JP2022528668A - カナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物、浸出液及びその調製方法 - Google Patents
カナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物、浸出液及びその調製方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2022528668A JP2022528668A JP2021558495A JP2021558495A JP2022528668A JP 2022528668 A JP2022528668 A JP 2022528668A JP 2021558495 A JP2021558495 A JP 2021558495A JP 2021558495 A JP2021558495 A JP 2021558495A JP 2022528668 A JP2022528668 A JP 2022528668A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- humulus
- pollen
- pollen allergen
- seq
- allergen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 239000013573 pollen allergen Substances 0.000 title claims abstract description 130
- 241000218228 Humulus Species 0.000 title claims abstract description 63
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 23
- 241000218229 Humulus japonicus Species 0.000 claims abstract description 128
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 95
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 75
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 68
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 claims abstract description 40
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 33
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 claims abstract description 33
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 32
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 22
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims abstract description 19
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 16
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 239000013566 allergen Substances 0.000 claims description 48
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 44
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 claims description 38
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 claims description 38
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 29
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 26
- 239000012466 permeate Substances 0.000 claims description 26
- 238000007654 immersion Methods 0.000 claims description 24
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 22
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 19
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 16
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 14
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 14
- 239000002994 raw material Substances 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 12
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 11
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims description 11
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 claims description 9
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 8
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 206010039085 Rhinitis allergic Diseases 0.000 claims description 7
- 201000010105 allergic rhinitis Diseases 0.000 claims description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 7
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 claims description 7
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 7
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 7
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 7
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 6
- 239000011087 paperboard Substances 0.000 claims description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 6
- 239000004744 fabric Substances 0.000 claims description 5
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 claims description 5
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 claims description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 claims description 4
- 238000009777 vacuum freeze-drying Methods 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 claims description 3
- 230000036618 natural shedding Effects 0.000 claims description 3
- 206010052568 Urticaria chronic Diseases 0.000 claims description 2
- 229940074608 allergen extract Drugs 0.000 claims description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 2
- 208000024376 chronic urticaria Diseases 0.000 claims description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 2
- 239000006191 orally-disintegrating tablet Substances 0.000 claims description 2
- 239000003826 tablet Substances 0.000 claims description 2
- 238000001291 vacuum drying Methods 0.000 claims description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 abstract description 57
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 7
- 238000010181 skin prick test Methods 0.000 abstract description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 5
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 abstract description 4
- 238000010586 diagram Methods 0.000 abstract description 3
- 238000007865 diluting Methods 0.000 abstract description 2
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 24
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 208000035285 Allergic Seasonal Rhinitis Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 8
- 206010048908 Seasonal allergy Diseases 0.000 description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 7
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 7
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 7
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 4
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 3
- 201000009961 allergic asthma Diseases 0.000 description 3
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 3
- FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N benzyl N-[2-hydroxy-4-(3-oxomorpholin-4-yl)phenyl]carbamate Chemical compound OC1=C(NC(=O)OCC2=CC=CC=C2)C=CC(=C1)N1CCOCC1=O FFBHFFJDDLITSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 229940061607 dibasic sodium phosphate Drugs 0.000 description 3
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 239000011265 semifinished product Substances 0.000 description 3
- 230000001235 sensitizing effect Effects 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 244000036975 Ambrosia artemisiifolia Species 0.000 description 2
- 235000003129 Ambrosia artemisiifolia var elatior Nutrition 0.000 description 2
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 2
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 2
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 2
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 2
- PRQROPMIIGLWRP-UHFFFAOYSA-N N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin Chemical compound CSCCC(NC=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PRQROPMIIGLWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 2
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 2
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 2
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000024780 Urticaria Diseases 0.000 description 2
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 235000003484 annual ragweed Nutrition 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 235000006263 bur ragweed Nutrition 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 235000003488 common ragweed Nutrition 0.000 description 2
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- CBMPTFJVXNIWHP-UHFFFAOYSA-L disodium;hydrogen phosphate;2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O CBMPTFJVXNIWHP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000007981 phosphate-citrate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 2
- 235000009736 ragweed Nutrition 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000010183 spectrum analysis Methods 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003261 Artemisia vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 240000006891 Artemisia vulgaris Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 102100024167 C-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710149862 C-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 description 1
- 206010008469 Chest discomfort Diseases 0.000 description 1
- 241001116468 Cunninghamia Species 0.000 description 1
- 241000218691 Cupressaceae Species 0.000 description 1
- 206010012434 Dermatitis allergic Diseases 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 101000984570 Enterobacteria phage T4 Baseplate wedge protein gp53 Proteins 0.000 description 1
- 101710198774 Envelope protein US9 Proteins 0.000 description 1
- 240000006890 Erythroxylum coca Species 0.000 description 1
- 101000997743 Escherichia phage Mu Serine recombinase gin Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 240000000249 Morus alba Species 0.000 description 1
- 235000008708 Morus alba Nutrition 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014443 Pyrus communis Nutrition 0.000 description 1
- 108091036333 Rapid DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000036071 Rhinorrhea Diseases 0.000 description 1
- 206010039101 Rhinorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 208000019802 Sexually transmitted disease Diseases 0.000 description 1
- 244000258044 Solanum gilo Species 0.000 description 1
- 235000018650 Solanum gilo Nutrition 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012197 amplification kit Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 description 1
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002457 bidirectional effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000008957 cocaer Nutrition 0.000 description 1
- ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N cocaine Chemical compound O([C@H]1C[C@@H]2CC[C@@H](N2C)[C@H]1C(=O)OC)C(=O)C1=CC=CC=C1 ZPUCINDJVBIVPJ-LJISPDSOSA-N 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- CSVGEMRSDNSWRF-UHFFFAOYSA-L disodium;dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP(O)([O-])=O.OP(O)([O-])=O CSVGEMRSDNSWRF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 238000010410 dusting Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 229940046528 grass pollen Drugs 0.000 description 1
- 229960004931 histamine dihydrochloride Drugs 0.000 description 1
- PPZMYIBUHIPZOS-UHFFFAOYSA-N histamine dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.NCCC1=CN=CN1 PPZMYIBUHIPZOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001660 histamine phosphate Drugs 0.000 description 1
- ZHIBQGJKHVBLJJ-UHFFFAOYSA-N histamine phosphate Chemical compound OP(O)(O)=O.OP(O)(O)=O.NCCC1=CNC=N1 ZHIBQGJKHVBLJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 1
- 240000004308 marijuana Species 0.000 description 1
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008447 perception Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012804 pollen sample Substances 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 206010041232 sneezing Diseases 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- UFYJXINNVLJWNG-UHFFFAOYSA-K trisodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OP(O)(O)=O.OP(O)(O)=O.[O-]P([O-])([O-])=O UFYJXINNVLJWNG-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- LEAHFJQFYSDGGP-UHFFFAOYSA-K trisodium;dihydrogen phosphate;hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OP(O)([O-])=O.OP([O-])([O-])=O LEAHFJQFYSDGGP-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000017260 vegetative to reproductive phase transition of meristem Effects 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000004260 weight control Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/35—Allergens
- A61K39/36—Allergens from pollen
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/02—Inorganic compounds
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
- A61K47/10—Alcohols; Phenols; Salts thereof, e.g. glycerol; Polyethylene glycols [PEG]; Poloxamers; PEG/POE alkyl ethers
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/0004—Screening or testing of compounds for diagnosis of disorders, assessment of conditions, e.g. renal clearance, gastric emptying, testing for diabetes, allergy, rheuma, pancreas functions
- A61K49/0006—Skin tests, e.g. intradermal testing, test strips, delayed hypersensitivity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
- A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/08—Antiallergic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Mycology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Otolaryngology (AREA)
- Botany (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
尹佳さんの「夏秋季花粉症患者が過敏性鼻炎と過敏性喘息を合併する状況及びそれらの関係研究」によれば、カナムグラ花粉症が北京の夏秋季花粉症患者の58%を占めることが分かった。趙京さんの「北京児童の気道過敏性疾患と皮膚アレルゲン試験の調査」によれば、13~14歳の児童に対する北京気道アレルギー疾患流行病学調査結果から、カナムグラ花粉敏感者が4.2%であることが分かった。任華麗さんの「北京地域成人過敏性鼻炎吸入アレルゲンスペクトル分析」によれば、北京の住民において過敏性鼻炎に診断した成人患者265例を選択し、永久性、季節性の2組の合計16種類の標準化アレルゲンに対して検出し、主なアレルゲン配列を分析し、カナムグラは18.11%であることが分かった。田芳潔さんの「北京地域アレルギー鼻炎の吸入性アレルゲン調査」によれば、北京地域アレルギー鼻炎(allergic rhinitis,AR)の主な吸入性アレルゲンに対して調査を行い、カナムグラが17.29%を占めることが分かった。李勇さんの「台州地域1013例アレルギー鼻炎患者アレルゲンスペクトル分析」によれば、台州地域アレルギー鼻炎患者のアレルゲン分布状況を調査し、カナムグラ花粉過敏者が248例で、30.58%を占めることが分かった。劉杰さんの「チンタオ地域空気伝染花粉及びそのα感作性調査」によれば、チンタオ市の空気伝染花粉の種類、数や発散特性は、主にマツ属花粉であり、2番目はカナムグラとヨモギ属であることが分かった。蘭海燕さんの「河北省遷安地域空気伝染花粉調査」によれば、遷安地域の空気伝染花粉種類、発散特性及び感作状況を調査し、空気伝染花粉の散るピークは春、秋であり、花粉種類はマツ属、コウヨウザン属、プラタナス属、ナシ属、サイプレス属、ヤナギ属、ヨモギ属、カナムグラ、ブタクサなどがあることが分かった。朱香順さんの「イ坊市花粉症患者において主な感作花粉種属分析」によれば、イ坊市花粉症患者において主な感作花粉種類における感作花粉がカナムグラで、68%を占め、2番目がカナムグラ、夏秋季花粉I、ブタクサ、スズカケノキであることが分かった。孫立英さんの「上海中心エリア空気伝染花粉調査」によれば、上海市年間空気伝染花粉の種類や数及びその分布特徴を分析し、秋に、カンナビス類及びグラミナス花粉が主であり、主にカナムグラ属(59.01%)、グラミナス(18.45%)やヨモギ属(5.32%)であることが分かった。
以上のカナムグラ花粉流行病学調査研究によれば、カナムグラ花粉過敏は幅広く中国各地に分布し、北の地域では、カナムグラ花粉は花粉過敏の主な感作原である。
現在のアレルゲン特異免疫治療の方法は、主に、皮下注射投薬免疫治療と舌下投薬免疫治療に分けられる。皮下注射投薬免疫治療は、すでに100年以上の歴史を持ち、その安全性と有効性は証明された。20世紀90年代最初に、アレルゲン舌下ドロップワクチンが誕生し、1998年に、WHOはアレルゲン舌下ドロップワクチンの安全と有効を開示した。
しかしながら、舌下投薬免疫脱感作の方式は、皮下注射免疫投薬に比べて、治療周期が長く、短時間内に治療効果が明らかではなく、平均脱感作周期が3~5年である。1つの治療周期では、舌下投薬方式免疫脱感作投薬量は皮下注射投薬量の100倍である。このため、皮下注射投薬免疫脱感作の方式は舌下投薬に比べて、患者コンプライアンスが悪いが、治療周期が短く、効果が速く、治療費用が低い。したがって、2種類の投薬方式は相互に補い合って作り上げる。現在、カナムグラ花粉アレルゲンに用いられる皮下注射免疫製剤の安定性が悪く、蛋白含有量と生物力価とも時間に従って低下し、成分不明の試薬が特定時間に保存した後、カナムグラ花粉によるアレルギー疾患を診断するとき、陽性率が低下し、正確性が低い。
上記の目的を実現するために、本発明は以下の技術的方案を利用する。
配列番号6で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 2を含み、
配列番号7で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 3を含み、
配列番号9で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 4を含み、
配列番号10で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 5を含み、
配列番号11で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 6を含み、
配列番号12で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 7を含み、
配列番号13で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 8を含み、
配列番号14で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 9を含み、
配列番号15で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 10を含み、
配列番号16で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 11を含み、
配列番号17で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 12を含み、
配列番号18で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 13を含み、
配列番号19で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 14を含み、
配列番号20で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 15を含む。
前記カナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物、体積比で0.2~0.4%のフェノール、体積比で45~55%のグリセリン、及び4.5~5.5g/LのNaClを含み、pH値が6.0~8.0であるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液。
好ましくは、前記カナムグラ花粉アレルゲン浸出液の活性濃度が50000~200000BAU/mlであり、前記カナムグラ花粉アレルゲン浸出液の総蛋白濃度が0.40~1.60mg/mlであり、前記カナムグラ花粉のアレルゲン蛋白含有量が0.08~0.32mg/mlである。
カナムグラ花粉を採集し、常温乾燥または真空乾燥またはフルイドベッド乾燥を行うステップS1と、
乾燥後の花粉を脱脂、乾燥するステップS2と、
ステップS3後の浸漬抽出液を取り、遠心分離により上清液を取り、上清液をろ過及び除菌ろ過するステップS4と、
ろ過後の上清液にを限外ろ過濃縮し、限外ろ過濃縮液を得るステップS5と、
前記限外ろ過濃縮液を再度ろ過及び除菌ろ過した後、真空凍結乾燥してカナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品を得るステップS6と、
前記カナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品をpH6.5~7.5リン酸塩―塩水緩衝液で再溶解させてカナムグラ花粉アレルゲン原液を調製し、2~8℃で放置し、等体積で滅菌のグリセリンと均一に混合し、溶液のpH値を6.0~8.0に調整するステップS7と、
を含む前記カナムグラ花粉アレルゲン浸出液の調製方法。
前記調製方法において、好ましくは、ステップS2において、前記花粉脱脂は、花粉とアセトンとの重量g体積ml比1:5~1:1で上層液体が上澄みになるまで脱脂処理を繰り返る。
前記調製方法において、好ましくは、ステップS4において、前記遠心分離の条件は、8000~12000g、遠心分離温度2~8℃、時間15~20minであり、前記ろ過及び除菌ろ過において、まず、4000メッシュのろ過布でろ過した後、板紙、0.45μm及び0.22μmのろ膜で順次にろ過する。
前記調製方法において、好ましくは、ステップS6において、前記真空凍結乾燥の条件は、-50~-35℃で凍結し、2~8mbar真空圧力で、-25℃で乾燥し、水分含有量≦3%に制御する。
前記調製方法において、好ましくは、前記ステップS1は、さらに、原料カナムグラ花粉に対して鏡検識別および/またはDNA鑑定を行うステップを含み、DNA鑑定方法は、プライマーとして配列番号1、配列番号2を用い、識別のカナムグラ花粉原料をPCR増幅させ、増幅製品を検出することである。
前記調製方法において、好ましくは、前記リン酸塩―塩水緩衝液は4.5~5.5g/Lの塩化ナトリウム、0.03%~0.05%のリン酸二水素カリウム、1.5%~2%二塩基性リン酸ナトリウム十二水和物、及び0.2%~0.4%のフェノールを含む。
カナムグラ花粉アレルゲンの調製において、浸漬抽出するとき、発明人は、様々な浸出液を試した上、それらの浸浸漬抽出効率を比較した。用いた浸出液は、0.8%の塩化ナトリウム、pH5.0 のリン酸水素二ナトリウム―クエン酸緩衝液、pH6.0のリン酸水素二ナトリウム―クエン酸緩衝液、pH7.5のリン酸水素二ナトリウム―リン酸二水素ナトリウム緩衝液、pH8.0のリン酸水素二ナトリウム―リン酸二水素ナトリウム緩衝液、pH8.2のcoca's液、pH8.9のTris―塩酸緩衝液、pHが7.9~8.2であり、4.5~5.5g/Lの塩化ナトリウムを含有し、重量%含有量が0.03%~0.05%であるリン酸二水素カリウム、1.5%~2%二塩基性リン酸ナトリウム十二水和物、0.2%~0.4%のフェノールなどを含む。実験の結果、pHが7.9~8.2であり、4.5~5.5g/Lの塩化ナトリウムを含有し、重量%含有量が0.03%~0.05%であるリン酸二水素カリウム、1.5%~2%二塩基性リン酸ナトリウム十二水和物、0.2%~0.4%のフェノールを利用すれば、浸漬抽出効率が高く、調製したカナムグラ花粉アレルゲン浸出液を長期間に効果的に保存でき、安定性が高いことが分かった。
自然脱落法でカナムグラ花粉を収集する収集ステップ(1)と、
花粉が付着しなくなるまで常温乾燥または真空乾燥またはフルイドベッド乾燥で乾燥し、乾燥後の花粉を150~250メッシュのサンプルふるいに通過させる乾燥ステップ(2)と、
ステップ(2)で得られた花粉とアセトンをそれぞれg及びmlとして1:5~1:1の重量体積比で脱脂処理し、30分間振動脱脂した後、静置して分層させ、上層液を注出し、新たなアセトンを入れ、上層液体が上澄みになるまで脱脂を繰り返し、脱脂後の花粉を均一に散開させ、室温で48時間~72時間乾燥する脱脂ステップ(3)と、
脱脂乾燥後のカナムグラカナムグラ花粉を重量体積比1:50~1:10でpH7.9~8.2のリン酸塩―塩水緩衝液10Lに入れ、2~8℃で22~26h攪拌し、浸漬抽出し、抽出後の浸出液を取り、遠心分離力8000~12000g、遠心分離温度2~8℃、時間15~20分間とすることにより遠心分離し、上清液を回収し、まず、4000メッシュのろ過布でろ過した後、ろ液を順次に板紙、0.45μmと0.22μmろ膜で順次にろ過させる抽出ステップ(4)と、
ろ過後の浸出液を3KD限外ろ過膜で限外ろ過し、限外ろ過濃縮液及び限外ろ過透過液をサンプルとして取り、その総蛋白含有量を検出し、限外ろ過透過液における総蛋白含有量≦0.02 mg/mlである場合に、透過液を直接排棄し、限外ろ過透過液における総蛋白含有量>0.02 mg/mlである場合に、限外ろ過膜の完全性テストを行い、限外ろ過膜が破損しないと、透過液を排棄し、限外ろ過膜が破損すると、限外ろ過膜を交換した後、透過液の限外ろ過を繰り返る限外ろ過濃縮ステップ(5)と、
限外ろ過濃縮液を再度ろ過及び除菌ろ過を行った後、-50~-35℃で凍結し、2~8mbar真空圧力で、―25℃で乾燥し、水分含有量≦3%に制御するという凍結乾燥プロセス条件によって、カナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品を得る凍結乾燥ステップ(6)と、
を含むことによって製造されるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液凍結乾燥品を提供する。
さらに、前記カナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物凍結乾燥品を錠剤、口腔内崩壊錠の調製に用い、前記カナムグラ花粉アレルゲン浸出液を注射液、舌下ドロップ、アレルゲン貼付剤、アレルゲン浸出液希釈液の調製に用いる。本発明により提供されるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液をカナムグラ花粉過敏性疾患を治療する薬物の調製に用いる。
本発明により調製されたカナムグラ花粉アレルゲン浸出液はパッチテストに応用できる。その原理は、感作物質(アレルゲン)を患者皮膚に敷き、皮膚または粘膜を介して、身体に入った後、抗原提示細胞により、抗原をTリンパ球に提示し、特異性Tリンパ球を活性化させ、炎症反応を誘発させる。
1、カナムグラは北の地域においての主な花粉アレルゲンであり、本発明により提供されるカナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液は、カナムグラ花粉によるアレルギー疾患を効果的に診断してそれに対して特異免疫治療を行うことができる。
2、安定剤グリセリンを入れ、安定性と徐放作用を向上させ、投薬の有効性と安全性を向上させる。
3、アレルギー疾患皮下注射免疫脱感作投薬方式は、舌下ドロップ投薬方式に比べて、効果が速く、周期が短い。治療周期全体の投薬剤量は舌下ドロップ投薬量(約100倍)より遥かに少なく、その治療費用は舌下ドロップ投薬免疫脱感作よりはるかに安く、患者の医療負担を低減させる。
4、本発明は、原液として、調製したアレルゲン浸出液を用い、プリックテストを行い、それぞれアレルギー専門医臨床総合特異性診断と血清特異性IgE(specific IgE,sIgE)診断に対比し、皮内試験結果と臨床総合特異性診断及び血清sIgEとの診断の結果が一致し、優れた感度と特異度を有し、安全性が良好である。
本発明により提供されるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液は、特異性が高い特徴を有し、カナムグラ感作蛋白成分抽出が充分であり、総生物力価が安定であり、有効期が長く、無菌効果がよい。アレルギー疾患の皮膚プリックテスト診断及び特異免疫治療に効果的に利用でき、カナムグラ花粉によるアレルギー疾患を効果的に診断してそれに対して特異免疫治療を行うことができる。標準化制御を実現でき、使用有効期を延長させ、よい経済的な利益をもたらす。
5、本発明は、調製したアレルゲン浸出液を1:103~108で希釈した後、体外好塩基球活性化試験を行い、臨床特異性でカナムグラ過敏患者を診断でき、一部の体外sIgE検出偽陽性を避け、それとともに、アレルゲン皮膚試験(プリックまたは皮内)による一部のヨモギ属花粉過敏患者の過敏性ショックのリスクを避けることができる。
本発明の方法によれば、凍結乾燥して再構成した後に取得した浸出液は、北京協和医院で調製したカナムグラ花粉アレルゲン注射原液に比べて、さらに安定であり、生物力価と蛋白含有量とも安定であり、且つ有効期間は3年である。
特別指定がない限り、実施形態で使用される技術的手段は、当業者に周知の従来の手段である。
原料の識別と純度が後続のアレルゲン診断及び治療製剤にとって極めて重要となるため、本実施例は、DNA特異性配列検出と顕微鏡検によりカナムグラ原料に対して二重識別及品質管理を行った。
1、カナムグラ花粉DNA抽出
天根快速DNA抽出増幅キット(天根生化KG203)を用いる。
抽出方法は、カナムグラ花粉サンプル5mgを量り取り、1.5mLの遠心分離管に置き、Buffer 1 100μlを加えた後、一回限りの擂粉木棒でサンプルを徹底的に摺り砕いた後、Buffer 2 100μlを加えた後、振蕩して均一に混合し、遠心分離分離機12000r/minにより5min遠心分離した後、上清液を新たな遠心分離管に入れ、DNA鋳型として控えた。
2、プライマーの設計及び合成
プライマー配列は以下の通りであった。
Hum ITS2―F(配列番号1):5'―CTGAGAAACGGCTACCACATC―3'
Hum ITS2―R(配列番号2):5'―GTCGGCCAAGGCTATAAACTC―3'
プライマー配列は上海生工生物工程有限公司により合成された。合成後、サブパッケージにして、―20℃に保存した。
3、PCR反応体系
PCR増幅キット(天根生化)。抽出したDNAに対して、表1に示す50μl体系の配合PCR反応体系を用いた。
5、シークエンシング
PCR製品純化回収キット(生工SK1141)により、PCR製品を回収し、シークエンシングを行い、シークエンシング結果番号Hum s ITS2は配列番号3に示した。
6、カナムグラの顕微鏡検
カナムグラ花粉顕微鏡下の形態学識別は、花粉粒球形となり、極面輪郭が円形であり、直径が26.7ミクロン×27.5ミクロンであり、3穴を有し、たまに4穴を有し、均一に赤道に配列した。穴の所に、外壁外部がやや厚く、穴環を形成する。外壁層がはっきりしなく、表面に細粒状装飾を有した。
1、カナムグラ花粉脱脂プロセスにおけるパラメータの決定
(1)カナムグラ花粉(g)とアセトン(ml)を1:2の重量体積比(w/v)で脱脂処理を行った。最適な脱脂時間を決定するために、異なるロット(異なる採集時間)のカナムグラ花粉の異なる脱脂時間サンプルに対して脂肪含有量検出を行った。
海能SOX500脂肪テスターによりカナムグラ花粉において脂肪含有量を測定し、ソックスレー抽出及び乾燥称量の方法により、抽出前後の花粉重量の変化を比較し、対応する脂肪含有量を取得し、脂肪含有量結果により脱脂後花粉に対して質量制御を行った。
結果は、図2を参照する。アセトン脱脂時間が30minになった後、脂肪含有量が脱脂時間に従ってほとんど下がらないため、脱脂時間を30minに決定した。
(2)脱脂パラメータの検証は、異なるロット(異なる採集時間)のカナムグラ花粉に対して30min脱脂を行った後、脂肪含有量を検出し、結果が表3に示した。
2、カナムグラ花粉蛋白浸漬抽出プロセスにおける重要なパラメータを決定
(1)カナムグラ花粉(g)とアセトン(ml)を1:2の重量体積比(w/v)で30分間攪拌または振動脱脂処理し、静置して分層させ、上層液体の上澄み状況を観察し、上層液体が上澄みになるまでに、繰り返して脱脂し、脱脂後の花粉を均一に散開させ、室温で48時間以上乾燥した。
(2)脱脂乾燥後のカナムグラ花粉を重量体積比1:10でpH7.9~8.2のリン酸塩―塩水緩衝液10Lに入れ、2~8℃で、攪拌速度250rpmで、攪拌時間がそれぞれ3h、6h、9h、12h、18h、24h、48h、72hなどになった抽出点に、抽出後の抽出液と浸出液を全部遠心分離桶に入れ、バランスを調整し、遠心分離力8000~12000g、遠心分離温度4℃、時間15~20分間で、遠心分離し、上清液を回収した。
(3)遠心分離後の上清液を、まず、4000メッシュろ過布でろ過した後、板紙でろ過し、0.45μmと0.22μmのろ膜で順次にろ過し、カナムグラ花粉粗抽出液を取得した。
サンプルを取り、Bradford法により蛋白含有量を測定し、結果は、カナムグラ花粉浸出液総蛋白含有量と浸漬抽出時間の関係を示す図3を参照する。
図3に示すように、蛋白抽出プロセスにおいて、攪拌抽出時間に従って、蛋白抽出含有量が増加し、抽出時間24hにおける含有量が最大982±10μg/mlになった。蛋白類物質の抽出時間が長すぎると、その蛋白含有量に影響を与えるため、抽出時間が22~26h左右であることが好ましい。
1、花粉採集
自然脱落法でカナムグラ花粉を収集した。花粉が粘着しないまでに、常温または真空またはフルイドベッド乾燥を行った。乾燥後の花粉を150~250メッシュサンプルふるいに通過させ、本実施例において、180メッシュサンプルふるいが好ましい。
2、乾燥
花粉が粘着しないまでに、通風して花粉を6~48h自然乾燥し、または真空乾燥し、またはフルイドベッド乾燥した。
3、脱脂
取得した花粉(g)とアセトン(ml)を1:5~1:1の重量体積比(w/v)で脱脂処理を行った。本実施例において、1:2が好ましい。30分間攪拌または振動脱脂した後、静置して分層させ、上層液体の上澄み状況を観察した。上層液を注出し、新たなアセトンを入れ、上層液体が上澄みになるまでに、繰り返して脱脂した。
4、再乾燥
脱脂後の花粉を均一に散開させ、室温で6~48h乾燥、または真空乾燥、またはフルイドベッド乾燥を行った。
5、不純物制御
(1)顕微鏡で、粒子計数法により測定した。不純物粒子の含有量は、胞子含有量≦1%、無関係花粉含有量≦2%、そのほかの不純物含有量≦10%という標準を満たすべきである。
(2)重金属及び有害元素
総重金属≦50 mg/kg、ヒ素≦5 mg/kg。
(3)アセトン残留
アセトン残留量≦0.5%(体積分率)。
1、実施例3のカナムグラ花粉原料プロセスによりカナムグラ花粉原料を調製した。
2、浸漬抽出
脱脂乾燥後のカナムグラ花粉を重量体積比1:50~1:10、本実施例において、1:20で、pH7.9~8.2のリン酸塩―塩水緩衝液10Lに入れ、2~8℃で22~26h攪拌して浸漬抽出させた。リン酸塩―塩水緩衝液(pH 8.2)1000mlを例とする調合方法は表4に示した。リン酸塩―塩水緩衝液を充分に溶解させた後、除菌ろ過を行い、2~8℃で放置し、30日以内に保存した。
抽出後の浸出液を取り、浸出液全体を遠心分離桶に入れ、バランスを調製し、遠心分離力8000~12000g、遠心分離温度2~8℃、時間15~20分間により、遠心分離を行い、上清液を回収した。
4、上澄み
遠心分離分離後の上清液を、まず、4000メッシュろ過布でろ過した後、ろ液を板紙でろ過し、0.45μmと0.22μmろ膜で順次にろ過した。
5、限外ろ過、透析、濃縮
ろ過後の浸出液に対し、3KDまたは1KD限外ろ過膜でタンジェント流限外ろ過を行い、好ましくは、本実施例において、3KD限外ろ過膜で限外ろ過を行った。透析液は、25~125mMのNH4HCO3を用い、本実施例において、50mMのNH4HCO3が好ましい。蛋白含有量品質標準に基づき、適当な体積までに限外ろ過して濃縮し、蛋白含有量から品質標準の総蛋白含有量までの区間を検出した。限外ろ過濃縮液、限外ろ過透過液を取り、それらの総蛋白含有量を検出した。限外ろ過透過液における総蛋白含有量≦0.02 mg/mlとなったとき、透過液を直接排棄し、限外ろ過透過液における総蛋白含有量>0.02 mg/mlとなったとき、限外ろ過膜に対して完全性テストを行い、限外ろ過膜が破損しなければ、透過液を排棄し、限外ろ過膜が破損すれば、限外ろ過膜を交換した後、透過液に対して繰り返して限外ろ過を行った。
6、無菌ろ過
0.22μm膜で除菌ろ過を行った。
7、凍結乾燥
―50~―35℃で凍結し、2~8mbar真空圧力で、―25℃で乾燥し、水分含有量≦3%に制御するという凍結乾燥プロセス条件により、カナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品を取得した。
1、再構成
実施例4で調製したカナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品をリン酸塩―塩水緩衝液(pH 6.5~7.5、調合方法は表5を参照)で再構成させ、総蛋白含有量を品質標準2倍範囲区間にさせた。2~8℃で放置した。
原液再構成後、クリーンホールにてA級清潔条件下で、再構成液と予め湿熱滅菌(121℃、30分間)して等体積で冷却のグリセリンとを均一に混合し、溶液のpH値を6.0~8.0に調製した。
3、半製品を除菌ろ過し、無菌サブパッケージで製品にさせ
クリーンホール内A級清潔条件下で、半製品を0.22μmろ膜で除菌ろ過させ、無菌サブパッケージで製品にさせ、pH6.0~8.0の浅黄色乃至茶褐色液体、即ちカナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液製品を取得した。
1、カナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液総蛋白成分SDS―PAGE法識別
還元型SDS―PAGE法により、分離ゲル濃度が4~12%であり、クマシーブリリアントブルーで染色した。結果は図3に示した。MはGenstar M223―01 Markerであり、Rは凍結乾燥内部参照品(即ち、凍結乾燥したカナムグラ花粉アレルゲン原液)であり、L1、L2及びL3は異なるロットのカナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液であり、その蛋白は主に6.3~76kDaに分布し、具体的には、10kDa(具体的な分子量は6.3 kDa、7.0kDa、8.09kDa、8.8kDa、9.6kDa、10.03kDa、10.22kDaである)、11.8 kDa、12.3 kDa、13.5 kDa 、15.2 kDa、 15.32 kDa、16.45 kDa 、16.61 kDa、19 kDa(具体的には、19.04 kDa、19.18 kDa、19.99 kDa)、28 kDa、37 kDa、42 kDa、45 kDa、52 kDa、66 kDa、76 kDaに分布した。
鑑定した感作蛋白分子量、配列、過敏血清陽性率、対応ホロ蛋白マススペクトル鑑定ペプチドセグメント概況は表6に参照する。
2、カナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液総アレルゲン成分Western Blotting法識別
還元型SDS―PAG電気泳動を用い、分離ゲル濃度が4~12%であり、0.2μm PVDF ImmobilonR―PSQ転写フィルムを用い、一次抗体血清反応希釈度が1:3であり、室温で2h雑交し、そして、4℃冷蔵庫で一晩雑交し、1×PBSTで3回洗い、10min/回となった。二次抗体Ms mAb to Hu IgE(ab99806)が1:1000であり、室温で2h雑交し、1×PBSTで3回洗い、10min/回となった。ECL現像液のA液とB液を1:1で均一に混合した後、露光して顕色させた。
結果は図4に示した。MはGenstar M223―01 Markerであり、Rは内部参照品であり、Nは浸出液と健康被験者血清の反応ストリップであり、P1~24はそれぞれ浸出液と臨床確診のカナムグラ過敏陽性患者24例(sIgE≧3級、皮膚試験≧+++、典型的な夏秋花粉症病史)の血清反応ストリップ結果であり、感作Hum sc 1―Hum sc 11の分子量及び過敏血清陽性率は表6に示した。これによって、血清陽性率最大のHum s 3(9.6kDa)がカナムグラ花粉の主な感作蛋白(血清陽性率最大が68.9%)であることが分かった。
3、感作蛋白配列測定
本発明の製品により、対応の感作蛋白(表6を参照)に対して全蛋白配列測定を行い、カナムグラ花粉原料においてそれぞれの感作蛋白対応mRNAに対してヌクレオチドフル・シークエンシングを行い、感作蛋白コード、配列識別子及びアミノ酸フル・配列、対応mRNAフル・配列結果は表6を参照する。そのうち、Hum s 3は主な感作蛋白であった。
本発明に含まれるカナムグラ感作蛋白のフル・配列は順次に以下となった。
Hum sc 1感作蛋白フル・配列は、配列番号4に示した。
Hum sx 2感作蛋白フル・配列は、配列番号5に示した。
Hum sc 2感作蛋白フル・配列は、配列番号6に示した。
Hum sc 3感作蛋白フル・配列は、配列番号7に示した。
Hum s 3感作蛋白フル・配列は、配列番号8(本出願者がこの前に発見したNCBIデータベースにおけるHum s 3:ADB97919.1蛋白配列に完全に合致するが、mRNAが第15位で同義的置換が発生した)に示した。
Hum sc 4感作蛋白フル・配列は、配列番号9に示した。
Hum sc 5感作蛋白フル・配列は、配列番号10に示した。
Hum sc 6感作蛋白フル・配列は、配列番号11に示した。
Hum sc 7感作蛋白フル・配列は、配列番号12に示した。
Hum sc 8感作蛋白フル・配列は、配列番号13に示した。
Hum sc 9感作蛋白フル・配列は、配列番号14に示した。
Hum sc 10感作蛋白フル・配列は、配列番号15に示した。
Hum sc 11感作蛋白フル・配列は、配列番号16に示した。
Hum sc 12感作蛋白フル・配列は、配列番号17に示した。
Hum sc 13感作蛋白フル・配列は、配列番号18に示した。
Hum sc 14感作蛋白フル・配列は、配列番号19に示した。
Hum sc 15感作蛋白フル・配列は、配列番号20に示した。
カナムグラ花粉原料においての前記それぞれの感作蛋白対応mRNAがヌクレオチドフル・シークエンシングを行った後、それらのmRNA対応配列は以下の通りであった。
Hum sc 1感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号21に示した。
Hum sx 2感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号22に示した。
Hum sc 2感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号23に示した。
Hum sc 3感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号24に示した。
Hum s3感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号25に示した。(NCBI番号FJ967117.1に比べて、第15位ヌクレオチドがT→C同義的置換を行った)
Hum sC 4感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号26に示した。
Hum sC5感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号27に示した。
Hum sC6感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号28に示した。
Hum sC7感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号29に示した。
sHum sC8感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号30に示した。
Hum sC 9感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号31に示した。
Hum sC 10感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号32に示した。
Hum sC 12感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号34に示した。
Hum sC 13感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号35に示した。
Hum sC 14感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号36に示した。
Hum sC 15感作蛋白遺伝子フル・配列は、配列番号37に示した。
本発明において新規鑑定したカナムグラ花粉蛋白(Hum sc 1―15)に対し、本発明は高解像度の両方向電気泳動(2D)にWestern Blotting技術(15例のカナムグラ花粉過敏患者陽性血清池と反応する)を加え、上記の蛋白とカナムグラ花粉過敏患者外周血におけるsIgEが結合できることを証明し、このため、感作蛋白となっている。2Dのゲル電気泳動図は図6(a)に示し、Western Blotting結果は図6(b)示した。
4、質量スペクトル検出
カナムグラアレルゲン浸出液に対し、ホロ蛋白マススペクトル分析を行い、カナムグラアレルゲンがSDS―PAGE分離した後に対応するガムテープに対し、それぞれサンプルを取り、質量スペクトル鑑定を行い、以下のペプチドセグメントを含むが、これらに限られない。
Hum sc 3質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号38:TADAAHSAADSVQEGKであった。
Hum S 3質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号39:ACTSLYDK
配列番号40:ACTSLYDKYYQNCVMK
配列番号41:LPPGACIDSENYR
配列番号42:LPPGACIDSENYRK
配列番号43:SIYPSNYAECATTHHNICGDLQG
配列番号44:YYQNCVMKであった。
Hum sc 4質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号45:YESCLLSHISCDFDSCK
配列番号46:ADCFTTCDSYYPK
配列番号47:IKHDDICNGLPであった。
Hum sc 7質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号48:ACGSLYDK
配列番号49:ACGSLYDKYYQNCVMK
配列番号50:YYQNCVMK
配列番号51:LPHGACIDDENYQNCLK
配列番号52:NNIGSCNINTCFEDTSK
配列番号53:SIYPNNYGDCATTHHDICGDLQGであった。
Hum sc 9質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号54:IISHHYNEK
配列番号55:IISHHYNEKR
配列番号56:LVKIISHHYNEK
配列番号57:NVPTLIDAR
配列番号58:RNVPTLIDAR
配列番号59:VIGPTTLRであった。
Hum sc 11質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号60:TLEQVEIK
配列番号61:GTTLIECGFSWDWGK
配列番号62:QSHHTDIYTPEGPNCRであった。
Hum sc 12質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号63:IEQVDVR
配列番号64:NVLDGKQDLSVYCK
配列番号65:QDLSVYCK
配列番号66:NNEFNTQILSYK
配列番号67:EFHNVQIFMPESLNCR
配列番号68:SFTFDCFDWGKであった。
Hum sc 13質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号69:AFLDAHNAIRであった。
Hum sc 15質量スペクトル鑑定したペプチドセグメントは、
配列番号70:AYLDAHNAVR
配列番号71:TLEDYAQKであった。
5、理化学的性質検出
このカナムグラアレルゲン浸出液は理化学的性質検出を行った後、その品質標準は表7に示した。
アレルゲン浸出液には治療有効量または診断有効量のカナムグラ花粉アレルゲンが含まれるとき、競争性ELISA法により、相対生物力価50000 BAU/ml~200000 BAU/ml、蛋白濃度0.40~1.60mg/mlであったことを測定した。
7、主な感作蛋白Hum s 3含有量検出
二抗体モノクローナル抗体サンドイッチ測定法ELISA法により、カナムグラ花粉アレルゲン浸出液における主な感作蛋白含有量を検出した。複数のロットの検出により、その変動範囲0.08~0.32mg/mlを決定した。
8、無菌検査
非無菌生長してはならなかった。
実施例5に調製したカナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液製品に対し、2~8℃で長期間安定性研究試験を行い、3つのロットのサンプルにそれぞれ0ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月及び12ヶ月のpH値変化、フェノール含有量、塩化ナトリウム含有量、蛋白含有量、総アレルゲン活性、主な感作蛋白Hum s 3含有量の変化を検出し、結果は図7~図12に示した。
上述した安定性結果において、12ヶ月の長期間試験では、カナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液の品質管理パラメータが不規則波動したが、実験誤差による可能性があるが、それにしても、品質標準管理範囲内にあり、且つ、異なるロットの間の変化トレンドがほぼ一致し、本発明によるカナムグラ花粉標準化アレルゲン浸出液は、2~8℃条件で、少なくとも12ヶ月内に安定に保存することができることが分かった。このため、カナムグラ花粉アレルゲン浸出液製品の有効期間は、36ヶ月と推定された。
本発明によるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液により、カナムグラ花粉過敏に対し、臨床特異性皮膚試験診断を行い、有効性と安全性を評価した。方法は以下の通りであった。2015年8月24日から2016年9月21日までの間に、北京協和医院アレルギー科の外来診療で、過敏性結膜炎、過敏性鼻炎、過敏性喘息、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎等の過敏性疾患にかかった患者1026例を選択した。被験者に対し、カナムグラ花粉アレルゲン皮膚プリックテスト(Skin prick test,SPT)を行い、原液を用い、平均膨疹径(Mean wheal diameter,MWD)を判定標準とし、花粉sIgEを標準とし、ROC分析を行い、異なる診断分割点下で、カナムグラ花粉アレルゲン浸出液を用い、診断カナムグラ花粉過敏の正確性を分析した。それとともに、不良事件を記録し、安全性を評価した。結果(Results)には、外来診療患者1026例(4~70歳)を含み、脱落症例がなく、除去率が22.1%であった。安全セット(Safety Set,SS)は1026例であり、フル・アナリシス・セット(Full Analysis Set,FAS)は990例であり、パー・プロトコル・セット(Per protocol set,PPS)は799例であった。年齢は、最小が6歳、最大が67歳であった。PPSのROC曲線を分析し、カナムグラ花粉SPTの最適な診断閾値がMWD 6.75mmであり、特異度が95%ときの診断閾値はMWD 8.25mmであることを推定した。それぞれMWD 3mm(国際通用閾値)、6.75mm、8.25mmを診断閾値とした。本発明のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液をカナムグラ花粉過敏の診断に用いる感度を順次に低下し、それぞれ0.9366(95%CI:0.9159 ~ 0.9572)、0.5485(95%CI:0.5064 ~ 0.5906)、0.4216(95%CI:0.3798 ~ 0.4634)であり、特異度は順次に上昇し、それぞれ0.0913(95%CI:0.0565 ~ 0.1261)、0.8517(95%CI:0.8088 ~ 0.8947)、0.9696(95%CI:0.9488 ~ 0.9903)であった。1026例患者では、7例は8回の不良事件が行われ、不良事件発生率が0.68%(7/1026)であり、主な症状は、鼻水、くしゃみ、鼻のかゆみ、呼吸困難、目のかゆみ、胸部圧迫感、局部皮膚プリック反応などであった。深刻な不良事件はなかった。結論は、本発明のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液はカナムグラ花粉過敏の診断に用い、診断価値が高く、安全性がよく、カナムグラ花粉アレルゲン特異性体内診断の臨床検査方法として利用されることができる。
実施例9 評価応用2
本発明によるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液により、カナムグラ花粉過敏患者全血に対し、好塩基球活性化試験を行い、臨床特異性過敏体外診断することができる。この検出方法は、IgEまたは非IgEにより誘発された過敏反応にも適用でき、一部のsIgE体外診断には偽陰性、偽陽性が存在する患者の確診及び一部の過敏性ショック患者が皮膚試験診断に不適合の状況にも利用されることができる。
Claims (29)
- 配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 1を含むことを特徴とするカナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物。
- 配列番号6で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 2を含むことを特徴とするカナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物。
- 配列番号7で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 3を含むことを特徴とするカナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物。
- 配列番号9で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 4を含むことを特徴とするカナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物。
- 配列番号10で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 5を含むことを特徴とするカナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物。
- 配列番号11で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 6を含むことを特徴とするカナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物。
- 配列番号12で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 7を含むことを特徴とするカナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物。
- 配列番号13で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 8を含むことを特徴とするカナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物。
- 配列番号14で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 9を含むことを特徴とするカナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物。
- 配列番号15で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 10を含むことを特徴とするカナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物。
- 配列番号16で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 11を含むことを特徴とするカナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物。
- 配列番号17で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 12を含むことを特徴とするカナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物。
- 配列番号18で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 13を含むことを特徴とするカナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物。
- 配列番号19で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 14を含むことを特徴とするカナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物。
- 配列番号20で示されるアミノ酸配列を有するカナムグラ花粉アレルゲン蛋白Hum sc 15を含むことを特徴とするカナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物。
- 前記遺伝子は、配列番号4、配列番号6、配列番号7、配列番号9―20で示されるアミノ酸配列をコードし、それぞれ配列番号21、配列番号23、配列番号24、配列番号26―37で示される配列と対応することを特徴とするカナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物をコードするための遺伝子。
- 請求項1~15のいずれか一項に記載のカナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物、体積比で0.2~0.4%のフェノール、体積比で45~55%のグリセリン、及び4.5~5.5g/LのNaClを含み、pH値が6.0~8.0であることを特徴とするカナムグラ花粉アレルゲン浸出液。
- 前記カナムグラ花粉アレルゲン浸出液の活性濃度が50000~200000BAU/mlであり、蛋白濃度が0.40~1.60mg/mlであることを特徴とする請求項17に記載のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液。
- 前記カナムグラ花粉アレルゲン浸出液の総蛋白濃度が0.40~1.60mg/mlであることを特徴とする請求項17に記載のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液。
- SDS-PAGE及びWestern Blotting検出に基づいて、前記カナムグラ花粉アレルゲン抽出物の蛋白は主に、10kDa、11.8 kDa、12.3 kDa、13.5 kDa 、15.2 kDa、 15.32 kDa、16.45 kDa 、16.61 kDa、19 kDa、28 kDa、37 kDa、42 kDa、45 kDa、52 kDa、66 kDa、76 kDaに分布することを特徴とする請求項17に記載のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液。
- ホロ蛋白マススペクトル検出に基づいて、主に、配列番号38~配列番号71の特性ペプチドセグメントを含むが、これらに限られないことを特徴とする請求項17に記載のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液。
- カナムグラ花粉を採集し、常温乾燥または真空乾燥またはフルイドベッド乾燥を行うステップS1と、
乾燥後の花粉を脱脂して、乾燥するステップS2と、
脱脂乾燥後のカナムグラ花粉を重量g体積ml比1:50~1:10でpH7.9~8.2のリン酸塩-塩水緩衝液に入れ、2~8℃で22~26h攪拌し、それを浸漬抽出するステップS3と、
ステップS3後の浸漬抽出液を取り、遠心分離により上清液を取り、上清液をろ過及び除菌ろ過するステップS4と、
ろ過後の上清液を限外ろ過濃縮し、限外ろ過濃縮液を得るステップS5と、
前記限外ろ過濃縮液を再度ろ過及び除菌ろ過した後、真空凍結乾燥してカナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品を得るステップS6と、
前記カナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品をpH6.5~7.5リン酸塩―塩水緩衝液で再溶解させてカナムグラ花粉アレルゲン原液を調製し、2~8℃で放置し、等体積で滅菌のグリセリンと均一に混合し、溶液のpH値を6.0~8.0に調整するステップS7と、
を含むことを特徴とする請求項17~21のいずれか一項に記載のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液の調製方法。 - ステップS2において、前記花粉脱脂は、花粉とアセトンとの重量g体積ml比1:5~1:1で、上層液体が上澄みになるまで脱脂処理を繰り返ることを特徴とする請求項22に記載の調製方法。
- ステップS4において、前記遠心分離の条件は、8000~12000g、遠心分離温度2~8℃、時間15~20minであり、前記ろ過及び除菌ろ過において、まず、4000メッシュのろ過布でろ過した後、板紙、0.45μm及び0.22μmのろ膜で順次にろ過することを特徴とする請求項22に記載の調製方法。
- 前記限外ろ過濃縮は、3KD限外ろ過膜により限外ろ過を行い、限外ろ過透過液における総蛋白含有量≦0.02 mg/mlである場合に、限外ろ過を中止させ、限外ろ過透過液における総蛋白含有量>0.02 mg/mlである場合に、限外ろ過膜を交換した後、限外ろ過透過液における総蛋白含有量≦0.02 mg/mlとなるまで限外ろ過透過液の限外ろ過を繰り返し、
ステップS6において、前記真空凍結乾燥の条件は、-50~-35℃で凍結し、2~8mbar真空圧力で、-25℃で乾燥し、水分含有量≦3%に制御することを特徴とする請求項22に記載の調製方法。 - 前記ステップS1は、さらに原料カナムグラ花粉に対して鏡検識別および/またはDNA鑑定を行うステップを含み、DNA鑑定方法は、プライマーとして配列番号1、配列番号2を用い、識別のカナムグラ花粉原料をPCR増幅させ、増幅製品を検出することであることを特徴とする請求項22に記載の調製方法。
- カナムグラ花粉の収集、乾燥、脱脂、抽出、限外ろ過濃縮、凍結乾燥によって製造されるカナムグラ花粉アレルゲン浸出液凍結乾燥品であって、
自然脱落法でカナムグラ花粉を収集する収集ステップ(1)と、
花粉が付着しなくなるまで常温乾燥または真空乾燥またはフルイドベッド乾燥で乾燥し、乾燥後の花粉を150~250メッシュのサンプルふるいに通過させる乾燥ステップ(2)と、
ステップ(2)で得られた花粉とアセトンをそれぞれg及びmlとして1:5~1:1の重量体積比で脱脂処理し、攪拌または振動脱脂30分間した後、静置して分層させ、上層液を注出し、新たなアセトンを入れ、上層液体が上澄みになるまで脱脂を繰り返し、脱脂後の花粉を均一に散開させ、室温乾燥または真空乾燥またはフルイドベッド乾燥で48時間~72時間乾燥する脱脂ステップ(3)と、
脱脂乾燥後のカナムグラカナムグラ花粉を重量体積比1:50~1:10でpH7.9~8.2のリン酸塩―塩水緩衝液10Lに入れ、2~8℃で22~26h攪拌し、浸漬抽出し、抽出後の浸出液を取り、遠心分離力8000~12000g、遠心分離温度2~8℃、時間15~20分間とすることにより遠心分離し、上清液を回収し、まず、4000メッシュのろ過布でろ過した後、ろ液を順次に板紙、0.45μm及び0.22μmろ膜で順次にろ過させる抽出ステップ(4)と、
ろ過後の浸出液を3KD限外ろ過膜で限外ろ過し、限外ろ過濃縮液及び限外ろ過透過液をサンプルとして取り、その総蛋白含有量を検出し、限外ろ過透過液における総蛋白含有量≦0.02 mg/mlである場合に、透過液を直接排棄し、限外ろ過透過液における総蛋白含有量>0.02 mg/mlである場合に、限外ろ過膜の完全性テストを行い、限外ろ過膜が破損しないと、透過液を排棄し、限外ろ過膜が破損すると、限外ろ過膜を交換した後、透過液の限外ろ過を繰り返る限外ろ過濃縮ステップ(5)と、
限外ろ過濃縮液を再度ろ過及び除菌ろ過した後、-50~-35℃で凍結し、2~8mbar真空圧力で、-25℃で乾燥し、水分含有量≦3%に制御するという凍結乾燥プロセス条件によって、カナムグラ花粉アレルゲン凍結乾燥品を得る凍結乾燥ステップ(6)と、
を含むことによって製造されることを特徴とするカナムグラ花粉アレルゲン浸出液凍結乾燥品。 - 浸出液浸出液過敏性喘息、アレルギー鼻炎、アトピー性皮膚炎及び慢性じんま疹を含むアレルギー疾患の診断、及びその特異免疫治療の製剤への、請求項1~15のいずれか一項に記載のカナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物、請求項17~21のいずれか一項に記載のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液、請求項27に記載のカナムグラ花粉アレルゲン浸出液凍結乾燥品の使用。
- 前記カナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物凍結乾燥品を錠剤、口腔内崩壊錠の調製に用い、前記カナムグラ花粉アレルゲン浸出液を注射液、舌下ドロップ、アレルゲン貼付剤、アレルゲン浸出液希釈液の調製に用いることを特徴とする請求項28に記載の使用。
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN201810243654 | 2018-03-23 | ||
CN201910210654.X | 2019-03-20 | ||
CN201910210654.XA CN110124028A (zh) | 2018-03-23 | 2019-03-20 | 一种葎草花粉变应原浸提物、浸液及其制备方法 |
PCT/CN2019/088605 WO2020186624A1 (zh) | 2018-03-23 | 2019-06-28 | 一种葎草花粉变应原浸提物、浸液及其制备方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2022528668A true JP2022528668A (ja) | 2022-06-15 |
JP7394866B2 JP7394866B2 (ja) | 2023-12-08 |
Family
ID=67568889
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2021558495A Active JP7394866B2 (ja) | 2018-03-23 | 2019-06-28 | カナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物、浸出液及びその調製方法 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP7394866B2 (ja) |
KR (1) | KR20220002909A (ja) |
CN (1) | CN110124028A (ja) |
WO (1) | WO2020186624A1 (ja) |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20230166288A (ko) | 2022-05-30 | 2023-12-07 | 연세대학교 산학협력단 | 화분증 진단용 조성물 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101392017A (zh) * | 2007-09-21 | 2009-03-25 | 中国医学科学院北京协和医院 | 葎草花粉主要致敏蛋白的分离纯化方法 |
CN101392023A (zh) * | 2007-09-21 | 2009-03-25 | 中国医学科学院北京协和医院 | 葎草花粉主要致敏蛋白 |
CN101791399A (zh) * | 2009-02-04 | 2010-08-04 | 阿尔克-阿贝洛有限公司 | 一种用于口腔粘膜给药的含水液体变态反应疫苗制剂 |
CN101972472A (zh) * | 2010-10-26 | 2011-02-16 | 北京新华联协和药业有限责任公司 | 一种变应原疫苗纯化及其制备的方法 |
CN102552900A (zh) * | 2011-12-21 | 2012-07-11 | 北京新华联协和药业有限责任公司 | 蒿属花粉变应原疫苗及其制备方法和应用 |
CN103131752A (zh) * | 2011-11-22 | 2013-06-05 | 青岛康地恩药业股份有限公司 | 一种快速鉴别天花粉类药材的分子生物学方法 |
CN107669743A (zh) * | 2017-11-24 | 2018-02-09 | 中国医学科学院北京协和医院 | 葎草花粉过敏性哮喘免疫治疗小鼠模型的建立方法 |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2145169C (en) * | 1992-09-21 | 2003-05-27 | Lubertus Berrens | A process for the purification of aqueous extracts containing allergenically active proteins, extracts obtainable according to this process as well as their use |
EP1718331A4 (en) * | 2004-02-06 | 2009-11-11 | Greer Lab Inc | METHOD AND COMPOSITIONS FOR DOSING ALLERGENS |
CN101905022B (zh) * | 2009-06-08 | 2013-10-30 | 浙江我武生物科技股份有限公司 | 一种稳定的含有蒿属花粉变应原的药物组合物及其制备方法 |
CN102512672B (zh) * | 2011-12-21 | 2014-09-10 | 北京新华联协和药业有限责任公司 | 一种蒿属花粉变应原疫苗及其制备方法 |
-
2019
- 2019-03-20 CN CN201910210654.XA patent/CN110124028A/zh active Pending
- 2019-06-28 JP JP2021558495A patent/JP7394866B2/ja active Active
- 2019-06-28 KR KR1020217034016A patent/KR20220002909A/ko not_active Application Discontinuation
- 2019-06-28 WO PCT/CN2019/088605 patent/WO2020186624A1/zh active Application Filing
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101392017A (zh) * | 2007-09-21 | 2009-03-25 | 中国医学科学院北京协和医院 | 葎草花粉主要致敏蛋白的分离纯化方法 |
CN101392023A (zh) * | 2007-09-21 | 2009-03-25 | 中国医学科学院北京协和医院 | 葎草花粉主要致敏蛋白 |
CN101791399A (zh) * | 2009-02-04 | 2010-08-04 | 阿尔克-阿贝洛有限公司 | 一种用于口腔粘膜给药的含水液体变态反应疫苗制剂 |
CN101972472A (zh) * | 2010-10-26 | 2011-02-16 | 北京新华联协和药业有限责任公司 | 一种变应原疫苗纯化及其制备的方法 |
CN103131752A (zh) * | 2011-11-22 | 2013-06-05 | 青岛康地恩药业股份有限公司 | 一种快速鉴别天花粉类药材的分子生物学方法 |
CN102552900A (zh) * | 2011-12-21 | 2012-07-11 | 北京新华联协和药业有限责任公司 | 蒿属花粉变应原疫苗及其制备方法和应用 |
CN107669743A (zh) * | 2017-11-24 | 2018-02-09 | 中国医学科学院北京协和医院 | 葎草花粉过敏性哮喘免疫治疗小鼠模型的建立方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP7394866B2 (ja) | 2023-12-08 |
KR20220002909A (ko) | 2022-01-07 |
CN110124028A (zh) | 2019-08-16 |
WO2020186624A1 (zh) | 2020-09-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN109939226B (zh) | 一种大籽蒿花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法 | |
FALK et al. | In vitro demonstration of specific immunological hypersensitivity to scabies mite | |
CN109182167B (zh) | 一种高效价结核菌素皮试诊断试剂(ppd)生产工艺 | |
CN109939227B (zh) | 一种豚草花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法 | |
CN110201188B (zh) | 一种地肤花粉变应原浸提物、其浸提液及其制备方法 | |
CN107446036A (zh) | 一种血小板细胞因子浓集物的富集方法 | |
JP2022528668A (ja) | カナムグラ花粉アレルゲン浸漬抽出物、浸出液及びその調製方法 | |
KR20150084629A (ko) | 루테리알 및 그 분리·배양 방법 | |
Havnen et al. | IgE concentrations in allergic asthma in children. | |
WO2008086721A1 (fr) | Procédé de préparation d'un mélange de sérum ordinaire en vue de déterminer l'activité d'un allergène et application du mélange de sérum | |
CN110064052B (zh) | 一种英国梧桐花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法 | |
CN104056259A (zh) | 一种治疗或预防过敏性疾病的有效成分 | |
CN110078803B (zh) | 一种洋白蜡花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法 | |
CN110064051B (zh) | 一种白桦花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法 | |
CN109771641B (zh) | 一种圆柏花粉变应原浸提物、其浸液及其制备方法 | |
Takwoingi et al. | Comparing nasal secretion eosinophil count with skin sensitivity test in allergic rhinitis in Ibadan, Nigeria | |
Al-Kaif et al. | Association between the levels of bradykinin and viral infection in patient suffering from respiratory infection, renal transplant, and renal failure | |
US20060078569A1 (en) | Method for recovery of photo-inhibited immunological activity | |
TW201629093A (zh) | 新穎美洲室塵蟎蛋白質 | |
CN104491858B (zh) | 一种稳定的含有动物毛皮屑变应原的液体药物组合物 | |
TW202033229A (zh) | 家禽類骨蛋白萃取物用於骨填補材的用途 | |
RU2618410C1 (ru) | Способ оценки врожденного иммунитета у детей с бронхиальной астмой | |
CN117547603B (zh) | 一种芒果花粉变应原浸提物、浸液及其制备方法和应用 | |
CN103304646B (zh) | 结核分枝杆菌候选抗原多肽及其应用 | |
Aslam et al. | Identification of major allergens of Paper Mulberry (Broussonetia papyrifera) pollens and purification of novel 40 kDa allergen protein |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20211201 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211201 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20211126 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20221101 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20230201 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20230418 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20230714 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20231114 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20231128 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7394866 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |