JP2002502604A - Ｍａｇｅファミリーからの腫瘍関連抗原及びそれらをコードする核酸配列、融合タンパク質の及びワクチン接種のための組成物の調製のための使用 - Google Patents

Ｍａｇｅファミリーからの腫瘍関連抗原及びそれらをコードする核酸配列、融合タンパク質の及びワクチン接種のための組成物の調製のための使用

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Abstract

(57)【要約】 本発明は、ＭＡＧＥファミリーからの新規タンパク質に、及びそれらの生産に、特に免疫学的融合パートナー、例えばリポプロテインＤに融合したＭＡＧＥタンパク質に関する。このような抗原は、所定範囲の腫瘍の治療のためのワクチンを供するよう調剤することができる。ＭＡＧＥタンパク質を精製するための新規な方法も供する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は癌ワクチン治療に利用できる腫瘍関連抗原を含むタンパク質誘導体に
関する。特に、本発明の誘導体は、Ｔヘルパーエピトープを供する免疫学的融合
パートナー、例えばヘモフィルス・インフルエンゼ（Haempophilus influenzae
）ＢからのプロテインＤの脂質化型に連結したＭＡＧＥ遺伝子のファミリー（例
えばＭＡＧＥ−３，ＭＡＧＥ−１）によりコードされた抗原を含む融合タンパク
質；抗原のジスルフィド架橋が還元されて生じたチオールがブロッキングされて
いる化学的に改変されたＭＡＧＥタンパク質、及びアフィニティータグが供され
及び／又はジスルフィド架橋形成を防ぐよう遺伝子改変された遺伝子的に改変さ
れたＭＡＧＥタンパク質を含む。ＭＡＧＥタンパク質を精製するため及び所定範
囲の癌、例えば黒色腫、乳癌、膀胱癌、肺癌、ＮＳＣＬＣ、頭部の癌及び扁平上
皮癌、結腸癌及び食道癌を治療するためのワクチンを調剤するための方法も記載
される。
【０００２】 ＭＡＧＥ遺伝子のファミリーによりコードされる抗原は（悪性黒色腫を含む）
黒色腫細胞及びＮＳＣＬＣ（非小細胞肺癌）を含むいくつかの他の癌、頭部及び
首扁平上皮癌、膀胱移行上皮癌及び食道癌で主に発現されるが、精巣及び胎盤を
除く正常な組織では検出できない（Gaugler, 1994; Weyhants, 1994; Patard 19
95）。ＭＡＧＥ−３は黒色腫の６９％で発現され（Gaugler, 1994 ）、ＮＳＣＬ
Ｃの４４％（Yoshimatsu 1988 ）、頭部及び首扁平上皮癌の４８％、膀胱移行上
皮癌の３４％、食道癌の５７％、直腸癌の３２％、及び乳癌の２４％（Van Pel,
1995; Inoue, 1995, Fujie 1997; Nishimura 1997）においても検出されている
。ＭＡＧＥタンパク質を発現する癌はＭＡＧＥ関連腫瘍として知られている。
【０００３】 ヒト黒色腫細胞の免疫原性は黒色腫細胞及び自己由来リンパ球の混合培養物を
用いる実験においてエレガントに証明されている。これらの培養物は自己由来黒
色腫細胞を排他的に溶解することができるが、自己由来繊維芽細胞も自己由来Ｅ
ＢＶ形質転換リンパ球も溶解することができない特定の細胞毒性Ｔリンパ球（Ｃ
ＴＬ）をしばしば作り出す（Knuth, 1984; Anichini, 1987 ）。これらのＣＴＬ
クローンにより自己由来黒色腫細胞上で認識される抗原のいくつかは、ＭＡＧＥ
ファミリーのものを含めて現在、同定されている。
【０００４】 自己由来黒色腫細胞上の特定のＣＴＬによりその認識を介して規定され得る最
初の抗原はＭＺ２−Ｅと呼ばれ（Van den Eynde, 1989 ）、遺伝子ＭＡＧＥ−１
によってコードされる（Van der Bruggen, 1991 ）。ＭＺ２−Ｅに対するＣＴＬ
は、これらの細胞がＨＬＡ．Ａ１対立遺伝子を有することを条件に自己由来及び
他の患者からのＭＺ２−Ｅ陽性黒色腫細胞を認識し、溶解する。
【０００５】 ＭＡＧＥ−１遺伝子は染色体Ｘ上に位置しそれらのコーディング配列において
互いに６４〜８５％の相同性を有する１２の密接に関連した遺伝子、ＭＡＧＥ１
，ＭＡＧＥ２，ＭＡＧＥ３，ＭＡＧＥ４，ＭＡＧＥ５，ＭＡＧＥ６，ＭＡＧＥ７
，ＭＡＧＥ８，ＭＡＧＥ９，ＭＡＧＥ１０，ＭＡＧＥ１１，ＭＡＧＥ１２のファ
ミリーに属する。これらは時折、ＭＡＧＥ Ａ１，ＭＡＧＥ Ａ２，ＭＡＧＥ
Ａ３，ＭＡＧＥ Ａ４，ＭＡＧＥ Ａ５，ＭＡＧＥ Ａ６，ＭＡＧＥ Ａ７，Ｍ
ＡＧＥ Ａ８，ＭＡＧＥ Ａ９，ＭＡＧＥ Ａ１０，ＭＡＧＥ Ａ１１，ＭＡＧ
Ｅ Ａ１２（ＭＡＧＥ Ａファミリー）として知られる。他の２つのグループの
タンパク質もＭＡＧＥファミリーの一部である。但しより遠い関係にある。これ
らはＭＡＧＥ Ｂ及びＭＡＧＥ Ｃグループである。ＭＡＧＥ Ｂファミリーは
、（ＭＡＧＥ Ｘｐ１及びＤＡＭ１０としても知られる）ＭＡＧＥ Ｂ１，（Ｍ
ＡＧＥ Ｘｐ２及びＤＡＭ６としても知られる）ＭＡＧＥ Ｂ２，ＭＡＧＥ Ｂ
３及びＭＡＧＥ Ｂ４を含む。ＭＡＧＥ Ｃファミリーは、現在、ＭＡＧＥ Ｃ
１及びＭＡＧＥ Ｃ２を含む。一般的に、ＭＡＧＥタンパク質はそのタンパク質
のＣ末端に対して位置したコア配列のサインを含むとして定義することができる
（例えばＭＡＧＥ Ａ１の３０９アミノ酸タンパク質に関して、コアのサインは
アミノ酸１９５〜２７９に相当する）。
【０００６】 従ってコアのサインの共通パターンは次の通りであり、ここでｘはいずれかの
アミノ酸を指し、小文字の残基は保存され（保存性変異を許容する）、大文字の
残基は完全に保存される。 コア配列のサイン LixvL(2x)I(3x)g(2x)apEExiWexl(2x)m(3-4x)Gxe(3-4x)gxp(2x)llt(3x)VqexYLx
YxqVPxsxP(2x)yeFLWGprA(2x)Et(3x)kv 保存性置換は公知であり、一般に配列アラインメントプログラムにおいてデフ
ォルトスコアリングマトリックスとして設定される。これらのプログラムには、
PAM250 (Dayhoft M.O.ら、(1978), “A model of evolutionary changes in pro
teins", In“Atlas of Protein sequence and structure" 5 (3) M.O. Dayhoft
(ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington、及
びBlosum 62 (Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992),“Amino acid s
ubstitution matricies from protein blocks"), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89
(Biochemistry): 10915-10919 がある。
【０００７】 一般的に、以下のグループ内の置換が保存性置換であるが、グループ間の置換
は非保存性であると考えられる。グループは次の通りである： ｉ）アスパラテート／アスパラギン／グルタメート／グルタミン ii）セリン／トレオニン iii) リシン／アルギニン iv）フェニルアラニン／チロシン／トリプトファン ｖ）ロイシン／イソロイシン／バリン／メチオニン vi）グリシン／アラニン 一般に及び本発明の文脈において、ＭＡＧＥタンパク質はＭＡＧＥ Ａ１のア
ミノ酸１９５〜２７９と、そのコア領域において約５０％、同一であろう。
【０００８】 いくつかのＣＴＬエピトープがＭＡＧＥ−３タンパク質上で同定されている。
１つのこのようなエピトープであるＭＡＧＥ−３．Ａ１はＭＨＣクラスＩ分子Ｈ
ＬＡ．Ａ１と会合して提示される時にＣＴＬに特異的なエピトープを構成するＭ
ＡＧＥ−３タンパク質のアミノ酸１６８〜１７６の間に位置したノナペプチドで
ある。現在、２つの更なるＣＴＬエピトープが、黒色腫細胞及び自己由来リンパ
球の混合培養物中でＣＴＬ応答を開始する能力によりＭＡＧＥ−３タンパク質の
ペプチド配列上で同定されている。これら２つのエピトープはＨＬＡ．Ａ２（Va
n der Bruggen, 1994 ）及びＨＬＡ．Ｂ４４（Herman, 1996）対立遺伝子の各々
についての特定の結合モチーフを有する。
【０００９】 本発明は、ＭＡＧＥタンパク質誘導体を供する。このような誘導体は所定範囲
の腫瘍型の治療のために適した治療用ワクチン製剤に用いるために好適である。 本発明の一実施形態において、本誘導体は異種のパートナーに連結したＭＡＧ
Ｅタンパク質ファミリーからの抗原を含む融合タンパク質である。そのタンパク
質は化学的にコンジュゲートされ得るが、好ましくは非融合タンパク質と比べて
増加したレベルが発現系で生産されるのを許容する組換え融合として発現される
。これにより、融合パートナーは、Ｔヘルパーエピトープ（免疫学的融合パート
ナー）、好ましくはヒトにより認識されるＴヘルパーエピトープを供するのを補
助し、又はネイティブ組換えタンパク質より高収率でタンパク質を発現するのを
補助し得る（発現エンハンサー）。好ましくは融合パートナーは、免疫学的融合
パートナー及び発現増強パートナーの両方であろう。
【００１０】 本発明の好ましい形態において、免疫学的融合パートナーはグラム陰性細菌ヘ
モフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenza ）Ｂの表面タンパク質で
あるプロテインＤから得られる（ＷＯ９１／１８９２６）。好ましくは、プロテ
インＤ誘導体は、そのタンパク質のおおよそ最初の１／３、特におおよそ最初の
Ｎ末端１００〜１１０アミノ酸を含む。好ましくは、プロテインＤ誘導体は脂質
化される。好ましくは、リポプロテインＤ融合パートナーの最初の１０９残基が
Ｎ末端上に含まれ、更なる外来Ｔ細胞エピトープと共にワクチン候補抗原を供し
、大腸菌内で発現レベルを増加させる（これにより発現エンハンサーとしても機
能する）。脂質のテールは、抗原提示細胞への抗原の最適な提示を確実にする。
【００１１】 他の融合パートナーには、インフルエンザウイルスからの非構造タンパク質Ｎ
Ｓ１（ヘマグルチニン）がある。典型的には、Ｎ末端８１アミノ酸が利用される
。但しそれらがＴヘルパーエピトープを含む限り異なるフラグメントを用いるこ
とができる。 別の実施形態において、免疫学的融合パートナーはＬＹＴＡとして知られるタ
ンパク質である。好ましくはその分子のＣ末端部分が用いられる。ＬＹＴＡは、
ペプチドグリカン骨格内の特定の結合を特異的に分解するオートリシンである（
ｌｙｔＡ遺伝子によりコードされる（Gene, 43 (1986) ページ265 〜272 ））Ｎ
−アセチル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、アミダーゼＬＹＴＡを合成するストレプ
トコッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）から得られる。ＬＹＴ
Ａタンパク質のＣ末端ドメインはコリンに対する又はＤＥＡＥのような特定のコ
リンアナログに対するアフィニティーの原因である。この特性は融合タンパク質
の発現のために役立つ大腸菌Ｃ−ＬＹＴＡ発現プラスミドの開発のために活用さ
れている。アミノ末端にＣ−ＬＹＴＡフラグメントを含むハイブリッドタンパク
質の精製は記述されている（Biotechnolosy: 10, (1992) ページ795 〜798 ）。
本明細書に用いる場合、好ましい実施形態は残基１７８で始まるＣ末端中に見い
出されるＬｙｔａ分子の反復部分を利用する。特に好ましい形態は残基１８８〜
３０５を組み込む。
【００１２】 上述の免疫学的融合パートナーは発現を補助するのにも有利である。特に、こ
のような融合体はネイティブの組換えＭＡＧＥタンパク質より高収率で発現され
る。 臨床セッティングにおけるこのような構成物は、本発明者により黒色腫を治療
することができることが示されている。１つの場合、段階IVの黒色腫はアジュバ
ントを添加しないlipo P 1/3 MAGE 3 His タンパク質の２回の投与後に転移物を
取り除いた。
【００１３】 従って、その実施形態において、本発明は、免疫学的融合パートナーに連結し
たＭＡＧＥファミリーからの腫瘍関連抗原を含む融合タンパク質を供する。好ま
しくは、その免疫学的融合パートナーはプロテインＤ又はそのフラグメント、最
も好ましくはリポプロテインＤである。ＭＡＧＥタンパク質は好ましくはＭＡＧ
Ｅ Ａ１又はＭＡＧＥ Ａ３である。リポプロテインＤ部分は好ましくはリポプ
ロテインＤの最初の１／３を含む。
【００１４】 本発明のタンパク質は好ましくは大腸菌内で発現される、好ましい実施形態に
おいて、タンパク質は、アフィニティータグ、例えば５〜９、好ましくは６のヒ
スチジン残基を含むヒスチジンテールと共に発現される。これらは精製を補助す
るのに有利である。 本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸も供する。このような配列は
好適な発現ベクターに挿入してＤＮＡ／ＲＮＡワクチン接種のために用い又は好
適な宿主内で発現させることができる。本核酸を発現する微生物ベクターはワク
チンとして用いることができる。このようなベクターには、例えばポックスウイ
ルス、アデノウイルス、アルファウイルス、リステリア及びモメルファージ（mo
narphage）がある。
【００１５】 本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列は標準的なＤＮＡ合成技術を用い
て、例えばD.M.Robertら（Biochemistry 1985, 24, 5090-5098）により記載され
る酵素連結法により、化学合成により、試験管内酵素重合により、もしくは例え
ば熱安定性ポリメラーゼを利用するＰＣＲ技術により、又はこれらの技術の組合
せにより合成することができる。
【００１６】 ＤＮＡの酵素による重合は、必要に応じて１０°〜３７℃の温度で、一般に５
０μＬ又はそれ未満の容量で、ヌクレオチドトリホスフェートｄＡＴＰ，ｄＣＴ
Ｐ，ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含む好適な緩衝液中で、ＤＮＡポリメラーゼＩ（ク
レノウフラグメント）のようなＤＮＡポリメラーゼを用いて試験管内で行うこと
ができる。ＤＮＡフラグメントの酵素による連結は、４℃〜環境温度の温度で、
一般に５０ml又はそれ未満の容量で、好適な緩衝液、例えば０．０５Ｍ Ｔｒｉ
ｓ（pH７．４）、０．０１Ｍ ＭｇＣｌ2 、０．０１Ｍジチオトレイトール、１
mMスペルミジン、１mM ＡＴＰ及び０．１mg／mlウシ血清アルブミン中で、Ｔ４
ＤＮＡリガーゼのようなＤＮＡリガーゼを用いて行うことができる。ＤＮＡポ
リマー又はフラグメントの化学合成は、‘Chemical and Enzymatic Synthesis o
f Gene Fragments-A Laboratory Manual’(ed. H.G.Gassen and A.Lang), Verla
g Chemie, Weinheim (1982) に、又は他の科学文献、例えばM.J.Gait, H.W.D.Ma
tthes, M.Singh, B.S.Sproat、及びR.C.Titmas, Nucleic Acids Research, 1982
, 10, 6243; B.S.Sproat、及びW.Bannwarth, Tetrahedron Letters, 1983, 24,
5771; M.D.Matteucci 及びM.H.Caruthers, Tetrahedron Letters, 1980, 21, 71
9; M.D.Matteucci及びM.H.Caruthers, Journal of the American Chemical Soci
ety, 1981, 103, 3185; S.P.Adams ら、Journal of the American Chemical Soc
iety, 1983, 105, 661; N.D.Sinha, J.Biernat, J.McMannus、及びH.Koester, N
ucleic Acids Research, 1984, 12, 4539;並びにH.W.D.Matthes ら., EMBO Jour
nal, 1984, 3, 801 に記載される方法のような固相技術を用いて、慣用的なホス
ホトリエステル、ホスファイト又はホスホルアミジト化学により行うことができ
る。
【００１７】 本発明の方法は、Maniatisら、Molecular Cloning-A Laboratory Manual; Col
d Spring Harbor, 1982-1989に記載されるような慣用的な組換え技術により行う
ことができる。 特に、その方法は、 ｉ）本タンパク質又はその免疫原性誘導体をコードするヌクレオチド配列を含
むＤＮＡポリマーを宿主内で発現することができる複製可能又は組込み可能発現
ベクターを調製し； ii）該ベクターで宿主細胞を形質転換し； iii) 該形質転換された宿主細胞を、前記ＤＮＡポリマーの発現が前記タンパ
ク質を生産することができる条件下で培養し；そして iv）該タンパク質を回収すること を含み得る。
【００１８】 用語“形質転換”は、本明細書において、外来ＤＮＡを宿主細胞に導入するこ
とを意味する。これは、例えば、好適なプラスミド又はウイルスで、例えばGene
tic Engineering: Eds. S.M.Kingsman及びA.J.Kingsman: Blackwell Scientific
Publications; Oxford, England, 1988に記載されるような慣用的な技術を用い
て、形質転換、トランスフェクション又は感染により達成することができる。用
語“形質転換された”又は“形質転換体”は、以後、関心の外来遺伝子を含みか
つそれを発現する生じた宿主細胞に適用するであろう。
【００１９】 本発現ベクターは新規であり、本発明の一部を形成する。 複製可能な発現ベクターは宿主細胞に適合したベクターを開裂して完全なレプ
リコンを有する直鎖ＤＮＡセグメントを供し、そしてその直鎖セグメントを、そ
の直鎖セグメントと一緒に要求される産物をコードする１又は複数のＤＮＡ分子
、例えば本発明のタンパク質をコードするＤＮＡポリマー又はその誘導体と、連
結条件下で組み合わせることにより本発明に従って調製することができる。
【００２０】 これにより、ＤＮＡポリマーは、必要に応じて予め形成し、又はベクターの作
製の間に形成することができる。 ベクターの選択は、部分的に宿主細胞により決定されよう。それは原核生物で
も真核生物であってもよいが、好ましくは大腸菌又はＣＨＯ細胞である。適切な
ベクターには、プラスミド、バクテリオファージ、コスミド及び組換えウイルス
がある。
【００２１】 複製可能発現ベクターの調整は、例えば上述のManiatisらに記載される手順に
より、ＤＮＡの制限、重合及び連結のための適切な酵素で便利に行うことができ
る。 組換え宿主細胞は、本発明に従って、形質転換条件下で宿主細胞を本発明の複
製可能発現ベクターで形質転換することにより調製される。適切な形質転換条件
は慣用的であり、例えば上述のManiatisら又は“DNA Cloning" Vol.II, D.M.Glo
ver ed., IRL Press Ltd, 1985に記載される。
【００２２】 形質転換条件の選択は宿主細胞により決定される。これにより、大腸菌のよう
な細菌宿主細胞は、ＣａＣｌ2 の溶液で（Cohen ら、Proc.Nat.Acad.Sci., 1973
, 69, 2110）又はＲｂＣｌ，ＭｎＣｌ2 、酢酸カリウム、及びグリセロールの混
合物を含む溶液で、そして次に３−〔Ｎ−モルホリノ〕−プロパン−スルホン酸
、ＲｂＣｌ及びグリセロールで処理することができる。培養中の哺乳動物細胞は
、ベクターＤＮＡの細胞へのカルシウム同時沈降により形質転換することができ
る。本発明は、本発明の複製可能発現ベクターで形質転換された宿主細胞にも広
げられる。
【００２３】 形質転換された宿主細胞をそのＤＮＡポリマーの発現を許容する条件下で培養
することは、便利には、例えば上述のManiatisら及び“DNA Cloning"に記載され
るように行われる。これにより、好ましくは細胞には栄養素が補給され、５０℃
未満の温度で培養される。 その産物は、宿主細胞に従って及び（細胞内又は培養培地にもしくは細胞内ペ
リプラズムに分泌された）発現産物の局在化に従って、慣用的な方法により回収
される。これにより、宿主細胞が細菌、例えば大腸菌である場合、それは例えば
物理的に、化学的に又は酵素的に溶解し、生じたライゼートからタンパク質産物
を単離することができる。宿主細胞が哺乳動物細胞である場合、その産物は一般
に、栄養培地から又は無細胞抽出液から単離することができる。慣用的なタンパ
ク質単離技術には、選択的沈殿、吸着クロマトグラフィー、及びモノクローナル
抗体アフィニティーカラムを含むアフィニティークロマトグラフィーがある。
【００２４】 本発明のタンパク質は、脂質に可溶性の形態で又は凍結乾燥形態で供される。 一般に、各々のヒトの投与量は、１〜１０００μｇのタンパク質、好ましくは
３０〜３００μｇを含むであろうと予想される。 本発明は、医薬として許容される賦形剤中に本発明のタンパク質を含む医薬組
成物も供する。好ましいワクチン組成物は、少くともリポプロテインＤ−ＭＡＧ
Ｅ−３を含む。このようなワクチンは、任意に、１又は複数の他の腫瘍関連抗原
を含み得る。例えばＭＡＧＥ及びＧＡＧＥファミリーに属する他のメンバーがあ
る。好適な他の腫瘍関連抗原には、ＭＡＧＥ−１，ＧＡＧＥ−１又はチロシナー
ゼタンパク質がある。
【００２５】 ワクチン調製物は、一般に、Vaccine Design (“The subunit and adjuvant a
pproach" (eds. Powell M.F. & Newman M.J) (1995) Plenum Press New York ）
に記載される。リポソームでのカプセル化は、Fullerton の米国特許４，２３５
，８７７に記載される。 本発明のタンパク質は、好ましくは、本発明のワクチン調製物中にアジュバン
トが添加される。好適なアジュバントアルミニウム塩、例えば水酸化アルミニウ
ムゲル（アルム）又はリン酸アルミニウムを含むが、カルシウム、鉄又は亜鉛の
塩であってもよく、またアシル化チロシン又はアシル化糖、カチオンに又はアニ
オンに誘導化したポリサッカライド又はポリホスファゼンの不溶性懸濁液であっ
てもよい。他の周知のアジュバントには、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドがある
。そのオリゴヌクレオチドは、ＣｐＧジヌクレオチドがメチル化されていないこ
とを特徴とする。このようなオリゴヌクレオチドは公知であり、例えばＷＯ９６
／０２５５５に記載される。
【００２６】 本発明の製剤において、アジュバント組成物はＴＨ１型に優先的に免疫応答を
誘導することが好ましい。好適なアジュバントシステムには、例えばモノホスホ
リル脂質Ａ、好ましくは３−ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−
ＭＰＬ）の、アルミニウム塩との組合せがある。ＣｐＧオリゴヌクレオチドもＴ
Ｈ１応答を優先的に誘導する。
【００２７】 増強されたシステムはモノホスホリル脂質Ａ及びサポニン誘導体の組合せ、特
にＷＯ９４／００１５３に開示されるＱＳ２１及び３Ｄ−ＭＰＬの組合せ、又は
ＷＯ９６／３３７３９に開示されるＱＳ２１がコレステロールでクエンチされて
いるより少い反応原性の組成物に関する。 水中油エマルション中のＱＳ２１，３Ｄ−ＭＰＬ及びトコフェロールに関する
特に能力のあるアジュバントはＷＯ９５／１７２１０に記載され、好ましい製剤
である。
【００２８】 従って、本発明の一実施形態において、モノホスホリル脂質Ａ又はその誘導体
がアジュバントとして添加された。本発明のタンパク質、より好ましくはリポプ
ロテインＤ（又はその誘導体）を含むワクチンを供する。 好ましくは、そのワクチンは、サポニン、より好ましくはＱＳ２１を更に含む
。
【００２９】 好ましくは、製剤は、水中油エマルション及びトコフェロールを更に含む。本
発明は、医薬として許容される賦形剤、例えば３Ｄ−ＭＰＬを一緒に本発明のタ
ンパク質を混合することを含むワクチン製剤を製造するための方法も供する。 本発明の一態様において、組換え生産されたＭＡＧＥ−タンパク質を精製する
ための方法を供する。その方法は、そのタンパク質を、例えば強カオトロピック
剤（例えば尿素、塩酸グアニジウム）に、又は両性イオン界面活性剤、例えば（
Empigen BB−ｎ−ドデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチルグリシン）に可溶化し、そのタン
パク質の分子内及び分子間ジスルフィド結合を還元し、生じたチオールをブロッ
キングして酸化的再カップリングを防止し、そしてそのタンパク質を１又は複数
のクロマトグラフィーステップにかけることを含む。
【００３０】 好ましくは、ブロッキング剤はアルキル化剤である。このようなブロッキング
剤には、これらに限らないが、α−ハロゲン酸（haloacids ）又はα−ハロゲン
アミド（haloamides）がある。例えば、ヨード酢酸及びヨードアセトアミドはタ
ンパク質をカルボキシメチル化又はカルボキシアミド化（カルバミドメチル化）
させる。他のブロッキング剤を用いることができ、これらは文献に記載されてい
る（例えばThe Proteins Vol II Eds H neurath, RL Hill and C-L Boeder, Aca
demic press 1976, or Chemical Reagents for Protein modification Vol I ed
s. RL Lundblad and CM Noyes, CRC Press 1985 を参照のこと）。このような他
のブロッキング剤の典型例には、Ｎ−エチルマレイミド、クロロアセチルホスフ
ェート、Ｏ−メチルイソウレア及びアクリロニトリルがある。ブロッキング剤の
使用は、それが産物の凝集を防ぎ、後の精製のための安定性を確実にするので有
利である。
【００３１】 本発明の一実施形態において、ブロッキング剤は、安定に共有結合した不可逆
的な誘導体（例えばα−ハロ酸又はα−ハロアミド）を誘導するように選択され
る。しかしながら、ブロッキング剤は、精製の後に、そのブロッキング剤が除去
されて非誘導化タンパク質を遊離し得るように選択してもよい。 誘導化遊離チオール残基を有するＭＡＧＥタンパク質は新規であり本発明の一
態様を形成する。特に、カルボキシアミド化又はカルボキシメチル化誘導体は本
発明の好ましい実施形態である。
【００３２】 本発明の好ましい実施形態において、本発明のタンパク質には、アフィニティ
ータグ、例えばＣＬＹＴＡ又はポリヒスチジンテールが供される。このような場
合、ブロッキングステップ後のタンパク質は、好ましくはアフィニティークロマ
トグラフィーにかけられる。ポリヒスチジンテールを有するこれらのタンパク質
のために、固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を
行うことができる。金属イオンは、いずれかの適切なイオン、例えば亜鉛、ニッ
ケル、鉄、マグネシウム又は銅であり得るが、好ましくは亜鉛又はニッケルであ
る。好ましくは、ＩＭＡＣ緩衝液は、最終産物中に低レベルのエンドトキシンを
生ずるので、Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ（以後、Ｅｍｐｉｇｅｎ）のような両性イオ
ン界面活性剤を含む。
【００３３】 タンパク質がＣｌｙｔａ部分と共に生産されるなら、そのタンパク質は、コリ
ン又はコリンアナログ、例えばＤＥＡＥへのアフィニティーを利用することによ
り精製することができる。本発明の一実施形態において、タンパク質には、ポリ
ヒスチジンテール及びＣｌｙｔａ部分が供される。これらは簡単な２ステップの
アフィニティークロマトグラフィー精製スケジュールで精製することができる。
【００３４】 本発明は、以下の実施例を引用することにより更に記述されよう。 実施例Ｉ： 融合タンパク質リポプロテインＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ（ＬＰＤ １／３−
ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ又はＬｐＤ ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ）を発現する組換え大
腸菌株の調製 １．大腸菌発現系： リポプロテインＤの生産のため、プロテインＤをコードするＤＮＡを発現ベク
ターｐＭＧ８１にクローン化した。このプラスミドはラムダファージＤＮＡから
のシグナルを利用して挿入された外来遺伝子の転写及び翻訳を駆動する。そのベ
クターは、ラムダＰＬプロモーターＰＬ、オペレーターＯＬ及びＮプロテインを
供した時に転写極性効果を緩和するための２つの利用部位（Ｎｕ＋Ｌ及びＮｕ＋
Ｒ）を含む（Gross ら、1985, Mol. & Cell.Biol. 5; 1015 ）。ＰＬプロモータ
ーを含むベクターはプラスミドＤＮＡを安定化するため大腸菌溶原性宿主に導入
される。溶原性宿主株は、ゲノム内に挿入された複製欠損ラムダファージＤＮＡ
を含む（Shatzmanら、1983; In Experimental Manipulation of Gene Expressio
n. Inouya (ed) pp 1 〜14, Academic Press NY ）。ラムダファージＤＮＡはベ
クターのＯＬリプレッサーに結合し、ＲＮＡポリメラーゼのＰＬプロモーターへ
の結合を防ぎ、それにより挿入された遺伝子の転写を防ぐｃＩリプレッサータン
パク質の合成を指示する。発現株ＡＲ５８のｃＩ遺伝子は、ＰＬに指示された転
写が温度変化により制御され得るように、即ち培養温度の増加がリプレッサーを
不活性化して外来タンパク質の合成が始まるように、温度感受性変異を含む。こ
の発現系は、外来タンパク質、特に細胞に対して毒性であり得るものの合成を制
御する（Shimataka & Rosenberg, 1981, Nature 292: 128）。
【００３５】 ２．大腸菌株ＡＲ５８： ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質の生産のために用いたＡＲ５８溶原
性大腸菌株は標準的なＮＩＨ大腸菌Ｋ１２株Ｎ９９の誘導体（F-Su-galK2, lacZ
-thr- ）である。それは、欠損した溶原性ラムダファージを含む（galE::TN10,
1Kil-cI857 DH1）のＫｉｌ−表現型は宿主高分子合成の遮断を防ぐ。ｃＩ８５７
変異は、温度感受性障害をｃＩリプレッサーに与える。ＤＨ１欠失は、ラムダフ
ァージの右オペロン及び宿主のｂｉｏ，ｕｖｒ３、及びｃｈｌＡ座を除去する。
ＡＲ５８株は、ＳＡ５００誘導体（galE::TN10, 1Kil-cI857 DH1）で先に増殖さ
せたＰラムダファージストックでのＮ９９の導入により作り出した。Ｎ９９への
欠損溶原の導入は、隣接ｇａｌＥ遺伝子中にテトラサイクリン耐性をコードする
ＴＮ１０トランスポゾンの存在によりテトラサイクリンで選択した。Ｎ９９及び
ＳＡ５００は、National Institute of HealthのDr.Martin Rosenberg's labora
toryから得た大腸菌Ｋ１２株である。
【００３６】 ３．組換えタンパク質ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを発現するようデザイン
したベクターの作製 原理は、ＭＡＧＥ−３のＮ末端に連結した融合パートナーとして脂質化プロテ
インＤのＮ末端１／３及びＣ末端に位置したいくつかのヒスチジン残基の配列（
Ｈｉｓテール）を用いて融合タンパク質としてＭＡＧＥ３を発現させることであ
った。
【００３７】 プロテインＤはリポタンパク質である（グラム陰性細菌ヘモフィルス・インフ
ルエンゼの表面上に露出した４２kDa イムノグロブリンＤ結合タンパク質）。そ
のタンパク質は、細菌のリポタンパク質についての共通配列を含む、１８アミノ
酸残基シグナル配列を有する前駆体として合成される（ＷＯ９１／１８９２６）
。
【００３８】 リポタンパク質のシグナル配列が分泌の間に処理される場合、（前駆体分子中
の位置１９の）Ｃｙｓがアミノ末端残基になり、同時に、エステル結合及びアミ
ド結合脂肪酸の両方の共有結合により改変される。 次に、アミノ末端システイン残基に結合した脂肪酸は膜アンカーとして機能す
る。
【００３９】 融合タンパク質を発現するプラスミドは、１８アミノ酸シグナル配列及び処理
されたプロテインＤの最初の１０９残基、２つの無関係なアミノ酸（Ｍｅｔ及び
Ａｓｐ）、ＭＡＧＥ−３のアミノ酸残基２〜３１４、後に７つのＨｉｓ残基に露
出されるヒンジ領域をして機能する２つのＧｌｙ残基を含む前駆タンパク質を発
現するようデザインした。
【００４０】 これにより、組換え株は、４３２アミノ酸残基長の処理された脂質化Ｈｉｓテ
ールを有する融合タンパク質を作り出す（図１）。ここでそのアミノ酸配列は配
列番号：１に記載され、コーディング配列は配列番号：２に記載される。 ４．ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ融合タンパク質の形成のためのクローニン
グストラテジー（ベクターｐＲＩＴ１４４７７）： （Ludwig InstituteからのDr Thierry Boon から頂いた）ＭＡＧＥ−３遺伝子
（Gaugler B ら、1994）のためのコーディング配列を含むｃＤＮＡプラスミド、
及び（図２に概説するように調製した）Ｌｉｐｏ−Ｄ−１／３コーディング配列
のＮ末端部分を含むベクターＰＲＩＴ１４５８６を用いた。そのクローニングス
トラテジーは以下のステップを含む（図３）。
【００４１】 ａ）オリゴヌクレオチドセンス：５′gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt c
ag cac tgc aag cct及びオリゴヌクレオチドアンチセンス：５′gcg tct aga tt
a atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa を用いてプ
ラスミドｃＤＮＡ ＭＡＧＥ３内に供される配列のＰＣＲ増幅；この増幅は、Ｎ
末端に以下の改変を導く：最初の５つのコドンの、大腸菌コドン使用への変化、
位置１におけるＰｒｏコドンのＡｓｐコドンによる置換、５′末端でのＮｃｏＩ
部位の設置及び２つのＧｌｙコドン及び７つのＨｉｓコドン、その後のＸｂａＩ
部位の、Ｃ末端での最後の付加。
【００４２】 ｂ）先に増幅したフラグメントのインビトロゲンのＴＡクローニングベクター
へのクローニング及び中間体ベクターｐＲＩＴ１４６４７の調製。 ｃ）プラスミドｐＲＩＴ１４６４７からのＮｃｏＩ ＸｂａＩフラグメントの
切り出し、及びベクターｐＲＩＴ１４５８６へのクローニング。 ｄ）宿主株ＡＲ５８の形質転換。
【００４３】 ｅ）ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ融合タンパク質を発現するプラスミドｐＲ
ＩＴ１４４７７を含む大腸菌株形質転換体の選択及びキャラクタリゼーション 実施例II： ＬＰＤ１／３−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ抗原の調製： １．細菌株の増殖及び誘導−ＬＰＤ１／３−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓの発現： プラスミドｐＲＩＴ１４４７７で形質転換したＡＲ５８の細胞を、各々イース
トエキス（６．４ｇ／Ｌ）及びカナマイシンスルフェート（５０mg／Ｌ）を補給
したＬＹ１２培地４００mLを含む２リッターフラスコ内で増殖させた。振とうテ
ーブル上で、３０℃で８＋／−１時間、インキュベートした後、顕微鏡検査のた
め各々のフラスコから少量のサンプルを除去した。２つのフラスコの内容物をプ
ールして２０リッター発酵槽のための接種物を供した。
【００４４】 その接種物（約８００mL）を、５０mg／Ｌのカナマイシンスルフェートを補給
した７リッターの培地を含む予め滅菌した２０リッター（全量）発酵槽に加えた
。そのpHを、ＮＨ4 ＯＨ（２５％ｖ／ｖ）の周期的な添加により６．８に調節し
、維持して、その温度を３０℃に調節し、維持した。エレーション速度を分当り
１２リッターに調節し、維持して、溶解した酸素圧を撹拌速度のフィードバック
制御により５０％の飽和に維持した。発酵槽における過圧は５００ｇ／cm2 （０
．５bar ）に維持した。
【００４５】 炭素供給溶液の添加量を制御することによりフェド・バッチ（fed-batch ）培
養を行った。供給溶液は最初に０．０４mL／分の速度で加え、０．１ｈ-1の増殖
速度を維持するように最初の４２時間の間、指数関数的に増加させた。 ４２時間後に、発酵槽中の温度を３９℃に迅速に増加させ、供給速度を、ＬＰ
Ｄ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓの細胞内発現が最大レベルに達する期間である更なる
２２〜２３時間、誘導期の間、０．００５mL／ｇ DCW／分の一定値に維持した。
【００４６】 その培養液のアリコート（１５mL）を増殖／誘導期全体を通して規則的な間隔
で採取し、発酵の終りに微生物増殖の速度及び細胞内産物発現を追跡し、更に、
微生物の同定／純度テストのためのサンブルを供した。 発酵の終りに、その培養物の光学密度は（４８〜７２ｇの DCW／Ｌの細胞濃度
に相当する）８０〜１２０であり、全液体量は約１２リッターであった。その培
養物を迅速に６〜１０℃に冷却し、ＥＣＫ３２の細胞を、５０００×ｇで４℃で
３０分の遠心により培養液から分離した。ＥＣＫ３２の濃縮細胞を迅速にプラス
チックバッグに保存し、直ちに−８０℃に凍結した。
【００４７】 ２．タンパク質の抽出： ＥＣＫ３２の凍結した濃縮細胞を４℃に解凍した後、細胞破壊緩衝液に再度懸
濁して（約３６ｇの DCW／Ｌの細胞濃度に相当する）６０の最終的な光学密度に
した。 その細胞を高圧ホモジナイザー（１０００bar ）に２回、通すことにより破壊
した。その破壊した細胞懸濁液を遠心し（×１０，０００ｇ、４℃、３０分）、
そのペレット画分をＴｒｉｔｏｎ Ｘ１００（１％ｗ／ｖ）＋ＥＤＴＡ（１mM）
で２回、洗い、次にリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）＋Ｔｗｅｅｎ２０（０．１％
ｖ／ｖ）で洗い、そして最後にＰＢＳで洗った。各々の洗浄段階の間に、懸濁液
を×１０，０００ｇで３０分、４℃で遠心し、その上清を捨てて、ペレット画分
を保持した。
【００４８】 実施例III ： 融合タンパク質ＬｉｐｏＤ−ＭＡＧＥ３のキャラクタリゼーション： １．精製： ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを以下に記載のステップの順番を用いて細胞ホ
モジネートから精製した： ａ）細胞破壊物からの洗浄したペレット画分の可溶化。
【００４９】 ｂ）タンパク質内及びタンパク質間ジスルフィド結合の化学的還元、次の酸化
物再カップリングを防ぐためのチオール基のブロッキング。 ｃ）粒子の除去及びエンドトキシンの削減のための反応混合物の精密ろ過。 ｄ）ポリヒスチジンテールと亜鉛装填Chelating Sepharose との間のアフィニ
ティー相互作用の利用によるＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓの捕獲及び最初の精
製。
【００５０】 ｅ）アニオン交換クロマトグラフィーによる汚染タンパク質の除去。 その精製したＬＰＤ−ＭＡＧＥ３−Ｈｉｓはいくつかの仕上げ段階にかけた： ｆ）Ｓｕｐｅｒｄｅｘ７５を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによる緩衝
液交換／尿素除去。 ｇ）製造過程のろ過。
【００５１】 ｈ）Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによる
緩衝液交換／脱塩。 これらのステップの各々を以下により詳細に記載する。 １．１）細胞ホモジネートペレットの可溶化 （上述の）最終洗浄段階からのペレット画分を、塩酸グアニジン（６Ｍ）及び
リン酸ナトリウム（０．１Ｍ、pH７．０）の溶液８００mL中で４℃で一晩、再び
可溶化した。
【００５２】 １．２）還元及びカルボキシメチル化 可溶化した材料（うすい黄色、濁った懸濁液）にアルゴンを流して残った酸素
を一掃し、２−メルカプトエタノールの保存溶液（１４Ｍ）を加えて４．３Ｍの
最終濃度（溶液１mL当り０．４４mLの２−メルカプトエタノールに相当）を供し
た。
【００５３】 得られた溶液を２つのガラスフラスコに分けて移し、それら両方を水浴中で９
５℃に加熱した。９５℃で１５分後に、そのフラスコを水浴から除去し、冷却し
て、その内容物を氷の中においたホイルでおおったビーカー（５Ｌ）にプールし
、そして固体のヨードアセトアミドを激しく混合しながら加えて６Ｍの最終濃度
（溶液１mL当り１．１１ｇのヨードアセトアミドに相当）を供した。その混合物
を１時間、暗所で氷上に保持し、ヨードアセトアミドの完全な可溶化を確実にし
、その後、約１Ｌの水酸化ナトリウム（５Ｍ）を加えることにより中和して（激
しい混合を維持してpHのモニターを続けて）、７．５〜７．８の最終pHを供した
。
【００５４】 得られた混合物を更に３０分、暗所で氷上に維持し、その後、pHを再びpH７．
５〜７．８に調節した。 １．３）精密ろ過 その混合物を、Minikros中空繊維カートリッジ（ret. No M22M-600-01N；面積
５，６００cm2 、０．２μｍ）を備えたAmicon Proflux M12接線フロー（tangen
ital-flow ）ユニット内で精密ろ過した。その透過液を後のクロマトグラフィー
精製のために保持した。
【００５５】 １．４）金属（Ｚｎ2+）キレートクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ） 金属キレートクロマトグラフィーを、ＢＰＧ １００／５００カラム（Pharma
cia Biotechnology Cat No.18-1103-01 ）に充填したChelating Sepharose FF (
Pharmacia Biotechnology Cat. No.17-0575-01）で行った。充填したベッドの寸
法は、直径１０cm；断面積７９cm2 ；ベッドの高さ１９cm；充填容量１, ５００
mLであった。空のカラムを水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）で浄化して精製水で洗
った。
【００５６】 （２０％ｖ／ｖエタノール中から出した）支持体を（真空下で）ブフナー漏斗
上で精製水（８リッター）で洗い、少くとも１５リッターのＺｎＣｌ2 の溶液（
０．１Ｍ）を流すことにより亜鉛で荷電させた。その支持体を、流出液のpHがＺ
ｎＣｌ2 溶液のpH（pH５．０）に達するまで、１０Ｌの精製水で洗うことにより
除去した。次にその支持体を、塩酸グアニジン（６Ｍ）及びリン酸ナトリウム（
０．１Ｍ、pH７．０）を含む溶液４リッターで平衡化した。
【００５７】 ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを含む精密ろ過からの浸透液を支持体と混合し
（バッチ結合）、次にそのＢＰＧカラムに塩酸グアニジン（６Ｍ）及びリン酸ナ
トリウム（０．１Ｍ、pH７．０）を含む溶液をロードし、充填した。 金属キレートクロマトグラフィーの次の段階は、６０mL／分の溶出流速で行っ
た。カラムを洗い、最初に塩酸グアニジン（６Ｍ）及びリン酸ナトリウム（０．
１Ｍ、pH７．０）を含む溶液で、次に尿素（６Ｍ）及びリン酸ナトリウム（０．
１Ｍ、pH７．０）を含む溶液で、カラム溶出液がＯＤ280nm で０の吸光度に達す
る（ベースライン）まで洗った。
【００５８】 粉純粋なＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質画分を、尿素（６Ｍ）、リ
ン酸ナトリウム（０．１Ｍ、pH７．０）及びイミダゾール（０．５Ｍ）を含む溶
液２カラム容量で溶出した。この画分のコンダクタンスは約１６mS／cmであった
。 １．５）アニオン交換クロマトグラフィー アニオン交換クロマトグラフィーを続ける前に、半純粋なＬＰＤ−ＭＡＧＥ−
３−Ｈｉｓタンパク質画分のコンダクタンスを、尿素（６Ｍ）及びＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（２０mM、pH８．０）を含む溶液で希釈することにより約４mS／cmに減少さ
せた。
【００５９】 アニオン交換クロマトグラフィーを、ＢＰＧ ２００／５００カラム（Pharma
cia Biotechnology Cat.No.18-1103-11 ）に充填したQ-Sepharose FF (Pharmaci
a Biotechnology, Cat No.17-0510-01）を用いた行った。充填したベッドの寸法
は、直径１０cm；断面積３１４cm2 ；ベッドの高さ９cm；充填容量２，９００mL
であった。
【００６０】 そのカラムに（２０％ｖ／ｖエタノール）を充填し、９リッターの精製水で７
０mL／分の溶出流速で洗った。その充填したカラムを３Ｌの水酸化ナトリウム（
０．５Ｍ）で浄化し、３０Ｌの精製水で洗い、次に６Ｌの尿素（６Ｍ）及びＴｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（２０mM、pH８．０）を含む溶液で平衡化した。希釈した半精製し
たＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓをそのカラムに充填し、次に尿素（６Ｍ）、Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（２０mM、pH８．０）、ＥＤＴＡ（１mM）及びＴｗｅｅｎ（０．
１％）を含む９Ｌの溶液で、その溶出液の吸光度（２８０nm）が０になるまで洗
った。
【００６１】 更なる洗浄ステップを、尿素（６Ｍ）及びＴｒｉｓ−ＨＣｌ（２０mM、pH８．
０）を含む６リッターの溶液で行った。 精製したＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを、尿素（６Ｍ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ
（２０mM、pH８．０）及びＮａＣｌ（０．２５Ｍ）を含む溶液でカラムから溶出
した。
【００６２】 １．６）サイズ排除クロマトグラフィー 精製したＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓからの尿素の除去及び緩衝液交換は、
両方とも、サイズ排除クロマトグラフィーにより行った。これは、ＸＫ ５０／
１００カラム（Pharmacia Biotechnology Cat.No.18-8753-01 ）に充填したSupe
rdex 75 (Pharmacia Biotechnology Cat.No.17-1044-01）を用いて行った。充填
したベッドの寸法は、直径５cm；断面積１９．６cm2 ；ベッドの高さ９０cm；充
填容量１，８００mLであった。
【００６３】 そのカラムはエタノール（２０％）中に充填し、５リッターの精製水で２０mL
／分の溶出速度で洗浄した。そのカラムを２リッターの水酸化ナトリウム（０．
５Ｍ）で浄化し、５リッターの精製水で洗い、次にＴｗｅｅｎ８０（０．１％ｖ
／ｖ）を含む５リッターのリン酸緩衝塩類溶液で平衡化した。 その精製したＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ画分（脱塩ラン当り最大５００mL
）を２０mL／分の溶出流速でカラムに充填した。その脱塩した精製ＬＰＤ−ＭＡ
ＧＥ−３−Ｈｉｓを、Ｔｗｅｅｎ８０（０．１％ｖ／ｖ）を含む３リッターのＰ
ＢＳでカラムから溶出した。
【００６４】 ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを含む画分はカラムのボイド容量で溶出した。 １．７）製造過程のろ過 サイズ排除クロマトグラフィーからのバルクＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓを
、層流フード中０．２２μｍ膜（クラス１０．０００）を介してろ過した。その
ろ過したバルクは−８０℃に凍結し、脱塩ステップまで保存した。
【００６５】 １．８）脱塩クロマトグラフィー 最終的なバルクのオスモル濃度は４００mOsM未満であるべきであるので、塩濃
度を減少させるために更なる緩衝液交換が必要とされた。これは、ＢＰＧ １０
０／９５０カラム（Pharmacia Biotechnology Cat.No.18-1103-03 ）に充填した
Sephadex G25 (Pharmacia Biotechnology Cat.No.17-0033-02 ）を用いて脱塩ク
ロマトグラフィーにより行った。充填したベッドの寸法は直径１０cm；断面積７
８．６cm2 ；ベッドの高さ８５cm；充填容量６，５００mLであった。
【００６６】 Sephadex G25を７リッターの精製水で水和し、４℃で一晩、膨潤させた。次に
そのゲルを純水で１００mL／分の溶出流速でカラムにつめた。 そのカラムを６リッターの水酸化ナトリウム（０．５Ｍ）で浄化し、次にリン
酸ナトリウム（１０mM、pH６．８）、ＮａＣｌ（２０mM）及びＴｗｅｅｎ８０（
０．１％ｖ／ｖ）を含む１０リッターの溶液で平衡化した。
【００６７】 その精製したＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ画分（脱塩ラン当り最大１５００
mL）を１００mL／分の溶出流速でカラムに流した。カラムのボイド容量で溶出し
た脱塩精製したＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ画分を０．２２μｍ膜を介して滅
菌ろ過し、−８０℃で保存した。 最終的なバルクタンパク質を＋４℃に解凍した後、容器に分取してラクトース
賦形剤中に凍結乾燥した。
【００６８】 ２．クーマシー染色したＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルでの分析： ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ精製抗原を、１２．５％アクリルアミドゲル上
で還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。 タンパク質充填量はクーマシーブルー染色について５０μｇ及び硝酸銀染色に
ついて５μｇであった。臨床用ｌｏｔ ９６Ｋ１９及びパイロットｌｏｔ ９６
Ｊ２２を分析した。６０kDa の分子量に相当する１つの主要バンドを可視化した
。約４５kDa 及び３５kDa の２つのマイナーな更なるバンドも見られた。
【００６９】 ３．ウェスタンブロット分析： ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により表さ
れるペプチドを、マウスモノクローナル抗体を用いてウェスタン・ブロットによ
り同定した。これらの抗体は、ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質（このタンパク
質はＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−ＨｉｓのＬＰＤ部分を含まない）の精製した調製物
を用いて企業内で開発した。
【００７０】 ２つのモノクローナル抗体調製物（Ｍａｂ２２及びＭａｂ５４）は、ウェスタ
ンブロット分析のための適合性に基づいて選択し、ｌｏｔリリースのための同一
性テストに用いた。図４は、Ｍａｂ３２及び５４で染色した後のｌｏｔ ９６Ｋ
１９及び９６Ｊ２２について得られたバンドパターンを示す。６００ngのタンパ
ク質が１２．５％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離され、それをナイロン膜に移し、Ｍ
ａｂ３２及び５４（６０μｇ／ml）と反応させ、ペルオキシダーゼに連結させた
抗マウス抗体で表した。
【００７１】 ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出された６０kDa 及び３０kDa ペプチドは両方の
Ｍａｂにより表した。 実施例IV： １．ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質を用いるワクチン調製物： これらの実験に用いたワクチンは、アジュバントを加えた又は加えなかった、
株ＡＲ５８からの大腸菌で発現されたリポプロテインＤ１／３−ＭＡＧＥ−３−
Ｈｉｓをコードする組換えＤＮＡから作り出す。アジュバントとして、その製剤
は、油／水エマルション中、３ｄｅ−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ
−ＭＰＬ）及びＱＳ２１の混合物を含む。アジュバントシステムＳＢＡＳ２は、
先にＷＯ９５／１７２１０に記載されている。
【００７２】 ３Ｄ−ＭＰＬは、グラム陰性細菌サルモネラ・ミネソタ（Salmonella minneso ta ）のリポポリサッカライド（ＬＰＳ）由来の免疫刺激剤である。ＭＰＬは脱ア
シル化されており、脂質Ａ成分上のホスフェート基を欠く。この化学的処理は、
免疫刺激特性を保存しながら、毒性を劇的に減少させる（Ribi, 1986）。Ribi I
mmunochemistryはＭＰＬを製造し、それをSB-Biologicalsに供給する。Smith Kl
ine Beecham Biologicals で行った実験は、種々のビヒクルと組合わせた３Ｄ−
ＭＰＬは、体液性免疫及び細胞性免疫のＴＨ１型の両方を強力に増強することを
示した。
【００７３】 ＱＳ２１は、南アメリカの樹木Quillaja saponaria Molina の樹皮から抽出さ
れた天然のサポニン分子である。樹皮の粗抽出液から個々のサポニンを分離する
ために開発した精製技術は、親構成物と比べて強いアジュバント活性及び低い毒
性を示すトリテルペングリコシドである特定のサポニンＱＳ２１の単離を許容し
た。ＱＳ２１はＭＨＣクラスＩ制限ＣＴＬをいくつかのサブユニットＡｇｓに活
性化し、及びＡｇ特異的リンパ球増殖を刺激することが示されている（Kensil,
1992）。Ａｑｕｉｌａ（正式にはCambridge Biotech Corporation ）はＱＳ２１
を製造し、それをSB-Biologicalsに供給する。
【００７４】 Smith Kline Beecham Biologicals で行った実験は、体液性及びＴＨ１型細胞
性免疫応答の両方の誘導におけるＭＰＬ及びＱＳ２１の組合せの明らかな相乗効
果を証明した。 油／水エマルションは、２種の油（トコフェロール及びスクアレン）から構成
される有機相、及び乳化剤としてＴｗｅｅｎ８０を含むＰＢＳの水性相から構成
される。そのエマルションは、５％のスクアレン、５％のトコフェロール、０．
４％のＴｗｅｅｎ８０を含み、１８０nmの平均粒径を有し、ＳＢ６２として知ら
れる（ＷＯ９５／１７２１０を参照のこと）。
【００７５】 Smith Kline Beecham Biologicals で行った実験は、３Ｄ−ＭＰＬ／ＱＳ２１
（ＳＢＡＳ２）へのＯ／Ｗエマルションの添加が種々のサブユニット抗原に対す
る後者の免疫刺激特性を更に増加させる。 ２．エマルションＳＢ６２（２倍濃縮物）の調製： Ｔｗｅｅｎ８０をリン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）に溶かしてＰＢＳ中２％溶液
を供する。１００mLの２倍濃縮エマルションを供するために、５ｇのＤＬ−α−
トコフェロール及び５mLのスクアレンをボルテキシングして完全に混合する。９
０mLのＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ溶液を加え、完全に混合する。次に生じたエマルショ
ンをシリンジに通して、Ｍ１１０Ｓマイクロフルーディクスマシンを用いること
により最終的にミクロな液体にする。得られた油滴は約１８０nmの大きさを有す
る。
【００７６】 ３．リポプロテインＤ１／３−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ ＱＳ２１／３Ｄ ＭＰ
Ｌ水中油（ＳＢＡＳ２）製剤の調製 アジュバントを油／水エマルション中で、ＭＰＬ及びＱＳ２１の組合せとして
調剤する。この調製物を０．７mlの容器に入れて、凍結乾燥した抗原（容器は３
０〜３００μｇの抗原を含む）と混合する。
【００７７】 凍結乾燥したワクチンのためのアジュバント希釈物の組成は次の通りである：
【００７８】
【表１】
【００７９】 最終的なワクチンは、凍結乾燥されたＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ調製物を
アジュバントで又はＰＢＳのみで再構成した後に得られる。 抗原を含まないアジュバント対照は、タンパク質をＰＢＳで置換することによ
り調製した。 ４．ワクチン抗原：融合タンパク質リポプロテインＤ１／３−ＭＡＧＥ−３−
Ｈｉｓ： リポプロテインＤはグラム陰性細菌ヘモフィルス・インフルエンゼの表面上に
露出したリポタンパク質である。
【００８０】 融合パートナーとしての処理したプロテインＤの最初の１０９残基の包含は、
Ｔ細胞エピトープを有するワクチン抗原を供する。ＬＰＤ成分の他に、タンパク
質は、２つの無関係なアミノ酸（Ｍｅｔ及びＡｓｐ）、Ｍａｇｅ−３のアミノ酸
残基２〜３１４、次の７つのヒスチジン残基を露出するためのヒンジ領域として
機能する２つのＧｌｙ残基を含む。
【００８１】 実施例Ｖ： １：マウス及びサルにおけるＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓの免疫原性： ヒトＭＡＧＥ−３タンパク質の抗原性及び免疫原性をテストするため、候補ワ
クチンを、遺伝的バックグラウンド及びＭＨＣ対立遺伝子が異なる２つの異なる
マウス株（Ｃ５７ＢＬ／６及びＢａｌｂ／ｃ）に注入した。両方のマウス株につ
いて、潜在的なＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスIIペプチドモチーフは、ＬＰＤ
−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ融合タンパク質のＭＡＧＥ部分のためのものであると理
論的に予測された。
【００８２】 ａ）免疫化プロトコル： 各々の株の５匹のマウスに、ヒトに用いた濃度の１０分の１でＳＢＡＳ２中に
調剤した５μｇのＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ又はそれのないものを、足のひ
らに、２週間間隔で２回、注入した。 ｂ）増殖アッセイ： リンパ球を、最後の注入後２週間に、マウスからの脾臓又は膝窩リンパ節を破
壊することにより調製した。２×１０5 細胞を９６ウェルプレートに３回重複し
て入れ、細胞を試験管内で７２時間、それ自体で又はラテックスマイクロビーズ
上にコートした異なる濃度（１〜０．１μｇ／ml）のＨｉｓ−Ｍａｇｅ３で再刺
激した。
【００８３】 ＳＢＡＳ−２製剤のみ又はＰＢＳを与えたマウスのリンパ球増殖応答と比べて
、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質を注入したＣ５７ＢＬ／６又はＢａ
ｌｂ／ｃマウスのいずれかからの脾臓細胞（図５及び７を参照のこと）及びリン
パ節細胞（図６及び８を参照のこと）の両方で、ＭＡＧＥ−３特異的リンパ球増
殖活性の増加が観察された。
【００８４】 更に、アジュバントＳＢＡＳ２中のＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓで免疫化し
たマウスからのリンパ球で、かなり高い増殖応答が得られた（図６及び８を参照
のこと）。 ｃ）結論 ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓはマウスにおいて免疫原性であり、この免疫原
性は、ＳＢＡＳ２アジュバント製剤の使用により増加させることができる。
【００８５】 ２．抗体応答： ａ）免疫化プロトコル Ｂａｌｂ／ｃ又はＣ５７ＢＬ／６マウスを、ＰＢＳ、又はＳＢＡＳ２、又は５
μＧのＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ、又は５μＧのＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈ
ｉｓ＋ＳＢＡＳ２のいずれかで、２週間間隔で足のひら内注入により２回、免疫
化した。
【００８６】 対照グループ及びテストグループの各々に３及び５の動物を用いた。 ｂ）間接ＥＬＩＳＡ： ２回目の注入後２週に、個々の血清を採取し、間接ＥＬＩＳＡにかけた。 ２μＧ／mlの精製Ｈｉｓ ＭＡＧＥ−３をコートした抗原として用いた。ＰＢ
Ｓ＋１％新生ウシ血清中で、３７℃で１時間の飽和の後、その血清を飽和緩衝液
中で逐次的に希釈（１／１０００で開始）し、４℃で一晩、又は３７℃で９０分
、インキュベートした。ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ２０、０．１％で洗った後、ビオチ
ニル化ヤギ抗マウス全ＩｇＧ（１／１０００）又はヤギ抗マウスＩｇＧ１，Ｉｇ
Ｇ２ａ，ＩｇＧ２ｂ抗血清（１／５０００）を二次抗体として用いた。３７℃で
９０分のインキュベーションの後、ペルオキシダーゼに連結したストレプトアビ
ジンを加え、ＴＭＢ（テトラメチルベンジジンペルオキシド）を基質として用い
た。１０分後、その反応をＨ2 ＳＯ4 ０．５Ｍを加えることによりブロックし
、そのＯ．Ｄ．を測定した。
【００８７】 ｃ）結果： 図９は、マウスの異なるグループ（Ｎ＝５／グループ）間で、曲線の中点に達
するために必要とされる平均希釈にある、血清の相対的平均中点タイターを比較
する。 これらの結果は、テストした両方のマウス株においてＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−
Ｈｉｓのみの２回の注入の後に弱いＡｂ応答がマウントされるが、ＬＰＤ−ＭＡ
ＧＥ−３−ＨｉｓをＳＢＡＳ２の存在下で注入した時にはより高い抗ＭＡＧＥ−
３ Ａｂ濃度が形成されることを示す。これにより、２週間隔でのＬＰＤ−ＭＡ
ＧＥ−３−Ｈｉｓの２回の注入のみで観察される高いＡｂ応答を作り出すのに十
分である。
【００８８】 Ｃ５７ＢＬ／６マウスで得られる応答と比べてＢａｌｂ／ｃマウスで観察され
るより優れたＡｂ応答は、たとえＣ５７ＢＬ／６マウスで達成されるＡｂタイタ
ーが、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓのみの注入後よりＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−
Ｈｉｓ＋ＳＢＡＳ２の注入後でより高いとしても、ハプロタイプの差又はこれら
２つの株の間のバックグラウンドの差によって説明することができる。
【００８９】 マウスの異なるグループにおけるワクチン接種後のＩｇサブクラス特異的抗Ｍ
ＡＧＥ−３応答は、図１０及び１１で見ることができ、これらは、血清の平均中
点希釈の比較を供する。 アジュバントＳＢＡＳ２中のＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓをワクチン接種し
たマウスからでさえ、血清サンプルのいずれにおいてもＩｇＡもＩｇＭも検出さ
れなかった。
【００９０】 対照的に、全ＩｇＧレベルは、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓのみをワクチン
接種したマウスからの血清中で少し高く、ＳＢＡＳ２中のＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３
−Ｈｉｓを注入した動物の血清においてかなり増加した。 異なるＩｇＧサブクラス濃度の分析は、テストした全てのＩｇＧサブクラス（
ＩｇＧ１，ＩｇＧ２ａ，ＩｇＧ２ｂ）のレベルが、Ａｇ又はアジュバントのみを
注入したマウスにおいてのものよりアジュバントを加えたＡｇをワクチン接種し
たマウスにおいて高かったので、混合されたＡｂ応答がマウスにおいて誘導され
たことを示す。
【００９１】 しかしながら、ＳＢＡＳ２の存在下でのＬｉｐｏＤ−ＭＡＧＥ−３でのワクチ
ン接種後のこの混合されたＡｂ応答の性質は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２ｂがＢａｌ
ｂ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウス各々の血清中に主に見い出されるので、マウス
株に依存するようである。 ３．アカゲザルにおけるリポプロテインＤ１／３ ＭＡＧＥ３−Ｈｉｓ＋ＳＢ
ＡＳ２アジュバントの免疫原性 ５匹のアカゲザル（Macaca Mulatta）の３つのグループを選択した。ＲＴＳ，
Ｓ及びｇｐ１２０を陽性対照として用いた。
【００９２】 グループ： グループ１ 右足：ＲＴＳ，Ｓ／ＳＢＡＳ２ 左足：ＧＰ１２０／ＳＢＡＳ２ グループ２ 右足：ＲＴＳ，Ｓ／ＳＢ２６Ｔ 左足：ＧＰ１２０／ＳＢ２６Ｔ グループ３ 右足：ＬｉｐｏＤ１／３ Ｍａｇｅ３ Ｈｉｓ／ＳＢＡＳ２ ０日目に動物にワクチンを与え、２８日目にブーストし、８４日目にＭＡＧＥ
３及びプロテインＤ成分の両方に対する抗体応答を決定するために採血した。ワ
クチンを、右足の後部にボーラス注入（０．５ml）で筋内に投与した。
【００９３】 少量の血液サンプルを１４日毎に採取した。３mlの非ヘパリン添加血液サンプ
ルを大腿静脈から収集し、少くとも１時間、凝固させ、室温で１０分、２５００
rpm で遠心した。 血清を除去して−２０℃で凍結し、特異的ＥＬＩＳＡによる抗体レベルの測定
のために用いた。
【００９４】 ９６ウェルマイクロプレート（maxisorb Nunc ）を、４℃で５μｇのＨｉｓ
Ｍａｇｅ ３又はプロテインＤでコートした。ＰＢＳ ＮＣＳ １％での３７℃
での１時間の飽和の後、ウサギ血清の連続希釈物を３７℃で１時間３０分、（１
／１０で始めて）加え、ＰＢＳ Ｔｗｅｅｎで３回、洗った後、抗ビオチニル化
血清（Amersham ref RPN 1004. lot 88 ）を加えた（１／５０００）。プレート
を洗い、ペルオキシダーゼ連結ストレプトアビジン（１／５０００）を３７℃で
３０分、加えた。洗浄後、５０μｌのＴＭＢ（BioRad）を７分、加え、その反応
をＨ2 ＳＯ4 で停止させ、ＯＤを４５０nmで測定した。中点希釈をSoftmaxProに
より計算した。
【００９５】 抗体応答： ＥＬＩＳＡによりＭＡＧＥ３に対する抗体応答の速度を追跡するために、１４
日毎に少量の血液サンプルを採取した。結果は、ＬＰＤ１／３ Ｍａｇｅ３ Ｈ
ｉｓ＋ＳＢＡＳ２の１回の注入後に、Ｍａｇｅ３特異的全Ｉｇタイターが低くな
ることを示し、同じサルでのＬｉｐｏＤ１／３ Ｍａｇｅ３＋アジュバントの２
回目及び３回目の注入後に、５の動物のうち３つで見られた。少い応答のものは
、３回の注入後でさえ陰性であり続けた。II後２８日又はIII 後に、抗体タイタ
ーは基底レベルに戻った。抗体のサブクラスはＩｇＭでなく主要なＩｇＧとして
決定した。ＩｇＧへのスイッチは、Ｔヘルパー応答が誘発されていることを示唆
する。プロテインＤ特異的抗体応答は、弱いか、Ｍａｇｅ３抗体応答と正確に平
行している。
【００９６】 実施例VI： １．ＬＰＤ−ＭＡＧＥ１ Ｈｉｓ 同様に、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−１−Ｈｉｓを調製した。そのアミノ酸及びＤＮＡ
配列を配列番号：３及び４に示す。得られたタンパク質は、ＬＰＤ−ＭＡＧＥ−
３−Ｈｉｓタンパク質と同様に精製した。要約すると、細胞培養物をホモジナイ
ズし、０．５％ Ｅｍｐｉｇｅｎ界面活性剤の存在下で４ＭグアニジンＨＣｌ及
び０．５Ｍ β−メルカプトエタノールで処理した。その産物をろ過し、浸透物
を０．６Ｍヨードアセトアミドで処理した。そのカルボキシアミド化画分をＩＭ
ＡＣ（亜鉛キレート−セファロースＦＦ）クロマトグラフィーにかけた。そのカ
ラムを平衡化し、４Ｍグアニジン、ＨＣｌ及びリン酸ナトリウム（２０mM、pH７
．５）及び０．５％ Ｅｍｐｉｇｅｎを含む溶液で洗い、次にそのカラムをリン
酸ナトリウム（２０mM、pH７．５）０．５％ Ｅｍｐｉｇｅｎ緩衝液中４Ｍ尿素
を含む溶液で洗った。タンパク質を同じ緩衝液であるが、イミダゾールの濃度を
増加させて（２０mM，４００mM及び５００mM）溶出した。
【００９７】 溶出液を４Ｍ尿素で希釈した。Ｑ−セファロースカラムを平衡化し、０．５％
Ｅｍｐｉｇｅｎの存在下で２０mMリン酸緩衝液（pH７．５）中４Ｍ尿素で洗っ
た。界面活性剤を含まない同じ緩衝液で２回目の洗浄を行った。同じ緩衝液であ
るがイミダゾールの濃度を増加させて（１５０mM，４００mM，１Ｍ）タンパク質
を溶出した。その溶出液を限外ろ過した。
【００９８】 実施例VII ： 発現プラスミドｐＲＩＴ１４４２６の作製及びＮＳ１−ＭＡＧＥ−３ Ｈｉｓ
を生産するための宿主株ＡＲ５８の形質転換： タンパク質デザイン： 大腸菌内で発現させるべき融合タンパク質ＮＳ１，ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓのデ
ザインを図１２に示す。
【００９９】 生じたタンパク質の一次構造は配列番号：５に記載の配列を有する。 上述のタンパク質デザインに対応するコーディング配列（配列番号：６）を大
腸菌発現プラスミド中のλｐＬプロモーターの制御下においた。 ＮＳ1 −ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ融合タンパク質の形成のためのクローニングス
トラテジー 出発材料は、ＭＡＧＥ−３遺伝子のためのコーディング配列を含む、Ludwig I
nstituteからのDr.Tierry Boonから受け取ったｃＤＮＡプラスミド、及びインフ
ルエンザからのＮＳ1 （非構造タンパク質）コーディング領域の８１ａａを含む
ベクターＰＭＧ８１であった。
【０１００】 図１３に概説するクローニングストラテジーは以下のステップを含む： ａ）オリゴヌクレオチドセンス：５′gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt c
ag cac tgc aag cct、及びオリゴヌクレオチドアンチセンス：５′gcg tct aga
tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa を用いて
、プラスミドｃＤＮＡ ＭＡＧＥ−３内に供される配列のＰＣＲ増幅。
【０１０１】 この増幅はＮ末端において以下の改変を導く：最初の５つのコドンの大腸菌コ
ドン使用への変化、位置１におけるＰｒｏコドンのＡｓｐコドンでの置換、５′
末端でのＮｃｏＩ部位の導入及び２つのＧｌｙコドン及び７つのＨｉｓコドン、
次のＸｂａＩ部位のＣ末端での最後の付加。 ｂ）先に増幅したフラグメントのインビトロゲンのＴＡクローニングベクター
へのクローニング及び中間体ベクターｐＲＩＴ１４６４７の調製。
【０１０２】 ｃ）プラスミドｐＲＩＴ１４６４７からのＮｃｏＩ−ＸｂａＩフラグメントの
切り出し及びベクターｐＲＩＴ ＰＭＧ８１へのクローニング。 ｄ）宿主株ＡＲ５８の形質転換。 ｅ）ＮＳ１−ＭＡＧＥ３−Ｈｉｓ融合タンパク質を発現するプラスミドｐＲＩ
Ｔ１４４２６（図１４を参照）を含む大腸菌株形質転換体の選択及びキャラクタ
リゼーション。
【０１０３】 組換えＮＳ1 −ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ（ｐＲＩＴ１４４２６）のキャラクタリ
ゼーション 細菌を、５０μｇ／mlのカナマイシンを補給したＬＢ培地で、３０℃で増殖さ
せた。その培養がＯＤ＝０．３（６２０nm）に達した時に、温度を４２℃に上げ
ることにより熱誘導を行った。
【０１０４】 ４時間の誘導後、細胞を収集し、ＰＢＳに再度懸濁し、フレンチプレスに３回
、通すことにより（分解により）溶解した。遠心（１００，０００ｇで６０分）
の後、ペレット上清及び全抽出液をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク
質をクーマシーＢ１染色したゲルにおいて可視化し、ここでその融合タンパク質
は全大腸菌タンパク質の約１％を表した。組換えタンパク質は、４４．９Ｋの見
掛けＭＷで単一バンドとして現れた。その融合タンパク質は、抗ＮＳ１モノクロ
ーナル抗体を用いてウェスタンブロット分析により同定した。
【０１０５】 実施例VIII： ウサギ／マウス免疫化のためのＮＳ１−ＭＡＧＥ３−Ｈｉｓ（大腸菌）の精製
。 精製スキーム： 抗原を精製するために以下の精製スキームを用いた： 細胞の溶解＋遠心 ↓ 抗原可溶化＋遠心 ↓ Ｎｉ2 ＋ＮＴＡアガロース ↓ 濃縮 ↓ Prep cell ↓ ＴＣＡ沈殿及びＰＢＳ可溶化 ａ．溶解 細菌細胞（２３ｇ）をＲａｎｎｉｅ（ホモジナイザー）により２０３mLの５０
mM ＰＯ4 pH７緩衝液に溶かし、そのライゼートを３０分、１５，０００rpm
でＪＡ２０ローターで遠心した。
【０１０６】 その上清を捨てた。 ｂ．抗原可溶化 ペレットの１／３を３４mlの１００mM ＰＯ4 −６Ｍ ＧｕＨＣｌ pH７中４
℃でＯ／Ｎに再び可溶化した。ＪＡ２０ローターで１５，０００rpm で３０分の
遠心の後、ペレットを捨てて、上清をＩＭＡＣにより更に精製した。
【０１０７】 ｃ．アフィニティークロマトグラフィー：Ｎｉ2 ＋ＮＴＡアガロース（Qiagen
） カラム容量：１５mL（１６mm×７．５cm） パッキング緩衝液：０．１Ｍ ＰＯ4 −６Ｍ ＧｕＨＣｌ pH７ サンプル緩衝液：同上 洗浄緩衝液：０．１Ｍ ＰＯ4 −６Ｍ ＧｕＨＣｌ pH７ ０．１Ｍ ＰＯ4 −６Ｍ尿素 pH７ 溶出：６Ｍ尿素を補給した０．１Ｍ ＰＯ4 緩衝液 pH７中のイミダゾール勾
配（０→２５０mM）。
【０１０８】 流速：２mL／分 ａ．濃縮： ＩＭＡＣ溶出物の抗原陽性画分（１６０mL）をプールし、Ｆｉｌｔｒｏｎ膜（
Ｏｍｅｇａ型カットオフ１０，０００）でＡｍｉｃｏｎ撹拌セル内で５mLに濃縮
した。この段階の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価して約７０％である。
【０１０９】 ｂ．調製用電気泳動（Prep Cell Biorad） ２．４mLの濃縮サンプルを０．８mLの還元サンプル緩衝液中で煮沸し、１０％
アクリルアミドゲルに充填した。その抗原を、４％ ＳＤＳを補給したＴｒｉｓ
−Ｇｌｙｃｉｎｅ緩衝液 pH８．３中に溶出し、Ｎｓ1 −ＭＡＧＥ３ Ｈｉｓ陽
性画分をプールした。
【０１１０】 ａ．ＴＣＡ沈殿： 抗原をＴＣＡで沈殿させ、ＪＡ２０ローターで１５，０００rpm で２０℃、遠
心した後、上清を捨てた。そのペレットをＰＢＳ緩衝液 pH７．４に再び溶かし
た。 そのタンパク質は、凍結／解凍後にＰＢＳに可溶性であり、３７℃で３時間、
保存した後にいずれの分解も示さず、そしてＳＤＳ（１２．５％ ＰＡＧＥ）に
より測定して約５０，０００ダルトンの見掛け分子量を有する。
【０１１１】 実施例IX： 融合タンパク質ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ−１−Ｈｉｓテールを発現する大腸菌株
の調製 １．発現プラスミドｐＲＩＴ１４６１３の作製及び宿主株ＡＲ５８の形質転換
： タンパク質デザイン： 大腸菌内で発現させる融合タンパク質Ｃｌｙｔａ−Ｍａｇｅ−１−Ｈｉｓのデ
ザインを図１５に示す。
【０１１２】 生じたタンパク質の一次構造は配列番号：７に示す配列を有する。 上述のタンパク質デザインに相当するコーディング配列（配列番号：８を参照
のこと）を大腸菌発現プラスミド中のλｐＬプロモーターの制御下においた。 クローニング： 出発材料は、ストレプトコッカス・ニューモニエからのＬｙｔＡコーディング
領域の１１７Ｃ末端コドンを含むベクターＰＣＵＺ１、及び我々が、Ludwig Ins
tituteからDr.Thierry Boon から頂いたプラスミドからの先にサブクローニング
したＭＡＧＥ−１遺伝子ｃＤＮＡを有するベクターｐＲＩＴ１４５１８であった
。
【０１１３】 ＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−１−Ｈｉｓタンパク質の発現のためのクローニングス
トラテジー（図１６の概説を参照のこと）は以下のステップを含む： ２．ＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−１−Ｈｉｓコーディング配列モジュールの調製： ａ）最初のステップは、ＣＬＹＴＡ配列をＮｄｅＩ−ＡｆｌIII 制限部位に隣
接させることを予定したＰＣＲ増幅であった。そのＰＣＲ増幅は、プラスミドＰ
ＣＵＺ１テンプレート及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドセンス：５′tt
a aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca ga
c 、及びオリゴヌクレオチドアンチセンス：５′GCC AGA CAT GTC CAA TTC TGG
CCT GTC TGC CAG を用いて行った。これは、３７８ヌクレオチド長のＣＬＹＴＡ
配列の増幅を導く。
【０１１４】 ｂ）第２のステップは、ＣＬＹＴＡ配列をＭＡＧＥ−１−Ｈｉｓ配列に連結し
て融合タンパク質のためのコーディング配列を作ることであった。このステップ
はＮｄｅＩ−ＡｆｌIII 制限フラグメントの切り出し及びＮｄｅＩ及びＮｃｏＩ
により先に開裂したベクターｐＲＩＴ１４５１８（ＮｃｏＩ及びＡｆｌIII に適
合）への挿入を含み、プラスミドｐＲＩＴ１４６１３を作り出す。
【０１１５】 ｃ）宿主細胞ＡＲ５８の形質転換 ｄ）プラスミドｐＲＩＴ１４６１３を含む大腸菌形質転換体（ＫＡＮ耐性）の
選択及びキャラクタリゼーション（図１６を参照）。 １．組換えタンパク質ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ−１−Ｈｉｓ（ｐＲＩＴ１４６１
３）のキャラクタリゼーション： 細菌を、３０℃で５０μｇ／mlカナマイシンを補給したＬＢ培地で増殖させた
。その培養物がＯＤ＝０．３（６２０nm）に達した時に、温度を３８℃に上げる
ことにより熱誘導を行った。
【０１１６】 ４時間の誘導の後、細胞を収集し、ＰＢＳ中に懸濁し、そしてワンショット（
one shot）により（分解により）溶解した。遠心の後、ペレット上清及び全抽出
物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質をクーマシーＢ１染色したゲ
ルで可視化し、ここでその融合タンパク質は全大腸菌タンパク質の約１％を示し
た。組換えタンパク質は約４９kDの見掛けＭＷの単一バンドとして現れた。融合
タンパク質を、抗Ｍａｇｅ−１ポリクローナル抗体を用いたウェスタン・ブロッ
トにより同定した。
【０１１７】 （ナリジクス酸誘導のために役立つ）長λｐＬプロモーター及びＣＬＹＴＡ−
Ｍａｇｅ−１コーディング配列ｐＲＩＴ１４６１４により構成される発現ユニッ
トの再構成： 長いＰＬプロモーター及びＣＬＹＴＡ配列の一部を含むＥｃｏＲＩ−ＮＣＯ1 制限フラグメントをプラスミドｐＲＩＴ ＤＶＡ６から調製し、プラスミドｐＲ
ＩＴ１４６１３のＥｃｏＲＩ−ＮＣＯ1 部位の間に挿入した。
【０１１８】 組換えプラスミドｐＲＩＴ１４６１４を得た。 融合タンパク質ＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−１−Ｈｉｓをコードする組換えプラス
ミドｐＲＩＴ１４６１４（図１７を参照）を用いて大腸菌ＡＲ１２０を形質転換
した。Ｋａｎ耐性候補株を選択し、キャラクタライズした。 組換えタンパク質のキャラクタリゼーション： 細菌を５０mg／mlのカナマイシンを補給したＬＢ培地で３０℃で増殖させた。
その培養物がＯＤ＝４００（６２０nm）に達した時に、ナリジクス酸を６０mg／
mlの最終濃度まで加えた。
【０１１９】 ４時間の誘導の後、細胞を収集し、ＰＢＳに再び懸濁して、分解（disintegra
tion）（分解ＣＬＳ“ワン・ショット”型）により溶解した。遠心後、ペレット
上清及び全抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質をクーマシー
ブルー染色したゲルで可視化した。ここで、その融合タンパク質は全大腸菌タン
パク質の約１％を示した。その融合タンパク質をウサギ抗Ｍａｇｅ−１ポリクロ
ーナル抗体を用いてウェスタンブロット分析により同定した。組換えタンパク質
は約４９kDの見掛けＭＷの単一バンドとして現れた。
【０１２０】 実施例Ｘ： ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ−３−ＨＩＳ Ａ：腫瘍拒絶組換え抗原：Ｃ−ｌｙｔＡ融合パートナーが可溶性タンパク質の
発現を導く融合タンパク質ＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−３−Ｈｉｓはアフィニティー
タグとして機能し、有用なＴ−ヘルパーを供する。
【０１２１】 融合タンパク質ＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−３−Ｈｉｓテールを発現する大腸菌の
調製 発現プラスミドｐＲＩＴ１４６４６の作製及び宿主株ＡＲ１２０の形質転換： タンパク質デザイン： 大腸菌内で発現させる融合タンパク質Ｃｌｙｔａ−Ｍａｇｅ−３−Ｈｉｓのデ
ザインを図１８に示す。
【０１２２】 得られたタンパク質の一次構造は配列番号：９に記載の配列及び配列番号：１
０に記載のコーディング配列を有する。 上述のタンパク質デザインに相当するコーディング配列を大腸菌発現プラスミ
ド内のλｐＬプロモーターの制御下においた。 クローニング： 出発材料は、Gene 43 (1986) p 265-272に記載されるストレプトコッカス・ニ
ューモニエからのＬｙｔＡコーディング領域の１１７Ｃ末端コドンを含むベクタ
ーＰＣＵＺ１、及び我々が、Ludwig InstituteからDr.Tierry Boonから頂いたプ
ラスミドからのＭＡＧＥ−３遺伝子ｃＤＮＡを先にサブクローニングしたベクタ
ーｐＲＩＴ１４４２６であった。
【０１２３】 ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質の発現のためのクローニングス
トラテジー（図１９の概説を参照のこと）は以下のステップを含む。 １．ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓコーディング配列モジュールの調製： １．１．最初のステップはＡｆｌII及びＡｆｌIII 制限部位にＣＬＹＴＡを隣
接させることを予定したＰＣＲ増幅であった。ＰＣＲ増幅は、テンプレートとし
てプラスミドＺ１及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドセンス：５′tta aa
c cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac 、
及びオリゴヌクレオチドアンチセンス：５′ccc aca tgt cca gac tgc tgg cca
att ctg gcc tgt ctg cca gtg を用いて行った。これは、４２７ヌクレオチド長
ＣＬＹＴＡ配列の増幅を導く。先に増幅したフラグメントをInvitrogenのＴＡク
ローニングベクターにクローン化して、中間体ベクターｐＲＩＴ１４６６１を得
た。
【０１２４】 １．２．第２のステップは、ＣＬＹＴＡ配列をＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓ配列に連
結して融合タンパク質のためのコーディング配列を作り出すことであった。この
ステップは、ＡｆｌII−ＡｆｌIII フラグメントの切り出し及びＡｆｌII及びＮ
ｃｏＩ（ＮｃｏＩ及びＡｆｌII適合）制限酵素により先に開裂したベクターｐＲ
ＩＴ１４４２６に挿入することを含み、プラスミドｐＲＩＴ１４６６２を作り出
した。
【０１２５】 ２．（ナリジクス酸誘導のために役立つ）長いλｐＬプロモーター及びＣＬＹ
ＴＡ−Ｍａｇｅ−３コーディング配列により構成される発現ユニットの再構成 短いｐＬプロモーター及びＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−３−Ｈｉｓコーディング配
列を含むＢｇｌII−ＸｂａＩ制限フラグメントをプラスミドｐＲＩＴ１４６６２
から調製し、プラスミドＴＣＭ６７（国際出願ＰＣＴ／ＥＰ９２／０１８２７に
記載される、アンピシリンに対する耐性、及び長いλｐＬプロモーターを含むｒ
ＢＲ３２２誘導体）のＢｇｌII−ＸｂａＩ部位の間に挿入した。プラスミドｐＲ
ＩＴ１４６０７を得た。
【０１２６】 融合タンパク質Ｃｌｙｔａ−Ｍａｇｅ−３ Ｈｉｓをコードする組換えプラス
ミドｐＲＩＴ１４６０７を用いて大腸菌ＡＲ１２０（Mottら、1985, Proc.Natl.
Acad.Sci, 82: 88）を形質転換した。アンピシリン耐性候補株を選択し、キャラ
クタライズした。 ３．プラスミドｐＲＩＴ１４６４６の調製： 最後に、ｐＲＩＴ１４６０7 に類似するがカナマイシン選択を有するプラスミ
ドを作製した（ｐＲＩＴ１４６４６）。
【０１２７】 組換えタンパク質のキャラクタリゼーション： 細菌を５０mg／mlのカナマイシンを補給したＬＢ培地で３０℃で増殖させた。
その培養物がＯＤ＝４００（６００nm）に達した時に、ナリジクス酸を６０ｇ／
mlの最終濃度まで加えた。 ４時間の誘導の後、細胞を収集し、ＰＢＳに懸濁し、分解（分解ＣＬＳ“ワン
・ショット”型）により溶解した。遠心の後、ペレット上清及び全抽出物をＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質をクーマシーブルーで染色したゲルで
可視化し、ここでその融合タンパク質は全大腸菌タンパク質の約１％を示した。
その融合タンパク質は、ウサギ抗Ｍａｇｅ−３ポリクローナル抗体を用いてウェ
スタンブロット分析により同定した。組換えタンパク質は約５８kDの見掛けＭＷ
の単一バンドとして表れた。
【０１２８】 実施例XI： 組換えタンパク質ＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−３ Ｈｉｓの精製： 組換え細菌ＡＲ１２０（ｐＲＩＴ１４６４６）を３０℃で、フェド・バッチ条
件下で２０リッター発酵槽中で増殖させた。組換えタンパク質の発現は、ナリジ
クス酸を６０ｇ／mlの最終濃度まで加えることにより誘導した。発酵の終りに細
胞を収集し、フレンチプレス破砕機（２０，０００psi ）に２回、通すことによ
り６０ ＯＤ／６００に溶解した。溶解した細胞を４℃で１５，０００ｇで２０
分、ペレット化した。組換えタンパク質を含む上清を、０．３Ｍ ＮａＣｌ、２
０mM Ｔｒｉｓ ＨＣｌ pH７．６（緩衝液Ａ）で予め平衡化した交換DEAE Sep
harose CL6B 樹脂（Pharmacia ）に充填した。緩衝液Ａでのカラム洗浄の後、融
合タンパク質を緩衝液Ａ中２％コリンにより溶出した。抗Ｍａｇｅ−３抗体を用
いてウェスタン・ブロット分析により表した陽性抗原画分をプールした。ＤＥＡ
Ｅで溶出した抗原を０．５％ Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ（両性イオン界面活性剤）
に及び０．５Ｍ ＮａＣｌにし、次に０．５％ Ｅｍｐｉｇｅｎ ＢＢ、０．５
Ｍ ＮａＣｌ、５０mMリン酸緩衝液 pH７．６（緩衝液Ｂ）で予め平衡化したIo
n Metal Affinityクロマトグラフィーカラムに充填した。
【０１２９】 ＩＭＡＣカラムを２８０nmの吸光度がベースラインに達するまで緩衝液Ｂで洗
った。界面活性剤を除去するためのＥｍｐｉｇｅｎ ＢＢを含まない緩衝液Ｂ（
緩衝液Ｃ）での第２の洗浄を行い、次に抗原を緩衝液Ｃ中のイミダゾール勾配０
〜２５０mMにより溶出した。 ０．０９０〜０．２５０Ｍイミダゾール画分をプールし、１０kDa Ｆｉｌｔ
ｒｏｎオメガ膜で濃縮し、次にＰＢＳ緩衝液に対して透析した。
【０１３０】 結論： 我々は、融合タンパク質ＬＰＤ−ＭＡＧＥ３−Ｈｉｓがマウスにおいて免疫原
性であること、及びこの免疫原性（増殖性応答及び抗体応答）は、上述のアジュ
バントの使用により更に増加させることができることを証明した。精製は、ジス
ルフィド結合を形成するチオールを誘導化することにより増強することができる
。
【０１３１】 我々は、アジュバントの存在下でのＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓでのワクチ
ン接種によりより優れた抗体応答が誘発されることも証明した。Ｃ５７ＢＬ／６
の血清中に見い出される主要なアイソタイプがＩｇＧ２ｂであることは、ＴＨ１
型免疫応答が生じたことを示唆する。 ヒトにおいてアジュバントを加えない製剤中のＬＰＤ−ＭＡＧＥ３−Ｈｉｓで
患者を臨床的に処置すると、黒色腫を除去した。
【０１３２】
【表２】
【０１３３】
【表３】
【配列表】
【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書
【提出日】平成１２年３月２３日（２０００．３．２３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１７】 ワクチンを製造するための方法であって、請求項１６に記
載の方法によりＭＡＧＥタンパク質又はその誘導体を精製し、そして得られたタ
ンパク質をワクチンとして調剤することを含む方法。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年１２月１３日（２０００．１２．１３）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】請求項１１
【補正方法】変更
【補正内容】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【００１４】 本発明のタンパク質は好ましくは大腸菌内で発現される、好ましい実施形態に
おいて、タンパク質は、アフィニティータグ、例えば５〜９、好ましくは６のヒ
スチジン残基を含むヒスチジンテールと共に発現される。これらは精製を補助す
るのに有利である。 本発明は、本発明のタンパク質をコードする核酸も供する。このような配列は
好適な発現ベクターに挿入してＤＮＡ／ＲＮＡワクチン接種のために用い又は好
適な宿主内で発現させることができる。本核酸を発現する微生物ベクターはワク
チンとして用いることができる。このようなベクターには、例えばポックスウイ
ルス、アデノウイルス、アルファウイルス、リステリア及びモナルファージ（mo
narphage）がある。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２１】 複製可能発現ベクターの調製は、例えば上述のManiatisらに記載される手順に
より、ＤＮＡの制限、重合及び連結のための適切な酵素で便利に行うことができ
る。 組換え宿主細胞は、本発明に従って、形質転換条件下で宿主細胞を本発明の複
製可能発現ベクターで形質転換することにより調製される。適切な形質転換条件
は慣用的であり、例えば上述のManiatisら又は“DNA Cloning″ Vol.II, D.M.Gl
over ed., IRL Press Ltd, 1985に記載される。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２８】 従って、本発明の一実施形態において、モノホスホリル脂質Ａ又はその誘導体
がアジュバントとして添加された、本発明のタンパク質、より好ましくはリポプ
ロテインＤ（又はその誘導体）−ＭＡＧＥ−３を含むワクチンを供する。 好ましくは、そのワクチンは、サポニン、より好ましくはＱＳ２１を更に含む
。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正内容】
【００５８】 半純粋なＬＰＤ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質画分を、尿素（６Ｍ）、リ
ン酸ナトリウム（０．１Ｍ、pH７．０）及びイミダゾール（０．５Ｍ）を含む溶
液２カラム容量で溶出した。この画分のコンダクタンスは約１６mS／cmであった
。 １．５）アニオン交換クロマトグラフィー アニオン交換クロマトグラフィーを続ける前に、半純粋なＬＰＤ−ＭＡＧＥ−
３−Ｈｉｓタンパク質画分のコンダクタンスを、尿素（６Ｍ）及びＴｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（２０mM、pH８．０）を含む溶液で希釈することにより約４mS／cmに減少さ
せた。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１２３】 ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質の発現のためのクローニングス
トラテジー（図１９の概説を参照のこと）は以下のステップを含む。 １．ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓコーディング配列モジュールの調製： １．１．最初のステップはＡｆｌII及びＡｆｌIII 制限部位にＣＬＹＴＡを隣
接させることを予定したＰＣＲ増幅であった。ＰＣＲ増幅は、テンプレートとし
てプラスミドＰＣＵＺ１及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドセンス：５′
tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca
gac 、及びオリゴヌクレオチドアンチセンス：５′ccc aca tgt cca gac tgc tg
g cca att ctg gcc tgt ctg cca gtg を用いて行った。これは、４２７ヌクレオ
チド長ＣＬＹＴＡ配列の増幅を導く。先に増幅したフラグメントをInvitrogenの
ＴＡクローニングベクターにクローン化して、中間体ベクターｐＲＩＴ１４６６
１を得た。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３３
【補正方法】変更
【補正内容】
【０１３３】
【表１】
【表２】
【表３】
【表４】
【表５】
【表６】
【表７】
【表８】
【表９】
【表１０】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 1/16 Ｃ０７Ｋ 1/16 14/11 14/11 14/315 14/315 14/47 14/47 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 15/00 ＺＮＡＡ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ， ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，Ｌ Ｔ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ， ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 コーエン，ジョセフ ベルギー国，ベ−1330 リクサンサール， リュドゥ ランスティトュ 89，スミスク ライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (72)発明者 スラウイ，モンセフ モアム ベルギー国，ベ−1330 リクサンサール， リュドゥ ランスティトュ 89，スミスク ライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム (72)発明者 ビナル バッソル，カルロタ ベルギー国，ベ−1330 リクサンサール， リュドゥ ランスティトュ 89，スミスク ライン ビーチャム バイオロジカルズ ソシエテ アノニム Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA31 BA32 BA36 CA04 DA05 EA04 GA11 HA01 4B065 AA49Y AA93Y AA95Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA45 4C084 AA02 AA03 AA13 NA14 ZB262 4C085 AA03 BB01 FF13 FF19 4H045 AA10 AA11 AA30 BA10 CA01 CA11 CA40 DA86 EA28 FA72 FA74

Claims (20)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＭＡＧＥファミリーからの腫瘍関連抗原誘導体。
  2. 【請求項２】 前記誘導体が免疫学的融合パートナー又は発現エンハンサー
    パートナーに連結したＭＡＧＥタンパク質であることを特徴とする請求項１に記
    載の抗原。
  3. 【請求項３】 前記誘導体がアフィニティータグを含むことを特徴とする請
    求項１又は２に記載の抗原。
  4. 【請求項４】 誘導化遊離チオールを含む請求項１〜３のいずれかに記載の
    抗原。
  5. 【請求項５】 カルボキシアミド誘導体又はカルボキシメチル化誘導体であ
    る請求項４に記載の抗原。
  6. 【請求項６】 前記融合パートナーがヘモフィルス・インフルエンゼ（Heam
    ophilus influenzae）ＢからのプロテインＤもしくはそのフラグメント、インフ
    ルエンザからのＮＳ１タンパク質もしくはそのフラグメント、又はストレプトコ
    ッカス・ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）からのＬｙｔａもしくはそ
    のフラグメントであることを特徴とする請求項２，３，４又は５に記載のタンパ
    ク質。
  7. 【請求項７】 前記融合パートナーがヘモフィルス・インフルエンゼＢから
    のプロテインＤ又はそのフラグメントの脂質化型であることを特徴とする請求項
    ２，３，４又は５に記載のタンパク質。
  8. 【請求項８】 前記ＭＡＧＥタンパク質が、ＭＡＧＥ Ａ１，ＭＡＧＥ Ａ
    ２，ＭＡＧＥ Ａ３，ＭＡＧＥ Ａ４，ＭＡＧＥ Ａ５，ＭＡＧＥ Ａ６，ＭＡ
    ＧＥ Ａ７，ＭＡＧＥ Ａ８，ＭＡＧＥ Ａ９，ＭＡＧＥ Ａ１０，ＭＡＧＥ
    Ａ１１，ＭＡＧＥ Ａ１２，ＭＡＧＥ Ｂ１，ＭＡＧＥ Ｂ２，ＭＡＧＥ Ｂ３
    及びＭＡＧＥ Ｂ４，ＭＡＧＥ Ｃ１，ＭＡＧＥ Ｃ２、からなる群から選択さ
    れることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載のタンパク質。
  9. 【請求項９】 請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質をコードする核
    酸配列。
  10. 【請求項１０】 請求項９に記載の核酸を含むベクター。
  11. 【請求項１１】 請求項１０に記載のベクターで形質転換された宿主。
  12. 【請求項１２】 請求項１〜８のいずれかに記載のタンパク質又は請求項９
    に記載の核酸を含むワクチン。
  13. 【請求項１３】 アジュバント、及び／又は免疫刺激性サイトカイン又はケ
    モカインを更に含む請求項１２に記載のワクチン。
  14. 【請求項１４】 前記タンパク質が水中油又は油中水エマルションビヒクル
    中に供されることを特徴とする請求項１２又は１３に記載の方法。
  15. 【請求項１５】 前記アジュバントが、３Ｄ−ＭＰＬ，ＱＳ２１又はＣｐＧ
    オリゴヌクレオチドを含む請求項１３又は１４に記載のワクチン。
  16. 【請求項１６】 １又は複数の抗原を更に含む請求項１２〜１５のいずれか
    に記載のワクチン。
  17. 【請求項１７】 医学に用いるための請求項１２〜１６のいずれかに記載の
    ワクチン。
  18. 【請求項１８】 黒色腫又は他のＭＡＧＥ関連腫瘍を患う患者を免疫療法的
    に治療するためのワクチンの製造のための請求項１〜８のいずれかに記載のタン
    パク質又は請求項９に記載の核酸の使用。
  19. 【請求項１９】 ＭＡＧＥタンパク質又はその誘導体を精製するための方法
    であって、ジスルフィド結合を還元し、得られた遊離チオール基をブロッキング
    基でブロッキングし、そして得られた誘導体を１又は複数のクロマトグラフィー
    精製ステップにかけることを含む方法。
  20. 【請求項２０】 ワクチンを製造するための方法であって、請求項１９に記
    載の方法によりＭＡＧＥタンパク質又はその誘導体を精製し、そして得られたタ
    ンパク質をワクチンとして調剤することを含む方法。
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