KR101058350B1 - 알러지 백신 조성물, 그 생산방법 및 알러지 치료에있어서의 그것의 사용 - Google Patents

Abstract

본원발명은 면역학 특히 면역-알러지 분야에 관한 것으로서, 특히 알레르겐에 대한 면역 응답을 조절할 수 있는 보강제 또는 운반체 화합물과 관한 것이다. 본원의 기술적 목적은 알러지성 반응 Th2 및 IgE를 알러지성 개체에게 적용되었을 때 프로텍터 반응 Th1로 변환시키는 박테리아성 단백질 함유 리포좀을 사용함으로써 치료 또는 예방 용도, 뿐만 아니라 아직 알러지 질환이 없는 개체에 대해서는 알러지의 발생 및 발전을 방지 할 수 있는 약학적 제재를 수득하기 위함이다. 백신 조성물은 알레르겐에 커플링되어 있는 그램 음성 박테리아에서 유래한 단백질 함유 리포좀으로 구성되며, 선택적으로 다른 보강제 및 항원을 포함할 수 있다. 이의 제조바업 및 2회의 면역화 계획이 개시된다.

알레르겐, 알러지 반응 Th2, IgE, 프로텍터 반응 Th1, 단백질 함유 리포좀

Description

알러지 백신 조성물, 그 생산방법 및 알러지 치료에 있어서의 그것의 사용{ALLERGY VACCINE COMPOSITION, PRODUCTION METHOD THEREOF AND USE OF SAME IN ALLERGY TREATMENT}

본원발명은 면역학 특히 면역-알러지 분야에 관한 것으로서, 특히 알레르겐에 대한 면역 응답을 조절할 수 있는 보강제 또는 운반체 화합물과 관한 것이다. 본원의 목적은 이의 병원성 영향을 줄이거나 방지할 수 있는 특정 반응에 변화를 유도하기 위함이다.

알러지는 특히 산업화된 국가에서 매우 흔한 질환이다. 알러지에는 여러 면역질환성(immunopathological) 메커니즘 및 특히 소위 타입 I 급성 과민성(anaphylactic hypersensitivity)가 개입된다. 타입 I 과민성의 물리적 병원성(physiopathogeny)은 증가된 발생량의 IgE, 세포친화 항체(cytotropic antibody)에 기초한다. IgE 항체는 외부 물질, 명명된 알레르겐, 1차 노출 후에 명명된 민감성에 의해 발생한다.

IgE 항체는 혈액 백혈구 및 조직 비만세포의 표면에 있는 IgE 수용체에 결합할 수 있으며, 혈액 내에서 수 시간의 평균수명을 조직 내에서 수 개월로 연장시킬 수 있다. 알레르겐이 세포에 결합된 IgE 항체와 결합하게 되면 주변 항체와 크로 스링크를 유발할 수 있으며, 이는 시그널 케스케이드(signal cascade)를 유발시키며, 이는 세포의 과립화 및 염증 매개체 예를 들어 히스타민, 세로토닌, 키닌을 방출에 이르게 된다.

가장 흔한 알러지 질환은 비염(rhinitis), 천식(asthma) 및 아토피성 피부질환(atopic dermatitis)이다. 알러지성 천식은 만성 염증 질환이다. 천식의 면역발병학에는 IgE 의존 메커니즘(타입 1 급성 반응과 관련)뿐만 아니라 T-세포, 특히 소위 Th2 세포 서브셋과도 관련되어 있다. Th2 림포사이트는 다른 세포의 보충 및 활성화를 통해 특히 IL-5 생산을 통해서 염증성 반응을 유발하고 유지하며, 이는 에오시노파일(Eosinophiles)의 보충 및 활성화와 관련되어있다. 에오시노필라(Eosinophilia)는 천식의 중요한 특징인 기관지 과민성의 발전에 중요한 역할을 한다.

흔한 알레르겐은 꽃가루, 집안 먼지 진드기, 곰팡이, 약물, 음식, 동물 털, 비듬이다. 집안 알레르겐 및 특히 집안 먼지 진드기는 호흡기 알러지 및 천식과 매우 관련있는 원인물질이다.

알러지 질환의 임상적 징후는 보통 안티-히스타민(anti-histaminics), 길항근(-agonists), 소듐 크로모글리케이트(sodium chromoglicate) 및 코르티코스테로이드(corticosteroids)로 치료한다. 이러한 치료는 일반적으로 부적절한데, 이는 대증적에 불과하며 질병의 에티오파토제니(ethiopathogeny)에는 영향을 미치지 않기 때문이다. 요즘, 좀더 효과적인 치료 접근, 그 중에서도 특성 면역치료법(specific immunotherapy) 또는 치료 백신이 필요하다고 널리 인식되고 있다

전통적으로, 알레르겐 추출물을 이용한 과민성(hyposensitization) 치료(소위 특성 면역치료법)이 알러지 질환의 치료에 널리 사용되었다. 이러한 타입에 있어서, 환자는 특성 자극적인 알레르겐(specific offending allergens)을 정기적으로 피하 주입받는다. 처음에는 적은 양으로 시작하여, 알러지 반응이 보이지 않으면 양은 증가한다. 처음에는 1주에 한번 투여되며, 나중에는 점차 증가하여 1달 또는 보름에 한번 유지투여량(a maintenance dose)에 도달한다. 이러한 치료법은 수년동안 유지된다(WHO Position Paper. Allergen Immunotherapy: Therapeutic Vaccines against Allergic Diseases. Geneva, January 1998).

이러한 치료가 몇몇 알러지 질환에는 상대적으로 효과가 있다고 간주되나, 면역치료법은 안전에 관한 이유로 그 효용성에 의심을 받아왔다. 이러한 치료 과정에, 환자는 심각한 급성 반응을 경험할 수 있으며, 사망에 이를 수도 있다. 또한 3년에 100~200회 정도로 투여 횟수가 매우 높아 실제 적용에 심각한 약점으로 작용한다. 낮은 환자 순응도 및 치료의 조기 포기는 적은 효과를 보이는 가장 빈번한 이유이다.

최근, 알러지 질환 환자에 있어 IgE 면역 반응의 유도의 메커니즘을 이해하는데 있어 큰 진전이 있었다. B 세포에 의한 IgE의 생산은 Th2 면역 세포 응답의 특정 메커니즘에 의해서 유도되며, 특히 Th2 세포에 의한 IL-4의 과생산에 의해 유도된다. Th2 세포는 그들의 조절 역할에 병리학적으로 관련되어 있을 뿐만 아니라(IL-4는 T 세포에 의해서 제공되는 콘택트 시그널에 의해서 매기되는 B-림포사이트 내 IgE로의 클래스 스위치를 유도한다), 이펙터 페이즈(effector phase)의 지연된 타입의 알러지 염증 반응 및 천식 만성 염증에도 직접적으로 참여한다.

유전적 인자 뿐만 아니라 환경적 알레르겐에도 노출되는 경우 알러지 민감성의 주요 현상을 구성하며 알러지 반응을 촉발하는 원인이 된다.

알레르겐 면역치료법 동안 환자의 임상적 향상에 대한 면역학적 메커니즘은 아직 완벽하게 설명되지는 않았다. 그럼에도 불구하고, 알레르겐 특성 IgE와 관련하여 몇가지 면역학적 변화가 발생한다는 점이 알려져 있다(IL-4 및 IL-5의 감소 및 IFN-γ 및 IgG 레벨의 증가가 있음). 이러한 변화는 비병원성 동시발생의 Th1 패턴의 유도의 가능한 결과와 같이 Th2 반응 패턴의 감소를 의미한다(WHO Position Paper. Allergen Immunotherapy: Therapeutic Vaccines against Allergic Diseases. Geneva, January 1998).

Th1/Th2 반응 패턴은 우선 Th 세포에 의해 분비되는 사이토킨의 전형적 패턴에 의해 우선 구분된다: 즉 Th1에 의한 IFN-γ 및 IL-2 및 Th2에 의한 IL-4 및 IL-5(Mossman, T. R., Cherwinski, H., Bond, M. W., Giedlin, M. To, and R. L. Coffman. 1986. Two types of murine T helper cell clones. I. Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. J. Immunol. 136:2348-2357). 반면, 혈청 Ig 클래스/서브클래스 프로파일을 결정하는 유도된 반응의 타입을 결정하는 것도 가능하다. 따라서 뮤린(murine) Th1 패턴은 (IFN-γ 의존의) IgG2 서브클래스 항체를 유도하며, 반면 Th2는 (IL-4 의존의) IgE 및 IgG1 서브클래스를 유도한다. 인간에 있어서 Th1는 IgG1/IgG3 항체와 관련되어 있으며 Th2는 IgE와 관련되어 있다.

알러지의 발생 및 발전은 환경적 요인에 의하지만, Th2/IgE 응답을 개발하는 개인적 차이는 유전적 요인에 의한다(Holgate ST. Environmental Genetic and interaction in allergy and Asthma. J Allergy Clin Immunol 1999; 104:1139-1146). 따라서, 알러지 질환의 부모의 자녀는 비 알러지성 부모의 자녀보다 알러지 질환의 빈도가 높다. 이러한 빈도는 부모 모두 알러지 질환, 모측 알러지 질환, 부측 알러지 질환의 경우 각각 75, 50 25%인 것으로 보고되었다. 이는 부모의 진단 시스템을 적용하여 개체의 거동을 높은 개연성을 가지고 예측할 수 있다는 것을 의미한다. 또한, 병리학적 Th2 패턴의 형성은 처음 6-24 개월에 이루어진다는 것은 널리 알려져 있다. 박테리아 감염과 같은 환경적 요인은 질환의 발생에 긍정적으로 영향을 미칠 수 있으며, Th1 패턴을 유도하며, 이는 알러지성 Th2 패턴을 낮추어 조절한다(Holt PG, Programming of Allergen Specific Th-memory during Childhood. Proceedings XVII International Congress of Allergology and Clinical Immunology. Sydney 2000. Allergy Clin Immunol International Suppl. 1, 2000 pp 83-85). 이러한 발견은 초기 아동 시기에 알레르겐에 대한 Th2 응답의 형성을 억제할 수 있는 예방적 항알러지성 백신을 설계할 수 있는 가능성을 암시한다. 이러한 백신은 Th1 보강제에 기초하며, 이는 이론적으로는 모유 수유 시기에도 효과가 있을 수 있다.

몇가지 시도에 의해서 알레르겐 면역치료법을 향상시켜, 부정적인 측면을 줄이고, 그 긍정적인 면을 유지 발전시키려고 하였다. 특히 몇 가지 방법에 의해서 알레르겐을 조절하여 그 알레르겐성(즉, IgE 항체에 의해서 인식될 수 있는 능력) 및 면역화를 거쳐 IgE 항체를 유도할 수 있는 능력이 감소될 수 있었으며, 뿐만 아니라 그들의 면역성(즉, 치료 또는 예방 반응의 능력)을 증가시킬 수 있었다. 이러한 시도들 중에는 알레르겐을 흡수시켜 축적 효과(보강제)를 발생시키는 물리적 방법 및 다른 화합물과의 또는 알레르겐 분자 간의 공유결합으로써 알레르겐 분자를 변형시키기 위한 화학적 방법이 있다.

그들 중에는 몇가지 물리적 시약이 사용되었다: 티로신(영국특허 1,377,074), 티로신 에스테그(미국특허 4,428,932); 리포좀(국제공개 WO 89/10753); 모노포스포릴 리피드 A(MLA)(미국특허 5,762,943); 사포닌(미국특허 4,432,969) 및 전통적인 시약: 알루미늄 하이드록사이드 및 칼슘 포스페이트.

알레르겐 중합을 위해 사용된 화학적 시약 중에는 호름 알데히드(Marsch DG et al. Studies on allergoids from naturally occurring allergens. III Preparation of Ragweed pollen allergoids by aldehyde modification. J. Allergy Clin. Immunol. 1981;68:449-59); 알기네이트(Corrado OJ et al. Allergy 1989;44:108-5) 및 글루타르알데히드(영국특허 1,282,163)가 있다. 또한, MPEG(Dreborg et al. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1990;6:315-65) 및 다당류 콘주게이트(유럽특허출원 EP 3497 008 A2)도 사용되었다.

이러한 방법은 몇몇의 경우에 있어서(예를 들어, Glutaraldehyde polymerized allergens, Alum adjuvanted, Grammer et al., Modified forms of allergen immunotherapy, J Allergy Clin Immunol 1985;44:108-15) 동물 모델에 있어서 알레르겐-특성 IgG 티터를 증가시켰다. 그럼에도 불구하고, 항체 클래스의 증가는 특히 IgE 항체의 평행적 증가가 있다면 반드시 환자의 임상적 향상을 의미하지는 않는다. 사실, 몇몇의 IgG 서브클래스(쥐의 IgG1 및 인간의 IgG4)가 거대 세포 표면에 잠시 그들을 결합시킬 수 있는 능력으로 인해 상이한 알러지 반응과 관련되어 있기도 하다. 반면, 인간에 있어서 임상적 증거는 IgG 항체의 증가가 임상적 향상과 직접적으로 관련되어 있지는 않다는 점을 보여주며, 이는 이러한 항체가 치료에 의해서 유도되는 조절 메커니즘에 있어서 2차적인 역할만 수행하고 있다는 점을 의미한다(Rak S. Lowhagen O., Venge P. Bronchial The effect of immunotherapy on hyperresponsiveness and eosinophil cationic protein in pollen-allergic patients. J Allergy Clin Immunol 1988; 82:470-80 및 Jutel M, Mller Or, Fricker M, Rihs S, Pichler W, Dahinden C. Influence of bee venom immunotherapy on degranulation and leukotriene generation in human blood basophiles. Clin Exp Immunol 1996;12:1112-18).

화학적으로 조절된 알레르겐(소위 알레르고이드)가 전통적인 알레르겐 추출물과 비교하여 치료 중 2차 부작용의 감소에 관한 장점이 있지만, 임상적으로 큰 향상을 보이지는 않는다(Bousquet et al. J. Allergy Clin. Immunol. 1989;84:546-56 and Grammer et al. J Allergy Clin Immunology 1985;76:397-401). 임상실험에 지금까지 사용되어 온 알레르고이드(글루타르알데히드 또는 포름알데히드)의 다른 약점은 표준화된 조성물을 얻기가 현실적으로 불가능하다는 점이며, 이는 최종적 생성물이 알레르겐 추출물(폴리펩티드 및 다른 생분자의 균질 혼합물)로부터 화학적 반응을 통해서 얻어지기 때문이다. 이러한 반응에 있어서, 상이한 중합도 또는 상이한 화학적 변형을 가지는 분자종이 형성되어 원하지 않고 제거하기 힘든 부산물을 구성하는 것을 피하기가 어렵기 때문이다.

비보강 알레르겐에 의한 것과 동일한 효과를 얻기 위해 필요한 주입 횟수를 줄이기 위해 알루미늄 하이드록사이드를 사용하며, 이는 이의 축적 및 낮은 방출효과에 기인한다. 그럼에도 불구하고, 보강제는 사람뿐만 아니라 동물에 있어서도 IgE의 생산을 자극하고 전형적인 Th2 패턴을 유도하며, 투여 중에 변원성 알러지 반응을 강화시킬 수 있다는 것은 매우 널리 알려져 있다.

칼슘 포스페이느 및 티로신은 알레르겐의 축적 효과 및 낮은 방출을 위해 흡수제로서 사용되어 왔다. 그럼에도 불구하고, 치료의 효율 및 안정성 면에 있어서, 이러한 제형이 수용성 또는 알럼-보강 추출물에 비해서 중요한 장점을 지닌다는 점은 관찰되지 않았다.(Altintas DU et al. Comparison between the use of adsorbed and aqueous immunotherapy material in Dermatophagoides pteronyssinus sensitive asthmatic patients. Allergologie et Immunopathologie 1999; 27(6):309-317).

위에서 언급한 용액인 현재까지의 제형은 인간 및 동물에 있어서 완전히 효과적인 면역 조절(Th2 패턴의 억제 또는 감소 또는 Th1의 유도에서 발현됨)을 얻을 수 없었다.

알레르겐을 포함하는 리포좀의 사용은 국제공개 WO 89/10753에 개시되어 있다. 축적을 유발할 뿐만 아니라 생성물의 알레르겐성을 줄이는 리포좀은 그 지질성 및 입자성 특징으로 인해 면역 시스템에 알레르겐을 제공하는 메커니즘에 영향 을 줄수 있다(WHO Position Paper. Allergen Immunotherapy: Therapeutic Vaccines against Allergic Diseases. Geneva, January 1998). 그럼에도 불구하고, 이 접근은 임상에 넓게 적용시키지 못하는 몇가지 약점이 있다. 이 중에서, 제형의 불안정성 및 알레르겐을 리포좀에 일관적 방식으로 주입하는 기술의 부재가 있다. 보관 또는 환자에 투여 중 리포좀 제형의 불안정성은 치료의 안정성 면에서 중요한 관련이 있으며, 이는 리포좀에서 알레르겐이 방출되는 것을 조절할 수 없어서 수용액 상의 알레르겐에서와 같이 심각한 급성반응을 유발할 수 있기 때문이다. 더욱이, Th1/Th2 균형에 영향을 주거나 또는 비 병원성 또는 방어원성 패턴을 유발하는 효과적인 면역 반응을 유발한다는 결정적 증거는 아진 보고된 바 없다.

최근의 시도들은 Th1 반응의 보강제 유도체, 예를 들어 모노포스포릴 리피드 A (MLA) (미국특허 5,762,943) 및 히트 쇼크 단백질(Heat Shock Proteins; HSP; 국제공개 WO9823735에 기재되어 있으며 미코박테리움 스트레스 단백질이라고도 알려져 있음)도 사용하고 있다. MLA 즉 LPS의 독성제거 변형체는 실험적 쥐 모델에서 특성 IgE를 줄이고 IgG 레벨을 증가시키는 것으로 관찰되었다. 그럼에도 불구하고, 알러지 반응의 Th2 세포 성분을 효과적으로 줄이는 것으로 보이지는 않는다. 그러므로, 이의 용도는 타입 1 과민성 메커니즘이 주요한 것으로 천식을 배제하는 알러지 질환에 엄격히 제한되어야 한다. 다른 주요 약점은, LPS의 독성이 약화되었음에도 불구하고, 그것이 완전히 제거되지 않았다는 점이며(Baldrick P et al. Vaccine 20, 2002 737-743), 이는 유아에의 사용을 제한할 수 있다. HSP의 경우, 이러한 단백질과 혼합되거나 콘주게이트된 임상적으로 관련된 알레르겐이 동물 모 델에서도 인간 모델에서도 알레르겐-특성 Th2 응답의 편차를 유발할 수 있다는 어떠한 실험적 입증도 제시되지 않았다.

그램 음성 박테리아의 외막에서 유래한 단백질 함유 리포좀의 사용이 Ruegg CL 등(Preparation of proteosome-based vaccines. J Immunological Methods 1990;135:101-9); Lowell 등(Proteosome-Lipopeptide Vaccines: Enhancement of for Immunity Malaria CS Peptides. Science 1988;240:800-2); 및 미국특허 5,597,572에서 감염 질병에 대한 예방적 백신 제재로서의 용도가 언급되었다. 마지막의 경우에, 주요 핵심은 네이세리아 메닌지티디스 혈청그룹 B 유래 소포(OMV) 또는 단백질 함유 리포좀의 외막이다. 그 입자성 구조, OMV에 포함된 리포-올리고당류 소량(LPS); 다당류 C; 알럼 내 지질 조성물 및 흡수가 사람에 있어 입증된 면역원성 및 예방원성과 관련되어 있다.

LPS를 포함하고 있음에도, 이 백신 제재는 사람 및 동물에게 독성 효과를 일으키지 않으며, 이는 OMV의 특이한 구조 및 조성에 기인한다. 반면, LPS의 면역조절 및 보강의 효과는 유지된다.

단백질 함유 리포좀에 기초하여, 항수막구균 백신은 회수 5 억 이상 사용되고 있으며, 이는 안전하고 N. 메닌디티디스 혈청 그룹 B 및 C에 대해 방어가 효과적이라는 것을 보여준다. 더욱이, 모유 수유 기간동안에도 안전하게 적용될 수 있다. T-의존 다당류 C 항원을 T-의존 항원으로 전환할 수 있다는 것이 관찰되었다. 이 백신은 인간 및 동물의 우선적 Th1 패턴을 유발하며, 단백질 및 mRNA 레벨에서 림프구 증식; 항-OMV IgG 항체(인간의 서브클래스 IgG1 및 쥐의 IgG2a ); IFN-γ, IL-2 및 IL-12의 특징이 있다. 단백질 및 mRNA 레벨에서 항-OMV IgE을 유도하지 않으며, 총 IgE 및 IL-4, IL-5 레벨을 증가시키지 않는다(Infect Immun. 2001, 69(72001):4502-4508). 백신에 의해 유도된 응답은 후천성 면역에서 흔한 것처럼 생성물에 포함된 박테리아 항원에 특성이 있으며, 따라서 알려진 흔한 알레르겐에 대한 면역 반응의 유도에 대한 증거는 없다.

본원발명의 목적은 박테리아성 단백질 함유 리포좀의 사용에 기초하여 치료 또는 예방 목적의 약학적 조성물을 수득하는 것이다. 본원에 따른 조성물은 알러지성 질환의 환자에게 적용이 되면 알레르겐에 의해서 유도된 알러지성 Th2 응답을 세포성 Th1 응답으로 전환시킬 수 있다. 본원발명은 또한 본원에 따른 백신 조성물을 이용한 면역화 계획에 관한 것이다. 또한 본원발명의 목적은 아토피성 가족력이 있는 어린이의 알러지성 질환의 발병 및 악화를 방지할 수 있는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본원에 따른 조성물은 하나 또는 그 이상의 알레르겐을 포함할 수 있으며, 이 알레르겐은 단백질 함유 리포좀과 커플링될 수도 있으며 이와 동시에 투여될 수도 있어, 알레르겐에 특이성이 있는 치료 또는 예방 면역 응답을 유도한다. 이러한 응답은 종래의 면역치료법과 비교하여 IgE 항체의 생산의 감소, IL-5의 비유도 및 IgG1 항체 아급(subclass; 인간) 및 IgG2a(쥐), IFN-γ(인간 및 쥐)의 유도의 특징을 가지고 있다. 이러한 특징들은 Th1 타입의 면역 반응이 유도되고 알레르겐성 Th2 반응을 세포성 Th1로 전환된다는 점을 보여준다.

본원발명에 따른 또 다른 목적은 알레르겐을 단백질 함유 리포좀 또는 다른 보강제에 커플링시키는 방법 및 비경구 경로로 이를 투여하기에 적합한 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본원의 신규한 특성은 우선 그램 음성 박테리아의 외막 단백질, 특히 네이세리아 메닌지티디스 B에서 유래된 단백질 함유 리포좀을 사용하는 것이다. 이러한 단백질 함유 리포좀(단독으로 또는 다당류와 함께)은 하나 또는 그 이상의 알레르겐 단백질에 비공유 또는 공유결합으로 커플링되며, 알러지성 대상에게 투여된다.

본원의 또 다른 신규한 특징은 본원에 따른 약학 조성물이 단 2 번의 주입만으로 조성물에 포함된 알레르겐에 대한 특정 면역 응답을 비병원성(non-pathogenic) 또는 방어성(protective) Th1 페턴으로 변화되는 것을 유도한다는 점이다.

또 다른 신규한 특징은 알러지성 부모의 자녀 또는 진단 초기의 아토피성 환자에 있어서 약학 조성물의 예방적 용도이다.

또한 조성물의 주요 성분을, 특히 단백질 함유 리포좀을 알레르겐에 비공유적으로 커플링하기 위한 절차 및 이러한 목적의 정제한 알레르겐의 용도도 역시 신규하다.

본원에서는 미국특허 제5,597,572에 기재된 바와 같이, 그램 음성 박테리아 배양액에서 정제된, 특히 N. 메닌지티디스 B에서 정제된 단백질 함유 리포좀 또는 OMV가 사용된다.

다당류 알레르겐을 사용할 수도 있으나 단백질 또는 글리코프로틴의 특성을 지니는 알레르겐을 사용하는 것이 바람직하다. 알레르겐은 널리 공지된 추출법 및 정제법을 이용하여 천연 알레르겐 원료로부터 수득할 수도 있으며, 미생물 또는 고등생물 세포 내에서 클로닝하고 발현시킴으로써 재조합 형태로 수득할 수도 있다. 혹은, 천연 알레르겐의 아미노산 서열에 맞춰 화학적으로 합성한 폴리펩티드도 사용할 수 있다. 특히 첫째로, 피로글리피다에(Pyroglyphidae) 또는 글리시파기다에(Glyciphagidae) 족, 특히 데르마토파고이데스(Dermatophagoides) 또는 블로미아(Blomia) 속, 특히 데르마토파고이데스 시보네이(Dermatophagoides siboney), 데르마토파고이데스 프테로니시누스(Dermatophagoides pteronyssinus) 또는 데르마토파고이데스 파리나에(Dermatophagoides farinae) 종에 속하는 집안 먼지 진드기에서 유래한 호흡기성 알레르겐이 바람직하다. 이러한 진드기 종의 정제된 알레르겐은 바람직하게 상용의 알레르겐 추출물로부터 수득할 수 있으며, 이는 동결건조 또는 단백질 함량이 10~100 mg/mL까지 농축시키고, 50~100%의 암모늄 설페이트 용액에서 식염수 침전(saline precipitation)를 함으로써 수득할 수 있다. 펠렛은 수용액에서 제조되며, Sephacryl S-100, Sephacryl S-200, Sephacryl S-300 or Superdex 75 중 하나의 매트릭스를 사용하여 겔투과 크로마토그래피(gel-filtration chromatography)로 분액화된다. 10-60 kDa의 분자량에 해당하는 피크를 수득한다. 이러한 분액은 주로 그룹 1(25 kDa 글리코프로틴: Der s 1, Der p 1, Der f 1) 및 그룹 2(15 kDa 프로틴: Der s 2, Der p 2, Der f 2)의 주요 알레르겐을 포함한다. 또는 각 주요 알레르겐에 대해서 별도의 정제과정을 거칠 수도 있으며, 바람직하게는 안티 그룹 1 및 안티 그룹 2 군항체 친화 크로마토그래피(Mab-affinity chromatography)를 이용하고 난후 양 성분을 조성물에 첨가하여 단백질 함유 리포좀에 커플링시킬 수도 있으며 혹은 별도로 커플링시킬 수도 있다.

양 기본 성분(알레르겐 및 단백질 함유 리포좀)의 커플링은 공유 또는 비공유 링크에 의해 수행된다. 각 특정 알레르겐의 특성을 고려하여 여러 선택을 할 수 있다. 비공유 커플링에 대해서, 진드기 알레르겐은 단백질 함유 리포좀 10 ㎍에 대해서 0.1-1 ㎍의 비율로 단백질 함유 리포좀에 엠베드된다. 이러한 커플링 방법은 양 성분의 소수성 및 친지질성 상호작용의 장점이 있으며, 30~60 분 동안 60~600 rpm으로 기계적 교반시켜 수행된다. 수득된 혼합물은 수용액으로 직접 투여될 수도 있으며, 알럼 히드록사이드 겔(Alum Hydroxide gel)에 흡수시킬 수도 있다. 이 경우 알레르겐은 단백질 함유 리포좀에 커플링시키기 전에 겔에 흡수시킬 수도 있으며, 바람직하게는 단백질 함유 리포좀을 겔에 흡수시킨 후에 첨가될 수 있다. 알럼 히드록사이드의 양은 단백질 함유 리포좀의 10~25 배이어야 하며, 상기 알레르겐 및 단백질 함유 리포좀의 비율을 유지시킨다. 알럼 겔에 흡수시키는 단계는 pH 6~8 및 60~600 rpm에서 교반시켜 수행된다.

알레르겐을 알럼 겔에 흡수시키는 효율은 주요 알레르겐, 예를 들어 안티-Der s 1 ELISA (Sewer et al. Int Arch Allergy Immunol 2000;123:242-248) 및 안티-그룹 2 ELISA (Heymann PW, Chapman MD et al J Allergy Clin Immunol 1989;83:1055 -1067)에 특성화되어 있는 Mab-ELISA을 이용하여 관찰할 수 있다. 알레르겐을 단백질 함유 리포좀에 커플링시키는 단계는 크로스 링커 또는 스페이서를 이용하여 공유결합 링커로 수행될 수도 있으며 (이는 단백질 함유 리포좀 상의 아미노 그룹에 커플링될 수 있음), 그 이후에 스페이서 말레이미드 그룹을 알레르겐 분자 상의 자유 설프히드릴(SH) 그룹에 커플링시킨다. 상기 자유 SH 그룹은 진드기의 주요 알레르겐 단백질(그룹 1 및 2)에 존재하며, 그럼에도 불구하고 그러한 그룹은 디설파이드 브릿지를 감소시키거나 또는 널리 공지된 화학적 방법으로 단백질을 유도체화(derivatization)시킴으로써 다른 알레르겐에도 유도될 수 있다. 수득된 콘주게이트는 나중에 콘주게이션 리에젼트 및 비결합 알레르겐을 제거하기 위해 삼투 또는 한외여과 및 마지막으로 겔투과 크로마토그래피(Sephacryl S-300 or Superdex 200)를 이용하여 정제된다. 알레르겐 분자는 적당한 면역반응을 유도하기 위하여 콘주게이트 전체 질량의 1~10%을 구성해야 한다. 콘주게이트는 적절한 수용성 부형제에 넣어져 주사가능한 경로로 투여되거나 또는 알럼 히드록사이드 겔 또는 다른 적당한 축적 보강제(depot adjuvant)에 흡수될 수 있다.

본원발명은 또한 친지질성(lipofilic) 잔기, 예를 들어 16~20 탄소의 양극성 지방산을 단백질 함유 리포좀에 비공유적으로 포함되는 것을 용이하게 하기 위하여 이를 상기 방법으로 알레르겐에 콘주게이션시키는 것을 포함한다.

또는 백신 조성물은 유도된 세포성 패턴에 영향을 미치지 않으며 알레르겐에 대한 예상 응답을 강화시키는 다른 항원을 포함할 수 있다. 다당류 특히 N. 메닌지티데스에서 유래된 다당류 C가 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 이들은 단백질 함유 리포좀의 0.5~4배의 비율로 조성물에 비공유결합의 형태로 첨가될 수 있다.

본원발명은 또한 다당류 특성을 가지는 알레르겐, 예를 들어 몇몇의 꽃가루 및 식물성 음식 알레르겐 근원지에서 발견되는 교차반응성 탄수화물 결정인자(Cross-reactive Carbohydrate Determinants; CCD)의 용도를 포함한다(Aalberse, RC. Crossreactivity of IgE antibodies to allergens. Allergy 56 (6), 2001, pp478-490). 이러한 경우에 알레르겐은 N. 메닌지티디스 다당류 C에 대해서 기술된 것과 동일한 방법으로 조성물에 첨가될 수 있다.

비예측적으로, 이러한 백신 조성물을 단 2회 비경구의 경로로 투여하는 경우, 종래 공지된 바의 단백질 함유 리포좀 항원에 대한 Th1 반응뿐만 아니라 조성물에 포함된 알레르겐에 대해 유사한 Th1 응답을 보인다. 놀랍게도 조성물 내에 알럼 히드록사이드를 사용함에도 불구하고 이러한 Th1 응답은 우세하여 축적 효과(depot effect)를 유지한다. 이러한 응답은 높은 수치의 IFN-γ를 가지는 사이토킨 패턴(cytokine patter) 및 IL-5의 비유도의 특징을 가지고 있으며, 또한 알레르겐-특성IgG2a 항체의 유도 및 쥐 내의 IgE 및 IgG1 항체의 감소의 특징을 가지고 있다. 본원에 따른 조성물을 투여하는 경우 그 이전의 면역화에 의해 유도되었던 박테리아 항원에 대해 미리 존재하였던 응답에 대해서는 영향을 미치지 않는다.

제안된 해결책은 다음의 장점을 지니고 있음:

본원의 조성물에 의해서 유도된 면역학적 효과는 상호작용을 하며, 즉 과민(anaphylactic) 타입 I 과민(hypersensitivity) 응답(IgE 및 IgG1의 감소), 및 지연(delayed) 타입 염증 및 만성 알러지 반응(IL-5 감소), 이는 천식의 치료에 효과적이다. 이러한 치료 효과는 알레르겐을 면역 시스템에 비알레르겐성 콘텍스트(a non-allergenic context)로 제공함에 기인하며, 종래 알레르겐 추출물에 의한 면역 치료와 비교하여 단축된 투여 횟수 및 시간에 의해서도 얻을 수 있다. 이러한 효과는 알러지 질환을 치료하기 위해서만 사용되는 것이 아니라, 초기 알러지 상태의 환자의 질병이 발전하는 것을 막고 다른 알레르겐에 대한 새로운 알러지성 민감을 방지하기 위해서도 사용될 수 있다.

면역 조절제 보강제로서 단백질 함유 리포좀의 면역학적 효과는 모유 수유 기간동안 초기 몇 달 동안은 효과가 있으며 안전하다. 질병이 발생하고 발전하기 전에 예방적 목적으로 상기 나이의 어린이에게 백신을 투여할 수 있다. 알러지 질환의 가족력이 있고 그럴 가능성이 높은 어린이의 경우에 매우 유용하다.

축적 보강제(depot adjuvant), 특히 알루미늄 하이드록 사이드에 활성성분을 흡수시키게 되면 수용성 알레르겐과 비교하여 10 배 이상 제재의 알레르겐성(즉, IgE 결합 능력)이 감소한다. 이것은 투여 기간동안 심각한 급성 반응이 크게 감소함을 의미한다. 또한, 겔에 흡수시키는 경우 활성성분의 분해를 유발할 수 있는화학반응의 속도를 감소시켜 제재의 유통기간을 연장시킬 수도 있다.

정제된 알레르겐 및 특히 데르마토파고이데스(Dermatophagoides) 종의 정제된 진드기 알레르겐은, 그룹 1 및 2의 알레르겐을 포함하여, 제품 조성의 표준화를 용이하게 한다. 제재 내의 알레르겐의 함량을 결정하고 정확히 조절하고 단백질 함유 리포좀에 커플링하거나 알루미늄 하이드록사이드 겔에 흡수시키는 효율을 산정하는 것이 가능하다. 또한, 공유결합 커플링의 경우 양 성분 간의 분자량의 큰 차이로 인해, 원하지 않은 부산물 (예를 들어 알레르겐-알레르겐 중합체)를 활성성분(단백질 함유 리포좀-알레르겐 콘주게이트)으로부터 쉽게 분리할 수 있다. 이러 한 분리는 상용으로 구입할 수 있는 크기별 배제 크로마토그래피(size-exclusion chromatography)를 이용하여 수행할 수 있다. 상이한 특성을 가지는 알레르겐에 기술을 적용할 수 있으며, 동일한 제재에 여러 알레르겐을 사용할 수 있다.

또 다른 장점은 다른 한편으로 면역학적 효과를 보유하는 소량의 LPS를 포함하고 있음에도 불구하고 제품 독성이 낮다는 점이다. 이는 인간 및 특히 어린이에게 안전하게 투여할 수 있도록 한다.

단백질 함유 리포좀은 또한 T-독립 항원, 예를 들어 탄화수소를 T-의존 항원으로 변화시킨다. 이러한 특성은 다당류의 특성을 가지는 알레르겐, 예를 들어 CCD에 유용하게 적용될 수 있다.

도 1: 도 1은 단기 계획(0-14 일)이 장기 계획(0-28 일)에 비해서 낮은 총 IgE를 유도한다는 점을 보여준다. 면역화 후 단기 계획의 경우 0, 15, 35 일 후에, 장기 계획의 경우 0, 28, 35 일 후에 출혈. Va, 단백질 함유 리포좀 + 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis) 혈청그룹 C 유래 다당류 + Al(OH)3 A, 알레르겐; Al, Al(OH)3. 알레르겐 양: 1 및 5 ㎍/쥐. IgE 반응은 두 번째 투여 후에 5 ㎍으로 장기 계획을 이용하여 면역화한 경우가 단기 계획을 이용한 경우보다 높게 관찰되었다. 사실, 단기 계획의 경우 동일한 농도를 가지는 그룹의 2차 반응은 감소하는 경향을 보인다.

도 2: 알레르겐의 농도가 어떻게 총 IgE의 낮은 유도를 발생시키는지 보여준다. 면역화 후 0, 15, 35 일에 출혈. Va, 단백질 함유 리포좀 + 네이세리아 메닌지티디스 혈청그룹 C 유래 다당류 + Al(OH)3 A, 알레르겐; Al, Al(OH)3 알레르겐 did: 0.5; 1.25 및 2.5 ㎍/쥐. 0.5 ㎍ 알레르겐 양에 의한 총 IgE의 유도가 보강제 콘트롤(Va)에 유사함을 알 수 있다. 다른 두개의 알레르겐 농도(1.25 및 2.5)는 총 IgE의 레벨을 증가시킨다.

도 3: 알레르겐 양의 포함이 어떻게 단백질 함유 리포좀-특성 IgG 반응에 영향을 미치지 않는지 보여준다. 면역화 후 0, 15 및 35 일에 출혈. Va, 단백질 함유 리포좀 + 네이세이아 메닌지티디스 혈청 그룹 C 유래 다당류 + Al(OH)3 Al, 알레르겐; A, Al (OH)3 알레르겐 양: 0.5; 1.25 and 2.5 ㎍/쥐. 알레르겐을 백신 조성물에 포함시켜도 단백질 함유 리포좀 항원에 대한 IgG 반응에는 영향을 미치지 않으며, 알레르겐 없이 보강제 혼합물만 투여한 경우(Va)와 비교해서 1차 및 2차 투여의 경우에도 마찬가지라는 점을 보여준다.

도 4: 알레르겐을 포함시켜도 단백질 함유 리포좀-특성 IgG 서브클래스 반응에 영향을 미치지 않는다는 점을 보여준다. 면역화 후 0, 15, 35 후에 출혈. Va, 단백질 함유 리포좀 + 네이세리아 메닌지티디스 혈청 그룹 C 유래 다당류 + Al(OH)3 Al, 알레르겐; A, Al (OH)3 알레르겐 양: 0.5; 1.25 및 2.5 ㎍/쥐. 알레르겐을 포함하는 백신 조성물로 면역화 하는 경우 보강제 혼합물만에 의한 경우(Va)에 비하여 단백질 포함 리포좀-특성 IgG 서브클래스 패턴을 변화시키지 않고 유지한다는 점을 관찰할 수 있다.

도 5: 낮은 알레르겐 농도에 의해서도 어떻게 알레르겐-특성 IgG2a 항체가 유도되는지 보여준다. 면역화 0, 15, 35 일 후에 출혈. Va, 단백질 함유 리포좀 + 네이세리아 메닌지티디스 혈청 그룹 C 유래 다당류 + Al(OH)3 Al, 알레르겐; A, Al (OH)3 알레르겐 양: 0.5; 1.25 및 2.5 ㎍/쥐. 가장 낮은 두개의 알레르겐 농도(0.5 및 1.25) IgG2a 응답을 유도하였다.

도 6: 단백질 함유 리포좀-유도 IFN-γ 생산의 결정에 관한 것이다. 지라 세포는 2차 면역화(2 주) 7일 후에 추출되었다. Va: 단백질 함유 리포좀 + 네이세리아 메닌지티디스 혈청 그룹 C 유래 다당류 + Al(OH)3 Al: 알레르겐; A: Al (OH)3. 알레르겐 양: 0.5; 1.25 및 2.5 ㎍/쥐. 1Va+Va-A0,5: Va의 1차 주입 및 Va + Va + 0.5 ㎍ 알레르겐의 2차 투여량. 가장 낮은 알레르겐 농도가 단백질 함유 리포좀-유도 IFN-γ 생산을 증가시킨다.

도 7: 알레르겐-유도 IFN-γ의 결정 및 보강제의 종전 양이 영향이 없다는 점에 관한 것이다. 지라 세포는 2차 면역(2 주) 7일 후에 추출되었다. Va: 단백질 함유 리포좀 + 네이세리아 메닌지티디스 혈청 그룹 C 유래 다당류 + Al(OH)3 Al: 알레르겐; A: Al (OH)3. 알레르겐 양: 0.5; 1.25 및 2.5 ㎍/쥐. 1Va+Va-A0,5: Va의 초기 투여 및 2차 투여량 Va + 0.5 ㎍ 알레르겐. 알레르겐-유도 IFN-γ 생산은 모든 알레르겐 농도에 대해서 관찰되었고, 가장 낮은 농도에서 높게 나타났다. 보강체 혼합물의 예전의 투여는 응답에 영향을 미치지 않았다.

도 8: 가장 낮은 알레르겐 양은 백신 조성물 및 알럼 하이드록사이드 간에 큰 차이의 알레르겐-특성 IgG 응답을 유도한다. 혈청은 2차 투여 14 일 후에 추출되었다. 0, 27일에 투여되었다. Va: 단백질 함유 리포좀 + 네이세리아 메닌지티디스 혈청 그룹 C 유래 다당류 + Al(OH)3 Al: 알레르겐; A: Al (OH)3. 알레르겐 양: 0.5; 1.25 및 2.5 ㎍/쥐. 가장 적은 양(0.5 및 1.25)가 가장 많은 양보다 더 증가된 알레르겐-특성 IgG 반응을 유도하였다.

도 9: It is referred to the induction of 알레르겐-특성 IgG2a의 유도에 관한 것이다. 혈청은 2차 투여 14일 후에 추출되었다. 0, 27일에 투여되었다. Va: 단백질 함유 리포좀 + 네이세리아 메닌지티디스 혈청 그룹 C 유래 다당류 + Al(OH)3 Al: 알레르겐; A: Al (OH)3. 알레르겐 양: 0.5; 1.25 및 2.5 ㎍/쥐. Va를 포함하는 모든 변형체가 단지 알럼-흡수 알레르겐만을 포함한 변형체와 비교하였을 때 큰 알레르겐-특성 IgG2a 응답을 유도하였음을 관찰하였다.

도 10: 수동적 피부 아나필락시스(passive cutaneous anaphylaxis)로 측정하였을 때, 포지티브 콘트롤(그룹 III 및 IV)와 비교하였을 때, 백신 조성물(그룹 V~VII)가 알레르겐-특성 IgE를 감소시키는 것으로 관찰되었다. Va: 단백질 함유 리포좀 + 네이세리아 메닌지티디스 혈청 그룹 C 유래 다당류 + Al(OH)3 Al: 알레르겐; A: Al (OH)3. 혈청은 0 (To), 2차 투여일(T15), 2차 투여일로부터 14일 후(T35)에 추출되었다. 그룹(V-VII)의 반응은 알럼-흡수 알라르겐에 의해 면역화된 그룹(III and IV)보다 낮았다. 네거티브 콘트롤(I and II)에서는 반응이 관찰되지 않았다.

기호: -, 부존재; +, 존재; A, 알레르겐; Va, 단백질 함유 리포좀 + 네이세리아 메닌지티디스 혈청 그룹 C 유래 다당류 + 알루미늄 하이드록사이드; A, 알루미늄 하이드록사이드.

도 11: 알레르겐-단백질 함유 리포좀 콘주게이트에 대한 알레르겐-특성 항체 반응에 관한 것이다. 쥐는 2 회의 5㎍의 Der s 1로 상이한 변형체 내에서: Ds (free 알레르겐); Ds-PLS (단백질 함유 리포좀에의 콘주게이트); [Ds-PLS]Alum (알루미늄 하이드록사이드에 흡수된 콘주게이트) 면역화되었다. 1차 면역화 8 주 후 응답이 평가되었다. 수직 막대는 표준편차를 의미한다.

본원발명은 하기의 실시예에 의해서 구체적으로 설명되며, 이에 의해서 한정되지 않는다.

실시예 1. 진드기 알레르겐의 수득 및 정제

알레르겐은 전체 진드기 배양액으로부터 수득하였고, 이는 죽은 진드기, 박편(scales) 및 분비물(fescal particles)뿐만 아니라 낮은 분자량의 배약 매개 성분을 포함하고 있다. 알레르겐은 다음 용액 중 하나에서 추출되었다: 암모늄 바이카보네이트, 소듐 바이카보네이트, 포스페이트 버퍼 식염수 또는 식염수 (생리수와 비슷한 pH를 가짐). 원료 추출액은 원심분리 및 여과로 세척되었으며, 저분자량 성분은 겔여과 크로마토그래피(Sephadex G-25) 또는 삼투여과(diafiltration; cutoff value: 5-10 kD) 또는 상기 2가지에 의해서 제거되었다. 그리고 나서, 수득된 물질은 안정성을 보장하기 위해서 한외여과 또는 동결건조에 의해서 농축되었다. 알레르겐을 추가적으로 정제하기 위하여, 동결건조된 추출물을 수용액 상에 재현탁시키고, 암모늄 설페이트 용액에서 염석(salting-out precipitation)시켰다. 펠렛은 물에서 다시 재현탁시키고 Superdex 75을 이용하여 겔여과 크로마토그래피법으로 분액화하였다. 10-60 kDa 분자량 범위에 해당하는 중간 피크(intermediate peak)을 얻었다. 이 분액은 주로 그룹 1(25 kDa) 및 그룹 2(15 kDa) 주 알레르겐을 포함한다. 마지막으로, 수득된 분액은 단백질 함유 리포좀에 커플링 되기 적절한 농도에서 재구성되기 위해 동결건조되었다.

실시예 2.단백질 함유 리포좀의 수득

N. 메닌지티디스 B(N. meningitidis B) 배양액에서 출발하였다. 생물량(biomass)은 원심분리에 의해서 얻어졌으며, 계면활성제(detergent), 효소 및 울트라소닉 처리에 의한 추출공정을 하였다. 세포 잔해(cellular debris)는 원심분리에 의해서 제거되었고 부유물은 핵산 제거를 위하여 핵산 가수분해 효소 공정을 거쳤다. 추출물은 울트라 원심분리에 의해서 회수되었고, 계면활성제 용액에서 재현탁되었고, 분자 배제 크로마토그래피를 이용하여 저분자 및 중분자 성분을 제거함으로써 정제하였다. 그리고 나서 수득한 단백질 함유 리포좀은 자유 형태가 아닌 그 구조에 엠베드된(embeded) 형태의 10% 미만의 핵산 및 약 10%의 LPS를 함유한다. 혹은, Optionally, the capsular polysaccharide, obtained from N. meningitides serogroup C according to Gold and Gotschlich(Gold et al., 1969-1970, WHO Bull. 45: 279-282 and Gotschlich et al., 1969, J. Exp. Med. 129: 1349-1365)에 따라서 N. 메닌지티데스 혈청그룹 C로부터 수득한 캡슐모양의 다당류를 단백질 함유 리포좀 함량의 0.5~4의 비율로 첨가한다. 또는, 단백질 함유 리포좀 함량의 10~25배의 비율로 추가 보강제로서 알럼 하이드록사이드를 첨가할 수 있다. 최종 pH 값은 7,0 ± 0,4로 유지한다. 알럼 겔에 단백질 함유 리포좀-다당류 복합체가 흡수되는 것은 80% 이상이며, LPS 함량은 6% 미만으로 보장한다. LPS는 단백질 함유 리포좀에 엠베드되며, 이는 면역 시스템이 가능하게 하며, 원하지 않은 독성 반응을 감소시킨다. 티메로살(thiomersal)을 보존제로 최종 농도 0.005~0.02%로 추가할 수 있다. 최종 제품은 여러 생물적 및 물리화학적 품질 관리 검사를 할 수 있다.

실시예 3. 알루미늄 하이드록사이드에 흡수된 제재의 알러지성(IgE 결합활성) 측정

인간 IgE 항원의 결합력으로 표현된 알러지 활성은 IgE-억제 ELISA를 통해서 측정하였다. 이러한 검사는 고체 상태 코팅 알레르겐에 IgE 결합을 억제하는 샘플 용액의 능력을 측정한다. 이러한 경우, 샘플 제재는 실시예 1에 의해서 D. 시보니(D. siboney) 정제 알레르겐을 실시예 2에 의해서 수득한 단백질 함유 리포좀과 혼합하여 알루미늄 하이드록사이드 겔에 흡수시킨다. 초기 Der s 1 알레르겐 농도는 4 ㎍/mL이며, 알레르겐 활성: 400 BU/mL (BU: Nordic Guidelines for the Registration of allergenic Products, 2nd Edition의 정의에 따른 생물학적 단위. 10 000 BU/mL는 스킨 프릭 테스트(Skin Prick Test)에 의한 10 mg/mL 히스타민HCl과 동등하다).

ELISA는 다음의 절차에 의해 수행된다. 폴리스티렌 마이크로플레이트는 레퍼런스 알레르겐 추출물로 코팅된다. 비-특성(non-specific) 결합 부위는 PBS-BSA 1%로 차단된다. 다음으로, 혈청을 증가하는 양의 알레르겐 샘플 및 레퍼런스로 평행하게(in parallel) 인큐베이팅 시켜 IgE 혈청 풀의 억제가 수행된다. 비-억제 IgE는 플레이트에 코팅된 알레르겐에 의해서 캡처된다. 비-특성적으로 결합된 항체를 세척하고 나서, 알레르겐에 결합된 IgE의 검출이 수행되고, 퍼록시다제 라벨 이 붙은 항-IgE MAb을 첨가한다. 적절한 특수발색 기질(chromogenic substrate)을 첨가하고 나서, 반응 생성물의 색농도를 ELISA 플레이트 리더를 이용하여 측정한다. 평행선 통계법(parallel lines statistical method)이 결과 분석 및 해석에 사용된다. 레퍼런스 및 샘플 억제 커브를 얻어 선형회귀분석(linear regression analysis)이 수행되어 각 샘플 라인 및 레퍼런스 라인의 평행성을 확인하였다. 마지막으로, 상대적인 효능(potency)는 평행성 간의 수평 거리의 인버스 로그 값으로 계산하였다.

주어진 샘플의 분석에서 얻어진 결과는 다음과 같다. 알레르겐 활성: 21.2 BU/mL (IC95% 13.6 - 32.4). 이 값은 수용액에서 알레르겐의 초기 활성의 5.3%를 나타낸다.

실시예 4. 총 IgE의 유도가 낮은 계획(scheme) 및 투여량(dosage)의 결정

면역화 계획(투여 간격) 및 알레르겐의 농도를 결정함에 있어서, Balb/c 쥐는 두가지 면역화에 의해서 근육 내 경로서 다음과 같이 투여되었다: 0 및 2주(단기) 또는 0 및 4 (장기)에 알레르겐(Al) + 알럼(A) 농도가 1 또는 5 ㎍/쥐 Der s 1. 동물들은 단기 계획에서 0, 2 및 5 주에서, 장기 계획에서는 0, 4 및 7 주에서 출혈이 발생하였다. 혈청 풀에서 총 IgE 레벨은 ELISA를 이용하여 결정하였다.

도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, 단기 계획은 장기 계획에 비하여 매우 적은 IgE 반응을 유도한다. 반면, 낮은 알레르겐 농도(1㎍)에서는 모든 계획에 있어서 IgE를 유도하지 못하였다. 이러한 이유로, 다음의 실험이 단기 계획 및 알레르겐 투여량이 1㎍/쥐로 수행되었다.

투여량을 좀 더 정확히 결정하기 위하여, Balb/c 쥐에 0 및 2 주에 두 번의 면역화를 근육 내 경로로 투여하였으며, 0 및 4주에 출혈이 발생하였다. 그룹 I은 단백질 함유 리포좀 + 혈청 그룹 C N. 메닌지티디스 다당류 + Al(OH)3를 투여받았다. 그룹 II, III 및 IV는Al(OH)3 + 알레르겐을 다음의 양으로 투여받았다: 0,5; 1,25 또는 2,5 ㎍/쥐. 혈청 풀에서의 총 IgE 레벨은 ELISA에 의해서 결정하였다. 도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, EgE는 관찰된 어느 그룹에서도 증가하는 것을 볼 수 없었다.

실시예 5. 단백질 함유 리포좀-특성 반응에 대한 알레르겐의 무영향(no effect) 및 알레르겐-특성 IgG 서브클래스 반응의 조절

단백질 함유 리포좀 항원에 관한 응답에 대한 알레르겐의 영향을 결정하기 위하여, Balb/c 쥐가 0 및 2 주에 두 번의 면역화를 근육 내 경로에 의하여 결정하였다. 그룹 I은 단백질 함유 리포좀 + 다당류 C + Al(OH)3 (Va)을 받았다. 그룹 II, III 및 IV은 0,5; 1,25 및 2,5 ㎍ /쥐의 알레르겐 + Va를 각각 받았다. 출혈은 처음 면역화 0, 15, 35일 후에 발생하였다. 단백질 함유 리포좀 및 알레르겐-특성 IgG 서브클래스 응답을 ELISA에 의해서 결정하였다.

도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 높은 IgG 항-단백질 함유 리포좀 티터(titters)가 관찰되었고, 놀랍게도 알레르겐이 포함됨에 따른 아무런 효과를 관찰할 수 없었다. IgG 서브 반응에서도 아무런 효과를 관찰할 수 없었다(도 4). 높은 IgG2a 티터는 이 보강제에 의해서 유도되는 우선적 Th1 반응(preferential Th1 response)의 표현이다. 도 5는 상이한 알레르겐-특성 IgG 서브 클래스의 자극을 보여준다. 낮은 알레르겐 농도, 특히 1.25 및 0.5 ㎍에서 IgG2a 수치의 증가를 관찰할 수 있다. 알레르겐에 대한 IgG2a 반응의 유도는 보강제가 Th1에 대한 Th2 반응을 조절할 수 있다는 점을 반영한다.

실시예 6. 면역화된 쥐의 지라 세포에 의한 IFN-γ의 생산 및 IL-5의 비생산, 단백질 함유 리포좀 알레르겐으로 in vitro 면역성 검사. 알레르겐-특성 IgG 서브클래스 응답과 사이토킨의 생산과의 관계. 보강제 제재 간의 비교: 단백질 함유 리포좀 + 다당류 C + Al(OH)3 및 Al(OH)3 단독.

Th1(IFN-γ) 및 Th2(IL-5) 사이토킨의 응답을 결정하기 위하여, Balb/c 쥐에 대해서 0 및 2 주에 2회의 면역화를 하였다. 그룹 I은 단백질 함유 리포좀 + 다당류 C + Al(OH)3(Va)를 받았다. 그룹 II, III 및 IV은 각각 0.5; 1.25 및 2.5 ㎍/쥐의 알레르겐 + Va를 받았다. 그룹 V은 초기량 Va 및 2차 투여량 0.5 ㎍ 알레르겐 + Va을 투여받았다. 동물은 최종 투여 7일 후 희생되었다. 지라는 제거되었고 통상적 기술에 의해서 처리되었으며, 세포는 단백질 함유 리포좀 또는 알레르겐 존재 하에서 배양되었다. 72 시간 후에, 배양 부유물은 모아서 IFN-γ 및 IL-5의 결정을 위하여 ELISA로 처리되었다.

세포 배양액의 단백질 함유 리포좀 면역성 검사(challenge)는 모든 그룹에 있어서 IFN- γ 생산을 유도하였으며, 이는 이 보강제에 의한 Th1 패턴과 부합한다. 그러나, 0.5 ㎍의 알레르겐에 의해서 면역화된 그룹에 있어서는 두 알레르겐 주입이 투여되었거나(그룹 II) 또는 Va의 전 투여량 또는 하나의 알레르겐 주입이 사용되었을 때(그룹 V, 도 6) IFN-γ 생산이 크게 강화되었다. 놀랍게도, 알레르 겐 면역성 검사는 IFN- γ 응답을 모든 그룹에 대해서 유도하였다. 비예측적으로, 이러한 반응은 양 변형체에 대해서 0.5 ㎍의 알레르겐으로 면역화시킨 그룹에서 크게 관찰되었다: 알레르겐 2회 주입 또는 Va으로 투여하고 한번의 알레르겐 주입(도 7). IL-5 응답은 단백질 함유 리포좀 또는 알레르겐 면역성 검사에서는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 알레르겐-유도 Th2 패턴 보강제에 의해서 Th1 패턴으로 전환을 반영한다.

알레르겐-특성 IgG 및 IgG 서브클래스 항체를 결정하기 위하여, 다른 유사한 실험을 수행하였다. 쥐를 위에서 언급한 바와 같이 다만 Al(OH)3에 흡수된 알레르겐만을 사용하여 면역화시켰다. 출혈은 1차 면역 0, 15 및 35 후에 발생하였다. 혈청 IgG 응답은 ELISA를 이용하여 측정하였다. 알레르겐-특성 IgG 응답은 Al(OH)3과 비교하여 Va 보강제를 사용하였을 때 매우 높았다. 놀랍게도, 양 보강제 간의 차이는 가장 낮은 알레르겐 양: 0.5 및 1,25 ㎍일 때 가장 높게 나타났다. 그러나, 가장 높은 알레르겐-특성 IgG 응답은 양 보강제에 대해서 가장 높은 알레르겐을 사용하였을 때 얻을 수 있었다(도 8). 가장 우세한 IgG 서브클래스는 모든 보강제 및 콤비네이션에 대해서 IgG1이었다. 그러나, IgG2a 서브클래스는 Va를 포함하는 모든 조성물에서 유도되었으며, 여기서 가장 높은 알레르겐 양(2.5 및 1.25 ㎍)에서 Al(OH)3일 때 단지 약간 양의 값을 얻을 수 있었다. 반면, 놀랍게도 양 보강제 간에 IgG2a 응답과 관련한 가장 큰 차이는 가장 낮은 알레르겐 양(0.5 ㎍)의 경우에 관찰되었다. 이 경우에, 값은Al(OH)3의 경우에 음의 값을, Va의 경우에 양의 값을 보였다(도 9).

실시예 7. 알레르겐-특성 IgE의 유도 및 관능성(functionality)의 결정.

알레르겐-특성 IgE 반응을 결정하기 위하여, Balb/c 쥐를 0 및 2 주에 2회 면역화시켰다. 그룹 I은 Al(OH)3을 받았고, 그룹 II는 단백질 함유 리포좀 + 다당류 C + Al(OH)3 (Va)를 받았으며, 그룹 III 및 IV는 1 및 5 ㎍의 알레르겐 + Al(OH)3을 각각 받았다. 그룹 V 및 VI는 0,5; 1,25 및 2,5 ㎍의 알레르겐 + Va을 받았다. 동물들은 1차 면역 0, 15, 35 후에 출혈이 발생하였다. IgE 응답은 수동적 피부 아나필락시스(Passive Cutaneous Anaphylaxis; PCA)를 이용하여 숫 위스타 래트(male Wistar rats)에 대해서 정성적 및 세미-정량적으로 평가하였다. 응답의 변수는 시간 및 혈청 희석액으로 표현되었으며, 이는 양의 값이며, 스팟 밀도 임의 단위로 되었다.

혈청은 0일(To), 2차 투여 시(T15) 및 2차 투여 14일 후에(T35) 추출되었다. 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이(PCA 상에서 반응 스팟의 강도 및 최종 양성 혈청 희석액), 그룹 V~VII(백신 조성물이 사용되었을 때)에 대한 최종 양성 희석액은 그룹 III 및 IV(알럼)의 경우보다 낮았다. 광학적 밀도에 대해서도 동일하게 관찰되었다. 이는 알레르겐-특성 IgE 응답의 중요한 감소를 나타낸다. 네거티브 콘트롤(I 및 II)에 대해서는 응답이 관찰되지 않았다.

네거티브 콘트롤 그룹(I 및 II)의 경우에, 응답값은 음성이었다. 그룹 III의 경우 양성값이 10660의 강도로 35일에 관찰되었으며, 이는 1:16 희석액까지 관찰가능하였다. 그룹 IV은 1 회(15 일)에서부터 강도9345로 양성이었으며, 1:8 희석액까지 관찰가능하였다. 35 일에 강도 39843의 강력한 응답이 1:32의 희석액까 지 관찰가능하였다. 반면, 놀랍게도 Va가 투여된 그룹에 있어서는 알레르겐-특성 IgE 응답이 매우 낮았으며, 35일에 매우 낮은 강도 및 매우 낮은 희석액에서만 관찰할 수 있었다. 가장 낮은 알레르겐 양(0,5 ㎍)을 사용하였을 때, 희석되지 않은 혈청(1:1)의 경우 약한 응답만이 관찰되었으며 1:2로 희석되었을 때 사라졌다(도 10 및 표 1). Va 보강제를 사용하고 가장 낮은 알레르겐 양을 사용한 경우 Al(OH)3와 비교하여 낮은 IgE 유도를 보여주는 이러한 결과는, 앞서의 실시예에서 총 IgE가 낮고 IFN-γ 및 IgG2a가 높게 나타난 결과와 부합한다.

표 1

그룹	면역화	양성, 2차 투여 후 일수	스팟 밀도 (임의 단위)	양성 최종 희석액
I	Al	-	0	-
II	P + PC + Al (Va)	-	0	-
III	1 ㎍ A + Al	35	10660	1:16
IV	5 ㎍ A + Al	15 * 35	9345 39843	1:8 1:32
V	0,5 ㎍ A + Va	35	1245	1:1
VI	1,25 ㎍ A + Va	35	4054	1:4
VII	2,5 ㎍ A + Va	35	4574	1:8

기호: Al, Al(OH)3 P, 단백질 함유 리포좀; PC, N. 메닌지티디스 혈청 그룹 C의 다당류 C; Al, 알레르겐 및 (*) 1차 투여 후 일수

실시예 8. 단백질 함유 리포좀에 알레르겐의 공유 커플링

화학적 콘주게이션에 의한 공유 커플링은 공지의 방법, 예를 들어 미국특허번호 4.695.694 및 미국출원번호 362,179; 555,558; 555,974; 555,966 및 555,339에 개시된 방법에 의해서 수행될 수 있다. 바람직한 방법은 동질 이가 관능성 시약(homobifuntional reagents), 예를 들어 글루타르알데히드(Glutaraldehyde) 또는 무수 숙신산(Succinic Anhydride)과 같이 자유 아미노 그룹으로 두 분자를 커플링 하는 것을 사용하는 것이다. 이러한 자유 아미노 그룹은 알레르겐 단백질 및 알레르겐 단백질 함유 리포좀, 특히 리신 잔기에서 발견할 수 있다. 또한, 이질 이가 관능성 시약(heterofuntional reagents), 바람직하게는 N-하이드록시숙신이미드-말레이미드 에스테르(예를 들어 MMBS, MPS, SMPB, GMBS, EMCS)를 사용한다. 이 경우 반응은 우선 크로스 링커를 단백질 함유 리포좀 상의 아미노 그룹에 커플링 시키고, 크로스 링커 말레이미드 그룹을 알레르겐 분자 상의 자유 설프히드릴 그룹에 커플링함으로써 수행된다. 글루타르알데히드 방법을 이용하여 데르마토파고이데스 시보니(Dermatophagoides siboney) 정제된 알레르겐을 to 단백질 함유 리포좀에 콘주게이션시키는 하나의 예 및 쥐에 있어서 면역화를 통해서 유도된 반응의 하나의 예는 다음과 같다.

콘주게이션: 실시예 1에 따라서 정제된 알레르겐 단백질을 200 ㎍/mL의 pH 7.0의 단백질 함유 리포좀 PBS 용액에 첨가하여, 최종 알레르겐 농도가 20 ㎍/mL되었다. 1 부피의 글루타르알데히드 0,4 %를 첨가하고, 1 시간동안 교반하였다. 반응은 25 mol/L의 리신(최종농도)를 첨가하여 중단시켰으며, pH를 7.0~7.8로 조절하였다. 미결합 글루타르알데히드는 Sephadex G25 컬럼에서 겔여과에 의해서 제거하였다. 잔류하는 자유 알레르겐을 제거하려고 콘주게이트를 추가적으로 정제하기 위하여, 생성물을 소듐 데옥시콜레이트 계면활성제(Sodium Deoxycholate detergent)를 최종 농도 1%까지 첨가하고 난 후 Sephacryl S-300 크로마토그래피 컬럼을 통과시켰다. 첫 번째 피크를 얻었으며, 이는 매트릭스 배제 부피(exclusion volume)에 해당한다. 그리고 나서 계면활성제는 PBS에 대해서 투석함 으로써 제거하였다. 수득한 생성물은 10 000 KDa 컷오프값을 가지는 막 울트라여과 (Amicon, USA)에 의해서 10 농축되었다. 콘주게이트 내의 Der s 1 함량은 샌드위치 ELISA에 의해서 알레르겐-특성 모노클로날 항체를 이용하여 측정되었다. PBS로 희석함으로써 농도는 흡수 과정에 적합한 값(10 ㎍/mL)으로 조절되었다. 마지막으로, 생성물은 0.2 ㎛ 막여과로 스테릴라이즈되었다(sterilized).

흡수 과정: 동일한 부피의 알루미늄 하이드록사이드 1.2 mg/mL 및 콘주게이트된 알레르겐 용액 10 ㎍/mL을 PBS pH 7.0에서 혼합하였다. 혼합물은 200 rpm에서 30 분 동안 서서히 교반하였다. 알루미늄 겔 내에 단백질이 흡수되는 것은 280 nm에서 부유물질의 흡광도를 모니터링함으로써 관찰하였고, 90 % 이상이 되도록 유지하였다.

면역화: 3 그룹의 Balb/C 쥐(각 7 마리의 쥐)가 알레르겐 in PBS solution용액 ("Ds"), 또는 PBS 내의 알레르겐-단백질 함유 리포좀 콘주게이트("PLS-Ds"), 또는 알루미늄 하이드록사이드 내의 알레르겐-단백질 함유 리포좀 콘주게이트에서 각각 2회의 면역화를 받았다. Der s 1 알레르겐 농도는 모든 변형체에 대해서 5 ㎍/mL이었다. 주입은 복강 내(intraperitoneal) 경로로 0 및 4주에 투여되었다. 쥐는 실험 시작 및 4 및 8주에 출혈이 발생하였다.

결과: 총 IgE 및 알레르겐-특성 IgG 뿐만 아니라 IgG1, IgG2a 및 IgG2b 서브클래스 혈청 항체가 ELISA에 의해서 결정되었다. 또한, 알레르겐-특성 IgE 응답이 PCA 방법을 이용하여 쥐스타르 래트에서 결정되었다. 항체 응답에 관한 결과는 도 11에 나타내었다. 일반적으로 콘주게이트를 포함하는 변형체는 IgG 응답을 알레르겐 단독에 의한 경우보다 높게 유도한다. 이는 IgG 서브클래스: IgG1, IgG2a 및 IgG2b에게 적용된다. 그러나, 총 IgE 응답은 PBS 용액 내의 콘주게이트 함유 변형체의 경우(즉, 알럼 하이드록사이드가 없는 경우)보다 낮다. 또한, PCA 결과는 이러한 변형체가 여하의 검출가능한 (네거티브 콘트롤보다 높은) 알레르겐-특성 응답을 유도하지 않는다는 것을 보여주고 있으며, 여기서 자유 알레르겐 및 알루미늄 겔에 흡수된 콘주게이트는 각각 1:1 및 1:10 희석액에서 관찰가능한 응답을 유도하였다.

실시예 9.몇 가지 알레르겐을 포함하는 제재

하나의 백신 조성물 내에 상이한 알레르겐의 제재는 실시예 8에 따라 공유 커플링에 의해서 또는 비공유 커플링에 의해서(혼합 및 알루미늄 하이드록사이드 겔에 흡수시킴으로써) 수행된다. 그러한 경우, 각 알레르겐은 단백질 함유 리포좀에 분리되어 콘주게이트되며, 마지막으로 함께 제재화된다. 본 실시예에서는 열대 지역에서 흔하게 찾아볼 수 있는 상이한 진드기 종(Dermatophagoides pteronyssinus, Dermatophagoides siboney and Blomia tropicalis)에서 유래한 3개의 알레르겐의 비공유 제재의 제조가 노출되었다.

상기 진드기의 알레르겐은 실시예 1에 따라서 별도로 제조되었다. 블로미아(Blomia)의 경우에, 전체 동결건조된 알레르겐 추출물이 분액화없이 사용되었다. Der p 1, Der s 1 및 Blo t 5 주요 알레르겐의 함량은 Mab-ELISA을 사용하여 결정되었다. 총 알레르겐성 활성은 IgE-억제 ELISA를 이용하여 실시예 3에 따라서 결정하였다. 동결건조된 알레르겐은 PBS에서 pH 7.0, 20 ㎍/mL(Der p 1 및 Der s 1 의 경우) 또는 10 ㎍/ml(Blo t 5의 경우)의 농도로 현탁되었으며, 0.2 m 막 여과로 스테릴라이즈함으로써, 알레르겐성 활성을 4000 BU/mL로 하였다. 단백질 함유 리포좀을 각 알레르겐에 별도로 최종 농도가 200 ㎍/mL가 되도록 첨가하였다. 용액은 30 분 동안 150 rpm으로 서서히 교반하여 균일화시켰다. 그리고 나서, 동일한 부피의 알루미늄 하이드록사이드(PBS 내, pH 7.0)을 각 알레르겐 용액에 첨가하고 60 분 동안 150 rpm으로 서서히 교반함으로써 혼합하였다. 알루미늄 겔에 단백질이 흡수되는 것은 280 nm에서 부유물의 흡광도를 모니터링함으로써 확인하였다. 마지막으로 3개의 알레르겐 생성물을 10 분 동안 서서히 교반하여 혼합하였다. 알레르겐 및 단백질 함유 리포좀이 겔에 완전히 흡수되었다는 점은 Der p 1, Der s1 및 Blo t 5에 대한 현탁 부유물의 함량을 ELISA (INDOOR Biotech, UK)로 결정하고 단백질 함량을 로우리 방법(Lowry method)에 의해서 결정함으로써 확인하였다. (흡수되지 않고) 잔류하는 알레르겐의 활성은 실시예 3에 따라서 결정하였다. 90% 이상의 알레르겐 흡광도 및 20% 미만의 알레르겐 활성을 얻었다.

2 회의 0.5 mL 양의 제재(총 알레르겐 함량: 3.33 ㎍ Der s 1 및 Der p 1, 1.17 ㎍ Blo t 5)는 Balb/c 쥐를 이용하여 3 주의 간격으로 복강내 경로로써 투여되었다. 알레르겐-특성 IgG 항체는 면역화 계획의 시작으로부터 7 주 후에 ELISA에 의해서 결정되었다. 모든 알레르겐에 대한 평형 항체 반응이 D. pteronyssinus, D. siboney 및 Blomia tropicalis에 대해서 각각 2:2:1의 비율로 관찰되었다. 관찰된 IgG 레벨은 평균 PBS 내의 알레르겐 혼합물에 의한 면역화에 의해서 얻어진 수치에 비해서 80 배 증가되었다.

본원발명은 면역학 특히 면역-알러지 분야에 관한 것으로서, 특히 알레르겐에 대한 면역 응답을 조절할 수 있는 보강제 또는 운반체 화합물과 관한 것이다. 본원의 기술적 목적은 알러지성 반응 Th2 및 IgE를 알러지성 개체에게 적용되었을 때 프로텍터 반응 Th1로 변환시키는 박테리아성 단백질 함유 리포좀을 사용함으로써 치료 또는 예방 용도, 뿐만 아니라 아직 알러지 질환이 없는 개체에 대해서는 알러지의 발생 및 발전을 방지 할 수 있는 약학적 제재를 수득하기 위함이다. 백신 조성물은 알레르겐에 커플링되어 있는 그램 음성 박테리아에서 유래한 단백질 함유 리포좀으로 구성되며, 선택적으로 다른 보강제 및 항원을 포함할 수 있다. 이의 제조방법 및 2회의 면역화 계획이 개시된다.

Claims (24)

1. a) 네이세리아 메닌지티디스(Neisseria meningitidis)의 외막에서 유래한 단백질 함유 리포좀;

   b) 집안 진드기(domestic mites)에서 유래된 것으로서 펩티드 또는 글리코펩티드 특성을 가지는 하나 또는 몇 개의 알레르겐; 및

   c) 축적 보강제(depot adjuvant)로서의 알루미늄 하이드록사이드를 포함하는 알러지 질환의 예방 또는 치료용 백신 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 1회 복용량 당 20~75 ㎍의 단백질 함유 리포좀을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
6. 삭제
7. 삭제
8. 제1항에 있어서, 상기 알레르겐은 데르마토파고이데스 종(Dermatophagoides genus)의 집안 진드기에서 유래된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
9. 제8항에 있어서, 상기 알레르겐은 데르마토파고이데스 시보네이 속(Dermatophagoides siboney specie)의 집안 진드기에서 유래된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
10. 제8항에 있어서, 상기 다수의 알레르겐은 그룹 1(Der s 1, Der p 1, Der f 1) 알레르겐 및 그룹 2(Der s 2, Der p 2, Der f 2) 알레르겐인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
11. 제1항에 있어서, 상기 알레르겐은 단백질 함유 리포좀의 10 질량 단위 당 0.1~1의 비율이며, 1회 복용량에 0.25~7.5 ㎍인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
12. 제1항에 있어서, 16~20 탄소의 양극성 지방산(bipolar fatty acid)을 포함하는 친지질성 잔기(lipofilic residue)가 상기 알레르겐에 공유결합되어 있는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
13. 삭제
14. 삭제
15. 제1항에 있어서, 상기 알루미늄 하이드록사이드 보강제는 단백질 함유 리포좀 단위 질량 당 10~25의 비율로 포함되며, 1회 복용량 내의 최종 함유량은 250~1000 ㎍인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
16. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 N. 메닌지티디스 혈청형 C(N. meningitidis serogroup C)에서 유래된 다당류 C를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 제16항에 있어서, 상기 다당류는 단백질 함유 리포좀의 단위 질량 당 0.5~4의 비율로 첨가되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.
21. 제1항, 제5항, 제8항, 제9항, 제10항, 제11항, 제12항, 제15항, 제16항 또는 제20항의 백신 조성물을 제조하는 방법에 있어서, 데르마토파고이데스 시보네이 진드기 알레르겐은 다음의 절차에 따라서 제조되고 정제되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물 제조방법:

    a) 동결건조(freeze-drying) 또는 단백질 농도가 10~100 mg/mL가 될 때까지 알레르겐 추출물을 한외여과에 의한 농축(concentration by ultrafiltration)하는 단계;

    b) 암모늄 설페이트 50~100중량% 용액에서 침전시키고, 펠렛을 선택하는 단계;

    c) 세파크릴 S-100(Sephacryl S-100), 세파크릴 S-200, 세파크릴 S-300 및 수퍼덱스 75(Superdex 75) 중에서 선택된 하나의 매트릭스를 이용하여 분자체 크로마토그래피에 의해 분액하고, 분자량이 10~60 kDa에 해당하는 분액을 선택하는 단계;

    d) 동결건조 및 단백질 농도가 10~100 ㎍/mL가 될 때까지 한외여과에 의해 농축하는 단계;

    e) 단백질 함유 리포좀의 10 단위 질량 당 0.1~1의 비율로 알레르겐을 단백질 함유 리포좀에 커플링하는 단계;

    f) 30~90 분 동안 60~600 rpm에서 교반하는 단계;

    g) 알루미늄 하이드록사이드를 단백질 함유 리포좀의 단위 질량 당 2~6의 비율로 첨가하는 단계;

    h) 30~90분 동안 60~600 rpm으로 혼합물을 교반하여 균질화시키는 단계.
22. 제21항에 있어서, 상기 e) 단계에 따른 알레르겐의 커플링은 공유결합인 것을 특징으로 하는 백신 조성물 제조방법.
23. 제21항에 있어서, 다음의 단계를 추가로 포함하는 백신 조성물 제조방법:

    a) 단백질 함유 리포좀의 단위 질량 당 0.5~4의 비율로 다당류 C(Polysaccharide C)를 첨가하는 단계;

    b) 30~90 분 동안 60~600 rpm으로 교반하여 균질화시키는 단계.
24. 삭제

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