor. Közzétették az aminoterminálisukon C-LYTA- fragmenst tartalmazó hibrid fehérjék tisztításának leírását ÍSioTeehnology 10: 795-798 (1992)), A találmány előnyös megvalósítási módja szerint a LYTAmolekula C-terminális részén, a 178. aminosavnái kezdődő ismétlődő részét alkalmazzuk. A találmány különösen előnyös megvalósítási módja szerint a 188-305. csoportokat építjük be.

A fenti immunológiai fúziós partner az expresszié elősegítésében is előnyös. Közelebbről, az ilyen fúziós molekulák a natív, rekomblnáns MAGÉ·· fehérjénél magasabb szinten expresszáiődnak.

Az ilyen konstrukciókról· klinikai körülmények között kimutattuk, hogy alkalmasak a melanoaa kezelésére. Sgy esetben egy IV. stádiumé metánoméban szenvedő beteg áttéteáeitűntek két dózis, adjuvánssai nem kiegészített

Iipo-D- 1 / 3 -MAGÉ- 3·· üis fehérje beadása után.

Ennek megfelelően, a találmány egyik megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezik olyan fúziós fehérjék, amelyek immunológiai fúziós partnerhez kapcsolt, MAGÉ-fehérjecsaiádból származó, tumorral összefüggő antigént tartalmaznak. Előnyösen az immunológiai fúziós partner a proteín-D vagy annak, frsgmense, előnyösebben lipoprotelnDr A MAGÉ-fehérjék előnyösen a MAGE-Al vagy a MAGE-A3. A iipoproiein-P-rész előnyösen tartalmazza a lípoprotein-D első 1/3—át.

A találmány szerinti fehérjéket előnyösen E. coli-bán fejezzük ki, A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a fehérjéket egy olyan affínitásí toldalékkal („tag) ellátva expresssáijak, mint például az 5-9, előnyösen hat hisztídincsoportot tartalmazó hísztidin-vég !„histíöine taii). Ezek hasznosak a tisztítás elősegítésében.

A találmány tárgyát képezi a. találmány tárgyát képező fehérjéket kódoló nukleinsav is. Az ilyen szekvenciákat alkalmas expresszzös vektorba illeszthetjük és alkalmazhatjuk DNS/RdS-vakcinázásban vagy expresszálhatjuk arra alkalmas gazdarendszerben. A nukleinsavat expresszálö mikrobiáiis vektorok alkalmazhatóak vakcinaként. Ilyen vektorok, többek «♦ X y

között, a poxvírus, az adenovírus, az .al favírus, a listeria. és a monarfág.

A találmány szerinti fehérjék DNS-.szekvencíáját megszintetizálhatjuk standard, DNS-szintézisre szolgáló eljárásokkal, mint például a Róberts által leírt enzimatikns ligái ássál [Roherts> D.M. és Kissi., Biochemísfcry 24: S090~ 5098 {1985; jo kémiai szintézissel, in vit.ro e.nz ima tikos polimer izálással, vagy például hőstabil polimerézt alkalmazó PCR-eijárassal, vagy ez előbbi technikák egy kombinációjává I A DNS enzimatikus pollmerízációját végrehajthatjuk ín. vítzo DNS-polimeráz, mint például a DNS-polimeráz-I (Klenow-fragmens) alkalmazásával, a dATP, dCTP, dGTP és dTTP nukleozid-trifoszfátokat tartalmazó·, megfelelő pufférőén, szükség szerint 10-37'X közötti hőmérsékleten, általában 50u.i-es vagy kisebb térfogatban.. A DNSt-fragmentumok enzimatikns ligálását végrehajthatjuk egy DNS-iigáz, például a Ti-DNS-1igaz alkalmazásával, egy megfelelő, például Ό.05 M Trís-t (pH 7.4j, 0.01 M MgCig-t, 0.01 M ditiotreítoit, 1 mM spermidint, 1 mM ATP-t és 0.1 mg/ml. marhaeredet ü szérum&Ibumint tartalmazó pofferben, 4*C és a szobahőmérséklet közötti hőmérsékleten, általában -SOpl-es, vagy kisebb térfogatban.. A DNS-polimer vagy fragmensei kémiai szintézisét végrehajthatjuk hagyományos foszíodiészter-, foszf.it- vagy foszforamidit-kémia.1 eljárásokkal, szilárd fázisú technikák alkalmazásával, amilyenek leírását a „Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments ··· A Laboratory Manual c. kiadványban (szerk.: Gassen, H.G. és

Láng, A. kiad,: Verlag Chemie, Wdnhdm (1982;} vagy Más tudományos közleményekben [például Gaít, M.J., Matth.es,

Síngh, M., Sproat, B.S, és Titmas, R.C. Nucleic Adás Research 10: 8243 (1982) ; Sproat, B.S., Sannwarth, d Tetrahedron Letters, 24:5771 (1983); Matteucci, és

Carufchers, M,H., Tetrahedron Letters 21: 719 (1980);

Mattencci, O és Caruthersg M.H., Journal of the American

Chemical Society 103: 3185 (1981); Adams és mtsai., Journal of the American Chemical Society 105: 561 (1983); Sinha,

h. d .,	Biernat, 81,	McMannus·, J,	és Koester, H., Nucleic
Aci.ds	Research 12:	1539 (1.984);	és Matthes, H.W.D. és
mtsai v	, EMBC Journal	3; 801 (1984)	.1 ,

A találmány tárgyát képező eljárást megvalósíthat juk olyan, hagyományos rekombináns. eljárások alkalmazásával, amelyek Mani.atis írt le [Maniatis és mtsai,, Molecular Cloning ~ A Laboratory Manna1; kiad.; Cold Spring Harhor (1932-1989)] .

Közelebbről az eljárás a követkéső lépéseket tartalmazhat ja :

1) a fehérje vagy egy immunogén származékát kódoló nukleedé-szekvendát tartalmazó DNS-szekvencia expressziéIára alkalmas, replikádéra képes, vagy integrálódó expressziős vektor előállítása;

2) gazdasejt transzformálása a vektorral;

3) a transzformált gazdasejt tenyésztése olyan körülmények kozott, amelyek a DNS-polimernek a fehérje termelése céljából történő expresszióját lehetővé festik;

4) a fehérje kinyerése.

φ » φ φ κ* * «

A „transzformálás .kifejezés alatt idegen, gén gazdasejtbe történő bejuttatását értjük. Ezt végrehajthatjuk például egy alkalmas plazmáddal vagy virális vektorral történő transzformációval, transzéakcióval vagy infekcióval, például a „Gehetic Engineering kiadványban leirt hagyományos .eljárások alkalmazásával {Genetic Sngineering, szerk; Kingsman. S.M., Kingsman A.J. , kiad..: Blackwel.1 Scientific Pofoticatíons, Oxford Anglia í1988}j. A „transzformált vagy „transzformáns kifejezést a továbbiakban az eredményül kapott, a szóban, forgó idegen gént tartalmazó- és expresszáló gazdasejtre alkalmazzuk.

Az expressziós vektorok újak és szintén a találmány tárgyát képezik.

A repükációra képes expressziós vektor előállíthatjuk a találmány szerinti eljárásnak megfelelően, úgy, hogy a gazdasejttel kompatibilis vektort hasítjuk intakt replifconnal rendelkező lineáris DNS-szegmens előállítása céljából, és a lineáris szegmenst egy vagy több olyan DNSmo.leknlával kombináljuk ligálási körülmények között, amely a .lineáris szegmenssel együtt a kívánt terméket kódolja, például a találmány tárgyát képező fehérjét kódoló DNSpolimert, vagy annak származékait.

így a DR8-polimert kialakíthatjuk előzetesen vagy a vektor elkészítésekor, szükség szerint.

A vektor kiválasztását részben a gazdasejt határozza meg, amely lehet proksrióta vagy eukarióta, de előnyösen í. coli vagy CHO-sejt. Alkalmas vektorok, többek között, a

4*4* *4** plazmidok, a bakteriofágok, kozmidok ás rekombináns városok .

A repiikáciöra képes expressziős vektor előállítását végrehajthattok hagyományos eljárásokkal a DNS hasítására alkalmas restrikciós enzimekkel, a polimerizásásra és iigálásra alkalmas enzimekkel például s fentebb idézett, Maníatis által közölt eljárások alkalmazásával,

A rekombináns gazdasejtet előállíthatjuk a találmány tárgyát képező eljárás szerint egy gazdasejtnek a találmány szerinti, repiikáciöra képes expresszi-ős· vektorral transzformálási körülmények között történő transzformálásával. .Alkalmas transzformálási körülmények a hagyományos transz·· formálási körülmények, és leírásuk megtalálható például Maniatis fentebb idézett kiadványában, vagy a ,,.DNA CIoning („DMA Cioning 11. kötet, szerk. : Glover D.M., kiad.; 1F.L

Press Ltd (1985)].

A transzformálási körülmények kiválasztását a gazdasejt határozza meg. így, egy olyan bakteriális gazdasejtet, mint például az Ei coli, kezelhetünk CaCl₃-oldattai (üöhen és mtsai., Proc. Nati. Acad. Sói.,, 69: 2110 (1973)j, vagy RbCl és MnCI_;> keveréket, kálium··acetátot és glicerint tartalmazó oldattal, majd 3- (N-morfoli.no) -propán-szulfonsavat, RbCl-t és glicerint tartalmazó: oldattal. Emlőssejtek tenyészetét transzformálhatjuk a vektor-DNS kalciummal a sejteken történő együttes kicsapásával. A találmány tárgyát képezi a találmány szerinti, repiikaciöra képes expressziós vektorral transzformált gazdasejt is.

A transzformált gazdasejtek tenyésztését a DÚSpolimer expresszié ját megengedő körülmények között hagyományosan például a fent idézett Maníatis es munkatársai kiadványában, és a „DNA. Cloníng kiadványban megtalálható leírás szerint hajtjuk végre. így# előnyösen, a sejteket tápanyaggal látjuk el és 5O'^;‘C~uál alacsonyabb hőmérsékleten tenyésztjük,

A terméket expressziős termék a gazdasejtnek lokalizációjának megfelelően megfelelően és az (intracéllaiáris, vagy a tenyészközegbe vagy a sejt periplazmájába szekretálőöott} nyerjük vissza. így bakteriális gazdasejt, például a. coli esetén a gazdasejtet fizikai·, kémiai vagy enzimatikus lízi.snek vethetjük alá, és a fehérjeterméket izolálhatjuk a kapott lázáramból. Ha a gazdasejt emlőseredetű, a terméket általában, a tápkozegból vagy a sejtmentes krvonatokfoól/extrakfnmekből izolálhatjuk. Hagyományos fehérjsi.zoiálási eljárások többek között a szelektív kicsapás, az abszorpciós kromatográfla és az affinitás! kromatográfla, többek között a monoklonális antitesttel ellátott affinitás! oszlop.

Λ találmány tárgyát képező fehérjéket oldatban, folyadék formában vagy ii.ofilez.ett formában biztosíthatjuk.

Általában elvárható, hogy minden,, emberi alkalmazásra kerülő dózis 1-1000 pg fehérjét, előnyösen 30-300 pg fehérjét tartalmaz.

Szintén a találmány tárgyát képezi a találmány szerinti fehérjét és gyógyászatilag elfogadott excipienst tartalmazó gyógyászati készítmény.

Előnyösen, egy vakcinakészítmény legalább a lipo~ protein-D - MAGE-o-at tartalmazza. Az ilyen vakcina kívánt esetben tartalmazhat egy vagy több, tumorral összefüggő antigént. Például tartalmazhat a MAGÉ és GAGE-családokhoz tartozó más .fehérjéket. Más, alkalmas, tumorral összefüggő antigén többek között a MAGS--1, a GAGE-i vagy a tirozinázfehérjók.

A vakcinaelőálixtás általános leírása megtalálható a „Va.cciné Design c. könyvben [Vaccíne. Design; The subunít and adjnvant approach szerk,: Powell M.F. és Newan M.J., kiad.: Plenum Press, Non York {1995}]. A liposzömákkai történő kapszuiázás Fül .1 értőn az 4 235 877.. sz. amerikai egyesült államokbeli szabadalmi iratban irta le.

A találmány tárgyát képező fehérjék a találmány szerinti vakcinában előnyösen adjuvánssal együtt vannak formuláivá. Alkalmas adjuvánsok többek között aiuminiumsök, mint például az alumíniumhidroxid gél {a.2»m>, vagy az alumínium-foszfát, de lehet egy kalcium-só, vas- vagy cinksó, vagy lehet acetiiált tirozin, vagy acetíláit cukrok, kationos vagy anionos poliszacharid~származékok, vagy polifoszfazének oldhatatlan szuszpenzíőja. Más, ismert adguvánsok többek között a CpG-tartalmú oiigonukleotidok. Az oiigonukleotidokra az jellemző, hogy a CpG-dinnkleotid nem métáiéit. Az ilyen oiigonukleotidok jól ismertek és leírásuk megtalálható például a hO9€/ü25S5. sz. nemzetközi közzétételi iratban.

A találmány szerinti formulában az adjuvánskészítmény előnyösen THl-tipusö. immunválaszt indukál. Alkalmas

χ.-Χ-Χ» adj -uvánsrendszer többek között a monofoszforí 1-l.ipi.d-A, előnyösen a E-dszoxí-aceti Iáit monotoszforil-lipid-A (3S~ b?b) egy almain! umsóva.1 alkotott kombinációja, A CpGoliyonukleotidők szintén előnyösen ?Hl~választ indukálnak.

Egy javított rendszer monofoszforil-iipid-A-t és egy szaponin-származékot, közelebbről a QE21 és a ŐD-KPl-t tartalmazza, ahogy a WGái/00153. sz., nemzetközi közzétételi, iratban vannak feltárva; vagy egy kevésbé reaktcgén készítményt., ahol a QS21 hatását koleszterinnel csillapítják, a

NOS6/33739. sz. nemzetközi közzétételi irat feltárásai szerint .

£gy különösen előnyös adjuvénsformula, amelyet a *4095/17210, sz. nemzetközi közzétételi irat tár fel, magában foglalja a QdGí-t, a ID-fiPi-t és to.kofe.ro.it „olaj a vízben® emulzióban.

A találmány egy megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezz egy vakcina, amely a találmány szerinti fehérjét tartalmazza, előnyösen a iipoprotei.n-D (vagy származékai) - MAGÉ-3 kombinációt, amelyet egy monofoszforiilipid-A adguvánssai egészítettünk ki.

Előnyösen a vakcina ráadásai tartalmaz egy szaponint, előnyösebben a QS2l~et.

Előnyösen a formula ráadásul tartalmaz egy „olaj a vízben' emulziót és tokoferolt. A találmány tárgyát képezi, egy vakcínaformulázási eljárás is, amely tartalmazza a találmány szerinti fehérje és egy győgyászatilag elfogadott excipiens, mint például a 3D-MPL összekeverésének lépését.

« * «‘Ό

- 16 A találmány egyik szempontja szerint a találmány tárgyát képezi rekombináns eljárással előállított MAGÉ-fehérje tisztítására szolgáié eljárás. Az eljárás tartalmazza a fehérje szolubilizálását, például egy erős „kaotroplkus anyagban (denaturálós-zerben, például karbamídbsn, guanidium-hidrokloridban), vagy egy iker ionos detergensben {Eísplgen BB : n-dodecil~N,Ndimet.il-gl.icin} _f a fehérje intramolekuiáris vagy infcermolekuláris dlszuifíd-hldjainak redukálását, a kapott elölök .blokkolását a. diszulfid-hidak oxidatív összekapcsolódásának megelőzése céljából, és egy vagy több kromatográfiás lépést.

Előnyösen a blokkolószer egy alkilálószer. Ilyen blokkoló-szer többek között, de nem kizárólag az alfahalogénezett savak és az .alfa-halogénezett amidok. Például a jődecetsav és a jódacetamid, amelyek alkalmazása a fehérje karboximetilálását vagy ka-rboxiamidálását Ckarbamldometilálás-at; eredményezi. Alkalmazhatóak más blokkolószerek, ezek leírását megtaláljuk az szakirodalomban [lásd például „The Proteins ΙΪ. kötet, szerk: Neurath H„, Hi.il R.L. és Boeder C-l., kiad. Academic Press jl9?6|, vagy .„Chemical Peagents fór Protein modifieation 1, kötet, szerk.: Lnnőbiad R.L. és Noyes C.PC, kiad.: CRC Press 11935} } . Ilyen, biokkoiészerekre jellemző példa többek között az N-etil-maleimid, a kloroaeetii-foszfát,. az O-neti.lIzo-karbamid, és az akrilonitrí1. A biokkolöszerek alkalmazása előnyös , mivel megelőzi a termék aggregációját, és a tisztítás következő lépéseinél stabilitást biztosit, » * ♦ »

A találmány egy jraegvalósításl módja. szerint a blokkolászer úgy választjuk ki, hegy stabil, kovalens és irreverzibilis származékok (például alfa-halogénezett savak és az alfa-halogénezett amidok? keletkezését indukálják. A biokkoiöszereket azonban kiválaszthatjuk úgy is, hogy a tisztítás után eltávolítható legyen a származékot nem képező fehérje felszabad!fása céljából.

A találmány egy szempontja szerint a szabad tiolcsoportjai által származékot képező MAGÉ-fehérjék újdonságot képeznek és a találmány előnyös megvalósítási módjába tartoznak.

A találmány egyik előnyös megvalósítási módja szerint a találmány tárgyát képezi affinitás! toldalék, például a C11TA vagy egy políhisztídin-vég. Ebben ez esetben a blokkolási lépés után a fehérjét affinitásé kromatográfiának vetjük alá. Polihisztidin-véggel, ellátott fehérjék esetében végrehajthatunk immobilizáit fémiont alkalmazó affinitás.!, kromatográflát (IMAC), A fémion lehet bármely alkalmas ion, például cink, nikkel, vas, magnézium vagy réz, azonban előnyösen cink vagy nikkel. Az IMAC-puffér előnyösen tartalmaz egy ikerionos detergensfc, mint például az .Smpigen SB, mivel ez a végtermék alacsonyabb endotoxínszintjét eredményezi.

Ha a fehérjét a Clyfca-résszel kiegészítve állítjuk elő, a fehérjét megtisztíthatjuk a kőiin vagy a kelinanalógok, mint a BEÁS irányában mutatott affinitás kiaknázásával. A találmány egyik megvalósítási módja szerint a fehérjéket polihisztidin-véggel és egy Clyte-résszel látjuk **« Φ ” 18

Φ χ « el. Ezeket egy egyszerűi kétlépéses affinitás! kromatográfiás eljárás alkalmazásával megtisztíthatjuk.

Az alábbi példák felhasználásával a találmány további, részletes leírását adjak;

I.Példa

A.........lípoprotein-D-HAGS-3-Hls(EPD1/3-MAGE-3-H1s vagy......LpD

MAGE-3-His) .fűziós fehérjét expresszálé rekombináns E, col!

törzs előállítósa

1. az .£, coli-eredetű expressziós rendszer

A Iipoprotein-D előállítására. a profcein-D~fc kódoló:

bbS-t a pM3-Sb expresszios vektorba klónoztak. Ez a plazmád iamhda-tágból szármázd szignált alkalmazza a beillesztett idegen gének transzkripciója és transzlációja vezérlésére. Ez a vektor tartalmazza a PL-lambda eredetű Fb~promötert, az Os-operátort és két alkalmazási í„atiiizatíorb ? helyet ;bat.ó és MatA) a transzkripciós polaritás! hatások csökkentése céljából az N-· fehérje esetében (Gross és mtsai.. Mól, δ Coll. Elő.!, 5: 1015 (1985)}. A Pf-promótert tartalmazó vektorokat egy E. coli lizogén gazdába visszük a plazmidDNS stabilizálása céljából. A lizogén gazdatörzsek a gorombán integrálódott, repiikácíós képességében hiányos lamhdafág-DNS-t tartalmaznak [ Shat mán és másai., Experimemtai Manípslation of Gene Expr asszon1-14. szerk,: Inoaya kiad- Academic Press NY (1983)1. A lambdafág-DbS irányítja a ol-represszorfehérje szintézisét, amely az vektor öl-reprasszorához kötődik és megakadályozza az PNS-polimeráz kötődését a Pi-promóterhez, így a beérni·- 19 - .....

tett gén transzkripcióját is. Az APöö exeresszios törzs cígénje egy, hőmérsékletre érzékeny mutációt tartalmaz, Így a PL által irányított transzkripciót a hőmérséklet emelésével szabályozhatjuk, azaz a tenyészet hőmérsékletének emelése inaktiválj'a a reptesszort és az idegen fehérje szintézise megkezdődik. Ez az expressxiós rendszer lehetővé teszi különösen az olyan idegen fehérjék szabályozott szintézisét, amelyek toxikusát lehetnek a sejt számára {Shimataka és Rosenberg, Natúré 292: Í2S iL9<UH

2. Az AE.5S-&S E. coll törzs

Az APE-.MáőE-3-Ei s fehérje előállítására alkalmazott AROS-as üregén E. coli törzs a standard ΕΤΗ E. coli-törzs EPH-es leszármazottja {F- Su- GaiK2, iaoá- ?hr~). Tartalmaz egy detektív iizogén lambda-fágot ígaiE: :TN'lö, 1 Kíl- cl.857 DH1) A ATI- fenotipus megakadályozza a gazdasejt makromolekula-szintézisének kikapcsolását. A cTH57 mutáció a clrepresszorsak a hőmérséklet emelésére érzékeny kikapcsolódási képességet ad. A THl-deléoiö eltávolítja a lamhda-fág jobb oldali operonját és a gazdasejt bio-, avrJ- és chiAlótuszát. Az AE.5E-vonalakat ar Aáá olyan P-lambdafág vonallal történő transzdukciőjávai állítottuk elő, amely fáget előzőleg SA5öé-bói származó törzsön (GaiE:;TN10, 1 Kilc.T.857 DH.U növesztettünk. A de£aktív iizogént beépülve tartalmazd Aíáá-et a szomszédos gaiE-génjén tetraciiinrezisztenciát kódoló íAIu-transzpozon jelenléte alapján, tetraciklinnel szelektáltuk. Az Hááés az SA5PÖ a Dr. Martin φ «ΦΦ*

Ro seribe rg Na t. ion a i Instituted of Health laboratóriumából származó KI2 coli -törzsekből származnak.

3._____Az LP'D -MAGRB-3-Hls rekomblnans £ ehérje exp r e s s z ió j ár a tervezett vektor szerkesztése

Elgondolásunk az volt, hogy a MAGE-3-at fúziós fehérjeként úgy fejezzük ki, hogy a lipidált protein-D N~ terminális harmadát alkalmazzuk fúziós partnerként a MAGÉ N-termínálisára kapcsolva és néhány hisztidíncsoportot helyezünk a C-terminálisra.

A protein-D egy lipoprotein (egy 42 kDa méretű immungiobuiin-D-köfcö fehérje, a Gram-negativ Kaemophyius influe/52«e félsz inén) . A fehérje egy 18 ami no sav-csoportból álló, a bakteriális lipoprotein számára konszenzus szekvenciát tartalmazó szignálszekvenciával ellátott prekurzűrként szint-etizálódik [WOSI/18928. számú nemzetközi közzétételi irat]

A szekréció során a lipoprotein szígnálszekvenciáj-a processzálódik, és ekkor a (prekurzormolekula 19. pozíciójában található) císztein válik az amino-terminális végcsoporttá, és ennek következtében módosul; zsírsavak kapcsolódnak kovalens észtérkötéssel és amidkötássei is.

Az amino-terminális ciszteincsoporlhoz kapcsolódó zsírsavak -ezután membrénhorgonyként fejtik ki hatásukat.

A fúziós fehérjét, expresszálö plazmídot úgy terveztük, hogy az általa expres-szált pfekurzor fehérje tartalmazza; a processzált protein~.D 18-ami nos a vas szignálszekvoreiáját és első Löt csoportját; két, nem rokon aoinoeavat (Met és Aspk, a MAGE-3 2-314. csoportjait, csuklórégióként működő két Gly-csoportot (a későbbi hét His-csoport exponálása céljából).

A rekombináns törzs Így a processzált, lípidált, Hisvéggel ellátott, 432 aminosav hosszúságú fúziós fehérjét (lásd. 1. ábra) állítja elő, amelynek aminosav-szekvenciáját az 1. azonosítószámú szekvencia (ezentúl a. sz.), kódoló szekvenciáját a 2. a. sz, írja. ie.

.. A.z LPD-MAGE -3-Hls fúzió s fenő r j e előál látás ának klőnozási stratégiája (a EAffi4477-vektor)

A MAGÉ™3-gén kódoló szekvenciáját (Gaugler B. és mtsai. (1994)] tartalmazó cDMS-plazmidot (a „Lu.őwig institnte-ról Dr. Thierry Boon bocsátotta rendelkezésünkre) és a Lipo-D-1/3 kódoló szekvenciájának h-terminális részét tartalmazó BAJT 145Se-vektort (előállítását a 2. ábrán vázoltuk) alkalmaztuk. A. klónozási stratégia a következő lépésekből áll (3. ábra):

a) á MAGÉ-3-cDN3-plaznd.dban jelen levő szekvenciák ECE alkalmazásával történő ampiifikálása az : 5' go geo atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cet „szent oiigcnnkleotíd és az 5' gcg tet aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc geo ctc tte ccc ctc tet caa „antiszenz oligonukleotidok alkalmazásával; ez az amplífikálás az K~ terminálison a következő módosításokhoz vezet; az első öt kodon cseréje az A. coli által használt kodonra, az 1. pozícióban az Ero-kodonjának cseréje Asp-kodonra, az 5*--végen '*·> ·*γ egy NcoA-hely beillesztése, és végül a -C~-terminálison 2 Gly-kodon és a His-kodon, majd egy Xbal-hely hozzáadása.

b) A fentiek szerint amplifikált fragmens klónozása a AA-klőnozö vektorba. (Jhviüregen) és az intermedier ρϊ?1Πdód /-vektor előállítása .

c} A Aco.f Xba i'-f ragstens kivágása a pAJTI 454 7piazmidból és a ρΑΙΤ 1.4586“ vektorba történő klónozása.

d) az ARS8- gazda törzs transzformációja.

e) A ρΑΓΤ i4477-pIazmidot tartalmazó, az őcö-MéGA-5Kis fúziós fehérjét expresszáló transzformáns A. colitörzsek szelekciója és jellemzése.

II. Példa

Az LFD1/3 - MAGE3~nls antigén előállítása:

1. Bakteriális törzs növesztése és indukciói-a - az LPD1/3MAGS- 3- ü 1 s expresszi.ója

A pAl'T? 4477-piazmiddal transzformáit sejteket 2 literes, 100 ml, élesztőki vonattal (0.4 g/I) és kanamiclnszulfáttal {dö mg/m.1} kiegészített IdbA-es tenyészközeget tartalmazó edényekben szaporítottuk. Rázóasztalon, 3'0°C-on Sri órás inkubálás után egy kevés mintát kivettünk minden edényből mikroszkópos vizsgálat céljára. A két edény tartalmát összegyűjtöttük 20 literes termentor számára oltóanyag biztosítása céljából.

Az oltóanyagot (300 ml) előre sterilizált 20 liter (össztérfogatú), '? liter, 50 rng/1 kanamícin-sznlfáttal kiegészített tenyészközeget tartalmazó fermentorba tettük.. A ph-t t.é-ra állítottuk be és ezen az értéken tartottuk

NH^GH :25¾ ν/ν) periodikus hozzáadásával, és a hőmérsékletet 30C-ra állítottuk be és ezen az értéken, tartottuk, A levegő átáramol tatást sebességet 12 liter levegő/perc~re állítottuk be és ezen as értéken tartottuk; az oldott oxigén tenxlóját 50%-os értékre állítottuk és ezen az értéken, tartottak a rázást sebesség visszacsatoiásos szabályozása, által* A fermentorban uralkodó túlnyomást 500 g/czó-es (0,5 bar) értéken tartottuk.

A „fed-bafcch (szakaszos rátápláiásos) tenyésztést egy szénforrásként szolgáló oldat szabályozott adagolásával hajtottuk végre. A tápoidatot 0.04 ml/perces kezdeti sebességgel adagoltuk, majd a mennyiséget az első 42 órában exponenciálisan növeltük 0.1h'^E növekedési sebesség fenntartása céljából.

óra elteltével a termentorhömársékbecet gyorsan ze^C-ra emeltük, és az adagolási sebességet 0.005 ml/perc/g száraz sej ttömeg („DCkö) sebességen állandósítottuk az indukciós fázisban további 22-23 órán át, ez alatt az LFSMA.GE-3~H.is extraceliuláris expressz í.ö ja maximális szintet ért el.

A baktérinmtenyészetböl a növekedési és az indukciós fázisokban, és a fermentáció végén szabályos időközönként aliguot mennyiségű (15 ml) mintákat vettünk a mikrobíáiis növekedés és az extraceliuláris termék expressziéja kinetikájának követése céljából, ezen kívül a mlkrobtáiís azonosítási és tisztasági tesztekhez minták biztosítása céljáA fermentáció végén & tenyészet optikai denzitása 80120 (4« és 72 g DCW/1 sej fckoncentráciőnak megfelelő), és a teljes folyadéktérfogat körülbelül 12 liter volt. A tenyészetet gyorsan 6-I0°C-ra hűtöttük, és az sCKő2-sejteket a tenyészt olvadéktól centrif ugatással (SOOuxg, 4®C, 30 perc) választottuk el. A koncentrált £őA32-sejteket gyorsan műanyag zsákokba tettük és azonnal -Sö^C-on lefagyasztottuk,

2. A fehérje extrakciőja

A fagyasztott 2Ck22~ sejfckoncentratamot 4‘X'-on felolvasztottak, majd sejtzúzó pufserben 60~as végső optikai denzitést biztosító (megközelítőleg' 36 g DCh/1 sejtkoncentrációnak megfelelő) koncentrációban felszuszpendáituk.

A sejteket kétszeri, nagynyomású homogén!sátoron történő átbocsátásával összezúztuk, A zúzott sejtszuszpenzröt centrifugál tűk (lOOOOxg thc-on, ŐGperc) és az üledékerakcíöt kétszer mostuk ?ritonX-10ü (1% w/v> és EDTA (1 mM) oldatával, majd 7ween-2ú (0.1% v/v) oldattal kiegészített, foszfáttal puffero.lt sóoidafctai fPBS) és végül FSS-sei. A mosási lépések között a szuszpenzíot minden esetben centrifugáltuk <10 000 x g, 30 perc, 4*Cj, a felülúszót kiöntöttük és az üledékfrakciót megtartottuk.

111. Példa

A nlpo-D-MAGE-3 fúziós fehérje jellemzése

- fisztitás

Az LPD-MAGE-3~üis fehérjét a sejtnomogenizátűmből az alábbi lépések egy sorozatával tisztítottak;

a) A sejtzúzásból származó mosott üledékfrakciő szolubilizálása,

b) A fehérjén belüli és a fehérjék közötti diszulfidkötések kémiai redukciója , ma.jdl a tiolcaoportok blokkolása oxidativ összekapcsolódásuk megelőzése céljából, cl A reakeióelegy míkrofíltrálása a szemcsék eltávolítása céljából és az endetoxinok redukciója,

d) Az LPD~MAGE~3~His elkülönítése és elsődleges tisztítása (,,captűre, befogás) a polihísztidin-vég és a cinkkel feltöltött kelátképző ,, Chef a fing'·'' Sepharcse közötti affinitás 1 kölcsönhatás kiaknázásával,

e) A szennyező fehérjék eltávolítása anioncserélő kromafcográfla alkalmazásával..

A tisztított LpD-MAGE-3-Hís fehérjét egy sor végső tisztítási lépésnek vetettük alá:

f) Puffercsere és a karbamid. eltávolítása gélszaresi. („size-exclnsiord ) kromatográfiával Superdex 75 alkalmazásával ,

g) Eljárás közbeni szűrés,

H) Puffercsere és sóéitávolítás méretkizárásí gélszűrési kromatografiával Sephadex S25 alkalmazásával.

A fenti lépések mindegyikét részletesebben leírjuk az alábbiakban :

1.1) A sejfchomogsnisatum-üledék szolubilizálása:

A végső mosási lépésből {lásd fentebb) származó üleöékfrakcíőt egy éjszakán át 300 ml·, guanidin-hidrokioridot (6M), nátrium-foszfátot (0.1 M, pH 7.0) tartalmazó oldattal

4^!:'C-on reszciubilizáltuk.

* *» * «'4»«

- 26 ~ ’

1.2) .Redukció és karbox.í-metíiáiás

A ssoíubilizálfc anyagon (halványsárga, zavaros oldat) argont áramoltatunk át a maradék oxigén eltávolítása céljából, és 2-martapto-etanol törzsoidatáhól (14 M) 2-merkaptoetenoit adtunk 4.3 M végkoncenfráclőig (0.44 ml 2-msrkapto™ etanol/.ml oldat).

A kapott oldatot szétosztottuk. és két üvegedénybe tettük, amelyeket 9S^:'C~ra hevítettünk vízfürdőn. 15 perces 95^cC-os kezelés után az edényeket a vízfürdőről levettük és hűlni hagytuk, majd a tartalmukat lombikba (5 1) öntöttük, fóliával lezártuk, jégre helyeztük, és szilárd jddacetamidót adtunk hozzá erőteljes rázás közben , SM végkoncentrációig (1.11 g jődacetamid/mi oldat). A keveréket 1 érán át jégen, sötétben tartottuk, a jódacetamid teljes oldódásának biztosítására, majd semlegesítettük (továbbra is erőteljesen rázva és a pH-t ellenőrizve) megközelítőleg I

1.1 tér nátrium-hidroxid (5M) hozzáadásával, 7.5-7.8 végső pH eléréséig.

A kapott keveréket jégen, sötétben tartottuk további 30 percen át, ezután a pH-fc újra 7.5-7.»' értékre állítottuk .

1.3) Mí.krofiltrálás

A keveréket Amícom Profiex tangenciális áramlásé, Mírd..k.rö.s üreges szálbetéttel (hollow fibre cartridge* . referenciaszám; M22M-€00-01N; felszíne; 5.6 ctt, 0.2 pm) felszerelt egységben mikroí1 bírálásnak vetettük alá. Az átfolyó frakciót a következő kromatográfiás tisztítás céljaira megőriztük.

y ff X ff ff ff * ff

1.4) Féia-kelát (zn^2>} -kromatográfia UW)

A fém-keiát. kromatográfiát egy SPG LOD/dOö oszlopba • Pharmacia Síofecóroiouy, Cat. do. 18-1103-01} töltött kelátképző Cheíating Gepharose FF (Féarmacía BíotechnoJogy, Gat. do. 17-0575-01} alkalmazásával hajtottuk végre. A töltet paraméterei: 10 cm átmérő, keresztmetszet: 79 erő, tőitetmagasság, 13 os, töltettéríogat: 1500 mi. Az üres oszlopot }0.5 d) nátrlum-nidroxíödal sterilizáltuk és tisztított vízzel mostuk.

A (20% v/v elánéiban leszállított és tárolt töltetet tisztítási lépésnek alávetett vízzel mostuk (8 liter) Bucéner-tölcséren (vákuum alatt) és legalább 15 liter ZnCl;;-oldattai (0.1 M} történő átmosással cinkkel féltőitől tűk. A cink feleslegét ágy távolitottuk el, hogy a töltetet 10 liter tisztítási lépésnek alávetett vízzel mostuk addig, mig a átfolyó folyadék pH-ja el nem érte a r SnCljoldat pH-ját (pH 5.0}. A töltetet ezután 4 liter guanidinhidrofcieridot (6 H) és nátrium-fos z.fétet (0.1 d, pH 7,0} tartalmazó oldattal equílibréltuk.

A mikrofiltrálás LPD-.MA.GE~3-His-1 tartalmazó szűrletét összekevertük a töltettel („batetd kötés}, azután a BPG-oszicpba töltöttük és pakoltuk a guanidin-hltíroklcridot (8 M) és nátrium-foszfátot (0,1 M, pH 7.0} tartalmazó oldattal együtt.

A fém-keiát kromatográf 1 a. következő lépesét az elaens 60 ml/perces áramlási sebessége mellett hajtottuk végre. Az oszlopot először guauidin-hídrokloridot (6 d; és nátriumfoszfátot (0.1 M, pH 7.0} tartalmazó oldattal, azután kar»«'*·»

- 28 - ‘ ·♦’ ^x feamidot (6 M)^: és nátrium-foszfátot (0.1 M, pH 7.0} tartalmazó oldattal mostuk, mig az. eluens abszorbaneiája (QDsmJ & 0 értéket (alapvonal· eléri.

A féltisztaságú LPD-MAGE-3-Hís fehérjefrakciöt 2 őszloptérfogat mennyiségű/ karbamidot (6 Mj nátrium-foszfátot (0,1 M, pH 7.0}és imidazolt tartalmazó oldattal eluáltuk, A frakció vezetőképessége megközelítőleg 16 mS/crn volt.

1.5. Anioncserélő kromatográfia

Az a.nioncserélő kromatográfiás lépés előtt a féltí-sztaságá LPP-MAGE-3-His f. ehér j «frakció vezetőképességét 4 mS/cm-re csökkentettük karbamidot (6 és Trís-HCl-t ·20 roM pH 0.0; tartalmazó oldattal történő hígítással.

Az anioncserélő kromatográfiai BOG 200/500 oszlopba (űharmaoia Alotacbnology, Cat. HP, 18-1103-11} pakolt <}Seonarose FF (Pharriucía Hioteeánology, Gat. Hő. 17-0518-22} alkalmazásával hajtottuk végre. A pakolt oszlop paraméterei; 10 cm átmérő, keresztmetszet: 314 ezt, töltetmagasság: 9 cm, föl tettéi fogat; 2900 ml.

Az oszlopot pakoltuk (20% v/v etanollal} és 9 liter tisztítási lépésnek alávetett vízzel 70 ml/perces elúciós áramlási sebességgel. A pakolt oszlopot 3 liter nátríumhidroxíddal (0.5 M) sterilizáltuk, mostuk 30 liter tisztítási lépésnek alávetett vízzel, ezután 6 liter, karbamidot (€M) és Tris-HCi-t (20 ®M, pH 8.0} tartalmazó oldattal equilibráltuk, A hígított, féltisztaságú LPD-MAGE-3-His fehérjét az oszlopra töltöttük és 9 liter, karbamidot (6fí) ins-HCi-t (20 mH, pH 8.0·, SDTA-t (ImM) és Tweer;-t (0. Iái tartalmazó oldattal mostuk, addig, míg az eiuens abszorbancíája (280 nm~en mérve) ü~ra csökkent.

Egy további mosási lépést baj tettunk végre 6 liter, karbamidot (nd) Tris-HCi-t (20 md, pH 8.0) tartalmazó olH 25 t t~ ,2« Ί lk tisztított LPD-MAGE-3-His fehérjét az oszlopról karbamidot (Obi Tris-HCl-t (20 mM, pH 8.0} és NaCI-t (0.25

M) tartalmazó oldattal eiuáltuk.

1,6) Géiszörési. kromatográfla

A tisztított LPD-MAGE-3-Ηίs fehér g©oldatból mind a. karbamid el távolítását, mind a puftorcserét méretkizárási kromatográfia alkalmazásával valósítottuk meg. Szt egy Xk Sö/iöö (Pharmacia Bíotee.ánoiagy Cat. Ho. 18-87 53-01} oszlopba töltött Suderpdex 75 (Pharmacia Bíocechnology Cat. No. 17--1044-81} alkalmazásával hajtottuk végre. A pakolt oszlop paraméterei: 5 cm. átmérő, 19.6 cat keresztmetszet, toltstmagasság: 90 cm, töitettérfogat: 1.8ΌΌ ml.

Az oszlopot etanollal (20%) pakoltuk és 5 liter tisztított vízzel mostuk 20 ad./perces átfolyási sebességgel. Az oszlopot 2 liter nátríuim-hldroxidda.l (0.5 M) sterilizáltuk, mostuk 5 liter tisztítási lépésnek alávetett vízzel és 5

liter, Tween-80-at	tartalmazó (0.1%	v/v) ,	foszfáttal
pufferoit sóoldattal	equ.il ábrái tűk.
A tisztított	EPD-MAGA-3~His	frakciót	(maximum
500 ml-t sömentesité	sí lépésenként) az	oszlopra	töltöttünk

az eiuens 20 ml/perces áramlási sebessége mellett. A sómentes ített, tisztított LPD-dAGE-3~-His fehérjét 3 liter.

- Οί

Tween-80-at tartalmazó (0.1% v/vi PBS-sel eiuáituk az oszlopról .

Az LFD-MAGE- 3-Hi.s fehérjét tartalmazó frakciót az oszlopról a kizárási („veid) térfogatnál eiuáituk.

1.7) Eljárás közbeni (,,ín process} szűrés

A méretkizárási kromatográfiás lépés után a nagy térfogatú LPD-MAGE-3~His frakciót egy 0.22 nm meiabrénon egy lamináris áramlásü fülke alatt szűrtük (10 000-es osztály) . A szűrt anyagot -SO'c-on fagyasztottuk és a sómentesítési lépésig igy tároltuk.

1.8} Sőmentesírési kromatografia

Mivel a végtermék ozmolaiitása maximum éOOmOsM lehet, egy további puffercserélési lépésre volt szükség a sökoncentráció csökkentése céljából. Ezt egy APG iéo/áSO oszlopba (Pharmacia Siotechzj;ciog.y Cat. No. 18-1103-03} töltött Sepéadex G-25 (Pharmacia Biotechnology Cat. No. 170033-02} alkalmazásával hajtottuk végre. A pakolt oszlop paraméterei: lö cm átmérő, 78.6 cat keresztmetszet, töltetmagasság: 85 cm, tói tettérfogat: 6.500 ml.

A Sephaőex G25-öt 7 liter tisztítási lépésnek alávetett vízzel hidráitűk és egy éjszakán át duzzasztottük 4°C~ en. A gélt ezután tisztított vízzel, 100 ml/perces áramlási sebességgel oszlopba töltöttük.

A.z oszlopot 6 liter nátrinm-hidroxiddal (0.5 M) sterilizáltuk, ezután 10 liter, nátrium-foszfátot (10 mM, 6.3} MaCl-t (20 mM) és Twenn-80-at (0.1%, v./v) tartalmazó oldattal egvrIzóráitok.

~ 3 #« * *

A. tisztított LFD-MAGE- 3-Kis frakciót (maximum SÖO mi-t sőmentesitési lépésenként; az oszlopra töltöttünk az eluens 100 mi/perces áramlási sebessége mellett. A sóment esi tett, tisztított bPD-MAGE-3~Kis fehérjét tartalmazó frakciót az oszlopról a kizárási („voió) térfogatnál eluáltuk, és sterilre szűrtük egy 0.22 pm pórusméretű membránon és -S-O^C-on tároltuk..

A végső, nagy térfogatai fehérjét t4^aC-on felolvasztottuk, majd fiolákban szétosztottuk és laktóz excipíenssei (3.2%) együtt fagyasztva-száritásí lépésnek vetettük alá.

2. _Cöomassie-velfestett SDS-poiiakrί 1 -amid gálánál ί z í s

Az LPD-MAGE-3-Hís tisztított antigént SGS-PAGS analízisnek vetettük alá 12.5 f-os akrilamid-géien, redukáló kör ü iménye k között.

A fehérjét Coomassie blue-val festett gélre 50 pg, ezüstültráttai festett gélre 5 pg mennyiségben vittük fel.

A ö6KI9--es klinikai mintái és a 6o22-es kísérleti mintát analizáltuk, Egy fö, SO kba molekulatömeghez tartozó sávot jelenítettünk meg. Két további, .körülbelül 45 kba és 35 kDa molekulatömegü anyaghoz tartozó kisebb sáv is látható volt.

3. Wesfe.rn~bl.o-t analízis

A SDS-PAGE. alkalmazásával kimutatott LFD-MAGE-3-Hispeptidoket monoklonális egér-antitestekkel Western---biot alkalmazásával mutattuk ki. Ezeket az antitesteket házon beiül állítottuk elő a AAGE~3~His fehérje egy tisztított pre- 32 ~ :

pár át urnával (er a fehérje nem tartalmazta az LPD-MAGE-z-ní s LPD--részét; „

Két monokionális antitest-preparátumot (MAS-22 és Mab-54) választottunk ii a $estern~blot-analízis céljaira való alkalmasságuk alapján és nagy mennyiségű mintára tervezett („lót raiease; azonosítási tesztben alkalmaztuk. A

4. ábra a P6A1P és a áőoi’P minták 32-es és 54-e.s monokionális antitesttel festett sáwdntázaiát mutatja be. 600 no fehérjét választottunk el egy 12.5%-os SDS-PAGE alkalmazásával, nylon, membránra vittük, 32-es és 54-es monokionális antitesttel kezeltük {60 ng/ml) és pewxi.dázzai kapcsolt, egére! leni antitest tel hívtuk, alő.

Az SDS-PAGE által detektált 60 kba-os és 30 kDA-os peptidet mindkét monokionális antitest azonosította.

XV. Példa r>Vakcinaelőáiiltás az hPD-MAGS-3-His fehérje alkalmazásával

A kísérletekben alkalmazott vakcinát a lípoprotein-b LPDl/3-MAGS-3-His fehérjét kódoló rekombrnáns DdS-ből előállított, A, coli AA52-tör zseben expresszélt fehérjével állítottuk elő, adjuvánssai vagy anélkül. Adjuvánsként ezek a formulák 3-dezoxi-aoetilált wnofoszforil-A-t (3-D-MPL-t) és <122!-et tartalmaztak, „olaj a vízben típusú emulzióban. Az SBAG2 adjuvánsrendszert már leírták a WG95/17210. számú nemzetközi közzétételi iratban.

φ * » *

3D-MPL: a Sa.toonei2a minnesota Gram-negatív baktérium lipopoliszacharidjából származó iinmunstimuláns. Az MPL· dexaciiáifc, és hiányzik egy foszfát csoport a lipid-A részéről, Ez a kémiai kezelés dráxtaí mértékben csökkenti a fcoxicitását, mig az ir«mun stimuláns tulajdonságait megtartja. (Riói ÍÍ9S6) j . (Ezt az anyagot) az Bibi Amnaochemí stry állítja elő és szállítja az SB-Sí oiogica.ls számára. A SíaibbAlino öeecham Bioiogd cals-nái végrehajtott kísérletek kimutatták, hogy az különböző hordozókkal kombinált 3D-MPL erősen megnöveli a humorális és a THl-típusű celiulárís immunválaszt .»

QS21: egy természetes szaponinmolakula, amelyet a dél-amerikai öiviiaja saponaria Mollna kérgéből vonnak ti. A kéreg nyers extraktumábol az egyedi szaponinok elválasztására kifejlesztett tisztítási eljárás lehetővé teszi a konkrét s zápor, in, a CS21 izolálást, amely a kevésbé toxikus· és erősebb adjuváns tulajdonságokkal rendelkező tríterpén glikozidf mint az eredeti összetevők, A Q,S21 bizonyítottan aktiválja az I osztályú K8C által korlátozott CTL-eket néhány antigén-alegység esetén, valamint stimulálja az anti.génspeci£ikus· lixafocit-a-proliterációt [Keiasil (1992)}. Agai 1 la (formálisan a Cambridge ö.iotech Corporation^ állítja elő és szállítja/forgalmazza a öC22-et az SB-Biologicalnak.

A. SbitnKline Aeacéam Bioíogícais-nái végrehajtott kísérletek kimutatták az é?Pi és a £?S21 kombinációjának világos szinergikus hatását a huraoráiis és a THl-típusú ce I lu 1 ár is Immunvá 1 as zban.

* * *

—. A? Λ ... * * * * * * 'ί » :«.«* *

Az „olaj a νizben em.1 zió: 2 olajbői (egy tokoferol és egy szkvalén) készült szerves fázisból és emulgeálószerként Tween-80-at tartalmazó PSS-ból (vizes fázisból) áll. Az addd-ként elnevezett emulzió 5% szkva. lenből, 5%. tokoterőiből, 0.4/ Tween-80-ből állt; átlagos részecskemérete ISO nm (lásd a WO/95/1721ö. számú nemzetközi közzétételi iratot).

A SmóinKiine Beecham Síouogicals-nál végzett kísérletek bizonyították, hogy az O/W emulzió 3D-MPL//QS21 (SBAS2)-hoz történő hozzáadása megnöveli az 3D-MPL//QS21 (SBAS2) különböző antígénalegységek iránt kifejtett immunstimuláns tulajdonságait.

2. az SS82 (kétszeres konoenfcrátumú) -emulzió előállítása

Tween-80-at oldottunk PBS-ben 2%-os koncentrációban. Kétszeres koncentrációjú emulzió előállítása céljából 5g dó-alfa-tokoferolt és 5 mi szkvalent vortexeltunk intenzív keverés céljából. 90 mi PES/Tween-oIdatot adtunk hozzá és alaposan összekevertük.. A. kapott emulziót ezután egy fecskendőn átnyomtuk. és mikroflüídizáituk egy mikrorluídizáló készülékkel. A kapott olaícseppek mérete megközelítőleg 180 nm volt.

3. A_lipoprfcot e 1 n - D-1 / 3 -MAGÉ ~ 3 - H i s QS21/3D MPL - _„olaj a vízben (SBAS2) formula sídéi Utasa:

Az adjuvánst az MPt és a QS21 kombinációjaként állítottuk elő, egy olai/víz. emulzióban. A preparátumot/ készítményt 0.7 ml-es fiolákban szétosztottuk a iiofi♦ * ·>

lizált antigénnel való keverés céljából [a fiolák 30-30-0 ne antigént tartalmaztak.} .

A liofilizált vakcina adjuváns-hígitójának összetétele a következő volt:

összetevő:	Mennyiség:
Adj uváns
SB62-emuizó:	250 gl
-szkvaié-n	10.7 ng
~DL a-tokeféről	11.9 mg
Tween 80	4.8 mg
Monofoszfőr i i-ii ρ1d - A	iOO üg
QS21	100 pg
Tartősitószer
Th.iome.rsal	25 pg
Buffer
Víz az injekció céljára.	q.s.ad 0.5- ml
-kétbá z iso s nát r ium-foszfát;	575 ug
-egybázisos nátrium-foszfát	100 gg
-káiíum-klorid	100 pg
- ná t r i um - ki o r i d	4.0

A végső vakcínaterméket a liofilizált LPD-MAGS-3-Hispreparátine adjuvánssal vagy egyedül PBS-sel történő re kőris ti tnciőj ával nyerjük.

Az antigén nélküli adjuvánskontrollt ügy készítettük, hogy a fehérjét PBS-sel helyettesítettük.

« « » « va ke Ina-antígén:a llpoprofeln-D 1 / 3 - MAGÉ ~ 2-fíl'S' fú z iás fehérje

A liporotein-D a Haemophilus influenzáé Grsm-negativ baktérium felszínén található lipoproteín.

A processzált profein-D első 109 csoportját alkalmaztuk fúziós partnerként, hogy a vakcina-antigént T-sejtepitoppal lássuk el. A LPD-rászen kívül a fehérje tartalmaz két , egymással nem. rokon animosavat (Met és Asp) , a MAGÉ-3 2-314. amimosav-csoportját, és csukléréglőként működő két Gly-csoportot, a későbbi hét His-csoport exponálása céljából .

V......PéIda

1. Az LbP-MAGÉ-3-Hl s ímmunogeniclfása egerek ás majmok eset eben

A humán eredetű MAGÉ-3 fehérje antigén!oltásának és immunogenicifásának tesztelése céljából a vakolnajelőd ttel két, a genetikai hátterükben és az MHC-alléijaikban különböző egértörzs egyebeibe (C5?SX/ú és Saib/C) oltottuk.

Mindkét egértörzsnél az LDP-MAGE-3-H'is fúziós fehérje MAGE-része esetében a potenciális T-osztályú és 11. osztályú MHC-peptidrészeket elmélet ideg megjósoltuk.

a) -immunizáeiós eiőirat:

Minden törzs esetében 5 egeret kétszer, két hetes időközben, a talpba („foot pád) adott injekcióval beoltottunk 5 cg, GAA-vai 111. anélkül foxmulázott LPD-MAGE-3-His fehérjével, a humán dózis koncentrációjának i/10-ével.

·	4 * * « « »a« 4 * 4 4♦ Λ x
elő az egere	fc lépéne-	k vagy
zásával, az t	ítoisé in	.jekcló
Alid sejtet	h é r onts z	crosan
remezeke bel	veztünk	és 72
. s.n a. k v etet t ü k	alá kü 1	önböző

b) proiiferáciös esszé:

Limfoci.fákat állítottunk elő térdhaj lati nyirokcsomóinak beadása után 2 héttel.

(tripi íkátémban) S6-méiyedéí órán. át in vit.ro restimül!

koncentrációjú (1-0.1 pg/m.l) His-Mage-3 fehérjével, és igy lator mikrogyongyöket burkoltunk ezekkel a sejtekkel.

Növekvő MAG	E-3-specifikus .;	Limfoproi	iteratív	aktívi
tást figyeltünk av	sg a lépi eredet	,ű (lásd	S. és 7	ábrát)
és a nyirokcsomói	eredetű (lásd a	&. és a	8 ábrát)	sej tek
nél az LPD-MAGE-3-	His fehérjével i	njaktáit	egereknél	akár
CőlSf/ó, akár a £	ia i fc/ C tör z sné 1,	az kizár	ólag Sóé	tS-2-ve

vagy P3S-sel injektált egerek esetében megfigyelt válaszreakcióhoz viszonyítva.

Ráadásul jelentős mértékben nagyobb proiiferativ válaszreakciót kaptunk az SBáSk-adjuvánssai adott LDP-MAGE-3Kis fehérjével immunizált egerekből származó iimfociták esetében, (lásd a 6. és 8. ábrát),

c) következtetés:

Az LPD-MAGE-3-His az egér esetében immunodén, és ez az i.mmunogenicitás növelhető az SSASé-aájuvánssai történő v o rmul a z ássa r .

2^ Antitest-válaszreakció:

a) Immunizáciős előirat:

A Salb/c vagy a CölSŐ/á-egereket két, a talpba („foot ;ad) beadott injekcióval, 2 hetes időközökben PBS-sel, ~ 3 3 ♦ «** ♦ ♦ vagy SBAS2-~vel, vagy akár 5 gg LD?-MAGE-3~His, vagy 5 pg fDP~MAGE~3~His 4- SSáS2~vel immunizáltunk.

A. kontrollcsoportban öt egeret alkalmaztunk és ezeket is teszteltük.

b) Indirekt PőrSA:

A második injekció után két héttel egyedi szérummintákat vettünk és ezeket indirekt -árláá-méréseknek vetettük alá,

2. ug/ml tisztított Hls-MAGS fehérjét alkalmaztunk burkolőantigén céljára. 1 órás, 37'd>-on, 1% újszülött borjúszérumot tartalmazó PBS-sal történő telítés után a szérummintákat telítési pufferrei sorozatúigátasnak vetettük alá (1/iOOO-es hígítással indulva), és egy éjszakán át 4°Con, vagy 90 percig .37°C-on inkubáltuk. 0/01% Tween 20-at tartalmazó BBS-sei mostuk, majd bitoiniláit, kecskéből származó, egér elleni összes IgG-t (1/1000) vagy kecskéből származó, egér elleni IgGÍ, lgG2a_f IgG2b antiszérumot ÍI/őöOOí alkalmaztunk második antitestként. 90 perces, S'lbj-Os inkubálás után sztrept avidínbez kötött peroxidázt adtunk, és ?M8-t <tetrametíi-foenzidin-peroxid) alkalmaztunk szubsztrátként. 10 perc elteltével a reakciót leállítottuk 0.5 M íbSOs hozzáadásával, és az O.D-t meghatároztuk.

c) Sre dmén ye k:

A 9. ábrán a különböző egércsoportok (N-5./csoport) széruméi tereinek relatív átlagos középértékeit („mean snidpoint) hasonlítjuk össze, amelyek a görbék középértékeinek eléréséhez szükséges átlagos hígítás! értékeket jelenti k.

Ezek az eredmények az mutatják, hogy mindkét tesztelt egértörzs esetében, a csak LPD~MAGE~3~His 2 injekcióban történő beadása után gyenge, antitestválaszt kaptunk, azonban erősebb anti-MAGE-3 antitest-választ kaptunk akkor, amikor az LPD-MAGE-3~Eis~t SBAS2~vel együtt adtuk be. így az MAGE~

3-His t SBAS2 kétszeri, két hetes időközben beadott injekciója elegendő a megfigyelt, magasabb szintű antitestválasz kiváltásához,

A Baib/c-egerek esetében a G57Bö/ö-egerekhez viszonyított jobb válaszreakció a két törzs különböző hapiotípusávai vagy a hátterével magyarázható, még akkor is, ha a CőZBr/6-egeréknél elért antitest-títerek a MAGE-3-His + SBAS2 beadása után szintén magasabbak voltak, mint csak az

LPD-MAGE-3-EÍs beadása után.

A vakcina beadása utáni, Ig-aiosztály szempontjából specifikus anti-MAGE-3 válaszreakciókat a különböző egércsoportok esetében a 10, és a 11. ábrán mutatjuk be, amelyek a szérumhlgitásofe átlagos középértékeit (,,mean mídpoint) hasonlítják össze.

IgA-t, és IgK-ef sem detektáltunk egyik szérnmmintában sem, még az SBASz-ben beadott LPü-MAGE-3-His esetében sem.

Ezzel szemben az össz-lgG-szint kissé magasabb volt a csak LBb-MAGE-3-His fehérjével vakcínázott egerek esetében, és jelentős mértékben, megnövekedett azoknál az állatoknál, amelyeknek SBA32-ben adtuk be az LPD-MAGE-3-His-t.

φ *

* Φ « ♦

- 40 - ♦·**♦.♦/ *

A különböző IgG-alosztályok koncentrációinak analízise azt matatja, hogy kevert típusú antitest-válaszreakciót váltottunk ki az egerekben, mivel mindegyik, tesztelt IgGalosztály (IgGl, TgGza, IgGzb) szintje magasabb volt sz adjuvánssal kiegészített antigénnel va.keinázott egereknél, mint csak az antigénnel vagy csak az adjutánssal beoltott egerek esetében.

A SBAS2 jelenlétében LlpoD-bAGE-3 fehérjével történő vakcinázás utáni kevert típusú antítestválasz azonban 'látszólag függ az egértörzs típusától, mivel a .Balb/c-egerek szerummintáiban túlnyomóan az IgGl-t, a Go 731/6-egereknél pedig igG2b-t találtunk.

3_. ^a lipoprotein-D-i /3-bAG£-3-His e az SBSz-adjuváns

Immun ogenácitása Ró e a a s majmok esetében.

öt Röesus {Macaca Mulatta? állatból álló három csoportot választottunk ki. Az ATS,-t S és gplzö-at alkalmaztuk pozitív kontrollként.

A csoportok;

1. csoport; jobb láb: ATS,3/SBAS2 bal láb: GP120/SSAS2

2. csoport: jobb láb: RTS,S/S826T bal láb: GP12Ö/SB2S?

3. csoport: jobb láb: LipoDl/3 MAGÉ 3 his/S8AS2

Az állatokat a 0. napon vakoináztuk, majd a 23. napon és a 34. napon ía reakciót) erősítő kezelést adtunk, majd vért vettünk a MAGS-3 és a proteín-D komponens elleni antitest-válasz meghatározása céljából. .A vakcinákat intramaszkalárisán, „foolus injekció (0.5 ml) formájában adtuk be a jobb láb hátsó· részébe.

Kis (mennyiségű) vérmintákat vettünk minden 14. napon. 3 ml, hepa.rinnal nem. kezelt vérmintát vettünk a combcsonti vénából, a mintákat alvadni hagytunk legalább 1 órán át, majd szobahőmérsékleten, centrifugáltuk (10 perc, 25800 rpm> .

A szérumot elválasztottuk, -2C>°C-on. lefagyasztottuk és specifikus AOASA-vai történő antitestszínt-meghatározásra küldtük.

96-mé.lyedésS mikrolemezeket (maxísorb bűne) burkoltunk 5 ug His-MAGE-3 vagy proteín-D fehérjével, egy éjszakán át, 4^:'C-on. 1 órás, 37*€~on, 1% NCS-fe tartalmazó FBS-sei történd telítés után nyúlszérum sorozathígítását (1/10-es hígítással kezdődő) adtuk, majd inkubáltuk 1 órás, 3?°C~on, majd 3-szcr mostuk PBS-Tween. oldattal, és bi-otinilált nyúlszérumot (Amersdam .reá, APb 10Ö4 lat 88) adtunk (1/5000) , A lemezeket mostuk, majd sztrep-tavidinhez kötött peroxidázt (1/5000) adtunk, és .inkubáltuk 30 percig, 3'bC-on. Mosás után 50 ui TbB-t (ülőpad) adtunk, 7 percig inkubáltuk, majd a reakciót 0.2 M ibSO< hozzáadásával leállítottuk és az QDf. 4 50 nra-en mértük. A félérték-higifásokat ucf'tmaxPro alkalmazásával számítottuk ki.

Antit estválás z y

Kis (mennyiségű) vérmintákat vettünk minden 14. napon a KAGE-3-ra adott antitestváiasz kinetikájának AUSA-vai történő követése céljából. Az eredmények azt jelzik, hegy az LDE-i/3-MAGE~3~Bis és SBAS2 egyszeri injekciója után a *** 4 «4»

- 42 ~ ϊ

MAGE-3-ra specifikus össz-Ig-titer alacsony volt, a LDP~ 1/3-MAGÉ-3-His és S3AS2 második és harmadik injekciója után ás 5-ból 3 majom esetében a reakció felerősödését figyeltük meg ugyanazoknál a majmoknál. A gyenge válaszreakciót adó állatok még 3 injekció után is negatívak maradtak. A 2. és a 3. injekció után 28 nappal az antitest-titerek az alapszintre csökkentek. Az antitestek a meghatározások szerint túlnyomóan az IgG-alosztályba, és nem az IgM-alosztáiyba. tartoztak. Az IgG-re váltás az valószínűsíti, hogy Thelper-választ indítottunk he. A proteín-D~re adott válaszreakció, gyengébben ugyan, de pontosan a MAGÉ-3 esetében megfigyelt antitest-válaszreakcióval párhuzamosan zajlott le.

VÜ , Példa:

1.hPD-MAGE-1-Hls

A- fentiek analóg módon elkészítettük az LPD-MAGE-fHis-t. Az aminosav-szekvenciát és a DbS-szekvencíát a 3. és a 4. a. sz. írja le. Az eredményül kapott fehérjét az LPDMAGE-3-His fehérje esetével analóg módon, tisztítottuk. Röviden: a sejtkultúrát hoaogenízáltuk és 4 M guan.idin-HCÍ~t, 0.5 M béta~m.erkapto“etanolt tartalmazó oldattal kezeltük 0.5% Fmpigen-detergens jelenlétében. A terméket szűrtük és a szűrletet ö.S M jödacetamiddal kezeltük. A karboxiamidáit frakciókat l'MAC í cink- kei át depó amse FF) kromatográfiának vetettük alá. Az oszlopot először 4 M guanídinHCl-fc, nátrium-foszfátot (2Ü jsM, pH 7.5) és 0.5% Ebpigen~t tartalmazó oldattal eguiliforáltuk és mostuk, majd az oszioX * V * Φ Φ « » pót 4Η karbamidot, nátrium- foszfátot (20 nMj pH 7.5) és 0,5% £mpígen~fc tartalmazó pufferről mostuk, A fehérjét ugyanezzel a pufferrel eluáltuk, azonban az elváló puffer növekvő koncentrációjú imidazo.it (20 400 PH és 500 mb) tartalmazott.

Az eluátumot 4 M karbamíddal hígítottuk. A QSepharose-osziopot 4M karbamidot, 20 mM foszfátot (pH 7.5) és 0.51 Aspigen-t tartalmazó pufferrel eguiiibráltuk és mostuk- Ugyanilyen, de detergenst nem tartalmazó pufferrel másodszor is mostuk az oszlopot. A fehérjét ugyanezzel a pufferrel elváltuk, de növekvő Ímidazol-koncentráció (150 ífMí 400 ö, 1 M· mellett. Az eluátumot uitraszürésnek vetettük alá.

V.T.I......Példa

A p.HITÍ442ó expresszios^piazmíd_konstrukoiőja és az. Ar5á~ gazdatörzs transzformációja. az hói -AiéGA-3-Hf s fehérje előállítása, céljából

Fehérjetervezés:

Az FA eoii-ban expreöszálandő N'Sl-MAGE-3-His fúziós fehérje tervezését a 12. ábrán mutatjuk be.

Az eredményül kapott fehérje elsődleges szerkezetét az 5. a, sz. szekvenciaként mutatjuk be,

A fenti, tervezett fehérjéhez tartozó kódoló szekvenciát (6, a. sz.) egy JS. coli expressziós plazmádban a Apópromóter szabályozása alá helyeztük,

»

Az NSi~í^AGE~3~Ití.s fúziós fehérje_létrehozásnak klónozás 1.

stratégiája

A kiindulási anyagként szolgáló cDNS (a Dadnig festi tute-rőf Dr. Tierry Soon bocsátotta rendelkezésünkre) a MAGÉ-3 gén kódoló szekvenciáját és az .Influenza-tAj nemstruktűr-fehérje «1 amínosavát tartalmazó PMG81-vektort tartalmazta.

A 13. ábrán vázolt klónozás! stratégia a következő lépéseket tartalmazza;

a) a MAGÉ-3 eDNS-plazmádban jelenlevő szekvenciák PCA által történő ampiifikálása az 5^f go gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag egg „szens* oliogonukleotid alkalmazásával és az 5^f gcg tet aga tta atg gtg atg gtg atg ctg atg aac gcc ctc tto ccc ctc oaa antizenz oligonukleotid a1kaIma zás a va1.

Sz az ampáifikáciö az ^-terminálison a. következő módosításokhoz vezet: az első öt kodon cseréje az E. coli által használt kodonra, a Pro-kodon. cseréje A.sp-kodonra. az ! „ pozícióban, az ö^?-végnél egy hcol-hely beillesztése és végül 2 Gly-kodcn és a 7 Hls-kodon, és egy X.ba.f~heiy hozzáadása a

C- t e rab. n á 1 is r és zen..

b) A fentiek szerint amplifikéit fragmens klónozása a i'A-kicnozó vektorba < Invitrcgcn) és az intermedier pffTl454 7-vektor előállítása.

c) A boci Xbaf-fragmens kivágása a pEJf.iéö4 7plazmídből és a pAIf SMG87-vektorba történő klónozása..

dj az AEőá-gazdatörzs transzformációja..

ei Α ρΒΤΤ 24426-p.lazmídot tartalmazó, az óPD-fíAPO-úffis fúziós- fehérjét express-zá.ló transzformáns &, coli.törzsek szelekciója és jellemzése (lásd a 14. ábrát).

A rekombináns, VS,;-dáGE--d-üla (pAITl-442g) jellemzése

Baktériumokat tenyésztettünk 50 pg/mí kanamicinnel kiegészített XS-tápközegben, SOkC-on. Amikor az tenyészet OD-je <620 nm-en) elérte a. 0.3-as értéket, hőindukciót hajtottunk végre úgy, hogy a hőmérsékletet 42“C-ra emeltük.

órás indukció után a sejteket összegyűjtöttük, PSS~ ben reszuszpendáltük és (zúzáson} lízisnek vetettük alá French press-en háromszor áfcnyomva. Centrífugáiás után <6ö perc, 2 00 000 g; az üledék felülúszóját és a teljes extráktűmet SDS-PAGE alkalmazásával analizáltuk. A fehérjéket Coozaassie £U~gyel festett géleken jelenítettük meg, ahol a fúziós fehérje az E, coli. Összes fehérjetartalmának körülbelül 1%-át képviselte. A rekombináns fehérje egyetlen sávként jelent meg 44.9 köa látszólagos so lekül a tömegnél. A fúziós fehérjét Western-Piot-tál azonosítottuk, anti-NSi monoklonális antitest alkalmazásával.

Vili. Példa

Az MSl-MAGE-_;3~His......(P. coli).__tisztítása nyúl/egér Immunizálásának céljaira

Tisztítási vázlat

A kővetkező tisztítási vázlatot alkalmaztuk az antigén tisztításának céljából:

« >

Sejtlizis + centrifugálás í

sntigén-szolabi iizálás -* centrifugál ás

Ni²' + -KTA-agaróz i

Tömény!rés í

F.rep-ceil i

TCA-kicsapás és PBS-szoinbilizálás ai Pisi a

A baktérinmsejbeket (23 g) 203 ml, 50 bM PO.._; (pH 7) pufferben Hanoié (homogén!zátor} alkalmazásával iizáltuk és a lizátumot JA-2Ö-rotorral IS 000 rpm~mel 30 percig centrifugáltuk .

A feiülúszöt kiöntötték.

b) Antí gén-szo1ab i1í zá1ás

Az üledék 1/3-át reszolubíiizáituk egy éjszakán át 4^,;'C~on 34 ml, 100 bd PO/', δ M Gu.HCl (pH 7) puff érben. Cen.tr i.fugálás után {JA-28 rotor, 15 000 rp.u, 30 perei az üledéket kiöntöttük és a feiülúszöt tovább tisztítottuk XdAC alkalmazásával .

c| Affinitás! kromatögráf la Ni² + -ATA-agaróz (Giuge.n) aikaibasásával

Az oszlop térfogata. 15 ml (16 aa x 7..5 cm}

Pakoiopuffér: 0.1 Μ PO/Ö δ M GuHCl, pH 7

Λ ff bintapuffsr: ugyanaz

MöSÓpuffer: 0.1 d PO/', 6 M GuHCl, pH '7

Óul M PG/, 6 H karbamid, pH 7

Elúció: imídazoi-gradiers (0-,250 mb) 6 M karbamiddal kiegészített 0.1 M PG,/pufferben (pH 7í Áramlási sebesség: 2 ml/perc a} Tömény1rés:

Az IMáC-röi származó eluatum (160 ml) antigénre nézve pozitív frakcióit összegyűjtöttük és 5 mi-re töményitettük kever tetett Amisen -cellában. Fiitron-membrán alkalmazásával íOmega-típus, 10 00Ό átcsapási tartomány). Ebben a fázisban a tisztaságét 70%-osra becsültük SDS-PAGE analízis alapján, b) Preparatív elektroforézrs (Pép veri, Hiorad)

A tömény! tett mintából 2.4 ml-t 0.8 ml redukáló mintapufferben felforraltunk és egy 10%-os akríiamíd-géire vi ttunk. Az antigént 4% SDS-sel kiegészített Tris-glíeim pufferre! (pH 8.3) eluáituk és az NS?“MA.GE-3-His-re nézve pozitív frakciókat összegyűjtöttük.

a) TCA-kicsapás:

Az antigént TCA-val kicsaptuk, és centrifugálás után ÍJA-20 rotor, 15 000 rom, 20 perc) a feiülúszót kiöntöttük. Az üledéket reszölubiiizáltufc PföS-pufferben (pH 7.4).

A PSS-ben oldható fehérje íagyasztás/olvasztás után nem mutatott degradációt 3 órás 37°C-os tárolás során, és látszólagos molekulatömege SDS-sel meghatározva (12.5%· PAGE) megközelítőleg 50 Oöö Daltón volt.

IX. Példa

A ÜTYTA-Mágg-l-ffl-s-végű. fúziós fehérjét expresszáló £< eo1 i-1ö rzsek előá.lUtasa

A ρΑϊΓΙ 7ói3- expr es s zi ŐS: piazmid konstrukciója és az AR5Sas gazdatorzs tr:anszformációja

Fehérjetervezés:

Az F. cöJi~foan expresszáiandő CLYTA-MAGS-l-Hís fúziós fehérje tervezését a 15, ábrán, irtuk le.

Az eredményül kapott fehérje elsődleges szerkezeteként a ?, a. sz. szekvenciát adjuk meg,

A. fentiek szerint megtervezett fehérje kódoló szekvenciáját (lásd. a 8. a. sz. szekvenciát) egy F. coli expressziós plazmádban a Apr-promöter szabályozása alá he1yeztük,

Klónozás:

A kiindulási anyagot a PCFFl-vektor, amely a Ftrepéococcus pneamoz’.iae-ből származó Lyt.á~t kódoló régiót 117 C-termínáiis kodonját tartalmazza, és a pAJTliSíúvektor, amelybe előzőleg a Ludwig Institnts-ról, Dr, Thierry Boon által rendelkezésünkre bocsátott MAGÉ-1-gén cDNS-ét szobklönoztuk,

A CLYTA-MAGE-l-His fehérje expressziőjának klónozás! stratégiája (lásd a 16. ábrát) a. következő lépéseket tart a ima zz a.:

2. A CL YTA-hiASE-1 - Η 1 s kődo 1 ó s z e k v en o 1 a -mo d u 1 j ána k eiőái iitása:

a) Az első lépés egy PCá-ampiif rkálási lépés volt, amelyet a CLIAA-szekvencia ó<ie.f-Af.i.ff J-resitrikcios helyekkei való szegélyezése céljából végeztünk el. A PCAamplifíkakaskor templátként a PCüá2-plazmidot alkalmaztuk, iáncinditóként pedig a következe oiigonukieotídokat: „szenz oligonukleotid: 5' tta aac cao acc tta agg ata tea cat atg aaa ggg gga att. gta cat tea tac , „antíszenz oligonukleotid; 5' GCC AGA CAT GTC CAA TTC TGG CCT GTC TGC GAG. Ezek egy 378 nukleotíd hosszúságú CAffA-szekvencia amp1 ü 1 káiodását ere.dmé.ny ezik,

b) A második lépés a CATAA-szekvencia MAGE-I-Hisszekvenciához való kötése volt, a fúziós fehérje kódoló szekvenciájának elkészítése céljából. Sz a lépés magában, foglalja az MáeJ-AfdÜT CAfTA-íragmens kivágását és beillesztését az előzőleg Adél és Hco.A {Hoof-gyei és AflJII-mal kompatibilis) restrikciós enzimekkel megnyitott pATTitóIövektorha és ezáltal a oAATl 8 érd-pia zmid létrehozását.

c) Az ABőd-as gazdatörzs transzformációja,

d) A pAJTóőlo-as plazmidot tartalmazó transzformáns (KAH-rezisztens) E. co.21 szelekciója és jellemzése (lásd a 16. ábrát).

1, A rekombínáns ChYTA-MAGE-1-His fshérje (pR1T14613) j ellenzése:

Baktériumokat tenyésztettünk 50 ug/ml kanamiclnnei kiegészített Ad-tápközegben, SCúC-on. .Amikor az tenyészet OD-je <620 nm-en) elérte a 0.3-as értéket, höindukciót hajtottunk végre ügy, hogy a hőmérsékletet 38^::'C-ra emeltük.

órás Indukció után a sejteket összegyűjtöttük, PSSben reszuszpendáituk és (zúzásos) 1 isisnek vetettük alá „one sünt eljárással. Centrífugálás után az üledék felül50 üszőjét és a teljes extrsktumot SDS-PAGE alkalmazásával analizáltuk. A fehérjéket Coomassie Si-gyel festett géleken jelenítettük meg, ahol a fúziós fehérje az z. coli összes fehérjstartalmának körülbelül 1%-át képviselte. A. rekombináns fehérje egyetlen sávként jelent meg 49 kPa látszólagos molekulatömegnél> A fúziós fehérjét Ifestern-Bicttál azonosítottuk., anti-MAGÉ-1 poiiklonális antitestek alkalmazásával .

A hosszá (a nalidlxsav általi iudukcióban alkalmaztatő) λ pL-promóter és a ötbfA-MAGE-1 (pRITl 4614} kódoló szekvenciájából álló expressriós egység rekons trukciőja:

A hosszá λ pL~promötert és a CrEfA-szekvenola egy részét tartalmazó AcoAJ-.UÖ0_? restrikciós fragraenst a pAJT ÓVA 6'-p Is amidből állítottuk elő és a pAlfü 4613-as plazmád EcoRI-bCO.; helyei közé illesztettük.

Előállítottuk a rekembináns pAJTl 4614-es piazmidot.

A CLYTA-MAGE-1 fúziós fehérjét kódoló rekombináns pAiri4ól4~es piazmidot alkalmaztuk az AA!2ö~ss A. colitörzs transzformálására, Egy Kan-rezisztens törzsjelöltet kiválasztottunk és jellemeztünk.

A rekombluáns fehérje jellemzése:

Baktériumokat tenyésztettünk 50 pg/ml kanamicinnel kiegészített f S-tápközegben, 30'^:o-on> Amikor az tenyészet OD-je (620 nm-en) elérte a 400-as értéket, nalidixsavat adtunk uömg/ml-es végkoncentráoi.öban.

órás indukció után a sejteket összegyűjtöttük, Bősben reszuszpendáltuk és (zűzásos) iizísnek vetettük alá {„one shot--típusú CfS-zűzás) . Centrí f'ugálás után az üledék íelüiúszőját és a teljes extraktumot SDS-PAGE alkalmazásával analizáltuk. A fehérjéket Cö-omassie Bl-gyel festett géleken jelenítettük meg, ahol a fúziós fehérje az £, coli összes fehérj©tartalmának körülbelül lk~át képviselte. A fúziós fehérjét Western-Slot-tál azonosítottuk, nyűieredetű ant.i-MAGE-1 políkionáiis antitestek alkalmazásával A rekombináns fehérje egyetlen sávként jelent meg 49 kPa látszólagos molekulatömegnél.

X......Példa

CLYTApMAGE-5 -Hl S

A.: Tumor.kilökődést rekombináns antigén: CLYTA-MASS3-üis fúziós fehérje, amelyben a -C-lyt A fúziós partner egy szolubilis fehérje expresszfőjához vezet, affinitás! jelzőcímkeként (toldalék) szolgál és hasznos T-halpe.r {szerepe van) .

A CXΓΓΑ-Maga~B-Άίs-végű fehérjét expresszáló B, colitörzs előállítása.

A pBTTliséü-expresszios plazmád megszerkesztése és az ABÍ2d--as gazdatörzs transzformációja:

Fehérjetervezés:

Az K. coli-ben expresszálandó CLYTA-Mage-3-üls fúziós fehérje tervezését a 13. ábrán, irtuk le.

Az eredményül kapott fehérje elsődleges szekvenciájaként a 9. a. szekvenciát, kódoló szekvenciaként a 10. a. szekvenciát jelöljük meg.

Ο

Ζ.

A fentiek szerint tervezett fehérjekódoló szekvenciáját egy 2. coli expressziős piszéidben a Apó-promőter szabályozása alá helyeztük.

Klónozás:

A kiindulási anyagot a PCóóI-vektor, amely a Streptococeas pneamoniae-böl származó fytA-t kódoló régiót 117 C~terminális komorját tartalmazza (Gene 4 3u265-272 (1986)j, és a pAJTlsól8-vektor, amelybe előzőleg a Ludwíg Institute-ról, Dr. Th.ierry Boon által .rendelkeséstinkre bocsátott MAGE-3-gén cDNS-ét szubklőnoztuk.

A CLYTA-MAGE-3-His fehérje expressziójának klónozást stratégiája {lásd a 19. ábrát) a következő lépéseket tart almazza:

1.......A... C L YTA-KAGE-3-His kódolőszekvenci a-moduljának előál 11 fása:

1.1. Az első lépés egy PCE-amplifikálási lépés volt, amelyet a CőYYA-szekvencia AAI.il és AfJuli-restrikciós helyekkel való szegélyezése céljából végeztünk el. A PCPampiifikáláskor femplátként a PCüál-plazmidot alkalmaztuk, láncindítóként pedig a következő oügonukleotidokat:' „szene oligonukieotid; 5' tta aac cac acc tta agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tea gac , „antiszenz oligonukieotid: 5 ccc aca tgt cca gac tgc tgg cca att ogt geo tgt ctg cca gtg. Ezek egy 42? nukleotid hosszúságú CLYTA-szekvencia ampiifikálődását eredményezik, A fentiek szerint amüf lkait fragmnst az Invit.rogen PA-klónozó vektorába klónoztuk a pPIÜénái intermedier vektor előállítása céljából.

12. A második lépés a CLYTA-- szekvencia MAGE-3-hisszekvenciához való kötése volt, a fúziós fehérje kódolószekvenciájának elkészítése céljából. Ez a lépés magában foglalja az Α/1ΙΓ--ΑΌ..ΓΓΓ CAATA-fragmens kivágását és beillesztését az előzőleg AflJJ és áfeol (bbol-gyel és AfdJIfmai kompatibilis) restrikciós enzimekkel megnyitott pAI'Tl451 ő~vektorba, és ezáltal a pAITGéDÓá-plazmid létrehozását .

2. A hosszú (a na1ídixsav általi indukcióban a1kaImazhatój λ pb-promóter és a £ZYTá-MAGE-3 kédo1ó szekvenciájából á11ó expressz16s egység rekonstrukcióé a;

A rövid λ pL~pronőterf és a CX-ETA- MAGÉ-3 kódoló szekvencia egy részét tartalmazó SgiJT-Xbal restrikciós fragmenst a pAJTIiádá-piazmidbői állítottuk elő és a TGV6'7~ as plazmid (az anspici 11 innék szembeni rezisztenciát és a hosszú λ pL~promőtert tartalmazó pSAJáf-származék, amelynek leírását a PCT/EP.92/01827. sz. nemzetközi be jelentésben találhatjuk meg) PglJ.r-Xbaf helyei közé illesztettük. Előállítottuk a rekombináns pEJTl iőő7--es plazmídot.

A CXETA-MAGE-3~His fúziós fehérjét kódoló rekombináns

p.Ri'Ti 1 dé7-es plazmídot alkalmaztuk az AAlfd-as E, colitörzs [Mott és másai., Proc. Náci. Acad. Sci, 82; 88

(.1985) ] transzformálására. Egy ampíci.ilin-reziszfens törzsjelöltet kiválasztottunk és- jellemeztünk.

. A pAETl i EVá-plazmi.d elő-ál Utasa;

Végül a pAJTléEév-eshez hasonló, de kanamzcinszel eke lóra alkalmas plazmídot :ρΑΓΤ1ΕΕ46) állítottunk össze.

»♦.♦.«·

A rekombináns fehérje jellemzése;

Baktériumokat tenyésztettünk 50· pg/ml kananá cinnel kiegészített £3-táp közegben,· 30°€~on. Amikor az tenyészet 00·-je iő20 nm-en) elérte a 400-as értéket, naiidíxsavat adtunk 60· ?g/ral~es végkoncentrációban.

órás indukció után a sejteket összegyűjtöttük, PBSben reszuszpendáltuk és (zúzásos) lízisnek vetettük alá (_f,one shot-típusú CDS-zúzás) . Centrifugális után az. üledék felüiűszóját és a teljes ex.traktum-ot SDB-PAGB alkalmazásával analizáltuk. A fehérjéket Coomassie 32—gyei festett géleken jelenítettük meg, ahol a fúziós- fehérje az A. coli összes fehérjetartalmának körülbelül 1%-át képviselte. A fúziós fehérjét Mestere-Síot-tai azonosítottuk, nyúiereoető sn.tl-MAGE~3 poliklonális antitestek alkalmazásával A rekombináns fehérje egyetlen sávként jelent meg 58 kDa látszólagos molekulatömegnél.

XI. példa

A rekombináns CfX7A-.MAGB-3-8ís fehérje tisztítása:

A rekombináns Anikó (pAJTl 4o4őj baktériumokat egy kö literes fermentorban „rátápiálásos körülmények között tenyésztettük 3$*C-on. A rekombináns fehérje expresszióját na.lidi.xsav hozzáadásával indukáltuk 60 7g/m.l végkoncentráóiéban. A sejteket a fermentáció végen összegyűjtöttük (zúzásáé) lizisnek vetettük alá és 500D/600-nál a francia prés „Frenob prése sejt zúzó készüléken kétszer átnyomva. (20 000 psí, azaz kb. 139 200 kPa). A Lizáit sejteket centrifugáitok (20 perc, 15 000 g, 4'^:C) . A rekombináns fehérjét tarA ««« «« V « talisazö felülúszófc az előzetesen 0,3 M NaCl-t, 20 mM Tris-t (pH 7.6) tartalmazó A-~pufferrei eguilibráit ioncserélő Íloán-Sepáarose CAB-gyantára {Pharmacia) töltöttük. Az oszlop A-pufferrei történő mosása után a fúziós fehérjét 2% kői innal (A~ puffer ben) eluáituk. A Mage-3 anti testek alkalmazásával elvégzett destern-blot alapján az antigénre nézve pozitív frakciókat összegyűjtöttük. A DSAH-ről eiuált antigénhez 0.5% Empigen SB-t (egy íkerionos detergenst) és 0.5 M NaCl-t adtunk, majd fémion-affinitás1 kromatográfiás oszlopra töltöttük, amelyet előzőleg 0.5% Bmpigen SB-t, 0.5 M HaCi-t, 50 cél foszfátot (pH 7.6· tartalmazó pufferrei (ö~ puffer) equilibráltunk.

Az TMAC-oszlopot H~puffezrei mostuk, mig a 230 nm-en mért abszorbanoia az alapvonalat elérte. Egy második mosást is végrehajtottunk, az Bsjpígen BB-t nem tartalmazó cpuffezzel a detergens eltávolítása céljából, majd az antigént ü-pufferrel, 0-2:50 mM-os ímidazol-gradienssel előéltük.

A. 0.090-0.250 M imldazolt tartalmazó frakciókat összegyűjtöttük, és töményítettük 10 kba átcsapási tartományú Bal trón ómega membránon, majd PBS-sel szemben dializáltuk.

üc étkeztetések:

Kimutattuk, hogy az LPD-KAGEB-His fúziós fehérje egérben immunogén tuiajdonságokkal rendelkezik, és ez az immunogenicitás (a proliíerativ- és az antitest-válaszreakció; tovább növelhető a fentiekben leírt adjutánssal. A * *< « κ*** tisztítás (hatékonysága) fokozható azzal, ha a diszu.1 f ídkótéseket képező tiolesöpörtokkal származékokat képezünk.

Kimutattuk azt · is, hogy jobb antitest-válaszreakciót váltunk ki az LPB-MAGE-3-His fehérjével az adjuváns jelenlétében történő vakcinázássai. A C5 7Sh./6-szérnxixbaxx túlnyomó többségben talált IgG'áb-í zotípns az valószínűsíti, hogy Tűi-típusú immunválaszt váltottunk ki.

Emberek esetében, klinikai körülmények között az LFDMAGE-3-His adjuváns nélküli formulájával kezelt beteg esetében a Kielanoiaa eltűnt (tünetei megszűntek) .

* «-Χ Φ » φφφ «

φφ *

Hivatkozások

- Aráéban A., Fossad G._t Farmiam G. Today 8: 385 (1987).

- De Flae© E,, Árde© K., Traverssri C., ei sí. 40: 360 (1994).

- Gaugtex B,, Vas ben Bynde B., vas. dér Bmggea P., el ah Z £φ. Med,.

179: 921 (1994).

- Herma© X, vao dér Bttrgge© P._x Immánuel R, et ah /mímmögenebay 43: 377 (1996).

- I»a« EE, Móri M._x Ii 1.» el ah Jűr, X Omeey 63: 523 (1995).

- Kensö G.B.., Sofeysik S._f Kami U._t et al. űr Qrarmock RjML , Gűrsfeurg FLS., Browa F., et ah, (eds.), Wxmet 92, (Cöld Spring B&rbor Eaűmwty Press, Goid Sphrrg Kardot, N.Y„X 36-40: (1992).

- Krmtb A., Daaowski B., OsgenH.F., er al. P®c. Adri Acsd. 5e£ EGA,

81: 3511 (1984).

- Patsrd 3J._X E, Gíl-Dsea S., er al. /Μ. X Gmeer, 64: 60 (1995).

- Kifej E., et at űr Levme L, Bonvemre K.E, Motelt© 1., ei at. (eds)., American Socbty fór Mierofeiotogy, Washington DC_X MeroAAdogy 2986, 9-13; (1986).

- Vas de© Bynde B., Harsasa P._x Héti© M. et al. /né X Gnrcer, 44: 634 (1989).

•s»

- Van dér Bruggen R, Traversari C., Chomez P., sí al. Science, 254: 1643 (1991).

- Van dér Brugge® R, Basán J., Gajewski T., et at Sír. /. Jswrot,

- Van Fel A., vas dér Brogges P„ Cosfe RG. , et at, /mmuri&L fóv., 145:229(1995).

- Weysams P., Leibe B., Brasseur F., et at Zni. /, Gmcer, 56: 826 (1994).

- Nishtówz S, Fujsía M, Téma N\ Tani Τ» Kndasna Μ» Lob K, Mihon Rinsfeo Menetó Gatótón Kaísfei 1997, Apr, 20 (2); 9S~10L et al, Ana Oacol 1997 Apr, β (4): 369-72.

♦ * » *·♦» 4

SZEKVENCIALISTA

AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI : A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 452 aminosav TÍ PUSA: axainosav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA; lineáris MOLEKULÁT! PO'S : fehérje

AZ 1. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Mar I	Asp Pro Lys	Thr Len 5	Alá Lee	Ser	Len 10	Len Alá Alá	Gly	Val 15	Lee
Alá	Gly Cys Ser	Ser His	Ser Ser	Asn	Mer	Alá Asn Thr	Gin	Mer	Lys
	20			25			30
Ser	Asp Lys 11a	He He	Alá &ls	Arg	Gly	Alá Ser Gly Tyr	Lee	Pro
	35		40			45
Gle	Kis Thr Lee	Gin Ser	Lys Alá	Lee	Al e	P5e A.I a G in	Gin	Alá	Asp
	50		55			«0
Tyr	len Gle Sin	As» Lee	Alá Mer	Thr	Lys	Asp Gly Arg	Lee	Val	Val
65		70				75			8Ö
He	Pás Asp Sls	Phe Lan	Asp Gly	Lee	Thr	Asp Vei Alá	Lys	Lys	Phe
		85			SO			05
Pro	Pí.s Are &is	Arg Lys	Asp Gly Arg	Tyr	Tyr Vei He	Asp	Phe	Thr
	100			105			110
Lee	Lys Gle He	Gin Ser	Lee Gin	Mer	Thr	Gin Asn Phe	Gin	Thr-	Mer
	115		120			125
Asp	Lan Gle Gin	Arg Ser	Gin Mi s	Cys	Lys	Pro Gin Gle	Gly	Lee	Gle
	1.30		1.35			140
Alá	Arc? Giy Gin	Alá Len	Gly Lee	Vei	Gly	Alá Gin Alá	Pro	Alá	Thr
145		150				155			ISO
Gin	Gle Gin Gin	Al á Alá	Ser Ser	Ser	Ser	Thr Lee Val	Gle	Val	Thr
		XSS			170			1.75
Leu	Gly Gin Val	Pro Alá	Alá Gle	Ser	Pro	Asp Pro Pro	Gin	Ser	Pro
	ISO			185			ISO
Gin	Giy Alá Ser	Ser Lee	Pro Thr	Thr	Mer	Asn Tyr Pro	Lee	Trp	Ser
	135		200			205
Sin	Ser Tyr Gin	Asp Ser	Ser Asn	Gin	Gin	Gle Gin Gly	Prn	Ser	Thr
	210		215			220
Phe	Pro Asp Len	Sin Ser	Gle Phe	Gin	Alá	Ale Len Ser	Arg	Lys	Val
225		230				235			240
Alá	Gle Len Val	81 s Phe	Lee Lee	Len	Lys	Tyr Arg Alá	Arg	Gin	Pro·
		2<5			250			255
Val	Thr Lys Alá	Gle Mer	Lee Gly	Ser	Vei	Val Gly Aon	Trp	Gin	Tyr
	2 GO			285			270
Phe	Phe Pro Val	He Phe	Ser Lys	Alá	Ser	Ser Ser Lee	Gle	Len	Val
	275		280			285
Pha	Giy He Gin	Lee Mer	Gle Val	Asp	Pro	He Gly Mis	Len	Tyr	Xle
	250		205			30S
Phe	Alá TAr Cys	Lee Gly	Lee Ser	Tyr	Asp	Gly Len Lee	Gly	Asp	Asn
305		310				315			320
Gin	He Mer Pro	Les Alá	Gly Len	Lan	He	He Vei Lee	Alá	Ha	He
		325			330			335
Alá	Arg Gle Giy	Asp Cys	Alá Pro	Gin	Gin	Lys Ha Trp	Gin	Gin	Lee
	340			34$			350
Ser	Vei Len Gin	Vei Phe	Gle Gly Arg	Gin	Asp Ser He	Lee	Gly	Asp
	355		360			365
Pro	Lys Lys Len	Lan Thr	Gle Kis	Phe	Vei	Gin Gin Asm	Tyr	Len	Gin
	370		375			380

e 4 «

- ŐO -

Tyr 385

Arg

Gls

Val

Pro

GXy 388

Sár

Asp

Pro

Alá

Cys 385

Tyr

Gl«

Phe

Lee

Trp 408

Gly

Pro

Arg Ma

Lee

Val

Gitt

Thr

Ser

Tyr

Val

Lys

Val

Lee

His

His

Mer

Val

485

418

415

Lys

11a

Ser

Gly

Gly

Pro

His

X Χξ£

Ser

Tyr

Pro

Pro

Leó

His

Gitt

?rp

Val 435

428

425

438

Leu

Arg

Gitt

ciy

δία 448

Gitt

Thr

Ser

Gly

Gly 445

His

His

His

His

His

His

AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI: HOSSZA: 1.35.3 bázispár TÍPUSA: -nukleinsav

HÁNY SZÁLÚ; egy TOPOLÓGIÁJA: 1inéár í s

MOLEKULÁTIPUS: cDMS

A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGGATCCA& AAACTTTAGC CCTTTCTTIA AGGCATTCAT CAAATATSGC GAAGACGCAA CGTGGTGGTA GCGGTTATTT ACCAGAGCAT CAACAGGCTG ATSATTTAGA GGAAGATTTA ATTCACGATC ACTTTTTAGA TGGCTTG&CT CGTAAAGATG GCCGTTACTA TGTCATCGAC ATGACAGAAA ACTTTGAAAG GATGGATCTG GAAGGCCTTG AGGCCCGAGG AGAGGCCC7G GAGGAGCAGG AGGCTGCCTC CTCCTGTTCT CCTGCTGCCG AGVCACCAGA TCCTGCCCAG ACCATGAACT ACCCTCTCTG GAGCCAATCC GGSCCAAGCA CCTTCGGTGA CCTGGAGTCC GCCGAATTGG TTCATTTTC? GCTCCTGAAG GAAATGCTGG GGAGIGTCGT CGGAAATTGG GCTTCCAGTT CCTTGCAGCT GGTCTTOGGC CAGTTGTACA TCTTVSCCAG CTGCCTGGGC CA.GATCATGG GCAAGGCAGG CCTCCTGATA GACTGTGCCC CTGAGGAGAA AATCTGGGAG AGGGAAGACA GTATCTTGGG GGAVGCCAAG AACTACCTGG AGTACCGGGA CGTCCCCGGC GGTCCAAGGG CGGTGGTTGA AACCAGCTAT AGTGGAGGAG CTGAGATTTC CT&COCAGCC GAGGGCGGTC ATCACCATCA «&TCSCC&T

TTAGCAGCTG GCGTACTAGC AGGTTGTAGC 88 ATGAAATCAG ACAAAATCAT TATTGCTCAC 120 ACGTTAGAAT GTAAAGCAGT TGCGTTTGCA 188 GCAATGACTA ÁGGA'TGGTCG TTTAGTGGTT 240 GATGTTGCGA AAAAATTCCC ACATCGTCAT 388 TTTACCT7AA &AGAAATTCA AAGTTTAGAA 358 6AACAGCGTA GTGAGGACTG CAAGCGTGAA 420 GGCCTGGTGG GTGCGCAGGC TCCTGCTACT 4S0 ACTCTAGTTG AAGTCACOCT GGGGGAGGTG 540 AGTCCTCAGG GAGCCTCCAG CCTCCCCAGT 800 TATGAGGACT CCAGCAACCA AGAAGAGGAG 068 GAGTTCCAAG CAGCACTCAG TAGGAAGGTG 720 lATGGAGCCA GGGAGCCGGT CACAAAGGCA 738 CAGTATTTGT TTCCTGTGAT CTTCAGCAAA 840 ATCG&SCTGA TGGAAGTGGA CCCCATCGGC 300 CTCTCCTAGS ATGGCCTGCT GGGTGACAAT SSO ATCGTCC7GG CCATAATCGG AAGAGAGGGC 1020 GAGCTGAGTG TGTTAGAGGT GTTTGAGGGG 1888 AAGCTSCTCA CCGAACATTT CGTGCAGGAA 1140 AGTSATCCTG GATGTtATGA ATTCCVGTGG 1280 GTGAAAGGGC TGC&GCATAT GGTAAAGATC 1200 CTGCATGAGT GGGTTTTGAG AGAGGGGGAA 1328 TAA 1353 « * * * * sí ·*·

A 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA. JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1341 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULATIPÚS:

C Íz

AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGGATCCAA

AŰCCATTCAY

CGTGGTGCTA

CAACAGGC19

ATTCACGAYC

CGTAAAGATS

ATGACAGAAA

GAGOAAGCCC

TCCTCCTCCT

GATCCTCCCC

CAGAGGCAAC

ATCCTGGSGT

CTGCTCCTCA

AYCAA&AATT

CTSGTCT7T6

ACCTGCCTAG

GSCYTCCTSA

S&&AYC2WS

GGGG&GCCCA

CAGCSPSCCSG

GAAACGAGCT

TTCTYCCCAT

C&CCATCACC

AAACYTYAGC

CAAATATGGC

Gcusrwrr

ATYATTTAG&

ACTTTmGA

GCCGTTAC1A

ACTUGOC

TYGAGGCCCA

CTCCTCTGGY

AGAGTGCTCA

CCAGTGAS5G cerrsTTCCG

AATATOSAGC

ACAAGCACTG

GUAYTGACGY

GYCTCYCCTA

TAATYGYCCY

AGGAGCTGAG

GGAAGCTGCY

ACAGTGATCC

ATCTG&&&GT

CCCTGC91GA &TC&CCATT&

CCTTYCYYTA

GAATACCCAA

MKRSASC&T

OSfiSITO

TGGCTTGADT

TGTC&.TCG&C

CAYGSSCYGT

ACAAGAGGGC

CCTSeSCACC

GGGAGCCTCC

TTCGAGGAGC

AGCAG1A&1C

OSGGASXA

TTYNXTGAG

GAAGGAAGCA

TGATGGCCTG gctcatgktt

TGYG&TSSRS

CACCCAAGAT

CGC&CGCTAT

CGTYG&STAT asc&scms

A ttagcagctg

ATGAAATCAG

ACGTTASAST

SCAATGACTA

GAYGTTGCG^

TTTACCYTAA

CTGCAACAGC

CTGGSCCTGG

CTGGAGAAG9

GcerrtcccA

CGTGftAGAGG

ACTAAGAAGG

GTCACAAAGG

ATCYTCGGCA

GACCCCACCG

CYGGGYGATA

CCAA1GGAGG

GTGYAYGAIG

TTGGTGCAGG

GAGTTCCTGT

GTGATC8A6G

AGAGADOA-GT

GCGTACTAGC

ACAAAATCAY

GTAAAGCACT

AGG&TGCTOS

AAAAATTCCC

AAGAAATTCA

GYAGTCYGC&

TGTGTGTGCA

TGCCC&CTGC

CTACCATCAA

AGGGGCCAAG

TGGCTGAYTT

CAGAAA.TGCT

AA9CCTCTGA

GCCACYCCTA

ATCAGATCAY

GCGGCC&TGC

GGAGG9AGCA

ARAASTACCT

GGGGTCCAAG

TCAGTGCAAG

AftGAGGGAGT

AGGTTGTAGC

TATTGCTCAC

TSCGYTTGCA·;

TTTACTGGTT

ACATCGTCAY

AAGTTTAGAA

CTGCAAGCCY

GGCWCCACC

TGGGTCAACA

CTTCACTCGA

CACCTCTTGT

GGTTGGTTTT

9G&G&SYGTC

GYCCYYGC&G

TGTCCTTGYC

GCCCAAGEACft

TCCTGAGGAG

CAGYGCXYAT

GGAGTACCGG ggccctcgct

AGTWSCTTT

CGGCGSTCAT €0

120

180

240

300

388 «20 <8Ö

5*9

Ő08

659

120

780

MG

590

569

1029

1GSG

11*8

1280

1250

1320

1341

A I. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 466 asdnosav TÍPUSA: ainosav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULÁTIDUS: fehérje ♦ φ φ X Φ Φ φ *

-4 Φ * Φ Α

A

4 .

iZOH

ÍOSÍ

TÖSZÁdí

J S’Z

:'EKV

ENC

ΣΑ Σ

,E ÍRÁSA

*

Met

Asp

Pro

Lys

Thr

Lett

Alá

Leó

Ser

Lett

Lett

Ma

Alá

Gly

Val

Leó

1

5

10

15

Alá

Gly

Cys

Ser

Ser

His

Ser

Ser

Asn

Mer

Alá

Asn

2br

Gin

Két

Lys

20

25

30

Ser

Asp

lys

lle

He

Alá

Kis

Arg

Gly

Ma

Ser

Gly

Tyr

Leó

Pro

35

40

45

Gitt

HiS

Thr

Len

Gro

Ser

Lys

Alá

Leó

Al®

Phe

Alá

Gin

Gin

Alá

Asp

50

55

68

Tyr

Lee

Sió

Gin

Asp

Le»

Alá

Met

Thr

Lys

Asp

Gly

Arg

Lett

Val

Val

S5

70

75

80

He

His

Asp

Kis

Pbe

Leó

Asp Gly

Lett

Thr

Asp

Val

Alá

Lys

Lys

Phe

85

30

OS

Pro

Kis

Arg

His

Arg

Lys

Asp Gly

Arg

Tyr

Tyr

Vei

He

Asp

Pb©

Tbr

100

105

no

Lett

Lys

Gitt

lle

Grn

Ser

Gin

Mer

Tbr

Gin

Asn

Pbe

Gis

Thr

Met

HS

120

125

Gly

Ser

Leó

Gitt

Gitt

Arg

Ser

Leó

Kis

Cys

Lys

Pro

Gitt

Glo

Alá

Len

130

135

140

Gitt

Alá

Gin

Gin

Gle

Ma

Lee

Gly

Leó

Val

Cys

Val

Gin

Ma

Alá

Tbr

145

ISO

155

ISO

Ser

Ser

Sor

Ser

Pro

Lee

Val

Hu

Gly

Thr

Len

Gitt

Glo

Val

Pro

T&r

145

170

175

M®

Gly

Ser

Tbr

Asp

Pro

Pro

Gin

Ser

Pro

Gin

Gly

Alá

Ser

Alá

Pbe

ISO

185

100

Pro

Tbr

Thr

11©

ft®

Pbe

Ittr

Arg

Gin

Arg

Gin

Pro

Ser

Gitt

Gly

Ser

105

208

205

Ser

Ser

Arg

Glo

Gitt

Glo

Giy

Pro

Ser

Thr

Ser

Cys

11«

Lett

Gitt

Ser

210

2X5

220

Le»

Pbe

Arg

Alá

Hl

He

Tbr

Lys

Lys

Vei

Alá

Asp

Val

Gly

Phe

225

230

235

240

tea

Lee

Se»

Lys

Tyr

Arg

Alá

Arg

Glo

Pro

Val

Tbr

Lys

Ma

Glo

Met

245

250

255

Lee

Gitt

Ser

Val

Xle

LyS

Asn

Tyr

Lys

Kis

Cys

Pb©

Pro

Gitt

He

Pb©

2SÖ

285

270

Gly

Lys

Ma

Ser

Gitt

Ser

Lett

Gitt

Lett

Val

Pbe

Gly

lle

Asp

Val

Lys

275

280

285

Sitt

Alá

Asp

Pro

Tte

Gly

His

Ser

Tyr

Vei

Len

Val

Tbr

Cys

Lea

Gly

2S0

205

300

Lett

Ser

?yr

Asp

Gly

Lee

Lee

Gly

Asp

Asn

Gin

He

Met

Pro

Lys

Tbr

305

310

315

320

Gly

Phe

lee

lle

He

Val

Lee

Kai

Met

11©

Alá

Met

Gitt

Gly Gly

His

325

.330

335

Alá

Pro

Gitt

Gitt

Gitt

Lle

Trp

Glo

Gin

Lee

Ser

Val

Met

Gitt

Val

Tyr

340

345

350

Asp

Gly

Arg

Gitt

His

Ser

Alá

Tyr

Gly

Gitt

Pro

Arg

Lys

Lett

Len

Tfcr

355

368

3S5

Gin

Asp

Leó

Val

Gin

Gitt

Lys

Tyr

Lett

Gin

Tyr

Arg

Gin

Val

Pro

Asp

370

375

380

Ser

Asp

Pro

Alá

Arg Tyr

Sitt

Pbe

Lett

Trp

Gly

Pro

Arg

Alá

Lett

Alá

385

3S0

355

400

Gin

Thr

Ser

Tyr

Val Lys

Val

Leó

Gitt

Tyr

Val

Xle

Lys

Val

Ser

Alá

405

410

415

Arg

Vei

Arg

Pb©

Pbe

Pbe

Pro

Ser

Lett

Arg

Glo

Alá

Alá

Lee

Arg

Gitt

420 425 4 30

Gitt Gitt Gly Vni Gly Gly Kis Has H.zs His HIíí His His 435 440 445

AZ 5. AZONOSÍTŐSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 404 aminosav TÍPUSA: aminosav HÁNY SZÁLÚ: sgy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULÁT í PUS: fehérje

AZ 5. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

SS

145

225

305 .50

138

210

230

370

Pro	ÁStt	Thr	Val	Ser	Ser	Phe	Gin	Val	Asp	Cys	?he
		5					10
Arg	Lvs	Arg	Val	Ale	Asp	Gin	Gitt	Len	Gly Asp Alá
	28					25					30
Arg	LStt	Arg	Arg	Asp	Gin	Lys	Ser	Leu	Arg Gly Arg
35					40					45
Gly	Lett	Aep	lle	Gitt	Thr	Ale	Thr	Arg	Ale	siy	lys
				55					eo
Arg	lle	lett	Lys	Gitt	Gltt	Ser	Aep	Gla	Alá	Len	Lys
			70					75
tett	Gitt	Gin	Arg	Ser	Gitt	His	Cys	Lys	Pro	Gitt	Gin
		85					30
Arg	Gly	Gitt	Ale	Leu	Gly	Leu	Vei	Sly	Aia	Gin	Ale
	100					105					110
Gitt	Gin	Gitt Alá	Alá	Ser	Ser	Ser	Ser	Thr	Lett	Val
1.15					120					125
Gly	Gitt	Val	Pro	Alá	Alá	Gitt	Ser	Pro	Asp	Pro	Pro
				135					140
Oly	Alá	Ser	Ser	Leu	Pro	TAr	Thr	Met	Asn	Tyr	Pro
			150					155
Ser	Tyr	Gitt	Asp	Ser	Ser	Asn	Gin	Gitt	Gitt	Gitt	Gly
		165					170
Pro	ASO	Len	Gitt	Ser	Gitt	Pbe	Gin	Ale	Ale	Lett	Ser
	188					185					ISO
Gitt	Len	Val	81s	Pfee	Lee	Lett	Lett	Lys	Tyr	Arg	Alá
155					200					205
Thr	Lys	Ale	01«	Met	Lee	Gly	Ser	val	Val	Gly	Asn
				215					220
Phe	Pro	Vei	lle	Phe	Ser	Lys	Alá	Ser	Ser	Ser	Lett
			230					235
Gly	lle	Gitt	Lett	Mer	Gitt	Vei	Asp	Pro	Xle	Gly	Pia
		245					250
Alá	Thr	Cys	Lett	Gly	Lee	Ser	Tyr	Asp	Gly	Lee	Lee
	2S0					2S5					270
lle	Mer	Pro	Lys	Aia	Oly	Lee	Leu	Xie	Xle	Val	Lee.
275					200					285
Ar?	Gin	Gly Asp	Cys	Alá	Pro	Glu	Glu	Lvs	l'le	Trp
				235					308
Vei	len	Gitt	Val	Phe	Sitt	Gly	Arg	Gitt	Asp	Ser	lle
			310					315
Lys	lys	Lett	Leu	Thr	Gin	Hxs	Phe	Val	Gin	Gitt	Asn
		325					330
Arg	Gin	Vei	Pro	Sly	Ser	Asp	Pro	Alá	Cys	Tyr	Gitt
	340					345					350
Pro	Arg	Ale	leu.	Val	Gitt	Tfer	Ser	Tyr	Vei	Lys	Val
355					3 SS					385
Val	Lys	lle	Ser	Gly Oly	Pro	His	Xle	Ser	Tyr	Pro
				375					380
Trp	Val	Lett	Arg	Gitt	Gly	Gitt	Gin	Gly	Gly	«is	8 is

S>5 ns

255

335

ISO ?40

320

Prs Kis Sis ~ £4 A 6. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1212 bázispár TÍPUSA; nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULATÍPUS: cDNS

A S. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGG&fCCAA ACACTSTGTC AAGCTTTCAG CGAGTTGCAS ACCAAGAACT &GGTGATGXX AAATCCCTAA GAGGAAGGGG CMGCftCTCTF GGAAAGCAGA TAGTGGASÖS S&TTCTGAAA ATGGATCTGG AACAGCGTAG TCASCACTGC GAGGCCCTGG GCCTGGTGGG TGOSCASGCT TCCTCTTCTA CTCTAGTTGA ^GTCSCGCTS CCTCCCCAGA CTCCTGAGGG &GCCTCCAGC AGCCAATCCT ATGAGGACTC CAGCAACCAA CTSGAGTOCG AGTTGCA&SC AGCACTCAGT CTGCTCAAGT ATCSJM30CBG GGaGOXSTC GGAAATTGGG AGTATTTCTT TCCTGTGATC GTCTTTGGCA TCGAGCTGAT GG8AGTGGAC TGCCTGGGGC TCTCCTACGA TGGCCTGCTG CTCCTGATAA TCSTCCTGSC OffiMTO» ATCTGGGAGG AGCTOAGTGT CTTAGAGGTS GATCCCAAGA AGCTGCTGAC CCAACATTTC STCCCCGGC& GTGATGCTGG &TGTTATGA& aocacctatg tgaaagtcgt scsoc&tatg TACCC&OCCC TGCATGAGTG GCTTTTGAGA CATCACSATT AA

GTAGATTGCT TTCTTTGGCA TGTCCGCAAA CGATTCCTTG ATCGGCTTCG CCGAGATCAG GGTCTGGACA TGGAGACAGC CACACGTGCT G&&GAATCCG ATGAGGCACT T&AAATGACC AAGCCTGAAG AAGGCCTTGA GGCCCSAGGA CCTGCTACTG AGGAGCAGGA SGCTGCCTCC GSGGAGGTGC CTGCTOCCGA GTCACCAGAT CTCCCCACXA CCATGA&CTA CCCTCTCTGG GAAGAGGAGG GGCCAAGCAC CTTCCCTGAC &GS&&GGTGG CCGA&TTGCT TCATTTTCTG ACtótóOG AAATGCTGGG G&STGTCGTC TTCAGCA&AG CPTCCAGTTC CTTGCAGCTG CCGATCGGCC ACTTGTACAT CTTTGCCACC GGTGACAATC AGATCATSCC CA&GGCAGGC AGAGAGGGCG XCTOTGCCCG TGAGC3M3AAA

GGGAALACMG TATCTTGGGS GTGC&SG&AA 8CTACCTGGA GTACCGGCAG TTCCTGTGGG GTCCAAGGGC CCTCGTTGAA GTA&ASATeA GTGGAGGACC TCACATTTCC GAGGSGGAAG ASGGCGGTCA TCACCATCAC

SÖ

120

280

240

3ÖÖ

380

420

480

540

800

880

720

780

840

900

000

1020

2080

1240

1200

2222

A 7, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 735 amlnosav TÍPUSA: amlnosav HÁNY SZÁLÓ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT! PUS: fehérje

A 7.

. AZ

•ONO.

SÍTC

>SZÁ

MÓ

SZEKVENCIA

LEÍRÁSA:

Met

Lys

Oly

Oly

Ile

Vei

8Í.S

Sex

Asp

Giy

Ser

Tyr

Pro

tys

Asp

tys

2

5

20

15

Phe

Giu

Lys

Ilé

Arn

Gly Thr Trp

Tyr

Tyr

Phe

Asp

Ser

Ser

Giy

Tyr

20

25

30

Met

Len

Alá

Asp Arg

Trp Arg Lys

Sir

Thr

Asp

G.ly

Astí

Trp

Tyr

Trp

35

40

95

Fhe

Arp

Asn

Ser

Giy

Glu

Mát

AJ.®

Thr

G2y

Trp

Lys

tys

lle

Aia

Asp

50

55

80

Lys

Trp

Tyr

Tyr

Phe

Ara

GXu

Gin

Giy

AXa

Met

Lys

Thr

Oly

Trp

VaX

85

70

75

80

Lys

Tyr

tys

Asp

Thr

Trp

Tyr

Tyr

Len

Asp

Alá

tyr

Glu

GXy

Al®

Met

85

90

95

Vei

Ser

Asn

Alá

Pha

He

Gin

Ser

Al®

Asp

Giy

Thr

Gly

Trp

Tyr

Tyr

100

105

; ;h

* * *

Leu

Lys

Pro 115

Asp

Gly

Thr

Lett

Alá 120

Asp

Arg

g'£'Q·

Gitt

Len 125

Asp

Mer

Gly

Ser

Lee 130

Gl»

Gin

Ara

Ser

Lee 135

Hls

Cys

Lys

Pro

Gitt 140

Gitt

Alá

Le»

Gl»

Alá 145

ni n

Gin

Gin

Alá

Len 150

Gly

Lett

Val

Cys

Val 155

Gin

Alá

Alá

Thr

Ser ISO

Ser

Ser

Ser

Pro

Lett 185

Vai

Leu

Gly

Thr

Leu 120

Gi»

Gitt

Val

Pro

Thr 17 5

Alá

Gly

Ser

Thr

Asp ISO

Pro

Pro

Gin

Ser

Pre 185

Gin

Gly

Alá

Ser

Alá 130

Phe

Pro

Thr

Thr

lle 135

Asn

Phe

Thr

Arg

Gin 200

Arg

Gin

Pro

Ser

Gitt 205

Gly

Ser

Ser

Ser

Arg 210

Gitt

Gitt

Gl» Gly

Pro 215

Ser

Thr

Ser

Cys

He 22G

La»

Gl»

Ser

Le»

Phe 225

Arg

Alá

Vei

Lle

Thr 230

Lys

Lys

Val

Alá

Asp 235

Le»

Val

Gly

Phe

Lett 240

Lee

Lee

Lys

Tyr

Arg 245

Ma

Arg

Sitt

Pro

Val 250

Thr

Lys

Alá

Gitt

Met 255

Len

Sin

Ser

Vei

lle 280

Lys

Asn

Tyr

Lys

Ris 255

Cys

Phe

Pro

Gin

lle 270

Phe

Gly

Lys

Alá

Ser 275

Gle

Ser

Lee

Gin

Lee 280

Val

Phe

Gly

He

Arc 225

Val

Lys

Gitt

Alá

Asp 200

Pro

Thr

Gly

Mis

Ser 235

Tyr

Val

Lett

Val

Thr 300

Cys

Lett

Gly

Leu

Ser 305

Tyr

Asp

Gly

Leu

Leu 310

Gly Asp

Asn

Gin

lle 315

Mer

Pro

Lys

Thr

Gly 320

Éhe

Lee

lle

lle

Val 325

Lett

Val

&et

lle

Alá 330

Mer

Gitt

Gly

Gly

Rís 335

Alá

Pro

Gl»

Gl»

Gitt 340

Lle

Trp

Gla

G-Lti

Le» 345

Ser

Val

Méh

Gia

Val 350

Tyr

Asp

Gly

Arg

Gitt 35S

His

Ser

Alá

Tyr

Oly 3S0

Gitt

Pro

Arg

Lys

Leu 385

Leu

Thr

Gin

Asp

Lee 370

val

Gin

Gle

Lys

Tyr 375

Lett

Gitt

Tyr

Arg

Gitt. 380

Val

Pro

Asp

Ser

Asp 30 5

Pro

Alá

Arg

Tyr

Gin 350

Phe

Len

Trp

Gly

Pre 335

Arg

Alá

Le»

Alá.

Gl» 400

Thr

Ser

Tyr

Val

Lys 40S

Val

Leu.

Gitt

Tyr

Val 410

He

Lys

Val

Ser

Alá 415

Arg

Val G.lu

Arg Gitt

Phe Gly 435

Éhe 420 Val

Fhe Frö GXy Gly

Ser Sás

Lee Sás 440

Arg 425 Kis

Gitt &Ls

Alá Sás

Alá Has

Lett Sás 445

Arg 430

Gitt

Gitt

ATOAAAGGGL

MATGGCACTT

CACACAGACG

AAAATGGGTG

AAGTACAAGG

TTTATCCAGT

GACAGGCCAG

GAAGCGC.TTG

A 8. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:

A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA; 1.33 8 házispán

T í PU SA: n u k 1 e 1 n. sav

HÁNY SZÁLÚ: egy

TOPOLÓGIÁJA: lineáris

MOLEKULÁT í PUS: DNS

A 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

AAGACAAGTT TGAGAAAATC GO

TTGCAGACCG CTGGAGGAAG 120 mWW AGGCTGGAAG ISO cgatgaagag AGGCTGGGTC 240

GG0CCA7GGT ATCAAATGCC 300

AAGCAGACGG &ACACTGGCA 380

GTCTtaCTS CAAGCGTGAG 420

GTGTGGAGGC TGCCACCTCC 43S

CCACTGCTGG GTCAACAGAT 540

TTCASAOGSC

TGACAGTTCA

CTGGTTCGAC

GTATTTCAAC

CT&CTTAGAC

AACASGCTSG

GGGCTCTCTG

AGAGGOOCTG

GGGCACGGTG

G&ATTSTAGA

GÖTAGTAGTT

GCAACTGGTA

ATAAGTGGTA

ACACTTGGTA

CAGCGGACGG

AATTGGACAT

AGGCCCAACA

CTCTGGTGCT

TCTTATGCAA

GGCTATATGC

AACTCAGSGG

SA&GAAGSTG

GCTAAAGAAG

TAGTACCTCA

GAAGAGCGTA

GGCCTGGTGT

GAGGAGGTGC «·

CCTCCCCA6A GTCGTCAGGG AGCCTCCGCC AGGCAACGCA GTGAGGGTTG CAGGAGCCGT CTGG&GTGCT TGTTCGGAGG AGTA8TCACT GTGC'TCAAAT ATCGAGGCAS GGDGCCAGTC AAAAATTACA AGCACTGTTT TCCTGAGATC GTCTTTGGGA TTGACGTGAA GGALGCAGAC TGCGTAGGTC TCTGGTATGA TGGGCTGCTG TTGCTGATAA TTGTCGTGGT CATGATTGCA ATCTGGGAGG AGCTGAGTGT GATGGAGGTG GAGCGCAGGA. AGGTGCTCAC CCAAGATTTG GTGCCGGACA GTGATCCCGC ACGCTATGAG ACCAGCTATG TGAAAGTCCT TG8GTATGT6 TTCCCATCCC TGCGTGAAGC AGCTTTGAGA CATCACCATC AGCATTAA

TTTCCCAGTA CCATCAACTT CACTCGACAG GAAGAGGAGG GGCCAAGCAC CTCTTGTATC AAGAAGGTGG CTGATTTGGT TGGTTTTCTG ACAAASGC&G ASATGCTGGA GAGTGTCATC TTCGGCAAAG CCWTGAGTC CTTGCAGCTG CCCACCGGCC' ACTCCTATGT GCTTGTCACC GGTGATAATG AS&TC&TGCC CAAGACAGGC AT66AGGGCG GCCATGCTGC TGAGGAGGAA TATGATGGGA GGGA.GCACA.G TGCCTATGGG GTGCAGGAAA AGTACCTGGA GTACCGGCAG TTCCTGTGGG GTCCAAGGGC CCTCGCTGAA ATCAAGGTCA GTGCAAGAGT TCGCTTTTTC GAGGAGGAAG AGGGAGTCGG CGGTC&TCAC soo δ se 720 760 840 300 560

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1.338

A 9„ AZONOSÍTÖSZÁMŰ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 4.54 aminosav 1 í íNíD.e.: aiAinosav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris MOLEKULÁT!PUS: fehérje

A 9. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

Met Lys	Gly	Sly	Ile	Val	Kis Ser Asp Gly Ser Tyr Pro Lys	Asp Lys
1			S		10	15
The Gitt	Gys	Ile	Asn	Gly Thr Trp Tyr Tyr Phe Asp Ser Ser	Gly Tyr
		20			25 30
Mát Len	Alá	Asp	Arg	Trp Arg Lys Kis Thr Asp Gly Asn Trp	Tyr Trp
	35				40 45
PAe Asp	Asn	Ser	Gly	Gin	Mát Alá Thr Gly Trp Lys Lys Ile	Alá Asp
se					55 60
Lys Tm	Tyr Tyr	Phe	Asn	Gin Gin Gly Alá Met Lys TAr Gly	Trp Vei
65				70	75	80
Lys Tyr	Gye	Asp	Thr	Trp	Tyr Tyr Len Asp Alá Lys Gin Gly	Alá Met
			85		80	85
Val Ser	Aen	Alá	Phe	Xle	Gin Ser Al.a Asp Gly Thr Gly Trp	Tyr Tyr
		100			105 no
Len Gye	Pre	Asp Gly	Thr	Len Alá Asp Arg Pro Gin Len Alá	Ser Mer
	11.5				120 125
Len Aep	Met	Assp	Ge»	Gin	Gin Arg Ser Gin Kis Cvs Lys Pro	Gin Gin
130					135 140
Gly Len	Gin	Alá	Arg	Gly	Gin Alá Lan Gly Len Vei Gly Alá	Gin Alá
145				150	155	160
erő Alá	Thr	Glu	Gin	Gin	Gin Alá Alá Ser Ser Ser Ser Thr	Lan Val
			165		170	17S
Gin Vei	Thr	Len	Gly Gin	Val Pro Alá Alá Gin Ser Pro Aso	Pro Pro
		180			185 ISO
Gin Ser	Orv	Gin	Gly Alá	Ser Ser Len Pro Thr Thr Met Asm	Tyr Pro
	155				200 205
Len Tr»	Ser	Gin	Ser	Tyr	Gin Asp Ser Ser As» Gin Gin Gin	Gin Gly
210					215 220
Pro Ser	TAr	8he	Pro	Asp	Len Gin Ser Gin Phe Gin Alá Alá	Len Ser
225				230	235	240
Arg Lys	Vei	Ale	Gin	Len	Vei Kis Pha Len Len Len Lys Tyr	Arg Alá
			245		250	255
Arg Gin	Pro	Oni	Thr	Lys	Alá Gin Mát Len Gly Ser Val Val	Gly Asn
		260			255 270
Trp Gin	Tyr	Phe	Phe	Pro	tel Ile Phe Ser Lys Alá Ser Ser	Ser Len
	275				280 285
Gin Len	Val.	Phe	Gly	I1&	Gin Len Met Gin Tál Asp Pro Ile	Gly 81 s

ü f ff ff A ff ff «X ff * ff

Xffff ff ♦ 9. xff «ff ♦ ff * *

230 295 3oo

Leu Tyr Σίβ Phe Alá Thr Cys Leu Gly Xey Ser Tyr Asp GXy Lén Leu

305 310 315 320

Gly Asp Asn. Gin He Mec Pro Lys Alá GXy Len Len 11« n_s y_ai r._eu

325 33 8 335

Aia IXe He Alá Arg Gin Gly Asp Cys Alá Pro Gin Gl« Lys Ile Tro

340 345 350

Gin Glu Lett Ser Vei Len Gin Val Phe Glu Gly Arg Gin Asp Ser XXe

3SS 360

38í

Gly

Asp

Pro

Lys

Lys

Lett

Lett

Thr

Gin

PXs

Ph©

VaX

Gin

Gin

Asn

3X8

37S

300

Len

Gin

Tyr

Arg

Gin

Val

Pro

oly

Ser

Asp

Pro

Alá

Cys

Tyr

GXn

330

305

488

Len

Trp Cly

Pro

Arg

Alá

Lee

val

GX«

TKr

Ser

Tyr

Val

Lys

VaX

405

4X0

4X5

81s

Kis

Mst

Val

Lys

Ile

Ser

Gly

Gly

Pro

81s

11©

Ser

Tyr

Pro

420

425

438

Len

Sir

Gin

Trp

VaX

Leu

Arg

Gin

GXy

Gin

Gin

GXy GXy

Sás

Ois

43S

448

445

01 s

Ols

Sir

8is

450

A 10. AZONOSÍTŐSZÁKÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:

HOSSZA: 1362 bázispár TÍPUSA: nnkleínsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA; lineáris MOLEKULÁT!Pü'S.: cDNS

A 10. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:

ATGAAAGGGG GAATTGTACA TTCAGAGGGC AATGGCACT7 GGTACTACT7 TGACAGTTCA CACAGAGACG 5CAACTGGTA CTGGTTCGAC AAAATCGCTG A7AAGTGGTA CPATTTC&AC AAGTACAAGG ACACT7GG7A ctacttagac TTTATCGAGT CAGCGSWSG AAGAGGCTGG GACAGGCCAG AATTGGCCAG CATGCTGGAO AAGCCTGAAG AAGSCCTOSA GGCCCGAGGA CCTGCTACTG &SGAGCASGA GGCTGCCTCC GGGGAGGTGC CTGCTGCOGA GTCACCAGA7 C7CCCCAC7A CCATGAACTA CCCTCTCTSS GAAGAGGAGG GGCCAAGCAC crTCtXTGAL AGGAAGGTGG CCAAGT3GGT TCmTKTS ACA&AGGCAS AAATOGTGSG GASTGTCGTC 7TCAGC&A&G CTTCCGATTC CTTGGAGCTG CCCKTCGSCC AGSTStaCRT CTTTGCCACC GGTGACAATC AGATCATGCC CAAGACASGC AAAGAGGGCG ACTGTGCCCC 7GAGGAGAAA TT7GAGGGGA GGGAAGACAG TATG7TCGGG GTGCAGGAAA AGTACC7GGA GTACCGGC&G T7CCTGTGGG GTCC&AGGGG CCVCATTGAA GTAAAíGATCA GTGGAGGACC TCGCATTTCC GAGGGGGAAG &GGGCGGTCA TCACCATCAC

TCTTATCCAA AAGACAAG7T TGAGAAAATC 68 GGCT&TATGG 7TGCAGACCG CWGAGSAAG 120 AACTCAGGCG AAATGGCLAG AGGG7GGAAG 188 GAAG&AGGTG CCATGAAGAC ASGCTGGGTC 240 GC7AAAGAAG GCGCCATSST ATCAAATGCC 308 TAGTACCTCA AACCAGACGG AACAGTGGCA 380 ATGGATCTGG AACAGCGTAG TLAGCACTGC 428 GAGGCCGTGG GCCTGGTGGG TGCGC&GGGT 400 TCCTCTTCTA CTCOGCT3A AGTCACCCTG 540 CCTCCCGASA GTCC7CASGG LGCGTCCAGG SCO AGCCAA1CCT ATGAGGACTC C&GCAACCAA SSÖ CTGGAGTCTG AGTTCCAAGC AGCACTCAGT 728 CTCCTCAAGT ATCGAGCCAS GGAGCCGGTC ?S0 GGAA&TTGGC AGTACTTOT TGCTGTGATC S40 GTGTTTSGCA TCGAGCTGAT GGAAGTGGAC 300 TGCCTGGGGC TCTCCTACGA TGGCCTGCTG 960 TTCCTGATAA TCATCCTGGC CATAATCGCA 1020 ATCTGGGAGG AGCTGAG7G7 GT7AGAGGTG 1080 GMCCCAAGA AGOGCTCM: GCAAXATTTC 1X40 GTCGCCGGGA GTGATCC7GC ATGC7ATGAG 1288 ACCAGGTATG YGSAAGTOCT O3SXATAYG 12S0 TACCCACTCC TGCATGAGTG GGCTTTGAGA 1328 CATCACGAW AA 1302

Claims (16)

1. A MAGB-essisdból származó, tumorral összefüggő artigénszármazek, amely származékoit riolcsoportokat tartalmaz .

2. Az 1. igénypont szerinti antigén, amelyben a származékolt szabad tlolcsoportok karboxi-amidáitak vagy karboxí-metíláltak.

3. As 1. vegv 2. igénypont szerinti antigén, amely fúziós partnerként az alábbiak bármelyikét tartalmazza: protein~D vagy profcein-D olyan származéka, amely annak megközelítőleg az első 1/3-át tartalmazza, vagy az Influenza Mii-fehérjéje vagy annak olyan fragmenss, amely az N~ termináiis 81 aml.nosavat tartalmazza, Streptocoocns pneumoniae-eredefü C-lyta vagy annak olyan fragmen.se, amely a 188--3.05. amínosavakat tartalmazza.

4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti, antigén, amely egy affinitás! toldalékot tartalmaz,

5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti antigén, amelyben a protein-D vagy a fragmense lipidált.

6. Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti antigén, amelyben a MAGÉ-fehérje MAGÉ Al, MAGÉ A2, MAGÉ A3, MAGÉ A4

MAGÉ A5, MAGÉ A6, MAGÉ A?, MAGÉ AS, MAGÉ A9, MAGÉ Alö, MAGÉ

All , MAGÉ A12, MAGÉ El, MAGÉ B2, MAGÉ B3, MAGÉ B4, MAGÉ Cl vagy MAGÉ C'2 .

7. A 3~S. igénypontok bármelyike szerinti fúziós fehérjét kódoló nukieinsav-szekvencia.

8. A 7. igénypont szerinti nukleinsavat tartalmazó vektor.

9. A 7, igénypont szerinti, au kiéin savval vagy a 8. igénypont, szerinti vektorral transzformált gazdasejt.

1G. Az l-δ. igénypontok bármelyike szerinti antigént vagy a 7. igénypont szerinti nukleinsavat tartalmazó vakcina.

11. A lö. igénypont szerinti, vakcina, amely adjuvánst és/vagy ircmunstimulátor tulajdonságokkal rendelkező eltekint vagy kemokínt is tartalmaz.

12. A 10. vagy a 11. igénypont szerinti vakcina, amelyben a fehérje „olaj a vízben vagy „víz az olajban típusú emulziós hordozóban, van jelen.

13. A 11. vagy a. 12. igénypont szerinti vakcina, amelyben az adjuváns 3D~MPL~t_; Qs21-et vagy CpG-oligonukleotidot tartalmaz.

14. A 10-13. igénypontok bármelyike szerinti vakcina, amely egy vagy több egyéb antigént tartalmaz.

15. A 10-13. igénypontok bármelyike szerinti vakcina gycgyá s z a t i a1kalma zásra.

16. A 7. igénypont szerinti nuklelnsav vagy az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti antigén alkalmazása msianőmában, mellrákban., hőiy a gr ókban, tüdőrákban, NSGLCben, fej és nyak pikkelysejtes rákjában, bélrákban, nyelőcsórékban vagy más, MAGS-vel összefüggő tumorban szenvedő beteg immunoterápiás kezelésére szolgáló vakcina előáiiitásában..

17. Eljárás MAGÉ-fehérje vagy annak MAGÉ fúziós fehérjéje tisztítására, ahol a MAGÉ-fúziós fehérje tartalmaz egy immunológiai fúziós partnert, amely T-helper epitópokat biztosít, azzal jellemezve, hogy a diszulfid-kötés/eke/t redukáljuk, a kapott szabad tiolcsoporto/ka/t blokkolóosoporttai blokkoljuk, és a kapott származéko/ka/t egy vagy több kromatográfiás lépésnek vetjük alá.18. Eljárás vakcina előállítására , azzal jellemezve, hogy a 17. igénypont szerinti eljárás alkalmazásával MAGÉ-fehérjét tisztítunk vagy annak MAGÉ fúziós fehérjéjét tisztítjuk, ahol a MAGÉ-fúziós fehérje immunológiai fúziós partnert tartalmaz, amely T~heiper epitópokat biztosít, és a kapott fehérjét vakcinaként formulázzuk.