CN104784689A

CN104784689A - 犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104784689A
Application number: CN201510225060.8A
Authority: CN
Inventors: 王宏伟
Original assignee: Beijing Is Won Lay And To Be Got Profit Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Is Won Lay And To Be Got Profit Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2015-05-05
Filing date: 2015-05-05
Publication date: 2015-07-22

Abstract

本发明公开了一种犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂及其制备方法和应用，属于免疫球蛋白制剂的制备领域。本发明首先公开了一种犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂，其中犬细小病毒特异性免疫球蛋白的含量＞30mg/ml，纯度≥97％，内毒素含量＜16IU，针对犬细小病毒的中和抗体效价达到1：400以上。本发明进一步公开一种所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备方法，对传统低温乙醇法提取血浆或血清中的免疫球蛋白的工艺进行了优化，既保持了免疫球蛋白分子结构的完整性和特有的生物活性，又提高了蛋白质纯度、免疫球蛋白含量和生物安全性，特别是大幅度提高了针对犬细小病毒的中和抗体效价，能够有效杀灭和中和犬细小病毒。

Description

犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及免疫球蛋白制剂，尤其涉及犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂，本发明还涉及所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备方法及其在制备预防或治疗犬细小病毒病的药物或试剂中的用途，属于免疫球蛋白制剂的制备领域。

背景技术

犬细小病毒病是由犬细小病毒(canine parvovirus，CPV)感染犬引起的一种急性传染病，以剧烈的呕吐、出血性肠炎和白细胞显著减少以及心肌炎为主要特征，发病率高，传染性强，死亡率高，是危害犬最为严重的传染病之一。目前，犬细小病毒疾病临床治疗药物主要是抗病毒药物和注射干扰素，但是这些药物效果并不显著。

免疫球蛋白是一类具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白，它普遍存在于动物的血液、组织液及外分泌液中，其中血清和初乳中的含量最高。免疫球蛋白是机体免疫系统的重要组成成分，在抗感染和免疫调节中发挥着重要的作物。经静脉注射吸收后，可迅速提高受者血液中免疫球蛋白的含量，通过其特异性中和作用及免疫调理等功能，起到预防和治疗各种病毒性、细菌性、真菌性、寄生虫性等疾病的作用。

因此，开发一种针对犬细小病毒的高纯度、高浓度、高活性和高效价的特异性免疫球蛋白制剂，是临床治疗和紧急预防犬细小病毒病的有效手段。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂；

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备方法，该方法所制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂具有高纯度、高浓度和高效价的特点；

本发明所要解决的第三个技术问题是提供所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂在制备预防或治疗犬细小病毒病的药物或试剂中的用途。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：

本发明首先公开了一种犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂，包括：犬细小病毒特异性免疫球蛋白；其中，所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白的含量＞30mg/ml，纯度≥97％，内毒素含量＜16IU，针对犬细小病毒的中和抗体效价(TCID₅₀/200μl)达到1：400以上。

本发明所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂为pH 4.0左右的液态或冻干剂型；其中，犬细小病毒特异性免疫球蛋白主要以IgG单体存在。本发明犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂保存期长，2-8℃可保存2年以上。

本发明所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的使用方法，一般采用直接静脉推注或静脉滴注；使用量较少时，可以直接静脉推注；使用量较大时，可采用5％葡萄糖注射液或氯化钠注射液适当稀释后进行静脉滴注；主要用于各品种犬的细小病毒感染疾病的治疗与紧急预防，有效增加患病犬机体免疫力和抗病力。

当犬受到细小病毒感染时，尽快静脉输注本发明犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂，可迅速使病犬血液中的犬细小病毒抗体从无或低浓度上升到有保护水平的浓度，迅速中和和杀灭病犬体内的细小病毒，有效阻止细小病毒对机体的继续感染和侵害，起到迅速治疗犬细小病毒病的作用。同时，免疫球蛋白自身又具有机体免疫调理作用，激活病犬体内的免疫细胞吞噬和清除侵入的病原，迅速增强病犬免疫力和抵抗力。

本发明进一步公开了一种所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)制备高免健康犬血浆或血清；(2)低温乙醇法提取步骤(1)制备的血浆或血清中的犬细小病毒特异性免疫球蛋白；(3)纯化步骤(2)所提取的犬细小病毒特异性免疫球蛋白；(4)将步骤(3)纯化后的犬细小病毒特异性免疫球蛋白进行超滤、浓缩、透析、过滤除菌，分装，即得。

其中，步骤(1)所述制备高免健康犬血浆或血清，包括以下步骤：选取健康犬，接种犬细小病毒疫苗，2周后按照同样方法加强免疫；免疫后10-14天，采集抗体效价不低于1：1280的犬血浆或血清。

经中国农业部合法批准的多种犬细小病毒疫苗均适用于本发明，按照使用说明使用即可。

步骤(2)所述低温乙醇法包括：(a)将血浆或血清融化，降温至0℃，调整pH至7.5-7.8；优选为使用pH为4.0的醋酸缓冲液调整pH；按照g/100ml计，加入预冷乙醇，优选为预冷-15℃—-20℃的53.3％乙醇至终浓度9-12％，离心，收集上清液；

(b)调整上清液的pH至3.5-4.4；按照g/100ml计，加入乙醇至终浓度15-25％，静置过夜，离心，收集沉淀；

(c)向步骤(b)所得沉淀中加入10倍体积的0℃注射用水，用0.5mol/L Na₂HPO₄和0.5mol/L醋酸调整pH至5.1-5.5，搅拌4-6小时，静置过夜，获得溶解液(Ⅰ)；

(d)将步骤(c)所获得的溶解液(Ⅰ)用连续离心机离心，收集上清液，过滤，得滤液；用0.5mol/L Na₂HPO₄和0.5mol/L醋酸调整滤液的pH至4.0-5.5；然后，按照g/100ml计，加入乙醇至终浓度20-25％，搅拌3-5小时，静置过夜，获得溶解液(Ⅱ)；

(e)将步骤(d)获得的溶解液(Ⅱ)离心，得到上清液；将上清液调pH至5.5-6.4，然后按照g/100ml计，加入乙醇至终浓度23-25％，静置过夜，离心，收集沉淀，即得。

优选的，步骤(2)所述低温乙醇法包括：(a)将血浆或血清融化，降温至0℃，调整pH至7.5；按照g/100ml计，加入预冷乙醇(-15℃—-20℃的53.3％乙醇)至终浓度10％，离心，收集上清液；

(b)调整上清液的pH至4.0；按照g/100ml计，加入乙醇至终浓度20％，静置过夜，离心，收集沉淀；

(c)向步骤(b)所得沉淀中加入10倍体积的0℃注射用水，用0.5mol/L Na₂HPO₄和0.5mol/L醋酸调整pH至5.5，搅拌4小时，静置过夜，获得溶解液(Ⅰ)；

(d)将步骤(c)所获得的溶解液(Ⅰ)用连续离心机离心，收集上清液，用0.45um滤板过滤，得滤液；用0.5mol/L Na₂HPO₄和0.5mol/L醋酸调整滤液的pH至5.0；然后，按照g/100ml计，加入乙醇至终浓度20％，搅拌4小时，静置过夜，获得溶解液(Ⅱ)；

(e)将步骤(d)获得的溶解液(Ⅱ)离心，得到上清液；将上清液调pH至6.0，然后按照g/100ml计，加入乙醇至终浓度25％，静置过夜，离心，收集沉淀，即得。

本发明对上述低温乙醇法中调整pH值所用的试剂没有特殊限定。

为了能够获得纯度更高、蛋白含量更高、内毒素含量更低以及抗体活性更好的免疫球蛋白，本发明对传统的低温乙醇法分离和提取血浆或血清中的免疫球蛋白的方法进行了优化。结果表明，采用优化后的低温乙醇法所制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的犬细小病毒特异性免疫球蛋白浓度为32mg/ml，蛋白质纯度为97％，内毒素含量小于16IU；中和抗体效价的测定结果表明，采用优化后的低温乙醇法所制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白TCID₅₀/200μl＝1/431，即1：431的犬细小病毒特异性免疫球蛋白可保护50％细胞不产生病变。而调整低温乙醇法中的pH或乙醇终浓度，所制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白的蛋白质浓度均低于20mg/ml，蛋白质纯度为90％左右，内毒素含量高于32IU；所制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白TCID₅₀/200μl＝1：286-325，抗犬细小病毒的中和抗体效价明显降低。

综上，采用优化后的低温乙醇法所制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白的浓度、蛋白质纯度更高，内毒素含量明显降低；抗犬细小病毒的中和抗体效价显著提高。

本发明所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备方法，步骤(3)所述纯化采用离子交换层析法；优选为，采用DEAE-Sepharose-FF凝胶柱。具体步骤包括：(1)用0.5mol/L NaOH溶液调蛋白液pH至6.6；(2)用磷酸盐缓冲液平衡凝胶柱；(3)上样蛋白液，待IgG蛋白峰刚出现收集穿透蛋白液；(4)上样完成后用磷酸盐缓冲液冲洗，待IgG峰下降至最高峰的约2/3处，用醋酸盐缓冲液冲洗层析柱，收集蛋白液。

步骤(4)所述超滤、浓缩、透析包括以下步骤：收集纯化后的蛋白液，边搅拌边加入0.5mol/L盐酸液，调整pH至4.0，用6倍体积的2-8℃注射用水透析，透析至乙醇含量低于0.025％(每100ml含0.025g酒精)，蛋白液浓度3％以上(每100ml含3g球蛋白)，即得。

本发明所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂能够应用于制备预防或治疗犬细小病毒病的药物或试剂。

本发明犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂中还可以加入适宜的保护剂，例如麦芽糖、葡萄糖等。本领域技术人员可以根据实际需要对保护剂的用量进行调整。

临床应用结果表明，对临床上诊断为犬细小病毒感染的患病犬静脉输注本发明优化后方法制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂，并配合使用其他药物，治愈率高达94％，而输注其他方法所制备的免疫球蛋白的治愈率最高仅为79％。

本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：

本发明犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂中，犬细小病毒特异性免疫球蛋白含量达到30mg/ml以上，蛋白质纯度达到97％以上，内毒素小于16IU，中和抗体效价不低于1：400；可应用于各品种犬感染细小病毒时的治疗与紧急预防，增加患病犬机体免疫力和抗病力。优化后的犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备方法，既保持了免疫球蛋白分子结构的完整性和特有的生物活性，又提高了蛋白质纯度、免疫球蛋白含量和生物安全性。

本发明所涉及到的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“内毒素”是革兰氏阴性细菌细胞壁中的一种成分，叫做脂多糖。脂多糖对宿主是有毒性的。内毒素只有当细菌死亡溶解或用人工方法破坏菌细胞后才释放出来，所以叫做内毒素。其毒性成分主要为类脂质A。

术语“中和抗体和中和抗体效价”，中和抗体是当病原微生物侵入动物机体时由体内适应性免疫应答细胞分泌产生的一种能与抗原特异性结合且具有特殊抗病能力的蛋白质，这种蛋白质实际就是免疫球蛋白。中和抗体是一种可溶性蛋白，存在于血液、淋巴和组织液中，当病毒等病原微生物侵入体内后，免疫细胞把中和蛋白分泌到血液里，后者与血液里的病毒等病原微生物颗粒结合，阻止病毒等病原微生物感染细胞，破坏病毒等病原微生物颗粒，这样就把病毒等病原微生物“中和”掉了。中和抗体效价是用来评价中和抗体中和病原微生物活性和能力的重要指标，一般采用细胞中和试验来测定中和抗体的效价，按reed-muench法计算能够使50％细胞孔获得保护的最高稀释度来确定中和抗体的效价。

附图说明

图1为细胞病变结果；其中，A为不能完全中和病毒，产生CPE；B为完全中和，无CPE产生。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备

1、实验方法

1.1高免健康犬血浆或血清的制备

(1)选取一定数量的健康肉用犬，接种符合《中国兽药典》质量标准要求的犬细小病毒疫苗，按照使用说明进行操作，2周后同样方法加强免疫；

(2)免疫接种完成后10-14天，选取符合下列要求的犬血浆或血清为制造免疫球蛋白用原料血浆或血清：利用血凝抑制试验(HI)测定抗体效价，抗体效价不低于1：1280；

(3)颈静脉采血，混合，低温保存。

1.2低温乙醇法提取犬细小病毒特异性免疫球蛋白

(1)将上述制备的血浆或血清融化，逐渐降温至0℃，用pH为4.0的醋酸缓冲液调整pH至7.5，加入预冷乙醇(即预冷为-15℃—-20℃的53.3％乙醇)至终浓度10％(g/100ml)，转数14000r/min离心去除杂蛋白，得上清液；

(2)对上清液进行处理，调整pH至4.0，逐渐加入乙醇至终浓度20％(g/100ml)，静置过夜后，离心保留沉淀；

(3)上述沉淀加入10倍体积的0℃注射用水，用0.5mol/L Na₂HPO₄和0.5mol/L醋酸调整pH至5.5，搅拌4小时，静置过夜，得溶解液；

(4)上述溶解液用连续离心机离心，用0.45um滤板过滤上清，用0.5mol/L Na₂HPO₄和0.5mol/L醋酸调整pH至5.0，加入乙醇至终浓度20％(g/100ml)，搅拌4小时，静置过夜；

(5)离心分离杂蛋白后的上清液调pH至6.0，加入乙醇至终浓度25％(g/100ml)，静置过夜得到免疫球蛋白悬浮液，离心，沉淀即为免疫球蛋白。

1.3DEAE-Sepharose-FF凝胶柱层析纯化免疫球蛋白

(1)用0.5mol/L NaOH溶液调上述蛋白液pH至6.6；

(2)用磷酸盐缓冲液平衡凝胶柱；

(3)上样蛋白液，待IgG蛋白峰刚出现收集穿透蛋白液；

(4)上样完成后用磷酸盐缓冲液冲洗，待IgG峰下降至最高峰的约2/3处，用醋酸盐缓冲液冲洗层析柱，收集蛋白液。

1.4超滤浓缩透析免疫球蛋白

超滤浓缩透析包括以下步骤：将收集的层析后蛋白液，边搅拌边缓慢加入0.5mol/L盐酸液，调节pH至4.0，用6倍体积的2-8℃注射用水透析，透析至乙醇含量低于0.025％(每100ml含0.025g酒精)，蛋白液浓度3％(每100ml含3g球蛋白)以上，分装或冻干保存。

1.5犬细小病毒特异性免疫球蛋白的蛋白质浓度、纯度、内毒素含量测定

按照《中国兽药典》、《中国药典》规定的方法测定所制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白的蛋白质浓度、纯度、内毒素含量。

2、实验结果

所制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白的蛋白质浓度为32mg/ml，蛋白质纯度为97％，内毒素含量小于16IU，pH为4.0。

实施例2犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备

1、实验方法

犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备方法同实施例1，区别在于，低温乙醇法提取犬细小病毒特异性免疫球蛋白的具体操作如下：

(1)将制备的血浆或血清融化，逐渐降温至0℃，调整pH至7.8，加入预冷乙醇(即预冷为-15℃—-20℃的53.3％乙醇)至终浓度12％(g/100ml)，转数14000r/min离心去除杂蛋白，得上清液；

(2)对上清液进行处理，调整pH至4.4，逐渐加入乙醇至终浓度25％(g/100ml)，静置过夜后，离心保留沉淀；

(3)上述沉淀加入10倍体积的0℃注射用水，用0.5mol/L Na₂HPO₄和0.5mol/L醋酸调整pH至5.5，搅拌6小时，静置过夜，得溶解液；

(4)上述溶解液用连续离心机离心，用0.45um滤板过滤上清，用0.5mol/L Na₂HPO₄和0.5mol/L醋酸调整pH至5.5，加入乙醇至终浓度25％(g/100ml)，搅拌5小时，静置过夜；

(5)离心分离杂蛋白后的上清液调pH至6.4，加入乙醇至终浓度25％(g/100ml)，静置过夜得到免疫球蛋白悬浮液，离心，沉淀即为免疫球蛋白。

2、实验结果

所制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白的蛋白质浓度为19mg/ml，蛋白质纯度为92％，内毒素含量为64IU，pH为4.5。

实施例3犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备

1、实验方法

(1)将上述制备的血浆或血清融化，逐渐降温至0℃，调整pH至7.6，加入预冷乙醇(即预冷为-15℃—-20℃的53.3％乙醇)至终浓度9％(g/100ml)，转数14000r/min离心去除杂蛋白，得上清液；

(2)对上清液进行处理，调整pH至3.5，逐渐加入乙醇至终浓度15％(g/100ml)，静置过夜后，离心保留沉淀；

(3)上述沉淀加入10倍体积的0℃注射用水，用0.5mol/L Na₂HPO₄和0.5mol/L醋酸调整pH至5.1，搅拌4小时，静置过夜，得溶解液；

(4)上述溶解液用连续离心机离心，用0.45um滤板过滤上清，用0.5mol/L Na₂HPO₄和0.5mol/L醋酸调整pH至4.0，加入乙醇至终浓度20％(g/100ml)，搅拌3小时，静置过夜；

(5)离心分离杂蛋白后的上清液调pH至5.5，加入乙醇至终浓度23％(g/100ml)，静置过夜得到免疫球蛋白悬浮液，离心，沉淀即为免疫球蛋白。

2、实验结果

所制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白的蛋白质浓度为15mg/ml，蛋白质纯度为90％，内毒素含量为32IU，pH为3.5。

实施例4犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备

1、实验方法

(1)将上述制备的血浆或血清融化，逐渐降温至0℃，调整pH至7.6，加入预冷乙醇(即预冷为-15℃—-20℃的53.3％乙醇)至终浓度10％(g/100ml)，转数14000r/min离心去除杂蛋白，得上清液；

(2)对上清液进行处理，调整pH至4.2，逐渐加入乙醇至终浓度20％(g/100ml)，静置过夜后，离心保留沉淀；

(3)上述沉淀加入10倍体积的0℃注射用水，用0.5mol/L Na₂HPO₄和0.5mol/L醋酸调整pH至5.4，搅拌4小时，静置过夜，得溶解液；

(4)上述溶解液用连续离心机离心，用0.45um滤板过滤上清，用0.5mol/L Na₂HPO₄和0.5mol/L醋酸调整pH至5.2，加入乙醇至终浓度20％(g/100ml)，搅拌4小时，静置过夜；

(5)离心分离杂蛋白后的上清液调pH至6.2，加入乙醇至终浓度25％(g/100ml)，静置过夜得到免疫球蛋白悬浮液，离心，沉淀即为免疫球蛋白。

2、实验结果

所制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白的蛋白质浓度为20mg/ml，蛋白质纯度为92％，内毒素含量为64IU，pH为3.8。

实验例1犬细小病毒特异性免疫球蛋白中和抗体效价的测定

1、实验方法

按照《兽药典》规定的细胞中和试验来测定。

1.1犬细小病毒特异性免疫球蛋白样品制备

将实施例1制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白按表1用2％血清培养液在离心管中做连续2倍稀释。

表1样品稀释表

1.2犬细小病毒病毒液制备

-80℃冰箱中取出已测定TCID₅₀为10^-2.909的犬细小病毒标准病毒液(由中国农科院哈尔滨兽医研究所提供)一支，溶解后用2％血清培养液将病毒液稀释成200TCID₅₀，制备15ml备用。

1.3中和试验

向按照表1稀释后的各不同滴度静脉注射用犬细小病毒特异性免疫球蛋白管中加入200TCID₅₀的病毒液，每管900μl。混匀后，置37℃温箱中感作1小时。

1.4细胞培养板的制备

把正常培养的胎猫肾传代细胞(FK81)(由中国农科院哈尔滨兽医研究所保存并提供)，弃去上清，消化后计数，用8％血清培养液制成每毫升含细胞数为2×10⁵个的细胞悬液25ml。接种96孔细胞培养板，每个孔中先加入细胞悬液200μl，贴壁培养24h后，吸去培养液，加入方法1.3中的中和病毒液，细胞板第1-10列分别加入1-10管对应管号的中和病毒液200μl，每列8孔完全一致；第11列为病毒对照，CPV终浓度为100TCID₅₀；第12列为空白对照，每孔200μl的2％血清培养液。

1.5培养

置37℃培养箱中逐日观察，逐孔记录。

1.6结果判定

试验完成后第5日，当病毒对照中100TCID50孔完全发生病变时，可判定结果。

1.7计算中和抗体效价

按reed-muench法计算，能够使50％细胞孔保护的最高稀释度为中和效价。

2、实验结果

2.1细胞病变结果

细胞病变结果判定按照常规进行，感染的细胞肿胀、变圆、细胞间隙拉大，感染病毒48-72小时后细胞单层破坏(图1A)；完全中和的孔，无CPE产生(图1B)。

2.2犬细小病毒特异性免疫球蛋白中和抗体效价

出现CPE孔统计结果见表2。

表2出现CPE孔统计结果

距离比例＝(高于50％病变率的百分数-50％)/(高于50％病变率的百分数-低于50％病变率的百分数)

＝(60.0-50)/(60.0-20.0)

＝10/40＝0.25

Lg TCID₅₀＝高于50％血清稀释度的对数－距离比例×稀释系数的对数

Lg TCID₅₀＝－2.709－0.25×(－0.3)＝－2.634

TCID₅₀＝10^－2.634＝1/431，200μl，

即1：431的犬细小病毒特异性免疫球蛋白可保护50％细胞不产生病变，1：431是犬细小病毒特异性免疫球蛋白的中和抗体效价。

实验例2犬细小病毒特异性免疫球蛋白中和抗体效价测定

1、实验方法

按照实验例1同样的方法分别测定实施例2、3、4所制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白中和抗体效价。

2、实验结果

实施例2、3、4所制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白中和抗体效价测定结果见表3。

表3犬细小病毒特异性免疫球蛋白中和抗体效价

实验例3犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的临床应用

对临床上400例临床症状表现为：精神沉郁、呕吐、出血性腹泻、眼结膜苍白、鼻子，剧烈腹泻时呈喷射状，初色黄带灰，混有大量血液、粘膜，随后粪便呈柏油状、腥臭，临床病理白细胞数明显减少，红细胞压积值升高，消化道内气体、水分增多，且经犬细小病毒抗原快速诊断试纸条检测为阳性的患病犬，随机分4组，分别静脉输注实施例1、2、3、4制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂，并配合使用其他药物，连用5日，统计治愈率(％)。

结果(表4)表明，输注实施例1制备的犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的治愈率高达94％，比输注实施例2、3或4制备的免疫球蛋白制剂的治愈率高15个百分点以上。

表4治愈率统计结果

Claims

1.一种犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂，其特征在于，包括：犬细小病毒特异性免疫球蛋白；其中，所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白的含量＞30mg/ml，纯度≥97％，内毒素含量＜16IU，针对犬细小病毒的中和抗体效价达到1：400以上。

2.一种权利要求1所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备高免健康犬血浆或血清；(2)低温乙醇法提取步骤(1)制备的血浆或血清中的犬细小病毒特异性免疫球蛋白；(3)纯化步骤(2)所提取的犬细小病毒特异性免疫球蛋白；(4)将步骤(3)纯化后的犬细小病毒特异性免疫球蛋白进行超滤、浓缩、透析、过滤除菌，分装，即得。

3.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述制备高免健康犬血浆或血清，包括以下步骤：选取健康犬，接种犬细小病毒疫苗，2周后按照同样方法加强免疫；免疫后10-14天，采集抗体效价不低于1：1280的犬血浆或血清。

4.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述低温乙醇法包括：

(a)将血浆或血清融化，降温至0℃，调整pH至7.5-7.8；按照g/100ml计，加入预冷乙醇至终浓度9-12％，离心，收集上清液；

(c)向步骤(b)所得沉淀中加入10倍体积的0℃注射用水，用0.5mol/LNa₂HPO₄和0.5mol/L醋酸调整pH至5.1-5.5，搅拌4-6小时，静置过夜，获得溶解液(Ⅰ)；

5.按照权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述低温乙醇法包括：

(a)将血浆或血清融化，降温至0℃，调整pH至7.5；按照g/100ml计，加入预冷乙醇至终浓度10％，离心，收集上清液；

(c)向步骤(b)所得沉淀中加入10倍体积的0℃注射用水，用0.5mol/LNa₂HPO₄和0.5mol/L醋酸调整pH至5.5，搅拌4小时，静置过夜，获得溶解液(Ⅰ)；

(d)将步骤(c)所获得的溶解液(Ⅰ)用连续离心机离心，收集上清液，过滤，得滤液；用0.5mol/L Na₂HPO₄和0.5mol/L醋酸调整滤液的pH至5.0；然后，按照g/100ml计，加入乙醇至终浓度20％，搅拌4小时，静置过夜，获得溶解液(Ⅱ)；

6.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述纯化采用离子交换层析法；优选为，采用DEAE-Sepharose-FF凝胶柱。

7.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述超滤、浓缩、透析包括以下步骤：

收集纯化后的蛋白液，边搅拌边加入0.5mol/L盐酸液，调整pH至4.0，用6倍体积的2-8℃注射用水透析；按g/ml，透析至乙醇含量低于0.025％，蛋白液浓度3％以上，即得。

8.权利要求1所述犬细小病毒特异性免疫球蛋白制剂在制备预防或治疗犬细小病毒病的药物或试剂中的用途。