PT1659179E - Derivados de antigénios associados a tumor da família mage e sequências de ácidos nucleicos codificando-os, utilizados para a preparação de proteínas de fusão e de composições para vacinação - Google Patents
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DESCRIÇÃO "DERIVADOS DE ANTIGÉNIOS ASSOCIADOS A TUMOR DA FAMÍLIA MAGE E SEQUÊNCIAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS CODIFICANDO-OS, UTILIZADOS PARA A PREPARAÇÃO DE PROTEÍNAS DE FUSÃO E DE COMPOSIÇÕES PARA VACINAÇÃO" A presente invenção refere-se à utilização de um derivado de antigénio associado a tumor da família MAGE, compreendendo resíduos de tiol derivatizados para a preparação de uma vacina para tratar, de um modo imunoterapêutico, um doente sofrendo de um tumor associado a MAGE, no qual o tumor associado a MAGE é seleccionado de cancro da mama, cancro da bexiga, cancro do pulmão, carcinoma de células não pequenas do pulmão (NSCLC), carcinoma da cabeça e das células escamosas, carcinoma do cólon e carcinoma do esófago. A presente divulgação refere-se a derivados de proteínas, compreendendo um antigénio associado a tumor que encontra utilidade em terapia de vacina de cancro. Em particular, os derivados da divulgação incluem proteínas de fusão compreendendo um antigénio codificado pela família de genes MAGE (e. g., MAGE-3, MAGE-1), ligadas a um parceiro de fusão imunológico que proporciona epitopos auxiliares T, tais como, por exemplo a forma lipidada de proteína D de Haemophilus ínfluenzae B; proteínas MAGE quimicamente modificadas, em que as pontes dissulfureto do antigénio estão reduzidas e os tióis resultantes bloqueados e as proteínas MAGE geneticamente modificadas dotadas de um marcador de afinidade e/ou geneticamente modificadas para impedir a formação de ponte dissulfureto. Também são descritos métodos para a purificação de proteínas MAGE e para a formulação de vacinas para tratamento de 1 uma gama de cancros, incluindo mas não limitados a Melanoma, mama, bexiga, pulmão, NSCLC, carcinoma da cabeça e das células escamosas, carcinoma do cólon e carcinoma do esófago.
Os antigénios codificados pela família de genes MAGE são predominantemente expressos em células de melanoma (incluindo melanoma maligno) e alguns outros cancros, incluindo NSCLC (cancro de células não pequenas do pulmão), carcinoma da cabeça e das células escamosas do pescoço, carcinoma de células de transição da bexiga e carcinoma do esófago, mas não são detectáveis em tecidos normais, excepto nos testículos e na placenta (Gaugler, 1994; Weynants, 1994; Patard, 1995). 0 MAGE-3 é expresso em 69% de melanomas (Gaugler, 1994) e também pode ser detectado em 44% de NSCLC (Yoshimatsu, 1988), 48% de carcinoma da cabeça e das células escamosas do pescoço, 34% de carcinoma de células de transição da bexiga, 57% de carcinoma do esófago, 32% de cancros do cólon e 24% de cancros da mama (Van Pel, 1995); Inoue, 1995, Fujie 1997; Nishimura, 1997). Os cancros expressando proteínas MAGE são conhecidos como tumores associados a MAGE. A imunogenicidade de células de melanoma humano foi elegantemente demonstrada em experiências utilizando culturas mistas de células de melanoma e linfócitos autólogos. Estas culturas produzem, frequentemente, linfócitos T citotóxicos específicos (CTL), capazes de lisarem exclusivamente as células de melanoma autólogas mas não os fibroblastos autólogos, nem linfócitos B transformados com EBV autólogos (Knuth, 1984; Anichini, 1987). Vários dos antigénios reconhecidos em células de melanoma autólogas por estes clones de CTL estão agora identificados, incluindo os da família MAGE. 2 0 primeiro antigénio que pôde ser definido através do seu reconhecimento por CTL específicos em células de melanoma autólogas é designado MZ2-E (Van den Eynde, 1989) e é codificado pelo gene MAGE-1 (Van der Bruggen, 1991). Os CTL dirigidos contra MZ2-E reconhecem e lisam células de melanoma positivas para MZ2-E de doentes autólogos, bem como de outros doentes, desde que estas células tenham o alelo HLA.A1. 0 gene MAGE-1 pertence a uma família de 12 genes int imamente relacionados, MAGE 1, MAGE 2, MAGE 3, MAGE 4, MAGE 5, MAGE 6, MAGE 7, MAGE 8, MAGE 9, MAGE 10, MAGE 11, MAGE 12, localizados no cromossoma X e partilhando entre si 64 a 85% de homologia na sua sequência codificante (De Plaen, 1994). Estes são, por vezes, conhecidos como MAGE Al, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE AIO, MAGE All, MAGE A12 (a família MAGE A). Dois outros grupos de proteínas também são parte da família MAGE, embora mais distantemente relacionados. Estes são o grupo MAGE B e MAGE C. A família MAGE B inclui MAGE BI (também conhecido por MAGE Xpl e DAM 10) , MAGE B2 (também conhecido como MAGE Xp2 e DAM 6) , MAGE B3 e MAGE B4 - a família Mage C inclui actualmente MAGE Cl e MAGE C2. Em termos gerais, uma proteína MAGE pode ser definida como contendo uma assinatura de sequência nuclear localizada em direcção à extremidade C-terminal da proteína (por exemplo, com respeito a MAGE Al, uma proteína de 309 aminoácidos, a assinatura nuclear corresponde aos aminoácidos 195-279). O padrão consenso da assinatura nuclear é, deste modo, descrito como se segue, em que x representa qualquer aminoácido, os resíduos em minúsculas são conservados (permitidos variantes conservadores) e os resíduos em maiúsculas são perfeitamente conservados. 3
Assinatura de sequência nuclear
LixvL(2x)I(3x)g(2x)apEExiWexl(2x)m(3-4x)Gxe(3-4x)gxp(2x)llt(3x)VqexYLxYxqVPxsxP(2x)yeFLWGprA(2x)Et (3 x) kv
As substituições conservadoras são bem conhecidas e são, em geral, implementadas como matrizes de pontuação predefinidas em programas de computador de alinhamento de sequências. Estes programas incluem PAM250 (Dayhoft M.O. et al., (1978), "A model of evolutionary changes in proteins", Em "Atlas of Protein sequence and structure" 5(3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352),
National Biomedical Research Foundation, Washington e Blosum 62 (Steven Henikoft e Jorja G. Henikoft (1992), "Amino acid substitution matricies from protein blocks"), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (Biochemistry) : 10915-10919.
Em termos gerais, as substituições dentro dos seguintes grupos são substituições conservadoras, mas as substituições entre grupos são consideradas não conservadoras. Os grupos são: i) Aspartato/asparagina/glutamato/glutamina ii) Serina/treonina iii) Lisina/arginina iv) Fenilalanina/tirosina/triptofano v) Leucina/isoleucina/valina/metionina vi) Glicina/alanina
Em geral, e no contexto desta divulgação, uma proteína MAGE será, aproximadamente, 50% idêntica nesta região nuclear com os aminoácidos 195 a 279 de MAGE Al. 4
Foram identificados vários epitopos de CTL na proteína MAGE-3. Um desses epitopos, MAGE-3.A1, é uma sequência nonapeptidica, localizada entre os aminoácidos 168 e 176 da proteína MAGE-3, que constitui um epitopo específico para CTL, quando apresentado em associação com a molécula HLA.A1 de MHC de classe I. Recentemente, foram identificados dois epitopos de CTL adicionais na sequência peptídica da proteína MAGE-3, pela sua capacidade para desencadearem uma resposta de CTL numa cultura mista de células de melanoma e linfócitos autólogos. Estes dois epitopos têm motivos de ligação específicos para os alelos HLA.A2 (Van der Bruggen, 1994) e HLA.B44 (Herman, 1996), respectivamente. 0 documento WO9504542 divulga o isolamento e produção do gene MAGE-1 completo e a identificação e teste de péptidos MAGE imunogénicos. É sugerida a fusão com o péptido auxiliar T, opcionalmente por meio de um espaçador. A presente divulgação proporciona derivados de proteínas MAGE. Esses derivados são adequados para utilização em formulações vacinais terapêuticas, que são adequadas para o tratamento de uma gama de tipos de tumores.
Numa forma de realização da presente divulgação, o derivado é uma proteína de fusão, compreendendo um antigénio da família de proteínas MAGE ligado a um parceiro heterólogo. As proteínas podem ser quimicamente conjugadas mas são, de um modo preferido, expressas como proteínas de fusão recombinantes, permitindo que sejam produzidos níveis aumentados num sistema de expressão, em comparação com proteína não fundida. Deste modo, o parceiro de fusão pode auxiliar a proporcionar epitopos auxiliares T (parceiro de fusão imunológico) , de um modo preferido epitopos 5 auxiliares T reconhecidos por humanos, ou auxiliar na expressão da proteína (estimulador de expressão) a rendimentos mais elevados do que a proteína recombinante nativa. De um modo preferido, o parceiro de fusão será um parceiro de fusão imunológico e um parceiro estimulador de expressão.
Numa forma preferida da divulgação, o parceiro de fusão imunológico é derivado de proteína D, uma proteína de superfície da bactéria gram-negativa, Haemophilus influenza B (documento W091/18926) . De um modo preferido, o derivado de proteína D compreende, aproximadamente, o primeiro 1/3 da proteína, em particular, aproximadamente, os primeiros 100-110 aminoácidos N-terminais. De um modo preferido, o derivado de proteína D é lipidado. De um modo preferido, os primeiros 109 resíduos do parceiro de fusão de Lipoproteína D estão incluídos na extremidade N, para proporcionarem o antigénio candidato vacinai com epitopos de célula T exógenos adicionais e aumentarem o nível de expressão em E-coli (actuando, deste modo, como um estimulador de expressão) . A cauda lipídica garante a apresentação óptima do antigénio às células de apresentação de antigénios.
Outros parceiros de fusão incluem a proteína não estrutural do vírus de influenza, NS1 (hemaglutinina). Tipicamente, são utilizados os 81 aminoácidos N-terminais, embora possam ser utilizados fragmentos diferentes, desde que incluam epitopos auxiliares T.
Noutra forma de realização, o parceiro de fusão imunológico é a proteína conhecida como LYTA. De um modo preferido, é utilizada a porção C terminal da molécula. A Lyta é derivada de Streptococcus pneumoniae que sintetiza uma N-acetil-L-alanina 6 amidase, amidase LYTA, (codificada pelo gene lytA {Gene, 43 (1986) página 265-272} uma autolisina que degrada especificamente determinadas ligações na estrutura do peptidoglicano. 0 domínio C-terminal da proteína LYTA é responsável pela afinidade para colina ou para alguns análogos de colina, tal como DEAE. Esta propriedade foi explorada para o desenvolvimento de plasmídeos expressando C-LYTA de E. coli, úteis para expressão de proteínas de fusão. Foi descrita a purificação de proteínas híbridas contendo o fragmento C-LYTA na sua extremidade amino {Biotechnology: 10, (1992) página 795-798}. Como aqui utilizada, uma forma de realização preferida utiliza a porção repetida da molécula de Lyta, verificada na extremidade C, começando no resíduo 178. Uma forma particularmente preferida incorpora os resíduos 188 - 305.
Os parceiros de fusão imunológicos acima referidos também são vantajosos no auxílio da expressão. Em particular, essas fusões são expressas a rendimentos mais elevados do que as proteínas MAGE recombinantes nativas.
Foi demonstrado pela presente requerente que, num quadro clínico, essas construções são capazes de tratar o melanoma. Num caso, foram eliminadas metástases de um doente com melanoma de fase IV, após duas doses de proteína lipo D 1/3 MAGE 3 His sem adj uvante.
Consequentemente, a presente divulgação proporciona, na forma de realização, proteínas de fusão compreendendo um antigénio associado a tumor da família MAGE, ligado a um parceiro de fusão imunológico. De um modo preferido, o parceiro de fusão imunológico é proteína D ou seu fragmento, de um modo muito preferido, lipoproteína D. As proteínas MAGE são, de um 7 modo preferido, MAGE AI ou MAGE A3. A parte de Lipoproteina D compreende, de um modo preferido, o primeiro 1/3 de Lipoproteina D.
As proteínas da presente divulgação são, de um modo preferido, expressas em E. coli. Numa forma de realização preferida, as proteínas são expressas com um marcador de afinidade, tal como, por exemplo, uma cauda de histidina compreendendo entre 5 a 9 e, de um modo preferido, seis resíduos de histidina. Estes são vantajosos em auxiliar a purificação. A presente divulgação também proporciona um ácido nucleico codificando as proteínas da presente divulgação. Essas sequências podem ser inseridas num vector de expressão adequado e utilizadas para vacinação de ADN/ARN ou expressas num hospedeiro adequado. Os vectores microbianos expressando o ácido nucleico podem ser utilizados como vacinas. Esses vectores incluem, por exemplo, poxvírus, adenovírus, alfavírus, listeria e monarfago.
Uma sequência de ADN codificando as proteínas da presente divulgação pode ser sintetizada utilizando técnicas de síntese de ADN padrão, tal como por ligação enzimática, como descrita por D.M. Roberts et ai., em Biochemistry 1985, 24, 5090-5098, por síntese química, por polimerização enzimática in vitro ou por tecnologia de PCR utilizando, por exemplo, uma polimerase termoestável ou por uma combinação destas técnicas. A polimerização enzimática de ADN pode ser efectuada in vitro utilizando uma ADN polimerase, tal como ADN polimerase I (fragmento de Klenow), num tampão apropriado contendo os trifosfatos de nucleósido dATP, dCTP, dGTP e dTTP, como requeridos, a uma temperatura de 10-37 °C, em geral num volume de 50 pL ou menos. A ligação enzimática de fragmentos de ADN pode ser efectuada utilizando uma ADN ligase, tal como T4 ADN ligase, num tampão adequado, tais como Tris a 0, 05 M (pH 7,4), MgCl2 a 0,01 M, ditiotreitol a 0,01 M, espermidina a 1 mM, ATP a 1 mM e albumina de soro bovino a 0,1 mg/mL, a uma temperatura de 4 °C até à ambiente, em geral num volume de 50 mL ou menos. A síntese química do polímero ou fragmentos de ADN pode ser efectuada por química convencional de fosfotriéster, fosfito ou fosforamidito, utilizando técnicas de fase sólida, tais como as descritas em "Chemical and Enzymatic Synthesis of Gene Fragments - A Laboratory Manual" (ed. H.G. Gassen e A. Lang), Verlag Chemie, Weinheim (1982) ou noutras publicações científicas, por exemplo, M.J. Gait, H.W.D. Matthes, M. Singh, B.S. Sproat e R.C. Titmas, Nucleic Acids Research, 1982, 10, 6243; B.S. Sproat e W. Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24, 5771; M.D. Matteucci e M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 719; M.D.
Matteucci e M.H. Caruthers, Journal of the American Chemical
Society, 1981, 103, 3185; S. P. Adams et ai. , Journal of the American Chemical Society, 1983, 105, 661 ; N. D. Sinha, J. Biernat, J. McMannus e H. Koester, Nucleic Acids Research, 1984, 12, 4539 e H.W.D. Matthes et ai., EMBO Journal, 1984, 3, 801. O processo da divulgação pode ser realizado por técnicas de recombinação convencionais, tais como descritas em Maniatis et ai., Molecular Cloning - A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor, 1982-1989.
Em particular, o processo pode compreender as etapas de: 9 i) preparar um vector de expressão replicável ou de integração capaz de expressar numa célula hospedeira um polímero de ADN compreendendo uma sequência nucleotidica que codifica a proteína ou um seu derivado imunogénico; ii) transformar uma célula hospedeira com o referido vector; iii) cultivar a referida célula hospedeira transformada, sob condições permitindo a expressão do referido polímero de ADN, para produzir a referida proteína; e iv) recuperar a referida proteína. 0 termo "transformar" é aqui utilizado para significar a introdução de ADN estranho numa célula hospedeira. Isto pode ser alcançado, por exemplo, por transformação, transfecção ou infecção com um vector plasmídico ou virai apropriado utilizando e. g. , técnicas convencionais como descritas em Genetic Engineering; Eds. S.M. Kingsman e A.J. Kingsman; Blackwell Scientific Publications; Oxford, Inglaterra, 1988. 0 termo "transformado" ou "transformante" será, a seguir, aplicado à célula hospedeira resultante contendo e expressando o gene estranho de interesse.
Os vectores de expressão são novos e também formam parte da divulgação.
Os vectores de expressão replicáveis podem ser preparados de acordo com a divulgação, através da clivagem de um vector compatível com a célula hospedeira, para proporcionar um 10 segmento de ADN linear tendo um replicão intacto e da combinação do referido segmento linear com uma ou mais moléculas de ADN que, juntamente com o referido segmento linear, codificam o produto desejado, tal como o polímero de ADN codificando a proteína da divulgação ou seu derivado, sob condições de ligação.
Deste modo, o polímero de ADN pode ser pré-formado ou formado durante a construção do vector, como desejado. A escolha do vector será determinada, em parte, pela célula hospedeira, que pode ser procariótica ou eucariótica mas é, de um modo preferido, E. Coli ou células CHO. Os vectores adequados incluem plasmídeos, bacteriófagos, cosmídeos e vírus recombinantes. A preparação do vector de expressão replicável pode ser efectuada convencionalmente, com enzimas apropriadas para restrição, polimerização e ligação do ADN, por processos descritos em, por exemplo, Maniatis et al. citado acima. A célula hospedeira recombinante é preparada, de acordo com a divulgação, pela transformação de uma célula hospedeira com um vector de expressão replicável da divulgação, sob condições de transformação. As condições de transformação adequadas são convencionais e são descritas em, por exemplo, Maniatis et al. citado acima, ou "DNA Cloning" Vol. II, D.M. Glover ed., IRL Press Ltd, 1985. A escolha de condições de transformação é determinada pela célula hospedeira. Deste modo, um hospedeiro bacteriano, tal como E. coli, pode ser tratado com uma solução de CaCl2 (Cohen 11 1973, 69, 2110) ou com uma et al., Proc. Nat. Acad. Sei., solução compreendendo uma mistura de RbCl, MnCl2, acetato de potássio e glicerol e, depois, com ácido 3-[N-morfolino]-propanossulfónico, RbCl e glicerol. As células de mamífero em cultura podem ser transformadas por co-precipitação com cálcio do ADN de vector nas células. A divulgação também se estende a uma célula hospedeira transformada com um vector de expressão replicável da divulgação. O cultivo da célula hospedeira transformada, sob condições permitindo a expressão do polímero de ADN, é efectuado convencionalmente, como descrito em, por exemplo, Maniatis et al. e "DNA Cloning" citado acima. Deste modo, de um modo preferido, a célula é alimentada com nutriente e cultivada a uma temperatura abaixo de 50 °C. O produto é recuperado por métodos convencionais de acordo com a célula hospedeira e de acordo com a localização do produto de expressão (intracelular ou segregado para o meio de cultura ou para o periplasma celular) . Deste modo, quando a célula hospedeira é bacteriana, tal como E. coli, pode, por exemplo, ser lisada fisicamente, quimicamente ou enzimaticamente e o produto de proteína isolado do lisado resultante. Quando a célula hospedeira é de mamífero, o produto pode ser, em geral, isolado do meio nutriente ou de extractos isentos de células. As técnicas convencionais de isolamento de proteína incluem precipitação selectiva, cromatografia de adsorção e cromatografia de afinidade, incluindo uma coluna de afinidade de anticorpo monoclonal. 12
As proteínas da presente divulgação são proporcionadas solúveis, numa forma líquida ou numa forma liofilizada.
Em geral, é esperado que cada dose humana compreenda 1 a 1000 pg de proteína e, de um modo preferido, 30 - 300 pg. A presente divulgação também proporciona numa composição farmacêutica compreendendo uma proteína da presente divulgação num excipiente farmaceuticamente aceitável.
Uma composição vacinai preferida compreende, pelo menos, Lipoproteína D - MAGE-3. Essa vacina pode conter, opcionalmente, um ou vários outros antigénios associados a tumor. Por exemplo, outros membros pertencendo às famílias MAGE e GAGE. Outro antigénio associado a tumor adequado inclui as proteínas MAGE-1, GAGE-1 ou Tirosinase. A preparação vacinai é, em geral, descrita em Vaccine Design ["The subunit and adjuvant approach" (eds Powell M.F. & Newman M.J.) (1995) Plenum Press, Nova Iorque]. A encapsulação dentro de lipossomas é descrita por Fullerton, Patente US 4235877.
As proteínas da presente divulgação são, de um modo preferido, com adjuvante na formulação vacinai da divulgação. Adjuvantes adequados incluem um sal de alumínio, tais como gel de hidróxido de alumínio (alum) ou fosfato de alumínio, mas também podem ser um sal de cálcio, ferro ou zinco, ou podem ser uma suspensão insolúvel de tirosina acilada, ou açúcares acilados, polissacáridos cationicamente ou anionicamente derivatizados ou polifosfazenos. Outros adjuvantes conhecidos incluem oligonucleótidos contendo CpG. Os oligonucleótidos são 13 caracterizados por o dinucleótido CpG ser não-metilado. Esses oligonucleótidos são bem conhecidos e são descritos, por exemplo, no documento W096/02555.
Na formulação da divulgação é preferido que a composição adjuvante induza uma resposta imunitária, de um modo preferido, do tipo TH1. Os sistemas adjuvantes adequados incluem, por exemplo, uma combinação de monofosforil-lipido A, de um modo preferido monofosforil-lipido A 3-des-0-acilado (3D-MPL), juntamente com um sal de alumínio. Os oligonucleótidos CpG também induzem, de um modo preferido, uma resposta TH1.
Um sistema melhorado envolve a combinação de um monofosforil-lipido A e um derivado de saponina, particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL, como divulgada no documento WO 94/00153, ou uma composição menos reactogénica, onde o QS21 é neutralizado com colesterol, como divulgado no documento WO 96/33739.
Uma formulação adjuvante particularmente potente envolvendo QS21, 3D-MPL & tocoferol numa emulsão de óleo em água é descrita no documento WO 95/17210 e é uma formulação preferida.
Consequentemente, numa forma de realização da presente divulgação, é proporcionada uma vacina compreendendo uma proteína da presente divulgação, de um modo mais preferido uma Lipoproteína D (ou seu derivado) - MAGE-3, com adjuvante com um monofosforil-lipido A ou seu derivado.
De um modo preferido, a vacina compreende, adicionalmente, uma saponina, de um modo mais preferido QS21. 14
De um modo preferido, a formulação adicional compreende uma emulsão de óleo em água e tocoferol. A presente divulgação também proporciona um método para a produção de uma formulação vacinai, compreendendo misturar uma proteína da presente divulgação juntamente com um excipiente farmaceuticamente aceitável, tal como 3D-MPL.
Num aspecto da divulgação, é proporcionado um processo para a purificação de uma proteína MAGE produzida de modo recombinante. 0 processo compreende a solubilização da proteína, por exemplo, num agente caotrópico forte (tais como, por exemplo, ureia, cloridrato de guanidínio) ou num detergente Zwiteriónico, e. g., (Empigen BB - n-dodecil-N,N-dimetilglicina), redução das ligações dissulfureto intra e intermoleculares da proteína, bloqueio dos tióis resultantes, para impedir a religação oxidativa e submissão da proteína a uma ou mais passos cromatográficos.
De um modo preferido, o agente de bloqueio é um agente alquilante. Esses agentes de bloqueio incluem mas não estão limitados a alfa-haloácidos ou alfa-haloamidas. Por exemplo, o ácido iodoacético e a iodoacetamida que resultam na carboximetilação ou carboxiamidação (carbamidometilação) da proteína. Podem ser utilizados outros agentes de bloqueio e estão descritos na literatura (Ver, por exemplo, The Proteins Vol. II, Eds H neurath, RL Hill e C-L Boeder, Academic Press 197 6 ou Chemical Reagents for Protein Modification, Vol. I eds. RL Lundblad e CM Noyes, CRC Press 1985). Exemplos típicos desses outros agentes de bloqueio incluem N-etilmaleimida, fosfato de cloroacetilo, O-metilisoureia e acrilonitrilo. A utilização do agente de bloqueio é vantajosa, visto que impede a agregação do produto e garante a estabilidade para purificação a jusante. 15
Numa forma de realização da divulgação, os agentes de bloqueio são seleccionados para induzirem um derivado estável covalente e irreversível (e. g., alfa-haloácidos ou alfa-haloamidas). Contudo, podem ser seleccionados outros agentes de bloqueio, de modo a que após purificação o agente de bloqueio possa ser removido para libertar a proteína não derivatizada.
As proteínas MAGE tendo resíduos de tiol livres derivatizados são novas e formam um aspecto da divulgação. Em particular, os derivados carboxiamidados ou carboximetilados são uma forma de realização preferida da divulgação.
Numa forma de realização preferida da divulgação, as proteínas da presente divulgação são proporcionadas com um marcador de afinidade, tais como CLYTA ou uma cauda de poli-histidina. Nesses casos, a proteína após a etapa de bloqueio é, de um modo preferido, submetida a cromatografia de afinidade. Para as proteínas com uma cauda de poli-histidina, pode ser realizada cromatografia de afinidade com ião metálico imobilizado (IMAC) . 0 ião metálico pode ser qualquer ião adequado, por exemplo, zinco, níquel, ferro, magnésio ou cobre mas é, de um modo preferido, zinco ou níquel. De um modo preferido, o tampão IMAC contém um detergente zwiteriónico, tal como Empigen BB (a seguir Empigen), visto que isto resulta em níveis inferiores de endotoxina no produto final.
Se a proteína for produzida com uma parte Clyta, a proteína pode ser purificada através da exploração da sua afinidade para colina ou análogos de colina, tal como DEAE. Numa forma de realização da divulgação, as proteínas são proporcionadas com uma cauda de poli-histidina e uma parte Clyta. Estas podem ser 16 purificadas num simples programa de purificação cromatográfica de afinidade de duas etapas. A divulgação será adicionalmente descrita, por referência aos exemplos seguintes: EXEMPLO I:
Preparação da estirpe de E. coll recombinante expressando a proteína de fusão Lipoproteína D-MAGE-3-His (LPD l/3-MAGE-3-His ou LpD MAGE-3-His) 1. O sistema de expressão de E. Colí:
Para a produção de Lipoproteína D, o ADN codificando a proteína D foi clonado dentro do vector de expressão pMG 81. Este plasmídeo utiliza sinais de ADN de fago lambda para dirigir a transcrição e tradução de genes estranhos inseridos. 0 vector contém o promotor PL, operador OL e dois sítios de utilização (NutL e NutR) de lambda PL, para atenuar efeitos de polaridade transcricional, quando é proporcionada a proteína N (Gross et al., 1985. Mol. & Cell. Bíol. 5:1015) . Os vectores contendo o promotor PL são introduzidos dentro de um hospedeiro lisogénico de E. coli para estabilizar o ADN plasmídico. As estirpes hospedeiras lisogénicas contêm ADN de fago lambda de replicação defeituosa, integrado dentro do genoma (Shatzman et al., 1983/
Em Experimental Manipulation of Gene Expression. Inouya (ed) p. 1-14. Academic Press NI) . 0 ADN de fago lambda dirige a síntese da proteína repressora cl que se liga ao repressor OL do vector e impede a ligação de ARN polimerase ao promotor PL e, desse modo, a transcrição do gene inserido. O gene cl da estirpe 17 de expressão AR58 contém uma mutação sensível à temperatura, de modo que a transcrição dirigida por PL pode ser regulada por mudança de temperatura, í. e., um aumento na temperatura de cultura inactiva o repressor e a síntese da proteína estranha é iniciada. Este sistema de expressão permite a síntese controlada de proteínas estranhas, em especial das que possam ser tóxicas para a célula (Shimataka & Rosenberg, 1981. Nature 292:128). 2. A estirpe de E. coli AR58: A estirpe AR58 lisogénica de E. coli, utilizada para a produção da proteína LPD-MAGE-3-His é um derivado da estirpe padrão NIH de E. coli K12, N99 (F- su- galK2, lacZ- thr-). Contém um fago lambda lisogénico defeituoso (galE::TN10, 1 Kil- cI857 DH1). 0 fenótipo Kil- impede a suspensão da síntese macromolecular do hospedeiro. A mutação cI857 confere uma lesão sensível à temperatura ao repressor cl.
A deleção de DH1 remove o operão direito do fago lambda e os loci bio, uvr3 e chlA do hospedeiro. A estirpe AR58 foi produzida por transdução de N99, com um stock de fago P lambda anteriormente crescido num derivado SA500 (galE::TN10, 1 Kil- cI857 DH1) . A introdução do lisogénio defeituoso dentro de N99 foi seleccionada com tetraciclina, em virtude da presença de um transposão TN10 codificando para resistência à tetraciclina no gene galE adjacente. 0 N99 e SA500 são estirpes K12 de E. coli derivadas a partir do laboratório do Dr. Martin Rosenberg, no National Institutes of Health. 18 3. Construção do vector concebido para expressar a proteína recombinante LPD-MAGE-3-His: A base racional era expressar MAGE-3 como uma proteína de fusão, utilizando o terço N-terminal da proteína D lipidada como parceiro de fusão ligado à extremidade N de MAGE-3 e uma sequência de vários resíduos de histidina (cauda His) colocados na sua extremidade C. A proteína D é uma lipoproteína (uma proteína de ligação à imunoglobulina D, de 42 kDa, exposta na superfície da bactéria Gram-negativa Haemophilus influenzae) . A proteína é sintetizada como um precursor, com uma sequência sinal de 18 resíduos de aminoácidos, contendo uma sequência consenso para a lipoproteína bacteriana (documento WO 91/18926).
Quando a sequência sinal de uma lipoproteína é processada durante a secreção, a Cys (na posição 19 na molécula precursora) torna-se no resíduo amino-terminal e é concomitantemente modificada por conjugação covalente de ácidos gordos ligados a éster e ligados a amida.
Os ácidos gordos ligados ao resíduo de cisteína amino-terminal funcionam, então, como âncora de membrana. 0 plasmídeo expressando a proteína de fusão foi concebido para expressar uma proteína precursora contendo a sequência sinal de 18 aminoácidos e os primeiros 109 resíduos da proteína D processada, dois aminoácidos não relacionados (Met e Asp), os resíduos de aminoácidos 2 a 314 de MAGE-3, dois resíduos Gly funcionando como uma região de articulação, para expor os sete resíduos His subsequentes. 19 A estirpe recombinante produz, deste modo, a proteína de fusão de cauda His lipidada processada, de 432 resíduos de aminoácidos de comprimento (ver a Figura 1), com a sequência de aminoácidos descrita em ID N° 1 e a sequência codificante é descrita em ID N° 2. 4. Estratégia de clonagem para a produção da proteína de fusão LPD-MAGE-3-His (vector pRIT14477):
Foram utilizados um plasmídeo de ADNc (do Dr Thierry Boon do Ludwig Institute), contendo a sequência codificante para o gene MAGE-3 (Gaugler B et ai., 1994) e o vector PRIT 14586, contendo a porção N-terminal da sequência codificante Lipo-D-1/3 (preparado como descrito na Figura 2). A estratégia de clonagem incluiu as seguintes etapas (Figura 3). a) - Amplificação por PCR das sequências apresentadas no ADNc plasmídico de MAGE 3 utilizando o oligonucleótido sentido: 5' gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct e o oligonucleótido anti-sentido: 5' gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa) ; esta amplificação conduz às seguintes modificações na extremidade N: alteração dos primeiros cinco codões para utilização de codão de E. coli, substituição do codão de Pro por um codão de Asp na posição 1, instalação de um sítio Ncol na extremidade 5' e, finalmente, adição de dois codões de 2 Gly e do codão de 7 His, seguido de um sítio Xbal na extremidade C. b) - Clonagem dentro do vector de clonagem TA, da Invitrogen, do fragmento amplificado acima e preparação do vector intermediário pRIT14647. 20 c) - Excisão do fragmento Ncol Xbal do plasmídeo pRIT14647 e clonagem dentro do vector pRIT 14586. d) - Transformação da estirpe hospedeira AR58. e) - Selecção e caracterização dos transformantes da estirpe de E. coli contendo o plasmideo pRIT 14477, expressando a proteína de fusão LPD-MAGE-3-His. EXEMPLO II:
Preparação do antigénio LPDl/3-MAGE-3-His: 1. Crescimento e indução de estirpe bacteriana - Expressão de LPD1/3-MAGE-3-HÍS:
As células de AR58, transformadas com o plasmídeo pRIT14477, foram crescidas em frascos de 2 litros, cada contendo 400 mL de meio LY12 suplementado com extracto de levedura (6,4 g/L) e sulfato de canamicina (50 mg/L). Após incubação numa plataforma de agitação, a 30 °C, durante 8 +/- 1 h, foi removida uma pequena amostra de cada frasco para examinação microscópica. Os conteúdos dos dois frascos foram agregados para proporcionarem o inoculo para o fermentador de 20 litros. O inoculo (cerca de 800 mL) foi adicionado a um fermentador de 20 litros (volume total) pré-esterilizado, contendo 7 litros de meio, suplementado com sulfato de canamicina a 50 mg/L. O pH foi ajustado e mantido a 6,8, pela adição periódica de NH4OH (25%, v/v) e a temperatura foi ajustada e mantida a 30 °C. A taxa de arejamento foi ajustada e mantida a 12 litros de ar/min 21 e a tensão de oxigénio dissolvido foi mantida a 50% de saturação, por controlo de retroacção da velocidade de agitação. A sobrepressão no fermentador foi mantida a 500 g/cm2 (0,5 bar) . A cultura em semi-continuo foi efectuada por adição controlada de uma solução de alimentação de carbono. A solução de alimentação foi adicionada a uma velocidade inicial de 0,04 mL/min e aumentada, exponencialmente, durante as primeiras 42 horas, para manter uma taxa de crescimento de 0,1 h-1.
Após 42 horas, a temperatura no fermentador foi rapidamente aumentada para 39 °C e a velocidade de alimentação foi mantida constante, a 0,005 mL/g DCW/min, durante a fase de indução, durante 22-23 horas adicionais, tempo durante o qual a expressão intracelular de LPD-MAGE-3-His atingiu um nivel máximo.
Foram recolhidas aliquotas (15 mL) de caldo, a intervalos regulares, em todas as fases de crescimento/indução e no fim da fermentação para seguir a cinética de crescimento microbiano e expressão de produto intracelular e, adicionalmente, para proporcionar amostras para testes de identificação/pureza microbiana.
No final da fermentação, a densidade óptica da cultura foi entre 80 e 120 (correspondendo a uma concentração celular compreendida entre 48 e 72 g DCW/L) e o volume liquido total foi, aproximadamente, 12 litros. A cultura foi rapidamente arrefecida para entre 6 e 10 °C e as células de ECK32 foram separadas do caldo de cultura por centrifugação, a 5000 x g, a 4 °C, durante 30 minutos. As células concentradas de ECK32 foram rapidamente armazenadas em sacos de plástico e imediatamente congeladas a -80 °C. 22 2. Extracção da proteína:
As células concentradas congeladas de ECK32 foram descongeladas, a 4 °C, antes de serem ressuspensas em tampão de disrupção celular, para uma densidade óptica final de 60 (correspondendo a uma concentração celular de, aproximadamente, 36 g DCW/L).
As células foram dissociadas por duas passagens através de um homogeneizador de alta pressão (1000 bar). A suspensão celular dissociada foi centrifugada (x 10000 g, a 4 °C, durante 30 minutos) e a fracção de sedimento foi lavada duas vezes com Triton X100 (1% p/v) + EDTA (1 mM) , seguido de uma lavagem com solução salina tamponada com fosfatos (PBS) + Tween 20 (0,1% v/v) e, finalmente, uma lavagem com PBS. Entre cada fase de lavagem, a suspensão foi centrifugada, a x 10000 g, durante 30 minutos, a 4 °C, o sobrenadante foi descartado e a fracção de sedimento foi retida. EXEMPLO III:
Caracterização de Proteína de fusão Lipo D - MAGE 3: 1. Puri fi cação: A LPD-MAGE-3-His foi purificada do homogeneizado celular utilizando uma sequência de etapas descritas abaixo: a) - Solubilização da fracção de sedimento lavada da dissociação celular, 23 b) - Redução química de ligações dissulfureto intra- e inter-proteína, seguida de bloqueio de grupos tiol para impedir a religação oxidativa, c) - Microfiltração da mistura reaccional para a remoção de particulados e redução de endotoxinas, d) - Captura e purificação primária de LPD-MAGE-3-His, por exploração da interacção de afinidade entre a cauda de poli-histidina e Sepharose Quelante carregada com zinco, e) - Remoção de proteínas contaminantes por cromatografia de permuta aniónica. A LPD-MAGE 3-His purificada foi submetida a um número de fases de aperfeiçoamento: f) - Troca de tampão/remoção de ureia por cromatografia de exclusão de tamanho, utilizando Superdex 75, g) - Filtração em processo, h) - Troca de tampão/dessalinização, por cromatografia de exclusão de tamanho, utilizando Sephadex G25.
Cada destas etapas é descrita com maior detalhe abaixo: 24 1.1) - Solubilização de sedimento de homogeneizado celular A fracção de sedimento da fase de lavagem final (como descrito acima) foi ressolubilizada, de um dia para o outro, em 800 mL de uma solução de cloridrato de guanidina (6 M) e fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0), a 4 °C. 1.2) - Redução e carboximetilação
Fez-se fluir árgon no material solubilizado (uma suspensão amarelo-claro, túrbida) para purgar qualquer oxigénio remanescente e foi adicionada uma solução stock de 2-mercaptoetanol (14 M), para proporcionar uma concentração final de 4,3 M (que correspondia a 0,44 mL de 2-mercaptoetanol por mL de solução). A solução resultante foi dividida e transferida para dentro de dois frascos de vidro, que foram ambos aquecidos a 95 °C, num banho-maria. Após 15 minutos a 95 °C, os frascos foram removidos do banho-maria e deixados arrefecer, após o que os conteúdos foram agregados para dentro de um copo (5 L) coberto com folha de alumínio, colocado em gelo e foi adicionada iodoacetamida sólida com mistura vigorosa, para proporcionar uma concentração final de 6 M (que correspondia a 1,11 g de iodoacetamida por mL de solução) . A mistura foi mantida em gelo, no escuro, durante 1 hora, para garantir a solubilização completa da iodoacetamida, antes de ser neutralizada (mantendo uma mistura vigorosa e monitorização contínua de pH) pela adição de, aproximadamente, 1 litro de hidróxido de sódio (5 M) , para dar um pH final de 7,5-7,8 . 25 A mistura resultante foi mantida em gelo, no escuro, durante 30 minutos adicionais, tempo após o que o pH foi reajustado para pH 7,5-7,8. 1.3) - Microfiltração A mistura foi microfiltrada numa unidade de fluxo tangencial Amicon Proflux M12, equipada com um cartucho de fibra oca Minikros (ref. N° M22M-600-01N; área 5600 cm2, 0,2 pm) . O permeado foi retido para purificação cromatográfica subsequente. 1.4) - Cromatografia (IMAC) de quelato metálico (Zn2+) A cromatografia de quelato metálico foi realizada com Sepharose FF Quelante (Cat. N° 17-0575-01 da Pharmacia
Biotechnology) , empacotada dentro de uma coluna BPG 100/500 (Pharmacia Biotechnology Cat. N° 18-1103-01). As dimensões do leito empacotado eram: diâmetro 10 cm; área de secção transversal 79 cm2; altura de leito 19 cm; volume empacotado 1500 mL. A coluna vazia foi limpa com hidróxido de sódio (0,5 M), depois lavada com água purificada. 0 suporte (fornecido em etanol a 20%, v/v) foi lavado com água purificada (8 litros) num funil de Buchner (sob vácuo) e carregado com zinco, através da passagem de, pelo menos, 15 litros de uma solução de ZnCl2 (0,1 M). O zinco em excesso foi removido através da lavagem do suporte com 10 litros de água purificada, até que o pH do liquido de salda atingisse o pH da solução de ZnCl2 (pH 5,0). O suporte foi, depois, equilibrado com 26 4 litros de uma solução contendo cloridrato de guanidina (6 M) e fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0). 0 permeado da microfiltração, contendo LPD-MAGE-3-His, foi misturado com o suporte (ligação descontinua), antes de carregar e empacotar a coluna BPG com a solução contendo cloridrato de guanidina (6 M) e fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0).
As fases seguintes da cromatografia de quelato metálico foram conduzidas a um caudal de eluente de 60 mL/min. A coluna foi lavada, em primeiro lugar, com a solução contendo cloridrato de guanidina (6 M) e fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0), depois com a solução contendo ureia (6 M) e fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0), até que o eluente de coluna atingisse absorvência zero a DO280 nm (linha de base) . A fracção de proteína LPD-MAGE-3-His semipura foi eluída com 2 volumes de coluna de uma solução contendo ureia (6 M) , fosfato de sódio (0,1 M, pH 7,0) e imidazole (0,5 M). A condutância desta fracção era, aproximadamente, 16 mS/cm. 1.5) - Cromatografia de permuta aniónica
Antes de se prosseguir com a cromatografia de permuta aniónica, a condutância da fracção de proteína LPD-MAGE-3-His semipura foi reduzida para, aproximadamente, 4 mS/cm, por diluição com uma solução contendo ureia (6 M) e Tris-HCl (20 mM, pH 8,0). A cromatografia de permuta aniónica foi realizada utilizando Q-Sepharose FF (Cat. N° 17-0510-01 da Pharmacia 27
Biotechnology) , empacotada numa coluna BPG 200/500 (Cat. N° 18-1103-11 da Pharmacia Biotechnology) . As dimensões do leito empacotado eram: diâmetro 10 cm; área de secção transversal 314 cm2; altura de leito 9 cm; volume empacotado 2900 mL. A coluna foi empacotada (com etanol a 20%, v/v) e lavada com 9 litros de água purificada, a um caudal de eluente de 70 mL/min. A coluna empacotada foi lavada com 3 litros de hidróxido de sódio (0,5 M), lavada com 30 litros de água purificada, depois equilibrada com 6 litros de uma solução contendo ureia (6 M) e Tris-HCl (20 mM, pH 8,0) . A LPD-MAGE-3-His diluída, semipurifiçada, foi carregada na coluna e, depois, lavada com 9 litros de uma solução contendo ureia (6 M), Tris-HCl (20 mM, pH 8,0), EDTA (1 mM) e Tween (0,1%), até que a absorvência (280 nm) do eluente caísse para zero.
Foi realizada uma etapa adicional de lavagem com 6 litros de uma solução contendo ureia (6 M) e Tris-HCl (20 mM, pH 8,0). A LPD-MAGE-3-His purificada foi eluída da coluna com uma solução contendo ureia (6 M) , Tris-HCl (20 mM, pH 8,0) e NaCl (0, 25 M) . 1.6) - Cromatografia de exclusão de tamanho A remoção de ureia de LPD-MAGE-3-His purificada e a troca de tampão foram ambas alcançadas por cromatografia de exclusão de tamanho. Isto foi realizado utilizando Superdex 75 (Cat. N° 17-1044-01 da Pharmacia Biotechnology), empacotada numa coluna XK 50/1000 (Cat. N° 18-8753-01 da Pharmacia Biotechnology). As dimensões do leito empacotado foram: diâmetro 5 cm; área de 28 secção transversal 19,6 cm2; altura de leito 90 cm; volume empacotado 1800 mL. A coluna foi empacotada em etanol (20%) e lavada com 5 litros de água purificada, a um caudal de efluente de 20 mL/min. A coluna foi lavada com 2 litros de hidróxido de sódio (0,5 M) , lavada com 5 litros de água purificada, depois equilibrada com 5 litros de solução salina tamponada com fosfatos contendo Tween 80 (0,1%, v/v). A fracção de LPD-MAGE-3-His purificada (máximo de 500 mL/corrida de dessalinização) foi carregada na coluna, a um caudal de eluente de 20 mL/min. A LPD-MAGE-3-His purificada dessalinizada foi eluida da coluna com 3 litros de PBS contendo Tween 80 (0,1%, v/v). A fracção contendo LPD-MAGE-3-His eluiu no volume morto da coluna. 1.7) - Filtração em processo O volume de LPD-MAGE-3-His de cromatografia de exclusão de tamanho foi filtrado através de uma membrana de 0,22 pm, numa câmara de fluxo laminar (classe 10000). O volume de filtrado foi congelado a -80 °C e armazenado até à etapa de dessalinização. 1.8) - Cromatografia de dessalinização
Visto que a osmolalidade do volume final deverá ser inferior a 400 mOsM, foi requerida uma etapa adicional de 29 troca de tampão, para reduzir a concentração de sal. Isto foi realizado por uma etapa de cromatografia de dessalinização, utilizando Sephadex G25 (Cat. N° 17-0033-02 da Pharmacia Biotechnology) , empacotada numa coluna BPG 100/950 (Cat. N° 18-1103-03 da Pharmacia Biotechnology). As dimensões do leito empacotado eram: diâmetro 10 cm; área de secção transversal 78,6 cm2/ altura de leito 85 cm; volume empacotado 6500 mL. A Sephadex G25 foi hidratada com 7 litros de água purificada e deixada dilatar, de um dia para o outro, a 4 °C. O gel foi, depois, empacotado na coluna com água pura, a um caudal de eluente de 100 mL/min. A coluna foi lavada com 6 litros de hidróxido de sódio (0,5 M), depois equilibrada com 10 litros de uma solução contendo fosfato de sódio (10 mM, pH 6,8), NaCl (20 mM) e Tween 80 (0,1%, v/v). A fracção de LPD-MAGE-3-His purificada (máximo de 1500 mL/corrida de dessalinização) foi carregada na coluna, a um caudal de eluente de 100 mL/min. A fracção de LPD-MAGE-3-His purificada dessalinizada, eluida no volume morto da coluna, foi filtrada de modo estéril através de uma membrana de 0,22 pm e armazenada a -80 °C. O volume de proteína final é descongelado para +4 °C, antes de ser aliquotado para dentro de frascos e liofilizado num excipiente de lactose (3,2%). 30 2. Análise em géis de SDS-poliacrilamida corados com Coomassie: 0 antigénio de LPD-MAGE-3-His purificado foi analisado por SDS-PAGE, num gel de acrilamida a 12,5% em condições redutoras. A carga de proteína era 50 pg para coloração com azul de Coomassie e 5 pg para coloração com nitrato de prata. Foram analisados o lote clínico 96K19 e o lote piloto 96J22. Foi visualizada uma banda principal, correspondendo a um peso molecular de 60 kDa. Também foram observadas duas bandas menores adicionais de, aproximadamente, 45 kDa e 35 kDa. 3. Análise de Transferência de Western:
Os péptidos revelados por análise SDS-PAGE da proteína LPD-MAGE-3-His foram identificados por transferência de Western, utilizando anticorpos monoclonais de murganho. Estes anticorpos foram desenvolvidos no local, utilizando uma preparação purificada da proteína MAGE-3-His (esta proteína não contém a parte LPD da LPD-MAGE-3-His).
Foram seleccionadas duas preparações de anticorpo monoclonal (Mab 22 e Mab 54), com base na sua adequação para análise de transferência de Western e utilizadas no teste de identidade para libertação de lote. A Figura 4 mostra os padrões de banda obtidos para os lotes 96K19 e 96J22, após coloração com os Mab 32 e 54. Foram resolvidos seiscentos (600) ng de proteína num SDS-PAGE a 12,5%, transferidos para uma membrana de nylon, reagidos com os Mab 32 e 54 (60 pg/mL) e revelados com anticorpos anti-murganho ligados a peroxidase. 31
Os péptidos de 60 kDa e 30 kDa detectados por SDS-PAGE são revelados por ambos os Mab. EXEMPLO IV: 1. Preparação vacinai utilizando a proteína LPD-MAGE-3-His: A vacina utilizada nestas experiências é produzida a partir de um ADN recombinante, codificando uma Lipoproteína D l/3-MAGE-3-His, expresso em E. coli da estirpe AR58, com adjuvante ou não. Como adjuvante, a formulação compreende uma mistura de monofosforil-lipido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) e QS21, numa emulsão de óleo/água. O sistema adjuvante SBAS2 foi anteriormente descrito no documento WO 95/17210. 3D-MPL: é um imunoestimulante derivado do lipopolissacárido (LPS) da bactéria Gram-negativa Salmonella minnesota. O MPL foi desacilado e não tem um grupo fosfato na fracção de lipido A. Este tratamento químico reduz drasticamente a toxicidade preservando, simultaneamente, as propriedades imunoestimulantes (Ribi, 198 6) . A Ribi Immunochemistry produz e fornece MPL à SB Bíologicals.
As experiências realizadas na Smith Kline Beecham Biologicals mostraram que o 3D-MPL, combinado com diversos veículos, aumenta fortemente a imunidade celular humoral e uma de tipo TH1. QS21: é uma molécula de saponina natural, extraída da casca da árvore Sul-americana Quillaja saponaia Molina. Uma técnica de purificação, desenvolvida para separar as saponinas individuais 32 dos extractos em bruto da casca, permitiu o isolamento da particular saponina, QS21, que é um glicósido triterpeno, demonstrando actividade adjuvante mais forte e menor toxicidade, em comparação com o componente parental. Demonstrou-se que a QS21 activa CTL restringidos a MHC de classe I a vários Ag de subunidade, assim como estimula a proliferação linfocitica especifica de Ag (Kensil, 1992). A Aquila (formalmente, Cambridge Biotech Corporation) produz e fornece QS21 à SB-Biologicals.
Experiências realizadas na SmithKline Beecham Biologicals demonstraram um claro efeito sinérgico de combinações de MPL e QS21 na indução de respostas imunitárias celulares humoral e de tipo TH1. A emulsão de óleo/água é composta por uma fase orgânica feita de 2 óleos (um tocoferol e esqualeno) e uma fase aquosa de PBS contendo Tween 80 como emulsionante. A emulsão compreendia esqualeno a 5%, tocoferol a 5%, Tween 80 a 0,4% e tinha um tamanho de partícula médio de 180 nm e é conhecida como SB62 (ver o documento WO 95/17210).
Experiências realizadas na SmithKline Beecham Biologicals provaram que a adjunção desta emulsão de O/A a 3D-MPL/QS21 (SBAS2) aumenta, adicionalmente, as propriedades imunoestimulantes da última contra diversos antigénios de subunidade. 33 2. Preparação de emulsão SB62 (concentrada 2 vezes): 0 Tween 80 é dissolvido em solução salina tamponada com fosfatos (PBS) para dar uma solução a 2% no PBS. Para proporcionar 100 mL de emulsão concentrada duas vezes, são vortexados 5 g de DL alf a-tocof erol e 5 mL de esqualeno para misturar exaustivamente. São adicionados 90 mL de solução de
PBS/Tween e misturados exaustivamente. A emulsão resultante é, depois, passada através de uma seringa e, finalmente, microfluidizada através da utilização de uma máquina M110S microfluidics. As goticulas de óleo resultantes têm um tamanho de, aproximadamente, 180 nm. 3. Preparação da formulação de óleo em água de Lipoprot. Dl/3 - MAGE-3-His QS21/3D MPL (SBAS2): O adjuvante é formulado como uma combinação de MPL e QS21, numa emulsão de óleo/água. Esta preparação é proporcionada em frasquinhos de 0,7 mL para serem misturados com o antigénio liofilizado (frascos-ampola contendo de 30 a 300 pg de antigénio). A composição do diluente adjuvante para a vacina liofilizada é como se segue:
Ingredientes: Quantidade (por dose): Adjuvantes Emulsão SB62: 250 pL - Esqualeno 10,7 mg 34 (continuação)
Ingredientes: Quantidade (por dose): - DL a-tocoferol 11,9 mg - Tween 80 4, 8 mg Monofosforil-Lípido A 100 pg QS21 100 pg Conservante Tiomersal 25 pg Tampão Água para injecção q.b. para 0,5 mL - Fosfato de sódio dibásico 575 pg - Fosfato de potássio monobásico 100 pg - Cloreto de potássio 100 pg - Cloreto de sódio 4, 0 mg A vacina final é obtida após reconstituição da preparação de LPD-MAGE-3-His liofilizada com o adjuvante ou com PBS isolada.
Os controlos adjuvantes sem antigénio foram preparados através da substituição da proteína por PBS. 35
Proteína de fusão Lipoproteína 4. Antigénio vacinai:
Dl/3 - MAGE-3-His: A lipoproteína D é uma lipoproteína exposta na superfície das bactérias Gram-negativas Haemophilus influenzae. A inclusão dos primeiros 109 resíduos da proteína D processada como parceiro de fusão é incorporada para proporcionar o antigénio vacinai com um epitopo de célula T. Além da fracção de LPD, a proteína contém dois aminoácidos não relacionados (Met e Asp) , os resíduos de aminoácidos 2 a 314 de Mage-3, dois resíduos de Gly funcionando como região de articulação para expor os sete resíduos de His subsequentes. EXEMPLO V: 1. Imunogenicidade de LPD-MAG-3-His em murganhos e macacos:
De modo a testar a antigenecidade e imunogenicidade da proteína MAGE-3 humana, a vacina candidata foi injectada em 2 estirpes de murganho diferentes (C57BL/6 e Balb/C), variando na sua composição genética e alelos de MHC.
Para ambas as estirpes de murganhos, os potenciais motivos peptídicos de MHC de classe I e MHC de classe II foram teoricamente previstos para a parte MAGE da proteína de fusão LPD-MAGE-3-His . 36 a) - Protocolo de imunização:
Foram injectados 5 murganhos de cada estirpe, duas vezes, a intervalos de 2 semanas, na almofada da pata, com 5 pg de LPD-MAGE-3-His, formulada ou não em SBAS2, a 1/10 da concentração utilizada em quadros humanos. b) - Ensaio de proliferação:
Os linfócitos foram preparados através do esmagamento do baço ou dos nódulos linfáticos popliteais dos murganhos, 2 semanas após a última injecção. Foram colocadas 2 x 105 células, em triplicado, em placas de 96 poços e as células foram reestimuladas in vitro, durante 72 horas, com diferentes concentrações (1- 0,1 pg/mL) de His-Mag 3 como tal ou revestidas sobre microesférulas de látex.
Foi observada uma actividade linfoproliferativa especifica de MAGE-3 aumentada com as células de baço (ver as Figuras 5 e 7) e células de nódulos linfáticos (ver as Figuras 6 e 8) de murganhos C57BL/6 ou Balb/C, injectados com a proteína LPD-MAGE-3-His, em comparação com a resposta linfoproliferativa de murganhos tendo recebido a formulação de SBAS-2 isolada ou PBS.
Além disso, foi obtida uma resposta proliferativa significativamente mais elevada com linfócitos de murganhos imunizados com LPD-MAGE-3-His no adjuvante SBAS2 (ver as Figuras 6 e 8) . 37 c) - Conclusão: A LPD-MAGE-3-His é imunogénica em murganhos e esta imunogenicidade pode ser aumentada pela utilização da formulação adjuvante de SBAS2. 2. Resposta de anticorpo: a) - Protocolo de Imunização:
Os murganhos Balb/c ou C57BL/6 foram imunizados por 2 injecções intra almofada da pata, a intervalos de 2 semanas, com PBS ou SBAS2, ou 5 pg de LPD-MAGE-3-His, ou 5 pg de LPD-MAGE-3-His + SBAS2.
Foram utilizados três e cinco animais nos grupos de controlo e nos grupos testados, respectivamente. b) - ELISA indirecto:
Duas semanas após a segunda injecção, foram recolhidos soros individuais e submetidos a um ELISA indirecto.
Foram utilizados 2 pg/mL de His MAGE 3 purificado, como antigénio revestido. Após saturação, durante 1 hora, a 37 °C, em PBS + soro de vitelo recém-nascido a 1%, os soros foram diluídos em série (começando a 1/1000) no tampão de saturação e incubados, de um dia para o outro, a 4 °C, ou 90 minutos a
37 °C. Após lavagem em PBS/Tween a 20,01%, foram utilizados IgG 38 total de cabra anti-murganho biotinilado (1/1000) ou anti-soros de cabra anti-murganho IgGl, IgG2a, IgG2b (1/5000) como segundos anticorpos. Após 90 minutos de incubação, a 37 °C, foi adicionada estreptavidina ligada a peroxidase e TMB (peróxido de tetrametilbenzidina) foi utilizado como substrato. Após 10 minutos, a reacção foi bloqueada por adição de H2SO4 a 0,5 M e a D.O. foi determinada. c) - Resultados: A Figura 9 compara entre os diferentes grupos de murganhos (N=5/grupo), o titulo médio de ponto médio relativo do soro, que consiste na diluição média necessária para atingir o ponto médio das curvas.
Estes resultados mostram que em ambas as estirpes de murganho testadas, é montada uma resposta de Ab fraca após 2 injecções de LPD-MAGE-3-His isolada, mas que são produzidas concentrações mais elevadas de Ab anti-MAGE-3 quando LPD-MAGE-3-His é injectada na presença de SBAS2. Deste modo, apenas 2 injecções de LPD-MAGE-3-His + SBAS2, a intervalos de 2 semanas, são suficientes para produzir a elevada resposta de Ab observada. A melhor resposta de Ab observada nos murganhos Balb/c, comparada com a resposta obtida nos murganhos C57BL/6, pode ser explicada por diferenças nos haplotipos ou na composição entre estas 2 estirpes, ainda que o titulo de Ab alcançado em murganhos C57BL/6 também seja mais elevado após injecções de LPD-MAGE-3-His + SBAS2 do que após injecções com LPD-MAGE-3-His isolada. 39
As respostas anti-MAGE-3 especificas de subclasses de Ig, após vacinações nos diferentes grupos de murganhos, podem ser observadas nas figuras 10 e 11 que dão uma comparação da diluição média de ponto médio dos soros. Não foi detectada IgA nem IgM em qualquer das amostras séricas, mesmo dos murganhos vacinados com LPD-MAGE-3-His no adjuvante SBAS2.
Pelo contrário, o nível de IgG total foi ligeiramente mais elevado nos soros de murganhos vacinados com LPD-MAGE-3-His isolada e aumentou significativamente nos soros de animais injectados com LPD-MAGE-3-His em SBAS2. A análise das diferentes concentrações de subclasses de IgG mostra que foi induzida uma resposta de Ab mista nos murganhos, visto que os níveis de todas as subclasses de IgG testadas (IgGl, IgG2a, IgG2b) foram mais elevados em murganhos vacinados com o Ag com adjuvante, do que em murganhos injectados com o Ag ou o adjuvante isolado. A natureza desta resposta de Ab mista, após vacinação com LipoD-MAGE 3 na presença de SBAS2 parece, contudo, depender da estirpe de murganho, visto que IgGl e IgG2b se verificaram, predominantemente, nos soros de murganhos Balb/c e C57BL/6, respectivamente. 40
His 3. Imunogenicidade da Lipoproteína D 1/3 MAGE3 + adjuvante SBAS2 em macacos Rhesus
Foram seleccionados três grupos de cinco animais Rhesus (Macaca Mulatta) . RTS,S e gpl20 foram utilizados como controlo positivo.
Grupos:
Grupo 1 perna direita: RTS,S/SBAS2 perna esquerda: : GP12 0/SBAS2 Grupo 2 perna direita: RTS,S/SB26T perna esquerda: : GP120/SB26T Grupo 3 perna direita: LipoDl/3 Mage 3 His/SBAS2
Os animais receberam a vacina no dia 0 e foram submetidos a um reforço no dia 28 e 84 e foi recolhido sangue para determinar a sua resposta de anticorpo contra os componentes de MAGE 3 e proteína D. As vacinas foram administradas intramuscularmente, como uma injecção de bólus (0,5 mL) na parte posterior da perna direita.
Foram recolhidas pequenas amostras de sangue de 14 em 14 dias. Foram recolhidas amostras de sangue não heparinizado de 3 mL da veia femoral, deixaram-se coagular durante, pelo menos, 1 hora e centrifugaram-se, à temperatura ambiente, durante 10 minutos, a 2500 rpm. 41 0 soro foi removido, congelado a -20 °C e enviado para determinação dos niveis de anticorpo, por ELISA especifico.
As microplacas de 96 poços (maxisorb Nunc) foram revestidas com 5 pg de His Mage 3 ou Proteína D, de um dia para o outro, a 4 °C. Após 1 hora de saturação, a 37 °C, com PBS NCS a 1%, foram adicionadas diluições em série dos soros de coelho, durante 1 h, a 37 °C (começando a 1/10) , após 3 lavagens em PBS Tween, foi adicionado (1/5000) soro anti-coelho biotinilado (Amersham, ref. RPN 1004, lote 88) . As placas foram lavadas e foi adicionada estreptavidina ligada a peroxidase (1/5000), durante 30 minutos, a 37 °C. Após lavagem, foram adicionados 50 pL de TMB (BioRad) , durante 7 minutos e a reacção foi interrompida com H2S04 a 0,2 M, a DO foi medida a 450 nm. As diluições de ponto médio foram calculadas por SoftmaxPro.
Resposta do anticorpo:
Foram recolhidas pequenas amostras de sangue de 14 em 14 dias para seguir a cinética da resposta de anticorpo para Mage 3, por ELISA. Os resultados indicam que após uma injecção de LPD1/3 Mage 3 His + SBAS2, o título de Ig total específica de Mage 3 era baixo, foi verificado um claro reforço em 3 de entre 5 animais após uma segunda e uma terceira injecção de LipoDl/3 Mage 3 + adjuvante nos mesmos macacos. Os que respondem fracamente permaneceram negativos, mesmo após 3 injecções. 28 dias após II ou após III, os títulos de anticorpo regressaram aos níveis basais. A subclasse destes anticorpos foi determinada como predominantemente IgG e não IgM. A troca para IgG sugere que foi desencadeada uma resposta de auxiliar T. A resposta de 42 é anticorpo especifica de proteína D, embora mais fraca, exactamente paralela à resposta de anticorpo Mage 3. EXEMPLO VI: 1. LPD - MAGE 1 His
De um modo análogo foi preparada LPD - MAGE 1-His. As sequências de aminoácidos e ADN são representadas na SEQUÊNCIA ID Nos 3 e 4. A proteína resultante foi purificada num modo análogo à proteína LPD-MAGE-3-His. Resumidamente, a cultura celular foi homogeneizada e tratada com guanidina HC1 a 4 M e beta-mercaptoetanol a 0,5 M, na presença de detergente Empigen a 0,5%. 0 produto foi filtrado e o permeado tratado com iodoacetamida a 0,6 M. As fracções carboxiamidadas foram submetidas a cromatografia IMAC (Quelato de zinco-sepharose FF) . A coluna foi, em primeiro lugar, equilibrada e lavada com uma solução contendo guanidina a 4 M. HC1 e fosfato de sódio (20 mM, pH 7,5) e Empigen a 0,5%, depois a coluna foi lavada com uma solução contendo ureia a 4 M em fosfato de sódio (20 mM, pH 7,5), tampão Empigen a 0,5%. A proteína foi eluída no mesmo tampão, mas com concentração crescente de Imidazole (20 mM, 400 mM e 500 mM). 0 eluato foi diluído com Ureia a 4 Μ. A coluna de Q-sepharose foi equilibrada e lavada com Ureia a 4 M em tampão de fosfatos a 20 mM (pH 7,5), na presença de Empigen a 0,5%. Uma segunda lavagem foi realizada no mesmo tampão, mas desprovido do detergente. A proteína eluída no mesmo tampão, mas com Imidazole crescente (150 mM, 400 mM, 1 M). O eluato foi ultrafiltrado. 43 EXEMPLO VII:
Construção do plasmideo de expressão pRIT14426 e transformação da estirpe hospedeira AR58 para produzir NS1- MA.GE -3 His:
Concepção de proteína: A concepção da proteína de fusão NS1,-MAGE-3-His a ser expressa em E. coli é descrita na figura 12. A estrutura primária da proteína resultante tem a sequência apresentada na ID N° 5. A sequência codificante (ID N° 6), correspondendo à concepção de proteína acima, foi colocada sob o controlo do promotor ÀpL num plasmideo de expressão de E. coli.
Estratégia de clonagem para a produção da proteína de fusão NSi-MAGE-3-His: 0 material de partida foi um plasmideo de ADNc, recebido do Dr. Tierry Boon do Ludwig Institute, contendo a sequência codificante para o gene MAGE-3 e o vector PMG81, contendo os 81 aa da região codificante de NS1 (Proteína não estrutural) de Influenza. A estratégia de clonagem, delineada na figura 13, incluiu as seguintes etapas: 44 a) Amplificação por PCR das sequências apresentadas no ADNc plasmídico de MAGE-3 utilizando o oligonucleótido sentido: 5' gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct e o oligonucleótido anti-sentido: 5' gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa.
Esta amplificação conduz às seguintes modificações na extremidade N: alteração dos primeiros cinco codões para utilização de codão de E. coli, substituição do codão de Pro por um codão de Asp na posição 1, instalação de um sítio Ncol na extremidade 5' e, finalmente, adição dos 2 codões de Gly e do codão de 7 His, seguido de um sítio Xbal na extremidade C. b) Clonagem dentro do vector de clonagem TA, da
Invitrogen, do fragmento amplificado acima e preparação do vector intermediário pRIT14647 c) Excisão do fragmento Ncol Xbal do plasmídeo pRIT14647 e clonagem dentro do vector pRIT PMG81 d) Transformação da estirpe hospedeira AR58. e) Selecção e caracterização dos transformantes da estirpe de E. coli contendo o plasmídeo pRIT14426, (ver a figura 14) expressando a proteína de fusão NS1-MAGE-3-His. 45
Caracterização da NSi-MAGE-3-His recombinante (pRIT14426):
As bactérias foram crescidas em Meio LB, suplementado com canamicina a 50 pg/mL, a 30 °C. Quando a cultura atingiu D0= 0,3 (a 620 nm), a indução por calor foi alcançada através do aumento da temperatura para 42 °C.
Após 4 horas de indução, as células foram recolhidas, ressuspensas em PBS e lisadas (por desintegração) , através da prensagem, três vezes, na prensa Francesa. Após centrifugação (60 minutos a 100000 g), sedimento, sobrenadante e extracto total foram analisados por SDS-PAGE. As proteínas foram visualizadas em géis corados com Coomassie Bl, onde a proteína de fusão representava cerca de 1% das proteínas totais de E. coli. A proteína recombinante surgiu como uma banda única, com um PM aparente de 44,9 K. A proteína de fusão foi identificada por análise de transferência de Western, utilizando anti-NS 1 monoclonal. EXEMPLO VIII:
Purificação de NS1-MAGE 3-His (E. coli) para Imunização de
Coelho/Murganhos.
Esquema de Purificação: O esquema de purificação seguinte foi utilizado para purificar o antigénio: 46
Lise de células + centrifugação
Solubilização de antigénio + centrifugação Ni2 +-NTA agarose
Concentração
Preparação celular
Precipitação com TCA e solubilização com PBS a. Lise
As células bacterianas (23 g) foram lisadas em 203 mL de um tampão PO4 a 50 mM, pH 7, por Rannie (homogeneizador) e o lisado foi centrifugado num rotor JA 20, a 15000 rpm, durante 30 minutos. 0 sobrenadante foi descartado. b. Solubilização de antigénio 1/3 do sedimento foi ressolubilizado, O/N, a 4 °C, em 34 mL de PO4 a 100 mM - GuHCl a 6 M, pH 7. Após centrifugação num rotor JA 20, a 15000 rpm, durante 30 minutos, o sedimento foi descartado e o sobrenadante foi adicionalmente purificado por IMAC. 47 c. cromatografia de afinidade: Ni2+-NTA agarose (Qiagen)
Volume de coluna: 15 mL (16 mm x 7,5 cm)
Tampão de empacotamento: P04 a 0,1 M - GuHCl a 6 M, pH 7 Tampão de amostra: idem
Tampão de lavagem: P04 a 0,1 M - GuHCl a 6 M, pH 7 P04 a 0,1 M - ureia a 6 M, pH 7 Eluição: gradiente de imidazole (0^250 mM) em tampão P04 a 0,1 M, pH 7, suplementado com ureia a 6 M.
Caudal: 2 mL/min a. Concentração:
As fracções positivas para antigénio do eluato de IMAC (160 mL) foram agregadas e concentradas para 5 mL numa célula agitada Amicon, numa membrana Filtron (tipo Omega, exclusão 10000) . Nesta fase, a pureza é cerca de 70%, como estimado por SDS-PAGE. b. Electroforese preparativa (Prep Cell Biorad) 2,4 mL da amostra concentrada foram fervidos em 0,8 mL de tampão de amostra redutor e carregados num gel de acrilamida a 10%. 0 antigénio foi eluido num tampão de Tris-Glicina, pH 8,3, suplementado com SDS a 4% e as fracções positivas para Nsi-MAGE 3 His foram agregadas. 48 a. Precipitação com TCA: 0 antigénio foi precipitado com TCA e, após centrifugação num rotor JA 20, a 15000 rpm, durante 20 minutos, o sobrenadante foi descartado. O sedimento foi ressolubilizado em tampão PBS, pH 7,4. A proteína é solúvel em PBS após congelação/descongelação não mostra qualquer degradação quando armazenada, durante 3 horas, a 37 °C e tem um peso molecular aparente de, aproximadamente, 50000 Daltons, como determinado por SDS (PAGE a 12,5%). EXEMPLO IX:
Preparação da estirpe de E. coli expressando uma proteína de fusão CLYTA-MAGE-1-cauda His 1. Construção do plasmídeo de expressão pRIT14613 e transformação da estirpe hospedeira AR58:
Concepção de proteína: A concepção da proteína de fusão Clyta-Mage-l-His a ser expressa em E. coli é descrita na figura 15. A estrutura primária da proteína resultante tem a sequência apresentada na sequência ID N° 7. 49 A sequência codificante (ver a SEQUÊNCIA ID N° 8), correspondendo à concepção de proteína acima, foi colocada sob o controlo do promotor λ pL num plasmídeo de expressão de E. coli.
Clonagem: 0 material de partida foi o vector PCUZ1 que contém os 117 codões C-terminais da região codificante de LytA de Streptococcus pneumoniae e o vector pRIT14518, em que foi anteriormente subclonado o ADNc do gene MAGE-1 de um plasmídeo recebido do Dr. Thierry Boon do Ludwig Institute. A estratégia de clonagem para a expressão da proteína CLYTA-Mage-l-His (ver esboço na Figura 16) incluiu as seguintes etapas: 2. Preparação do módulo de sequência codificante de CLYTA-Mage-1-Hi s: a) A primeira etapa foi uma amplificação por PCR, destinada a flanquear as sequências de CLYTA com os sítios de restrição Ndel-AflIII. A amplificação por PCR foi feita utilizando o plasmídeo PCUZ1 como molde e como iniciadores o oligonucleótido sentido: 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac e o oligonucleótido anti-sentido: 5' GCC AGA CAT GTC CAA TTC TGG CCT GTC TGC CAG. Isto conduz à amplificação de uma sequência de CLYTA de 378 nucleótidos de comprimento. 50 b) A segunda etapa foi a ligação das sequências de CLYTA às sequências de MAGE-l-His, para produzir a sequência codificante para a proteína de fusão. Esta etapa incluiu a excisão de um fragmento Ndel-AflIII de Clyta e inserção dentro do vector pRIT14518 anteriormente aberto pelas enzimas de restrição Ndel e Ncol (compatível com Ncol e AflIII) e deu origem ao plasmídeo pRIT14613. c) Transformação da estirpe hospedeira AR58. d) Selecção e caracterização do transformante de E. coli (resistente a KAN) contendo o plasmídeo pRIT14613. (Ver a figura 16) 1. Caracterização da proteína recombinante CLYTA-MAGE-l-His (pRIT!4613):
As bactérias foram crescidas em Meio LB, suplementado com canamicina a 50 pg/mL, a 30 °C. Quando a cultura atingiu DO= 0,3 (a 62 0 nm) , a indução por calor foi alcançada através do aumento da temperatura para 38 °C.
Após 4 horas de indução, as células foram recolhidas, ressuspensas em PBS e lisadas (por desintegração) por um pulso. Após centrifugação, o sedimento, sobrenadante e extracto total foram analisados por SDS-PAGE. As proteínas foram visualizadas em géis corados com Coomassie Bl, onde a proteína de fusão representava cerca de 1% das proteínas totais de E. coli. A proteína recombinante surgiu como uma banda única, com um PM aparente de cerca de 49 kD. A proteína de fusão foi identificada 51 por análise de Transferência de Western, utilizando anticorpos policlonais anti-Mage-1.
Reconstituição da unidade de expressão composta pelo promotor λ pL longo (útil para indução de ácido nalidixico) e a sequência codificante de CLYTA-Mage-1 pRIT14614):
Foi preparado um fragmento de restrição EcoRI-NCOí contendo o promotor PL longo e uma parte de sequências de CLYTA a partir do plasmideo pRIT DVA6 e inserido entre os sítios EcoRI-NCOí do plasmídeo pRIT14613.
Foi obtido o plasmídeo recombinante pRIT14614. 0 plasmídeo recombinante pRIT14614 (ver a figura 17), codificando a proteína de fusão CLYTA-Mage-l-His, foi utilizado para transformar E. coli AR120. Foi seleccionada e caracterizada uma estirpe candidata resistente Kan.
Caracterização da proteína recombinante:
As bactérias foram crescidas em Meio LB, suplementado com canamicina a 50 mg/mL, a 30 °C. Quando a cultura atingiu uma D0= 400 (a 620 nm) foi adicionado ácido nalidixico para uma concentração final de 60 mg/mL.
Após 4 horas de indução, as células foram recolhidas, ressuspensas em PBS e lisadas por desintegração (desintegração de CLS de tipo "um pulso") . Após centrifugação, o sedimento, sobrenadante e extracto total foram analisados por SDS-PAGE. As 52 proteínas foram visualizadas em géis corados com Azul de Coomassie, onde a proteína de fusão representava cerca de 1% das proteínas totais de E. coli. A proteína de fusão foi identificada por análise de transferência de Western, utilizando anticorpos policlonais anti-Mage-1. A proteína recombinante surgiu como uma banda única, com um PM aparente de cerca de 4 9 kD. EXEMPLO X:
CLYTA - MAGE-3-HIS A: Antigénio recombinante de rejeição de tumor: uma proteína de fusão CLYTA-Mage-3-His, onde o parceiro de fusão C-lyt A conduziu à expressão de uma proteína solúvel, actua como marcador de afinidade e proporciona um auxiliar T útil.
Preparação da estirpe de E. coli expressando uma proteína de fusão CLYTA-Mage-3-cauda His
Construção do plasmídeo de expressão pRIT14646 e transformação da estirpe hospedeira AR 120:
Concepção de proteína: A concepção da proteína de fusão Clyta-Mage-3-His a ser expressa em E. coli é descrita na figura 18. 53 A estrutura primária da proteína resultante tem a sequência descrita na SEQUÊNCIA ID N° 9 e a sequência codificante na sequência ID N° 10 A sequência codificante correspondendo à concepção de proteína acima, foi colocada sob o controlo do promotor λ pL num plasmídeo de expressão de E. coli.
Clonagem: O material de partida foi o vector PCUZ1 que contém os 117 codões C-terminais da região codificante de LytA de Streptococcus pneumoniae, descrito em Gene 43, (1986) p. 265-272, e o vector pRIT14426, em que foi anteriormente subclonado o ADNc do gene MAGE-3 de um plasmídeo recebido do Dr. Thierry Boon do Ludwig Institute. A estratégia de clonagem para a expressão da proteína CLYTA-MAGE-3-His (ver esboço na Figura 19) incluiu as seguintes etapas: 1- Preparação do módulo de sequência codificante de CLYTA-MAGE-3-His: 1.1. A primeira etapa foi uma amplificação por PCR, destinada a flanquear as sequências de CLYTA com os sítios de restrição AflII e AflIII. A amplificação por PCR foi feita utilizando o plasmídeo PCUZ1 como molde e como iniciadores o oligonucleótido sentido: 5' tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac e o oligonucleótido anti-sentido: 5' ccc 54 aca tgt cca gac tgc tgg cca att ctg gcc tgt ctg cca gtg. Isto conduz à amplificação de uma sequência de CLYTA de 427 nucleótidos de comprimento. O fragmento amplificado acima foi clonado dentro do vector de clonagem TA, da Invitrogen, para se obter o vector intermediário pRIT14661. 1.2. A segunda etapa foi a ligação das sequências de CLYTA às sequências de MAGE-3-His, para produzir a sequência codificante para a proteína de fusão. Esta etapa incluiu a excisão de um fragmento Afl II-Afl-III de Clyta e inserção dentro do vector pRIT14426 anteriormente aberto pelas enzimas de restrição Afl II e Ncol (compatível com Ncol e AflIII) e deu origem ao plasmídeo pRIT14662. 2.- Reconstituição da unidade de expressão composta pelo promotor λ pL longo (útil para indução de ácido nalidíxico) e a sequência codificante de CLYTA-Mage-3:
Um fragmento de restrição BglII - Xbal, contendo o promotor pL curto e as sequências codificantes de CLYTA-Mage-3-His, foi preparado a partir do plasmideo pRIT14662 e inserido entre os sítios BglII - Xbal do plasmídeo TCM67 (um derivado de pBR322 contendo a resistência a ampicilina e o promotor λ pL longo, descrito no pedido internacional PCT/EP92/01827) . Foi obtido o plasmídeo pRIT14607. 0 plasmídeo recombinante pRIT14607, codificando a proteína Clyta-Mage-3 Hls, foi utilizado para transformar E. coli AR 12 0 (Mott et al.1985, Proc. Natl. Acad. Sei, 82: 88) . Foi seleccionada e caracterizada uma estirpe candidata resistente a ampicilina. 55 3. Preparação do plasmideo pRIT 14646:
Finalmente, foi construído um plasmideo semelhante a pRIT 14607, mas tendo a selecção de canamicina (pRIT 14646)
Caracterização da proteína recombinante:
As bactérias foram crescidas em Meio LB, suplementado com canamicina a 50 mg/mL, a 30 °C. Quando a cultura atingiu uma DO= 400 (a 620 nm) foi adicionado ácido nalidíxico para uma concentração final de 60 ?g/mL.
Após 4 horas de indução, as células foram recolhidas, ressuspensas em PBS e lisadas por desintegração (desintegração de CLS de tipo "um pulso") . Após centrifugação, o sedimento, sobrenadante e extracto total foram analisados por SDS-PAGE. As proteínas foram visualizadas em géis corados com Azul de Coomassie, onde a proteína de fusão representava cerca de 1% das proteínas totais de E. coli. A proteína de fusão foi identificada por análise de transferência de Western, utilizando anticorpos policlonais de coelhos anti-Mage-3. A proteína recombinante surgiu como uma banda única, com um PM aparente de cerca de 58 kD. 56 EXEMPLO XI:
Purificação da proteína recombinante CLYTA-Mage-3 His:
As bactérias recombinantes AR120 (pRIT 14646) foram crescidas num fermentador de 20 Litros, sob condições semi-contínuas, a 30°. A expressão da proteína recombinante foi induzida através da adição de ácido nalidíxico, a uma concentração final de 60 ?g/mL. As células foram recolhidas no final da fermentação e lisadas, a 60 DO/600, por duas passagens através de um dissociador de Prensa Francesa (20000 psi) . As células lisadas foram sedimentadas 20 min, a 15000 g, a 4 °C. O sobrenadante contendo a proteína recombinante foi carregado em resina DEAE Sepharose CL6B (Pharmacia), pré-equilibrada em Tampão A de NaCl 0,3 M, Tris HC1 a 20 mM, pH 7,6. Após uma lavagem de coluna com tampão A, a proteína de fusão foi eluída por colina a 2% em (Tampão A). As fracções de antigénio positivas, como reveladas por análise de transferência de Western, utilizando um anticorpo anti-Mage-3, foram agregadas. O antigénio eluído com DEAE foi ajustado para Empigen BB a 0,5% (um detergente zwiteriónico) e NaCl a 50 M, antes de carregamento numa coluna de cromatografia de Afinidade de Metal Iónico, pré-equilibrada em Empigen BB a 0,5%, NaCl a 0,5 M, tampão de fosfatos a 50 mM, pH 7,6 (Tampão B). A coluna IMAC foi lavada com tampão B, até que a absorvência a 280 nm atingisse a linha de base. Foi executada uma segunda lavagem em tampão B, sem Empigen BB (Tampão C) , de modo a eliminar o detergente, antes de eluição de Antigénio por um gradiente de Imidazole a 0-250 mM Imidazole em tampão C. 57
As fracções de Imidazole a 0,090-0,250 M foram agregadas, concentradas numa membrana Filtron omega de 10 kDa, antes de diálise, versus tampão PBS. CONCLUSÃO: A requerente demonstrou que a proteína fundida LPD-MAGE3-His é imunogénica em murganhos e que esta imunogenicidade (a resposta proliferativa e resposta de anticorpo) pode ser adicionalmente aumentada, pela utilização do adjuvante descrito acima. A purificação pode ser melhorada através da derivatização dos tióis que formam pontes dissulfureto. A requerente também demonstrou que uma melhor resposta de anticorpo foi desencadeada pela vacinação com o LPD-MAGE-3-His na presença do adjuvante. O isotipo predominante verificado no soro de C57BL/6 sendo IgG2b sugere que foi deduzida uma resposta imunitária do tipo TH1.
No quadro clínico humano, foi eliminado o melanoma de um doente tratado com LPD-MAGE3-His, numa formulação sem adjuvante. 58 REFERÊNCIAS:
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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS (1) INFORMAÇÃO GERAL (i) REQUERENTE: SmithKline Beecham Biologicals (ii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Vacina (iii) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 10 60 (iv) ENDEREÇO DE CORRESPONDÊNCIA: (A) DESTINATÁRIO: SmithKline Beecham
(B) RUA: 2 New Horizons Court, Great West Road, B (C) CIDADE: Middx (D) ESTADO:
(E) PAÍS: UK
(F) CÓDIGO POSTAL: TW8 9EP (v) FORMA DE LEITURA EM COMPUTADOR: (A) TIPO DE MEIO: Disquete (B) COMPUTADOR: IBM Compatível
(C) SISTEMA OPERATIVO: DOS (D) SOFTWARE: FastSEQ para Windows, Versão 2.0 (vi) DADOS DO PEDIDO ACTUAL: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (C) CLASSIFICAÇÃO: (vii) DADOS DEO PEDIDO ANTERIOR: (A) NÚMERO DO PEDIDO: (B) DATA DE APRESENTAÇÃO: (viii) INFORMAÇÃO DO REPRESENTANTE/AGENTE:
(A) NOME: Dalton, Marcus J (B) NÚMERO DE REGISTO: (C) NÚMERO DE REFERÊNCIA/DOCUMENTO: B45126 (ix) NÚMEROS DE CONTACTO: (A) TELEFONE: 0181 9756348 (B) TELEFAX: 0181 9756177 (C) TELEX: 61 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 1: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 452 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 1:
Met 1 Asp Pro Lys Thr 5 Leu Ala Leu Ser Leu 10 Leu Ala Ala Gly Vai 15 Leu Ala Gly Cys Ser 20 Ser His Ser Ser Asn 25 Met Ala Asn Thr Gin 30 Met Lys Ser Asp Lys 35 Ile Ile Ile Ala His 40 Arg Gly Ala Ser Gly 45 Tyr Leu Pro Glu Hls 50 Thr Leu Glu Ser Lys 55 Ala Leu Ala Phe Ala 60 Gin Gin Ala Asp Tyr 65 Leu Glu Gin Asp Leu 70 Ala Met Thr Lys Asp 75 Gly Arg Leu Vai Vai 80 Ile His Asp His Phe 85 Leu Asp Gly Leu Thr 90 Asp Vai Ala Lys Lys 95 Phe Pro His Arg His 100 Arg Lys Asp Gly Arg 105 Tyr Tyr Vai Ile Asp 110 Phe Thr Leu Lys Glu 115 Ile Gin Ser Leu Glu 120 Met Thr Glu Asn Phe 125 Glu Thr Met Asp Leu 130 Glu Gin Arg Ser Gin 135 His Cys Lys Pro Glu 140 Glu Gly Leu Glu Ala 145 Arg Gly Glu Ala Leu 150 Gly Leu Vai Gly Ala 155 Gin Ala Pro Ala Thr 160 Glu Glu Gin Glu Ala 165 Ala Ser Ser Ser Ser 170 Thr Leu Vai Glu Vai 175 Thr Leu Gly Glu Vai 180 Pro Ala Ala Glu Ser 185 Pro Asp Pro Pro Gin 190 Ser Pro Gin Gly Ala 195 Ser Ser Leu Pro Thr 200 Thr Met Asn Tyr Pro 205 Leu Trp Ser Gin Ser 210 Tyr Glu Asp Ser Ser 215 Asn Gin Glu Glu Glu 220 Gly Pro Ser Thr 62
Phe 225 Pro Asp Leu Glu Ser 230 Glu Phe Gin Ala Ala 235 Leu Ser Arg Lys Vai 240 Ala Glu Leu Vai His 245 Phe Leu Leu Leu Lys 250 Tyr Arg Ala Arg Glu 255 Pro vai Thr Lys Ala 260 Glu Met Leu Gly Ser 265 Vai Vai Gly Asn Trp 270 Gin Tyr Phe Phe Pro 275 Vai Ile Phe Ser Lys 280 Ala Ser Ser Ser Leu 285 Gin Leu Vai Phe Gly 2 90 Ile Glu Leu Met Glu 295 Vai Asp Pro Ile Gly His 300 Leu Tyr Ile Phe 305 Ala Thr Cys Leu Gly 310 Leu Ser Tyr Asp Gly 315 Leu Leu Gly Asp Asn 320 Gin Ile Met Pro Lys 325 Ala Gly Leu Leu Ile 330 Ile Vai Leu Ala Ile 335 Ile Ala Arg Glu Gly 340 Asp Cys Ala Pro Glu 345 Glu Lys Ile Trp Glu 350 Glu Leu Ser Vai Leu 355 Glu Vai Phe Glu Gly 360 Arg Glu Asp Ser Ile 365 Leu Gly Asp Pro Lys 370 Lys Leu Leu Thr Gin 375 His Phe Vai Gin Glu Asn 380 Tyr Leu Glu Tyr 385 Arg Gin Vai Pro Gly 390 Ser Asp Pro Ala Cys 395 Tyr Glu Phe Leu Trp 400 Gly Pro Arg Ala Leu 405 Vai Glu Thr Ser Tyr 410 Vai Lys Vai Leu His 415 His Met Vai Lys Ile 420 Ser Gly Gly Pro His 425 Ile Ser Tyr Pro Pro 430 Leu His Glu His Trp His 450 Vai 435 His Leu Arg Glu Gly Glu 440 Glu Thr Ser Gly Gly 445 His His His (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1353 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 2: ATGGATCCAA AAACTTTAGC CCTTTCTTTA TTAGCAGCTG GCGTACTAGC AGGTTGTAGC 60 AGCCATTCAT CAAATATGGC GAATACCCAA ATGAAATCAG ACAAAATCAT TATTGCTCAC 120 CGTGGTGCTA GCGGTTATTT ACCAGAGCAT ACGTTAGAAT CTAAAGCACT TGCGTTTGCA 180 63
CAACAGGCTG ATTATTTAGA ATTCACGATC ACTTTTTAGA CGTAAAGATG GCCGTTACTA ATGACAGAAA ACTTTGAAAC GAAGGCCTTG AGGCCCGAGG GAGGAGCAGG AGGCTGCCTC CCTGCTGCCG AGTCACCAGA ACCATGAACT ACCCTCTCTG GGGCCAAGCA CCTTCCCTGA GCCGAATTGG TTCATTTTCT GAAATGCTGG GGAGTGTCGT GCTTCCAGTT CCTTGCAGCT CACTTGTACA TCTTTGCCAC CAGATCATGC CCAAGGCAGG GACTGTGCCC CTGAGGAGAA AGGGAAGACA GTATCTTGGG AACTACCTGG AGTACCGGCA GGTCCAAGGG CCCTCGTTGA AGTGGAGGAC CTCACATTTC GAGGGCGGTC ATCACCATCA
GCAAGATTTA GCAATGACTA TGGCTTGACT GATGTTGCGA TGTCATCGAC TTTACCTTAA CATGGATCTG GAACAGCGTA AGAGGCCCTG GGCCTGGTGG CTCCTCTTCT ACTCTAGTTG TCCTCCCCAG AGTCCTCAGG GAGCCAATCC TATGAGGACT CCTGGAGTCC GAGTTCCAAG GCTCCTCAAG TATCGAGCCA CGGAAATTGG CAGTATTTCT GGTCTTTGGC ATCGAGCTGA CTGCCTGGGC CTCTCCTACG CCTCCTGATA ATCGTCCTGG AATCTGGGAG GAGCTGAGTG GGATCCCAAG AAGCTGCTCA GGTCCCCGGC AGTGATCCTG AACCAGCTAT GTGAAAGTCC CTACCCACCC CTGCATGAGT CCATCACCAT TAA
AGGATGGTCG TTTAGTGGTT AAAAATTCCC ACATCGTCAT AAGAAATTCA AAGTTTAGAA GTCAGCACTG CAAGCCTGAA GTGCGCAGGC TCCTGCTACT AAGTCACCCT GGGGGAGGTG GAGCCTCCAG CCTCCCCACT CCAGCAACCA AGAAGAGGAG CAGCACTCAG TAGGAAGGTG GGGAGCCGGT CACAAAGGCA TTCCTGTGAT CTTCAGCAAA TGGAAGTGGA CCCCATCGGC ATGGCCTGCT GGGTGACAAT CCATAATCGC AAGAGAGGGC TGTTAGAGGT GTTTGAGGGG CCCAACATTT CGTGCAGGAA CATGTTATGA ATTCCTGTGG TGCACCATAT GGTAAAGATC GGGTTTTGAG AGAGGGGGAA 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1353 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 3: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1341 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 3: 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660
ATGGATCCAA AAACTTTAGC CCTTTCTTTA TTAGCAGCTG GCGTACTAGC AGGTTGTAGC AGCCATTCAT CAAATATGGC GAATACCCAA ATGAAATCAG ACAAAATCAT TATTGCTCAC CGTGGTGCTA GCGGTTATTT ACCAGAGCAT ACGTTAGAAT CTAAAGCACT TGCGTTTGCA CAACAGGCTG ATTATTTAGA GCAAGATTTA GCAATGACTA AGGATGGTCG TTTAGTGGTT ATTCACGATC ACTTTTTAGA TGGCTTGACT GATGTTGCGA AAAAATTCCC ACATCGTCAT CGTAAAGATG GCCGTTACTA TGTCATCGAC TTTACCTTAA AAGAAATTCA AAGTTTAGAA ATGACAGAAA ACTTTGAAAC CATGGGCTCT CTGGAACAGC GTAGTCTGCA CTGCAAGCCT GAGGAAGCCC TTGAGGCCCA ACAAGAGGCC CTGGGCCTGG TGTGTGTGCA GGCTGCCACC TCCTCCTCCT CTCCTCTGGT CCTGGGCACC CTGGAGGAGG TGCCCACTGC TGGGTCAACA GATCCTCCCC AGAGTCCTCA GGGAGCCTCC GCCTTTCCCA CTACCATCAA CTTCACTCGA CAGAGGCAAC CCAGTGAGGG TTCCAGCAGC CGTGAAGAGG AGGGGCCAAG CACCTCTTGT 64
ATCCTGGAGT CCTTGTTCCG CTGCTCCTCA AATATCGAGC ATCAAAAATT ACAAGCACTG CTGGTCTTTG GCATTGACGT ACCTGCCTAG GTCTCTCCTA GGCTTCCTGA TAATTGTCCT GAAATCTGGG AGGAGCTGAG GGGGAGCCCA GGAAGCTGCT CAGGTGCCGG ACAGTGATCC GAAACCAGCT ATGTGAAAGT TTCTTCCCAT CCCTGCGTGA CACCATCACC ATCACCATTA
AGCAGTAATC ACTAAGAAGG CAGGGAGCCA GTCACAAAGG TTTTCCTGAG ATCTTCGGCA GAAGGAAGCA GACCCCACCG TGATGGCCTG CTGGGTGATA GGTCATGATT GCAATGGAGG TGTGATGGAG GTGTATGATG CACCCAAGAT TTGGTGCAGG CGCACGCTAT GAGTTCCTGT CCTTGAGTAT GTGATCAAGG AGCAGCTTTG AGAGAGGAGG A
TGGCTGATTT GGTTGGTTTT CAGAAATGCT GGAGAGTGTC AAGCCTCTGA GTCCTTGCAG GCCACTCCTA TGTCCTTGTC ATCAGATCAT GCCCAAGACA GCGGCCATGC TCCTGAGGAG GGAGGGAGCA CAGTGCCTAT AAAAGTACCT GGAGTACCGG GGGGTCCAAG GGCCCTCGCT TCAGTGCAAG AGTTCGCTTT AAGAGGGAGT CGGCGGTCAT 720 780 840 900 960 1020 1080 1140 1200 1260 1320 1341 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 4: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 466 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 4:
Met 1 Asp Pro Lys Thr 5 Leu Ala Leu Ser Leu 10 Leu Ala Ala Gly Vai 15 Leu Ala Gly Cys Ser 20 Ser His Ser Ser Asn 25 Met Ala Asn Thr Gin 30 Met Lys Ser Asp Lys 35 Ile Ile Ile Ala His 40 Arg Gly Ala Ser Gly 45 Tyr Leu Pro Glu His 50 Thr Leu Glu Ser Lys 55 Ala Leu Ala Phe Ala 60 Gin Gin Ala Asp Tyr 65 Leu Glu Gin Asp Leu 70 Ala Met Thr Lys Asp 75 Gly Arg Leu Vai Vai 80 Ile His Asp His Phe 85 Leu Asp Gly Leu Thr 90 Asp Vai Ala Lys Lys 95 Phe Pro His Arg His 100 Arg Lys Asp Gly Arg 105 Tyr Tyr Vai Ile Asp 110 Phe Thr Leu Lys Glu 115 Ile Gin Ser Leu Glu 120 Met Thr Glu Asn Phe 125 Glu Thr Met Gly Ser 130 Leu Glu Gin Arg Ser 135 Leu His Cys Lys Pro 140 Glu Glu Ala Leu Glu 145 Ala Gin Gin Glu Ala 150 Leu Gly Leu Vai Cys 155 Vai Gin Ala Ala Thr 160 65
Ser Ser Ser Ser Pro 165 Leu Val Leu Gly Thr 170 Leu Glu Glu Val Pro 175 Thr Ala Gly Ser Thr 180 Asp Pro Pro Gin Ser 185 Pro Gin Gly Ala Ser 190 Ala Phe Pro Thr Thr 195 Ile Asn Phe Thr Arg 200 Gin Arg Gin Pro Ser 205 Glu Gly Ser Ser Ser 210 Arg Glu Glu Glu Gly 215 Pro Ser Thr Ser Cys 220 Ile Leu Glu Ser Leu 225 Phe Arg Ala Vai Ile 230 Thr Lys Lys Val Ala 235 Asp Leu Val Gly Phe 240 Leu Leu Leu Lys Tyr 245 Arg Ala Arg Glu Pro 250 Val Thr Lys Ala Glu 255 Met Leu Glu Ser Vai 260 Ile Lys Asn Tyr Lys 265 His Cys Phe Pro Glu 270 Ile Phe Gly Lys Ala 275 Ser Glu Ser Leu Gin 280 Leu Val Phe Gly Ile 285 Asp Val Lys Glu Ala 290 Asp Pro Thr Gly His 295 Ser Tyr Val Leu Val 300 Thr Cys Leu Gly Leu 305 Ser Tyr Asp Gly Leu 310 Leu Gly Asp Asn Gin 315 Ile Met Pro Lys Thr 320 Gly Phe Leu Ile Ile 325 Val Leu Val Met Ile 330 Ala Met Glu Gly Gly 335 His Ala Pro Glu Glu 340 Glu Ile Trp Glu Glu 345 Leu Ser Val Met Glu 350 val Tyr Asp Gly Arg 355 Glu His Ser Ala Tyr 360 Gly Glu Pro Arg Lys 365 Leu Leu Thr Gin Asp 370 Leu Vai Gin Glu Lys 375 Tyr Leu Glu Tyr Arg 380 Gin Val Pro Asp Ser 385 Asp Pro Ala Arg Tyr 390 Glu Phe Leu Trp Gly Pro 395 Arg Ala Leu Ala 400 Glu Thr Ser Tyr Val 405 Lys Val Leu Glu Tyr 410 Val Ile Lys Val Ser 415 Ala Arg Vai Arg Phe 420 Phe Phe Pro Ser Leu 425 Arg Glu Ala Ala Leu 430 Arg Glu
Glu Glu Glu Gly Vai Gly Gly His His His His His His His 435 440 445 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 404 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína 66 5:
(xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N
Met 1 Asp Pro Asn Thr 5 Vai Ser Ser Phe Gin 10 Vai Asp Cys Phe Leu 15 Trp His Vai Arg Lys 20 Arg Vai Ala Asp Gin 25 Glu Leu Gly Asp Ala 30 Pro Phe Leu Asp Arg 35 Leu Arg Arg Asp Gin 40 Lys Ser Leu Arg Gly 45 Arg Gly Ser Thr Leu 50 Gly Leu Asp Ile Glu 55 Thr Ala Thr Arg Ala 60 Gly Lys Gin Ile Vai 65 Glu Arg Ile Leu Lys 70 Glu Glu Ser Asp Glu 75 Ala Leu Lys Met Thr 80 Met Asp Leu Glu Gin 85 Arg Ser Gin His Cys 90 Lys Pro Glu Glu Gly 95 Leu Glu Ala Arg Gly 100 Glu Ala Leu Gly Leu 105 Vai Gly Ala Gin Ala 110 Pro Ala Thr Glu Glu 115 Gin Glu Ala Ala Ser 120 Ser Ser Ser Thr Leu 125 Vai Glu Val Thr Leu 130 Gly Glu Vai Pro Ala 135 Ala Glu Ser Pro Asp 140 Pro Pro Gin Ser Pro 145 Gin Gly Ala Ser Ser 150 Leu Pro Thr Thr Met 155 Asn Tyr Pro Leu Trp 160 Ser Gin Ser Tyr Glu 165 Asp Ser Ser Asn Gin 170 Glu Glu Glu Gly Pro 175 Ser Thr Phe Pro Asp 180 Leu Glu Ser Glu Phe 185 Gin Ala Ala Leu Ser 190 Arg Lys Vai Ala Glu 195 Leu Vai His Phe Leu 200 Leu Leu Lys Tyr Arg 205 Ala Arg Glu Pro Vai 210 Thr Lys Ala Glu Met 215 Leu Gly Ser Vai Vai 220 Gly Asn Trp Gin Tyr 225 Phe Phe Pro Vai ile 230 Phe Ser Lys Ala Ser 235 Ser Ser Leu Gin Leu 240 Vai Phe Gly Ile Glu 245 Leu Met Glu Vai Asp 250 Pro Ile Gly His Leu 255 Tyr Ile Phe Ala Thr 260 Cys Leu Gly Leu Ser 265 Tyr Asp Gly Leu Leu 270 Gly Asp Asn Gin ile 275 Met Pro Lys Ala Gly 280 Leu Leu Ile Ile Vai 285 Leu Ala Ile Ile Ala 290 Arg Glu Gly Asp Cys 295 Ala Pro Glu Glu Lys 300 Ile Trp Glu Glu Leu 305 Ser Vai Leu Glu Vai 310 Phe Glu Gly Arg Glu 315 Asp Ser Ile Leu Gly 320 Asp Pro Lys Lys Leu 325 Leu Thr Gin His Phe 330 Vai Gin Glu Asn Tyr 335 Leu Glu Tyr Arg Gin 340 Vai Pro Gly Ser Asp 345 Pro Ala Cys Tyr Glu 350 Phe Leu Trp Gly Pro 355 Arg Ala Leu Vai Glu 360 Thr Ser Tyr Vai Lys 365 Vai Leu His His Met 370 Vai Lys Ile Ser Gly 375 Gly Pro His Ile Ser 380 Tyr Pro Pro Leu His 385 His Glu His Trp His Vai Leu Arg 390 Glu Gly Glu Glu Gly 395 Gly His His His His 400 67 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 6: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1212 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 6: ATGGATCCAA ACACTGTGTC AAGCTTTCAG GTAGATTGCT TTCTTTGGCA TGTCCGCAAA 60 CGAGTTGCAG ACCAAGAACT AGGTGATGCC CCATTCCTTG ATCGGCTTCG CCGAGATCAG 120 AAATCCCTAA GAGGAAGGGG CAGCACTCTT GGTCTGGACA TCGAGACAGC CACACGTGCT 180 GGAAAGCAGA TAGTGGAGCG GATTCTGAAA GAAGAATCCG ATGAGGCACT TAAAATGACC 240 ATGGATCTGG AACAGCGTAG TCAGCACTGC AAGCCTGAAG AAGGCCTTGA GGCCCGAGGA 300 GAGGCCCTGG GCCTGGTGGG TGCGCAGGCT CCTGCTACTG AGGAGCAGGA GGCTGCCTCC 360 TCCTCTTCTA CTCTAGTTGA AGTCACCCTG GGGGAGGTGC CTGCTGCCGA GTCACCAGAT 420 CCTCCCCAGA GTCCTCAGGG AGCCTCCAGC CTCCCCACTA CCATGAACTA CCCTCTCTGG 480 AGCCAATCCT ATGAGGACTC CAGCAACCAA GAAGAGGAGG GGCCAAGCAC CTTCCCTGAC 540 CTGGAGTCCG AGTTCCAAGC AGCACTCAGT AGGAAGGTGG CCGAATTGGT TCATTTTCTG 600 CTCCTCAAGT ATCGAGCCAG GGAGCCGGTC ACAAAGGCAG AAATGCTGGG GAGTGTCGTC 660 GGAAATTGGC AGTATTTCTT TCCTGTGATC TTCAGCAAAG CTTCCAGTTC CTTGCAGCTG 720 GTCTTTGGCA TCGAGCTGAT GGAAGTGGAC CCCATCGGCC ACTTGTACAT CTTTGCCACC 780 TGCCTGGGCC TCTCCTACGA TGGCCTGCTG GGTGACAATC AGATCATGCC CAAGGCAGGC 840 CTCCTGATAA TCGTCCTGGC CATAATCGCA AGAGAGGGCG ACTGTGCCCC TGAGGAGAAA 900 ATCTGGGAGG AGCTGAGTGT GTTAGAGGTG TTTGAGGGGA GGGAAGACAG TATCTTGGGG 960 GATCCCAAGA AGCTGCTCAC CCAACATTTC GTGCAGGAAA ACTACCTGGA GTACCGGCAG 1020 GTCCCCGGCA GTGATCCTGC ATGTTATGAA TTCCTGTGGG GTCCAAGGGC CCTCGTTGAA 1080 ACCAGCTATG TGAAAGTCCT GCACCATATG GTAAAGATCA GTGGAGGACC TCACATTTCC 1140 TACCCACCCC TGCATGAGTG GGTTTTGAGA GAGGGGGAAG AGGGCGGTCA TCACCATCAC 1200 CATCACCATT AA 1212 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 445 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear 68 (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 7:
Met 1 Lys Gly Gly Ile 5 Vai His Ser Phe Glu Lys Ile 20 Asn Gly Thr Trp Met Leu Ala 35 Asp Arg Trp Arg Lys 40 Phe Asp 50 Asn Ser Gly Glu Met 55 Ala Lys 65 Trp Tyr Tyr Phe Asn 70 Glu Glu Lys Tyr Lys Asp Thr 85 Trp Tyr Tyr Vai Ser Asn Ala 100 Phe Ile Gin Ser Leu Lys Pro 115 Asp Gly Thr Leu Ala 120 Ser Leu 130 Glu Gin Arg Ser Leu 135 His Ala 145 Gin Gin Glu Ala Leu 150 Gly Leu Ser Ser Ser Pro Leu 165 Vai Leu Gly Gly Ser Thr Asp 180 Pro Pro Gin Ser Thr Thr lie 195 Asn Phe Thr Arg Gin 200 Ser Arg 210 Glu Glu Glu Gly Pro 215 Ser Phe 225 Arg Ala Vai Ile Thr 230 Lys Lys Leu Leu Lys Tyr Arg 245 Ala Arg Glu Glu Ser Vai Ile 260 Lys Asn Tyr Lys Lys Ala Ser 275 Glu Ser Leu Gin Leu 280 Ala Asp 290 Pro Thr Gly His Ser 295 Tyr Ser 305 Tyr Asp Gly Leu Leu 310 Gly Asp Phe Leu Ile Ile Vai 325 Leu Vai Met Pro Glu Glu Glu 340 Ile Trp Glu Glu Gly Arg Glu 355 His Ser Ala Tyr Gly 360 Asp Leu 370 Vai Gin Glu Lys Tyr 375 Leu
Asp Gly 10 Ser Tyr Pro Lys Asp 15 Lys Tyr 25 Tyr Phe Asp Ser Ser 30 Gly Tyr His Thr Asp Gly Asn 45 Trp Tyr Trp Thr Gly Trp Lys 60 Lys Ile Ala Asp Gly Ala Met 75 Lys Thr Gly Trp Val 80 Leu Asp 90 Ala Lys Glu Gly Ala 95 Met Ala 105 Asp Gly Thr Gly Trp 110 Tyr Tyr Asp Arg Pro Glu Leu 125 Asp Met Gly Cys Lys Pro Glu 140 Glu Ala Leu Glu Vai Cys Val 155 Gin Ala Ala Thr Ser 160 Thr Leu 170 Glu Glu Val Pro Thr 175 Ala Pro 185 Gin Gly Ala Ser Ala 190 Phe Pro Arg Gin Pro Ser Glu 205 Gly Ser Ser Thr Ser Cys Ile 220 Leu Glu Ser Leu Vai Ala Asp 235 Leu Val Gly Phe Leu 240 Pro Vai 250 Thr Lys Ala Glu Met 255 Leu His 265 Cys Phe Pro Glu Ile 270 Phe Gly Vai Phe Gly Ile Asp 285 Val Lys Glu Vai Leu Val Thr 300 Cys Leu Gly Leu Asn Gin Ile 315 Met Pro Lys Thr Gly 320 Ile Ala 330 Met Glu Gly Gly His 335 Ala Leu 345 Ser Val Met Glu Val 350 Tyr Asp Glu Pro Arg Lys Leu 365 Leu Thr Gin Glu Tyr Arg Gin 380 Val Pro Asp Ser 69
Asp Pro Ala Arg Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala Glu 385 390 395 400 Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val Ser Ala Arg 405 410 415 Vai Arg Phe Phe Phe Pro Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Arg Glu Glu 420 425 430 Glu Glu Gly Val Gly Gly His His His His His His His 435 440 445 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1338 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 8: ATGAAAGGGG GAATTGTACA TTCAGACGGC TCTTATCCAA AAGACAAGTT TGAGAAAATC 60 AATGGCACTT GGTACTACTT TGACAGTTCA GGCTATATGC TTGCAGACCG CTGGAGGAAG 120 CACACAGACG GCAACTGGTA CTGGTTCGAC AACTCAGGOG AAATGGCTAC AGGCTGGAAG 180 AAAATCGCTG ATAAGTGGTA CTATTTCAAC GAAGAAGGTG CCATGAAGAC AGGCTGGGTC 240 AAGTACAAGG ACACTTGGTA CTACTTAGAC GCTAAAGAAG GCGCCATGGT ATCAAATGCC 300 TTTATCCAGT CAGCGGACGG AACAGGCTGG TACTACCTCA AACCAGACGG AACACTGGCA 360 GACAGGCCAG AATTGGACAT GGGCTCTCTG GAACAGCGTA GTCTGCACTG CAAGCCTGAG 420 GAAGCCCTTG AGGCCCAACA AGAGGCCCTG GGCCTGGTGT GTGTGCAGGC TGCCACCTCC 480 TCCTCCTCTC CTCTGGTCCT GGGCACCCTG GAGGAGGTGC CCACTGCTGG GTCAACAGAT 540 CCTCCCCAGA GTCCTCAGGG AGCCTCCGCC TTTCCCACTA CCATCAACTT CACTCGACAG 600 AGGCAACCCA GTGAGGGTTC CAGCAGCCGT GAAGAGGAGG GGCCAAGCAC CTCTTGTATC 660 CTGGAGTCCT TGTTCCGAGC AGTAATCACT AAGAAGGTGG CTGATTTGGT TGGTTTTCTG 720 CTCCTCAAAT ATCGAGCCAG GGAGCCAGTC ACAAAGGCAG AAATGCTGGA GAGTGTCATC 780 AAAAATTACA AGCACTGTTT TCCTGAGATC TTCGGCAAAG CCTCTGAGTC CTTGCAGCTG 840 GTCTTTGGCA TTGACGTGAA GGAAGCAGAC CCCACCGGCC ACTCCTATGT CCTTGTCACC 900 TGCCTAGGTC TCTCCTATGA TGGCCTGCTG GGTGATAATC AGATCATGCC CAAGACAGGC 960 TTCCTGATAA TTGTCCTGGT CATGATTGCA ATGGAGGGCG GCCATGCTCC TGAGGAGGAA 1020 ATCTGGGAGG AGCTGAGTGT GATGGAGGTG TATGATGGGA GGGAGCACAG TGCCTATGGG 1080 GAGCCCAGGA AGCTGCTCAC CCAAGATTTG GTGCAGGAAA AGTACCTGGA GTACCGGCAG 1140 GTGCCGGACA GTGATCCCGC ACGCTATGAG TTCCTGTGGG GTCCAAGGGC CCTCGCTGAA 1200 ACCAGCTATG TGAAAGTCCT TGAGTATGTG ATCAAGGTCA GTGCAAGAGT TCGCTTTTTC 1260 TTCCCATCCC TGCGTGAAGC AGCTTTGAGA GAGGAGGAAG AGGGAGTCGG CGGTCATCAC 1320 CATCACCATC ACCATTAA 1338 70 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 454 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: proteína (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 9:
Met 1 Lys Gly Gly Ile 5 Vai His Ser Asp Gly 10 Ser Tyr Pro Lys Asp 15 Lys Phe Glu Lys Ile 20 Asn Gly Thr Trp Tyr 25 Tyr Phe Asp Ser Ser 30 Gly Tyr Met Leu Ala 35 Asp Arg Trp Arg Lys 40 His Thr Asp Gly Asn 45 Trp Tyr Trp Phe Asp 50 Asn Ser Gly Glu Met 55 Ala Thr Gly Trp Lys 60 Lys Ile Ala Asp Lys 65 Trp Tyr Tyr Phe Asn 70 Glu Glu Gly Ala Met 75 Lys Thr Gly Trp Vai 80 Lys Tyr Lys Asp Thr 85 Trp Tyr Tyr Leu Asp 90 Ala Lys Glu Gly Ala 95 Met Vai Ser Asn Ala 100 Phe Ile Gin Ser Ala 105 Asp Gly Thr Gly Trp 110 Tyr Tyr Leu Lys Pro 115 Asp Gly Thr Leu Ala 120 Asp Arg Pro Glu Leu 125 Ala Ser Met Leu Asp 130 Met Asp Leu Glu Gin 135 Arg Ser Gin His Cys 140 Lys Pro Glu Glu Gly 145 Leu Glu Ala Arg Gly 150 Glu Ala Leu Gly Leu 155 Vai Gly Ala Gin Ala 160 Pro Ala Thr Glu Glu 165 Gin Glu Ala Ala Ser 170 Ser Ser Ser Thr Leu 175 Vai Glu Vai Thr Leu 180 Gly Glu Vai Pro Ala 185 Ala Glu Ser Pro Asp 190 Pro Pro Gin Ser Pro 195 Gin Gly Ala Ser Ser 200 Leu Pro Thr Thr Met 205 Asn Tyr Pro Leu Trp 210 Ser Gin Ser Tyr Glu 215 Asp Ser Ser Asn Gin 220 Glu Glu Glu Gly Pro 225 Ser Thr Phe Pro Asp 230 Leu Glu Ser Glu Phe 235 Gin Ala Ala Leu Ser 240 Arg Lys Vai Ala Glu 245 Leu Vai His Phe Leu 250 Leu Leu Lys Tyr Arg 255 Ala 71
Arg Clu Pro Vai Thr Lys Ala Glu Met Leu Gly Ser Vai Vai Gly Asn 260 265 270
Trp Gin Tyr Phe Phe Pro Vai Ile Phe Ser Lys Ala Ser Ser Ser Leu 275 280 285
Gin Leu Vai Phe Gly Ile Glu Leu Met Glu Vai Asp Pro Ile Gly His
Leu 290 Tyr Ile Phe Ala Thr 295 Cys Leu Gly Leu Ser 300 Tyr Asp Gly Leu Leu 305 Gly Asp Asn Gin Ile 310 Met Pro Lys Ala 315 Gly Leu Leu Ile Ile Vai 320 Leu Ala Ile Ile Ala 325 Arg Glu Gly Asp Cys 330 Ala Pro Glu Glu Lys 335 Ile Trp Glu Glu Leu 340 Ser Vai Leu Glu Vai 345 Phe Glu Gly Arg Glu 350 Asp Ser Ile Leu Gly 355 Asp Pro Lys Lys Leu 360 Leu Thr Gin His Phe 365 Vai Gin Glu Asn Tyr 370 Leu Glu Tyr Arg Gin 375 Vai Pro Gly Ser Asp 380 Pro Ala Cys Tyr Glu 385 Phe Leu Trp Gly Pro 390 Arg Ala Leu Vai 395 Glu Thr Ser Tyr Vai Lys 400 Vai Leu His His Met 405 Vai Lys Ile Ser Gly 410 Gly Pro His Ile Ser 415 Tyr Pro Pro Leu His 420 Glu Trp Vai Leu Arg 425 Glu Gly Glu Glu Gly 430 Gly His His His His 450 435 His His His 440 445 (2) INFORMAÇÃO PARA SEQ ID N° 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1362 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CADEIA: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: ADNc (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID N° 10: ATGAAAGGGG GAATTGTACA TTCAGACGGC TCTTATCCAA AAGACAAGTT TGAGAAAATC 60 AATGGCACTT GGTACTACTT TGACAGTTCA GGCTATATGC TTGCAGACCG CTGGAGGAAG 120 CACACAGACG GCAACTGGTA CTGGTTCGAC AACTCAGGCG AAATGGCTAC AGGCTGGAAG 180 AAAATCGCTG ATAAGTGGTA CTATTTCAAC GAAGAAGGTG CCATGAAGAC AGGCTGGGTC 240 AAGTACAAGG ACACTTGGTA CTACTTAGAC GCTAAAGAAG GCGCCATGGT ATCAAATGCC 300 TTTATCCAGT CAGCGGACGG AACAGGCTGG TACTACCTCA AACCAGACGG AACACTGGCA 360 72 GACAGGCCAG AATTGGCCAG CATGCTGGAC ATGGATCTGG AACAGCGTAG TCAGCACTGC 420 AAGCCTGAAG AAGGCCTTGA GGCCCGAGGA GAGGCCCTGG GCCTGGTGGG TGCGCAGGCT 480 CCTGCTACTG AGGAGCAGGA GGCTGCCTCC TCCTCTTCTA CTCTAGTTGA AGTCACCCTG 540 GGGGAGGTGC CTGCTGCCGA GTCACCAGAT CCTCCCCAGA GTCCTCAGGG AGCCTCCAGC 600 CTCCCCACTA CCATGAACTA CCCTCTCTGG AGCCAATCCT ATGAGGACTC CAGCAACCAA 660 GAAGAGGAGG GGCCAAGCAC CTTCCCTGAC CTGGAGTCTG AGTTCCAAGC AGCACTCAGT 720 AGGAAGGTGG CCAAGTTGGT TCATTTTCTG CTCCTCAAGT ATCGAGCCAG GGAGCCGGTC 780 ACAAAGGCAG AAATGCTGGG GAGTGTCGTC GGAAATTGGC AGTACTTCTT TCCTGTGATC 840 TTCAGCAAAG CTTCCGATTC CTTGCAGCTG GTCTTTGGCA TCGAGCTGAT GGAAGTGGAC 900 CCCATCGGCC ACGTGTACAT CTTTGCCACC TGCCTGGGCC TCTCCTACGA TGGCCTGCTG 960 GGTGACAATC AGATCATGCC CAAGACAGGC TTCCTGATAA TCATCCTGGC CATAATCGCA 1020 AAAGAGGGCG ACTGTGCCCC TGAGGAGAAA ATCTGGGAGG AGCTGAGTGT GTTAGAGGTG 1080 TTTGAGGGGA GGGAAGACAG TATCTTCGGG GATCCCAAGA AGCTGCTCAC CCAATATTTC 1140 GTGCAGGAAA ACTACCTGGA GTACCGGCAG GTCCCCGGCA GTGATCCTGC ATGCTATGAG 1200 TTCCTGTGGG GTCCAAGGGC CCTCATTGAA ACCAGCTATG TGAAAGTCCT GCACCATATG 1260 GTAAAGATCA GTGGAGGACC TCGCATTTCC TACCCACTCC TGCATGAGTG GGCTTTGAGA 1320 GAGGGGGAAG AGGGCGGTCA TCACCATCAC CATCACCATT AA 1362
Lisboa, 8 de Setembro de 2011 73
Claims (10)
- REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um derivado de antigénio associado a tumor da família MAGE, compreendendo resíduos de tiol derivatizados para a preparação de uma vacina para tratar, de um modo imunoterapêutico, um doente sofrendo de um tumor associado a MAGE, no qual o tumor associado a MAGE é seleccionado de cancro da mama, cancro da bexiga, cancro do pulmão, carcinoma de células não pequenas do pulmão (NSCLC), carcinoma da cabeça e das células escamosas, carcinoma do cólon e carcinoma do esófago.
- 2. Utilização como reivindicada na reivindicação 1, em que os tióis livres derivatizados são carboxiamidados ou carboximetilados.
- 3. Utilização como reivindicada nas reivindicações 1 e 2, em que o antigénio compreende um parceiro de fusão seleccionado de proteína D ou um derivado de proteína D que compreende, aproximadamente, o primeiro 1/3 de proteína D.
- 4. Utilização como reivindicada em qualquer das reivindicações 1 a 3, em que o antigénio compreende um marcador de afinidade.
- 5. Utilização como reivindicada em qualquer das reivindicações 1 a 4, em que a proteína D ou o seu referido fragmento está lipidado. 1
- 6. Utilização como reivindicada em qualquer das reivindicações 1 a 5, em que a proteína MAGE é seleccionada do grupo: MAGE Al, MAGE A2, MAGE A3, MAGE A4, MAGE A5, MAGE A6, MAGE A7, MAGE A8, MAGE A9, MAGE AIO, MAGE All, MAGE A12, MAGE Bl, MAGE B2, MAGE B3, MAGE B4, MAGE Cl e MAGE C2.
- 7. Utilização de qualquer reivindicação anterior, na qual a vacina compreende, adicionalmente, um adjuvante e/ou citocina ou quimiocina imunoestimuladora.
- 8. Utilização da reivindicação 7, na qual a proteína é apresentada num veículo de emulsão de óleo em água ou água em óleo.
- 9. Utilização da reivindicação 7 ou 8, em que o adjuvante compreende 3D-MPL, QS21 ou um oligonucleótido CpG.
- 10. Utilização de qualquer das reivindicações 7 a 9 compreendendo, adicionalmente, um ou vários outros antigénios. Lisboa, 8 de Setembro de 2011 2
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