MX2012009267A - Proceso para producir un extracto alergenico. - Google Patents

Abstract

La presente invención describe procedimientos para producir extractos alérgenos nativos despigmentados y polimerizados. La invención describe además extractos producidos a través de los procesos y composiciones farmacéuticas y vacunas que comprenden los extractos para el diagnostico y tratamiento de la alergia.

Description

PROCESO PARA PRODUCIR UN EXTRACTO ALERGÉNICO Campo técnico La invención se refiere a un proceso para producir un extracto de alérgenos purificado y a composiciones farmacéuticas y vacunas para su uso en el diagnóstico y tratamiento de la alergia.

Antecedentes de la invención La alergia es un trastorno adquirido de hipersensibilidad del sistema inmunológico y es activada por la exposición de sustancias ambientales inofensivas conocidas como alérgenos. La reacción de hipersensibilidad de tipo I es característica de las reacciones alérgicas y da como resultado la producción de cantidades excesivas de anticuerpos IgE que, a su vez, activan a basófilos y mastocitos provocando una reacción inflamatoria. Los efectos pueden ser sistémicos, tales como vasodilatación, secreción de mucosidad, estimulación de nervios y contracción del músculo liso provocando una reacción anafiláctica, o pueden estar limitados a un área concreta del cuerpo, por ejemplo el sistema respiratorio.

Las alergias alimentarias son un importante problema sanitario público emergente que afecta a aproximadamente 6% de niños en edad escolar y a aproximadamente 4% de adultos, y puede tener consecuencias graves, incluyendo reacciones anaf ¡lácticas fatales'1 Por tanto, las alergias pueden tener un impacto significativo sobre los aspectos psicosociales de la calidad de vida que se extienden más allá de los efectos clínicos inmediatos del trastorno alérgico del paciente y las actividades diarias de las familias'2'. En la actualidad, el criterio de atención para este tipo de alergias incluye evitar estrictamente a los alérgenos ofensivos y el tratamiento con adrenalina.

La alergia a los cacahuetes es una respuesta inmunológica de hipersensibilidad de tipo I (mediada por IgE) a sustancias de la dieta procedentes de cacahuetes que provoca una sobrerreacción del sistema inmunológico. The Asthma and Allergy Foundation of America estima que la alergia a los cacahuetes es la causa más común de muertes relacionadas con los alimentos en EEUU y ha estimado que afecta al 0,4-0,6% de la población. Los frutos secos, tales como las pacanas, los pistachos, los piñones y las nueces, también son alergénos habituales.

Hasta la fecha se han identificado once alérgenos (de Ara h 1 a Ara h 11 ) en el cacahuete (Arachis hypogea) y muchos de ellos se han secuenciado y clonado. Basándose en la nomenclatura de "the International Union of Immunological Societies Allergen Nomenclatura Sub-Committee" (IUIS), estos alérgenos incluyen: Ara h 1 , una cupina (de tipo vicilina, globulina 7S) de 64 kDa; Ara h 2, un conglutina (albúmina 2S) de 17 kDa; Ara h 3, una cupina (de tipo legumina, globulina 1 1 S, glicinina) de 60 kDa; Ara h 4, una cupina (de tipo legumina, 1 1 S, glicinina) de 37 kDa; Ara h 5, una profilina de 15 kDa; Ara h 6, una conglutina (albúmina 2S) de 15 kDa; Ara h 7, una conglutina (albúmina 2S) de 15 kDa; Ara h 8, una proteína relacionada con la patogénesis, PR-10 de 17 kDa; Ara h 9, una proteína 1 de transferencia de lípidos no específica de 9,8 kDa; Ara h 10, una oleosina de 16 kDa, y Ara h 1 1 , una oleosina de 14 kDa.

La alergia a los gatos es muy común, y aparece hasta en un 25% de las personas con alergias. La alergia a los gatos es más común que la alergia a la caspa de los perros, que puede estar relacionado con la potencia del pelo y la caspa de gato como alérgenos, así como con el hecho de que a los gatos no se les baña en general. El alérgeno de los gatos es producido en grandes cantidades, en particular por gatos macho no castrados, porque el alérgeno tiene un control parcialmente hormonal. La caspa está constantemente con el aire, es pegajosa y se encuentra en sitios públicos, aunque no haya gatos. Esto es debido a que la ropa de los dueños de gatos porta la caspa que después se desprende en sitios públicos. Por tanto, el alérgeno de los gatos es un componente del polvo doméstico, incluso en hogares en que nunca haya vivido un gato. El tamaño de las partículas de la caspa de gato es muy pequeño, y se inhala hasta las vías inferiores en los pulmones. Por tanto, la caspa de gato es una causa habitual del asma alérgico, y los dueños de gatos que son alérgicos a los gatos son más propensos al desarrollo de síntomas de asma<8, 9).

Los principales alérgenos de los gatos y perros se encuentran en extractos de pelo/caspa y saliva y, por tanto, se consideran alérgenos epiteliales. En el gato se han identificado ocho alérgenos diferentes y muchos de estos se han secuenciado y clonado. Basándose en el sitio Web de IUIS1, estos alérgenos incluyen: Fel d 1 , una uteroglobina de 14 y 4 kDa; Fel d 2, una albúmina de 69 kDa; Fel d 3, una cistatina de 1 1 kDa; Fel d 4, una lipocalina de 22 kDa; Fel d 5, una inmunoglobulina A de 400 kDa; Fel d 6, una inmunoglobulina M de 800-1000 kDa; Fel d 7, una proteína de la glándula de von Ebner de 17,5 kDa; Fel d 8, una proteína de tipo laterina de 24 kDa. El principal alérgeno de gato, Fel d 1 , se ha caracterizado a fondo mediante técnicas inmunoquímicas y de proteínas, y recientemente se ha expresado como un alérgeno recombinante. Fel d 1 representa un dímero de aproximadamente 36 kDa, que está compuesto por dos subunidades de 17 kd< 0).

La alergia a gramíneas es una de las formas más comunes y extendidas de alergia que afecta a las personas con historia de esta en ciertas estaciones del año. Está presente en el aire en los meses de finales de primavera y principios de verano, y puede provocar rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica y asma. El contacto directo de la piel con la hierba, tras sentarse sobre ella o segarla, puede provocar picores en la piel, urticaria y dermatitis atópica. Una de las especies más representativas es Phleum pratense, seleccionada como líder del grupo de gramíneas. Se han identificado nueve alérgenos diferentes de la especie Phleum pratense. Basándose en el sitio Web de la IUIS', estos alérgenos incluyen: Phl p 1 , una beta-expansina de 27 kDa; Phl p 2, un alérgeno del grupo ll/lll de gramíneas de 10-12 kDa; Phl p 4, una proteína de 55 kDa; Phl p 5 de 32 kDa; Phl p 6 de 1 1 kDa; Phl p 7, una proteína de unión al calcio de 6 kDa; Phl p 11 , una proteína relacionada con Ole e 1 de 20 kDa; Phl p 12, una profilina de 14 kDa; y Phl p 13, una poligalacturonasa de 55 kDa.

Phragmites es un género que pertenece al grupo de las gramíneas. Se han descrito varias especies, que incluyen P. australis, o P. communis. Se ha indicado que el polen de Phragmites communis es alergénico en diferentes áreas. La polinización se produce entre el verano y el otoño, dependiendo de la latitud y de la altitud. En el género Phragmites se han identificado cinco proteínas diferentes con capacidad de unión a IgE. Basándose en el sitio Web de Allergome', estos alérgenos incluyen: una expansina de 30 kDa; una proteína que pertenece al grupo 4 de gramíneas de 60 kDa; una ribonucleasa de 35 kDa; una profiluna de 14 kDa; y por último una poligalacturonasa.

La ambrosía (Ambrosia) es una hierba que crece principalmente en Europa central. Un pie de planta vive sólo una temporada, pero la planta produce miles de granos de polen. El calor, la humedad y la brisa después del amanecer ayudan a liberar los granos de polen. Hasta la fecha se ha relacionado a tres especies diferentes con los síntomas de la alergia (Ambrosia artemisiifolia, A. psilostachya y A. trífida). Se han identificado diez alérgenos diferentes en A. artemisiifolia, y muchos se han secuenciado y clonado. En el caso de Ambrosia artemisiifolia se denominan Amb 1 a Amb 10 según la nomenclatura internacional para alérgenos. Basándose en el sitio Web de IUIS1 , estos alérgenos incluyen: Amb a 1 , una pectato liasa de 38 kDa; Amb a 2, una pectato liasa de 38 kDa; Amb a 3, una plastocianina de 1 1 kDa; Amb a 4, una proteína de tipo defensina de 30 kDa; Amb a 5, de 5 kDa; Amb a 6, una proteína de transferencia de lípidos de 10 kDa; Amb a 7, una plastocianina de 12 kDa; Amb a 8, una profilina de 14 kDa; Amb a 9, una polcancina de 10 kDa; y Amb a 10, una proteína de tipo polcalcina de 19 kDa. Sólo se ha descrito el alérgeno Amb p 5 para A. psilostachya con función biológica desconocida. Sólo se ha descrito un alérgeno de 5 kDa en A. trífida.

Las hierbas pueden dividirse en grupos homólogos según sus extractos alergenicos clasificados. La ambrosía se seleccionó como uno de los líderes de este grupo de plantas. Por esta razón, los resultados obtenidos con el extracto de este polen pueden extrapolarse a otras hierbas'.

La alergia puede tratarse mediante una serie de métodos conocidos, que incluyen la inmunoterapia con alérgenos, la inmunoterapia específica (SIT) o la vacunación de alergias específicas (SAV), que es una forma de inmunoterapia para trastornos alérgicos en que los pacientes son vacunados con dosis cada vez mayores de un extracto de alérgenos con el objetivo de inducir una tolerancia inmunológica. La inmunoterapia con alérgenos modula la respuesta inmunológica al alérgeno en lugar de mejorar los síntomas inducidos por una reacción alérgica, y puede reducir la necesidad de medicación, reducir la gravedad de los síntomas o eliminar la hipersensibilidad en general.

Aunque existen muchas pruebas de que la inmunoterapia con alérgenos es el único medio, aparte de evitar los alérgenos, para tratar causalmente los trastornos alérgicos mediados por IgE provocados por alérgenos inhalados y picaduras de insectos del grupo Hymenoptera, la inmunoterapia con extractos de alérgenos no se emplea habitualmente para el tratamiento de alergias alimentarias. Sólo dos estudios recientes han demostrado una eficacia clínica moderada utilizando una inmunoterapia sublingual en individuos sensibilizados a las avellanas y al melocotón, respectivamente'3, 4).

En estudios previos se ha intentado inducir una tolerancia a dosis bajas dando de comer minúsculos trozos de cacahuete a niños, trozos que gradualmente se van haciendo mayores para fortaleciendo el sistema inmunológico'4, 6). Aunque datos de ensayos clínicos anteriores indican que la alergia a los cacahuetes puede mejorarse utilizando una inmunoterapia'7', en la actualidad no existe ningún tratamiento confirmado para prevenir o curar las reacciones alérgicas a los cacahuetes, siendo la única opción eficaz para individuos atópicos el evitar alimentos que contengan o que estén contaminados con cacahuetes enteros, partículas de cacahuete y aceites de cacahuete, y proporcionar un acceso sencillo a la epinefrina autoinyectable.

Uno de los riesgos de la inmunoterapia es que la inyección de un alérgeno a un paciente sensible puede provocar una reacción alérgica grave o anafilaxis. Desde su primer uso a principios del siglo XX se han realizado muchos esfuerzos para mejorar aún más la seguridad y la eficacia de la inmunoterapia con alérgenos. Una estrategia es emplear vacunas de alérgenos con alergenicidad reducida pero manteniendo la inmunogenicidad.

Los documentos US 5.770.698 y EP 0662080 describen un proceso para la eliminación de sustancias y de otros materiales de bajo peso molecular para purificar el extracto de alérgenos y para aumentar el contenido final de alérgenos/proteínas. El proceso consiste en alterar las fuerzas electrostáticas, hidrófobas u otras fuerzas físicas bajo condiciones que despegan los compuestos no alergénicos de las proteínas alergénicamente activas. El proceso puede consistir en un tratamiento ácido suave disminuyendo el pH por debajo del pl de las respectivas proteínas de alérgenos.

Una de varias formas de reducir la alergenicidad consiste en modificar químicamente extractos de alérgenos nativos con aldehidos (principalmente formaldehído y glutaraldehído) para producir alergoides. Este tratamiento con aldehidos conduce a unos productos de reacción (principalmente polímeros) que han perdido parte de su alerginicidad (es decir, muestran una reducción de los epitopos de células B reactivos a IgE), reduciendo los efectos secundarios alérgicos. Al mismo tiempo, la inmunogenicidad nativa del alérgeno se mantiene debido a que los epitopos de células T no cambian. Esta vía de modificación de alérgenos ha sido elegida por algunos fabricantes de vacunas de alérgenos para desarrollar productos disponibles en el mercado basados en este principio. En general, existe una tendencia a purificar aún más los extractos de alérgenos, seleccionando cuidadosamente los alérgenos más importantes y los mas relevantes desde el punto de vista clínico Los documentos EP 1834649 y EP 1834648 describen métodos para producir extractos de alérgenos; sin embargo, estos métodos no eliminan suficientemente las proteínas contaminantes de bajo peso molecular.

Es necesario aumentar aun más la seguridad y la eficacia de los medicamentos utilizados para la inmunoterapia de trastornos alérgicos mediante la optimización del proceso de purificación de alérgenos para asegurarse de que se eliminan las proteínas contaminantes de bajo peso molecular, y los componentes irritantes y tóxicos.

Sumario de la invención Los inventores han desarrollado una etapa intermedia antes de la polimerización para mejorar aún más el proceso de polimerización y reducir la alerginicidad de ciertos extractos, tales como ácaros, pólenes que incluyen gramíneas, hierbas y árboles, alérgenos epiteliales y alérgenos alimentarios, antes del tratamiento con glutaraldehído.

Un objeto de la presente invención es proporcionar un proceso para la preparación de extractos que comprenden alérgenos, y composiciones farmacéuticas y vacunas para el tratamiento de la alergia. Otro objeto es proporcionar un extracto de alérgenos óptimamente eficaz con menor capacidad de unión a IgE pero que mantenga su capacidad inmunogénica.

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un proceso para producir un extracto de alérgenos, que comprende: a) poner en contacto un material de origen que comprende un alérgeno con un agente de extracción líquida para producir una mezcla que contiene lípidos disueltos en la fase líquida, y una fase sólida que consiste en residuos del material de origen que comprenden alérgenos y proteínas, b) someter la mezcla a una primera etapa de separación para aislar los residuos del material de origen; c) poner en contacto los residuos del material de origen con un agente de extracto de alérgenos para producir una mezcla de alérgenos disuelta en la fase líquida, y una fase sólida que consiste en residuos no alergénicos, d) someter la mezcla a una segunda etapa de separación para aislar los alérgenos disueltos en la fase líquida, para producir un extracto de alérgenos bruto, e) someter al extracto de alérgenos bruto a una etapa de eliminación de fracciones de bajo peso molecular para eliminar las moléculas que tengan un tamaño molecular menor que 3,5 kDa, y f) llevar a cabo la etapa e) hasta que el extracto de alérgenos tenga una conductividad menor que 1000 µß/?p? a 3-5°C para obtener un extracto de alérgenos nativos purificado.

Una etapa posterior del tratamiento puede comprender: g) Hacer un tratamiento con un ácido suave del extracto de alérgenos nativos paraeliminar las moléculas que tengan un tamaño molecular menor que 3,5 kDa, y neutralizar el pH para producir un extracto de alérgenos despigmentado.

El proceso también puede comprender una etapa de polimerización, que comprende: h) poner en contacto un extracto de alérgenos nativos o un extracto de alérgenos despigmentado con un aldehido, y i) eliminar las moléculas que tengan un tamaño molecular menor que 100 kDa.

Según un segundo aspecto de la invención, se proporciona un extracto de alérgenos que puede obtenerse según el proceso del primer aspecto de la presente invención.

Según un tercer aspecto de la invención, se proporciona un extracto de alérgenos purificado para su uso como una sustancia terapéutica activa para el tratamiento de la alergia.

Definiciones Un "alérgeno" puede definirse como una molécula capaz de inducir una respuesta de IgE y/o una reacción alérgica de tipo I.

El término "despigmentado" mencionado en la presente puede definirse como un extracto de alérgenos sem ¡purificados obtenido de un extracto nativo mediante la eliminación de las sustancias irrelevantes, incluyendo los pigmentos adsorbidos que pueda contener.

Descripción detallada de la invención Los extractos de alérgenos de la invención pueden derivarse de cualquier material de origen que comprenda alérgenos naturales conocidos por provocar una reacción inmunológica mediada por IgE en un individuo. Estos alérgenos pueden incluir alérgenos alimentarios (por ejemplo, cacahuetes), alérgenos aéreos (por ejemplo, polen de gramíneas, árboles, hierbas, ácaros del polvo, hongos y mohos), alérgenos de insectos (por ejemplo, cucarachas, pulgas, veneno de abeja y de avispa), y alérgenos epiteliales (pelo de animales, caspa de animales, por ejemplo caspa de gato y perro).

Los alérgenos del polen de árboles, gramíneas y hierbas se derivan del orden taxonómico Fágales (por ejemplo, Alnus y Betula), Lamíales (por ejemplo, Olea y Plantagó), Poales (por ejemplo, Phleum pratense), Asterales (por ejemplo, Ambrosia y Artemisia), Cariofilales (por ejemplo, Chenopodium y Salsola), Rosales (por ejemplo, Parietaria), Proteales (por ejemplo, Platanus), etc. Los ácaros del polvo pertenecen al orden de Astigmata (por ejemplo, Dermatophagoides y Euroglyphus). Los alérgenos aéreos se derivan de mohos y hongos que pertenecen al orden Pleosporales (por ejemplo, Alternaría), Capnodiales (por ejemplo, Cladosporium), etc.

El material de origen según la presente invención puede ser cualquier alérgeno, incluyendo alérgenos alimentarios, cacahuetes, cacahuetes enteros, alérgenos aéreos (por ejemplo, polen (polen de árboles, polen de hierbas, polen de gramíneas, polen de cereales), ácaros del polvo, hongos, mohos), ácaros, alérgenos de gramíneas, árboles y hierbas, alérgenos epiteliales (pelo de animales, caspa de animales, por ejemplo pelo y caspa de gato, y pelo y caspa de perro), y alérgenos de insectos (por ejemplo, cucarachas, pulgas, veneno de abejas y de avispas).

Un alérgeno alimentario carácter'sitico, dada su importancia alergénica es el cacahuete alérgeno( Arachis hypogaeá).

Los alérgenos áereos pueden seleccionarse o se seleccionan de los grupos de polen de árboles (AInus glutinosa, Betula alba, Coryius avellana, Cupressus arizonica, Olea europea, Platanus sp.), polen de gramíneas (Cynodon dactylon, Dactylis glomerata, Festuca elatior, Holcus lanatus, Lolium perenne, Phleum pratense, Phragmites communis, Poa pratensis), polen de hierbas (Ambrosia elatior, Artemisia vulgaris, Chenopodium álbum, Parietaria judaica, Plantago lanceolata, Salsola kali), y polen de cereales (Avena sativa, Hordeum vulgaris, Sécale cereale, Triticum aestivum, Zea mays), ácaros del polvo (Acarus siró, Blomia tropicalis, Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides microceras, Dermatophagoides pteronyssinus, Euroglyphus maynei, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae), hongos y mohos (Alternaría altérnate, Cladosporium herbarum, Aspergillus fumigatus).

Los alérgenos epiteliales pueden seleccionarse de cualquier animal, incluyendo pelo y caspa de gatos, pelo y caspa de perros, pelo y caspa de caballos, pelo y caspa humanos, pelo y caspa de conejos, y plumas.

Los alérgenos de insectos pueden seleccionarse de hormigas, pulgas, ácaros (Acarus siró, Blomia tropicalis, Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides microceras, Dermatophagoides pteronyssinus, Euroglyphus maynei, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae), cucarachas, veneno de abejas, y veneno de avispas.

Preferiblemente, el material de origen se selecciona de alérgenos alimentarios (Arachis hypogaeá), polen (AInus glutinosa, Betula alba, Coryius avellana, Cupressus arizonica, Olea europea, Platanus sp., Cynodon dactylon, Dactylis glomerata, Festuca elatior, Holcus lanatus, Lolium perenne, Phleum pratense, Phragmites communis, Poa pratensis, Ambrosia elatior, Artemisia vulgaris, Chenopodium álbum, Parietaria judaica, Plantago lanceolata, Salsola kali, Avena sativa, Hordeum vulgaris, Sécale cereale, Triticum aestivum, Zea mays), ácaros del polvo (Acarus siró, Blomia tropicalis, Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides microceras, Dermatophagoides pteronyssinus, Euroglyphus maynei, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae), hongos y mohos (Alternaría altérnate, Cladosporium herbarum, Aspergillus fumigatus), alérgenos epiteliales (pelo y caspa de gatos, pelo y caspa de perros, pelo y caspa de caballos, pelo y caspa humanos, pelo y caspa de conejos, y plumas), alérgenos de insecto (hormigas, pulgas, ácaros, cucarachas, veneno de abejas, y veneno de avispas).

Más preferiblemente, el material de origen se selecciona de cacahuetes {Arachis hypogaea), polen (Olea europaea, Parietaría judaica, Phragmites communis y Phieum pratense), ácaros (Dermatophagoides pteronyssinus) y material epitelial (caspa de gato).

En una realización preferida de la invención, el material de origen se selecciona de Arachis hypogaea, Olea europaea, Parietaría judaica, Phieum pratense, Dermatophagoides pteronyssinus, Phragmites communis, y caspa de gato.

En una realización aún más preferida de la invención, el material de origen se selecciona de Arachis hypogaea, Phieum pratense, Phragmites communis, Parietaría judaica, y caspa de gato.

En una realización más preferida de la invención, el alérgeno es de Arachis hypogaea.

Cuando el material de origen son cacahuetes preferiblemente se elimina la piel, o el material puede triturarse o pulverizarse. Los cacahuetes pueden estar tostados, frito o crudos.

El material de origen puede tratarse para crear una superficie específica máxima para que se ponga en contacto con el agente de extracción líquida. El material de origen puede estar homogeneizado, mezclado, triturado o en polvo para producir una suspensión homogénea para la extracción líquida. La etapa de extracción líquida es una etapa de "desgrasado" para eliminar los compuestos lipófilos, como lípidos y ácidos grasos del material de origen.

El agente de extracción líquida puede ser acetona, que puede estar fría. La etapa de extracción líquida puede realizarse con una proporción de 1 :1 (peso del material de origen/peso del agente de extracción líquida), o cualquier proporción en la que el peso del agente de extracción líquida sea mayor que el peso del material de origen, por ejemplo 1 :2, 1 :3, 1 :5, 1 :10. La etapa de extracción líquida se realiza preferiblemente en una proporción de 1 kg de material de origen por 2 I del agente de extracción líquida. La etapa de extracción líquida se realiza preferiblemente durante un tiempo suficiente para que los lípidos en el material de origen se disuelvan en el agente de extracción líquida, que puede ser durante más de 1 minuto, preferiblemente más de 5 min, más preferiblemente más de 30 minutos, y lo más preferiblemente durante 1 hora o más. La etapa de extracción líquida puede realizarse entre 20-25°C, pero se realiza preferiblemente en frío entre 2-6°C, y lo más preferiblemente entre 3- 5°C. Durante la etapa de extracción líquida, el material de origen se agita preferiblemente con el agente de extracción líquida.

La primera etapa de separación puede ser una filtración.

Después de la primera etapa de separación, el residuo del material de origen puede lavarse con el agente de extracción líquida. Opcionalmente, el residuo del material de origen puede extraerse otra vez con el agente de extracción líquida y después separarse. Preferiblemente se realizan una, dos o más etapas de extracción líquida posteriores. La extracción líquida del residuo del material de origen preferiblemente continúa hasta que el agente de extracción líquida se mantiene transparente tras ponerlo en contacto con el residuo del material de origen.

Después de la extracción líquida, el residuo del material de origen puede secarse. El residuo del material de origen puede secarse entre 2-25°C y se seca preferiblemente a temperatura ambiente. La etapa de secado continúa preferiblemente durante un tiempo suficiente para permitir la eliminación del agente de extracción líquida del residuo del material de origen, que puede ser entre 1 -24 horas, 6-18 horas, 10-14 horas y preferiblemente durante aproximadamente 12 horas.

Los alérgenos pueden obtenerse a partir del residuo del material de origen "desgrasado" mediante una extracción con un agente de extracción de alérgenos para producir un extracto de alérgenos bruto que comprende alérgenos disueltos en la fase líquida, y una fase sólida que consiste en residuos no alergénicos "no deseados". El agente de extracción de alérgenos puede ser una disolución acuosa y comprende preferiblemente un agente tamponante. El agente de extracción de alérgenos puede comprender PBS y/o NaCI, por ejemplo una disolución de PBS 0,01 M/NaCI 0,15 M. El residuo del material de origen puede extraerse en el agente de extracción de alérgenos en cualquier proporción en la que el peso del agente de extracción de alérgenos sea mayor que el peso del residuo del material de origen, por ejemplo 1 :2, 1 :3, 1 :5, 1 :10, 1 :20, 1 :50. Preferiblemente, el residuo del material de origen se extrae en el agente de extracción de alérgenos en una proporción de residuo del material de origen:agente de extracción de alérgenos 1 :10 (en p/p). La proporción del residuo del material de origen al agente de extracción de alérgenos en la etapa de extracción puede variar, pero debería de ser de tal forma que los alérgenos en el residuo del material de origen puedan disolverse en el agente de extracción de alérgenos. La extracción del residuo del material de origen con el agente de extracción de alérgenos se realiza preferiblemente durante un tiempo suficiente para que los alérgenos en el residuo del material de origen se disuelvan en el agente de extracción de alérgenos, que puede ser entre 30 minutos a 12 horas, preferiblemente entre 1 -6 horas, más preferiblemente entre 2-5 horas, y lo más preferiblemente durante aproximadamente 4 horas. La etapa de extracción de alérgenos puede realizarse entre 20-25°C, pero se realiza preferiblemente fría entre 2-6°C, y lo más preferiblemente entre 3-5°C. Durante la etapa de extracción de alérgenos, el residuo del material de origen se agita preferiblemente con el agente de extracción de alérgenos.

Después de la etapa de extracción de alérgenos, los alérgenos disueltos en la fase líquida pueden separarse del residuo no alergénico para producir un extracto de alérgenos bruto. La etapa de separación es preferiblemente una centrifugación aunque pueden utilizarse muchas técnicas para separar sólidos de líquidos, siendo éstas muy conocidas por los expertos en la técnica. Preferiblemente, los alérgenos disueltos en la fase líquida se centrifugan entre 2-6°C, y preferiblemente entre 3-5°C, durante un tiempo suficiente para sedimentar el residuo no alergénico como un sedimento, por ejemplo entre 1 minuto a 1 hora, o más de 1 hora. El extracto de alérgenos bruto (es decir, el sobrenadante que contiene los alérgenos disueltos) puede conservarse entre 2-6°C. El sedimento del residuo no alergénico puede extraerse otra vez con el agente de extracción de alérgenos utilizando las mismas condiciones que la primera etapa de extracción de alérgenos, y preferiblemente durante un periodo de extracción más largo, como entre 4-8 horas, 8-12 horas, o más de 12 horas. Después de la segunda etapa de extracción de alérgenos, los alérgenos disueltos en la fase líquida pueden separarse del residuo no alergénico para producir un extracto de alérgenos bruto. Los extractos de alérgenos brutos procedentes de la primera y la segunda etapa de extracción de alérgenos preferiblemente se reúnen para su posterior tratamiento.

El extracto de alérgenos bruto puede filtrarse, por ejemplo utilizando un tamaño de poro de 0,45 µ?t?. El extracto de alérgenos bruto puede someterse a una etapa de eliminación de fracciones de bajo peso molecular para eliminar las moléculas que tengan un tamaño molecular bajo, como sales y otros compuestos no alergénicos. El solicitante ha determinado de modo experimental que la composición de proteínas y alérgenos de los extractos de cacahuete es entre 8 y 150 kDa, y que estos alérgenos deben retenerse durante las etapas de eliminación de fracciones moleculares. Por ejemplo, la proteína de transferencia de lípidos (LTP) (un importante alérgeno) de cacahuete tiene 8 kDa y necesita retenerse durante la etapa de eliminación de fracciones de bajo peso molecular. En la etapa e), las moléculas que tienen un peso molecular menor que 8 kDa, o 7 kDa, o 6 kDa, o 5 kDa, 4 kDa o 3,5 kDa pueden eliminarse. La etapa de eliminación de fracciones de bajo peso molecular continúa preferiblemente hasta que la conductividad del extracto de alérgenos a 3-5°C es menor que 900 µß/a?, o menor que 800 µß/a?, o menor que 700 µß/???, o menor que 600 µß/???, o más preferiblemente menor que 500 µß/???. La etapa de eliminación de fracciones de bajo peso molecular continúa preferiblemente hasta que la conductividad del extracto de alérgenos a 3-5°C es entre 200 y 1000 µ3/???, o entre 300 y 900 µß/a?, y lo más preferiblemente entre 400 y 800 µe/???.

El extracto de alérgenos nativos purificado resultante puede filtrarse, por ejemplo utilizando un tamaño de poro de 0,45 y/o 0,22 µp?.

El extracto de alérgenos nativos puede utilizarse para la preparación de una composición farmacéutica o una vacuna para objetivos de estandarización, diagnóstico, síntesis y vacunación.

El proceso también puede comprender una etapa de tratamiento posterior, en la que se eliminan los compuestos no alergénicos adheridos a las proteínas de alérgeno utilizando medios que rompan las fuerzas electrostáticas, hidrófobas u otras fuerzas físicas que son responsables de la adherencia de los compuestos no alergénicos a las proteínas. Los medios para romper las fuerzas electrostáticas, hidrófobas u otras fuerzas físicas pueden seleccionarse del grupo de medios químicos que consisten en materiales ácidos y alcalinos, incluyendo materiales de intercambio aniónico y catiónico, sales y corrientes eléctricas. Los medios químicos ácidos y alcalinos pueden utilizarse en una cantidad que provoque que se exceda el punto isoeléctrico de las proteínas. El extracto de alérgenos resultante de esta etapa de tratamiento posterior se denomina en lo sucesivo en la presente el extracto de alérgenos despigmentado.

Esta etapa de tratamiento posterior puede comprender: g) acidificar el extracto de alérgenos nativos, eliminar las moléculas que tengan un tamaño molecular menor que 3,5 kDa, y neutralizar el pH para producir un extracto de alérgenos despigmentado.

Esta etapa de tratamiento posterior comprende preferiblemente un tratamiento ácido suave. En el tratamiento ácido suave, el pH de las proteínas de alérgeno puede reducirse a un pH menor que 3, por ejemplo a un valor de pH entre 2,0 y 2,5. El pH de las proteínas dé alérgeno puede estar entre 2,0 y 6,0. El solicitante ha identificado de modo experimental que el pH óptimo para despegar los compuestos no alergénicos adheridos a las proteínas de alérgeno es entre pH 2,0 y 2,1. Un valor de pH menor que 2,0 conduce a que el perfil de proteínas del extracto de alérgenos despigmentado sea incompleto, y un pH insuficientemente bajo, por ejemplo mayor que 3,0, conduce a la eliminación incompleta de los compuestos no alérgicos en el extracto de alérgenos despigmentado resultante.

El pH del extracto de alérgenos nativos puede reducirse utilizando un ácido adecuado, por ejemplo HCI. El extracto acidificado puede mantenerse a un pH bajo durante 1-60 minutos, preferiblemente 5-30 minutos, más preferiblemente 10-20 minutos, y lo más preferiblemente aproximadamente 15 minutos. Las moléculas que tienen un tamaño molecular menor que 3,5 kDa pueden eliminarse en una etapa de eliminación de fracciones de bajo peso molecular.

Después de la etapa de tratamiento posterior, el extracto despigmentado resultante puede recogerse, y el pH del extracto de alérgenos de cacahuete puede neutralizarse utilizando un álcali adecuado, por ejemplo NaOH. El pH puede ajustarse hasta un valor en que se evite la precipitación de las proteínas, por ejemplo mayor que pH 7,0, preferiblemente entre pH 7,0 y 8,0, más preferiblemente entre pH 7,0 y 7,5, y lo más preferiblemente entre pH 7,3 y 7,4.

La etapa de tratamiento posterior comprende: g) acidificar el extracto de alérgenos nativos hasta pH 2-2,1 y mantener el extracto acidificado durante 5-30 minutos, seguido de someter al extracto a una etapa de eliminación de fracciones de bajo peso molecular para eliminar las moléculas que tengan un tamaño molecular menor que 3,5 kDa, y ajustar el pH a 7,3-7,4 para producir un extracto de alérgenos despigmentado.

La etapa de tratamiento posterior puede comprender acidificar el extracto de alérgenos nativos hasta un pH de 2,0 a 4,0.

Los medios para romper las fuerzas electrostáticas pueden comprender corrientes eléctricas en forma de una electroforesis. Los compuestos no alergénicos pueden tener un peso molecular menor que 8.000 daltons, 5.000 daltons y preferiblemente menor que 3.500 daltons, y pueden comprender flavonoides y/o sus glicósidos.

La etapa de eliminación de fracciones de bajo peso molecular puede ser una etapa de diálisis, en la que el extracto se dializa contra un dializado, como agua purificada o un tampón. La etapa de eliminación de fracciones de bajo peso molecular puede realizarse entre 20-25°C pero se realiza preferiblemente en frío entre 2-6°C, y lo más preferiblemente entre 3-5°C. La etapa de eliminación de fracciones de bajo peso molecular puede realizarse durante 12-24 horas, en las que el disolvente, o en el caso de la diálisis, el dializado, se cambia regularmente para mantener la reacción.

El extracto de alérgenos despigmentado resultante puede filtrarse, por ejemplo utilizando un tamaño de poro de 0,45 µ?? y/o 0,22 µ?t?, y puede congelarse o liofilizarse para su conservación.

Cualquiera de los extractos producidos utilizando el proceso de la presente invención puede tratarse posteriormente. El proceso puede comprender además una etapa de polimerización, que comprende: h) poner en contacto un extracto de alérgenos nativos o un extracto de alérgenos despigmentado con un aldehido, y i) eliminar las moléculas que tengan un tamaño molecular menor que 100 kDa. El aldehido puede ser cualquier aldehido adecuado, por ejemplo glutaraldehído o formaldehído.

La etapa de polimerización puede comprender: h) poner en contacto un extracto de alérgenos nativos o un extracto de alérgenos despigmentado con glutaraldehído o formaldehído, i) someter el extracto a una etapa de eliminación de fracciones moleculares para eliminar las moléculas que tengan un tamaño molecular menor que 100 kDa, y j) llevar a cabo la etapa i) hasta que el extracto de alérgenos tenga una conductividad menor que 210 iS/c a 3-5°C y/o está ausente de glutaraldehído para obtener un extracto de alérgenos polimerizado o un extracto despigmentado polimerizado.

Cuando el extracto para la polimerización se liofiliza, puede reconstituirse en un tampón, por ejemplo PBS 0,01 M/NaCI 0,15 M, hasta una concentración final de 0,1 -500 mg/ml, preferiblemente 1 -100 mg/ml y lo más preferiblemente 10-50 mg/ml.

La reacción de polimerización se realiza preferiblemente hasta que se completa, de forma que las bandas de proteínas <100 kDa (por ejemplo, 14-25 kDa) no sean detectables mediante una SDS-PAGE no reductora en el extracto polimerizado. El solicitante ha determinado de modo experimental (véase la tabla 2) que dos parámetros influyen en las condiciones óptimas para la polimerización.

En primer lugar, la concentración final del glutaraldehído es importante, por lo cual concentraciones crecientes de glutaraldehído disminuyen el rendimiento del polímero y aumentan el rendimiento del residuo obtenido mediante centrifugación antes de la diálisis. Por contraste a las condiciones de polimerización previamente conocidas, que emplean una concentración de glutaraldehído de aproximadamente 5 mg/ml (es decir, 0,009 mi de glutaraldehído por mi de extracto de alérgeno), se determinó de modo experimental que la concentración óptima de glutaraldehído era aproximadamente el doble que la de la cantidad conocida, es decir, 10 mg/ml (0,02 mi de giutaraldehído por mi de extracto de alérgenos). El aldehido puede añadirse en un intervalo de 1 -20 mg/ml. Mientras que el empleo de las cantidades previamente conocidas de concentración final de giutaraldehído puede conducir a que se produzca algo de polimerización de los alérgenos, se prefiere que el aldehido se añada a una concentración final de 10 mg/ml o en una proporción de 0,02 mi de giutaraldehído por mi de extracto para lograr una polimerización óptima.

En segundo lugar, el solicitante ha determinado que disminuyendo la velocidad de adición del giutaraldehído se disminuye el rendimiento del polímero y se aumenta el rendimiento del residuo. El aldehido puede añadirse al extracto a una velocidad constante, por ejemplo entre 0,001 -0,5 mi por minuto (1 -500 µ?/min, 60-3000 µ?/hora).

La reacción de polimerización puede mantenerse entre 1 -12 h, preferiblemente durante 7 horas a temperatura ambiente. La reacción de polimerización puede detenerse utilizando glicina en una proporción de 40 mg por mi de disolución de extracto polimerizado. La reacción de detención puede mantenerse durante la noche a 3-5°C, preferiblemente con agitación. Los alérgenos polimerizados en la fase líquida pueden separarse del residuo insoluble para producir un extracto de alérgenos polimerizado o un extracto de alérgenos despigmentado polimerizado. La etapa de separación es preferiblemente una centrifugación, aunque son aplicables muchas técnicas de separación, siendo éstas conocidas por los expertos en la técnica. Preferiblemente, el extracto se centrifuga entre 2-6°C, y preferiblemente entre 3-5°C, durante una tiempo suficiente para sedimentar el residuo insoluble como un sedimento, por ejemplo entre 1 minuto a 1 hora, o más de 1 hora. El sobrenadante (que contiene los alérgenos solubles) puede recogerse y someterse a una etapa de eliminación de fracciones moleculares (i).

En la etapa i), las moléculas que tienen un tamaño molecular menor que 150 kDa pueden eliminarse. Se ha descubierto que las moléculas con un peso molecular mayor que 3 Mda precipitan y también pueden eliminarse durante la etapa de polimerización.

Preferiblemente, la etapa de eliminación de fracciones moleculares es una etapa de diálisis, en la que el extracto se dializa contra un dializado, como agua purificada o un tampón, a 3-5°C. La etapa de eliminación de fracciones moleculares puede continuarse hasta que la conductividad medida a 3-5°C sea menor que 200 µß/?p?, más preferiblemente menor que 175 µß/???, más preferiblemente menor que 150 µß/a?, más preferiblemente menor que 125 µß/???, más preferiblemente menor que 100 µß/?Gp, más preferiblemente entre 50 y 200 µe/at?, y lo más preferiblemente entre 100 y 150 µß/a?.

El extracto de alérgenos resultante puede filtrarse, por ejemplo utilizando un tamaño de poro de 0,45 µ?t? y/o 22 µ?t?, y puede congelarse o liofilizarse para su conservación.

Cualquiera de las etapas de eliminación de fracciones de bajo peso molecular c), e) o g) puede comprender una etapa de ultrafiltración, una etapa de diafiltración, una etapa de diálisis, o una filtración.

En su forma más simple, el proceso de la presente invención puede comprender preparar un extracto de alérgenos nativos soluble, opcionalmente tratar después el extracto, por ejemplo mediante un tratamiento ácido suave, para eliminar los compuestos no alergénicos que tienen un tamaño molecular pequeño, y polimerizar el extracto utilizando un aldehido. El extracto de alérgenos nativos solubles puede ser de alérgenos de cacahuete, polen, hierbas, epiteliales, de mohos, hongos, insectos o ácaros. El proceso de la presente invención produce un extracto de alérgenos que muestra una capacidad de unión a IgE reducida pero que mantiene su capacidad inmunogénica.

La presente invención comprende además un tratamiento para la alergia y un fármaco de diagnóstico para la alergia, que comprenden extractos de alérgenos producidos mediante los procesos de la presente invención, como ingrediente activo. La alergia puede estar asociada a la exposición a diversos alérgenos que provocan una respuesta alérgica mediada por IgE, según se analiza en la presente.

Según un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un extracto de alérgenos que puede obtenerse según el proceso del primer aspecto de la presente invención. Se proporciona un extracto de alérgenos purificado para su uso como sustancia terapéutica activa. Se proporciona un extracto de alérgenos nativos, un extracto de alérgenos nativos polimerizados, un extracto de alérgenos despigmentado, un extracto de alérgenos despigmentado polimerizado, que pueden obtenerse según el proceso del primer aspecto de la presente invención. Preferiblemente, el extracto es un extracto de alérgenos nativos polimerizado, y más preferiblemente un extracto de alérgenos despigmentado polimerizado.

El extracto de alérgenos puede seleccionarse de alérgenos de cacahuete (Arachis hypogea ), polen {Olea europaea, Parietaria judaica, Phragmites communis, Parietaría judaica y Phleum pratense), ácaros (Dermatophagoides pteronyssinus), y epiteliales (caspa de gato).

El extracto de alérgeno puede utilizarse para el tratamiento de la alergia. En una realización preferida, el extracto de alérgenos de Arachis hypogaea puede utilizarse para el tratamiento de la alergia a los cacahuetes.

El extracto de alérgenos despigmentado polimerizado puede caracterizarse mediante las siguiente propiedades fisicoquímicas y biológicas: i. es soluble en agua, ii. no hay alérgenos/proteínas no polimerizados con un peso molecular menor que 100 kDa (identificados con bandas en una SDS-PAGE en condiciones no reductores), iii. no existen bandas de reconocimiento de IgE con un peso molecular menor que 100 kDa (identificadas mediante una inmunotransferencia en condiciones no reductoras), iv. no existen moléculas polimerizadas con un peso molecular menor que 100 kDa (determinadas mediante una cromatografía de exclusión molecular con HPLC), v. presenta una reducción del 75% de los grupos amino libres con respecto al extracto nativo (determinado mediante el método de fluram), vi. presenta una reducción de la potencia biológica (95%) con respecto al extracto de alérgenos nativo (determinada mediante experimentos ELISA de IgE utilizando un pool específico de sueros de individuos sensibilizados), y vii. no hay toxicidad anómala en ratones.

Los extractos de alérgenos de la presente invención pueden utilizarse como componente activo de un medicamento para el tratamiento de un individuo alérgico, con el objetivo de inducir tolerancia a ciertos alérgenos.

Se proporciona el uso de un extracto de alérgenos según la presente invención en diagnósticos de trastornos inmunológicos, preferiblemente para detectar una enfermedad alérgica. Se proporciona el uso de un extracto de alérgenos según la presente invención para el tratamiento de la alergia o para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la alergia. El uso puede ser para inmunoterapia. El uso puede ser para objetivos de estandarización, diagnóstico, síntesis y vacunación. El uso puede ser en un tratamiento terapéutico de pacientes, preferiblemente en inmunoterapia. El uso puede ser para controlar a los pacientes durante una inmunoterapia.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona una composición farmacéutica que comprende un extracto de alérgenos según la presente invención. Se proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento de la alergia, que comprende como ingrediente activo una cantidad farmacéuticamente eficaz de un extracto de alérgenos según la presente invención y al menos un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. Se proporciona una composición de diagnóstico para la alergia que comprende como ingrediente activo una cantidad diagnósticamente eficaz de un extracto de alérgenos según la presente invención.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona una vacuna que comprende un extracto de alérgenos según la presente invención. La composición farmacéutica y la vacuna también pueden comprender uno o más adyuvantes, diluyentes, conservantes o sus mezclas. La composición farmacéutica o la vacuna pueden comprender un vehículo fisiológicamente aceptable. Tal como se emplea en la presente, la expresión "farmacéuticamente aceptable" significa preferiblemente un medio aprobado por una agencia reguladora de un gobierno, o listado en la Farmacopea Europea o de EEUU u otra farmacopea generalmente reconocida para su uso en seres humanos.

Estos vehículos farmacéuticamente aceptables pueden ser líquidos estériles, como agua y aceites, incluyendo los que tienen su origen en el petróleo, un origen animal, vegetal o sintético, como aceite de cacahuete, aceite de soja, aceite mineral, aceite de sésamo y similares. También pueden emplearse disoluciones salinas y disoluciones acuosas de dextrosa y glucosa como vehículos líquidos, en particular para disoluciones inyectables. Los excipientes farmacéuticos adecuados incluyen manitol, albúmina de suero humano (HSA), almidón, glucosa, lactosa, sacarosa, gelatina, malta, arroz, harina, tiza, gel de sílice, carbonato de magnesio, estearato de magnesio, estearato de sodio, monoestearato de glicerol, talco, cloruro de sodio, leche desnatada deshidratada, glicerol, propileno, glicol, agua, etanol y similares.

Según otro aspecto de la presente invención se proporciona un proceso para producir una vacuna de alérgenos, que comprende formular un extracto de alérgenos según la presente invención, con uno o más adyuvantes, diluyentes, conservantes o sus mezclas.

Se proporciona una vacuna que puede obtenerse según el proceso del otro aspecto de la presente invención. La vacuna puede ser para el uso subcutáneo o sublingual.

Se proporciona el uso de una vacuna según la presente invención para el tratamiento de la alergia cacahuetes, o para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la alergia.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para evitar una sensibilización a alérgenos, que comprende la etapa de exponer un individuo a una cantidad eficaz de un extracto de alérgenos, la composición farmacéutica o la vacuna de la presente invención.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un método para tratar una alergia en un individuo sensibilizado, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un extracto de alérgenos, la composición farmacéutica o la vacuna de la presente invención. El extracto de alérgenos, la composición farmacéutica o la vacuna puede administrarse por vía subcutánea o sublingual, y puede administrarse como una dosificación creciente o constante.

El individuo puede ser un ser humano o un animal, preferiblemente un ser humano.

Breve descripción de los dibujos Figura 1 : Resume el proceso para la producción de extractos de alérgenos. Figura 2: Análisis de HPLC del extracto de alérgenos de cacahuetes nativos: patrón de baja amplitud BioRad (carril 1 ), extracto nativo (carril 2), precipitado (carril 3), fracción 20 (carril 4), fracción 21 (carril 5), fracción 40 (carril 6), fracción 78 (carril 7), fracción 96 (carril 8), fracción 1 11 (carril 9).

Figura 3: Análisis de HPLC del extracto de alérgenos de cacahuete despigmentado polimerizado.

Figura 4: Análisis de HPLC del residuo del extracto de alérgenos de cacahuete despigmentado polimerizado: patrón de baja amplitud BioRad (carril 1), residuo del extracto despigmentado polimerizado (carril 2), precipitado (carril 3), fracción 21 (carril 4), fracción 51 (carril 5), fracción 74 (carril 6), fracción 75 (carril 7), fracción 120 (carril 8).

Figura 5: Análisis de SDS-PAGE de 40 g de extractos de alérgenos de cacahuete: STD (patrón de baja amplitud BioRad), carriles 1-4 bajo condiciones reductoras, carriles 5-8 bajo condiciones no reductoras, extracto nativo de cacahuete 230209/LN (carril 1), extracto despigmentado de cacahuete 230209/LD (carril 2), extracto despigmentado/polimerizado de cacahuete 030309/LP (carril 3), residuo del extracto despigmentado/polimerizado de cacahuete 030309/LP (carril 4), extracto nativo de cacahuete 230209/LN (carril 5), extracto despigmentado de cacahuete 230209/LD (carril 6), extracto despigmentado/polimerizado de cacahuete 030309/LP (carril 7), y residuo del extraco despigmentado/polimerizado de cacahuete 030309/LP (carril 8).

Figura 6: Análisis de IEF de 40 µ? de extractos de alérgenos de cacahuete: patrones marcadores de IEF Bio-Rad, pl 4,45-9,6 (carriles 1 y 2), extracto nativo de cacahuete 230209/LN (carril 3), extracto despigmentado de cacahuete 230209/LD (carril 4), extracto despigmentado/polimerizado de cacahuete 030309/LP (carril 5), residuo del extracto despigmentado/polimerizado de cacahuete 030309/LP (carril 6).

Figura 7: Análisis de inmunotransferencia de 40 µg de extractos de alérgenos de cacahuete bajo condiciones reductoras (figura 7a) y bajo condiciones no reductores (figura 7b) utilizando un pool de sueros de donantes alérgicos a los cacahuetes (dilución 1/20) y a-lgE-PO (120705, dilución 1/500), en la que en cada figura: extracto nativo de cacahuete 230209/LN (carril 1), extracto despigmentado de cacahuete 230209/LD (carril 2), extracto despigmentado/polimerizado de cacahuete 030309/LP (carril 3), residuo del extracto despigmentado/polimerizado de cacahuete 030309/LP (carril 4).

Figura 8: Análisis de la inhibición de inmunotransferencias de extractos de alérgenos de cacahuete bajo condiciones reductoras utilizando un pool de sueros de donantes alérgicos a los cacahuetes (dilución 1/20) y a-lgE-PO (120705, dilución 1/500), en la que el carril 1 es un control (sólo suero) y los carriles 2-4 utilizan los sueros agrupados junto con 800 µ? de extracto de alérgenos de cacahuete despigmentado/polimerizado, 400 µg de extracto (carril 3), y 200 µg de extracto (carril 4).

Figura 9: ELISA basado en el análisis de la inhibición de IgE de extractos de alérgenos de cacahuete.

La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos que detallan procesos para la preparación, la purificación, el tratamiento posterior y la polimerización de extractos que comprenden alérgenos. Los métodos A-D detallan los procesos utilizados para fabricar los extractos de alérgenos, y los ejemplos 1-8 detallan la caracterización experimental de un extracto de alérgenos despigmentado polimerizado o despigmentado.

Métodos A. Proceso de desgrasado del material de alérgenos bruto Los extractos desgrasados se obtuvieron mediante diversos métodos dependiendo de la naturaleza del material bruto. Los métodos para cada alérgeno se definen en cada ejemplo.

En general, el material homogeneizado se desgrasa en acetona a 3-5 °C y se filtra. Esta etapa se repite hasta que la acetona es transparente. El material desgrasado se recupera y se seca a temperatura ambiente hasta que toda la acetona haya desaparecido.

B. Preparación del extracto de alérgenos nativos El material desgrasado seco se pesó y se extrajo en PBS 0,01 M/NaCI 0,15 en una proporción de 1 :10 durante 4 horas a 3-5°C bajo agitación magnética. Después, la disolución se centrifugó durante 30 minutos a 4°C a 10.000 rpm. El sobrenadante resultante se recogió y se conservó a 3-5°C, y el sedimento se reconstituyó en PBS 0,01 M/NaCI 0,15 M (1 :10) y se extrajo durante la noche a 3-5°C bajo agitación magnética. Después la disolución se centrifugó durante 30 minutos a 3-5°C a 10.000 rpm y el sobrenadante se recogió y se mezcló con la fracción previamente obtenida. El extracto reunido se filtró utilizando un tamaño de poro de 0,45 µ?? y se dializó extensamente en membranas de diálisis de límite de exclusión de 3 kDa hasta que la conductividad fue menor que 1000 µß/at?. El extracto entonces se esterilizó mediante filtración utilizando un tamaño de poro de 0,22 µ?t?.

C. Preparación del extracto de alérgenos despigmentado El extracto nativo en disolución salina y mantenido a 3-5°C se trató después utilizando el siguiente procedimiento. Bajo agitación magnética, el pH de la disolución se ajustó a 2-2,1 mediante la adición de HCI 0,1 y se mantuvo bajo estas condiciones durante 15 minutos. Después el extracto se dializó en membranas de diálisis de límite de exclusión de 3,5 kDa con agua purificada durante 17 horas contra 10 volúmenes de agua purificada a 3-5°C. El agua purificada se sustituyó 4 veces durante este periodo. Después del tratamiento ácido débil, el extracto se recogió y el pH se ajustó a 7,3-7,4 utilizando NaOH 0,1 M. Por último, el extracto se esterilizó mediante filtración hasta conseguir 0,22 µp?, se congeló y se liofilizó.

D. Preparación del extracto de alérgenos despigmentado polimerizado El extracto despigmentado liofilizado se reconstituyó en PBS 0,01 M/NaCI 0,15 hasta una concentración final de 15 mg/ml con agitación magnética hasta que se dluyó completamente. El proceso de polimerización consistió en la adición de glutaraldehído, empleando 0,02 mi de glutaraldehído por mi de extracto despigmentado. El glutaraldehído se añadió al extracto despigmentado a una velocidad constante (36 ml/hora) utilizando un inyector automático. La reacción de polimerización se mantuvo durante 7 horas a temperatura ambiente. La reacción se detuvo mediante la adición de glicina en una proporción de 40 mg de glicerina por mi de disolución. La reacción se mantuvo durante la noche a 3-5°C bajo agitación magnética continua. Después la disolución se centrifugó a 10.000 rpm durante 30 minutos a 3-5°C. El sedimento se retiró y el sobrenadante se recogió y se dializó extensamente en membranas de diálisis de límite de exclusión de 100 kDa con agua purificada (16,67 mi de agua por mi de extracto) en condiciones refrigeradas. Se consideró que el proceso había finalizado cuando la conductividad fue menor que 210 µ5/??t?, y se confirmó la ausencia de glutaraldehído mediante barrido de UV/luz visible. Por último, el extracto se esterilizó mediante filtración utilizando un tamaño de poro de 0,22 µ??, se congeló y se liofilizó.

El producto final consiste en un extracto despigmentado y polimerizado liofilizado que se conservó a 4°C en condiciones de liofilización.

Caracterización inmunológica Contenido en proteínas El contenido en proteínas de los extractos nativo, despigmentado y despigmentado/polimerizado y del residuo despigmentado/polimerizado se midió mediante el método de Lowry-Biuret siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados para un lote experimental del ejemplo 1 se muestran en la tabla 1.

Cromatografía de exclusión molecular (HPLC) Una muestra liofilizada del extracto se resuspendió en agua muy purificada hasta una concentración final de 1 mg/ml y se agitó durante 10-15 minutos. La muestra se centrifugó a 13000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se trasladó a un vial para la inyección automática. La columna utilizada para el análisis de HPLC fue PL-aquagel-OH 60 8 µ?? (PolymerLabs), previamente equilibrada con agua, en la que el fraccionamiento se basa en las diferencias de tamaño. Las muestras se ensayaron con un caudal de 1 ml/min (siguiendo las recomendaciones del fabricante). Se detectaron las señales de UV a 254 nm y 280 nm para obtener un cromatograma. Las figuras 2-4 muestran los resultados del análisis de HPLC.

Electroforesis en ael de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio Se empleó un análisis de electroforesis en gel de poliacrilamida-dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) para determinar el perfil antigénico/de proteínas de los extractos. Las muestras se ensayaron en geles de SDS-PAGE con acrilamida de 2,67%, C y 15%T al, en condiciones nativas o desnaturalizadas (la disolución tampón contenía ß-mercaptoetanol y se calentó durante 10 minutos a 95°C). Se cargaron 40 microgramos de material liofilizado de cada extracto en los geles. Como control se pusieron marcadores de referencia con pesos moleculares conocidos (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EEUU) en el mismo gel. Los geles se tiñeron con azul de Coomassie R-250 (BioRad Laboratories). El perfil antigénico se estudió utilizando un escáner (Sharp JX-330; Sharp Electronics Corp., Mahwah, NJ) y se analizó utilizando Image Master l-D Elite v. 4.00 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). La figura 5 muestra un gel teñido con azul de Coomassie, en el que el extracto de alérgenos despigmentado/polimerizados, bajo condiciones no reductoras (carril 7), muestra la ausencia de alérgenos/proteínas no polimerizadas con un peso molecular menor que 100 kDa.

Enfoque isoeléctrico Se empleó un análisis de enfoque isoeléctrico (IEF) para determinar el perfil de proteínas/antigénico de los extractos según el punto isoeléctrico de las proteínas. Las muestras se ensayaron en geles de electroforesis de poliacrilamida en condiciones nativas. Se cargaron 40 microgramos de material liofilizado de cada extracto en los geles. Se ensayaron marcadores de referencia con puntos isoeléctricos conocidos (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EEUU) en el mismo gel. Los geles se tiñeron con azul Coomassie R-250 (BioRad Laboratories) y el perfil antigénico se estudió utilizando un escáner (Sharp JX-330; Sharp Electronics Corp., Mahwah, NJ) y se analizó utilizando Image Master l-D Elite v. 4.00 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia). Los carriles 3-6 de la figura 6 muestran los resultados para el extracto nativo (carril 3), despigmentado (carril 4), despigmentado/polimerizado (carril 5) y para el residuo de extracto despigmentado/polimerizado (carril 6).

Inmunotransferencia Las proteínas separadas mediante electroforesis se ellectrotransfirieron a membranas P-lmmobilon (Millipore, Bedford, MA). Después de la transferencia, las membranas se secaron a temperatura ambiente durante 4 horas. Las membranas se incubaron durante la noche con un pool de de sueros diluidos en salina tamponada con fosfato 0,01 M y Tween al 2%. Se detectó la unión específica a IgE utilizando un anticuerpo monoclonal anti-lgE humana conjugado con peroxidasa (Ingenasa, Madrid) durante 2 horas. El perfil alergénico se estudió utilizando el Sharp JX-330 y se analizó utilizando Image Master l-D Elite v. 4.00. Los carriles 1 -4 de la figura 7b muestran los resultados para el extracto nativo (carril 1 ), despigmentado (carril 2), despigmentado/polimerizado (carril 3) y para el residuo de extracto despigmentado/polimerizado (carril 4) bajo condiciones no reductoras. El extracto de alérgenos despigmentado/polimerizado no muestra bandas de reconocimiento de IgE por debajo de 100 kDa. En la figura 8, se observa inhibición de IgE utilizando diluciones de extractos de alérgenos de cacahuete polimerizados, comparado con un pool de sueros de donantes alérgicos a los cacahuetes.

Inhibición de ?a? Se ensayó la actividad alergénica in vitro de los extractos (nativo, despigmentado y polimerizado) mediante ELISA de inhibición, estableciendo el punto de inhibición del 50% utilizando un extracto nativo como referencia. Se revistieron placas de microvaloración de plástico (Immulon IV; Dynex Technologies, Chatilly, VA) con el extracto nativo (10 µg de proteína/ml) durante la noche. Se realizaron varias diluciones a partir de los extractos nativo, despigmentado y polimerizado. Cada dilución se incubó con un pool de sueros durante 2 horas a temperatura ambiente. Después las diluciones de los extractos se trasladaron a las placas con extracto nativo revestidas y se incubaron durante 2 horas. Después de lavar se añadieron 100 µ? de anti-lgE humana con peroxidasa y se dejó en reposo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar, las placas se revelaron durante 30 minutos y se detuvieron con ácido sulfúrico (1 N). Se observó la mayor inhibición de la unión de IgE utilizando el extracto de alérgenos despigmentado/polimerizado (figura 9).

Inhibición de laG Se ensayó la actividad alergénica ¡n vitro de los extractos (nativo, despigmentado y polimerizado) mediante ELISA de inhibición, estableciendo el punto de inhibición del 50% utilizando un extracto nativo como referencia. Se revistieron placas de microvaloración de plástico (Immulon IV; Dynex Technologies, Chatilly, VA) con el extracto nativo (10 µg de proteína/ml) durante la noche. Se realizaron varias diluciones a partir de los extractos nativo, despigmentado y polimerizado. Cada dilución se incubó con un pool de sueros durante 2 horas a temperatura ambiente. Después las diluciones de los extractos se trasladaron a las placas con extracto nativo revestidas y se incubaron durante 2 horas. Después de lavar se añadieron 100 µ? de anti-lgG humana con peroxidasa y se dejó en reposo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar, las placas se revelaron durante 30 minutos y se detuvieron con ácido sulfúrico (1 N).

Fluram La determinación de los grupos amino libres se detectó en extractos nativos, despigmentados y despigmentados-polimerizados. La polimerización reduce el número de grupos amino libres porque el entrecruzamiento entre alérgenos es mediado por este grupo reactivo. Se preparan extractos nativos y despigmentados a 25 µg ml y extractos despigmentados-polimerizados a 1000 µ?/???. Se emplea el ácido 6-aminocaproico a 2-10 mg ml como patrón. Se añade disolución de Evans a todas las muestras. Los grupos amino se diluyen en este tampón. Después se añade tampón borato de sodio (0,2 M) a todas las muestras y se homogeneizan. Por último se añade fluorescamina, previamente diluida en acetona, a la mezcla, y la disolución se mide en un fluorímetro, con excitación a 390 nm y emisión a 480 nm.

Espectrofotometría de barrido de UV/visible Los extractos nativo, despigmentado y despigmentado-polimerizado se diluyen a 1 mg/ml en PBS 0,01 M. Después de la dilución, las muestras se analizan a una ? entre 200 y 600 nm.

Potencia biológica mediante HEP La actividad biológica de los extractos (nativo y despigmentado) se mide mediante una competición REINA. Placas de microtitulación de plástico se tapizatapizan con anti-lgE humana. Se añade un pool de sueros de individuos alérgicos a las microplacas y se incuba durante 30 minutos. Las muestras y una referencia interna (IHR) se diluyen previamente y se incuban con la IHR marcada con peroxidasa. Después las microplacas se lavan y las muestras incubadas se añaden a las microplacas y se incuban durante 30 minutos. Por último, las microplacas se lavan y se incuban con cromógeno. Las placas se leen a 450 nm.

Toxicidad anómala en ratones Siguiendo las recomendaciones de la Farmacopea Europea, se inyectaron ratones hembra (raza NMRI) con 1 mi de los extractos de cacahuete despigmentado y polimerizado a concentraciones de 0,1 mg/ml y 1 mg ml. Se emplearon inyecciones intraperitoneales para la administración. El periodo de observación fue de 7 días después de los cuales no se observaron variaciones significativas en el peso o en el comportamiento en los animales.

Ejemplos Ejemplo 1 - Extracto de alérgenos de cacahuete Etapa A. Proceso de desgrasado del material de cacahuete bruto Se homogeneizaron cacahuetes pelados en un mezclador para obtener una suspensión homogeneizada. El material homogeneizado se desengrasó con acetona fría en una proporción de 1 kg de suspensión:2 I de acetona durante 1 hora a 3-5°C bajo agitación magnética continua para extraer los lípidos, los ácidos grasos y los flavonoides libres. La disolución resultante se filtró con un embudo Buchner. La acetona se retiró y el extracto de cacahuete se recogió en un filtro, y se lavó dos veces con acetona fresca. El proceso completo se repitió dos veces más hasta que la acetona recogida fue transparente. Después de terminar el proceso, el extracto de cacahuete desgrasado se recogió y se secó a temperatura ambiente bajo una campana de flujo laminar durante 12 horas, hasta que el material se secó totalmente y toda la acetona se hubo eliminado.

Se obtuvo un extracto de alérgenos de cacahuete despigmentado polimerizado según las etapas B-D del método.

Caracterización de los extractos de alérgenos de cacahuete El producto de extracto de alérgenos de cacahuete despigmentado polimerizado tenía que cumplir las siguientes especificaciones: a. que el producto sea soluble en agua, b. que no haya alérgenos/proteínas no polimerizados con un peso molecular menor que 100 kDa (identificados como bandas mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras), c. que no existan bandas de reconocimiento de IgE con un peso molecular menor que 100 kDa (identificadas mediante inmunotransferencia en condiciones no reductoras), d. que no existan moléculas polimerizadas con un peso molecular menor que 100 kDa (determinadas mediante cromatografía de exclusión molecular con HPLC), e. que presente una reducción de los grupos amino libres (75%) con respecto al extracto nativo (determinada mediante el método del fluram), f. que presente una reducción de la potencia biológica (95%) con respecto al extracto nativo (determinada mediante experimentos de inhibición ELISA de IgE utilizando un pool específico de sueros procedentes de individuos sensibilizados), g. que no haya toxicidad anormal en ratones.

El sedimento que comprende el residuo despigmentado/polimerizado se utilizó como control para la caracterización de los extractos nativo, despigmentado y despigmentado/polimerizado (véanse las tablas 1 y 2).

Tabla 1. Resumen de los resultados obtenidos con un lote experimental Ejemplo 2 · Extracto de alérgenos de ambrosía (Ambrosia artemisiifolia) Etapa A. Proceso de desgrasado del material de alérgeno bruto Polen de ambrosía recogido de la planta después de la polinización se desengrasó con acetona fría en una proporción 1:4 (en p/v) bajo agitación continua durante 3 horas a 3-5 °C. La disolución resultante se filtró con un embudo Buchner y se lavó al menos tres veces con acetona fresca. Después de terminar el proceso, el extracto desgrasado se recogió y se secó a temperatura ambiente bajo una campana de flujo laminar durante 12 horas, hasta que el material se secó totalmente y toda la acetona se hubo eliminado.

Se obtuvo el alérgeno de ambrosía (Ambrosia artemisiifolia) despigmentado polimerizado según las etapas B-D del método. El pH de la disolución se ajusta a 4-4,1 mediante la adición de HCI 0,1 M en la etapa 3.

El producto final consiste en un extracto de ambrosía despigmentado y polimerizado liofilizado que debe conservarse en condiciones de liofilización a 4 °C. El producto resultante tenía que cumplir las siguientes especificaciones: a. que el producto sea soluble en agua, b. que no haya alérgenos/proteínas no polimerizados con un peso molecular menor que 100 kDa (identificados como bandas mediante SDS-PAGE en condiciones no reductores), c. que no existan bandas de reconocimiento de IgE con un peso molecular menor que 100 kDa (identificadas mediante inmunotransferencia en condiciones no reductoras), d. que no existan moléculas polimerizadas con un peso molecular menor que 100 kDa (determinadas mediante cromatografía de exclusión molecular con HPLC), e. que presente una reducción de los grupos amino libres (75%) con respecto al extracto nativo (determinada mediante el método del fluram), f. que presente una reducción de la potencia biológica significativa con respecto al extracto nativo (determinada mediante experimentos de inhibición ELISA de IgE utilizando un pool específico de sueros procedentes de individuos sensibilizados), g. que se detecten anticuerpos monoclonales del alérgeno principal Amb a 1 , h. que no haya toxicidad anormal en ratones.

Contenido en el alérgeno principal El contenido en el alérgeno principal Amb a 1 se midió utilizando el kit Indoor Biotech (INDOOR Biotechnologies Inc., Charlottesville, Virginia, EEUU). Se tapizatapiza un anticuerpo IgG policlonal anti-Amb a 1 (1 :1000 del vial preparado a 1 mg/ml). Se prepara una curva patrón utilizando un extracto de ambrosía cuantificado y estandarizado frente a un extracto de la FDA de EEUU (referencia de inmunodifusión radial para Amb a 1 , C14-RAS que contiene 30 U de Amb a 1/ml) que contiene una actividad 2,5 U/ml de Amb a 1. El anticuerpo secundario consiste en un anticuerpo biotinilado IgG policlonal generado contra el alérgeno de A. artemissifolia. Las muestras nativa y despigmentada se diluyen a 500 ng/ml. Se calcula el contenido en el alérgeno principal en los extractos polimerizados utilizando estos valores.

El sedimento que comprende el residuo despigmentado/polimerizado se utilizó como control para la caracterización de los extractos nativo, despigmentado y despigmentado/polimerizado (véanse las tablas 3a y 3b).

Tabla 3a - Resumen de los resultados obtenidos para el ejemplo 2 (ambrosía, Ambrosia artemisiifolia) Tabla 3b - Resumen de los resultados obtenidos para el ejemplo 2 (ambrosía, Ambrosia artemisiifolia) Ejemplo 3 - Extracto de alérgenos del polen (Olea europaea) Polen de Olea europaea recogido del árbol después de la polinización se desengrasó con acetona fría en una proporción 1 :4 (en p/v) bajo agitación continua durante 3 horas a 3-5 °C. La disolución resultante se filtró con un embudo Buchner y se lavó al menos tres veces con acetona fresca. Después de terminar el proceso, el extracto desgrasado se recogió y se secó a temperatura ambiente bajo una campana de flujo laminar durante 12 horas, hasta que el material se secó totalmente y toda la acetona se hubo eliminado.

Se obtuvo el extracto de alérgeno de polen despigmentado según las etapas B- C del método.

El producto final consiste en un extracto despigmentado liofilizado que debe conservarse en condiciones de liofilización a 4 °C. El producto resultante tiene que cumplir las siguientes especificaciones: a. que el producto sea soluble en agua, b. que tenga un perfil de proteínas similar al extracto nativo, determinado mediante SDS-PAGE y 2D, c. que tenga un perfil alergénico similar al extracto nativo, determinado mediante inmunotransferencia, d. que tenga un contenido en proteínas similar al extracto nativo, e. que tenga un contenido en alérgeno principal similar al extracto nativo, f. que tenga una actividad biológica similar al extracto nativo.

Tabla 4 - Resumen de los resultados obtenidos para el ejemplo 3 (Olea europaea) Ejemplo 4 - Extracto de alérgenos del polen (Panetería judaica) Polen de Parietaria judaica recogido de la planta después de la polinización se desengrasó con acetona fría en una proporción 1 :4 (en p/v) bajo agitación continua durante 3 horas a 3-5 °C. La disolución resultante se filtró con un embudo Buchner y se lavó al menos tres veces con acetona fresca. Después de terminar el proceso, el extracto desgrasado se recogió y se secó a temperatura ambiente bajo una campana de flujo laminar durante 12 horas, hasta que el material se secó totalmente y toda la acetona se hubo eliminado.

Se obtuvo el extracto de alérgeno de polen desengrasado según la etapa B del método.

El producto final consiste en un extracto despigmentado liofilizado que debe conservarse en condiciones de liofilización a 4 °C. El producto resultante tiene que cumplir las siguientes especificaciones: a. que el producto sea soluble en agua, b. que tenga un perfil de proteínas similar al extracto nativo, determinado mediante SDS-PAGE y 2D, c. que tenga un perfil alergénico similar al extracto nativo, determinado mediante inmunotransferencia, d. que tenga un contenido en proteínas similar al extracto nativo, e. que tenga un contenido en alérgeno principal similar al extracto nativo, f. que tenga una actividad biológica similar al extracto nativo.

Tabla 5 - Resumen de los resultados obtenidos para el ejemplo 5 (Parietaria judaica) Ejemplo 5 - Extracto de alérgenos de ácaros (Dermatophagoides pteronyssinus) Se obtuvo el extracto de alérgenos de ácaros siguiendo la etapa B del método a partir de un cultivo maduro de Dermatophagoides pteronyssinus.

El producto final consiste en un extracto despigmentado liofilizado que debe conservarse en condiciones de liofilizacion a 4 °C. El producto resultante tenía que cumplir las siguientes especificaciones: a. que el producto sea soluble en agua, b. que tenga un perfil de proteínas similar al extracto nativo, determinado mediante SDS-PAGE y 2D, c. que tenga un perfil alergénico similar al extracto nativo, determinado mediante inmunotransferencia, d. que tenga un contenido en proteínas similar al extracto nativo, e. que tenga un contenido en alérgeno principal similar al extracto nativo, f. que tenga una actividad biológica similar al extracto nativo.

Contenido en el alérgeno principal El contenido en el alérgeno principal (Der p 1 y Der p 2) se midió utilizando los kits Indoor Biotech en D. pteronyssinus. Se revistieron anticuerpos IgG monoclonales anti-Der p 1 y/o anti-Der p 2 (1 :1000 del vial preparado a 1 mg/ml para Der p 1 , y 2 mg/ml para Der p 2) en pocilios de microtitulación de poliestireno (NUNC Maxisorp). Se prepara una curva patrón utilizando un patrón universal cuantificado y estandarizado (subestandarizado frente a la referencia de D. pteronyssinus de WHO/IUIS que contiene 2500 ng/ml de Der p 1 , y 1000 ng/ml de Der p 2). Las diluciones de la curva control son de 250-0,49 ng/ml para Der p 1 , y 100-0,2 ng/ml para Der p 2. Las muestras de ácaros se diluyeron en dos veces de forma rutinaria. Después de lavar la placa se añadieron 100 µ? de las muestras y el patrón de alérgeno diluido y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar la placa se añadieron 100 µ? de anticuerpo secundario (anticuerpo IgG monoclonal biotinilado) diluido 1/1000 y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. Después de lavar la placa se añadieron 100 µ? de estreptavidina-peroxidasa diluida 1/1000 y se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Por último la placa se lava, se revela añadiendo 100 µ? de ABTS 1 mM en tampón citrato fosfato 70 mM, pH 4,2, que contenía una dilución 1/1000 de H202 al 30% (es decir, ABTS 10 µ?/10 mi) y se leyó cuando la densidad óptica a 405 nm alcanzó 2,0-2,4.

Tabla 6 - Resumen de los resultados obtenidos para el ejemplo 5 (Dermatophagoides pteronyssinus) Ejemplo 6 - Extracto de alérgenos del carrizo (Phragmites communis) Polen de Phragmites communis recogido de la planta después de la polinización se desengrasó con acetona fría en una proporción 1 :4 (en p/v) bajo agitación continua durante 3 horas a 3-5 °C. La disolución resultante se filtró con un embudo Buchner y se lavó al menos tres veces con acetona fresca. Después de terminar el proceso, el extracto desgrasado se recogió y se secó a temperatura ambiente bajo una campana de flujo laminar durante 12 horas, hasta que el material se secó totalmente y toda la acetona se hubo eliminado.

Se obtuvo el extracto del alérgeno de Phragmites despigmentado polimerizado según las etapas B-D del método. En la etapa D, el proceso de polimerización consiste en la adición de glutaraldehído utilizando un factor de 0,015 mi de glutaraldehído/ml de extracto.

El producto final consiste en un extracto de Phragmites despigmentado y polimerizado liofilizado que debe conservarse en condiciones de liofilización a 4 °C. El producto resultante tenía que cumplir las siguientes especificaciones: a. que el producto sea soluble en agua, b. que no haya alérgenos/proteínas no polimerizados con un peso molecular menor que 100 kDa (identificados como bandas mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras), c. que no existan bandas de reconocimiento de IgE con un peso molecular menor que 100 kDa (identificadas mediante inmunotransferencia en condiciones no reductoras), d. que no existan moléculas polimerizadas con un peso molecular menor que 100 kDa (determinadas mediante cromatografía de exclusión molecular con HPLC), e. que presente una reducción de los grupos amino libres (75%) con respecto al extracto nativo (determinada mediante el método del fluram), f. que presente una reducción de la potencia biológica significativa con respecto al extracto nativo (determinada mediante experimentos de inhibición ELISA de IgE utilizando un pool especifico de sueros procedentes de individuos sensibilizados), g. que no haya toxicidad anormal en ratones.

El sedimento que comprende el residuo despigmentado/polimerizado se utilizó como control para la caracterización de los extractos nativo, despigmentado y despigmentado/polimerizado (véanse las tablas 7a y 7b).

Tabla 7a - Resumen de los resultados obtenidos para el ejemplo 6 (Phragmites communis) Tabla 7b - Resumen de los resultados obtenidos para el ejemplo 6 (Phragmites communis) Ejemplo 7 - Extracto de alérgenos epiteliales de gato Se desengrasó pelo de gato con acetona fría en una proporción 1 :4 (en p/v) manteniendolodurante cinco minutos de agitación cada hora durante 7 horas a 3-5 °C. El desengrasado continuó durante al menos 16 horas sin agitación. La disolución resultante se filtró con un embudo Buchner y se guardaron los matraces. El pelo de gato de nuevo se desengrasó con la misma acetona durante 1 hora a temperatura ambiente y se repitió dos veces. Los copos obtenidos se recogieron y se secaron a temperatura ambiente bajo una campana de flujo laminar durante 15 horas, hasta que el material se secó totalmente y toda la acetona se hubo eliminado.

En la etapa B, el material de copos de piel desengrasado secado obtenido de pelo de gato se pesa y se extrae en PBS 0,01 M/NaCI 0,15 M en una proporción 1 :40 durante 4 horas a 3-5 °C y bajo agitación magnética.

Se obtuvo el extracto del alérgeno de gato despigmentado polim erizado según las etapas B-D del método.

El producto final consiste en un extracto de epitelio de gato despigmentado y polimerizado liofilizado que debe conservarse en condiciones de liofilización a 4 °C. El producto resultante tenía que cumplir las siguientes especificaciones: a. que el producto sea soluble en agua, b. que presente una reducción de los grupos amino libres (75%) con respecto al extracto nativo (determinada mediante el método del fluram), c. que presente una reducción de la potencia biológica significativa con respecto al extracto nativo (determinada mediante experimentos de competición REINA de IgE utilizando pool específico de sueros procedentes de individuos sensibilizados), d. que puedan detectarse anticuerpos monoclonales frente al alérgeno principal Fel d 1 , e. que no haya toxicidad anormal en ratones.

Contenido en el alérgeno principal El contenido de alérgeno principal Fel d 1 se midió utilizando el kit Indoor Biotech. Se tapizatapiza un anticuerpo lgG1 monoclonal anti-Amb a 1 (1 :1000 del vial preparado a 1 mg/ml). Se prepara una curva patrón utilizando un patrón de alérgeno universal que contiene 1000 ng de Fel d 1/ml. El anticuerpo secundario consiste en un anticuerpo biotinilado lgG1 monoclonal generado contra el alérgeno epitelial de gato.

Las muestras nativa y despigmentada se diluyen a 250 ng/ml. Se calcula el contenido en el alérgeno principal en los extractos polimerizados utilizando estos valores.

El sedimento que comprende el residuo despigmentado/polimerizado se utilizó como control para la caracterización de los extractos nativo, despigmentado y despigmentado/polimerizado (véase la tabla 8).

Tabla 8 - Resumen de los resultados obtenidos para el ejemplo 7 (epitelio de gato) Ejemplo 8 - Extracto de alérgenos de Phleum pratense Polen de Phleum pratense recogido de la planta después de la polinización se desengrasó con acetona fría en una proporción 1 :4 (en p/v) bajo agitación continua durante 3 horas a 3-5 °C. La disolución resultante se filtró con un embudo Buchner y se lavó al menos tres veces con acetona fresca. Después de terminar el proceso, el extracto desengrasado se recogió y se secó a temperatura ambiente bajo una campana de flujo laminar durante 12 horas, hasta que el material se secó totalmente y toda la acetona se hubo eliminado.

Se obtuvo el extracto del alérgeno de Phleum pratense despigmentado polimerizado según las etapas B-D del método. En la etapa D, el proceso de polimerización consiste en la adición de glutaraldehído utilizando un factor de 0,009 mi de glutaraldehído/ml de extracto.

El producto final consiste en un extracto de Phleum pratense despigmentado y polimerizado liofilizado que debe conservarse en condiciones de liofilización a 4 °C. El producto resultante tenía que cumplir las siguientes especificaciones: a. que el producto sea soluble en agua, b. que no haya alérgenos/proteínas no polimerizados con un peso molecular menor que 100 kDa (identificados como bandas mediante SDS-PAGE en condiciones no reductores) , c. que no existan bandas de reconocimiento de IgE con un peso molecular menor que 100 kDa (identificadas mediante inmunotransferencia en condiciones no reductoras), d. que no existan moléculas polimerizadas con un peso molecular menor que 100 kDa (determinadas mediante cromatografía de exclusión molecular con HPLC), e. que presente una reducción de los grupos amino libres (75%) con respecto al extracto nativo (determinada mediante el método del fluram), f. que presente una reducción de la potencia biológica significativa con respecto al extracto nativo (determinada mediante experimentos de inhibición ELISA de IgE utilizando un pool específic de sueros procedentes de individuos sensibilizados), g. que no haya toxicidad anormal en ratones.

Contenido en el alérgeno principal El contenido en el alérgeno principal Phl p 5 se midió utilizando el kit Indoor Biotech. Se tapizatapiza un anticuerpo lgG1 monoclonal anti-Phl p 5 (1 :1000 del vial preparado a 2 mg ml). Se prepara una curva patrón utilizando un Phl p 5a recombinante. El anticuerpo secundario consiste en un anticuerpo biotinilado lgG1 monoclonal generado contra el alérgeno de Phleum pratense. Las muestras nativa y despigmentada se diluyen a 250 ng/ml. Se calcula el contenido en el alérgeno principal en los extractos polimerizados utilizando estos valores.

El sedimento que comprende el residuo despigmentado/polimerizado se utilizó como control para la caracterización de los extractos nativo, despigmentado y despigmentado/polimerizado (véase la tabla 9).

Tabla 9 - Resumen de los resultados obtenidos para el ejemplo 8 (Phleum pratense) Referencias bibliográficas 1. Vickery, B., Burks, W., Immunotherapy in the treatment of food allergy: focus oral \olerance, Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol., 2009, 9:364-370. 2. King, R.M., Knibb, R.C., y Hourihane, J.O.B., Impact of peanut allergy on quality of Ufe, stress and anxiety in the family, Allergy, 2009, 64:461-468. 3. Enrique, E., Pineda, F., Malek, T., Bartra, J., Basagaña, M., Telia, R., Castelló, J.V., Alonso, R., de Mateo, J.A., Cerdá-Trias, T., San Miguel-Moncín Mdel, M., Monzón, S., García, M., Palacios, R., Cisteró-Ba ima, A., Sublingual immunotherapy for hazeinut food allergy: a randomized, double-blind, placebo- controlled study with a standardized hazeinut extract, J. Allergy Clin. Immunol., 2005, 116(5):1073-1079. 4. Fernández-Rivas, M., Garrido Fernández, S., Nadal, J.A., Díaz de Durana, M.D., García, B.E., González-Mancebo, E., Martín, S., Barber, D., Rico, P., Tabar, A.I., Randomized double-blind, placebo-controlled trial of sublingual immunotherapy with a Pru p 3 quantified peach extract, Allergy, 2009, 64(6):876-883. 5. Hofmann, A.M., Scurlock, A.M., Jones, S.M., Palmer, K.P., Lokhnygina, Y., Steele, P.H., Kamilaris, J., Burks, A.W., Safety of a peanut oral immunotherapy protocol in children with peanut allergy, J. Allergy Clin. Immunol., 26 de mayo 2009. 6. Jones, S.M., Pons, L, Roberts, J.L., Scurlock, A.M., Perry, T.T., Kulis, M., Shreffler, W.G., Steele, P., Henry, K.A., Adair, M., Francis, J.M., Durham, S., Vickery, B.P., Zhong, X., Burks, A.W., Clinical efficacy and immune regulation with peanut oral immunotherapy, J. Allergy. Clin. Immunol., agosto 2009, 124(2):292-300, 300. 7. Clark, A.T., Islam, S., King, Y., Successful oral tolerance induction in severo peanut allergy, Allergy, agosto 2009, 64(8):1218-1220. 8. Wallace, D.V., Pet dander and perennial allergic rhinitis: therapeutic options, Allergy Asthma Proc, nov.-dic. 2009, 30(6):573-583. 9. Ling, M., Long, A.A., Pet dander and difficult-to-control asthma: Therapeutic options, Allergy Asthma Proc, sept. 2010, 31 (5):385-391. 10. Grónlund, H., Saarne, T., Gafvelin, G., van Hage, M., The major cat allergen, Fel d 1, ¡n diagnosis and therapy, Int. Arch. Allergy Immunol., 2010, 51 (4):265-274, Epub 22 de oct. de 2009, artículo.

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Claims (17)

REIVINDICACIONES

1.- Un proceso para producir un extracto de alérgenos que comprende: a) poner en contacto un material de origen natural con un agente de extracción líquida para producir una mezcla que contiene lípidos disueltos en la fase líquida, y una fase sólida que consiste en residuos del material de origen que comprenden alérgenos y proteínas, entre otras muestras biológicas b) someter la mezcla a una primera etapa de separación para aislar los residuos del material de origen; c) poner en contacto los residuos del material de origen con un agente de extracto de alérgenos para producir una mezcla de alérgenoalérgenos/proteinas disuelta en la fase líquida, y una fase sólida que consiste en residuos no alergénicos, d) someter la mezcla a una segunda etapa de separación para aislar los alérgenos disueltos en la fase líquida, para producir un extracto de alérgenos bruto, e) someter al extracto de alérgenos bruto a una etapa de eliminación de fracciones de bajo peso molecular para eliminar las moléculas que tengan un tamaño molecular menor que 3,5 kDa, y f) llevar a cabo la etapa e) hasta que el extracto de alérgenos tenga una conductividad menor que 1000 S/cm a 3-5°C para obtener un extracto de alérgenos nativos purificado.

2.- Un proceso según la reivindicación 1 , en el que la etapa de eliminación de fracciones de bajo peso molecular continúa hasta que la conductividad es menor que 500 µe/a? a 3-5°C.

3.- Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una etapa de tratamiento posterior que comprende: g) acidificar el extracto de alérgenos nativos hasta pH 2-3,0 y mantener el extracto acidificado durante 5-30 minutos, seguido de someter al extracto a una etapa de eliminación de fracciones de bajo peso molecular para eliminar las moléculas que tengan un tamaño molecular menor que 3,5 kDa, y ajustar el pH a 7,0-8,0 para producir un extracto de alérgenos despigmentado.

4.- Un proceso según la reivindicación 3, en el que el extracto de alérgenos nativos se acidifica hasta pH 2-2,1.

5. - Un proceso según la reivindicación 3, en el que el extracto de alérgenos nativos se acidifica hasta pH 2,0-4,0.

6. - Un proceso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además una etapa de polimerización que comprende: h) poner en contacto un extracto de alérgenos nativos o un extracto de alérgenos despigmentado con glutaraldehído o formaldehído, i) someter el extracto a una etapa de eliminación de fracciones moleculares para eliminar las moléculas que tengan un tamaño molecular menor que 100 kDa, y j) llevar a cabo la etapa i) hasta que el extracto de alérgenos tenga una conductividad menor que 210 µß/?Gt? a 3-5°C y/o está ausente de glutaraldehído, determinado mediante barrido de UV o de luz visible, para obtener un extracto de alérgenos polimerizado o un extracto de alérgenos despigmentado polimerizado.

7. - Un extracto de alérgenos nativos que puede obtenerse según el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones.

8. - Un extracto de alérgenos despigmentado que puede obtenerse según el proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 3 o 4.

9. - Un extracto de alérgenos despigmentado polimerizado que puede obtenerse según el proceso de la reivindicación 5.

10.- Un extracto de alérgenos según las reivindicaciones 6-8, en el que el material de origen se selecciona de alérgenos alimentarios, cacahuetes, cacahuetes enteros, alérgenos aéreos (por ejemplo, polen (polen de árboles, polen de hierbas, polen de gramíneas, polen de cereales), ácaros del polvo, hongos, mohos), ácaros, alérgenos de gramíneas, árboles y hierbas, alérgenos epiteliales (pelo de animales, caspa de animales, por ejemplo pelo y caspa de gato, y pelo y caspa de perro), y alérgenos de insectos (por ejemplo, cucarachas, pulgas, veneno de abejas y de avispas).

11.- Un extracto de alérgenos según la reivindicación 9, en el que el material de origen se selecciona de alérgenos alimentarios (Arachis hypogaeá), polen {AInus glutinosa, Betula alba, Coryius avellana, Cupressus arizonica, Olea europea, Platanus sp., Cynodon dactylon, Dactylis glomerata, Festuca elatior, Holcus lanatus, Lolium perenne, Phleum pratense, Phragmites communis, Poa pratensis, Ambrosia elatior, Artemisia vulgaris, Chenopodium álbum, Parietaria judaica, Plantago lanceolata, Salsola kali, Avena sativa, Hordeum vulgaris, Sécale cereale, Triticum aestivum, Zea mays), ácaros del polvo {Acarus siró, Blomia tropicalis, Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides microceras, Dermatophagoides pteronyssinus, Euroglyphus maynei, Lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiaé), hongos y mohos {Alternaría altérnate, Cladosporium herbarum, Aspergillus fumigatus), alérgenos epiteliales (pelo y caspa de gatos, pelo y caspa de perros, pelo y caspa de caballos, pelo y caspa humanos, pelo y caspa de conejos, y plumas), alérgenos de insecto (hormigas, pulgas, ácaros, cucarachas, veneno de abejas, y veneno de avispas).

12. - Un extracto de alérgenos de la reivindicación 9, en el que el material de origen se selecciona de cacahuetes (Arachis hypogaea), polen {Olea europaea, Parietaria judaica, Phragmites communis y Phleum pratense), ácaros (Dermatophagoides pteronyssinus) y material epitelial (caspa de gato).

13. - Un extracto de alérgenos de la reivindicación 12, en el que el material de origen es Arachis hypogaea.

14. - Un extracto de alérgenos según una cualquiera de las reivindicaciones 6-13 para su uso en el tratamiento de la alergia.

15. - El uso de un extracto de alérgenos de la reivindicación 13 para el tratamiento de la alergia a los cacahuetes.

16. - Una composición farmacéutica que comprende un extracto de alérgenos según una cualquiera de las reivindicaciones 12-15.

17.- Una vacuna que comprende un extracto de alérgenos según una cualquiera de las reivindicaciones 6-13.