NO328507B1 - Tumorassosierte antigenderivater fra MAGE-familien, vaksine inneholdende slike og anvendelse for fremstilling av vaksine, samt fremgangsmate for rensing av antigenderivatene og fremstilling av vaksinen - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse vedrører tumorassosierte antigenderivater fra MAGE-familien, vaksine inneholdende slike og anvendelse for fremstilling av vaksine, samt fremgangsmåte for rensing av antigenderivatene og fremstilling av vaksinen.

Antigener som kodes for av familien fra MAGE-genene er fortrinnsvis uttrykt på melanomceller (inklusiv malignt melanom) og noen andre cancere inklusiv NSCLC (ikke-småcellet lungecancer), hode og nakke platecellecarcinom, blæretransisjonscelle carcinom og spiserørscarcinom, men er ikke detekterbare på normale vev med unntak i testikler og placenta (Gaugler, 1994; Weynants, 1994; Patard, 1995). MAGE-3 ble uttrykt i 69% av melanomene (Gaugler, 1994), og kan også detekteres i 44% av NSCLC (Yoshimatsu 1988), 48% av hode og nakke celle carcinom, 34% av blæretransisjons-cellecarcinom 57% av spiserørscarcinom 32% av koloncancer og 24% av brystcancere (Van Pel, 1995); Inoue, 1995 Fujie 1997; Nishimura 1997). Cancere som uttrykker MAGE-proteinene er kjent som MAGE-assosierte tumorer.

Immunogeniteten til humane melanomceller har blitt vist i eksperimenter ved å bruke blandede kulturer av melanomceller og autologe lymfocytter. Disse kulturene danner ofte spesifikke cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) som er i stand til å lysere utelukkende eksklusivt autologe melanomceller, men verken autologe fibroblaster, eller autologe EBV-transformerte B-lymfocytter (Knuth, 1984; Anichini, 1987). Flere av antigenene som gjenkjennes på autologe melanomceller av disse CTL klonene er nå identifisert, inklusive de fra MAGE-familien.

Det første antigenet som kunne defineres gjennom dets gjenkjenning ved spesifikk CTL på autologe melanomceller er kalt MZ2-E (Van den Eynde, 1989) og kodes for av genet MAGE-1 (Van der Bruggen, 1991). CTL rettet mot MZ2-E gjenkjenner og lyserer MZ2-E positive melanomceller fra autologe så vel som fra andre pasienter forutsatt at disse cellene har HLA.A1 allel.

MAGE-1 genet tilhører en familie av 12 nært beslektede gener, MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MAGE 5, MAGE 6, MAGE 7, MAGE 8, MAGE 9, MAGE 10, MAGE 11, MAGE 12, lokalisert på kromosom X og som deler fra 64 til 85% med hverandre i deres kodene sekvens (De Plaen, 1994). Disse er noen ganger kjent som MAGE Al, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE Al 1, MAGE A12, (MAGE A familien). To andre grupper av proteiner er også en del av MAGE-familien skjønt de er mer fjernt beslektet. Disse er MAGE B og MAGE C gruppen. MAGE B familien inkluderer MAGE Bl (også kjent som MAGE Xpl, og DAM 10), MAGE B2 (også kjent som MAGE Xp2 og DAM 6) MAGE B3 og MAGE B4 - MAGE C familien inkluderer for tiden MAGE Cl og MAGE C2.1 generelle vendinger kan MAGE-proteinet defineres til å inneholde en kjernesekvenssignatur lokalisert mot den C-terminale enden i proteinet (for eksempel med hensyn på MAGE Al et 309 aminosyreprotein, hvor kjernesignaturen korresponderer mrf amino syren 195-279).

Konsensusmønsteret til kjernesignaturen blir derfor beskrevet som følger hvori X representerer en hvilken som helst aminosyre, nedre tilfeller av residier er konservert (konservative varianter er tillatt) og øvre tilfeller av residier er perfekt konservert.

Kjernesekvenssignatur

LixvL (2x) I (3x) g (2x) apEExiWexl (2x) m (3-4x) Gxe (3-

4x) gxp (2x) lit (3x) VqexYLxYxqVPxsxP (2x) yeFLWGprA (2x) Et (3

x) kv

Konservative substitusjoner er vel kjent og blir generelt satt opp som standard scorings-matriser i sekvensoppstillingscomputerprogram. Disse programmene inkluderer PAM250 (Dayhoft M.O. et al., (1978), "En modell for evlusjonære endringer i proteiner", i "Atlas for proteinsekvens og -struktur" 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington, and Blosum 62 (Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992), "Amino acid substitution matricies form protein blocks"), Proe. Nati. Acad. Sei. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919.

I generelle vendinger, er substitusjon innen følgende grupper konservative substitusjoner, men substitusjoner mellom grupper er betraktet som ikke konserverte. Gruppene er:

i) Aspartat, aspargin, glutamat, glutamin

ii) Serin/treonin

iii) Lysin/arginin

iv) Fenylalanin/tyrosin/tryptofan

v) Leucin/isoleucin/valin/metionin

vi) Glysin/alanin

Generelt, og i sammenheng med denne oppfinnelsen, vil MAGE-proteinet være omtrent 50% identisk i denne kjerne regionen med amino syrene 195 til 279 fra MAGE Al. Flere CTL epitoper har blitt identifisert på MAGE-3 proteinet. Et slikt epitop, MAGE-3.Al, er en nonapeptid sekvens lokalisert mellom aminosyrene 168 og 176 i MAGE-3 proteinet som består av en epitop spesifikk for CTL når den er presentert i sammenheng med MHC klasse 1 molekyl HLA.A1. Nylig har to ytterligere CTL epitoper blitt identifisert på peptidsekvensen til MAGE-3 proteinet ved deres evne til å reise en CTL respons i en blandet kultur av melanomceller og autologe lymfocytter. Disse to epitopene har spesifikke bindingsmotiver for henholdsvis HLA.A2 (Van der Bruggen, 1994) og HLA.B44 (herman, 1996) alleler.

For øvrig omhandler følgende dokumenter omhandler nær beslektet teknikk:

WO Al 9639524 beskriver metoder for å øke immunresponsen mot antigener i en vaksine, som for eksempel tumorantigener.

WO Al 9610413 beskriver sammensetninger som igangsetter en immunrespons, der sammensetningen inneholder tumorantigener, eksempelvis peptider fra MAGE-familien, og adjuvanser.

WO Al 9504542 beskriver peptider avledet fra MAGE-1-antigenet, og vaksiner inneholdende disse, som stimulerer en immunrespons hos pasienter med melanom.

Imidlertid omhandler ingen av disse dokumentene oppfinnesen beskrevet heri omfattende forskjellige spesifikke tumorassosierte antigenderivater fra MAGE-familien.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer tumorassosiert antigenderivat tilhørende MAGE-familien kjennetegnet ved at derivatet omfatter derivatiserte tiolresider. Slike derivater er egnet for anvendelse i terapeutisk vaksineformulering som er egnet for behandling av et spekter av tumortyper.

I en utførelsesform av den foreliggende oppfinnelse er antigenet ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at de derivatiserte frie tioler er karboksyamiderte eller karboksymetylerte.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er antigenet ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at antigenet omfatter en fusjonspartner utvalgt fra protein D eller fragment av dette omfattende den første 1/3 av protein D.

Andre fusjonspartnere inkluderer ikke strukturellr proteinrt fra influenzae virus, NS1 (hemagglutinin). Typisk blir de N-terminale 81 aminosyrer utnyttet, skjønt forskjellige fragmenter kan anvendes forutsatt at de inkluderer T hjelperepitoper.

Slike konstruksjoner er i klinisk sammenheng vist av oppfinnerne å være i stand til å behandle melanom. I et tilfelle ble en pasient med stadiet IV melanom fri for melanomer etter to doser av lipo D 1/3 MAGE 3 His protein uten adjuvans.

MAGE-proteinene er fortrinnsvis antigen ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at MAGE-proteinet er utvalgt fra gruppen: MAGE Al, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE Al 1, MAGE A12, MAGE Bl, MAGE B2, MAGE B3, MAGE B4, MAGE Cl og MAGE C2.

Proteinene fra den foreliggende oppfinnelsen blir fortrinnsvis uttrykt i E. coli. I en foretrukket utførelsesform blir proteinene uttrykt med et affinitetsmerke, slik som for eksempel, en histidinhale som omfatter mellom 5 til 9 og fortrinnsvis seks histidin-residie. Disse er fordelaktig under rensning.

Nukleinsyrene som kode for proteiner ifølge den foreliggende oppfinnelse er også nyttige. Slike sekvenser kan settes inn i egnede ekspresjons vektorer og brukes til DNA/RNA vaksinering eller uttrykkes i en egnet vert. Mikrobielle vektorer som uttrykker nuklein syre kan brukes som vaksine. Slike vektorer inkluderer for eksempel, poksvirus, adenovirus, alfavirus, listeria og monarfag.

En DNA sekvens som koder for proteiner ifølg den foreliggende oppfinnelse kan synte-tiseres ved å bruke standard DNA synteseteknikker, slik som enzymatisk ligering som beskrevet av D.M. Roberts et al. in Biochemistry 1985, 24, 5090-5098, ved kjemisk syntese, ved in vitro enzymatrisk polymerisering, eller ved PCR-teknologi som benytter for eksempel, en varmestabil polymerase, eller ved en kombinasjon av disse teknikkene.

Enzymatisk polymerisering av DNA kan bli utført in vitro ved å bruke en DNA-polymerase slik som DNA-olymerase I (Klenow fragment) i en egnet buffer som inneholder nukleosidtirfosfatene dATP, dCTP, dGTP og dTTP som krever en temperatur på 10°-37°C, generelt i et volum på 50 ul eller mindre. Enzymatisk ligering av DNA-fragmentene kan utføres ved å bruke en DNA-ligase slik som T4 DNA-hgase i en egnet buffer, slik som 0,05M Tris (pH 7,4), 0,01M MgCl2, 0,01M ditiotreitol, ImM spermidin, ImM ATP og 0,1 mg/ml bovinserumalbumin, ved en temperatur på 4°C til omkringliggende temperatur, generelt i et volum på 50 ml eller mindre. Det kjemiske syntese av DNA polymeren eller fragmenter kan bli utført ved konvensjonell fosfotriester, fosfit eller fosforamiditkjemi, ved å bruke fastfaseteknikker slik som de som er beskrevet i 'Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual' (ed. H.G. Gassen and A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982), eller i andre forskningspublikasjoner, for eksempel M.J. Gait, h.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat, and R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982,10,6243; B.S. Sproat, and W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983,24, 5771; M.D. Matteucci and M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980,21,719; M.D. Mettaucci and M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical Society, 1981,103, 3185; S.P. Adams et al., Journal of the American Chemical Society, 1983,105,661; N.D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus, and H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984,12,4539; and H.W.D. Matthes et al., EMBO Journal, 1984,3, 801.

Fremgangsmåten i oppfinnelsen kan utføres ved konvensjonelle rekombinante teknikker, slik som beskrevet i Maniatis et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Horbor, 1982-1989.

Spesielt, består fremgangsmåten av følgende trinn:

i) fremstille en replikerbar eller integrerende ekspresjonsvektor i stand til i en vertscelle, å uttrykke en DNA-polymer som omfatter en nukleotidsekvens som

koder proteinet eller et immunogent derivat derav;

ii) transformere en vertscelle med nevnte vektor;

iii) å dyrke nevnte transformerte vertscelle under betingelser som tillater ekspresjon

av nevnte DNA-polymer for å produsere nevnte protein; og

i v) gjenvinning av nevnte protein.

Betegnelsen "transformering" blir brukt heri for å ha betydningen av å introdusere fremmed DNA inn i en vertscelle. Dette kan oppnås for eksempel ved transformasjon, transfeksjon eller infeksjon med et egnet plasmid, eller viral vektor ved å bruke for eksempel konvensjonelle teknikker som beskrevet i Genetic Engineering; Eds. S.M. Kingsman and A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, England, 1988. Betegnelsen "transformert" eller "transformant" vil heretter anvendes på den resulterende vertscellen som inneholder og uttrykker det fremmede genet av interesse.

Ekspresjonsvektorene er nye og er også en del av oppfinnelsen.

De replikerbare ekspresjonsvektorene kan fremstilles i overensstemmelse med oppfinnelsen, ved å kutte en vektor kompatibel med vertscellen for å tilveiebringe et lineært DNA-segment som har et intakt replikon, og kombinere nevnte lineære segment med et eller flere DNA-molekyler som, sammen med nevnte lineære segment koder for det ønskede produktet, slik som DNA-polymeren som koder for proteinet fra oppfinnelsen, eller derivat derav, under ligeringsbetingelser.

Derfor, kan DNA-polymeren bli utført eller dannet under konstruksjonen av vektoren, som ønskelig.

Valg av vektoren vil bli bestemt delvis av vertscellen, som kan være prokaryot eller eukaryot, men er fortrinnsvis E.coli eller CHO-celler. Egnede vektorer inkluderer plasmider, bakteriofager, cosmider og rekombinante virus.

Fremstilling av replikerbar ekspresjonsvektor kan utføres konvensjonelt med egnede enzymer for restriksjon, polymerase og ligering av DNA, ved prosedyrer beskrevet i, for eksempel, Maniatis et al. sitert over.

Rekombinant vertscelle blir fremstilt, i overensstemmelse med oppfinnelsen, ved å transformere en vertscelle med replikerbar ekspresjonsvektor fra oppfinnelsen under transformerende betingelser. Egnede transformerende betingelser er konvensjonelle og er beskrevet i, for eksempel, Maniatis et al. sitert over, eller "DNA Cloning" Vol. II, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985.

Valg av transformerende betingelser er bestemt av vertscellen. Derfor kan en bakterie-vert slik som E.coli bli behandlet med en løsning av CaCh (Cohen et al., Proe. Nat. Acad. Sei., 1973, 69,2110) eller med en løsning som omfatter en blanding av RbCl, MnCh, kaliumacetat og glycerol, og deretter med 3-[N-morfolino]-propan-sulfonsyre, RbCl og glycerol. Mammaliske celler i kultur kan transformeres med kalsium-kopresipitering av vektor DNA på cellen. Oppfinnelsen omfatter også vertscellen transformert med en replikerbar ekspresjonsvektor fra oppfinnelsen.

Dyrking av transformert vertscelle under betingelser tillater ekspresjon av DNA-polymeren blir utført konvensjonelt, som beskrevet, for eksempel, Maniatis et al. and "DNA Cloning" sitert over. Derfor blir cellene fortrinnsvis supplert med næring og dyrket ved en temperatur under 50°C.

Produktet gjenvunnet ved konvensjonelle metoder i overensstemmelse med vertscellen og i samsvar med lokalisering av ekspresjonsproduktet (intracellulært eller sekretert inn i kulturmediumet eller inn i cellepeirplasma). Derfor, der hvor vertscellen er bakteriell, slik som E.coli, kan den for eksempel bli lysert fysisk, kjemisk eller enzymatisk og proteinet produktet isolert fra deres resulterende lysatet. Der hvor vertscellen er mammalsk, kan produktet generelt bli isolert fra næringsmediumet eller fra cellefrie ekstrakter. Konvensjonelle proteinisolasjonsteknikker inkluderer selektiv presipitering, absorpsjonskromatografi og affinitetskromatografi som inkluderer en monoklonal antistoffaffinitetskolonne.

Proteinene fra den foreliggende oppfinnelse er tilveiebrakt enten løselige i en flytende form eller i en lyofilisert form.

Det er generelt forventet at hver human dose vil omfatte 1 til 1000 \ ig av protein, og fortrinnsvis 30-300 ug.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en vaksine som omfatter et protein fra den foreliggende oppfinnelse. Vaksinen kjenetegnes ved at den ytterligere omfatter en adjuvans og/eller et immunstimulerende cytokin eller kjemokin. En foretrukket vaksine-sammensetning omfatter minst lipoprotein D -MAGE-3. Slik vaksine kan eventuelt inneholde en eller flere andre tumorassosierte antigen. For eksempel, andre medlemmer som tilhører MAGE- og -GAGE-familiene. Egnede andre tumorassosierte antigen inkluderer MAGE-1, GAGE-1 eller tyrosinaseproteinene.

Vaksinefremstillingen er generelt beskrevet i Vaccine Design ("The subunit and adjuvans approach" (eds. Powell M.F. & Newman M.J.). (1995) Plenum Press New York). Innkapsling inne i liposomene er beskrevet av Fullerton, US Patent 4,235,877.

En foretrukket utførelsesform omfatter vaksine ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at proteinet er til stede i en olje-i-vann eller vann-i-olje emulsjonsvehikkel.

Egnede adjuvanser inkluderer et aluminiumsalt slik som aluminiumhydroksidgel (alum) eller aluminium fosfat, men kan også være et salt fra kalsium, jern eller sink, eller kan være en uløselig suspensjon av acylert tyrosin, eller acylerte sukkere, kationiske eller anioniske derivatiserte polysakkarider, eller polyfosfazener. Andre kjente adjuvanser inkluderer CpG.inneholdende oligonukleotider. Oligonukleotidene er kjennetegnet ved at CpG-dinukleotidene er umetylert. Slike oligonukleotider er velkjent og er beskrevet i, for eksempel WO96/02555.

I formuleringen fra opprinnelsen er det foretrukket at adjuvanssammensetningen induserer en immunrespons fortrinnsvis av TH1-typen. Egnede adjuvanssystemer inkluderer, for eksempel, en kombinasjon av monofosforyllipid A, fortrinnsvis 3-de-O-acylert monofosforyllipid A (3D-MPL) sammen med et aluminiumsalt. CpG oligonukleotidene induserer også fortrinnsvis en TH1 respons. Spesielt foretrekkes vaksinen ifølge oppfinnelsen kjennetegnet ved at adjuvansen omfatter 3D-MPL, QS21 eller et CpG-oligonukleotid.

Et forsterket system involverer kombinasjonen av monofosforyllipid A og et saponin-derivat spesielt kombinasjonen av QS21 og 3D-MPL som beskrevet i WO 94/00153, eller en mindre reaktogenetisk sammensetning hvor QS21 blir stoppet med kolesterol som beskrevet i WO 96/33739.

En spesielt potent adjuvansformulering som involverer QS21 3D-MPL & tokoferol i en olje-i-vannemulsjon er beskrevet i WO 95/17210 og er foretrukket.

Vaksinen ifølge oppfinnelsen er til bruk som medisin.

Foreliggende oppfinnelse angår også anvendelse av et antigen for fremstilling av en vaksine for immunterapeutisk behandling av en pasient som lider av melanom eller andre MAGE-assosierte tumorer.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også en fremgangsmåte for rensing av et tumorassosiert antigen avledet fra MAGE-familien eller nevnte antigen omfattende en fusjonspartner utvalgt fra protein D eller et fragment derav omfattende den første 1/3 av protein D, omfattende redusering av disulfidbindinger, blokkering av de resulterende frie tiolgrupper med en blokkeringsgruppe, og utsetting av det resulterende derivat for en eller flere kromatografiske rensingstrinn.

Fortrinnsvis er det blokkerende middelet et alkyleringsmiddel. Slike blokkerende midler inkluderer, men er ikke begrenset til alfa-halosyrer eller alfa-haloamider. For eksempel jodeddiksyre og jodacetamid som resulterer i karboksymetylering eller karboksyamider-ing (karbamidometylering) av proteinet. Andre blokkeringsmidler kan anvendes og er beskrevet i litteraturen (se for eksempel, The Proteins Vol II Eds H nuerath, RL Holl and C-L Boeder, Academics press 1976, eller Chemical Reagents for Protein modifi-cation Vol I eds. RL Lundblad and CM Noyes, CRC Press 1985). Typiske eksempler på slike andre blokkeringsmidler inkluderer N-etylmaleimid, kloroacetylfosfat, O-metyl-isourea og akrylonitril. Anvendelsen av blokkeringsmiddelet er fordelaktig siden det hindrer agregering av produktet, og sikrer stabilitet for nedstrømsrensning.

I en utførelsesform av oppfinnelsen, blir blokkeringsmiddelet selektert til å indusere en stabil kovalent og irreversibelt derivat (for eksempel alfa-halosyrer eller alfa-haloamider). Imidlertid, kan andre blokkeringsmidler bli selektert slik at etter rensning kan blokkeringsmiddelet fjernes for å frigi ikke derivatisert protein.

I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen blir proteinet fra den foreliggende oppfinnelsen tilveiebrakt ved et affinitetsmerke, slik som CLYTA eller en polyhistidinhale. I slike tilfeller er proteinet etter blokkeringstrinnet fortrinnsvis utsatt for affinitetskromatografi. For de proteinene med en polyhistidinhale kan imobilisert metallion-affinitetskromatografi (JMA.C) bli utført. Metallionet kan være et hvilket som helst egnet ion for eksempel sink, nikkel, jern, magnesium eller kobber, men er fortrinnsvis sink eller nikkel. Fortrinnsvis inneholder IMAC-bufferen en zwitteriondetergent slik som Empigen BB (heretter Empigen) siden dette resulterer i lavere nivåer av endotoksin i sluttproduktet.

Hvis proteinet blir produsert av en Clyta-del, kan proteinet renses ved å undersøke dets affinitet for cholin eller cholinanaloger slik som DEAE. I en utførelsesform av oppfinnelsen blir proteinene tilveiebrakt med en polyhistidinhale og en Clyta-del. Disse kan bli renset i en enkel to-trinns affinitetskromatografisk rensningsmåte.

Foreliggende oppfinnelse angår også en fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine kjennetegnet ved at den omfatter trinnene: rensing av et tumorassosiert antigen avledet fra MAGE-familien eller nevnte antigen omfatter en fusjonspartner utvalgt fra protein D eller et fragment derav omfattende den første 1/3 av protein D ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, og formulering av det resulterende protein som en vaksine.

Oppfinnelsen vil ytterligere bli beskrevet ved referanse til følgende eksempler:

EKSEMPEL I:

Fremstilling av rekombinant E. coli stamme som uttrykker fusjonsprotein lipoprotein D-MAGE-3-His (LPD l/3-MAGE-3-His eller LpD MAGE-3-His)

1. E. coli ekspresjons system:

Til produksjonen av lipoprotein D har DNA-kodende protein D blitt klonet inn i ekspresjonsvektor pMG 81. Dette plasmidet benytter signalet fra lambda DNA for å drive transkripsjon og translasjonen av de innskutte fremmede genene. Vektoren inneholder lambda PL promoter PL, operator OL og to utnyttelsesseter (NutL og NutR) for å gi transkripsjonspolaritetseffekter når N proteinet er tilveiebrakt (Gross et al., 1985. Mol. & Cell. Biol. 5:1015). Vektorene som inneholder PL promoteren, blir introdusert inn i en E. coli lysogenvert for å stabilisere plasmid DNA. Lysogene verts-stammer inneholder replikasjonsdefektiv lambda fag DNA integrert inn i genome (Shatzman et al., 1983; In Experimental Manipulation of Gene Expression. Inouya (ed) pp 1-14. Academic Press NY). Lambda fag DNA dirigerer syntese av cl repressor proteinet som binder til OL repressoren i vektoren og hindrer binding av RNA polymerase til PL promoteren og derved transkripsjon av det innskutte genet. CI genet til ekspresjonsstammen AR58 inneholder en temperatursensitiv mutasjon slik at PL rettet transkripsjon kan reguleres ved temperaturskift, det vil si en økning i kultur-temperaturen som inaktiverer repressoren og syntese av det fremmede proteinet initieres. Dette ekspresjonssystemet tillater kontrollert syntese av fremmede proteiner spesielt av de som kan være toksiske for cellen (Shimataka & Rosenberg, 1981. Nature 292:128).

2. E. coli stammen AR58:

AR58 lysogen E. coli stammer som blir brukt for produksjon av LPD-MAGE-3-His protein er et derivat av standarden NIH E.coli Kl2 stammen N99 (F-su-galK2, lacZ-thr-). Den inneholder en defekt lysogen lambda (galE::TN10,1 Kil-cI857 DH1). Kil-fenotype hindrer avstenging av vertsmakromolekylær syntese. CI857 mutasjonen gir en temperatursensitiv lesjon i cl repressoren. DH1 delesjonen fjerner lambdafagens høyre operon og vertenes bio, uvr3, og chlA loci. AR58 stammen ble dannet ved transduksjon av N99 med en P lambda fage stock som tidligere var dyrket på et SA500 derivat (galE::TN10,1 Kil- cI857 DH1). Introduksjonen av den defekte lysogenen inn i N99 ble selektert med tetracyklin i kraft av tilstedeværelse av et TN10 transposon som kode for tetracyklinresistens i det ved siden av liggende galE genet. N99 og SA500 er E.coli K12 stammer fra Dr. Martin Rosenberg's laboratorie ved the National Institutes of Health. 3. Konstruksjon av vektor fremstilt for å uttrykke det rekombinante proteinet

LPD-M AGE-3-His:

Rasjonalet var å uttrykke MAGE 3 som et fusjonsprotein ved å bruke den N-terminale tredjedel av det lipidierte protein D som fusjonspartner forbundet i N-terminal ende av MAGE-3 og en sekvens av flere histidinresidier (His hale) plassert ved dets C-terminale ende.

Protein D er et lipoprotein (en 42 kDa immunglobulin D bindingsprotein eksponert på overflaten av den Gram-negative bakterien heamofilus influenzae). Proteinet blir syntetisert som en forløper med en 18 aminosyreresidie signalsekvens som inneholder en konsensus sekvens for bakterielt lipoprotein (WO 91/18926).

Når signalsekvensen til et lipoprotein blir prosessert under sekresjon, blir Cys (i posisjon 19 i forløpermolekylet) den aminoterminale residien og blir samtidig modifisert ved kovalent forbindelse av både esterbundede og amidbundede fettsyrer.

Fettsyrene bundet til den aminoterminale cysteinresidien fungerer derfor som et membrananker.

Plasmidet som uttrykker fusjonsproteinet ble fremstilt for å uttrykke et forløperprotein som inneholder de 18 aminosyresignalsekvensene og de første 109 residiene av det prosesserte protein D, to ubeslektede aminosyrer (Met og Asp), aminosyreresidier 2 til 314 av MAGE-3, to Gly-residier som fungerer som en hengselregion for å eksponere de etterfølgende syv His residiene.

Den rekombinante stammen produserer derved det prosesserte lipidet His halefusjons-proteinet for 432 aminosyreresidie langt (se figur 1), med aminosyresekvensen beskrevet i ID Noi og den kodende sekvensen er beskrevet i ID No2. 4. Klonings strategi for generering av LPD-MAGE-3-His fusjonsproteinet (vektor pRIT14477): Et cDNA plasmid (fra Dr Thierry Boon fra Ludwig Institute) som inneholder den kodende sekvensen for MAGE-3 genet (Gaugler B et al, 1994) og vektoren PRIT 14586, som inneholder den N-terminale delen av lipo-D-1/3 kodende sekvens (fremstilt som beskrevet i figur 2) ble brukt. Kloningsstrategien inkluderte følgende trinn (figur 3). a) - PCR amplifisering av sekvensene tilstede i plasmid cDNA MAGE 3 ved å bruke oligonukleotid sense: 5' gc gcc atg gat etg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cet, og oligonukleotid antisense: 5' gcg tet aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc etc ttc ccc etc tet caa); denne amplifiseringen fører til følgende modifiseringer i den N-terminale enden: endring av de fem første kodonene til E.coli kodon anvendelse, erstatning av Pro kodonet med en Asp kodon i posisjon 1, installering av et Ncol sete i den ytterste 5' terminale ende og til slutt tilføyelse av to Gly kodoner og 7 His kodoner etterfulgt av et Xbal sete i den C-terminale enden. b) - Kloning inn i TA kloningsvektoren til invitrogen av det ovenfor amplifiserte fragmentet og fremstilling av intermediatvektoren pRIT14647. c) - Utkutting av Ncol Xbal fragmentet fra plasmid pRIT14647 og kloning inn i vektor pRIT 14586.

d) - Transformering av vertsstammen AR58.

e) - Seleksjon og karakterisering av E.coli stammetransformanter som inneholder

plasmid pRIT 14477, som uttrykker LPD-MAGE-3-His fusjonsprotein.

EKSEMPEL 2:

Fremstilling av LPDl/3-MAGE-3-His antigen:

1. Vekst og induksjon av bakteriell stamme-ekspresjon av LPSl/3-MAGE-3-His: Cellene fra AR58 transformert med plasmid pRIT14477 ble dyrket i 2 liters kolber, som hver inneholder 400 ml av LY12 medium supplert med gjærekstrakt (6,4 g/L) og kanamycinsulfat (50 mg/L). Etter inkubering på en bordrister ved 30°C i 8 +/-1 time, ble en liten prøve fjernet fra hver kolbe for mikroskopisk undersøkelse. Inneholdet i de to kolbene ble samlet sammen for å tilveiebringe inoculum for 20 liters fermentoren.

Inoculumet (omtrent 800 mL) ble tilsatt til et presterilisert 20 liters (totalt volum) fermentor som inneholder 7 liter medium, supplert med 500 mg/L av kanamycinsulfat. PH ble juster til og opprettholdt ved 6,8 ved periodisk tilsetting av NH4OH (25% v/v), og temperaturen ble justert til og opprettholdt ved 30°C. Luftingsraten ble justert til og opprettholdt ved 12 liter luft/minutt og den løste oksygentensjonen ble opprettholdt ved 50% av mettningen ved feedbackkontroll for ristingshastigheten. Overtrykk i fermentoren ble opprettholdt ved 500 g/cm<2> (0,5 bar).

"Fed-batch"-dyrkningen ble utført ved kontrollert tilsetting av en karbontilsettings-løsning. Tilsettingsløsningen ble tilsatt ved en startrate på 0,04 mL/min., og økt eksponensielt under de første 42 timer for å opprettholde en vekstrate på 0,11"<1>.

Etter 42 timer ble temperaturen i fermentoren raskt økt til 39°C, og tilsettingshastig-heten ble opprettholdt konstant ved 0,005 mL/g DC W/min. under induksjonsfasen for ytterligere 22-23 timer, hvorved intracellulær ekspresjon av LPD-MAGE-3-His nådde et maksimumsnivå.

Alikvoter (15 mL) av næringsmediumet ble tatt ved regulære intervaller under vekst/- induksjonsfasene og på slutten av fermenteringen for å følge kinetikken til den mikrobielle veksten og intracellulær produktekspresjon og i tillegg for å tilveiebringe prøver for mikrobiell identifisering/renhetstester.

På slutten av fermenteringen var den optiske tettheten i kulturen mellom 80 og 120 (korresponderende til en cellekonsentrasjon på mellom 48 og 72 g DCW/L), og det totale flytende volumet var omtrent 12 liter. Kulturen ble raskt avkjølt til mellom 6 og 10°C, og cellene fra ECK32 ble separert fra kulturmediumet ved sentrifugering ved 5000 x g i 4°C i 30 minutter. De konsentrerte cellene fra ECK32 ble raskt lagret i plastikkposer og umiddelbart fryst ved -80°C.

2. Ekstraksjon av proteinet:

De fryste konsentrerte cellene fra ECK32 ble tint til 4°C før de ble resuspendert i celle-ødeleggelsesbuffer til en sluttoptisk tetthet på 60 (korresponderende til en cellekonsentrasjon på omtrent 36 g DCW/L).

Cellene ble deretter ødelagt ved to passasjer gjennom en høytrykkshomogenisator (1000 bar). Den ødelagte cellesuspensjonen ble sentrifugert (x 10 000 g ved 4°C i 30 minutter) og pelletfraksjonen ble vasket to ganger med triton X100 (1% v/v) + EDTA (1 mM), etterfulgt av en vask med fosfatbufferet saltvann (PBS) + Tween 20 (0.1% v/v) og til slutt en vask med PBS. Mellom hvert vasketrinn ble suspensjonen sentrifugert ved x 10 000 g i 30 minutter ved 4°C, supernatanten ble kastet og pelletfraksjonen ble beholdt.

EKSEMPEL 3:

Karakterisering av fusjonsprotein Lipo D - MAGE 3:

1. Rensning:

LPD-MAGE-3-His ble renset fra cellehomogenatet ved å bruke en sekvens av trinn som beskrevet under:

a) - Oppløsning av den vaskede pelletfraksjonen fra celleødeleggelsen,

b) - Kjemisk reduksjon av intra- og inter-protein disulfidbindinger etterfulgt av blokkering av tiolgrupper for å hindre oksidativ rekobling, c) - Mikrofiltrering av reaksjonsblandingen for å fjerne partikler og reduksjon av endotoksiner, d) - Innsamling og primær rensning av LPD-MAGE-3-His ved å undersøke affinitets-interaksjonen mellom polyhistidinhalen og sinkfylt chelaterende sefarose,

e) - Fjerning av kontaminerende proteiner ved anionbyttekromatografi.

Den rensede LPD-MAGE-3-His ble utsatt for et antall av poleringstrinn:

f) - Bufferbytte/ureafjerning ved størrelseseksklusjonskromatografi ved å bruke

Superdex 75,

g) - "In-process" filtrering,

h) - Bufferbytte/avsalting ved størrelseseksklusjonskromatografi ved å bruke Sephadex

G25.

Hvert av disse trinnene er beskrevet i mer detalj under:

1.1) - Oppløselighet av cellehomogenatpellet

Pelletfraksjonen fra sluttvaskingstrinnet (som beskrevet over) ble gjenoppløst over natt i 800 mL av en løsning av guanidinhydroklorid (6M) og natriumfosfat (0,1 M, pH 7,0) ved 4°C.

1.2) - Reduksjon og karboksymetylering

Det oppløste materialet (en blek gul, turbidsuspensjon) ble skylt med argon for å rense ut gjenværende oksygen, og en stock-løsning av 2-merkaptoetanol (14M) ble tilsatt for å tilveiebringe en slutt konsentrasjon på 4,3M (som korresponderer med 0,44 mL av 2-merkaptoetanol per mL løsning).

Den resulterende løsning ble delt og overført til to glasskolber som begge ble varmet opp til 95°C i et vannbad. Etter 15 minutter ved 95°C ble kolbene fjernet fra vannbadet og fikk stå å avkjøle seg, hvoretter inneholdene ble samlet sammen i et begerglass dekket med aluminiumsfolie (5 L), plassert på is, og fast jodoacetamid ble tilsatt med kraftig risting for å tilveiebringe en sluttkonsentrasjon på 6M (som korresponderer til 1,11 g av jodoacetamid per mL løsning). Blandingen ble holdt på is i mørket i 1 time for å sikre fullstendig oppløselighet av jodoacetamid før den ble nøytralisert (ved å opprettholde kraftig omrøring og kontinuerlig pH måling) ved tilsetting av omtrent 1 liter natriumhydroksid (5 M) for å gi en slutt pH på 7,5-7,8.

Den resulterende blandingen ble holdt på is i mørket ytterligere 30 minutter, hvoretter pH'en ble justert til pH 7,5-7,8.

1.3) - Mikrofiltrering

Blandingen ble mikrofiltrert i en Amicon Proflux Ml2 "tangential"-strømningsenhet utstyrt med et Minikros helfiberinnlegg (ref. No. M22M-600-01N; areal 5.600 cm<2>, 0.2 Hm). Permeatet ble bibeholdt for etterfølgende kromatografisk rensning.

1.4) - Metall (Zn<2+>) chelatkromatografi (MAC)

Metallchelatkromatografi ble utført med chelaterende sefarose FF (Pharmacia Biotechnology Cat. No. 17-0575-01) pakket inn i en BPG 100/500 kolonne (Pharmacia Biotechnology Cat. No. 18-1103-01). Dimensjonene av det pakkede sjiktet var: diameter 10 cm; krysseksjonsareal 79 cm<2>; sjikthøyde 19 cm; pakkevolum 1,500 mL. Den tomme kolonnen ble rengjort med natriumhydroksid (0,5M), og deretter vasket med renset vann.

Støttesjiktet (avlevert i 20% v/v etanol) ble vasket med renset vann (8 liter) i en Buchner trakt (under vakuum) og ladet med sink av minst 15 liter av en løsning av ZnCl2 (0,1M) passere. Overskuddssink ble fjernet ved å vaske støttematerialet med 10 liter av renset vann, inntil pH av det flytende utkommet nådde pH til sinkklorid løsningen (pH 5,0). Støttematerialet ble deretter ekvilibrert med 4 liter av en løsning som inneholde guanidinhydroklorid (6M) og natriumfosfat (0,1M, pH 7,0).

Permeatet fra mikrofiltreringen, som inneholdet LPD-MAGE-3-His, ble blandet med støttematerialet (batch binding), før påsetting og pakking av BPG-kolonnen med løsningen som inneholdt guanidinhydroklorid (6M) og natriumfosfat (0,1M, pH 7,0). De neste trinnene av metallchelatkromatografien ble utført ved en eluent strømningsrate på 60 ml/min. Kolonnen ble vasket, først med løsning som inneholdt guanidinhydroklorid (6M) og natriumfosfat (0,1M, pH 7,0), deretter med en løsning som inneholdt urea (6M) og natriumfosfat (0,1M, pH 7,0), inntil kolonneeluenten oppnådde null absorbans ved OD280 nm (baselinje).

Den delvis rene LPD-MAGE-3-His proteinfraksjonen ble eluert med 2 kolonne volum av løsningen som inneholdt urea (6M), natriumfosfat (0,1M, pH 7,0) og imidazol (0,5M). Ledeevnen av denne fraksjonen var omtrent 16 mS/cm.

1.5) - Anionbyttekromatografi

Før en fortsatte med anionbyttekromatografien, ble lederevnen til den delvis rene LPD-MAGE-3-His proteinfraksjonen redusert til omtrent 4 mS/cm ved fortynning med en løsning som inneholdt urea (6M) og Tris-HCl (20 mM, pH 8,0).

Anionbyttekromatografien ble utført ved å bruke Q-sefarose FF (Pharmacia Biotechnology, Cat. No. 17-0510-01) pakket i en BPG 200/500 kolonne (Pharmacia Biotechnology, Cat. No. 18-1103-11). Dimensjonene av det pakkede sjiktet var: diameter 10 cm; tverrsnittsareal 314 cm<2>; sjikthøyden 9 cm; pakket volum 2,900 mL.

Kolonnen ble pakket (ved 20 % v/v etanol) og vasket med 9 liter renset vann ved en eluentstrømningsrate på 70 mL/min. Den pakkede kolonnen ble renset med 3 liter av natriumhydroksid (0,5M) vasket med 30 liter renset vann, deretter ekvilibrert med 6 liter av en løsning som inneholder urea (6M) og Tris-HCl (20 mM, pH 8,0). Den for-tynnede, delvis rensede LPD-MAGE-3-His ble satt på en kolonne og deretter vasket med 9 liter av en løsning som inneholdt urea (6M), Tris-HCl (20 mM, pH 8,0), EDTA (ImM) og Tween (0,1%), inntil absorbansen (280 nm) av eluentet falt til null.

Et ytterligere vasketrinn ble utført med 6 liter av en løsning som inneholdt urea (6M) og Tris-HCl (20 mM, pH 8,0).

Det rensede LPD-MAGE-3-His ble eluert fra kolonnen med en løsning som inneholdt urea (6M), Tris-HCl (20 mM, pH 8,0) og NaCl (0,25M).

1.6) - Størrelseseksklusjonskromatografi

Fjerning av urea fra renset LPD-MAGE-3-His og bufferbyttingen ble begge oppnådd ved størrelseseksklusjonskromatografi. Denne ble utført ved å bruke Superdex 75 (Pharmacia Biotechnology, Cat. No. 17-1044-01) pakket i en XK 50/100 kolonne (Pharmacia Biotechnology, Cat. No. 18-8753-01). Dimensjonene til det pakkede sjiktet var: diameter 5 cm; tverrsnittsareal 19,6 cm<2>; sjikthøyde 90 cm; pakket volum 1,800 mL.

Kolonnen ble pakket i etanol (20%) og vasket med 5 liter renset vann med en effluent strømningsrate på 20 mL/min. Kolonnen ble renset med 2 liter av natriumhydroksid (0,5M), vasket med 5 liter renset vann, deretter ekvilibrert med 5 liter av fosfat-bufferet saltvann som inneholdt Tween 80 (0,1% v/v).

Den rensede LPD-MAGE-3-His fraksjonen (maksimum 500 mL/avsaltingskjøring) ble satt på en kolonne med en eluent strømningsrate på 20 mL/min. Det avsaltede rensede LPD-MAGE-3-His ble eluert fra kolonnen med 3 liter PBS som inneholdt Tween 80 (0,1% v/v).

Fraksjonen som inneholdt LPD-MAGE-3-His eluert i tomrommet i kolonnen.

1.7) - "In-process" filtrering

Mengden LPD-MAGE-3-His fra størrelseseksklusjonskromatografi ble filtrert gjennom en 0,2 \ im membran i enlaminær strømningshette (hood) (klasse 10.000). Den filtrerte mengden ble fryst ved -80°C og lagret inntil avsaltingstrinnet.

1.8) - Avsaltingskromatografi

Siden osmolaliteten til sluttmengden skulle være mindre enn 400 mOsM, var det påkrevet med et ytterligere bufferbyttetrinn for å redusere saltkonsentrasjonen. Dette ble utført ved et avsaltingskromatografisk trinn ved å bruke Sefadex G25 (Pharmacia Biotechnology, Cat. No. 17-0033-02) pakket i en BPG 100/950 kolonne (Pharmacia Biotechnology, Cat. No. 18-1103-03). Dimensjonene av det pakkede sjiktet var: diameter 10 cm; tverrsnittsareal 78,6 cm<2>; sjikthøyden 85 cm; pakket volum 6,500 mL.

Sefadex G25 ble hydrert med 7 liter renset vann og fikk lov å svelle over natt ved 4°C. Gelen ble deretter pakket i kolonnen med rent vann ved en eluentstrømningsrate på 100 mL/min.

Kolonnen ble renset med 6 liter av natriumhydroksid (0,5M), deretter ekvilibrert med 10 liter av en løsning som inneholdt natriumfosfat (10 mM, pH 6,8), NaCl (20 mM) og Tween 80 (0,1% v/v).

Den rensede LPD-MAGE-3-His fraksjonen (maksimum 1500 mL/avsaltingskjøring) ble satt på en kolonne med en eluentstrømningsrate på 100 mL/min. Den avsaltede rensede LPD-MAGE-3-His fraksjonen ble eluert i mellomromsvolumet i kolonnen, og ble steril-flltrert gjennom en 0,22 um membran og lagret ved -80°C.

Sluttmengdeproteinet ble tint til + 4°C før den ble porsjonert i rør og frysetørket i en laktoseeksipient (3,2%).

2. Analyse på Coomassie-fargede SDS-polyakrylamidgeler:

LPD-MAGE-3-His renset antigen ble analysert ved SDS-PAGE på en 12,5% akrylamidgel i reduserende betingelser.

Proteinmengden var 50 ug for Coomassie blåfarging og 5 ug for sølvnitratfarging. Klinisk mengde nr. 96K19 og pilotmengde nr. 96J22 ble analysert. Et hovedband korresponderende til molekylvekt på 60kDa ble visualisert. To mindre ytterligere bånd på omtrent 45kDa og 35kDa kunne også sees.

3. Western Blot analyse:

Peptidene som man fikk ved SDS-PAGE analyse av LPD-MAGE-3-His proteinet ble identifisert ved Western blot ved å bruke musemonoklonale antistoffer. Disse antistoffene ble utviklet i huset ved å bruke en renset fremstilling av MAGE-3-His protein (dette proteinet inneholder ikke LPD delen av LPD-MAGE-3-His).

To monoklonale antistoffremstillinger (Mab 22 og Mab 54) har blitt selektert på basis av deres egnethet for Western blot analyse og anvendt i identitetstest for mengdefri-givelse. Figur 4 viser båndmønsterne ervervet for mengde nr. 96K19 og 96J22 etter farging med Mab 32 og 54. Seks hundre (600) ng av proteinet ble oppløst på en 12,5% SDS-PAGE, overført til en nylonmembran, reagert med Mab 32 og 54 (60 \ ig/ m\) og vist med anti-museantistoffer koblet til peroksidase. 60 kDa og 30 kDa peptider detektert ved SDS-PAGE kan sees ved begge Mab.

EKSEMPEL IV:

1. Vaksinefremstilling ved å bruke LPD-MAGE-3-His protein:

Vaksinen brukt i disse eksperimentene blir produsert fra et rekombinant DNA, som kode for et lipoprotein D l/3-MAGE-3-His, uttrykt i E.coli fra stamme AR58, enten adjuvansert eller ikke. Som en adjuvans omfatter formuleringen en blanding av 3 de-O-acylert monofosforyllipid A (3D-MPL) og QS21 i en olje/vannemulsjon. Adjuvans-systemet SBAS2 har tidligere blitt beskrevet i WO 95/17210.

3D-MPL: er en immunostimulant avledet fra lipopolysakkarid (LPS) fra den Gram-negative bakterien Salmonelle minnesota. MPL har blitt deacylert og mangler en fosfat-gruppe på lipid A delen. Denne kjemiske behandlingen reduserer dramatisk toksisiteten mens den opprettholder de immunostimulerende egenskapene (Ribi, 1986). Ribi Immunochemistry produserer og forsyner MPL til SB-Biologicals. Eksperimentene utført ved Smith Kline Beecham Biologicals har vist at 3D-MPL kombinert med forskjellige bindemidler sterkt øker både den humorale og TH1 type av cellulær immunitet.

QS21: er et naturlig saponinmolekyl ekstrahert fra barken på det syd-amerikanske treet Quillaja saponaria Molina. En rensningsteknikk utviklet for å separere de individuelle saponinene fra råekstraktene av barken tillot isolering av det spesielle saponin, QS21, som er et triterpenglykosid som viser sterkere adjuvansaktivitet og lavere toksisitet sammenlignet med foreldrekomponenten. QS21 har blitt vist å aktivere MHC klasse 1 begrenset CTL til flere subenhet Ag, så vel som stimulert Ag spesifikk lymfocyttisk proliferering (Kensil, 1992). Aquila (formally Cambridge Biotech Corporation) produserer og forhandler QS21 til SB-Biologicals.

Eksperimenter utført ved SmithKline Beecham Biologicals har vist en klar synergistisk effekt av kombinasjonene av MPL og QS21 i induksjonen av både humoral og TH1 type cellulære immunresponser.

Olje/vannemulsjon er sammensatt av en organisk fase fremstilt av 2 oljer (en tokoferol og squalen), og en vandig base av PBS som inneholder Tween 80 som emulgator. Emulsjonen omfatter 5% squalen 5% tokoferol 0,4% Tween 80 og har en gjennomsnitts partikkelstørrelse på 180 nm og er kjent som SB62 (se WO 95/17210). Eksperimentene utført ved SmithKline Beecham Biologicals har vist at tilføyelse av denne O/W emulsjonen til 3D-MPL/QS21 (SBAS2) ytterligere øker immunstimulerende egenskaper til en siste mot forskjellige subenhetantigener.

2. Fremstilling av emulsjon SB62 (2 ganger konsentrat):

Tween 80 er løst i fosfatbufferet saltvann (PBS) for å gi en 2% løsning i PBS. For å tilveiebringe 100 ml to ganger konsentratemulsjon ble 5 g av DL alfa-tokoferol og 5 ml squalenvortex mikset og blandet godt. 90 ml av PBS/Tween løsning ble tilsatt og blandet godt. Den resulterende emulsjonen passeres deretter gjennom en sprøyte og blir til slutt mikrofluidisert ved å bruke en Ml 1 OS mikrofluidiseringsmaskin. De resulterende oljedråpene har en størrelse på omtrent 180 nm. 3. Fremstilling av Lipoprotein Dl/3 - MAGE-3-His QS21/3D MPL olje i vann (SBAS2) formulering: Adjuvansen blir formulert som en kombinasjon av MPL og QS21, i en olje/vannemulsjon. Denne fremstillingen ble avlevert i rør på 0,7 ml for å bli blandet med det lyofiliserte antigenet (rørene inneholder fra 30 til 300 ug antigen).

Sammensetningen av adiuvanseluenten til den lvofiliserte vaksinen er som følger:

Sluttvaksinen erverves etter rekonstituering av lyofilisert LPD-MAGE-3-His fremstilling med adjuvanser eller med PBS alene.

Adjuvanskontrollene uten antigen blir fremstilt ved å erstatte proteinet med PBS.

4. Vaksineantigen: Fusjonsprotein Lipoprotein Dl/3 - MAGE-3-His: Lipoprotein D er et lipoprotein eksponert på overflaten av den Gram-negative bakterien Heamophilus influenzae.

Inkluderingen av de første 109 residiene av det prosesserte protein D som fusjonpartner er inkorporert for å tilveiebringe vaksineantigenet med T-celleepitoper. Ved siden av

LPD delen, inneholder proteinet to ubeslektede aminosyrer (Met og Asp), aminosyre-residiene 2 til 314 fra Mage-3, to Gly residier som fungerer som hengselsregion for å eksponere de etterfølgende syv His residiene.

EKSEMPEL V:

1. Immunogenitet hos LPD-MAGE-3-His i mus og aper:

For å teste antigeniteten og immunogeniteten til humant MAGE-3 protein, ble kandidat vaksinen injisert i to forskjellige musestammer (C57BL/6 og Balb/C), og som varierer i deres genetiske bakgrunn og MHC alleler. For begge musestammene ble potensielle MHC klasse 1 og MHC klasse 2 peptidmotiver teoretisk forutbestemt for MAGE-delen av LPD-MAGE-3-His fusjonsproteinet.

a) - Immuniseringsprotokoll:

5 mus fira hver stamme ble injisert to ganger 2 ukers intervaller i fotpoten med 5 \ ig

LPD-MAGE-3-His, formulert eller ikke i SBAS2 ved 1/10 av konsentrasjonen brukt i human sammenheng.

b) - Prolifereringsanalyse:

Lymfocytter ble fremstilt ved å knuse milten eller de popliteale lymfeknutene fra mus, 2

uker etter siste injeksjon. 2 x IO<5> celler ble plassert i triplett i 96 brønners plater og cellene ble restimulert in vitro i 72 timer med forskjellige konsentrasjoner (1-0,1 ng/ml) av His-Mage 3 som sådan eller overtrukket på latex mikro-kuler.

En økt MAGE-3 spesifikk lymfeproliferativ aktivitet ble observert hos både miltcellene (se figurene 5 og 7) og lymfeknutecellene (se figurene 6 og 8) fra enten C57BL/6 eller Balb/C mul injisert med LPD-MAGE-3-His protein, sammenlignet med den lymfepro-liferative responsen hos mus som har mottatt SBAS-2 formuleringen alene eller PBS.

Dessuten ble en signifikant høyere proliferativ respons ervervet med lymfocytter fra mus immunisert med LPD-MAGE-3-His i adjuvansen SBAS2 (se figurene 6 og 8).

-Konklusjon:

LPD-MAGE-3-His er immunogen i mus, og immunogeniteten kan økes ved anvendelse av SBAS2 adjuvansformuleringen.

2. Antistoffrespons:

a) - Immuniseringsprotokoll:

Balb/C eller C57BL/6 mus ble immunisert med 2 intra fotpoteinjeksjoner med 2 ukers

intervaller med enten PBS, eller SBAS2, eller 5 uG av LPD-MAGE-3-His, eller 5 uG av LPD-MAGE-3-His + SBAS2.

Tre og fem dyr ble brukt i henholdsvis kontrollgruppene og i testgruppene.

b) - Indirekte ELISA:

To uker etter den andre injeksjonen ble individuelt sera tatt og utsatt for indirekte

ELISA.

2 uG/ml av renset His MAGE 3 ble brukt som overtrukne antigen. Etter metting i 1 time ved 37°C, i PBS + 1% nyfødt kalveserum, ble sera seriefortynnet (ved å starte på 1/1000) i mettningsbufferen og inkubert over natt ved 4°C, eller 90 minutter ved 37°C. Etter vasking med PBS/Tween 20,01% ble biotinylert geite anti-mus total IgG (1/1000) eller geite anti-mus IgGl, IgG2a, IgG2b antisera (1/5000) brukt som det andre anti-stoffet. Etter 90 minutters inkubering ved 37°C Streptavidin koblet til peroksidase ble tilsatt og TMB (tetra-metyl-benzidinperoksid) ble brukt som substrat. Etter 10 minutter ble reaksjonen blokkert med tilsetting av H2SO4 0,5M, og O.D. ble bestemt.

c) - Resultater:

Figur 9 sammenligner mellom de forskjellige gruppene av mus(N=5/gruppe) den

relative gjennomsnittsmidtpunkttiter til sera som består av den gjennomsnittsfortynning som er nødvendig for å nå midtpunktet på kurvene.

Disse resultatene viser at i begge muse stammene som ble testet, ble en svak Ab respons målt etter 2 injeksjoner av LPD-MAGE-3-His alene, men at en høyere anti-MAGE 3 Ab konsentrasjon blir dannet når LPD-MAGE-3-His blir injisert med tilstedeværelse av SBAS2. Således er det observert at bare 2 injeksjoner av LPD-MAGE-3-His + SBAS2, med 2 ukers intervaller er tilstrekkelig for å danne høy Ab respons.

Den høyere Ab responsen observert i Balb/c mus sammenlignet med responsen som ble ervervet i C57BL/6 mus kan forklares ved forskjeller i haplotyper eller i bagrunn mellom disse to stammene, selv om Ab titere som ble oppnådd i C57BL/6 mus også er høyere etter injeksjoner med LPD-MAGE-3-His + SBAS2 enn etter injeksjoner med LPD-MAGE-3 -His alene.

Ig subklasse spesifikk anti-MAGE-3 responser etter vaksineringer i forskjellige grupper av mus kan sees på figurene 10 og 11, som gir en sammenligning av gjennomsnitts-midtpunktsfortynning av sera.

Verken IgA, eller IgM ble detektert i noen av serumsprøvene selv fra musene som ble vaksinert med LPD-MAGE-3-His i adjuvans SBAS2.

I motsatt fall ble totalt IgG nivå noe høyere i sera fra mus vaksinert med LPD-MAGE-3-His alene, og signifikant økt i sera hos dyr injisert med LPD-MAGE-3-His i SBAS2.

Analysen av forskjellige IgG subklasse konsentrasjoner viste at en blandet Ab respons ble indusert i musene, siden nivåene av alle IgG subklasser som ble testet (IgGl, IgG2a, IgG2b) var høyere i mus vaksinert med adjuvansert Ag enn i mus injisert med Ag eller adjuvans alene.

Egenskapen til denne blandede Ab responsen etter vaksinering med LipoD-MAGE 3 ved tilstedeværelse av SBAS2 ser imidlertid ut til å være avhengig av musestammen, siden IgGl og IgG2b fortrinnsvis ble funnet i sera hos Balb/C og C57BL/6 mus respektiv.

3. Immunogenitet hos Lipoprotein D 1/3 MAGE-3 - His + SBAS2 adjuvans i Rhesus aper

Tre grupper av fem Rhesus (Macaca Mulatta) dyr ble selektert. RTS,S og gpl20 ble brukt som positiv kontroll.

Grupper:

Dyrene mottok vaksine på dag 0 og fikk en ny på dag 28, og 84 og det ble tatt blod-prøver for å bestemme deres antistoffrespons med henhold til både MAGE 3 og protein D komponenten. Vaksinen ble administrert intramuskulært som en bolusinjeksjon (0,5ml) i den bakre delen av høyre ben.

Små blodprøver ble tatt hver 14 dag. Uheparinisert blodprøver på 3 ml ble samlet fra den femorale vene, og fikk lov til å koagulere for minst i 1 time og sentrifugert ved romtemperatur i 10 minutter ved 2500 rpm.

Serumet ble fjernet, fryst ved -20°C og sendt for bestemmelse for antistoffhivåer ved spesifikk Elisa. 96 brønners mikroplater (maxisorb Nunc) ble enten belagt med 5 ug av His Mage 3 eller protein D over natt ved 4°C. Etter 1 times mettning ved 37°C med PBS NCS 1%, ble en seriefortynning av kaninsera tilsatt i 1,5 time ved 37°C (som startet ved 1/10), etter 3 vaskinger i PBS Tween, antikaninbiotinylert serum (Amersham ref RPN 1004 lot 88) ble tilsatt (1/5000). Platene ble vasket og peroksidasekoblet streptavidin (1/5000) ble tilsatt i 30 minutter ved 37°C. Etter vasking ble 50 ul TMB (BioRad) tilsatt i 7 minutter og reaksjonen ble stoppet med H2S04 0,2M, OD ble målt ved 450 nm. Midtpunktsfortynninger ble beregnet ved SoftmaxPro.

Antistoff respons:

Små blodprøver ble tatt hver 14. dag for å følge kinetikken til antistoffresponsen til MAGE 3 ved Elisa. Resultatene indikerer at etter en injeksjon med LPD1/3 MAGE 3 His + SBAS2, var MAGE 3 spesifikk total lg titer lav, en klar "boost" kunne sees i 3 ut av 5 dyr etter en andre og en tredje injeksjon av LipoDl/3 MAGE 3 + adjuvans i de samme apene. De som responderte dårlig forble negative selv etter 3 injeksjoner. 28 dager post II eller post III, hadde antistofftiterene returnert til basalnivåene. Subklassen av disse antistoffene ble bestemt som fortrinnsvis IgG og ikke IgM. Bytte til IgG indikerer at en T hjelperrespons har blitt trigget. Protein D spesifikk antirespons, skjønt den var svakere, var fullstendig parallell til MAGE 3 antistofrfespons.

EKSEMPEL VI:

1. LPD-MAGE 1 His

På en analog måte ble - LPD - MAGE 1-His fremstilt. Aminosyren og DNA sekvensene er avbildet i SEQUENCE ID Nos. 3 og 4. Det resulterende proteinet ble renset på en analog måte til LPD-MAGE-3-His protein. I korthet cellekulturen ble homogenisert og behandlet med 4M guanidin HC1 og 0,5 M beta-merkaptoetanol ved tilstedeværelse av 0,5% Empigen detergent. Produktet ble filtrert og permeatet behandlet med 0,6 M jodacetamid. Karboksyamiderte fraksjoner ble utsatt for IM AC (sinkchelat-sefarose FF) kromatografi. Kolonnen ble først ekvilibrert og vasket med en løsning som inneholdt 4M guanidin. HC1 og natriumfosfat (20 mM, pH 7,5) og 0,5% Empigen, deretter ble kolonnen vasket med en løsning som inneholdt 4M urea i natruim fosfat (20 mM, pH 7,5) 0,5% Empigen buffer. Proteinet ble eluert i samme buffer, men med økende konsentrasjon av imidazol (20 mM, 400 mM og 500 mM).

Eluatet ble fortynnet med 4M urea. Q-sefarosekolonnen ble ekvilibrert og vasket med 4M urea i 20 mM fosfatbuffer (pH 7,5) ved tilstedeværelse av 0,5% Empigen. Den andre vasken ble utført i samme buffer, men uten detergentet. Proteinet eluerte i samme buffer, men med økende imidazol (150 mM, 400 mM, IM). Eluatet ble ultrafiltrert.

EKSEMPEL VII:

Konstruksjon av ekspresjonsplasmid pRIT14426 og transformasjon av vertsstammen AR58 for å produsere NS1 - MAGE -3 His:

Protein design:

Design av fusjonsprotein NS1, -MAGE-3-His som skulle uttrykkes i E.coli er beskrevet i figur 12.

Den primære funksjonen til det resulterende protein har sekvensen som fremsatt i ID No. 5.

Den kodende sekvensen (ID No. 6) korresponderende til det ovenfor nevnte protein-designet ble plassert under kontroll av XpL promotor i et E.coli ekspresjonsplasmid.

Kloningsstrategien for dannelse av NSi-MAGE-3-His fusjonsprotein: Utgangsmaterialet var et cDNA plasmid mottatt fra Dr Thierry Boon fra Ludwig Instituttet, som inneholdt den kodende sekvensen for MAGE-3 genet og vektor PMG81, som inneholdt en 81 aminosyre av NSi (ikke strukturelt protein) kodende region fra influensa.

Kloningsstrategien som er beskrevet i figur 13 inkluderte følgende trinn:

a) PCR amplifisering av sekvensene tilstede i plasmid cDNA MAGE-3 ved å bruke oligonukleotid sense: 5' gc gcc atg gat etg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cet, og

oligonukleotid antisense: 5' gcg tet aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc etc ttc ccc etc tet caa.

Amplifiseringen førte til følgende modifiseringer i den N terminale ende: endring av de første fem kodonene til E.coli kodonanvendelse, erstatning av Pro kodon av en Asp kodon i posisjon 1, installering av et Ncol sete i 5' ende og til slutt tilsetting av 2 Gly kodoner og 7 His kodoner etterfulgt av et Xbal sete i den C-terminale enden. b) Kloning inn i TA kloningsvektor fra invitrogen av det ovenfor nevnte amplifiserte fragmentet og fremstilling av intermediatvektoren pRIT14647 c) Utkutting av Ncol Xbal fragmentet fra plasmid pRIT14647 og kloning inn i vektor pRITPMG81

d) Transformasjon av vertsstammen AR58

e) Seleksjon og karakterisering av E.coli stammetransformanter som inneholder

plasmid pRIT14426 (se figur 14) som uttrykker NSI-MAGE-3-His fusjonsproteiner.

Karakterisering av det rekombinante NS i -MAGE-3-His (pRIT14426):

Bakterier ble dyrket på LB medium supplert med 50 ug/ml kanamycin ved 30°C. Når kulturen har nådd OD=0.3 (ved 620 nm), ble varmeinduksjonen oppnådd ved å øke temperaturen til 42°C.

Etter 4 timers induksjon ble cellene høstet, resuspendert i PBS og lysert (ved disintegra-sjon) ved tre ganger pressing i den franske pressen. Etter sentrifugering (60 minutter ved 100,000 g), ble pelletsupernatanten og totalt ekstrakt analysert ved SDS-PAGE. Proteinene ble visualisert på Coomassie Bl fargede geler hvor fusjonsproteinet representerte omtrent 1% av totale E.coli proteiner. Det rekombinante proteinet så ut til å være et enkelt bånd med en tydelig molekylvekt på 44,9 K. Fusjonsproteinet ble identifisert ved Western Blot analyse ved å bruke anti-NS 1 monoklonal.

EKSEMPEL VIII:

Rensning av NS 1-MAGE 3-His (E.coli) for kanin/musimmunisering.

Rensningsskj ema:

Følgende rensningsskj ema ble brukt for å rense antigenet:

a. Lyse

Bakterieceller (23g) ble lysert i 203 ml av en 50 mM P04 pH7 buffer ved Rannie (homogenisator) og lysatet ble sentrifugert i en JA 20 rotor ved 15,000 rpm i 30 minutter.

Supernatanten ble kastet.

b. Antigen oppløselighet

1/3 av pelleten ble gjenoppløst over natt ved 4°C i 34 ml av 100 mM P04 - 6M GuHCl pH7. Etter sentrifugering i en JA 20 rotor ved 15,000 rpm i 30 minutter, ble pelleten kastet og supernatanten ble ytterligere renset ved IMAC.

c. Affinitetskromatografi: Ni<2> + -NTA agarose (Qiagen)

Kolonnevolum: 15 ml (16 mm x 7,5 cm)

Pakkebuffer: 0,1 M P04 - 6 M GuHCl pH7

Prøvebuffer: idem

Vaskebuffer: 0,1 M P04 - 6 M GuHCl pH7

0,1 MP04-6MureapH7

Eluering: imidazolgradient (0 -» 250 mM) i 0,1 M P04 buffer pH7 supplert med 6 M urea.

Strømningsrate: 2 ml/min

a. Konsentrasjon:

Antigenpositive fraksjoner fra IMAC eluatet (160 ml) ble samlet sammen og konsentrert til 5 ml i en Amicon omrørt celle på en Filtran membran (type Omega "cut-off' 10,000). Renheten på dette stadium er omtrent 70% beregnet ved SDS-PAGE.

b. Preparativ elektroforese (Prep Cell Biorad)

2,4 ml av den konsentrerte praven ble kokt i 0,8 ml reduserende prøvebuffer og satt på en 10% akrylamidgel. Antigenet ble eluert i en Tris-glysinbuffer pH 8,3 supplert med 4% SDS og Nsi -MAGE 3 His positive fraksjoner ble samlet sammen.

a. TCA presiptering:

Antigenet ble TCA presiptert og etter sentrifugering i en JA 20 rotor ved 15,000 rpm i 20 minutter, ble supernatanten kastet. Pelleten ble gjenoppløst i PBS buffer pH 7,4. Proteinet er løselig i PBS etter frysing/tining og viser ingen degradering når den blir lagret i 3 timer ved 37°C og har en antatt molekylvekt på omtrent 50,000 Daltons bestemt ved SDS (12.5% PAGE).

EKSEMPEL IX:

Fremstilling av E.coli stammen som uttrykker et fusjonsprotein CLYTA-MAGE-1-His tail 1. Konstruksjon av ekspresjonsplasmid pRIT14613 og transformasjon av vertsstammen AR58:

Protein design:

Fremstilling av fusjonsproteinet Clyta-Mage-l-His som skal uttrykkes i E.coli er beskrevet i figur 15.

Den primære strukturen til det resulterende protein har sekvensen fremsatt i sekvens ID No. 7.

Den kodende sekvensen (se sekvens ID No. 8) korresponderende til den ovenfor nevnte proteinfremstilling ble plassert under kontroll av X pL promotor i et E.coli ekspresjonsplasmid.

Kloning:

Utgangsmaterialet var vektoren PCUZ1 som inneholder 117 C-terminale kodon av LytA kodende region fra Streptococcus pneumoniae og vektor pRIT14518, hvori vi på forhånd hadde subklonet MAGE-1 genet cDNA fra et plasmid som vi har mottatt fra Dr Thierry Boon fra Ludwig instituttet.

Kloningsstrategien for ekspresjon av CLYTA-Mage-l-His proteinet (se beskrivelsen i figur 16) inkluderer følgende trinn:

2. Fremstilling av CLYTA-Mage-l-His kodende sekvensmodul:

a) Første trinnet var en PCR amplifisering, bestemt for å flankere CLYTA sekvensene med Ndel-Aflin restriksjonsseter. PCR amplifiseringen ble gjort ved å bruke

plasmid PCUZ1 som templat og som primere ble det brukt oligonukleotid sense: 5'

tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tea gac, og oligonukleotid antisense: 5' GCC AGA CAT GTC CAA TTC TGG CCT GTC TGC CAG. Dette fører til amplifisering av en 378 nukleotiders lang CLYTA sekvens.

b) Det andre trinnet var kobling av CLYTA sekvenser til MAGE-1-His sekvenser, for å danne den kodende sekvensen for fusjonsproteinet. Dette trinnet inkluderer

ekskursjon av Ndel-Afllll Clyta fragment og insersjon inn i vektor pRIT14518 tidligere åpnet opp med Ndel og Ncol (Ncol og Afllll kompatibel) restriksjons enzymer og ga opphav til plasmid pRIT14613.

c) Transformering av vertsstammen AR58

d) Seleksjon og karakterisering av E.coli transformanten (KAN resistent) som

inneholder plasmid pRIT14613. (Se figur 16)

1. Karakterisering av det rekombinante proteinet CLYTA-MAGE-l-His (pRIT14613): Bakterien ble dyrket på LB medium supplert med 50 ug/ml kanamycin ved 30°C. Når kulturen hadde nådd OD=0.3 (ved 620 nm), ble en varmeinduksjon oppnådd ved å heve temperaturen til 38°C.

Etter 4 timers induksjon ble cellene høstet, resuspendert i PBS og lysert (ved desinte-grering) ved et skudd. Etter sentrifugering ble pelletsupematant og totalt ekstrakt analysert ved SDS-PAGE. Proteinene ble visualisert i Coomassie Bl fargede geler, hvor fusjonsproteinet representerte omtrent 1% av de totale E.coli proteinene. Det rekombinante proteinet fremsto som et enkelt bånd med en antatt molekylvekt på omtrent 49 kD. Fusjonsproteinet ble identifisert ved Western Blot analyse ved å bruke anti-MAGE-1 polyklonalt antistoff.

Rekonstituering av ekspresjonsenheten sammensatt av den lange X pL promotor (nyttig for Nalidiks syreinduksjon) og CLYTA-MAGE-1 kodende sekvens pRIT14614): Et EcoRI-NCOi restriksjonsfragment som inneholder den lange PL promotoren og en del av CLYTA sekvensen ble fremstilt fra plasmid pRIT DVA6 og satt inn mellom EcoRI-NCOi setene til plasmid pRIT14613.

Det rekombinante plasmidet pRIT14614 ble ervervet.

Det rekombinante plasmidet pRIT14614 (se figur 17) som koder for fusjonsproteinet CLYTA-MAGE-1 -His ble brukt for å transformere E.coli ARI 20. En Kan-resistent kandidatstamme ble selektert og karakterisert.

Karakterisering av rekombinant protein:

Bakteriene ble dyrket på LB medium supplert med 50 mg/ml kanamycin ved 30°C. Når kulturen hadde nådd OD=400 (ved 620nm) Nalidiksinsyre tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 60 mg/ml.

Etter 4 timers induksjon ble cellene høstet, resuspendert i PBS og lysert ved desintegrer-ing (desintegrerings CLS "et skudd" type). Etter sentrifugering ble pelletsupernatant og totalt ekstrakt analysert ved SDS-PAGE. Proteinene ble visualisert i Coomassie blå-fargede geler, hvor fusjonsproteinet representerte omtrent 1% av de totale E.coli proteinene. Fusjonsproteinet ble identifisert ved Western Blot analyse ved å bruke kanin anti-MAGE-1 polyklonale antistoffer. Rekombinant protein fremsto som et enkelt bånd med antatt molekylvekt på omtrent 49 kD.

EKSEMPEL X:

CLYTA - MAGE-3-His

A: Tumorawisningsrekombinant antigen: et fusjonsprotein CLYTA -MAGE-3-His hvor C-lyt A fusjonspartner førte til ekspresjon av et løselig protein, virket som et affinitetsmerke og tilveiebringer en nyttig T-hjelper.

Fremstilling av E.coli stammen som uttrykker et fusjonsprotein CLYTA-MAGE-3-His hale.

Konstruksjon av ekspresjonsplasmid pRIT14646 og transformasjon av vertsstammen AR 120:

Protein design:

Design av fusjonsproteiner Clyta-MAGE-3-His for at dette skal uttrykkes i E.coli er beskrevet i figur 18.

Den primære strukturen til det resulterende protein har en sekvens beskrevet i sekvens ID No. 9: og den kodende sekvensen i sekvens ID No. 10

Den kodende sekvensen korresponderer til det ovenfor nevnte proteindesign ble plassert under kontroll av X pL promotor i et E.coli ekspresjonsplasmid.

Kloning:

Utgangsmaterialet var vektoren PCUZ1 som inneholder 117 C-terminale kodon fra LytA kodende region fra Streptococcus pneumoniae, beskrevet i Gene 43, (1986) s. 265-272 og vektoren pRIT14426, som vi tidligere har subklonet MAGE-3 genet cDNA fra et plasmid mottatt fra Dr. Thierry Boon fra Ludwig Institute.

Kloningsstrategien for ekspresjon av CLYTA-MAGE-3-His-proteinet (se beskrivelsen i figur 19) inkluderte følgende trinn:

Fremstilling av CLYTA-MAGE-3-His kodende sekvensmodul:

1.1 Første trinnet var en PCR amplifisering, bestemt for å flankere CLYTA sekvensene med Aflll- og Afllll-restriksjonssete. PCR-ampliifseringen ble gjort ved å bruke plasmid-PCUZl som templat og som primere oligonukleotid sense: 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tea gac, og oligonukleotid antisense: 5' ccc aca tgt cca gac tgc tgg cca att etg gcc tgt etg cca gtg. Det førte til amplifiseringen av en 427 nukleotider lang CLYTA sekvens. Det ovenfor nevnte amplifiserte fragmentet ble klonet inn i TA kloningsvektor fra Invitrogen for å gi intermediatvektoren pRIT14661 1.2 Det andre trinnet var kobling av CLYTA-sekvensene til MAGE-3-His-sekvensene, for å danne den kodende sekvensen til fusjonsproteinet. Dette trinnet inkluderte utkutting av et Afl II-Afl-IU CLYTA-fragment og innføring i vektoren pRIT14426 som på forhånd var åpnet av Afl II- og Ncol- (Ncol og Aflll kompatible) restrik-sjonsenzymer og ga opphav til plasmid pRIT14662. 2. - Rekonstituering av ekspresjonsenhet sammensatt av den lange A, pL promotor (nyttig for Nalidiksinsyreinduksjon) og CLYTA-MAGE-3 kodende sekvens: Et Bglll - Xbal restriksjonsfragment som inneholdt den korte pL promotoren og CLYTA-MAGE-3 -His kodende sekvenser ble fremstilt fra plasmid pRIT14662, og satt inn mellom Bglll - Xbal setene til plasmid TCM67 (et pBR322 derivat som inneholder resistensen for ampicillin og den lange X pL-promoter, beskrevet i den internasjonale søknaden PCT/EP92/01827). Plasmid pRIT14607 ble ervervet.

Det rekombinante plasmidet pRIT14607 som koder for fusjonsproteinet Clyta- Mage- 3 His ble brukt til å transformere E.coli AR 120 (Mott et al. 1985, Proe. Nati. Acad. Sei, 82:88). En ampicillinresistent kandidatstamme ble selektert og karakterisert.

3. Fremstilling av plasmid pRIT 14646:

Til slutt ble et plasmid likt pRIT 14607, men som hadde kanamycinseleksjon konstruert

(pRIT 14646)

Karakterisering av det rekombinante proteinet:

Bakterier ble dyrket på LB medium supplert med 50 mg/ml kanamycin ved 30°C. Når kulturen hadde nådd OD= 400 (ved 600nm) ble Nalidiksinsyre tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 60 g/ml.

Etter 4 timers induksjon ble cellene høstet, resuspendert i PBS og lysert ved desintegrer-ing (desintegrasjons CLS type "et skudd"). Etter sentrifugering ble pelletsupernatant og totalt ekstrakt analysert ved SDS-PAGE. Proteinene ble visualisert i Coomassie blå-fargede geler, hvor fusjonsproteiner representerte omtrent 1% av de totale E.coli-proteinene. Fusjonsproteinet ble identifisert ved Western Blot analyse ved å bruke kanin-anti-MAGE-3 polyklonale antistoffer. Det rekombinante proteinet fremsto som et enkelt bånd med en antatt molekylvekt på omtrent 58 kD.

EKSEMPEL XI:

Rensing av det rekombinante proteinet CLYTA-MAGE-3 His:

Den rekombinante bakterien AR120 (pRIT 14646) ble dyrket i en 20 liters fermentor under "fed-batch" betingelser ved 30°C. Ekspresjonen av det rekombinante proteinet ble indusert ved å tilsette Nalidiksinsyre til en sluttkonsentrasjon på 60 g/ml. Cellene ble høstet på slutten av fermenteringen og lysert ved 60 OD/600 ved to passasje gjennom en fransk presseødelegger (20 000 psi). Lyserte celler ble pelletert i 20 minutter ved 15 000 g ved 4°C. Supernatanten som inneholdt det rekombinante proteinet ble satt på en ione-bytte DEAE-sefarose CL6B-resin (Pharmacia) som på forhånd var ekvilibrert i 0,3M NaCl, 20 mM Tris HC1 pH 7,6 buffer A. Etter at kolonnen ble vasket med buffer A, ble fusjonsproteinet eluert ved 2% cholin i (buffer A). Positive antigenfraksjoner som kom frem ved Western Blot analyse ved å bruke et anti-MAGE-3 antistoff, ble samlet sammen. DEAE-eluert antigen ble brakt til 0,5% Empigen BB (et zwitterionisk detergent) og til 0,5 M NaCl før det ble satt på en ionemetall affinitetskromatografi-kolonne preekvilibrert i 0,5% Empigen BB, 0,5 M NaCl, 50 mM fosfatbuffer pH 7,6 (buffer B).

JMAC-kolonnen ble vasket med buffer B inntil 280 nm absorbans nådde basislinjen. En andre vask i buffer B uten Empigen BB (buffer C) for å eliminere detergenten ble utført før antigeneluering med en imidazolgradient 0-250 mM imidazol i buffer C.

0,090-0,250 M imidazolfraksjoner ble samlet sammen, konsentrert på en 10 kDa filtron omegamembran før dialyse versus PBS buffer.

Konklusjon:

Vi har vist at det fusjonerte proteinet LPD-MAGE-3-His er immunogent i mus, og at immunogeniteten (proliferativ respons og antistofrfespons) kan ytterligere økes ved anvendelse av adjuvans beskrevet over. Rensningen kan forsterkes ved derivatisering av tioler som danner disulfidbindingene.

Vi har også vist at en bedre antistoffrespons ble trigget ved vaksinering med LPD-MAGE-3-His ved tilstedeværelse av adjuvanser. Den dominerende isotypen som ble funnet i serumet til C57BL/6 var IgG2b dette indikerer at en TH1 type immunrespons ble reist.

I den humane kliniske utførelsen ble en pasient som ble behandlet med LPD-MAGE-3-His i en uadjuvansformulering kvitt sitt melanom.

REFERANSER:

- Anichini A., Fossati G., Parmiani G. Immunol. Today, 8: 385 (1987).

- De Plaen E., Arden K., Traversari C, et al. Immunogenetics, 40: 360 (1994).

- Gaugler B., Van den Eynde B., van der Bruggen P., et al. /. Exp. Med.,

179: 921 (1994).

- Herman J., van der Bruggen P., Irnmanuel F., et al. Immunogenetics,

43: 377 (1996).

- Inoue H., Mori M., Li J., et al. Int. J. Cancer, 63: 523 (1995).

- Kensil C.R., Soltysik S., Patel U., et al. in: Channock R.M. , Ginsburg H.S.,

Brown F., et al., (eds.), Vaccines 92,

(Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.),

36-40: (1992).

- Knuth A., Danowski B., Oettgen H.F., et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA,

81: 3511 (1984).

- Patard J.J., Brasseur F., Gil-Diez S., et al. Int. J. Cancer, 64: 60 (1995).

- Ribi E., et al. in: Levine L., Bonventre P.F., Morello J., et al. (eds)., American Society for Microbiology, Washington DC, Microbiology 1986, 9-13; (1986). - Van den Eynde B., Hainaut P., Hérin M. et al. Int. J. Cancer, 44: 634 (1989). - Van der Bruggen P., Traversari C, Chomez P., et al. Science, 254: 1643 (1991).

- Van der Bruggen P., Bastin J., Gajewski T., et al. Eur. J. Immunol.,

24: 3038 (1994).

- Van Pel A., van der Bruggen P., Coulie P.G. , et al., Immunol. Rev.,

145: 229 (1995).

- Weynants P., Lethé B., Brasseur F., et al. Int. J. Cancer, 56: 826 (1994).

- Nishimura S, Fujita M, Terata N, Tani T, Kodama M, Itoh K, Nihon Rinsho Meneki Gakkai Kaishi 1997, Apr, 20 (2): 95-101.

- Fuijie T et al, Ann Oncol 1997 Apr, 8 (4): 369-72.

Claims (15)

1. Tumorassosiert antigenderivat tilhørende MAGE-familien, karakterisert ved at derivatet omfatter derivatiserte tiolresidier.

2. Antigen ifølge krav 1, karakterisert ved at de derivatiserte frie tioler er karboksyamiderte eller karboksymetylerte.

3. Antigen ifølge kravene log2, karakterisert ved at antigenet omfatter en fusjonspartner utvalt fra protein D eller fagment av dette omfattende den første 1/3 av protein D.

4. Antigen ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3, karakterisert ved at antigenet omfatter et affinitetsmerke.

5. Antigen ifølge et hvilket som helst av kravene 3 eller 4, karakterisert ved at protein D eller fragment av dette er lipidert.

6. Antigen ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 5, karakterisert ved at MAGE-proteinet er utvalgt fra gruppen: MAGE Al, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE A10, MAGE Al 1, MAGE A12, MAGE Bl, MAGE B2, MAGE B3, MAGE B4, MAGE Cl og MAGE C2.

7. Vaksine, karakterisert ved at den inneholder et protein ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 6.

8. Vaksine ifølge krav 7, karakterisert ved at den ytterligere omfatter en adjuvans og/eller et immunstimulerende cytokin eller kjemokin.

9. Vaksine ifølge krav 7 eller 8, karakterisert ved at proteinet er til stede i en olje-i-vann eller vann-i-olje emulsjonsvehikkel.

10. Vaksine ifølge krav 7 eller 8, karakterisert ved at adjuvansen omfatter 3D-MPL, QS21 eller et CpG-oligonukleotid.

11. Vaksine iføgle et hvilket som helst av kravene 7 til 10, karakterisert ved at de ytterligere omfatter ett eller flere antigener.

12. Vaksine ifølge et hvilket som helst av kravene 7 til 10 til bruk som medisin.

13. Anvendelse av et antigen ifølge et hviket som helst av kravene 1 til 6 for fremstilling av en vaksine for immunterapeutisk behandling av en pasient som lider av melanom eller andre MAGE-assosierte tumorer.

14. Fremgangsmåte for rensing av et tumor-assosiert antigen avledet fra MAGE-familien ifølge krav 1 eller nevnte antigen omfattende en fusjonspartner utvalgt fra protein D eller et fragment derav omfattende den første 1/3 av protein D ifølge krav 3, omfattende redusering av disulfidbindinger, blokkering av de resulterende frie tiolgrupper med en blokkeringsgruppe, og utsetting av det resulterende derivat for en eller flere kromatografiske rensingstrinn.

15. Fremgangsmåte for fremstilling av en vaksine, karakterisert v e d at den omfatter trinnene: rensing av et turnorassosiert antigen avledet fra MAGE-familien eller nevnte antigen omfatter en fusjonspartner utvalgt fra protein D eller et fragment derav omfattende den første 1/3 av protein D ved fremgangsmåten ifølge krav 17, og formulering av det resulterende protein som en vaksine.