CN100540052C - 变态反应疫苗组合物及其制备方法及在变态反应治疗中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及免疫学领域，免疫-变态反应和尤其是用于调节对变应原免疫应答的佐剂或载体的用途。本发明的目的是为了制备一种使用细菌蛋白脂质体的具有治疗或预防作用的药物制剂，其应用于变应性个体时能将Th2和IgE依赖性变应性应答转换为保护性Th1应答；而且它还能阻止仍然为非变应性个体中变应性的出现和发展。该疫苗组合物含有与变应原偶联的来自革兰氏阴性菌的蛋白脂质体和任选的含有其他佐剂或抗原。本发明还涉及制备创造性疫苗组合物方法以及用所述疫苗组合物的两剂量的免疫接种方案。

Description

变态反应疫苗组合物及其制备方法及在变态反应治疗中的用途
技术领域
本发明涉及免疫学领域，特别是免疫-变态反应的分支和尤其是能调节对变应原免疫应答的佐剂或载体化合物的用途。本发明的目的是在特异性应答中诱发变化从而减少或阻止它的致病效应。
背景技术
变态反应是一种非常常见的病理学，主要发生在工业化国家中。变态反应中介入了若干免疫病理学机制，特别是所谓的I型过敏性超敏感性。I型超敏感性的病理生理学是基于一种亲细胞抗体IgE产生的增加。在最初接触即致敏后，针对外来物质即变应原产生IgE抗体。
IgE抗体能与血液嗜碱细胞和组织肥大细胞表面上的IgE受体结合，其平均寿命从血液中的几个小时延长到组织中的几个月。变应原与细胞结合的IgE抗体的随后接触能引起邻近抗体的交联，其能触发向细胞质的信号级联，从而导致细胞脱粒和炎症介质如组胺、血清素(serotonine)和激肽(kinines)的释放。
最常见的变应性疾病有鼻炎、哮喘和特应性皮炎。变应性哮喘是一种慢性炎症疾病。哮喘的免疫发病机制不仅涉及IgE依赖机制(I型过敏应答的原因)，还涉及T细胞，尤其是所谓的Th2细胞亚型。Th2淋巴细胞通过其它细胞的募集和活化，尤其通过造成嗜曙红细胞募集和活化的IL-5产生诱发和维持炎症应答。嗜曙红细胞在支气管高反应性的发生中起着重要的作用，它是哮喘的一个基本特征。
常见的变应原有花粉，房尘螨(house dustmites)、霉菌、药品、食物、动物毛发和皮屑。室内的变应原特别是房尘螨是呼吸变态反应和哮喘最相关的起因。
变应性疾病的临床表现通常用抗组胺药、β-激动剂、sodiumchromogllcate和皮质激素进行治疗。这些治疗剂一般是不适当的，因为它们是纯粹针对症状的并不影响疾病的发病机理(ethiopathogeny)。现在，广泛的认识到需要更加有效的治疗方法，特别是特异性免疫疗法或治疗性疫苗。
传统上，用变应原提取物进行脱敏处理(也称为特异免疫疗法)被广泛用于变应性疾病的治疗中。在这种类型的治疗中，病人定期皮下注射给予特异性令人厌恶的变应原。一开始注射小剂量的变应原，如果没有出现变应性反应，则加大剂量。开始时每周注射给药一次，随后剂量逐渐增加直至达到每月一次或每半个月一次的维持剂量。这个治疗需维持数年(WHO Position Paper.Allergen Immunotherapy：Therapeutic Vaccines against Allergic Diseases.Geneva，January 1998)。
虽然该方法被认为对于一些变应性疾病是相对有效的，但免疫疗法的安全性还是受到了置疑。在治疗中，病人可能遭受严重过敏反应的痛苦，最后甚至是致命的。另外，3年中大约为100-200次的高数量的注射给药，对它的实际应用构成了严重的缺陷。不良的病人顺应性和过早的治疗放弃经常导致达不到预期效果。
近几年来，对变应性学科中IgE免疫应答诱发机制的认识已经取得了很大的进步。B细胞的IgE产生通过Th2免疫细胞应答的特异性机制激发，特别是，它通过经由Th2细胞的IL-4的过量产生诱发。Th2细胞不仅病理学上涉及它们的调节作用(通过T细胞提供的接触信号介导，IL-4诱发类别转换为B淋巴细胞中的IgE)，还涉及直接参与迟发型变应性炎症应答和哮喘慢性炎症的效应期。
与周围环境变应原的接触，另外还有自己的遗传体质，都导致了变应性敏化现象的发生，并引起变应性反应的触发。
使病人在变应原免疫疗法中取得临床改善的免疫机制仍然不能完全被解释。尽管如此，已知一些免疫学变化的发生，IL-4和IL-5分泌的减少和IFN-γ和IgG水平的增加与变应原特异性IgE的长期减少相关联。这些变化表示了Th2应答模式的减少，也就可能诱发不致病的并发Th1模式(WHO Position Paper.Allergen Immunotherapy：Therapeutic Vaccinesagainst Allergic Diseases.Geneva，January 1998)。
Th1/Th2应答模式首先通过经由Th细胞分泌的细胞因子的典型模式来进行区别，即Th1分泌IFN-γ和IL-2和Th2分泌IL-4和IL-5(Mossman，T.R.，Cherwinski，H.，Bond，M.W.，Giedlin，M.To，和R.L.Coffman.1986.Two types of murine T helper cell clones.I.Definition according to profiles of lymphokine activities andsecreted proteins.J.Immunol.136：2348-2357)。另一方面，可以确定决定血清Ig类/亚类特征的诱发应答的类型。从而，鼠Th1模式诱发优选IgG2亚类的抗体(IFN-γ依赖型)，而Th2诱发IgE和IgG1亚类(IL-4依赖型)。在人体中，Th1与IgG1/IgG3抗体相关联和Th2与IgE相关联。
虽然变态反应的发病和发展是由环境因素引起的，但个体形成Th2/IgE应答的倾向中的主要作用是遗传性指令(Holgate ST.Environmental Genetic and interaction in allergy and Asthma.JAllergy Clin Immunol 1999；104：1139-1146)。因此，变应性父母的后代比非变应性父母的孩子有更大的机率患变应性疾病。如果父母亲，母亲或父亲患有变应性疾病的话，该机率分别估计为75、50和25％。那就意味着如果对于父母应用诊断系统，能够很大程度的预测人群中个体的行为。另外，众所周知的是，病理学Th2模式的建立出现在生命的最初6-24月内。环境因素如暴露于细菌感染确实可以引起发病，诱发Th1模式，其下调了变应性Th2模式(Holt PG，Programming ofAllergen Specific Th-memory during Childhood.Proceedings XVIIInternational Congress of Allergology and Clinical ImmunologySydney 2000.Allergen Clin Immunol International Suppl.1，2000pp 83-85)。这些发现暗示设计在幼童早期能防止对变应原形成Th2应答的预防性抗变应性疫苗的可能性。这些疫苗可基于被理论上认为在哺乳期间有效的Th1佐剂。
一些方法被尝试用于改善变应原免疫疗法，目的为了减少它们的不良作用，保留并扩大它们的优点。特别是，已知已经使用一些方法去修饰变应原，使得它的变应原性(即它被IgE抗体识别的能力)和免疫接种后诱发IgE抗体的能力可能被降低，以及增加了它们的免疫原性(即其诱发治疗性或可能的保护性应答的能力)。其中有通过变应原吸附产生贮存效果(佐剂)的物理方法，也有对变应原进行修饰的化学方法，其将变应原与其它化合物或在它们自己中间通过共价连接。
所使用的一些物理试剂有：酪氨酸(专利No.GB 1,377,074)，酪氨酸酯(专利US 4,428,932)；脂质体(专利申请WO 89/10753)；单磷酰脂质A(Monophosforil Lipid A)(MLA)(专利US 5,762,943)；皂角苷(Saponine)(专利US 4,432,969)和传统上的一些如氢氧化铝或磷酸钙。
用于变应原聚合的化学试剂有甲醛(Marsch DG等，Studies onallergoids from naturally occurring allergens.III Preparationof Ragweed pollen allergoids by aldehyde modification.J.AllergyClin.Immunol.1981；68：449-59)；藻酸盐(Corrado OJ等，Allergy1989；44：108-5)和戊二醛(专利GB 1,282,163)。另外还有MPEG(Dreborg等，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1990；6：315-65)和多糖缀合物(欧洲专利申请EP 3497008A2).
这些解决办法在一些情况下(例如Glutaraldehyde polymerizedallergens，Alum adjuvanted，Grammer等，Modified forms of allergenimmunotherapy，J Allergy Clin Immunol 1985；44：108-15)可能增加动物模型中变应原特异性IgG滴度。尽管如此，这些抗体种类的增加并不必然意味着病人的临床改善，特别是当IgE抗体平行增加时。事实上，在不同的变应性反应中也涉及一些IgG亚类(小鼠中的IgG1和人体中的IgG4)，由于其与肥大细胞表面短暂结合的能力。在另一方面，人类的临床数据显示IgG抗体的增加与临床改善并无直接的关系，表明这些抗体在由治疗诱发的调节机制中起着次要的作用(Rak S.Lowhagen O.，Venge P.Bronchial The effect of immunotherapy onhyperresponsiveness and eosinophil cationic protein inpollen-allergic patients.J Allergy Clin Immunol 1988；82：470-80和Jutel M，Müller Or，Fricker M，Rihs S，Pichler W，DahindenC.Influence of bee venom immunotherapy on degranulation andleukotriene generation in human blood basophiles.Clin ExpImmunol 1996；12：1112-18)。
尽管与传统变位原提取物比较经化学修饰的变应原(称为类变应原(allergoid))在治疗过程中具有一些有关次要副作用有所减少的优点，但它们不会产生显著的临床改善(Bousquet等，J.AllergyClin.Immunol.1989；84：546-56和Grammer等，J Allergy  Clin.Immunology 1985；76：397-401)。到目前为止临床试验中所用的类变应原(经戊二醛或甲醛修饰的)的另一个缺陷是实际不可能获得一种标准化的组合物，因为由变应原提取物通过化学反应获得的最终产品是多肽和其它生物分子的不均匀混合物。在这些反应中，不可避免的形成具有不同聚合程度或化学修饰的分子种类，其中就有不需要的并且难以除去的副产物。
氢氧化铝仅仅是用于减少达到与没加佐剂的变应原相同的效应必须注射的次数，这归功于它的贮藏(depot)和缓慢释放的效果。尽管如此，已知该佐剂刺激IgE产生，这在动物体和人体内差不多，诱发典型的Th2模式，从而在其给药期间可能会加强致病的变应性应答。
磷酸钙和酪氨酸也被用作吸附剂以形成贮藏效果，并缓慢释放变应原。然而，在治疗的有效性和安全性上这些制剂与用水或明矾辅佐的提取物相比没有显示出显著的优点(Altintas DU等，Comparison betweenthe use of adsorbed and aqueous immunotherapy material inDermatophagoides pteronyssinus sensitive asthmatic patients.Allergologie et Immunopathologie 1999；27(6)：309-317)。
目前存在的、先前提及的解决办法还没有在动物或人体中达到完全有效的免疫调节(表现为抑制或减少Th2模式或诱发Th1)，而且减少注射次数病人中没有显示出临床有效性。
含变应原的脂质体的使用在专利申请WO 89/10753中已有记载。其中认为由于脂质体具有脂质的和微粒的性质，因此它们除了能形成贮藏并且减少产物的变应原性，而且还能影响对免疫系统的抗原呈递机制(WHO Position Paper.Allergen Immunotherapy：TherapeuticVaccines against Allergic Diseases.Geneva，January 1998)。然而，这些方法仍具有不能广泛用于临床实践的缺陷。其中包括制剂缺乏稳定性和以一致的方式将变应原包含入脂质体的技术的可利用性。脂质体制剂在贮藏或对病人给药期间缺乏稳定性将对治疗的安全性产生严重的影响，因为变应原从脂质体中可能不可控的释放会引起严重的过敏反应，类似于水性形式的变应原。而且，还没有获得诱发有效免疫应答，如影响Th1/Th2平衡或诱发非致病的或产生保护的模式的确定证据。
近来更多的方法设法使用带有Th1应答佐剂诱导物的变应原制剂，如单磷酰脂质A(MLA)(专利US 5,762,943)和专利WO9823735中记载的热休克蛋白(HSP)，也称为分枝杆菌弹性蛋白。MLA，一种LPS的去毒变体，在实验小鼠模型中能减少特异性I gE和增加IgG水平。尽管如此，也未能证明它能有效减少变应性应答的Th2细胞成分。因此，它的用途被严格的限制于以I型超敏反应机制为主的变应性疾病，不包括哮喘。另一个主要缺陷是，虽然LPS的毒性已被减弱但并没完全除去(Baldrick P等，Vaccine 20，2002737-743)，这将限制其在小孩中的用途。至于HSP，还没有任何实验证据表明在动物模型或人体中，临床有关的变应原与这些蛋白混合或缀合能产生变应原特异性Th2应答的变化。
来自革兰氏阴性菌外膜的蛋白脂质体用于对抗感染性疾病的预防性疫苗中的用途在如下文献中已有记载，Ruegg CL和cols.(Preparation of proteosome-based vaccines.J ImmunologicalMethods 1990；135：101-9)；Lowell和cols.(Proteosome-Lipopept ide vaccines：Enhancement of for ImmunityMalaria CS Peptides.Science 1988；240：800-2)；和专利US5,597,572。在后者中，主要记载了来自脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseriameningitidis)血清组B的外膜蛋白脂质体或小囊泡(OMV)。并且认为它经证实的在人体中的免疫原性和保护原性与它的微粒结构、加入OMV中的脂低聚糖(LPS)痕量、多糖C、脂质组分和吸附入明矾中相关。
由于OMV的特殊结构和组成，尽管含有LPS，这些疫苗制剂在人体或动物体内都不会引起毒性效应。在另一方面，仍能保持LPS的免疫调节剂和佐剂效应。
基于这种蛋白脂质体的抗脑膜炎球菌的疫苗已经被成功的使用超过5000万剂量，并证明用于预防脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B和C是安全、非反应原性和有效的。而且它还能被安全地用于哺乳期。它还显示出能将非T细胞依赖型多糖C抗原转换为T细胞依赖型。该疫苗在人体和动物体中优先诱发Th1模式，特征在于：诱发淋巴组织增生；抗OMV IgG抗体(人体中IgG1亚类和小鼠中IgG2a亚类)；IFN、IL-2和IL-12，蛋白和mRNA水平上。它并不诱发抗OMV IgE，也不增加蛋白或mRNA水平上的总I gE和IL-4、IL-5水平(Infect Immun.2001，69(72001)：4502-4508)。就像平常的适应性免疫一样，通过该疫苗诱发的应答，对产品中所含的细菌性抗原是特异性的，从而对于常见的一般变应原没有诱发免疫应答的证据。
发明内容
本发明的目的就是要得到一种用于治疗或预防目的的基于使用细菌蛋白脂质体的药物组合物。该组合物，一旦被用于变应性病人就能将变应原诱导的变应性Th2应答转换为细胞Th1应答。本发明还涉及使用该疫苗组合物的免疫接种方案。本发明的另一个目的是提供一种能防止具有遗传性过敏症家族史的孩子出现和发生变应性疾病的药物组合物。
该组合物可含有一种或多种变应原，它们可以偶联到蛋白脂质体上或与其同时给药，诱发变应原特异的治疗或保护性免疫应答。该应答的特征在于：与传统的免疫疗法相比IgE抗体产生减少，不诱发IL-5，以及IgG1抗体亚类(在人体中)和IgG2a抗体亚类(在小鼠中)，和IFN-γ(在两者中)的诱发。这些特征表明了Th1型免疫应答的诱发和从变应原性Th2应答到细胞Th1的转换。
本发明的另一个目标是提供将变应原偶联到蛋白脂质体或其它佐剂上的方法，以及提供了一种适于非胃肠道途径给药的药物组合物。
本发明的新颖性首先在于来自革兰氏阴性菌和特别是来自脑膜炎奈瑟氏球菌B外膜蛋白的蛋白脂质体的应用。这些蛋白脂质体(单独或与多糖一起)以非共价或共价方式与一种或多种变应原蛋白偶联，随后向变应性受试者给药。
本发明的特别的新颖性是，该药物组合物通过仅用两次注射诱发对包含其中的变应原特异性免疫应答的调节，将其变为非致病和保护性Th1模式。
另一个创新方面是该药物组合物在变应性父母的后代或早期诊断为遗传性过敏症个体中的预防性应用。
另外的创新点是用于将制剂的主要成分特别是蛋白脂质体与变应原非共价偶联的方法，以及用于该目的经纯化的变应原的用途。
在本发明中，使用蛋白脂质体或OMV，纯化自革兰氏阴性菌培养物、特别是如专利US5,597,572中所记载的脑膜炎奈瑟氏球菌B培养物。
本发明中，虽然也能使用多糖变应原，但优选使用蛋白或糖蛋白性质的变应原。这些变应原获自天然变应原性来源材料，使用已知的提取和纯化方法或通过在微生物或高等生物细胞中表达和克隆以重组形式获得。或者，可以使用根据天然变应原的氨基酸序列化学合成的多肽。特别是，优选呼吸变应原：首先得自属于室尘螨科(Pyroglyphidae)或甜食螨属(Glyciphagidae)族的房尘螨，特别是属于表皮螨属(Dermatophagoldes)或Blomia属和尤其是属于丝泊尘螨(Dermatophagoides siboney)，房尘螨(Dermatophagoidespteronyssinus)或粉尘螨(Dermatophagoides farinae)种。这些螨类的纯化的变应原优选来自任何可用的商业变应原提取物，该提取物首先进行冷冻干燥或通过超滤浓缩至蛋白含量为10-100mg/mL，随后在50-100％硫酸铵溶液中进行盐析沉淀。将沉淀物再混悬于水溶液中并通过使用具有如下基质之：Sephacryl S-100，Sephacryl S-200，Sephacryl S-300或Superdex 75的凝胶过滤色谱法进行分离。收集相应于10-60kDa分子量的峰。该级分主要含有组1(25kDa糖蛋白：Ders 1，Der p 1，Der f 1)和组2(15kDa蛋白：Der s 2，Der p 2，Der f 2)主要变应原。或者，对各个主要变应原进行分离纯化步骤，优选使用抗组1和抗组2单抗亲和色谱法，随后，将所有成分加入制剂中与蛋白脂质体偶联，或者分别与其偶联。
两种基本成分(变应原和蛋白脂质体)的偶联通过共价或非共价连接完成的。这种选择需要考虑每个特异变应原的性质。对于非共价偶联，螨类变应原以0.1-1μg/10μg蛋白脂质体的比例包埋入蛋白脂质体中。该偶联方法利用了两种成分之间的疏水和亲脂相互作用；该方法通过在60至600rpm转速下机械搅拌30-60分钟而进行。所得到的混合物可以直接以水溶液形式或吸附到氢氧化铝凝胶上给药。在后者中，变应原可以在与蛋白脂质体偶联之前先吸附到凝胶上，或者优选在蛋白脂质体吸附后再加入凝胶上。氢氧化铝的量可以是蛋白脂质体量的10到25倍，同时保持前面提及的变应原与蛋白脂质体的含量比例。在pH值6至8的范围内，通过在60-600rpm搅拌下进行吸附到明矾凝胶上的过程。
使用主要变应原特异的Mab-ELISA检测变应原吸附到明矾凝胶中的效力，如抗-Der s 1 ELISA(Sewer等，Int Arch Immunol Immunol2000；123：242-248)和抗-De r s 2 ELISA(Heymann PW，Chapman MD等，J Allergy Clin Immunol 1989；83：1055-1067)。
变应原与蛋白脂质体的偶联也能通过使用交联剂或间隔基(spacer)进行共价连接而完成，所述间隔基能与蛋白脂质体上可用的氨基酸基团偶联，随后将间隔基马来酰亚胺基与变应原分子上的游离巯基(SH)偶联。螨主要变应原蛋白(组1和2)中就存在这样的游离SH基团，尽管如此，它们也能通过减少二硫桥或用已知化学方法进行蛋白的衍生在其它的变应原中被诱发。所得到的缀合物随后通过透析或超滤纯化，最后通过凝胶过滤色谱法(Sephacryl S-300或Superdex 200)去除缀合试剂以及未结合的变应原。为了诱发适当的免疫应答，变应原分子必须占缀合物总量的1至10％。缀合物在适宜的水性赋形剂中或吸附至氢氧化铝凝胶上或在其它适当的贮藏佐剂中以注射途径给药。
本发明还包括通过上述方法的亲脂性残基(如16至20个碳的两性脂肪酸)与变应原的缀合，促进其非共价掺入蛋白脂质体。
或者，该疫苗组合物可能包括不会影响被诱发的细胞模式和对变应原预期应答强度的其它抗原。多糖，特别是来自脑膜炎奈瑟氏球菌的多糖C能用于此目的。它们以非共价形式加入制剂中，以0.5到4倍于蛋白脂质体量的比例。
本发明还包括一些在花粉和植物食物变应原来源中发现的多糖性质的变应原的用途，如交叉反应性糖类决定簇(CCD)(Aalberse，RC.Crossreactivity of IgE antibodies to allergens.Allergy 56(6)，2001，pp478-490)。在该情况中，变应原以与脑膜炎奈瑟氏球菌多糖C相同的方式加入制剂中。
令人意想不到的是，该疫苗组合物仅以两剂量通过非肠胃道途径给药，不仅诱发先前已知的对蛋白脂质体抗原的特异性Th1应答，还有直接对抗制剂中所包括的抗原的类似Th1应答。令人惊奇的是，Th1应答占优势，尽管制剂中使用了氢氧化铝，保留了贮藏效应。该应答特征在于细胞因子模式，具有高水平的IFN，IL-5不诱发，还有变应原特异性IgG2a抗体的诱发和小鼠中IgE和IgG1抗体的减少。该组合物的给药不会影响先前免疫接种诱发的对抗细菌性抗原的已经存在的应答。
所提出的解决方法具有如下优点：
该疫苗组合物诱发的免疫效应能解决如下问题：过敏性I型超敏应答(IgE和IgG1的减少)，和迟发型炎症和慢性变应性反应(IL-5减少)，因而它可以有效的治疗哮喘。治疗效果归功于在非变应性情况下变应原对免疫系统的呈递，并且它与用变应原提取物的传统免疫疗法相比以减少的注射次数和缩短的时间获得。该效果不仅能有利的被用于变应性病人的治疗，而且还能阻止变应性疾病在带有早期变应性状态个体中的发生或阻止对其它变应原的新变应性敏化的发生。
作为一种免疫修饰佐剂，蛋白脂质体的免疫效应在生命的最初几个月即哺乳期内是有效和安全的。它使那个年龄的孩子在疾病还没出现或发展时，为了达到预防目的进行疫苗给药成为可能。它对于具有变应性家族史而因此具有高概率发病的那些孩子特别有用。
将活性成分吸附入贮藏佐剂，特别是氢氧化铝中，制剂的变应原性(即IgE的结合能力)相对于相似剂量的水溶液变应原减少了10倍以上。这就意味着显著减少了给药期间严重过敏反应的风险。另外，吸附入凝胶可减少有可能引起活性成分降解的化学反应的动力学，从而延长了制剂贮存期的稳定性。
经纯化的变应原和特别是经纯化的表皮螨属类的螨类变应原(包括组1和2变应原)的应用促进了产物组合物的标准化。随后，可以精确的测定或适合制剂中变应原的含量和分析它与蛋白质脂质体偶联或吸附入与氢氧化铝凝胶的效力。另外，在共价偶联中，由于两种成分的分子量的显著差异，能很容易的从活性化合物中(蛋白脂质体-变应原缀合物)分离出不需要的副产物(如变应原-变应原聚合物)。这种分离可以通过商业可得的分子筛色谱法进行。该技术可以被用于不同性质的变应原，从而可能在同一制剂中使用多种变应原。
本发明的另一个优点在于产物虽然含有少量的LPS，但是无毒性，在另一方面，保持了它们的免疫原效应。这就使其适合安全的给药于人特别是小孩子。
蛋白脂质体还可以将T非依赖型抗原，如糖类转换为T依赖型抗原。该特征也能有利的用于多糖性质的变应原，如CCD。
具体实施方式
本发明通过如下具体的实施例进行进一步描述。
实施例1.螨类变应原的获得和纯化
变应原来自全部的螨培养物，其中包括死螨、鳞屑、排泄物颗粒以及低分子量的培养基成分。在如下溶液之一中提取变应原：PH值接近生理值的碳酸氢铵，碳酸氢钠，磷酸盐缓冲盐水或盐水。粗提物通过离心分离和过滤进行澄清，并通过凝胶过滤色谱法(Sephadex G-25)或透析过滤法(界限值：5-10kD)或两种方法除去低分子量成分。随后，产物通过超滤法浓缩并冷冻干燥以确保其稳定性。为了进一步纯化变应原，将经冷冻干燥的提取物再混悬于水溶液中并在50-100％的硫酸铵溶液中进行盐析沉淀。将沉淀物再混悬于水中并通过Superdex 75的凝胶过滤色谱法进行分离。收集10-60kDa分子量范围内的中间峰。该级分主要含有组1(25kDa)和组2(15kDa)主要变应原。最后收集到的级分被再次冷冻干燥，用于被重建成适当的浓度与蛋白脂质体偶联。
实施例2.蛋白脂质体的获得
它开始于脑膜炎奈瑟氏球菌B培养物。通过离心收获生物质并使用洗涤剂，酶和超声处理进行提取。通过离心除去细胞碎片，用核酸酶消化处理上清液以除去核酸。通过超速离心回收提取物，将其再混悬于洗涤剂溶液中，并通过分子分离色谱法除去其余的低和中间分子量成分进行纯化。所获得的蛋白脂质体，含有被包埋入它们结构中的少于10％的核酸和大约10％的LPS；但是无游离形式。任选地，以蛋白脂质体含量的0.5到4倍的比例加入荚膜多糖，其来自Gold和Gotschlich(Gold等，1969-1970，WHO Bull.45：279-282和Gotschlich等，1969，J.Exp.Med.129：1349-1365)所述的脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C。任选地，以蛋白脂质体量的10到25倍的比例加入氢氧化铝作为附加的佐剂。保持最后的PH值在7,0±0,4。保证蛋白脂质体-多糖复合物在明矾凝胶上的吸附超过80％和LPS的含量低于6％。被包埋入蛋白脂质体中的LPS，允许对免疫系统足够的呈递以减少有害毒性反应的可能性。硫柳汞可作为防腐剂加入，达到0.005-0.02％的最后浓度。将最终所得到的产物进行生物学和物理化学质控分析。
实施例3.吸附到氢氧化铝上的制剂变应原性(IgE结合活性)的测定
表达为人体IgE抗体结合能力的的变应原性，可通过I gE-抑制ELISA测定。该测定法测定了样品溶液抑制IgE与包被变应原的固相结合的能力。在这种情况中，所用的样品制剂是根据实施例1纯化的D.siboney变应原，与根据实施例2所得的蛋白脂质体混合，然后吸附到氢氧化铝凝胶上。最初的Der s 1变应原浓度为4μg/mL，变应原活性为400BU/mL(BU：根据第2版Nordic Guidelines for theRegistration of Allergenic Products的定义的生物学单位。在SkinPrick Test中10000BU/mL等于10mg/mL盐酸组胺。)
根据下述步骤进行ELISA。用参比变应原提取物包被聚苯乙烯微量培养板。用PBS-BSA1％封闭非特异性结合位点。随后，通过平行温育血清与逐渐增加量的变应原样品和参比物完成IgE血清混合物的抑制。通过包被在板上的变应原捕获没被抑制的IgE。在洗去非特异性结合抗体后，通过加入过氧化酶标记的抗IgE Mab，对结合到变应原上IgE进行检测。在加入适当的显色底物后，使用ELISA板读器测定反应产物的颜色强度。用平行线统计方法进行结果的分析和说明。建立参比物和样品抑制曲线，并进行线性回归分析，以验证每个样品曲线和参比曲线之间的平行性。最后，通过平行线之间水平距离的反对数计算出相对效力。
通过对所给样品的分析，得出如下结果：
变应原活性：21.2BU/mL(IC95％13.6-32.4)。该值表示仅为水溶液中变应原的最初活性的5.3％。
实施例4.显示总IgE的较少诱发的方案和剂量的确定.
对Balb/c小鼠在以下星期以Der s 1为1或5μg/鼠的浓度通过肌内途径免疫接种变应原(A1)+明矾(A)两次：0和2(短期方案)或0和4(长期方案)，用于确定免疫方案(剂量间隔时间)和变应原浓度。在短期方案中，在0，2和5星期时对动物取血，在长期方案中在0，4和7星期时取血。通过ELISA测定血清混合物中总IgE水平。
如附图1所示：短期方案诱发的IgE应答显著小于长期方案。另一方面，在所有方案中较低的变应原浓度(1μg)均不能诱发IgE。因为该原因，使用短期方案和大约1μg/鼠变应原剂量来进行下述实验。
为了更精确地确定剂量，Balb/c小鼠在0和2星期时被再次通过肌内途径免疫接种两次，并在0和4星期时取血。组I用蛋白脂质体+血清组C脑膜炎奈瑟氏球菌多糖+Al(OH)3。组II，III和IV分别用Al(OH)3+如下剂量0,5；1,25或2,5μg/鼠的变应原。通过ELISA测定血清混合物中的总IgE水平。如附图2所示：在被评估任何一组中IgE均没有显著的增加。
实施例5.变应原的加入对蛋白脂质体-特异性应答的无影响和变应原特异性IgG亚类应答的调节
Balb/c小鼠在0和2星期时通过肌内途径免疫接种两次，用于确定变应原对针对蛋白脂质体抗原应答的影响。组I用蛋白脂质体+多糖C+Al(OH)3(Va)。组II，III和IV分别用0,5，1,25和2,5μg/鼠的变应原+Va。在第一次免疫接种后的第0，15和35天时取血。通过ELISA测定蛋白脂质体和变应原特异性IgG亚类应答。
如附图3所示：检测到高IgG抗蛋白脂质体滴度，令人惊奇的是，变应原的加入并没有产生任何影响。在IgG亚类应答(附图4)中也没有检测到任何影响。高IgG2a滴定度是通过佐剂诱发的优先Th1应答的表示。附图5显示出不同变应原特异性IgG亚类的刺激。值得注意的是，在较低变应原浓度特别是1,25和0,5μg时，IgG2a水平的增加。对变应原IgG2a应答的诱发反映出佐剂能将Th2应答调节为Th1。
实施例6.用蛋白脂质体或变应原进行体外激发后的免疫接种的小鼠脾细胞的IFN-γ的产生和IL-5不产生。细胞因子产生与变应原特异性IgG亚类应答的关系。佐剂制剂之间的比较：蛋白脂质体+多糖C+Al(OH)3和单独的Al(OH)3。
Balb/c小鼠在0和2星期时免疫接种两剂量，用于确定Th1(IFN-γ)和Th2(IL-5)细胞应答。组I用蛋白脂质体+多糖C+Al(OH)3(Va)。组II，III和IV分别用0,5，1,25和2,5μg/鼠的变应原+Va。组V首剂量用Va和第二剂量用0,5μg变应原+Va。在最后剂量的七天后将动物处死。通过常规技术取出并处理脾，在蛋白脂质体或变应原的存在下培养细胞。72小时后，收集培养物上清液并通过ELISA进行处理以测定IFN-γ和IL-5。
所有组中蛋白脂质体激发的细胞培养物诱发IFN-γ产生，与已知的通过该佐剂诱发的Th1模式相一致。然而，当用两次变应原注射给药时(组II)或使用Va的在先剂量和单一的变应原注射时(组V，附图6)，在用0,5μg变应原剂量免疫接种的这些组中，IFN-γ产生令人惊奇的被加强。令人惊奇的是，所有组中的变应原激发也能诱发IFN-γ应答。意外的是，以0,5μg变应原免疫接种的组对于两种变化情况的应答(variant)都比较高：两次变应原注射或具有在先Va给药的仅一种变应原注射(附图7)。蛋白脂质体或变应原激发后没有检测出IL-5应答。这些结果反映通过佐剂可将变应原-诱发的Th2模式调节为Th1模式.。
进行其它类似的实验来确定变应原特异性IgG和IgG亚类抗体。通过上述相同的方案对小鼠免疫接种，但是仅使用吸附入Al(OH)3的变应原。在第一次接种后的第0，15和35天取血。通过ELI SA评估血清IgG应答。与Al(OH)3相比，使用Va佐剂时变应原特异性IgG应答显著的增高。令人惊奇的是，最低变应原剂量0.5和1,25μg的佐剂间的差异比较大。然而，对于两种佐剂，用最高变应原剂量获得最高的变应原特异性IgG应答(附图8)。对于所有佐剂和组合的主要IgG亚类是IgG1。然而，用所有含Va的组合物诱发了IgG2a亚类，反之在两个最高的变应原剂量(2.5和1,25μg)时用Al(OH)3仅获得微小的阳性值。相反的，令人惊奇的是，在最低剂量变应原(0,5μg)时发现两种佐剂间对于IgG2a应答的最大差异。在那种情况下，发现对于Al(OH)s是阴性，对于Va是阳性(附图9)。
实施例7.变应原特异性IgE的诱发和功能的测定
Balb/c小鼠在0和2星期时免疫接种两次，用于测定变应原特异性IgE应答。组I用Al(OH)3。组II用蛋白脂质体+多糖C+Al(OH)3(Va)。组III和IV分别用1和5μg变应原+Al(OH)3。组V和VI用0,5；1,25和2,5μg变应原+Va。在第一次接种后的0、15和35天对动物取血。IgE应答通过在雄Wistar大鼠中进行被动皮内过敏反应(PCA)进行定性和半定量评估。应答变量通过时间和阳性血清稀释度和斑点密度任意单位表示。
在0天(To)，第二次时(T15)和第二次14天后(T35)时提取血清。可以从表1中看出(PCA中反应斑点的强度和最终阳性血清稀释度)，组V到VII(使用疫苗组合物时)的最终阳性稀释度低于组III和IV(明矾)。两者的光密度相同。这就表示变应原特应性IgE应答的大量减少。在阴性对照组(I和II)中没有发现应答。
阴性对照组(I和II)中，应答值是负值。在组III中，在第35天观察到阳性值，10660的强度，其在高达1∶16稀释度时可检测到。组IV，在第一次后(15天)稀释至1∶8时获得强度为9345的阳性值。在第35天，稀释至1∶32时发现强度为39843的高效应答。相反，令人惊奇的是，用Va给药的组，变应原特异性IgE应答非常的低，仅在第35天时显示出低强度并且仅在低稀释度时可检测到。值得注意的是，对于最低变应原剂量(0,5μg)，仅在使用未稀释的血清(1∶1)时可检测到最小应答，当血清被稀释至1∶2时就消失了(附图10和表1)。这些结果显示出使用最低变应原剂量时，Va佐剂相比较于Al(OH)3具有较低的IgE诱发，这与在先实施例的结果一致，其中总IgE较低和IFN-γ和IgG2a较高。
表1
组 免疫接种   阳性，第二剂量后的天数   斑强度(任意单位) 最终阳性稀释度
  I   Al   -   0   -
  II   P+PC+Al  (Va)   -   0   -
  III   1μg A+Al   35   10660   1∶16
IV 5μg A+Al   15*35   934539843   1∶81∶32
  V   0,5μg A+Va   35   1245   1∶1
  VI   1,25μg A+Va   35   4054   1∶4
  VI I   2,5μg A+Va   35   4574   1∶8
图例：Al，Al(OH)3；P，蛋白脂质体；PC，脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的多糖；A，变应原和(*)第一次后的天数
实施例8.变应原与蛋白脂质体的共价偶联.
通过化学缀合的共价偶联可以通过一些已知的方法进行，例如专利U.S 4.695.694和专利申请US SN 362,179；555,558；555,974；555,966和555,339中描述的方法。优选的方法使用同双功能试剂如戊二醛和琥珀酸酐，其能通过游离氨基基团偶联两个分子。变应原蛋白和蛋白脂质体中可发现这些游离氨基，特别是赖氨酸残基。另外，可以使用异双功能试剂，优选N-羟基琥珀酰亚胺(Hydroxisuccinimide)-马来酰亚胺酯(如MBS，MPS，SMPB，GMBS，EMCS)。这种情况中反应的进行，首先通过交联剂与蛋白脂质体上可用的氨基偶联，随后通过交联剂马来酰亚胺基团与变应原分子上的游离巯基偶联。如下描述了丝泊尘螨(Dermatophagoides siboney)经纯化的变应原与蛋白脂质体使用戊二醛法形成缀合物的例子，和用该缀合物对小鼠免疫接种被诱发应答的例子。
缀合：根据实施例1的纯化的变应原蛋白被加入pH 7.0，200μg/mL蛋白脂质体PBS溶液中，最后的变应原浓度为20μg/mL。加入1体积0,4％的戊二醛，并摇荡1小时。加入25mol/L甘氨酸(最终浓度)停止反应；随后调pH至7.0-7.8。通过Sephadex G25柱的凝胶过滤除去没有偶联的戊二醛。为了进一步纯化缀合物，除去残留的游离变应原，产物通过事先加入去氧胆酸钠洗涤剂至终浓度为1％的SephacrylS-300色谱柱。收集第一峰，其相当于基质排除体积。随后通过PBS透析除去洗涤剂。得到的产物通过截留值为10000Kda的膜超滤(Amicon，USA)浓缩10倍。通过变应原特异性单克隆抗体夹心酶联免疫分析法(sandwich ELISA)测定缀合物中的Der s 1含量。通过PBS稀释调节浓度至用于吸附过程的适当值10μg/mL。最后产物通过0.2μm膜过滤进行灭菌。
吸附过程：将1.2mg/mL氢氧化铝和待缀合的10μg/mL变应原溶液等体积混合于pH 7.0的PBS中。在200rpm轻柔摇荡混合物30分钟。通过在280nm检测上清液的吸光度检验蛋白与铝凝胶的吸附，得到的值大于90％。
免疫接种：三组Balb/C小鼠(每组7只)分别用变应原的PBS溶液(″Ds″)，或变应原-蛋白脂质体缀合物的PBS溶液(″PLS-Ds″)，或氢氧化铝中的变应原-蛋白脂质体缀合物(″[PLS-Ds]Alum″)两剂量免疫接种。对于所有变化情况Der s 1变应原浓度是5μg/mL。在第0和4星期时通过腹腹内途径注射给药。在开始试验时(0)和4和8星期时对小鼠取血。
结果：通过ELISA测定总IgE和变应原特异性IgG，还有，IgG1，IgG2a和IgG2b亚类血清抗体。另外，通过在Wistar大鼠中的被动皮肤过敏反应法(PCA)测定变应原-特异性IgE应答。抗体应答的结果显示于附图11中。值得注意的是，一般而言，含有缀合物的变化情况诱发的IgG应答显著高于单独的变应原。这对于所有IgG亚类也是同样有效的：IgG1，IgG2a和IgG2b。然而，在含缀合物的PBS溶液变化情况中(即没用氢氧化铝凝胶)的总IgE应答比较低。另外，PCA结果显示这些变化情况不会诱发任何可检测到的变应原特异性应答(高于阴性对照)，然而所有游离的变应原和吸附到氢氧化铝上的缀合物分别在稀释至1∶1和1∶10时诱发可检测到的应答。
实施例9.具有多种变应原的制剂
在一个疫苗组合物中不同变应原的制剂可以通过非共价偶联(通过混合或吸附入氢氧化铝凝胶中)或实施例8所述的共价偶联实现。在这种情况中，每个变应原分别与蛋白脂质体缀合，最后一起制剂。本实施例中公开了在来自不同螨种的三种变应原的非共价制剂的制备，所述螨种在热带区域非常普遍(房尘螨、丝泊尘螨和Blomia tropicalis)。
根据实施例1分别对所述螨种进行制备。对于Blomia，使用整体冷冻干燥的提取物，无需分离。使用Mab-ELISA测定Der p 1，Der s 1和Blo t 5主要变应原的含量。根据实施例3，使用IgE抑制ELISA测定总变应原活性。经冷冻干燥的变应原以浓度为20μg/mL(对于Der p1和Der s 1)或10μg/ml(对于Blo t 5)的重悬于pH 7.0的PBS，并且通过0.2μm膜过滤灭菌，使变应原活性达到4000BU/mL。蛋白脂质体以终浓度为200μg/mL分别被加入每个变应原中。将溶液在150rpm下轻柔搅拌匀化30分钟。随后，等体积的溶于pH 7.0的PBS中的氢氧化铝2mg/mL被加入每种变应原溶液中并混合，在150rpm下轻柔搅拌60分钟。可以通过在280nm检测上清液的吸光度来检验蛋白与铝凝胶的吸附。最后，混合三种变应原产物并轻柔搅拌10分钟。通过ELISA(INDOOR Biotech，UK)分析混悬液的上清液的Der p 1，Der s 1和Blo t 5，和通过用于蛋白含量测定的罗氏蛋白定量法(Lowry method)，可以证明变应原和蛋白脂质体几乎完全被吸附到凝胶上。根据实施例3测定残留的变应原活性(没被吸附的)。可以发现，超过90％的变应原被吸附和变应原活性的减少低于20％。
将两份0.5mL剂量的制剂(总变应原含量：3.33μg Der s 1和Der p 1，1.17μg Bl o t 5)对Balb/c小鼠通过腹膜内途径给药，两次给药间间隔三星期。在免疫接种方案开始后的七星期，通过ELISA测定变应原特异性IgG抗体。可以发现，对所有变应原的平衡的抗体应答，分别对房尘螨，丝泊尘螨和Blomia tropicalis的比例为2∶2∶1。所检测到的平均IgG水平比用PBS中变应原混合物免疫接种所得到的值高80％。
附图说明：
附图1：显示了短期方案(0-14天)诱发的总IgE量少于长期方案(0-28天)。在短期方案中免疫接种后的第0，15和35天取血和长期方案中免疫接种后第第0，28和35天取血。Va：蛋白脂质体+来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的多糖+Al(OH)3；A：变应原；Al：Al(OH)3.变应原剂量1和5μg/鼠。如其所示，在第二次注射后，长期方案中用5μg进行免疫接种的组的IgE应答高于短期方案。事实上，短期方案中具有相同浓度的组中的第二应答具有减少的倾向。
附图2：可以发现的是，什么浓度的变应原可以产生总IgE的更少诱发。在免疫接种后的第0，15和35天取血。Va：蛋白脂质体+来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的多糖+Al(OH)3；A：变应原；Al：Al(OH)3.变应原剂量0.5；1.25和2.5μg/鼠。值得注意的是，用0.5μg变应原剂量诱发的总IgE的量相似于佐剂对照组(Va)。其他两种变应原浓度(1.25和2.5)不会增加总IgE水平。
附图3：显示出包含多少变应原不会影响蛋白脂质体特异性I gG应答。在免疫接种后的第0，15和35天取血。Va：蛋白脂质体+来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的多糖+Al(OH)3；A：变应原；Al：Al(OH)3.变应原剂量0.5；1.25和2.5μg/鼠。值得注意的是在疫苗组合物中包含在第一和第二剂量后不会影响对蛋白脂质体抗原的应答(与用没有变应原的佐剂混合物(Va)给药比较)。
附图4：可见包含变应原不会影响蛋白脂质体特异性IgG亚类应答。在免疫接种后的第0，15和35天取血。Va：蛋白脂质体+来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的多糖+Al(OH)3；A：变应原；Al：Al(OH)3.变应原剂量0.5；1.25和2.5μg/鼠。用包括变应原的疫苗组合物免疫接种，其相比于单独的佐剂混合物(Va)，保持不变的蛋白脂质体特异性IgG亚类模式。
附图5：显示出低变应原浓度可以诱发多少变应原特异性I gG2a抗体。在免疫接种后的第0，15和35天取血。Va：蛋白脂质体+来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的多糖+Al(OH)3；A：变应原；Al：Al(OH)3.变应原剂量0.5；1.25和2.5μg/鼠。两个最低变应原浓度(0.5和1.25)诱发I gG2a应答。
附图6：涉及经蛋白脂质体-诱发的IFN-γ产生的测定。在第二次免疫接种(2星期)后的第7天提取脾细胞。Va：蛋白脂质体+来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的多糖+Al(OH)3；A：变应原；Al：Al(OH)3.变应原剂量0.5；1.25和2.5μg/鼠。1Va+Va-A0,5：首次用Va注射和第二剂量时用Va+0.5μg变应原。最低变应原浓度增加了蛋白脂质体-诱发的IFN-γ产生。
附图7：涉及经变应原-诱发的IFN-γ的测定和在先给药的佐剂无影响。在第二次免疫接种(2星期)后的第7天提取脾细胞。Va：蛋白脂质体+来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的多糖+Al(OH)3；A：变应原；Al：Al(OH)3.变应原剂量0.5；1.25和2.5μg/鼠。1Va+Va-A0,5：最初用Va注射和第二剂量时用Va+0.5μg变应原。对于所有的变应原浓度均发现有经变应原-诱发的IFN-γ产生，但是在最低浓度值时更高。佐剂混合物的在先注射不会影响应答。
附图8：可见最低变应原剂量可以诱发疫苗组合物和氢氧化铝之间变应原特异性IgG应答的显著差异。在第二剂量后的第14天取血清。在第0和27天注射给药。Va：蛋白脂质体+来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的多糖+Al(OH)3；A：变应原；Al：Al(OH)3.变应原剂量0.5；1.25和2.5μg/鼠。可以发现的是，最低剂量(0.5和1.25)诱发的变应原特异性IgG应答显著高于最高剂量诱发的。
附图9：涉及变应原特异性IgG2a的诱发。在第二剂量后的第14天取血清。在第0和27天注射给药。Va：蛋白脂质体+来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的多糖+Al(OH)3；A：变应原；Al：Al(OH)3.变应原剂量0.5；1.25和2.5μg/鼠。可以发现，所有含有Va的变化情况与仅包含明矾吸附的变应原的变化情况相比诱发的变应原特异性IgG2a应答更显著。
附图10：其显示了通过被动皮肤过敏反应测量，疫苗组合物组(组V到VII)与阳性对照组(组III和IV)相比变应原特应性IgE的减少。Va：蛋白脂质体+来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的多糖+Al(OH)3；A：变应原；Al：Al(OH)3。在0天(To)，第二剂量期时的(T15)和第二剂量后的第14天(T35)时提取血清。组(V-VII)中的应答低于用明矾吸附的变应原免疫接种的组(III和IV)。在阴性对照组(I和II)中没有发现应答。
图例：-，无；+，有；A，变应原；Va，蛋白脂质体+来自脑膜炎奈瑟氏球菌的多糖+氢氧化铝；Al，氢氧化铝。
附图11.其涉及对变应原-蛋白脂质体缀合物的变应原特异性抗体应答。在不同变化情况中：Ds(游离变应原)；Ds-PLS(与蛋白脂质体缀合)；[Ds-PLS]明矾(吸附到氢氧化铝上的缀合物)，小鼠用5μg Ders 1免疫接种两次。在第一次免疫接种后的8星期评估应答。竖条代表标准差。

Claims (11)

1.用于变应性疾病的疫苗组合物，含有：
a)来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组B的并能诱发细胞介导的Th1应答模式的蛋白脂质体；
b)一种或多种来自房尘螨的呼吸性变应原，其为天然状态或经化学修饰；和
c)合适的贮藏佐剂，
其中变应原与蛋白脂质体的质量比为0.1∶10至1∶10。
2.根据权利要求1的疫苗组合物，其中所述的呼吸性变应原来自表皮螨属(Dermatophagoides genus)的房尘螨。
3.根据权利要求2的疫苗组合物，其中所述的呼吸性变应原来自丝泊尘螨(Dermatophagoides siboney)种的房尘螨。
4.根据权利要求2的疫苗组合物，其中所述的房尘螨变应原是组1(Ders1，Derp1和Derf1)变应原和组2(Ders2，Derp2和Derf2)变应原。
5.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述的呼吸性变应原与具有16-20个碳原子的双极性脂肪酸的亲脂性残基共价偶联，得到经化学修饰的变应原。
6.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述的贮藏佐剂选自氢氧化铝和磷酸铝。
7.根据权利要求6所述的疫苗组合物，其中所述的贮藏佐剂以与蛋白脂质体的质量比为10∶1至25∶1的比例加入。
8.根据权利要求1所述的疫苗组合物，其中所述的组合物还含有来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的多糖C。
9.根据权利要求8所述的疫苗组合物，其中所述多糖C以与蛋白脂质体的质量比为0.5∶1至4∶1的比例加入。
10.权利要求1-7中任一项所述的疫苗组合物的制备方法，包括下列步骤：
a)通过冷冻干燥或超滤浓缩房尘螨的变应原提取物至蛋白浓度为10到100mg/mL；
b)在50-100％硫酸铵溶液中沉淀和选择沉淀物；
c)通过使用如下基质之一：Sephacryl S-100，Sephacryl S-200，Sephacryl S-300或Superdex 75的分子筛色谱法分级分离，选择分子量为10-60kDa的级分；
d)冷冻干燥和超滤浓缩至蛋白浓度为10到100μg/mL；
e)将变应原与蛋白脂质体以0.1∶10至1∶10的质量比按共价或非共价形式相偶联；
f)在60到600rpm搅拌30到90分钟；
g)以与蛋白脂质体的质量比为2∶1至6∶1的比例加入选自氢氧化铝和磷酸铝的一种贮藏佐剂；
h)在60到600r pm下匀浆混合物30到90分钟。
11.根据权利要求10的方法，其中所述的方法还包括如下步骤：
a)以与蛋白脂质体的质量比为0.5∶1至4∶1的比例加入来自脑膜炎奈瑟氏球菌血清组C的多糖C；
b)在60到600rpm下匀浆混合物30到90分钟。
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Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CU23420A1 (es) * 2003-12-30 2009-09-08 Univ De Cambridge Proteoliposomas y sus derivados como adyuvantes inductores de respuesta citotóxica y las formulaciones resultantes
EP1872792A1 (en) * 2006-06-29 2008-01-02 Biotech Tools S.A. A method for the production of hydrolyzed allergen
CN101553246B (zh) * 2006-08-07 2019-05-21 哈佛大学校长及研究员协会 蛋白质基质疫苗及这种疫苗的制备和给药方法
EP2042193A1 (en) * 2007-09-28 2009-04-01 Biomay AG RNA Vaccines
US20100278880A1 (en) * 2008-01-02 2010-11-04 Biotech Tools S.A. Pharmaceutical formulation for allergen preparation
CU20080215A7 (es) * 2008-11-19 2012-06-21 Inst Finlay Vacunas unitemporales
EP2865389A1 (en) * 2008-12-09 2015-04-29 Pfizer Vaccines LLC IgE CH3 peptide vaccine
CU20100083A7 (es) 2010-05-05 2012-06-21 Inst Finlay Tolerogenos adyuvados como vacuna de malaria
CN101972472A (zh) * 2010-10-26 2011-02-16 北京新华联协和药业有限责任公司 一种变应原疫苗纯化及其制备的方法
CU20110202A7 (es) 2011-11-02 2013-12-27 Inst Finlay Ct De Investigación Producción De Sueros Y Vacunas Composición inmunogénica de polisacáridos planos adyuvados y las formulaciones resultantes
EP2689775A1 (en) 2012-07-25 2014-01-29 Instituto Finlay, Centro de Investigacion-Produccion de vacunas y sueros Cochleate with only one mamp
CN110624101A (zh) * 2018-06-22 2019-12-31 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 重组尘螨变应原蛋白药物合剂及其应用
CN112023062A (zh) * 2020-09-18 2020-12-04 北京基因安科技有限公司 一个用可溶性IgE受体抑制过敏反应的方法
IT202200011459A1 (it) * 2022-05-31 2023-12-01 Anallergo S P A Uso della ultrafiltrazione per la produzione di estratti allergenici purificati

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5597572A (en) * 1987-07-30 1997-01-28 Centro Nacional De Biopreparados Method of producing Neisseria meningitidis B vaccine, and vaccine produced by method
US6165502A (en) * 1996-09-11 2000-12-26 Albany Medical College Protein-lipid vesicles and autogenous vaccine comprising the same

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4695694A (en) 1986-02-14 1987-09-22 Fusion Systems Corporation Structure for minimizing microwave leakage
IT1318691B1 (it) * 2000-09-12 2003-08-27 Consiglio Nazionale Ricerche Varianti di proteine allergeniche del gruppo 2 di dermatophagoides.
EP1372706B1 (en) * 2001-03-09 2010-12-01 ID Biomedical Corporation of Quebec Proteosome-liposaccharide vaccine adjuvant

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5597572A (en) * 1987-07-30 1997-01-28 Centro Nacional De Biopreparados Method of producing Neisseria meningitidis B vaccine, and vaccine produced by method
US6165502A (en) * 1996-09-11 2000-12-26 Albany Medical College Protein-lipid vesicles and autogenous vaccine comprising the same

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
真菌免疫反应与慢性鼻窦炎. 刘天懿等.中华耳鼻咽喉科杂志，第36卷第5期. 2001

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