CN104447943A - 一种提取狗毛皮屑变应原的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种提取狗毛皮屑变应原的方法，包括如下步骤：1)狗毛皮屑脱脂；2)使用缓冲有效量的pH7.5～10.0的浸提缓冲液进行浸提，收集粗浸提液；3)使用酸性化合物调节步骤2)所得到的粗浸提液的pH至pH3.0～5.0，沉淀部分非变应原的杂蛋白，并且过滤除去杂蛋白。采用本发明方法获得的狗毛皮屑变应原浸提液中主要变应原占总蛋白的比例明显提高。

Description

一种提取狗毛皮屑变应原的方法

技术领域

本发明属于生物药物技术领域，具体涉及一种提取狗毛皮屑变应原的方法。

背景技术

过敏性疾病是当今世界上最常见的疾病之一。过敏性疾病的发病率约占人口的20％。过敏性疾病从新生儿到老年人的各年龄段均可能发生，且有明显的遗传性倾向。过敏性疾病包括过敏性哮喘、过敏性鼻炎、特应性皮炎、过敏性结膜炎等，严重的甚至会威胁到人的生命(过敏性休克)。

当变应原通过食入或吸入等方式进入体内后，会诱导B细胞产生特异性的抗体IgE(sIgE)。sIgE会牢固地结合在肥大细胞、噬碱粒细胞表面。当变应原再次进入体内时，会与这些sIgE相结合。这种结合会诱导与sIgE结合的肥大细胞和噬碱粒细胞释放生物活性介质。释放的生物活性介质除了组织胺以外，还可以是前列腺素D2、白三烯、血小板活化因子等，它们的作用都相似，都可引起平滑肌收缩，毛细血管扩张和通透性增强，腺体分泌物增多，即导致过敏性疾病的发生。

引起过敏的主要变应原之一是动物皮屑。其中狗毛皮屑是最重要的动物变应原之一，可能诱发过敏性哮喘、过敏性鼻炎或特应性皮炎等疾病。国内外狗致敏性疾病都比较普遍，受累人群众多。在我国，据王瑞琦等报道，2008年至2010年在北京协和医院变态反应科就诊的患者共计204968例次，狗变应原阳性率38.1％。在美国，Ingram等发现Los Alamos地区约67％的哮喘患儿血清中可检测到针对狗变应原的特异性IgE抗体。

由于导致过敏性疾病的变应原种类繁多，因此，进行诊断导致患者过敏的变应原种类的检测显得尤为重要，其中，皮肤点刺试验是目前临床上最常见的变应原体内诊断方法。当变应原进入过敏性疾病患者皮肤后，与肥大细胞上的特异性IgE抗体结合，导致肥大细胞脱颗粒释放组胺等炎症介质，使局部血管扩张，渗出增加，引起皮肤表面的风团和红晕反应。患者机体对变应原刺激的敏感程度与体内组胺的释放量、皮肤表面的风团反应呈正相关。

过敏性疾病的治疗方法主要有对症药物治疗与特异性免疫治疗。现有的对症药物主要包括抗组胺药物、过敏反应介质阻滞剂、钙剂、免疫抑制剂等。但对症药物常伴有不同的副作用，且长期或大剂量服用易产生耐药性，因此并不能达到根治的效果。特异性免疫治疗是在皮肤点刺试验或其他方法验证导致过敏的主要变应原物质后，将主要变应原制成不同浓度的药物制剂，通过梯度递增的给药方式连续给患者以变应原制剂，从而使患者对变应原脱敏。特异性免疫治疗是一种对因治疗，世界卫生组织WHO在其关于免疫脱敏的指导性文件中明确指出：“脱敏治疗是唯一可以改变过敏性疾病自然进程的治疗方法”。

过敏性疾病的诊断和治疗上，变应原药物制剂都起到了至关重要的作用，因此，开发稳定而有效的变应原药物制剂具有重要的意义。

目前，对于狗毛皮屑变应原的获取方法主要是收集狗毛皮屑直接进行提取，获得狗毛皮屑变应原浸提液。由于狗毛皮屑中含有较多的杂质，现有的方法不能很好地去除非变应原的杂蛋白，导致狗毛皮屑变应原浸提液中变应原蛋白占总蛋白的比例较低。

发明内容

本发明所要解决的技术问题即克服狗毛皮屑变应原浸提液变应原得率较低的缺陷，提供一种提取较高变应原比率的狗毛皮屑变应原的方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种提取狗毛皮屑变应原的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

1)狗毛皮屑脱脂；

2)使用缓冲有效量的pH7.5～10.0的浸提缓冲液进行浸提，收集粗浸提液；

3)使用酸性化合物调节所述步骤2)得到的粗浸提液的pH至pH3.0～5.0，沉淀部分非变应原的杂蛋白；并且过滤除去杂蛋白。

在一个优选的实施方案中，所述提取狗毛皮屑变应原的方法包含以下步骤：

1)狗毛皮屑脱脂；

2)使用缓冲有效量的pH7.5～10.0的浸提缓冲液进行浸提，收集粗浸提液；

3)使用酸性化合物调节所述步骤2)得到的粗浸提液的pH至pH3.0～5.0，沉淀部分非变应原的杂蛋白，并且过滤除去杂蛋白；

4)将步骤3)得到的滤液浓缩至原体积的1/10～1/150；

5)将步骤4)得到的浓缩液中加入药学上可接受的载体；

6)过滤除菌。

在一个优选的实施方案中，在所述步骤1)前还可以将狗毛皮屑材料进行粉碎(更优选的使用液氮粉碎)。

在一个优选的实施方案中，所述的提取方法步骤2)浸提还可以加入0.1％～5％NaCl。在一个更优选的实施方案中，所述NaCl浓度为0.5％～2％。在一个还要优选的实施方案中，所加入的NaCl浓度为1％。

在一个优选的实施方案中，狗毛皮屑的来源选自：中华田园犬、边境牧羊犬、德国牧羊犬、中国沙皮犬、阿拉斯加雪橇犬、萨摩耶、拉布拉多寻回犬。

在一个优选的实施方案中，在所述步骤1)中，使用有机溶剂脱脂，并且脱脂后干燥。在一个更优选的实施方案中，脱脂所使用的有机溶剂选自丙酮、乙醚、无水乙醇、甲苯。在一个优选的实施方案中，所述步骤1)中所述有机溶剂加入量与狗毛皮屑质量比为1∶5～1∶50w/v。

在一个优选的实施方案中，所述步骤2)的浸提缓冲液的pH为pH8.0～9.0。在另一个优选的实施方案中，所述步骤2)的浸提缓冲液选自pH7.6的磷酸盐缓冲液、pH8.0的硼酸盐缓冲液、pH8.2的磷酸盐缓冲液、pH8.5的硼酸盐缓冲液。

在一个优选的实施方案中，所述步骤3)的酸性化合物选自柠檬酸、盐酸、硫酸、磷酸、乙酸。

在一个优选的实施方案中，在所述步骤3)中使用酸性化合物调节粗浸提液的pH至pH3.0～4.5。在一个更优选的实施方案中，所述步骤3)使用酸性化合物调节粗浸提液的pH至pH3.5～4.5。在一个最优选的实施方案中，所述步骤3)使用酸性化合物调节粗浸提液的pH至pH4.0。

在一个优选的实施方案中，所述步骤3)的过滤方法选自离心过滤、滤膜过滤。

在一个优选的实施方案中，在所述步骤4)中的浓缩方法选自超滤、透析。

在一个优选的实施方案中，在所述步骤4)中，所述浓缩时使用pH5.0～7.0的缓冲液更换缓冲体系。在一个更加优选的实施方案中，在所述步骤4)中，浓缩时使用pH5.5～6.5的缓冲液更换缓冲体系。

在一个优选的实施方案中，所述步骤4)浓缩时使用的代替原浸提液的pH5.0～7.0的缓冲液选自：甘氨酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、乙酸-EDTA缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、碳酸钠-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液、氯化钾-盐酸缓冲液、氯化钾-氢氧化钠缓冲液。

在一个更优选的实施方案中，所述步骤4)浓缩时替代浸提液所使用的pH5.0～7.0的缓冲液选自：pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液、pH5.5的乙酸-EDTA缓冲液、pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH6.5的Tris-盐酸缓冲液、pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。

在一个优选的实施方案中，所述步骤4)将所述步骤3)得到的滤液浓缩至原体积的1/40～1/100。

在一个优选的实施方案中，所述步骤5)的药学上可接受的载体选自多元醇、药用防腐剂、氨基己酸或其组合。其中，所述的多元醇选自：丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇，浓度范围在40％～60％v/v，更优选的为45％～55％v/v的甘油。所述的药用防腐剂选自苯酚、硫柳汞、苯甲酸、山梨酸、山梨酸盐类、对羟基苯甲酸酯类、苯甲醇、苯乙醇或其组合，浓度范围在0.1％～3％w/v。更优选的为药用防腐剂为0.1％～0.5％w/v的苯酚。所述的氨基己酸的浓度范围在0.1％～2.0％w/v，优选的氨基己酸浓度范围在0.3％～1.0％w/v，更优选的氨基己酸浓度为0.65％w/v。

利用本发明所述的提取方法提取的狗毛皮屑变应原，主要变应原占总蛋白的比例明显提高。所提取的狗毛皮屑变应原可以用于制备含有狗毛皮屑变应原的药物组合物，以用于诊断或治疗由狗毛皮屑变应原引起的免疫性疫病。

具体实施方式

本发明提供了一种提取狗毛皮屑变应原的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

1)狗毛皮屑脱脂；

2)使用缓冲有效量的pH7.5～10.0的浸提缓冲液进行浸提，收集粗浸提液；

3)使用酸性化合物调节所述步骤2)得到的粗浸提液的pH至pH3.0～5.0，沉淀部分非变应原的杂蛋白，并且过滤除去杂蛋白。

在一个优选的实施方案中，所述提取狗毛皮屑变应原的方法包含以下步骤：

1)狗毛皮屑脱脂；

2)使用缓冲有效量的pH7.5～10.0的浸提缓冲液进行浸提，收集粗浸提液；

3)使用酸性化合物调节所述步骤2)得到的粗浸提液的pH至pH3.0～5.0，沉淀部分非变应原的杂蛋白，并且过滤除去杂蛋白；

4)将步骤3)得到的滤液浓缩至原体积的1/10～1/150；

5)将步骤4)得到的浓缩液中加入药学上可接受的载体；

6)过滤除菌。

本发明中的“包含以下步骤”是指该方法除了所列出的必要步骤外，还可以有任何其它有帮助或促进该项实施方案完成的操作步骤。

在一个优选的实施方案中，狗毛皮屑的来源包括：中华田园犬、边境牧羊犬、德国牧羊犬、中国沙皮犬、阿拉斯加雪橇犬、萨摩耶、拉布拉多寻回犬等。狗毛皮屑可以通过商业途径购买，也可以通过其他途径获得。

在一个优选的实施方案中，狗毛皮屑材料获得后首先通过研磨使其粉碎。在一个更优选的实施方案中，研磨在低温条件下进行。低温环境下进行研磨，有利于保持狗毛皮屑变应原蛋白的活性。研磨方法可以是但不限于：液氮研磨。

在一个优选的实施方案中，在所述步骤1)中，使用有机溶剂脱脂，并且脱脂后干燥。在一个更加优选的实施方案中，所使用的有机溶剂选自但不限于乙醚、丙酮、无水乙醇、甲苯。将脱脂有机溶剂与狗毛皮屑材料以一定比例(较佳1∶5～1∶50w/v，更佳1∶5～1∶25w/v，还要佳1∶10～1∶20w/v)混合，搅拌1～24小时(较佳1～12小时，更佳1～6小时，还要佳1～3小时，最佳2小时)，弃上层脱脂有机溶剂。脱脂2～6次，至脱脂后的有机溶剂为无色，将脱脂后的固体物自然干燥后称重。实验室操作应在通风橱内完成，中试采用真空浓缩提取罐。

在一个具体的实施方案中，所述步骤1)使用丙酮作为脱脂溶剂。将丙酮与狗毛皮屑材料以一定比例(较佳1∶5～1∶50w/v，更佳1∶5～1∶25w/v，还要佳1∶10～1∶20w/v)混合，搅拌1～24小时(较佳1～12小时，更佳1～6小时，还要佳1～3小时，最佳2小时)，弃上层丙酮。脱脂2～6次，至脱脂后的丙酮为无色，将脱脂后的固体物自然干燥后称重。

动物来源原料中的蛋白质多为酸性蛋白。在本发明所述步骤2)中，选择偏碱性pH值的浸提液，可增大蛋白质的溶解度，提高提取效果。在一个优选的实施方案中，所述步骤2)的浸提缓冲液的pH范围为pH8.0～9.0。在另一个优选的实施方案中，浸提缓冲液选自pH7.6的磷酸盐缓冲液、pH8.0的硼酸盐缓冲液、pH8.2的磷酸盐缓冲液、pH8.5的硼酸盐缓冲液。

在一个优选的实施方案中，所述步骤2)的浸提缓冲液中还可以加入0.1％～5％NaCl。在一个更优选的实施方案中，所述NaCl浓度为0.5％～2％。在一个还要优选的实施方案中，所加入的NaCl浓度为1％。

在一个优选的实施方案中，所述的浸提过程可在低温下(优选2～8℃)进行。低温下进行浸提可以保护蛋白的活性，减少蛋白失活的比例，同时避免浸提过程中微生物繁殖、减少狗自身酶系的作用。

在一个具体的实施方案中，在2～8℃条件下，所述步骤2)以一定的比例(优选1∶5～1∶50w/v，更优选1∶10～1∶40w/v，还要优选1∶20～1∶30w/v)加入pH7.5～10.0的磷酸盐缓冲液(优选pH8.2的磷酸盐缓冲液)和0.1％～5％NaCl(优选0.5％～2％NaCl，更优选1％NaCl)，充分接触搅拌1～72小时(优选进行10～70小时，更优选48～60小时)，离心或/并过滤，获得粗浸提液。

在一个优选的实施方案中，所述步骤3)的酸性化合物选自但不限于柠檬酸、盐酸、硫酸、磷酸、乙酸。使用所述酸性化合物调节所述步骤2)得到的粗浸提液的pH至pH3.0～5.0，更佳至pH3.0～4.5，再佳至pH3.5～4.5，最佳至pH4.0。

本发明所述步骤3)主要是根据不同蛋白等电点不同的原理而设计的。等电点为本领域技术人员所熟知的专业术语。在某一pH的溶液中，氨基酸或蛋白质解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的pH成为该氨基酸或蛋白质的等电点。当溶液pH为该蛋白等电点时，该蛋白在溶液中的溶解度最低。通过反复研究发现，将狗毛皮屑的粗浸提液pH调节至pH3.0～5.0(更佳至pH3.0～4.5，再佳至pH3.5～4.5，最佳至pH至pH4.0)时，各种杂蛋白因溶解度降低而沉淀，即主要变应原蛋白(例如狗毛皮屑主要变应原蛋白Can f1)在浸提液中的比例提高。

在一个优选的实施方案中，在所述步骤3)中使用酸性化合物(选自但不限于柠檬酸、盐酸、硫酸、磷酸、乙酸)将粗浸提液pH调节至pH3.0～5.0(更佳至pH3.0～4.5，再佳至pH3.5～4.5，最佳至pH4.0)，静置12～72小时(优选24～60小时，更优选的48～60小时)，静置后使用离心过滤或滤膜过滤将沉淀去除。其中，若过滤步骤使用滤膜过滤，则可以依次按孔径从大到小的顺序使用滤膜进行过滤，直至滤过顺畅。优选地，可以依次选用孔径为3μm、0.8μm、0.45μm、0.22μm的滤膜进行过滤。若过滤步骤使用离心过滤，则以转速10000～13000rpm离心(优选在2～8℃条件下进行离心)5～30分钟，弃沉淀，离心可重复2～5次。

在一个优选的实施方案中，在低温条件下(优选2～8℃)使用酸性化合物(选自但不限于柠檬酸、盐酸、硫酸、磷酸、乙酸)将粗浸提液pH调节至pH3.0～5.0(更佳至pH3.0～4.5，再佳至pH3.5～4.5，最佳至pH4.0)。

在一个具体的实施方案中，2～8℃条件下，用柠檬酸将粗浸提液pH调节至pH3.0～5.0(优选pH3.0～4.5，进一步优选pH3.5～4.5，最优选pH4.0)，静置12～72小时(优选24～60小时，更优选的48～60小时)，然后依次按孔径从大到小的顺序使用3μm、0.8μm、0.45μm、0.22μm滤膜进行过滤，直至滤过顺畅，去除沉淀。

在另一个具体的实施方案中，用乙酸将粗浸提液pH调节至pH3.0～5.0(优选pH3.0～4.5，进一步优选pH3.5～4.5，最优选pH4.0)，静置12～72小时(优选24～60小时，更优选的48～60小时)，然后在转速10000～13000rpm离心(优选在2～8℃条件下进行离心)5～30分钟，弃沉淀，离心可重复2～5次。

本发明所述步骤4)的浓缩是为了将步骤3)得到的滤液浓缩至原体积的1/10～1/150，进一步提高变应原蛋白的浓度。浓缩方法选自超滤或透析，可以选择截留孔径为3～20kD(优选的为3～10kD，更优选的为5kD)的超滤膜或透析膜进行浓缩。在一个优选的实施方案中，所述步骤4)将步骤3)得到的滤液浓缩至原体积的1/40～1/100。

在一个优选的实施方案中，在所述步骤4)的浓缩(超滤或透析)过程中可以进行缓冲液的替换，即将浸提时的缓冲液替换成其他的缓冲体系。此处，更换缓冲体系可以使狗毛皮屑变应原浸提液更加稳定。同时，利用换液的过程，可以部分除去浸提液中可能存在的色素等无变应原活性成分。

在一个优选的实施方案中，在所述步骤4)中，浓缩时使用pH5.0～7.0的缓冲液更换缓冲体系。所述pH5.0～7.0的缓冲液选自：甘氨酸-盐酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、柠檬酸-氢氧化钠-盐酸缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、乙酸-乙酸钠缓冲液、乙酸-EDTA缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液、磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液、Tris-盐酸缓冲液、硼砂-盐酸缓冲液、硼酸-硼砂缓冲液、甘氨酸-氢氧化钠缓冲液、硼砂-氢氧化钠缓冲液、碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液、碳酸钠-氢氧化钠缓冲液、磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲液、氯化钾-盐酸缓冲液、氯化钾-氢氧化钠缓冲液。

在一个更加优选的实施方案中，在所述步骤4)浓缩时，使用pH5.5～6.5的缓冲液更换缓冲体系。在另一个更加优选的实施方案中，在所述步骤4)浓缩时，使用的缓冲液选自：pH5.0的乙酸-乙酸钠缓冲液、pH5.5的乙酸-EDTA缓冲液、pH6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、pH6.5的Tris-盐酸缓冲液、pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。

在一个优选的实施方案中，所述步骤4)的超滤可重复进行多次(更优选进行2～5次)。多次进行超滤可以更好地去除杂质，更好地浓缩浸提液，并且更充分地替换缓冲体系。

在一个优选的实施方案中，所述步骤5)加入的药学上可接受的载体选自但不限于：多元醇、药用防腐剂、氨基己酸或其组合。其中，所述的多元醇选自但不限于：丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇，多元醇浓度范围在40％～60％v/v，更优选的为45％～55％v/v的甘油。所述的药用防腐剂选自但不限于：苯酚、硫柳汞、苯甲酸、山梨酸、山梨酸盐类、对羟基苯甲酸酯类、苯甲醇、苯乙醇或其组合，所述药用防腐剂浓度范围在0.1％～3％w/v，更优选的为0.1％～0.5％w/v的苯酚。所述的氨基己酸的浓度范围在0.1％～2.0％w/v，优选的氨基己酸浓度范围在0.3％～1.0％w/v，更优选的氨基己酸浓度为0.65％w/v。加入多元醇、药用防腐剂、氨基己酸或其组合，有利于液体药物组合物的稳定性。

在一个优选的实施方案中，所述步骤6)使用的滤膜选自孔径为3μm、0.8μm、0.45μm、0.22μm的滤膜或其组合。若使用不同孔径滤膜组合，则按照孔径由大至小的顺序原则进行使用。过滤除菌可有效地去除液体药物组合物中的细菌，有利于更长时间的保存。

利用本发明所述的方法获得的狗毛皮屑变应原，主要变应原蛋白(Can f1)占总蛋白的比例较现有方法有显著提高。所提取的狗毛皮屑变应原可以用于制备含有狗毛皮屑变应原的药物组合物，以用于诊断或治疗由狗毛皮屑变应原引起的过敏性疾病。

下面将结合实施例进一步详细地描述本发明。然而应当理解，列举这些实施例只是为了起说明作用，而并不是用来限制本发明的范围。

实施例1不同pH值的酸性化合物沉淀狗毛皮屑变应原粗浸提液的效果比较

发明人发现，使用酸性化合物将狗毛皮屑变应原粗浸提液的pH调至pH3.0～5.0(优选pH3.5～4.5，更优选pH4.0)时，各种杂蛋白的溶解度降低而沉淀，即主要变应原蛋白(例如Can f1)的比例提高。本试验分别选择将狗毛皮屑的粗浸提液pH调节至pH3.0，pH3.5，pH4.0，pH4.5，pH5.0。

狗毛皮屑变应原浸提的具体步骤如下：

1、取中华田园犬毛皮屑原材料2～3kg，按质量体积比(w/v)1∶20加入丙酮，连续搅拌脱脂2小时，过滤，回收固体物，弃丙酮溶液，重复该过程3次，将脱脂后的原材料转移到干净托盘中，平铺成薄层，室温(18～25℃)干燥36～48小时。

2、取脱脂干燥后原材料2～3kg，按质量体积比(w/v)1∶20加入含1.0％NaCl的50mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH8.2)，在2～8℃下，连续浸提48～60小时，除去固体颗粒后，即得狗毛皮屑变应原粗浸提液。

3、使用柠檬酸分别调整粗浸提液至pH3.0，pH3.5，pH4.0，pH4.5，pH5.0，2～8℃下，静置48小时，依次使用0.45μm、0.22μm滤孔滤膜过滤，去除沉淀物。

使用Brandford蛋白浓度测定法测定总蛋白浓度，使用酶联免疫吸附(ELISA)方法测定狗毛皮屑主要变应原蛋白(Can f1)的浓度，其中，Brandford蛋白浓度测定法以及ELISA法均是该领域技术人员所熟知的方法。具体结果见下表所示。

试验结果显示，当使用酸性化合物调节粗浸提液的pH至pH3.0～5.0时，溶液中主要变应原蛋白与总蛋白的比例显著地提高了，这说明，使用酸性化合物调节粗浸提液的pH至pH3.0～5.0能很好地去除粗浸提液中的非变应原蛋白，提高主要变应原蛋白在总蛋白中的比例。

实施例2狗毛皮屑变应原制剂的制备工艺

使用本方明方法提取的狗毛皮屑变应原，具体步骤如下：

1、脱脂：取液氮粉碎后的中华田园犬毛皮屑原材料2～3kg，按质量体积比(w/v)1∶10加入丙酮，连续搅拌脱脂2小时，过滤，回收固体物，弃丙酮溶液，重复该过程3次，将脱脂后的原材料转移到干净托盘中，平铺成薄层，室温(18～25℃)干燥36～48小时。

2、浸提：取脱脂干燥后原材料2～3kg，按质量体积比(w/v)1∶30加入含1.0％NaCl的100mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH7.6)，在2～8℃下，连续浸提48～60小时，除去固体颗粒后，即得狗毛皮屑变应原粗浸提液。

3、沉淀：使用柠檬酸调整粗浸提液至pH4.0，2～8℃下，静置48小时，依次使用0.45μm、0.22μm的滤孔滤膜过滤，去除沉淀物。

4、浓缩：在2～8℃下，Millipore公司的截留孔径为5kD的超滤装置进行浓缩和换液。将浸提液约浓缩为原有体积的1/40，随后连续加入pH6.0的60mM的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，进行换液操作，最终控制浓缩液体积为浸提液体积的约1/40。

5、将步骤4得到的浓缩液使用pH6.0的60mM的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液稀释4倍，得到狗毛皮屑浸提液，然后每500ml狗毛皮屑浸提液添加500ml甘油、4g苯酚、6.5g氨基己酸，混匀。经0.22μm无菌滤膜除菌过滤，即得狗毛皮屑变应原制剂。

使用Brandford蛋白浓度测定法测定得到的狗毛皮屑变应原制剂总蛋白浓度为1119μg/ml，使用酶联免疫吸附(ELISA)方法测定狗毛皮屑主要变应原蛋白(Can f1)的浓度为2.71μg/ml，主要变应原Can f1/总蛋白的比例为2.42×10^-3。

实施例2所得的狗毛皮屑变应原制剂可以用于皮肤点刺试验或变应原特异性免疫治疗，具体诊断及治疗的方法是本领域技术人员所熟知的。

Claims (10)

1.一种提取狗毛皮屑变应原的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

1)狗毛皮屑脱脂；

2)使用缓冲有效量的pH7.5～10.0的浸提缓冲液进行浸提，收集粗浸提液；

3)使用酸性化合物调节所述步骤2)得到的粗浸提液的pH至pH3.0～5.0，沉淀部分非变应原的杂蛋白，并且过滤除去杂蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包含以下步骤：

1)狗毛皮屑脱脂；

2)使用缓冲有效量的pH7.5～10.0的浸提缓冲液进行浸提，收集粗浸提液；

3)使用酸性化合物调节所述步骤2)得到的粗浸提液的pH至pH3.0～5.0，沉淀部分非变应原的杂蛋白，并且过滤除去杂蛋白；

4)将步骤3)得到的滤液浓缩至原体积的1/10～1/150；

5)将步骤4)得到的浓缩液中加入药学上可接受的载体；

6)过滤除菌。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述狗毛皮屑的来源选自：中华田园犬、边境牧羊犬、德国牧羊犬、中国沙皮犬、阿拉斯加雪橇犬、萨摩耶、拉布拉多寻回犬。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述步骤1)中，使用有机溶剂脱脂，并且脱脂后干燥。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤2)的浸提缓冲液的pH为pH8.0～9.0。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述步骤3)的酸性化合物选自柠檬酸、盐酸、硫酸、磷酸、乙酸。

7.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述步骤3)中，使用酸性化合物调节浸提液的pH至pH3.0～4.5。

8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤5)的药学上可接受的载体选自多元醇、药用防腐剂、氨基己酸或其组合。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述多元醇选自丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇、聚乙二醇。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述药用防腐剂选自苯酚、硫柳汞、苯甲酸、山梨酸、山梨酸盐类、对羟基苯甲酸酯类、苯甲醇、苯乙醇或其组合。