PT2533808E - Processo de produção de um extrato alergénico - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO «PROCESSO DE PRODUÇÃO DE UM EXTRATO ALERGÉNICO»

CAMPO TÉCNICO

[0001] A invenção refere-se a um processo para produção de um extrato alergénico purificado, composições farmacêuticas e vacinas para utilização no diagnóstico e tratamento da alergia.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] A alergia é uma perturbação adquirida de hipersensibilidade do sistema imunitário e é desencadeada pela exposição a substâncias ambientais inofensivas, conhecidas como alergénios. Uma reação de hipersensibilidade de tipo I é característica de reações alérgicas e resulta na produção excessiva de anticorpos IgE que, por sua vez, ativam basófilos e mastócitos, causando uma reação inflamatória. Os efeitos poderão ser sistémicos, tais como vasodilatação, secreção de muco, estimulação nervosa e contração muscular suave, causando uma reação anafilática, ou serem circunscritos a uma área específica do corpo, por exemplo, o sistema respiratório.

[0003] As alergias alimentares são um problema de saúde pública emergente que afeta cerca de 6% das crianças em idade escolar e aproximadamente 4% dos adultos e que pode ter sérias consequências, entre as quais, reações anafiláticas fatais (1) . A alergia pode, então, ter um impacto significativo nos aspetos psicossociais da qualidade de vida, 1 estendendo-se para além dos efeitos clínicos imediatos da condição alérgica do doente e atividades diárias das famílias. (2) Atualmente, o padrão de cuidados para este tipo de alergia inclui o evitamento absoluto dos alergénios ofensivos e o tratamento com epinefrina.

[0004] A alergia ao amendoim é uma resposta imune de hipersensibilidade de Tipo I (mediada por IgE) a substâncias alimentares derivadas de amendoim que causa uma reação exagerada do sistema imunitário. A fundação norte-americana "Asthma and Allergy Foundation of America" considera que a alergia ao amendoim é a causa mais comum de óbito associado à alimentação nos Estados Unidos, estimando que esta afete entre 0,4-0,6% da população. São também alergénios comuns os frutos de casca rija como as nozes pecã, pistácios, pinhões e nozes.

[0005] Até à data, foram identificados onze alergénios (Ara h 1 até Ara h 11) no amendoim (Arachis hypogea), tendo muitos deles sido sequenciados e clonados. Segundo a União Internacional das Sociedades de Imunologia (UISI), a nomenclatura destes alergénios inclui: Ara h 1, uma cupina (do tipo vicilina, globulina 7S) de 64 kDa; Ara h 2, uma conglutina (albumina 2S) de 17 kDa; Ara h 3, uma cupina (do tipo legumina, globulina 11S, Glicinina) de 60 kDa; Ara h 4, uma cupina (de tipo legumina, glicinina 11S) de 37 kDa; Ara h 5, uma profilina de 15 kDa; Ara h 6, uma conglutina (albumina 2S) de 15 kDa; Ara h 7, uma conglutina (albumina 2S) de 15 kDa; Ara h 8, uma proteína de associação patogénica, PR-10 de 17 kDa; Ara h 9, uma proteína de transferência lipídica não específica 1 de 9,8 kDa; Ara h 10, uma oleaosina de 16 kDa e Ara h 11, uma oleosina de 14 kDa. 2 [0006] A alergia a gatos é extremamente comum, ocorrendo em até 25% das pessoas com alergias. A alergia a gatos é mais comum que a alergia a pelo de cão, o que poderá estar relacionado com a potência do pelo do gato e ao pelo enquanto alergénio, bem como ao facto de estes não serem, geralmente, lavados. Os alergénios de gato são produzidos em grandes quantidades, particularmente nos gatos macho não esterilizados, uma vez que o alergénio se encontra parcialmente sob controlo hormonal. O pelo está constantemente presente no ar, é aderente e pode ser encontrado em espaços públicos, mesmo quando não há gatos. Tal deve-se ao transporte do pelo na roupa de pessoas que têm gatos e que o libertam em espaços públicos. Como tal, os alergénios de gato são um componente da poeira doméstica, mesmo em casas em que não tenha vivido qualquer gato. A dimensão das partículas de pelo de gato é extremamente reduzida, propiciando a sua aspiração pulmonar profunda. O pelo de gato é, portanto, uma causa frequente de asma alérgica, pelo que os donos de gatos que tenham esta alergia são mais susceptíveis ao desenvolvimento de sintomas asmáticos. (8'9) Os principais alergénios de cão e gato podem ser encontrados em extratos pilosos e na saliva sendo, portanto, considerados como alergénios epiteliais. Foram identificados oito tipos distintos de alergénios em gatos, tendo muitos deles sido sequenciados e clonados. Com base no sítio web da UISI1, estes alergénios incluem: Fel d 1, uma uteroglobina de 14 e 4 kDa; Fel d 2, uma albumina de 69 kDa; Fel d 3, uma cistatina de 11 kDa; Fel d 4, uma lipocalina de 22 kDa; Fel d 5, uma imunoglobulina A de 400 kDa; Fel d 6, uma imunoglobulina M de 800-1000 kDa; Fel d 7, uma proteína da glândula de Von Ebner de 17,5 kDa; Fel d 8, uma proteína 3 do tipo laterina de 24 kDa. 0 principal alergénio de gato, Fel d 1, foi extensivamente caracterizado por técnicas de análise proteica e imunoquimicas e recentemente expresso como um alergénio recombinante. 0 Fel d 1 representa um dímero de aproximadamente 36 kDa, constituído por duas subunidades de 17 kd (10).

[0007] A alergia a gramineas é uma das formas mais comuns e prevalecentes de alergia que afeta pessoas com historial alérgico em determinadas estações. Encontra-se presente no ar na fase final da primavera e início dos meses de verão, podendo causar rinite alérgica, conjuntivite alérgica e asma. O contacto direto da pele com gramineas, desde sentar a cortar a relva, pode causar prurido na pele, urticária e dermatite atópica. Uma das espécies mais representativas é a Phleum pratense, selecionada como líder do grupo das gramineas. Foram identificados nove alergénios distintos na espécie Phleum pratense. Com base no sitio web da Allergen1, estes alergénios incluem: Phl p 1, uma beta-expansina de 27 kDa; Phl p 2, uma graminea do grupo II/III de 10-12 kDa; Phl p 4, uma proteina de 55 kDa; Phl p 5, de 32 kDa; Phl p 6, de 11 kDa; Phl p 7, uma proteina de ligação ao cálcio de 6 kDa; Phl p 11, Ole e proteina relacionada de 20 kDa; Phl p 12, uma profilina de 14 kDa e Phl p 13, uma poligalacturonase de 55 kDa.

[0008] Phragmites é um género pertencente ao grupo das gramineas. Foram descritas várias espécies, incluindo P. australis ou P. communis. O pólen da Phragmites communis foi reportado como sendo alergénico em diferentes áreas. A polinização ocorre entre o verão e outono, dependendo da latitude e altitude. Foram identificadas cinco proteinas 4 distintas com capacidade de ligação à IgE no género Phragmites. Com base no sitio web da Allergome1, estes alergénios incluem: Uma expansina de 30 kDa; uma proteína pertencente ao grupo IV das gramíneas de 60 kDa; uma ribonuclease de 35 kDa, uma profilina de 14 kDa e, finalmente, uma poligalacturonase.

[0009] A ambrósias são ervas que crescem, maioritariamente, na Europa Central. Cada planta vive apenas durante uma estação e produz até mil grãos de pólen. O calor, humidade e brisa após o nascer do sol ajudam a libertar os grãos de pólen. Até o momento, foram identificadas três espécies distintas associadas a sintomas alérgicos (Amborsia artentisiifolia (ambrósia pequena), A. psilostachya (ambrósia ocidental) e A. tri fida (ambrósia gigante)) . Foram identificados dez tipos distintos de alergénios na ambrósia pequena, tendo muitos deles sido sequenciados e clonados. No caso da Amborsia artemisiifolia, estes são designados por Amb a 1 até Amb a 10, de acordo com a nomenclatura internacional dos alergénios. Com base no sítio web da UISI1, estes alergénios incluem: Amb a I, uma pectato-liase de 38 kDa; Amb a 2, uma pectato-liase de 38 kDa; Amb a 3, uma plastocianina de 11 kDa; Amb a 4, uma proteína do tipo defensina de 30 kDa; Amb a 5, de 5 kDa; Amb a 6, uma proteína de transferência lipídica de 10 kDa; Amb a 7; uma plastocianina de 12 kDa; Amb a 8; uma profilina de 14 kDa; Amb a 9; uma polcalcina de 10 kDa e Amb a 10, uma proteína do tipo polcalcina de 18 kDa. No caso da A. psilostachya, só foi descrito o alergénio Amb p 5 com função biológica desconhecida. Também só foi descrito um alergénio de 5 kDa na A. trifida. 5 [0010] As gramíneas podem ser divididas em grupos homólogos, de acordo com os extratos alergénicos classificados. A ambrósia foi selecionada como uma das lideres neste grupo de plantas. Por esse motivo, os resultados obtidos com este extrato de pólen poderão ser extrapolados para outras gramíneas.1 [0011] A alergia pode ser tratada através de uma série de métodos conhecidos, que incluem imunoterapia alergénica, imunoterapia específica (ITE) ou vacinação anti-alérgica específica, uma forma de imunoterapia para distúrbios alérgicos em que o doente é vacinado com doses progressivamente mais elevadas de um extrato de alergénio, com o objetivo de indução de uma tolerância imunológica. A imunoterapia com alergénios modula a resposta imunitária ao alergénio em vez de amenizar os sintomas induzidos por uma reação alérgica conseguindo, dessa forma, reduzir a necessidade medicamentosa e a gravidade dos sintomas, podendo até eliminar completamente a hipersensibilidade.

[0012] Apesar de existirem amplas evidências de que a imunoterapia com alergénios é o único meio, à parte do evitamento rigoroso do alergénio, de tratamento causal dos distúrbios alérgicos mediados pela IgE causados pela inalação de alergénios e picadas de insetos do grupo Hymenoptera, a imunoterapia com extratos alergénicos não é habitualmente utilizada para o tratamento de alergias alimentares. Apenas dois estudos recentes demonstraram uma eficácia clinica moderada da imunoterapia sublingual em indivíduos sensibilizados com avelãs e pêssegos, respetivamente. (3'4) 6 [0013] Em estudos anteriores, foi tentada uma indução de tolerância a dosagens reduzidas ao alimentar crianças com vestígios minúsculos de amendoim que, gradualmente, se tornavam maiores, de modo a fortalecer o sistema imunitário. (4'6) Apesar de os dados obtidos nos primeiros ensaios clínicos indicarem que a alergia ao amendoim pode ser minorada através de imunoterapia(7), atualmente não existe qualquer tratamento comprovado para prevenir ou curar reações alérgicas ao amendoim, restando como única opção eficaz para os indivíduos atópicos evitar alimentos que contenham ou estejam contaminados com amendoins inteiros, partículas ou óleos de amendoim, e ter acesso imediato a epinefrina autoinjetável.

[0014] Um dos riscos da imunoterapia é o de que a injeção de um alergénio a um doente sensibilizado poderá causar reações alérgicas graves ou anafilaxia. Desde a sua primeira utilização, no início do século 20, foram envidados diversos esforços no sentido do reforço da segurança e eficácia da imunoterapia com alergénios. Uma das abordagens é o emprego de vacinas com reduzido potencial alergénico, mas com manutenção da imunogenicidade.

[0015] As patentes US 5,770,698 e EP0662080 descrevem um processo para remoção de substâncias e outros materiais de baixo peso molecular, de modo a purificar o extrato alergénico e a aumentar o teor final de alergénio/proteína. Este processo consiste na disrupção de forças eletrostáticas, hidrofóbicas ou outras forças físicas em condições que permitam a separação de compostos não alergénicos das proteínas ativas a nível alergénico. O processo pode consistir num tratamento ácido moderado através da redução do 7 pH abaixo do ponto isoelétrico (pi) das proteínas de alergénio respetivas.

[0016] Uma das várias formas de reduzir o potencial alergénico consiste numa modificação química de extratos alergénicos nativos com aldeídos, sobretudo formaldeído e glutaraldeido, para produzir alergóides. Este tratamento com aldeídos conduz à obtenção de produtos de reação (principalmente polímeros), que tenham perdido parte do seu potencial alergénico (por exemplo, que apresentem uma redução de epítopos de células β reativas à IgE), reduzindo efeitos secundários de carácter alérgico. Em simultâneo, a imunogenicidade nativa do alergénio é conservada, devido a epítopos de células T inalterados. Esta via de modificação de alergénios foi selecionada por alguns fabricantes de vacinas no desenvolvimento de produtos disponíveis no mercado com base neste princípio. Em geral, há uma tendência para alargar a purificação de extratos alergénicos, com seleção criteriosa dos alergénios mais importantes e com relevância clínica.

[0017] As patentes EP1834649 e EP1834648 descrevem métodos de produção de extratos alergénicos, contudo, estes não permitem uma remoção suficiente de proteínas contaminantes de baixo peso molecular.

[0018] Há necessidade de melhorar a segurança e eficácia dos medicamentos para utilização imunoterapêutica em distúrbios alérgicos através da otimização do processo de purificação de alergénios, de modo a garantir a eliminação de proteínas contaminantes de baixo peso molecular e componentes tóxicos.

DEFINIÇÕES 8 [0025] "Alergénio" pode ser definido como uma molécula capaz de induzir uma resposta IgE e/ou uma reação alérgica de Tipo I. 0 termo "despigmentado" aqui utilizado pode ser definido como um extrato alergénico semi-purifiçado, obtido a partir de um extrato nativo por remoção de substâncias irrelevantes, incluindo quaisquer pigmentos absorvidos que este possa conter.

RESUMO DA INVENÇÃO

[0019] Os inventores desenvolveram um passo intermédio anterior à polimerização para melhorar adicionalmente o processo de polimerização e reduz o potencial alergénico de determinados extratos, tais como ácaros, pólenes, incluindo gramineas, ervas e árvores, alergénios epiteliais e alergénios alimentares, antes do tratamento com glutaraldeido.

[0020] É um objetivo da presente invenção fornecer um processo para preparação de extratos compreendendo alergénios e composições farmacêuticas e vacinas para o tratamento de alergia. É ainda um objetivo fornecer um extrato alergénico de máxima eficácia com capacidade reduzida de ligação à IgE mas que conserva a sua capacidade imunogénica.

[0021] De acordo com um primeiro aspeto da presente invenção é fornecido um processo para produção de um extrato alergénico compreendendo: a) colocar um material de base compreendendo um alergénio em contacto com um agente de extração liquida para 9 produzir uma mistura contendo lipidos dissolvidos em fase liquida e uma fase sólida que consiste em resíduo de material de base compreendendo alerqénios e proteínas. b) sujeitar a mistura a um primeiro passo de separação para isolar o resíduo do material de base, c) colocar o resíduo de material de base em contacto com um agente de extrato de alergénio para produzir uma mistura de alergénios dissolvidos em fase líquida, e uma fase sólida que consiste em resíduo não alergénico. d) sujeitar a mistura a um segundo passo de separação para isolar os alergénios dissolvidos em fase líquida, para produzir um extrato de alergénio em bruto, e) sujeitar um extrato de alergénio em bruto a um passo de remoção da fração de baixo peso molecular para remover moléculas com um tamanho molecular inferior a 3,5 kDa, e f) repetir o passo e) até o extrato de alergénio ter uma condutividade inferior a 1000 mS/cm a 3-5°C para obter um extrato alergénico nativo purificado. g) acidificar o extrato alergénico nativo, remover moléculas com um tamanho molecular inferior a 3,5 kDa e neutralizar o pH para produzir um extrato alergénico despigmentado.

[0022] O processo compreende ainda um passo de polimerização, compreendendo h) colocar um extrato alergénico despigmentado em contacto com glutaraldeido ou formaldeído, e i) remover moléculas com um tamanho molecular inferior a 100 kDa. 10 [0023] De acordo com um segundo aspeto da invenção, é fornecido um extrato alergénico despigmentado obtido seguindo o processo do primeiro aspeto da presente invenção.

[0024] De acordo com um terceiro aspeto da invenção, é fornecido um extrato alergénico purificado para uso como substância terapêutica ativa no tratamento de alergias.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0026] Os extratos alergénicos da invenção podem ser derivados de qualquer material de base compreendendo alergénios naturais conhecidos por desencadear uma resposta imune mediada por IgE num indivíduo. Tais alergénios podem incluir alergénios alimentares (e.g. amendoim), alergénios aéreos (e.g. pólen de gramíneas, árvores, ervas, ácaros do pó, fungos e bolores), alergénios de inseto (e.g. barata, pulga, veneno de abelha e de vespa) e alergénios epiteliais (pelo animal, e.g. pelo de gato e cão).

[0027] Alergénios de pólen de árvores, gramíneas e ervas derivam do grupo taxonómico (ordem) das Fagales (e.g. Alnus e Bétula), Lamiales (e.g. Olea e Plantago), Poales (e.g. Phleum pratense) , Asterales (e.g. Ambrósia and Artemísia), Cayophyllales (e.g. Chenopodium and Salsola), Rosales (e.g. Parietaria), Proteales (e.g. Platanus) etc. Os ácaros do pó pertencem à ordem Astigmata (e.g. Dermatophagoides e Euroglyphus). Alergénios aéreos derivados de bolores e fungos pertencem à ordem Pleosporales (e.g. Altennaria), Capnodiales (e.g. Cladosporium) etc. 11 [0028] O material de base de acordo com a presente invenção pode ser qualquer alerqénio, incluindo alerqénios alimentares, amendoins, amendoins inteiros, alerqénios aéreos (pólen (pólen de árvore, pólen de erva, pólen de gramíneas, pólen de cereal), ácaros do pó, fungos, bolores)), alergénios de ácaros, gramíneas, árvores e ervas, alergénios epiteliais (pelo animal, e.g. pelo de gato e pelo de cão) e alergénios de insetos (e.g. barata, pulgas, veneno de abelha e vespa).

[0029] Um alergénio alimentar preferido é o amendoim.

Mais preferivelmente o alergénio de amendoim é Arachis hipogeal.

[0030] Os alergénios aéreos podem ser selecionados a partir dos grupos de: pólen de árvore (Alnus glutinosa, Bétula alba, Corylus avellana, Cupressus arizonica, Olea europea, Platanus sp), pólen de gramíneas (Cynodon dactylon, Dactylis glomerata, Festuca elatior, Holcus lanatus, Lolium perenne, Phleum pratense, Phragmites communis, Poa pratensis), pólen de erva (Ambrósia elatior, Artemísia vulgaris, Chenopodium album, Parietaria judaica, Plantago lanceolata, Salsola kali) e pólen de cereal (Avena sativa, Hordeum vulgare, Secale cereal, Triticum aestivum, Zea mays), ácaros do pó (Acarus siro, Blomia tropicalis, Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides microceras, Dermatophagoidespteronyssinus, Euroglyphus maynei, lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae), fungos e bolores (Alternaria alternate,

Cladosporium herbarum. Aspergillusfumigatus).

[0031] Alergénios epiteliais podem ser selecionados de qualquer animal incluindo pelo de gato, pelo de cão, pelo de cavalo, pelo e cabelo humano, pelo de coelho e penas. 12 [0032] Alergénios de insetos podem ser selecionados de entre formiga, pulga, ácaros (Acarus siro, Blomia tropicalis, Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides microceras, Dermatophagoidespteronyssinus, Euroglyphus maynei, lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae), barata, veneno de vespa e de abelha.

[0033] Preferivelmente, o material de base é selecionado de entre alergénios alimentares (Arachis hypogeal), pólen (Alnus glutinosa, Bétula alba, Corylus avellana, Cupressus arizonica, Olea europea, Platanus sp, Cynodon dactylon, Dactylis glormerata,Festuca elatior, Holcus lanatus, Lolium perenne, Phleum pratense, Phragmites communis, Poa pratensis, Ambrósia elatior, Artemísia vulgaris, Chenopodium album, Parietaria judaica, Plantago lanceolata, Salsola kali, Avena sativa, Hordeum vulgare, Secale cereal, Triticum aestivum, Zea mays), ácaros de pó (Acarus siro, Blomia tropicalis, Dermatophagoides farinae, Dermatophagoides, microceras, Dermatophagoidespteronyssinus, Euroglyphus maynei, lepidoglyphus destructor, Tyrophagus putrescentiae), fungos e bolores (Alternaria alternate, Cladosporium herbarum, Aspergillusfumigatus), alergénios epiteliais (pelo de gato, pelo de cão, pelo de cavalo, cabelo e pelo humano, pelo de coelho e penas), alergénios de insetos (formiga, pulga, ácaros, barata, veneno de vespa e de abelha).

[0034] Mais preferivelmente, o material de base é selecionado de entre amendoim (Arachis hypogea), pólen (Olea europaea, Parietaria judaica, Phragmites communis e Phleum pratense), ácaros (Dermatophagoides pteronyssinus) e epitélio (pelo de gato) . 13 [0035] Numa modalidade preferida da invenção, o material de base é selecionado de entre Arachis hypogeal, Olea europaea, Parietaria judaica, Phleum pratense, Dermatophagoides pteronyssinus, Phragmites communis, Parietaria judaica e pelo de gato.

[0036] Numa modalidade ainda mais preferida da invenção, o material de base é selecionado de entre Arachis hypogea, Phleum pratense, Phragmites communis, Parietaria judaic e pelo de gato.

[0037] Numa modalidade mais preferida da invenção, o alergénio é Arachis hypogeal.

[0038] Quando o material de base é amendoim, as peles são preferencialmente removidas ou o material pode ser esmagado ou pulverizado. Os amendoins podem ser torrados, tostados, fritos ou crus.

[0039] 0 material de base pode ser tratado de modo a criar uma área de superfície máxima para contacto com o agente de extração de líquido. 0 material de base pode ser homogeneizado, misturado, esmagado ou pulverizado para produzir uma pasta homogénea para extração líquida. O passo de extração líquida é um passo de "desengorduramento" para remover compostos lipofílicos, tais como lípidos e ácidos gordos a partir do material de base.

[0040] 0 agente de extração líquida pode ser acetona, que pode estar fria. 0 passo de extração líquida pode ser realizado numa razão de 1:1 (peso do material de base/peso do 14 agente de extração líquida) ou qualquer razão em que o peso do agente de extração líquida exceda o peso do material de base, por exemplo 1:2, 1:3, 1:5, 1:10. O passo de extração líquida é preferivelmente realizado numa razão de lkg de material de base para 2L de agente de extração líquida. O passo de extração líquida é de preferência realizado por um período de tempo suficiente para os lípidos no material de base se dissolverem no agente de extração líquida, o que pode ser por mais de 1 minuto, de preferência mais de 5 minutos, mais preferivelmente mais de 30 minutos e o mais preferivelmente 1 hora ou mais. O passo de extração líquida pode ser realizado entre 20 e 25 °C, mas é preferivelmente realizado a frio entre 2-6 °C e mais preferivelmente entre 3-5 °C. Durante o passo de extração líquida, o material de base é de preferência misturado ou agitado com o agente de extração líquida.

[0041] O primeiro passo de separação pode ser filtração.

[0042] Após o primeiro passo de separação, o resíduo de material de base pode ser lavado com o agente de extração líquida. Opcionalmente, o resíduo de material de base pode ser ainda extraído com o agente de extração líquida, e depois separado. Preferivelmente, são realizados um, dois ou mais outros passos de extração líquida. A extração líquida do resíduo do material de base de preferência é continuada até o agente de extração líquida ficar transparente após contacto com o resíduo de material de base.

[0043] Após a extração líquida, o resíduo do material de base pode ser seco. 0 resíduo do material de base pode ser seco entre 2-25 °C, e é de preferência seco à temperatura 15 ambiente. 0 passo de secagem é, de preferência, prosseguido por um período suficiente para permitir a remoção do agente de extração líquida a partir do resíduo de material de base, que pode ser entre 1-24 horas, 6-18 horas, 10-14 horas e, preferivelmente, cerca de 12 horas.

[0044] Os alergénios podem ser obtidos a partir do resíduo de material de base "desengordurado" por extração com um agente de extrato alergénico para produzir um extrato alergénico em bruto compreendendo alergénios dissolvidos em fase líquida e uma fase sólida que consiste em resíduo não alergénico "indesejado". 0 agente de extrato alergénico pode ser uma solução aquosa e compreende, de preferência, um agente tampão. O agente de extrato alergénico pode compreender PBS e/ou NaCl, por exemplo uma solução de PBS 0,01 M/NaCl 0,15 M. 0 resíduo de material de base pode ser extraído no agente de extrato alergénico em qualquer razão em que o peso do agente de extrato alergénico exceda o peso do resíduo de material base, por exemplo 1:2, 1:3, 1:5, 1:10, 1:20, 1:50. Preferivelmente, o resíduo de material de base é extraido no agente de extrato alergénico numa razão de 1:10 de resíduo de material de base: agente de extrato alergénico (p/p). A razão de resíduo de material de base para agente de extrato alergénico no passo de extração pode variar mas deve ser tal que os alergénios no resíduo de material de base se possam dissolver no agente de extrato alergénico. A extração do residuo de material de base com o agente de extrato alergénico é, preferivelmente, realizada por um período suficiente para os alergénios no resíduo de material de base se dissolverem no agente de extração do alergénio, que pode ser entre 30 minutos a 12 horas, preferivelmente entre 1-6 16 horas, mais preferivelmente entre 2-5 horas, e mais preferivelmente por cerca de 4 horas. 0 passo de extração do alergénio pode ser realizado a 20-25 °C, mas é preferivelmente realizado a frio entre 2-6 °C e mais preferivelmente entre 3-5 °C. Durante o passo de extração do alergénio, o resíduo do material de base é de preferência misturado ou agitado com o agente de extração do alergénio.

[0045] Após o passo de extração de alergénio, os alergénios dissolvidos na fase líguida podem ser separados do resíduo não alergénico, para produzir um extrato de alergénio em bruto. O passo de separação é, de preferência, centrifugação, embora sejam aplicáveis muitas técnicas para separar sólidos de líquidos, sendo estas bem conhecidas do especialista. Preferivelmente, os alergénios dissolvidos em fase líguida são centrifugados entre 2-6 °C e, de preferência, entre 3-5 °C, por um período de tempo suficiente para sedimentar o resíduo não alergénico como um concentrado, por exemplo entre 1 minuto e 1 hora ou mais de 1 hora. 0 extrato de alergénio em bruto (i.e. o sobrenadante contendo os alergénios dissolvidos) pode ser armazenado entre 2-6 °C. 0 concentrado de resíduo não alergénico pode ser ainda extraído com o agente de extrato alergénico usando as mesmas condições do que o primeiro passo de extração de alergénio, e preferivelmente por um período de extração mais longo, por exemplo entre 4-8 horas, 8-12 horas ou mais de 12 horas. Após o segundo passo de extração de alergénio, os alergénios dissolvidos na fase líquida podem ser separados do resíduo não alergénico, para produzir um extrato de alergénio em bruto. Os extratos de alergénio em bruto do primeiro e segundo passos de extração de alergénio são preferivelmente agrupados para tratamento posterior. 17 [0046] O extrato de alergénio em bruto pode ser filtrado, por exemplo usando um tamanho de poro de 0,45 mm. 0 extrato de alergénio em bruto pode ser sujeito a um passo de remoção da fração de baixo peso molecular para remover moléculas com tamanho molecular reduzido, por exemplo, sais e outros compostos não alergénicos. 0 requerente determinou experimentalmente que a composição da proteína e do alergénio de extratos de amendoim é entre 8 e 150 kDa, e estes alergénios devem ser retidos durante os passos de remoção da fração molecular. Por exemplo, a Proteína de Transferência de Lípidos (LTP) - um alergénio importante - do amendoim tem 8kDa e deve ser retida durante o passo de remoção da fração de baixo peso molecular. No passo e) podem ser removidas moléculas com um tamanho molecular inferior a 8 kDa, 7 kDa, 6 kDa, 5 kDa, 4 kDa ou 3,5 kDa. 0 passo de remoção da fração de baixo peso molecular é, de preferência, prosseguido até a condutividade do extrato de alergénio a 3-5°C ser inferior a 900 mS/cm, ou inferior a 800 mS/cm, ou inferior a 700 mS/cm, ou inferior a 600 mS/cm, ou mais preferivelmente inferior a 500 mS/cm. O passo de remoção da fração de baixo molecular é, de preferência, continuado até a condutividade do extrato de alergénio a 3-5°C estar entre 200 e 1000 mS/cm ou entre 300 e 900 mS/cm e, mais preferivelmente, entre 400 e 800 mS/cm.

[0047] O extrato de alergénio nativo purificado resultante pode ser filtrado, por exemplo usando um tamanho de poro de 0,45 e/ou 0,22 mm.

[0048] O extrato de alergénio nativo pode ser usado na preparação de uma composição farmacêutica ou vacina para fins de padronização, diagnóstico, síntese e vacinação. 18 [0049] O processo pode ainda compreender um passo de tratamento adicional, no qual os compostos não alergénicos que aderem às proteínas de alergénio são removidos usando meios que afetam as forças eletroestáticas, hidrofóbicas ou outras forças físicas sendo responsáveis pela aderência dos compostos não alergénicos às proteínas. 0 meio para disrupção das forças eletrostáticas, hidrofóbicas ou outras forças físicas pode ser selecionado do grupo de meios químicos que consistem em materiais ácidos e alcalinos incluindo materiais de permuta aniónica e catiónica, sais e correntes elétricas. Os meios químicos ácidos e alcalinos podem ser usados numa quantidade que leve à ultrapassagem do ponto isoelétrico das proteínas. O extrato de alergénio resultante do passo adicional de tratamento é daqui por diante designado como extrato alergénico despigmentado.

[0050] 0 passo de tratamento adicional pode compreender g) acidificar o extrato alergénico nativo, remover moléculas com um tamanho molecular inferior a 3,5 kDa, e neutralizar o pH para produzir um extrato alergénico despigmentado.

[0051] 0 passo de tratamento adicional compreende de preferência um tratamento ácido moderado. No tratamento ácido moderado, o pH das proteínas do alergénio pode ser reduzido a menos de 3, por exemplo um valor de pH entre 2,0 e 2,5. 0 pH das proteínas do alergénio pode ser entre 2,0 e 6,0. O requerente identificou experimentalmente que o pH ótimo para separação dos compostos não alergénicos que aderem às proteínas do alergénio se situa entre 2,0 e 2,1. Um valor de pH inferior a 2,0 origina um perfil proteico incompleto do extrato alergénico despigmentado, e um pH insuficientemente 19 leva à eliminação reduzido, por exemplo acima de 3,0, incompleta dos compostos não alergénicos no extrato alergénico despigmentado resultante.

[0052] 0 pH do extrato alergénico nativo pode ser reduzido usando um ácido adequado, por exemplo HC1. 0 extrato acidificado pode ser mantido num pH baixo durante 1-60 minutos, de preferência 5-30 minutos, mais preferivelmente 10-20 minutos, e mais preferivelmente cerca de 15 minutos. Moléculas com um tamanho molecular inferior a 3,5 kDa podem ser removidas num passo de remoção da fração de peso molecular reduzido.

[0053] Após o passo de tratamento adicional, o extrato despigmentado resultante pode ser colhido, e o pH do extrato de alergénio pode ser neutralizado usando um alcali adequado, por exemplo NaOH. O pH pode ser ajustado para um valor no qual é evitada a precipitação das proteínas, por exemplo acima de 7,0, de preferência entre 7,0 e 8,0, mais preferivelmente entre 7,0 e 7,5, e mais preferivelmente entre 7,3 e 7,4.

[0054] O passo de tratamento adicional pode compreender: g) acidificar o extrato alergénico nativo até pH 2-2,1 e manter o extrato acidificado durante 5-30 minutos, depois sujeitar o extrato a um passo de remoção da fração de baixo peso molecular para remover moléculas com um tamanho molecular inferior a 3,5 kDa, e ajustar o pH para 7,3-7,4 para produzir um extrato alergénico despigmentado. 20 [0055] O passo de tratamento adicional pode compreender acidificar o extrato alergénico nativo para pH 2,0 a 4,0.

[0056] 0 meio para disrupção das forças eletrostáticas pode compreende correntes elétricas sob a forma de eletroforese. Os compostos não alergénicos podem ter um peso molecular inferior a 8.000 Da, 5.000 Da e preferivelmente inferior a 3.500, e podem compreender flavonoides e/ou seus glicósidos. O passo de remoção da fração de baixo peso molecular pode ser um passo de diálise, na qual o extrato é dialisado contra uma solução de diálise como água purificada ou um tampão. O passo de remoção da fração de baixo peso molecular pode ser realizado entre 20-25 °C, mas é preferivelmente realizado a frio entre 2-6 °C e mais preferivelmente entre 3-5 °C. O passo de remoção da fração de baixo peso molecular pode ser realizado durante 12-24 horas, em que o solvente ou, no caso da diálise, a solução de diálise, é regularmente trocada para manter a reação.

[0057] O extrato alergénico despigmentado resultante pode ser filtrado, por exemplo usando um tamanho de poro de 0,45 mm e/ou 0,22 mm, e pode ser congelado ou liofilizado para armazenamento.

[0058] Qualquer um dos extratos produzidos usando o processo da presente invenção é tratado adicionalmente. O processo compreende ainda um passo de polimerização, compreendendo: h) colocar um extrato alergénico despigmentado em contacto com um aldeído, e 21 i) remover moléculas com um tamanho molecular inferior a lOOkDa.

[0059] O aldeído é glutaraldeído ou formaldeído.

[0060] O passo de polimerização compreende: h) colocar um extrato alergénico nativo ou um extrato alergénico despigmentado em contacto com glutaraldeído ou formaldeído, i) sujeitar o extrato a um passo de remoção da fração de baixo peso molecular para remover moléculas com um tamanho molecular inferior a 100 kDa, e j) executar o passo i) até o extrato alergénico ter uma condutividade inferior a 210 mS/cm a 3-5°C e/ou ficar livre de glutaraldeído para obter um extrato alergénico polimerizado ou um extrato alergénico polimerizado despigmentado.

[0061] Quando o extrato para polimerização é liofilizado, pode ser reconstituído num tampão, por exemplo PBS 0,01M/Nacl 0,15M, até uma concentração final de 0,1-500 mg/ml, de preferência 1-100 mg/ml, e mais preferivelmente 10-50 mg/ml.

[0062] A reação de polimerização é de preferência realizada até à sua conclusão, para que bandas de proteína <100 kDa (e.g.14-25 kDa) não sejam detetáveis pela SDS-PAGE não redutora no extrato polimerizado. 0 requerente determinou experimentalmente (ver tabela 2) que dois parâmetros influenciam as condições ótimas para polimerização. 22 [0063] Em primeiro lugar, a concentração final de glutaraldeído é importante, na medida em que concentrações crescentes de glutaraldeído reduzem o rendimento do polímero e aumentam a produção de resíduo obtido por centrifugação antes da diálise. Em contraste com condições de polimerização previamente conhecidas que empregam uma concentração de glutaraldeído de cerca de 5 mg/ml (i.e. 0,009 ml de glutaraldeído por ml de extrato de alergénio), a concentração de glutaraldeído ótima foi experimentalmente determinada como sendo aproximadamente o dobro da quantidade conhecida, i.e. 10 mg/ml (0,02 ml de glutaraldeído por ml de extrato de alergénio) . O aldeído pode ser adicionado no intervalo de 1-20 mg/ml. Embora a utilização de quantidades anteriormente conhecidas de uma concentração final de glutaraldeído possa produzir alguma polimerização dos alergénios, é preferido que o aldeído seja adicionado numa concentração final de 10 mg/ml ou numa razão de 0,02 ml de glutaraldeído por ml de extrato para alcançar uma polimerização ótima.

[0064] Em segundo lugar, o requerente determinou que reduzir a taxa de adição de glutaraldeído reduz a produção de polímero e aumenta a produção de resíduo. O aldeído pode ser adicionado ao extrato a uma velocidade constante, por exemplo entre 0,001-0,5 ml por minuto (1-500 ml/min, 60-3000 ml/hora).

[0065] A reação de polimerização pode ser mantida entre 1-12 h, de preferência 7 horas, à temperatura ambiente. A reação de polimerização pode ser interrompida usando glicina numa proporção de 40 mg por ml de solução de extrato polimerizado. A reação parada pode ser mantida durante a noite a 3-5°C, de 23 preferência sob agitação. Os alergénios polimerizados na fase liquida podem ser separados do resíduo insolúvel para produzir um extrato alergénico polimerizado ou um extrato alergénico polimerizado despigmentado. 0 passo de separação é, de preferência, centrifugação, embora possam ser aplicáveis muitas técnicas de separação bem conhecidas do especialista.

Preferivelmente, o extrato é centrifugado entre 2-6°C e, de preferência, entre 3-5 °C, por um período de tempo suficiente para sedimentar o resíduo insolúvel como um concentrado, por exemplo entre 1 minuto e 1 hora ou mais de 1 hora. 0 sobrenadante (com os alergénios solúveis) pode ser colhido e sujeito ao passo de remoção da fração molecular (i).

[0066] No passo i) podem ser removidas moléculas com um tamanho molecular inferior a 150 kDa. Moléculas com um peso molecular superior a 3MDa revelaram precipitar e podem igualmente ser removidas durante o passo de polimerização.

[0067] De preferência, o passo de remoção da fração molecular é um passo de diálise, em que o extrato é dializado contra uma solução de diálise, como água purificada ou um tampão, a 3-5 °C. 0 passo de remoção da fração molecular pode prosseguir até a condutividade medida a 3-5°C ser inferior a 200 mS/cm, mais preferivelmente inferior a 175 mS/cm, mais preferivelmente inferior a 150 mS/cm, mais preferivelmente inferior a 125 mS/cm, mais preferivelmente inferior a 100 mS/cm, mais preferivelmente entre 50 e 200 mS/cm, e o mais preferível entre 100 e 150 mS/cm. 24 [0068] O extrato alergénico resultante pode ser filtrado, por exemplo, usando um tamanho de poro de 0,45 mm e/ou 0,22 mm, e pode ser congelado ou liofilizado para armazenamento.

[0069] Qualquer um dos passos de remoção da fração de baixo peso molecular c) , e) ou g) pode compreender um passo de ultrafiltração, um passo de diafiltração, um passo de diálise ou filtração.

[0070] Na sua forma mais simples, o processo da presente invenção pode compreender a preparação de um extrato de alergénio solúvel nativo, opcionalmente com tratamento adicional do extrato, por exemplo através de um tratamento ácido moderado, para remover compostos não alergénicos com um tamanho molecular reduzido e polimerização do extrato usando um aldeído. 0 extrato alergénico nativo solúvel pode ser um alergénio de amendoim, pólen, gramíneas, tecido epitelial, bolor, fungos, insetos ou ácaros. 0 processo da presente invenção produz um extrato alergénico que exibe uma capacidade de ligação à IgE reduzida, mas que conserva a sua capacidade imunogénica.

[0071] A presente invenção fornece adicionalmente um tratamento para as alergias e uma substância para diagnóstico de alergia, compreendendo ambos extratos de alergénio produzidos pelos processos da presente invenção, como princípio ativo. A alergia pode ser associada à exposição a vários alergénios que desencadeiam uma resposta imune mediada por IgE, conforme discutido acima. 25 [0072] De acordo com um segundo aspeto da presente invenção, é fornecido um extrato alergénico obtido seguindo o processo do primeiro aspeto da presente invenção. É fornecido um extrato alergénico purificado para uso como substância terapêutica ativa. É fornecido um extrato alergénico nativo, um extrato alergénico nativo polimerizado, um extrato alergénico nativo despigmentado, um extrato alergénico nativo polimerizado despigmentado obtidos seguindo o processo do primeiro aspeto da presente invenção. Preferivelmente, o extrato é um extrato alergénico nativo polimerizado e, mais preferivelmente um extrato alergénico polimerizado despigmentado.

[0073] 0 extrato alergénico pode ser selecionado de entre amendoim (Arachis hypogea) , pólen (Olea europaea, Parietaria judaica, Phragmites communis e Phleum pratense) , ácaros (Dermatophagoides pteronyssinus) e epitélio (pelo de gato).

[0074] 0 extrato alergénico pode destinar-se ao uso no tratamento de alergia. Numa modalidade preferida, o extrato alergénico Arachis hypogeal pode destinar-se à utilização no tratamento de alergia ao amendoim.

[0075] 0 extrato alergénico polimerizado despigmentado pode caracterizar-se pelas seguintes propriedades fisico-quimicas e biológicas: i. Solúvel em água, ii. Ausência de proteínas/alergénios não polimerizados com um peso molecular inferior a 100 kDa (identificados como bandas por SDS-PAGE em condições não redutoras) 26 iii. Ausência de bandas de reconhecimento de IgE com um peso molecular inferior a 100 kDa (identificadas por imunomarcação em condições não redutoras) iv. Ausência de moléculas polimerizadas com um peso molecular inferior a 100 kDa (determinado por cromatografia de exclusão por tamanho com HPLC) v. Redução de 75% dos grupos amino livres em relação ao extrato nativo (determinados pelo método fluram) vi. Redução da potência biológica (95%) em relação ao extrato nativo (determinado por experiências de inibição de ELISA de IgE usando um conjunto especifico de soros de indivíduos sensibilizados) e vii. Ausência de toxicidade anormal em ratos.

[0076] Os extratos de alergénio da presente invenção podem destinar-se à utilização como um componente ativo de um medicamento para o tratamento de um indivíduo alérgico, com o objetivo de induzir a tolerância a determinados alergénios.

[0077] É fornecido o uso de um extrato de alergénio de acordo com a presente invenção no diagnóstico de doenças imunológicas, preferivelmente para detetar doenças alérgicas. É apresentado o uso de um extrato alergénico de acordo com a presente invenção para o tratamento de alergia ou no fabrico de um medicamento para o tratamento da alergia. O uso pode ser para imunoterapia. O uso pode ser para fins de padronização, diagnóstico, síntese e vacinação. O uso pode ser para o tratamento terapêutico de doentes, de preferência em imunoterapia. O uso pode ser para monitorizar os doentes durante imunoterapia. 27 [0078] De acordo com um aspeto adicional da presente invenção, é fornecida uma composição farmacêutica compreendendo um extrato alergénico de acordo com a presente invenção. É fornecida uma composição farmacêutica para o tratamento de alergias que inclui como ingrediente ativo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um extrato alergénico de acordo com a presente invenção e pelo menos um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável. É fornecida uma composição de diagnóstico de alergia que compreende como principio ativo uma quantidade diagnosticamente eficaz de um extrato alergénico de acordo com a presente invenção.

[0079] De acordo com um aspeto adicional da presente invenção é fornecida uma vacina compreendendo um extrato alergénico de acordo com a presente invenção. A composição farmacêutica e a vacina podem ainda compreender um ou mais adjuvantes, diluentes, conservantes ou misturas destes. A composição farmacêutica ou a vacina podem compreender um veiculo fisiologicamente aceitável. Como aqui empregue, a expressão "farmaceuticamente aceitável" significa, de preferência, aprovado por uma entidade reguladora governamental ou listado na Farmacopeia europeia ou norte-americana ou outra farmacopeia geralmente reconhecida para uso humano.

[0080] Tais veículos farmaceuticamente aceitáveis podem ser líquidos estéreis, como água e óleos, incluindo os de origem fóssil, animal, vegetal ou sintéticos, por exemplo óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo ou similares. Podem igualmente ser empregues soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Excipientes farmacêuticos adequados incluem manitol, albumina 28 de soro humano (HSA), amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, gesso, silica-gel, carbonato de magnésio, estearato de magnésio, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado em pó, glicerol, propilenoglicol, água, etanol ou similares.

[0081] Segundo um aspeto adicional da presente invenção é fornecido um processo para produzir uma vacina de alergénio compreendendo formular um extrato alergénico de acordo com a presente invenção com um ou mais adjuvantes, diluentes, conservantes ou misturas destes.

[0082] É fornecida uma vacina obtida de acordo com o processo do aspeto adicional da presente invenção. A vacina pode ser para uso subcutâneo ou sublingual.

[0083] É apresentado o uso de uma vacina de acordo com a presente invenção para o tratamento de alergia ou no fabrico de um medicamento para o tratamento da alergia.

[0084] De acordo com um aspeto adicional da presente invenção, é fornecido um método de prevenção da sensibilização a um alergénio compreendendo o passo de: expor um indivíduo a uma quantidade eficaz de um extrato alergénico, a composição farmacêutica ou a vacina da presente invenção.

[0085] Segundo um aspeto adicional da presente invenção, é fornecido um método de tratamento de uma alergia num indivíduo sensibilizado, incluindo administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de um extrato alergénico, a composição 29 farmacêutica ou a vacina da presente invenção. 0 extrato alergénico, a composição farmacêutica ou a vacina podem ser administrados por via subcutânea ou sublingual e podem ser administrados em dose crescente ou constante.

[0086] 0 indivíduo pode ser um humano ou um animal, de preferência um humano.

Breve descrição das figuras [0087]

Figura 1: Resume o processo de produção de extratos alergénicos.

Figura 2: Análise HPLC do extrato alergénico nativo de amendoim. Padrão BioRad de gama estreita (faixa 1), extrato nativo (faixa 2) , precipitado (faixa 3) , fração 20 (faixa 4), fração 21 (faixa 5), fração 40 (faixa 6), fração 78 (faixa 7), fração 96 (faixa 8), fração 111 (faixa 9);

Figura 3: Análise HPLC do extrato alergénico de amendoim polimerizado despigmentado.

Figura 4: Análise HPLC do resíduo de poliextrato alergénico de amendoim polimerizado despigmentado. Padrão

BioRad de gama estreita (faixa 1), resíduo de extrato polimerizado despigmentado (faixa 2), precipitado (faixa 3), fração 21 (faixa 4), fração 51 (faixa 5), fração 74 (faixa 6), fração 75 (faixa 7), fração 120 (faixa 8);

Figura 5: Análise SDS-PAGE de 40 mg de extratos alergénicos de amendoim: STD (Padrão BioRad de gama estreita), faixas 1-4 sob condições redutoras, faixas 5-8

sob condições não redutoras, amendoim Sunativo 230209/LN 30 (faixa 1), amendoim despigmentado 230209/LD (faixa 2), amendoim despigmentado/polimerizado 030309/LP (faixa 3) , resíduo de amendoim despigmentado/polimerizado 030309/LP (faixa 4), amendoim nativo 230209/LN (faixa 5), amendoim despigmentado 230209/LD (faixa 6), amendoim despigmentado/polimerizado 030309/LP (faixa 7) e resíduo de amendoim despigmentado/polimerizado 030309/LP (faixa 8) ;

Figura 6: Análise de focagem isoelétrica (IEF) de 40 mg de extratos alergénicos de amendoim, marcadores IEF BioRad padrão, pi 4,45-9,6 (faixas 1 e 2)), amendoim nativo 230209/LN (faixa 3), amendoim despigmentado 230209/LD (faixa 4), amendoim despigmentado/polimerizado 030309/LP (faixa 5), resíduo de amendoim despigmentado/polimerizado 030309/LP (faixa 6) ;

Figura 7: Ensaios imunoenzimáticos de 40 mg de extratos alergénicos de amendoim sob condições redutoras (Figura 7a) e não redutoras (Figura 7b) , utilizando um conjunto de soros de dadores alérgicos ao amendoim (dil. 1/20) e oí-IgE-PO (120705, dil.1/500) onde, em cada figura: Amendoim nativo 230209/LN (faixa 1) , amendoim despigmentado 230209/LD (faixa 2) , amendoim despigmentado/polimerizado 030309/LP (faixa 3) , resíduo de amendoim despigmentado/polimerizado (faixa 4);

Figura 8: Ensaio imunoenzimático de inibição de extratos alergénicos de amendoim sob condições redutoras, utilizando um conjunto de soros de dadores alérgicos ao amendoim (dil. 1/20) e a-IgE-PO (120705, dil. 1/500), onde a faixa 1 é um controlo (apenas soro) e as faixas 2-4 utilizam o conjunto de soros com 800 mg de extrato alergénico de amendoim despigmentado/polimerizado, 400 mg de extrato (faixa 3) e 200 mg de extrato (faixa 4); 31

Figura 9: Ensaio ELISA com base na análise de inibição de IgE de extratos alergénicos de amendoim; [0088] A presente invenção é ilustrada pelos seguintes exemplos, que detalham processos para preparação, purificação, tratamento adicional e polimerização de extratos que contêm alergénios. Os métodos A-D escrutinam os processos utilizados na produção de extratos alergénicos e os exemplos 1-8 descrevem a caracterização experimental de extratos alergénicos despigmentados polimerizados ou despigmentados.

MÉTODOS A. Processo de desengorduramento de material alergénico em bruto [0089] O extrato desengordurado foi obtido através de vários métodos, em função da natureza do material em bruto. Os métodos para cada alergénio são definidos em cada um dos exemplos. Em geral, o material homogeneizado é desengordurado em acetona a 3-5°C e filtrado. Esta etapa é repetida até a acetona se tornar transparente. 0 material desengordurado é recuperado e seco, à temperatura ambiente, até que toda a acetona tenha sido removida. B. Preparação de extrato alergénico nativo.

[0090] 0 material seco desengordurado foi pesado e extraido em PBS 0,01 M/NaCl 0,15M, numa proporção de 1:10, durante 4 horas a 3-5°C, sob agitação magnética. O sobrenadante resultante foi recolhido e armazenado a 3-5°C e o pélete foi reconstituído em 0,01 M/NaCl 0,15M (1:10) e extraído, durante 32 a noite, a 3-5°, sob agitação magnética. A solução foi centrifugada durante 30 minutos a uma temperatura de 3-5°C, a 10.000 rpm, sendo o sobrenadante recolhido e misturado com a fração previamente obtida. O extrato combinado foi filtrado, em poros de 0,45 mm, e extensivamente filtrado em membradas de diálise (corte de 3 kDa) , até que a condutividade foi reduzida a menos de 1000 mS/cm. O extrato foi então esterilizado por filtração, em poros de 0,22 mm. C. Preparação do extrato alergénico despigmentado [0091] O extrato nativo em solução aquosa, mantido a 3-5°C, foi adicionalmente tratado através do processo que se segue. Sob agitação magnética, o pH da solução foi ajustado até 2-2,1, por adição de HC1 0,1M, e mantido sob as mesmas condições, durante 15 minutos. Em seguida, o extrato foi filtrado em membranas de diálise (corte de 3,5 kDa) com água purificada, durante 15 horas contra 10 volumes de água purificada a 3-5°C. A água purificada foi substituída 4 vezes durante este período. Após tratamento ácido moderado, o extrato foi recolhido e o pH ajustado a 7,3 -7,4, utilizado NaOH 0,1 M. Finalmente, o extrato foi esterilizado por filtração, até 0,22 mm, congelado e liofilizado. D. Preparação de extrato alergénico despigmentado polimerizado [0092] O extrato despigmentado liofilizado foi reconstituído em PBS 0,01 M/NaCl 0,15M até ser obtida uma concentração final de 15 mg/ml, sob agitação magnética, até a sua dissolução completa. O processo de polimerização consistiu na adição de glutaraldeído, utilizando 0,02 ml de glutaraldeído 33 por ml de extrato despigmentado. 0 glutaraldeído foi adicionado ao extrato despigmentado a uma velocidade constante (36 ml/hora) , com recurso a um injetor automático. A reação de polimerização foi mantida durante 7 horas, à temperatura ambiente. A reação foi parada através da adição de glicina, numa proporção de 4 0 mg de glicina por ml de solução. A reação foi mantida durante a noite, a 3-5°C, sob agitação magnética continua O pélete foi removido e o sobrenadante recolhido e extensivamente filtrado em membranas de diálise (corte de 100 kDa) com água purificada (16,67 ml de água por ml de extrato), sob refrigeração. O processo foi considerado terminado quando a condutividade foi reduzida a um valor inferior a 210 mS/cm e foi confirmada a ausência de glutaraldeído, através de varrimento de ultravioleta visível. Finalmente, a solução foi esterilizada por filtração, em poros de 0,22 mm, congelada e liofilizada.

[0093] O produto final consiste num extrato polimerizado e despigmentado liofilizado, armazenado a 4°C, em condições de liofilização.

CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÓGICA

Teor proteico [0094] 0 teor proteico dos extratos nativo, despigmentado, despigmentado/polimerizado e resíduo despigmentado/ polimerizado foi medido através do método Lowry-Biuret, de acordo com as instruções do fabricante. 34 [0095] Os resultados para um lote experimental, referente ao Exemplo 1, são apresentados na Tabela 1. Cromatografia por exclusão de tamanho (HPLC) [0096] Uma amostra liofilizada do extrato foi ressuspensa em água altamente purificada, até uma concentração final de lmg/ml e agitada durante 10-15 minutos. A amostra foi centrifugada durante 10 minutos a 13000 rpm e o sobrenadante foi transferido para um frasco, para injeção automática. A coluna usada para o ensaio HPLC foi uma PL-aquagel-OH 60 de 8 pm (PolymerLabs), previamente equilibrada com água, onde o fracionamento foi realizado em função de diferenças de tamanho. As amostras foram testadas com um caudal de 1 ml/min (consoante as recomendações do fabricante). Foram detetados sinais UV a 254 nm e 280 nm de forma a obter um cromatograma. As figuras 2-4 apresentam os resultados obtidos através da análise HPLC.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida com Dodecil Sulfato de Sódio [0097] A eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) foi utilizada para determinar o perfil proteina/antigénio dos extratos. As amostras foram testadas em géis SDS-PAGE com C a 2,67%, T-acrilamida a 15%, em condições nativas ou desnaturadas (a solução tampão contém β-mercaptoetanol, aquecido durante 10 minutos a 95°C). Foram carregados nos géis quarenta microgramas de material liofilizado de cada um dos extratos. Os marcadores de referência com pesos moleculares conhecidos (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EUA) foram testados no mesmo gel. Os géis foram corados com azul brilhante de Coomassie R-250 35 (BioRad Laboratories) . 0 perfil antigénico foi estudado com recurso a um digitalizador (Sharp JX-330; Sharp Eletronics Corp, Mahwah, NJ) e analisado na versão 4.00 da aplicação "Image Master 1-D Elite" (Pharmacia Biotech, Uppsala,

Suécia). A figura 5 apresenta um gel corado com azul brilhante de Coomassie, onde o extrato alergénico despigmentado/polimerizado, sob condições não redutoras (faixa 7), demonstra a ausência de proteínas/alergénios não polimerizados com um peso molecular inferior a 100 kDa.

Focagem isoelétrica [0098] A análise por focagem isoelétrica (IFE) foi utilizada para determinar o perfil proteína/antigénio dos extratos, em função do ponto isoelétrico das proteínas. As amostras foram testadas em géis de eletroforese de poliacrilamida, em condições nativas. Foram carregados nos géis quarenta microgramas de material liofilizado de cada um dos extratos. Os marcadores de referência com pontos isoelétricos conhecidos (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EUA) foram testados no mesmo gel. Os géis foram corados com azul brilhante de Coomassie R-250 (BioRad Laboratories) e o perfil antigénico foi estudado com recurso a um digitalizador (Sharp JX-330; Sharp Eletronics Corp, Mahwah, NJ) e analisado na versão 4.00 da aplicação Image Master 1-D Elite (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia). As faixas 3-6 da figura 6 apresentam os resultados para os extratos nativo (faixa 3), despigmentado (faixa 4), despigmentado/polimerizado (faixa 5) e resíduo despigmentado/polimerizado (faixa 6) .

Imunomarcação 36 [0099] As proteínas separadas por eletroforese foram transferidas para membranas P-Immobilon (Millipore, Bedford, MA) . Após a transferência, as membranas secaram, à temperatura ambiente, durante 4 horas. As membranas foram incubadas, durante a noite, com o conjunto de soros diluído em solução salina com Tween 2%, tamponada com fosfato 0,01 M. A ligação especifica à IgE foi detetada com recurso a IgE monoclonal anti-humana conjugada com peroxidase (Ingenasa, Madrid), durante 2 horas. O perfil alergénico foi estudado com recurso ao digitalizador Sharp JX-330 e analisado com a versão 4.00 da aplicação Image Master 1-D Elite. As faixas 1-4 da figura 7b apresentam os resultados para os extratos nativo (faixa 1), despigmentado (faixa 2), despigmentado/ polimerizado (faixa 3) e resíduo despigmentado/polimerizado (faixa 4), em condições não redutoras. O extrato alergénico despigmentado/polimerizado não apresenta bandas de reconhecimento de IgE abaixo de 100 kDa. Na figura 8, a inibição de IgE é observada com recurso à comparação de diluições de extratos alergénicos de amendoim polimerizados com conjuntos de soros de dadores alérgicos ao amendoim.

Inibição de IgE [0100] A atividade alergénica in vitro dos extratos (nativo, despigmentado e polimerizado) foi testada através de inibição ELISA, estabelecendo-se o ponto de inibição como 50% e utilizando o extrato nativo como referência. Revestiram-se placas plásticas de microtitulação (Immulon IV; Dynex Technologies, Chantilly, VA) com o extrato nativo (10 pg de proteína/ml), durante a noite. Foram realizadas diversas diluições a partir dos extratos nativo, despigmentado e polimerizado. Cada uma das diluições foi incubada com um 37 conjunto de soros, durante 2 horas, à temperatura ambiente. Em seguida, as diluições dos extratos foram transferidas para as placas revestidas com extrato nativo e incubadas ao longo de 2 horas. Após lavagem, foram adicionados 100 μΐ de peroxidase IgE anti-humana, deixando-se repousar durante 30 minutos, à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram desenvolvidas durante 30 minutos e interrompeu-se a reação com ácido sulfúrico (IN). A inibição de ligação à IgE com maior proporção foi observada com a utilização do extrato alergénico despigmentado/polimerizado (figura 9).

Inibição de IgG [0101] A atividade alergénica in vitro dos extratos (nativo, despigmentado e polimerizado) foi testada através de inibição ELISA, estabelecendo-se o ponto de inibição como 50% e utilizando o extrato nativo como referência. Revestiram-se placas de microtitulação de plástico (Immulon II; Dynex Technologies, Chantilly, VA) com o extrato nativo (10 pg de proteina/ml), durante a noite. Foram realizadas diversas diluições a partir dos extratos nativo, despigmentado e polimerizado. Cada uma das diluições foi incubada com um conjunto de soros, durante 2 horas, à temperatura ambiente. Em seguida, as diluições dos extratos foram transferidas para as placas revestidas com extrato nativo e incubadas ao longo de 2 horas. Após lavagem, foram adicionados 100 μΐ de peroxidase IgE anti-humana, deixando-se repousar durante 30 minutos, à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram desenvolvidas durante 30 minutos e interrompeu-se a reação com ácido sulfúrico (1 N).

Fluorescamina ("Fluram") 38 [0102] A determinação de grupos amina livres foi detetada nos extratos nativo, despigmentado e despigmentado-polimerizado. A polimerização reduz o número de grupos amina livres, uma vez que a ligação cruzada entre alergénios é mediada por este grupo reativo. Os extratos nativo e despigmentado foram preparados a 25 yg/ml e o despigmentado-polimerizado a 1000 pg/ml. Foi utilizado ácido aminocapróico 6 a 2-10 mg/ml como padrão. Foi adicionada solução de Evans a todas as amostras. Os grupos amina foram diluídos neste tampão. Em seguida, foi adicionado tampão de borato de sódio (0,2 M) a todas as amostras e homogeneizou-se. Por fim, foi adicionada à mistura fluorescamina previamente diluída em acetona e esta foi analisada num fluorímetro, com uma excitação de 390 nm e emissão de 480 nm.

Espectrofotometria ultravioleta de varredura visível [0103] Os extratos nativo, despigmentado e despigmentado-polimerizado são diluídos a 1 mg/ml em PBS 0,01M. Após diluição, as amostras são analisadas a λ entre 200 e 600 nm.

Potência biológica por HEP (Potência Equivalente à Histamina) [0104] A atividade biológica dos extratos (nativo e despigmentado) foi mensurada através de competição REINA. As placas plásticas de microtitulação foram revestidas com anti-IgE. Foi adicionado um conjunto de soros de indivíduos alérgicos às microplacas, seguida de incubação, por 30 minutos. As amostras e a referência interna (IHR) são previamente diluídas e incubadas com IHR marcado com peroxidase. Em seguida, as microplacas são lavadas, são 39 adicionadas as amostras incubadas e é realizada uma incubação, por 30 minutos. Finalmente, as microplacas são extensivamente lavadas e incubadas com cromogénio. As placas são lidas a 450 nm.

Toxicidade anormal em ratinhos [0105] Em conformidade com as recomendações da Farmacopeia Europeia, ratinhos fêmea (espécie NMRI) foram injetados com 1 ml de extratos de amendoim despigmentados e polimerizados, a concentrações de 0,1 mg/ml e 1 mg/ml. A administração foi realizada com recurso a injeções intraperitoneais. 0 período de observação teve a duração de 7 dias, após os quais não foram observadas variações significativas nos animais, quer ao nivel do peso como do comportamento.

CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÓGICA

Teor proteico [0094] 0 teor proteico dos extratos nativo, despigmentado, despigmentado/polimerizado e resíduo despigmentado/ polimerizado foi medido através do método Lowry-Biuret, de acordo com as instruções do fabricante.

[0095] Os resultados para um lote experimental, referente ao Exemplo 1, são apresentados na Tabela 1. Cromatografia por exclusão de tamanho (HPLC) [0096] Uma amostra liofilizada do extrato foi ressuspensa em água altamente purificada, até uma concentração final de lmg/ml e agitada durante 10-15 minutos. A amostra foi 40 centrifugada durante 10 minutos a 13000 rpm e o sobrenadante foi transferido para um frasco, para injeção automática. A coluna usada para o ensaio HPLC foi uma PL-aquagel-OH 60 de 8 pm (PolymerLabs), previamente equilibrada com água, onde o fracionamento foi realizado em função de diferenças de tamanho. As amostras foram testadas com um caudal de 1 ml/min (consoante as recomendações do fabricante). Foram detetados sinais UV a 254 nm e 280 nm de forma a obter um cromatograma. As figuras 2-4 apresentam os resultados obtidos através da análise HPLC.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida com Dodecil Sulfato de Sódio [0097] A eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) foi utilizada para determinar o perfil proteina/antigénio dos extratos. As amostras foram testadas em géis SDS-PAGE com C a 2,67%, T-acrilamida a 15%, em condições nativas ou desnaturadas (a solução tampão contém β-mercaptoetanol, aquecido durante 10 minutos a 95°C). Foram carregados nos géis quarenta microgramas de material liofilizado de cada um dos extratos. Os marcadores de referência com pesos moleculares conhecidos (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EUA) foram testados no mesmo gel. Os géis foram corados com azul brilhante de Coomassie R-250 (BioRad Laboratories). O perfil antigénico foi estudado com recurso a um digitalizador (Sharp JX-330; Sharp Eletronics Corp, Mahwah, NJ) e analisado na versão 4.00 da aplicação "Image Master 1-D Elite" (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia). A figura 5 apresenta um gel corado com azul brilhante de Coomassie, onde o extrato alergénico despigmentado/polimerizado, sob condições não redutoras 41 (faixa 7), demonstra a ausência de polimerizados com um peso molecular proteínas/alergénios inferior a 100 kDa. não 42

Focagem isoelétrica [0098] A análise por focagem isoelétrica (IFE) foi utilizada para determinar o perfil proteína/antigénio dos extratos, em função do ponto isoelétrico das proteínas. As amostras foram testadas em géis de eletroforese de poliacrilamida, em condições nativas. Foram carregados nos géis quarenta microgramas de material liofilizado de cada um dos extratos. Os marcadores de referência com pontos isoelétricos conhecidos (BioRad Laboratories, Hercules, CA, EUA) foram testados no mesmo gel. Os géis foram corados com azul brilhante de Coomassie R-250 (BioRad Laboratories) e o perfil antigénico foi estudado com recurso a um digitalizador (Sharp JX-330; Sharp Eletronics Corp, Mahwah, NJ) e analisado na versão 4.00 da aplicação Image Master 1-D Elite (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suécia). As faixas 3-6 da figura 6 apresentam os resultados para os extratos nativo (faixa 3), despigmentado (faixa 4), despigmentado/polimerizado (faixa 5) e resíduo despigmentado/polimerizado (faixa 6).

Imunomarcação [0099] As proteínas separadas por eletroforese foram transferidas para membranas P-Immobilon (Millipore, Bedford, MA) . Após a transferência, as membranas secaram, à temperatura ambiente, durante 4 horas. As membranas foram incubadas, durante a noite, com o conjunto de soros diluído em solução salina com Tween 2%, tamponada com fosfato 0,01 M. A ligação específica à IgE foi detetada com recurso a IgE monoclonal anti-humana conjugada com peroxidase (Ingenasa, Madrid), durante 2 horas. 0 perfil alergénico foi estudado com recurso ao digitalizador Sharp JX-330 e analisado com a 43 versão 4.00 da aplicação Image Master 1-D Elite. As faixas 1-4 da figura 7b apresentam os resultados para os extratos nativo (faixa 1), despigmentado (faixa 2), despigmentado/ polimerizado (faixa 3) e resíduo despigmentado/polimerizado (faixa 4), em condições não redutoras. O extrato alergénico despigmentado/polimerizado não apresenta bandas de reconhecimento de IgE abaixo de 100 kDa. Na figura 8, a inibição de IgE é observada com recurso à comparação de diluições de extratos alergénicos de amendoim polimerizados com conjuntos de soros de dadores alérgicos ao amendoim.

Inibição de IgE [0100] A atividade alergénica in vitro dos extratos (nativo, despigmentado e polimerizado) foi testada através de inibição ELISA, estabelecendo-se o ponto de inibição como 50% e utilizando o extrato nativo como referência. Revestiram-se placas plásticas de microtitulação (Immulon IV; Dynex Technologies, Chantilly, VA) com o extrato nativo (10 pg de proteína/ml), durante a noite. Foram realizadas diversas diluições a partir dos extratos nativo, despigmentado e polimerizado. Cada uma das diluições foi incubada com um conjunto de soros, durante 2 horas, à temperatura ambiente. Em seguida, as diluições dos extratos foram transferidas para as placas revestidas com extrato nativo e incubadas ao longo de 2 horas. Após lavagem, foram adicionados 100 μΐ de peroxidase IgE anti-humana, deixando-se repousar durante 30 minutos, à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram desenvolvidas durante 30 minutos e interrompeu-se a reação com ácido sulfúrico (IN). A inibição de ligação à IgE com maior proporção foi observada com a utilização do extrato alergénico despigmentado/polimerizado (figura 9). 44

Inibição de IqG [0101] A atividade alergénica in vitro dos extratos (nativo, despigmentado e polimerizado) foi testada através de inibição ELISA, estabelecendo-se o ponto de inibição como 50% e utilizando o extrato nativo como referência. Revestiram-se placas de microtitulação de plástico (Immulon II; Dynex Technologies, Chantilly, VA) com o extrato nativo (10 pg de proteina/ml) , durante a noite. Foram realizadas diversas diluições a partir dos extratos nativo, despigmentado e polimerizado. Cada uma das diluições foi incubada com um conjunto de soros, durante 2 horas, à temperatura ambiente. Em seguida, as diluições dos extratos foram transferidas para as placas revestidas com extrato nativo e incubadas ao longo de 2 horas. Após lavagem, foram adicionados 100 μΐ de peroxidase IgE anti-humana, deixando-se repousar durante 30 minutos, à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram desenvolvidas durante 30 minutos e interrompeu-se a reação com ácido sulfúrico (1 N).

Fluorescamina ("Fluram") [0102] A determinação de grupos amina livres foi detetada nos extratos nativo, despigmentado e despigmentado-polimerizado. A polimerização reduz o número de grupos amina livres, uma vez que a ligação cruzada entre alergénios é mediada por este grupo reativo. Os extratos nativo e despigmentado foram preparados a 25 pg/ml e o despigmentado-polimerizado a 1000 pg/ml. Foi utilizado ácido aminocapróico 6 a 2-10 mg/ml como padrão. Foi adicionada solução de Evans a todas as amostras. 45

Os grupos amina foram diluídos neste tampão. Em seguida, foi adicionado tampão de borato de sódio (0,2 M) a todas as amostras e homogeneizou-se. Por fim, foi adicionada à mistura fluorescamina previamente diluída em acetona e esta foi analisada num fluorímetro, com uma excitação de 390 nm e emissão de 480 nm.

Espectrofotometria ultravioleta de varredura visível [0103] Os extratos nativo, despigmentado e despigmentado-polimerizado são diluídos a 1 mg/ml em PBS 0,01M. Após diluição, as amostras são analisadas a λ entre 200 e 600 nm.

Potência biológica por HEP (Potência Equivalente à Histamina) [0104] A atividade biológica dos extratos (nativo e despigmentado) foi mensurada através de competição REINA. As placas plásticas de microtitulação foram revestidas com anti-IgE. Foi adicionado um conjunto de soros de indivíduos alérgicos às microplacas, seguida de incubação, por 30 minutos. As amostras e a referência interna (IHR) são previamente diluídas e incubadas com IHR marcado com peroxidase. Em seguida, as microplacas são lavadas, são adicionadas as amostras incubadas e é realizada uma incubação, por 30 minutos Finalmente, as microplacas são extensivamente lavadas e incubadas com cromogénio. As placas são lidas a 450 nm.

Toxicidade anormal em ratinhos [0105] Em conformidade com as recomendações da Farmacopeia Europeia, ratinhos fêmea (espécie NMRI) foram injetados com 1 46 ml de extratos de amendoim despigmentados e polimerizados, a concentrações de 0,1 mg/ml e 1 mg/ml. A administração foi realizada com recurso a injeções intraperitoneais. 0 período de observação teve a duração de 7 dias, após os quais não foram observadas variações significativas nos animais, quer ao nível do peso como do comportamento.

EXEMPLOS

Exemplo 1 - Extrato Alergénico de Amendoim

Passo A. Processo de desengorduramento de amendoim em bruto [0106] Amendoins descascados foram homogeneizados num misturador para obter uma pasta homogénea. 0 material homogeneizado foi desengordurado com acetona a frio numa proporção de lkg de pasta: 2L acetona durante 1 hora a 3-5°C sob agitação magnética contínua para extrair lípidos, ácidos gordos e flavonóides livres. A solução resultante foi filtrada num funil de Buchner. A acetona foi removida e o extrato foi colhido num filtro e lavado duas vezes com acetona fresca. Todo o processo foi repetido mais duas vezes até a acetona colhida ficar transparente. Depois de terminado o processo, o extrato de amendoim desengordurado foi colhido e seco à temperatura ambiente numa câmara de fluxo laminar durante 12 horas, até o material estar totalmente seco e toda a acetona ter sido removida. amendoim polimerizado com os passos B-D do [0107] O extrato alergénico de despigmentado foi obtido de acordo método. 47

Caracterização de extratos alergénicos de amendoim [0108] 0 produto extrato alergénico de amendoim polimerizado despigmentado deverá cumprir as seguintes especificações: a. Produto solúvel em água b. Isento de proteínas/alergénios não polimerizados com um peso molecular inferior a 100 kDa (identificados como bandas por SDS-PAGE em condições não redutoras) c. Isento de bandas de reconhecimento de IgE com um peso molecular inferior a 100 kDa (identificadas por imunomarcação em condições não redutoras) d. Isento de moléculas polimerizadas com peso molecular inferior a 100 kDa (determinado por cromatografia de exclusão de tamanho com HPLC) e. Redução dos grupos amino livres (75%) em relação ao extrato nativo (determinado pelo método fluram) f. Redução da potência biológica (95%) em relação ao extrato nativo (determinado por experiências de inibição de ELISA de IgE usando um conjunto especifico de soros de indivíduos sensibilizados) g. Ausência de toxicidade anormal em ratos [0109] O pélete compreendendo resíduo despigmentado/ polimerizado foi utilizado como controlo na caracterização dos extratos nativos, despigmentados e despigmentados/ polimerizados (consultar as Tabelas 1 e 2). 48

Tabela 1. Resumo dos resultados obtidos com um lote experimental.

Amendoim Lote Rendi mento ELISA inib. (IgE) μρ 50% inib. (perda de potência em %) ELISA inib. (igG) μρ 50% de inib. (perda de potênci a em %) Lowry- Biuret μg prot./m g liofil. Lowry- Biuret μg prot./mg liofil. uv- Visível 1 mg/ml Nativo 230209/ LN 5, 95% 0, 041 0,021 419, 6 65, 1 1,326 (264nm) Despigme ntado 230209/ LD 85,3% 0, 153 0, 144 372,7 66, 9 1,356 (260nm) Despigme ntado e polimeri zado 030309/ LP 9, 08% 1,336 (96,9%) 0,699 348,3 6,45 (90%) 2,591 (260nm) Despigme ntado e polimeri zado (resíduo ) 030309/ LP 46,3% 1,405 (97,1%) 0,627 234,6 2,82 (95,7%) 0,192 (260nm)

Exemplo 2 - Extrato Alergénico de Ambrósia (Ambrósia artemisiifolia)

Passo A. Processo de desengorduramento de material alergénico em bruto 49 [0110] O pólen de Ambrósia colhido da planta após a polinização foi desengordurado com acetona fria e numa proporção 1:4 (p/v) sob agitação magnética continua durante 3 horas a 3-5°C. A solução resultante foi filtrada num funil de Buchner e lavada pelo menos três vezes com acetona fresca.A solução resultante foi filtrada num funil de Buchner e lavada pelo menos três vezes com acetona fresca. ++Depois de terminado o processo, o extrato desengordurado foi colhido e seco à temperatura ambiente numa câmara de fluxo laminar durante 12 horas, até o material estar totalmente seco e toda a acetona ter sido removida.

[0111] Ambrósia polimerizada despigmentada (Ambrósia artemisii folia) foi obtida de acordo com os passos B-D do método. 0 pH da solução é ajustado para 4-4,1 pela adição de HC1 a 0,1 M no passo 3.

[0112] 0 produto final consiste num extrato de ambrósia polimerizado e despigmentado liofilizado, armazenado a 4°C, em condições de liofilização. 0 produto resultante tem de cumprir as especificações seguintes: a. Produto solúvel em água b. Isento de proteinas/alergénios não polimerizados com um peso molecular inferior a 100 kDa (identificados como bandas por SDS-PAGE em condições não redutoras) c. Isento de bandas de reconhecimento de IgE com um peso molecular inferior a 100 kDa (identificadas por imunomarcação em condições não redutoras) 50 d. Isento de moléculas polimerizadas com peso molecular inferior a 100 kDa (determinado por cromatografia de exclusão de tamanho com HPLC) e. Redução dos grupos amino livres (75%) em relação ao extrato nativo (determinado pelo método fluram) f. Redução significativa da potência biológica em relação ao extrato nativo (determinado por experiências de inibição de ELISA de IgE usando um conjunto especifico de soros de indivíduos sensibilizados) g. Deteção dos principais anticorpos monoclonais anti-Amb a 1 h. Ausência de toxicidade anormal em ratos Teor do alergénio principal [0113] O teor de alergénio principal Amb a 1 é determinado usando o kit Indoor Biotech (INDOOR Biotechnologies Inc. Charlottesville, Virgínia, USA) . O anticorpo IgG policlonal anti-Amb a 1 é revestido (1:1000 do frasco preparado a 1 mg/ml). A curva padrão é preparada usando um extrato de ambrósia quantificado e padronizado de acordo com a FDA dos EUA (referência de imunodifusão radial para Amb a 1, C14-RAS que contém 30 U de Amb a 1/ml) com uma atividade de 2,5 U/ml de Amb a 1. O anticorpo secundário consiste num anticorpo biotinilado de IgG policlonal de coelho que se desenvolve contra o alergénio de ambrósia curto. Amostras nativas e despigmentadas são diluídas a 500 ng/ml. O teor do alergénio principal é calculado em extratos polimerizados usando estes valores.

[0114] O pélete compreendendo resíduo despigmentado/ polimerizado foi utilizado como controlo na caracterização 51 dos extratos nativos, despigmentados e despigmentados/ polimerizados (consultar as Tabelas 3a e 3b).

Tabela 3a - Resumo dos resultados obtidos para o Exemplo 2 (Ambrósia, Ambrósia artemisiifolia)

Ambrósia Rendi mento (%) ELISA inib. (IgE) 50% de inibição ^g) (perda de potência em %) Teor de proteína μg prot./mg Fluram μg ACA/mg (% grupo de amino redução ) UV-visível 1 mg/mL Absorvância (nm) Amb a 1 U/mg liof. Nativo 12,36 0,022 201 62,3 1,102 (272nm) 61,3 Despigmen tado 77,4 0, 011 288 82,4 0,766 (274nm) 69,2 Polimeriz ado despigmen tado (0,009) 81,7 0, 104 332 4, 04 (93,5%) 1, 665 (268nm) N/A Polimeriz ado despigmen tado (0,013) 72,5 0,120 359 4, 06 (93,5%) 1, 687 (268nm) N/A Polimeriz ado despigmen tado (0,02) 70, 13 0,182 210 6,3 (89,9%) 1, 610 (268nm) N/A Polimeriz ado despigmen tado (0,018) 68,3 0,141 274 3, 8 (93,8%) 1,502 (268nm) N/A 52

Tabela 3b - Resumo dos resultados obtidos para o Exemplo 2 (Ambrósia, Ambrósia artemisiifolia)

Ambrósia SDS-PAGE (kDa) Imunomarcaçã o (kDa) Tamanho molecular (kDa) Nativo 10-100 10-100 10-100 Despigmentado 10-100 10-100 10-100 Despigmentado-polimerizado (0,009) >100 Ausente >100 Despigmentado-polimerizado (0,013) >100 Ausente >100 Despigmentado-polimerizado (0,02) >100 Ausente >100 Despigmentado-polimerizado (0,018) >100 Ausente >100

Exemplo 3 - Extrato Alergénico de Pólen (Olea euopaea) [0115] Pólen de Olea europaea colhido da árvore após polinização foi desengordurado com acetona fria numa proporção 1:4 (p/v ) sob agitação continua durante 3 horas a 3-5°C. A solução resultante foi filtrada num funil de Buchner e lavada pelo menos três vezes com acetona fresca. Depois de terminado o processo, o extrato desengordurado foi colhido e seco a temperatura ambiente numa câmara de fluxo laminar durante 12 horas, até o material estar totalmente seco e toda a acetona ter sido removida. 0 extrato de alergénio de pólen despigmentado foi obtido de acordo com o passo B-C do método 53 [0116] O produto final consiste num extrato despigmentado liofilizado, armazenado a 4°C, em condições de liofilização. 0 produto resultante tem de cumprir as especificações seguintes: a. Produto solúvel em água

b. Perfil de proteína similar ao do extrato nativo, determinado por SDS-PAGE e 2-D c. Perfil alergénico similar ao do extrato nativo, determinado por imunomarcação d. Teor proteico similar ao do extrato nativo e. Teor alergénico principal similar ao extrato nativo f. Atividade biológica similar à do extrato nativo

Tabela 4 - Resumo dos resultados obtidos para o Exemplo 3 (Olea euopaea)

Olea europaena Rendi mento (%) ELISA inib. μ (igE)μ 50% inib. Teor proteico μg prot/mg. UV-visível Img/ml Potência HEPL/mg Nativo 3, 64 0, 009 321, 6 1,577 (270nm) 257,2 Despigment ado pH2 74, 0 0, 009 307, 4 1,302 - 274 (nm) 196, 8 Despigment ado pH3 62, 0 0, 007 324,2 1,365 (27 4nm) 204, 8 Despigment ado pH4 70, 7 0, 008 368, 7 1,291 (274nm) 221, 3 Despigment ado pH5 78,2 0, 009 348, 8 1,374 (274nm) 257, 7 Despigment ado pH6 80,2 0, 010 402,1 1,348 (27 4nm) 247, 0 54

Exemplo 4 - Extrato Alergénico de Pólen (Parietaria judaica) [0117] O pólen de Parietaria judaica colhido da planta após polinização foi desengordurado com acetona fria numa proporção 1:4 (p/v) sob agitação continua durante 3 horas a 3-5°C. A solução resultante foi filtrada num funil de Buchner e lavada pelo menos três vezes com acetona fresca. Depois de terminado o processo, o extrato desengordurado foi colhido e seco à temperatura ambiente numa câmara de fluxo laminar durante 12 horas, até o material estar totalmente seco e toda a acetona ter sido removida.

[0118] 0 extrato alergénico de pólen despigmentado foi obtido de acordo com o passo B do método.

[0119] 0 produto final consiste num extrato despigmentado liofilizado, armazenado a 4°C, em condições de liofilização. O produto resultante tem de cumprir as especificações seguintes: a. Produto solúvel em água

b. Perfil de proteína similar ao do extrato nativo, determinado por SDS-PAGE e 2-D c. Perfil alergénico similar ao do extrato nativo, determinado por imunomarcação d. Teor proteico similar ao do extrato nativo e. Teor alergénico principal similar ao extrato nativo f. Atividade biológica similar à do extrato nativo 55

Tabela 5

Resumo dos resultados obtidos para o Exemplo 5 (Parietaria judaica)

Parietar ia judaica Rend imen to (%) ELISA inib. (Ig E) \lg 50% inib. Lowry-Biuret mg prot. / μg UV-visivel 1 mg/ml Potência HEPL/mg Nativo 4, 07 0, 031 219, 7 3,073 (266nm) 1, 492 (342nm) 281 Despigme ntado pH2 82, 7 0, 018 197,9 2, 680 (270nm) 1, 393(342nm) 397 Despigme ntado pH3 79,5 0, 015 228, 6 2, 943 (27 Onm) 1,519 (34 6nm) 430 Despigme ntado pH4 83, 5 0, 017 213, 5 2, 769 (27Onm) 1, 463 (348nm) 534 Despigme ntado pH5 79, 9 0, 012 245, 4 2, 658 (272nm) 1, 504 (344nm) 1007 Despigme ntado pH6 87,3 0, 001 216,2 2, 763 (27Onm) 1,539 (344nm) 954

Exemplo 5 - Extrato Alergénico de Acaro (Dermatophagoides pteronyssinus) 0 extrato alergénico de ácaros foi obtido seguindo o passo B do método a partir de cultura plenamente desenvolvida de Dermatophagoides pteronyssinus.

[0120] 0 produto final consiste num extrato despigmentado liofilizado, armazenado a 4°C, em condições de liofilização. 56 0 produto resultante tem de cumprir as especificações seguintes: a. Produto solúvel em água

b. Perfil de proteína similar ao do extrato nativo, determinado por SDS-PAGE e 2-D c. Perfil alergénico similar ao do extrato nativo, determinado por imunomarcação d. Teor proteico similar ao do extrato nativo e. Teor alergénico principal similar ao extrato nativo f. Atividade biológica similar à do extrato nativo

Teor do alergénio principal [0121] 0 teor do alergénio principal (Der p 1 e Der p 2) é determinado usando os kits Indoor Biotech em D. pteronyssinus. Anticorpos IgG monoclonais anti Der p 1 e/ou anti Der p 2 são revestidos (1 :1000 a partir do frasco preparado a 1 mg/ml para Der p 1 e 2 mg/ml para Der p 2) em poços de microtitulação de poliestireno (NUNC Maxisorp). A curva padrão é preparada usando um padrão universal quantificado e padronizado (sub-padronizado segundo a referência UISI da OMS de D. pteronyssinus contendo 2500 ng/ml de Der p 1 e 1000 ng/ml de Der p 2) : As diluições da curva de controlo são de 250-0,49 ng/ml para Der p 1 e 100-0,2 ng/ml para Der p 2. As amostras de ácaros são habitualmente diluídas duas vezes. Após lavagem da placa, 100 ml de padrão de alergénio e amostras diluídos são adicionados e incubados durante 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem da placa, 100 ml de anticorpo secundário (anticorpo biotinilado de IgG policlonal) diluídos 1/1000 são adicionados e incubados durante 1 hora à temperatura 57 ambiente. Após lavagem da placa, 100 ml de Estreptavidina-Peroxidase diluídos 1/1000 são adicionados e incubados durante 30 minutos à temperatura ambiente. Finalmente, a placa é lavada, desenvolvida adicionando 100 ml de ABTS lmM em tampão citrato-fosfato 70mM, pH 4,2 contendo uma diluição 1/1000 de H2O2 a 30% (i.e. lOml/lOml ABTS) e lida quando a densidade ótica a 405nm atinge 2,0-2,4.

Tabela 6 - Resumo dos resultados obtidos para o Exemplo 5 (Dermatophagoides pteronyssinus)

Dermato phagoid es pterony ssinus Rendim ento (%) ELISA inib. ( IgE) mg 50% inib. Lowry Bi ure t mg prot. /mg UV/visiv ei 1 mg /ml Potên cia HEP- L/mg mgDerp 1/mg liofil izado mgDerp 2 /mg liofil izado Nativo 4,59 0,161 251, 7 1, 909 (27 6nm) 327 8, 49 7, 98 Despigm entado pH2 34, 7 0,268 238,1 1, 851 (27 6nm) 339 0,37 14, 62 Despigm entado pH2 53, 7 0,136 257, 8 2, 057 (27 6nm) 555 8, 96 12,18 Despigm entado pH2 67, 6 0,110 271, 4 2,188 (27 6nm) 873 13, 32 10, 92 Despigm entado pH2 79,1 0,127 265,5 2,122 (27 6nm) 1221 14,10 8, 40 Despigm entado pH2 81,1 0,116 30 7, 9 2,133 (276nm) 1705 13,20 8, 55 58

Exemplo 6 Extrato alergénico de ambrósia (Phragmites communis) [0122] 0 pólen de Phragmites communis colhido da planta após a polinização é desengordurado com acetona fria numa proporção 1:4 (p/v) sob agitação continua durante 3 horas a 3-5°C. A solução resultante foi filtrada num funil de Buchner e lavada pelo menos três vezes com acetona fresca. Depois de terminado o processo, o extrato desengordurado foi colhido e seco à temperatura ambiente numa câmara de fluxo laminar durante 12 horas, até o material estar totalmente seco e toda a acetona ter sido removida.

[0123] 0 extrato alergénico de Phragmites polimerizado despigmentado foi obtido de acordo com os passos B-D do método. No passo D o processo de polimerização consiste na adição de glutaraldeido usando um fator de 0,015 ml de glutaraldeído/ml de extrato.

[0124] O produto final é composto por um extrato de Phragmites polimerizado e despigmentado liofilizado, armazenado a 4°C, em condições de liofilização. O produto resultante tem de cumprir as especificações seguintes: a. Produto solúvel em água b. Isento de proteínas/alergénios não polimerizados com um peso molecular inferior a 100 kDa (identificados como bandas por SDS-PAGE em condições não redutoras) c. Isento de bandas de reconhecimento de IgE com um peso molecular inferior a 100 kDa (identificadas por imunomarcação em condições não redutoras) 59 d. Isento de moléculas polimerizadas com peso molecular inferior a 100 kDa (determinado por cromatografia de exclusão de tamanho com HPLC) e. Redução dos grupos amino livres (75%) em relação ao extrato nativo (determinado pelo método fluram) f. Redução significativa da potência biológica em relação ao extrato nativo (determinado por experiências de inibição de ELISA de IgE usando um conjunto especifico de soros de indivíduos sensibilizados) g. Ausência de toxicidade anormal em ratos [0114] 0 granulado/concentrado compreendendo resíduo despigmentado/ polimerizado foi utilizado como controlo na caracterização dos extratos nativos, despigmentados e despigmentados/polimerizados (consultar as Tabelas 7a e 3b). 60

Tabela 7a

Resumo dos resultados obtidos para o Exemplo 6 (Phragmites communis)

Phragmi tes communi s Rendimen to (concent rado) ELISA inib.(IgE) 50% de inibição (μρ) (perda de potência em %) Teor proteico μρ prot./mg Fluram μρ ACA/mg (% de redução grupo amino) Absorvân cia UV-visível 1 mg/ml (nm) Nativo 0, 486 240,7 145 1,074 (272nm) Despigm entado 0, 847 321,5 103 0,844 (274nm) Despigm entado polimer izado (0,009) 80, 7 (2,74) 2, 051 329, 8 3,6 (95,7) 1,891 (2 6 6nm) Despigm entado polimer izado (0,0045 ) 80, 7 (3,1) 1,217 381,4 6,3 (95,7) 1,897 (268nm) Despigm entado polimer izado (0,015) 64, 8 (4,75) 5, 080 306,2 1,6 (98,9) 2,206 (268nm) Despigm entado polimer izado (0,02) 25, 2 (2,5) 5, 035 306,1 24, 3 (83,2) 1,749 (2 6 6nm) 61

Tabela 7b

Resumo dos resultados obtidos para o Exemplo 6 (Phragmites communis)

Phragmites communis SDS-PAGE (kDa) Imunomarcação (kDa) Tamanho molecular (kDa) Nativo 10-100 10-100 10-100 Despigmentado 10-100 10-100 10-100 Despigmentado- polimerizado (0,009) >100 Ausente >100 Despigmentado- polimerizado (0,0045) >100 Ausente >100 Despigmentado- polimerizado (0,015) >100 Ausente >100 Despigmentado-polimerizado (0,02) >100 Ausente >100

Exemplo 7 Extrato alergénico de epitélio de gato [0126] 0 pelo de gato foi desengordurado com acetona fria numa proporção de 1:40 (p/v) após cinco minutos, agitando a cada hora durante 7 horas a 3-5°C. O desengorduramento prosseguiu durante pelo menos 16 horas sem agitação. A solução resultante foi filtrada num funil de Buchner e os flocos foram conservados. O pelo de gato foi novamente desengordurado com a mesma acetona durante 1 hora à temperatura ambiente e o processo foi repetido duas vezes. Os flocos obtidos foram colhidos e secos à temperatura ambiente numa câmara de fluxo laminar durante 15 horas, até o material estar totalmente seco e toda a acetona ter sido removida. 62 [0127] No passo B, o material de flocos de pele desengordurado seco obtido a partir de pelo de gato é pesado e extraído em PBS 0,01 M/NaCl 0,15M numa proporção 1:40 durante 4 horas a 3-5°C e sob agitação magnética. O extrato alergénico de gato polimerizado despigmentado foi obtido de acordo com os passos B-D do método.

[0128] 0 produto final consiste num extrato de epitélio de gato polimerizado e despigmentado liofilizado, para ser armazenado a 4°C em condições de liofilização. 0 produto resultante tem de cumprir as especificações seguintes: a. Produto solúvel em água b. Redução dos grupos amino livres (75%) em relação ao extrato nativo (determinado pelo método fluram) c. Redução significativa da potência biológica em relação ao extrato nativo (determinado por testes de competição de REINA de IgE usando um conjunto específico de soros de indivíduos sensibilizados) d. Deteção dos principais anticorpos monoclonais ao alergénio Fel d 1. g. Ausência de toxicidade anormal em ratos Teor do alergénio principal [0129] O teor do alergénio principal Fel d 1 é determinado usando o kit Indoor Biotech. 0 anticorpo IgGl monoclonal anti-Amb a 1 é revestido (1:1000 do frasco preparado a 1 mg/ml). A curva padrão é preparada usando um padrão de alergénio universal que contémlOOO ng Fel d 1 /ml. O anticorpo secundário consiste num anticorpo IgGl monoclonal biotinilado desenvolvido contra alergénio de epitélio de 63 gato. Amostras nativas e despigmentadas são diluídas a 250 ng/ml. 0 teor do alergénio principal é calculado em extratos polimerizados usando estes valores.

[0130] 0 pélete compreendendo resíduo despigmentado/ polimerizado foi utilizado como controlo na caracterização dos extratos nativos, despigmentados e despigmentados/ polimerizados (consultar a Tabela 8).

Tabela 8 - Resumo dos resultados obtidos para o Exemplo 7 (Epitélio de gato/

Epitélio de gato Rend imen to (%) ELISA inib.(IgE) 50% de inibição (mg) (perda de potência em %) Teor prote ico mg prot. /mg Fluram mg ACA/mg (% de reduçã o grupo amino) Absorvân cia UV-visível 1 mg/ml (nm) Pot ênc ia (HE PL/ mg) Fel d 1 mg/ml Nativo 10,3 0, 029 154 14 0,396 (280nm) 1488 42 Despigment ado 85, 9 0, 044 195 10,4 0,428 (280nm) 1478 42 Despigment ado polimeriza do (0,009) 96,2 0,192 171 1,5 (89%) 0,701 (268nm) 28 8 Despigment ado polimeriza do (0,013) 92,9 0,373 183 1,3(90, 6%) 0, 698 (268nm) 23 7 Despigment ado polimeriza do (0,02) 90,6 0,494 169 1,2 (91,5%) 0,769 (268nm) 17 2 64

Exemplo 8 Extrato alergénico de Phleum pratense [0131] 0 pólen de Phleum pratense colhido da planta após polinização foi desengordurado com acetona fria numa proporção 1:4 (p/v) sob agitação contínua durante 3 horas a 3-5°C. A solução resultante foi filtrada num funil de Buchner e lavada pelo menos três vezes com acetona fresca. Depois de terminado o processo, o extrato de amendoim desengordurado foi colhido e seco à temperatura ambiente numa câmara de fluxo laminar durante 12 horas, até o material estar totalmente seco e toda a acetona ter sido removida.

[0132] 0 extrato alergénico de Phleum pratense polimerizado despigmentado foi obtido de acordo com os passos B-D do método. No passo D o processo de polimerização consiste na adição de glutaraldeído usando um fator de 0,009 ml de glutaraldeído/ml de extrato.

[0133] O produto final consiste num extrato de Phleum pratense polimerizado e despigmentado liofilizado, para ser armazenado a 4°C em condições de liofilização. O produto resultante tem de cumprir as especificações seguintes: a. Produto solúvel em água b. Isento de proteínas/alergénios não polimerizados com um peso molecular inferior a 100 kDa (identificados como bandas por SDS-PAGE em condições não redutoras) c. Isento de bandas de reconhecimento de IgE com um peso molecular inferior a 100 kDa (identificadas por imunomarcação em condições não redutoras) 65 d. Isento de moléculas polimerizadas com peso molecular inferior a 100 kDa (determinado por cromatografia de exclusão de tamanho com HPLC) e. Redução dos grupos amino livres (75%) em relação ao extrato nativo (determinado pelo método fluram) f. Redução significativa da potência biológica em relação ao extrato nativo (determinado por experiências de inibição de ELISA de IgE usando um conjunto específico de soros de indivíduos sensibilizados) g. Ausência de toxicidade anormal em ratos

Teor do alergénio principal [0134] 0 teor de alergénio principal Phl p 5 é determinado usando o kit Indoor Biotech. O anticorpo IgGl monoclonal anti-Phl p 5 é revestido (1:1000 do frasco preparado a 2 mg/ml). A curva padrão é preparada usando um Phl p 5a recombinante. 0 anticorpo secundário consiste num anticorpo

IgGl monoclonal biotinilado desenvolvido contra o alergénio de Phleum pratense. Amostras nativas e despigmentadas são diluidas a 250 ng/ml. O teor do alergénio principal é calculado em extratos polimerizados usando estes valores.

[0135] O pélete compreendendo resíduo despigmentado/ polimerizado foi utilizado como controlo na caracterização dos extratos nativos, despigmentados e despigmentados/ polimerizados (consultar a Tabela 9). 66

Tabela 9 - Resumo dos resultados obtidos para o Exemplo 8 (Phleum pratense)

Phleum pratense Rendimen to (%) ELISA inib.(IgE ) 50% de inibição (mg) (perda de potência em %) Teor protei co mg prot./ mg Potên cia (HEPL /mg) SDS- PAGE (kDa) Imuno marca ção Tamanho molecular (kDa) Nativo 8,42 0,089 409, 9 904,5 10-100 1478 10-100 Despigme ntado polimeri zado (0,009) 45, 0 00,341 446, 0 35,3 10-100 28 10-100 Despigme ntado polimeri zado (0,009) 98,0 0,305 464,3 13,2 >100 Ausent e >100 Despigme ntado polimeri zado (0,013) 19, 85 0,429 420,5 19,3 >100 Ausent e >100 Despigme ntado polimeri zado (0,02) 57,5 1,274 1234,8 14,4 >100 Ausent e >100 67

Referências bibliográficas [0136] 1. Vickery, B., Burks, W. Immunotherapy in the treatment offood allergy: focus oral tolerance. Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 2009; 9:364-370. 2. King, R.M., Knibb, R.C., and Hourihane, J.O.B. Impact of peanut allergy on quality of life, stress and anxiety in the famiily. Allergy 2009; 64: 461-468. 3. Enrique, E., Pineda, F., Malek, T., Bartra, J., Basagana, M., Telia, R., Castelló, J.V., Alonso, R., de Mateo, J.A., Cerdá-Trias, T., San Miguel-Moncín Mdel, M., Monzón, S., Garcia, M., Palacios, R., Cisteró-Bahíma, A. Sublingual immunotherapy for hazelnut food allergy: a randomized, double-blind, placebo-controlled study with a standardized hazelnut extract. J. Allergy Clin. Immunol. 2005; 116 (5) :1073-9. 4. Fernández-Rivas, M., Garrido Fernández, S., Nadai, J. A., Diaz de Durana, M.D., Garcia, B.E., González-Mancebo, E., Martin, S., Barber, D., Rico, P., Tabar, A.I. Randomized double-blind, placebo-controlled trial of sublingual immunotherapy with a Pru p 3 quantified peach extract. Allergy. 2009; 64(6):876-83. 5. Hofmann, A.M., Scurlock, A.M., Jones, S.M., Palmer, K. P., Lokhnygina, Y., Steele, P.H., Kamilaris, J., Burks, A.W. Safety of a peanut oral immunotherapy protocol in children with peanut allergy. J. Allergy Clin. Immunol. 2009 May 26. 6. Jones, S.M. , Pons, L., Roberts, J. L., Scurlock, A.M. Perry, T . T . , Kulis, M., Shreffler, W.G., Steele, P. Henry, K.A. , Adair, M., Francis, J.M., Durham, S. 68

Vickery, B.P., Zhong, X., Burks, A.W. Clinicai efficacy and immune regulation with peanut oral immunotherapy. j. Allergy. Clin. Immunol. 2009 Aug; 124(2):292-300, 300. 7. Clark, A.T., Islam, S., King, Y. Successfull oral tolerance induction in severe peanut allergy. Allergy 2009 Aug; 64(8):1218-20. 8. Wallace DV. Pet dander and perennial allergic rhinitis: therapeutic options. Allergy Asthma Proc. 2009 Nov-Dec; 30(6):573-83. 9. Ling M, Long AA Pet dander and difficult-to-control asthma: Therapeutic options. Allergy Asthma Proc. 2010 Sep; 31 (5) :385-91. 10. Grõnlund H, Saarne T, Gafvelin G, van Hage M. The major cat allergen, Fel d 1, in diagnosis and therapy. Int Arch Allergy Immunol. 2010; 151 (4) :265-74. Epub 2009 Oct 22. Review

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Lisboa

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para produzir um extrato alergénico compreendendo: a) colocar um material de base compreendendo um alergénio em contacto com um agente de extração liquida para produzir uma mistura contendo lípidos dissolvidos em fase liquida e uma fase sólida que consiste em resíduo de material de base incluindo alergénios e proteínas. b) sujeitar a mistura a um primeiro passo de separação para isolar o resíduo do material de base, c) colocar o resíduo de material de base em contacto com um agente de extrato alergénico para produzir uma mistura de alergénios dissolvidos em fase líquida, e uma fase sólida que consiste em resíduo não alergénico, d) sujeitar a mistura a um segundo passo de separação para isolar os alergénios dissolvidos em fase líquida, para produzir um extrato de alergénio em bruto, e) sujeitar o extrato bruto de alergénio a um passo de remoção da fração de baixo peso molecular para remover moléculas com um tamanho molecular inferior a 3,5 kDa, f) repetir o passo e) até o extrato alergénico ter uma condutividade inferior a 1000 mS/cm a 3-5°C para obter um extrato alergénico nativo purificado. g) acidificar o extrato alergénico nativo até um pH de 2 a 3,0 e manter o extrato acidificado durante 5-30 minutos, depois sujeitar o extrato a um passo de remoção da fração de baixo peso molecular para remover moléculas com um tamanho molecular inferior a 3,5 kDa, e ajustar o pH para 7,0-8,0 para produzir um extrato alergénico despigmentado. 1 h) colocar um extrato alergénico despigmentado em contacto com glutaraldeído ou formaldeído, i) sujeitar o extrato a um passo de remoção da fração de baixo peso molecular para remover moléculas com um tamanho molecular inferior a 100 kDa, e j) executar o passo i) até o extrato alergénico ter uma condutividade inferior a 210 mS/cm a 3-5°C e/ou ficar livre de glutaraldeido conforme determinado por varrimento UV ou visível, para obter um extrato alergénico polimerizado despigmentado.
2. 2. Um processo como reivindicado na reivindicação 1 em que o passo de remoção da fração de baixo peso molecular (f) é prosseguido até a condutividade ser inferior a 500 mS/cm a 3-5°C.
3. 3. Um processo como reivindicado na reivindicação 1 em que o extrato alergénico nativo é acidificado até um pH de 2 a 2,1.
4. 4. Um processo como reivindicado na reivindicação 1, em que o extrato alergénico nativo é acidificado até um pH de 2 a 4,0.
5. 5. Um processo de acordo com as reivindicações 1-4, em que o aldeído é adicionado ao extrato numa velocidade de adição entre 0,001-0,5 ml por minuto.
6. 6. Um processo como reivindicado nas reivindicações 1-5, em que o passo de remoção da fração molecular (j) é prosseguido até a condutividade se situar entre 50 e 200 mS/cm a 3-5°C. 2
7. 7. Um processo de acordo com a reivindicação 1-6, em que os passos de remoção da fração de baixo peso molecular e) ou g) compreendem um passo de ultrafiltração, um passo de diafiltração, um passo de diálise ou filtração.
8. 8. Um extrato alergénico polimerizado despigmentado obtido de acordo com o processo das reivindicações 1-7.
9. 9. Um extrato alergénico de acordo com a reivindicação 8, em que o material de base é selecionado de entre alergénios alimentares, amendoins, amendoins inteiros, alergénios aéreos (e.g. pólen (pólen de árvore, pólen de erva, pólen de gramineas, pólen de cereal), ácaros do pó, fungos, bolores)), alergénios de ácaros, gramineas, árvores e ervas, alergénios epiteliais (pelo animal, e.g. pelo de gato e pelo de cão) e alergénios de insetos (e.g. barata, pulgas, veneno de abelha e vespa).
10. 10. Um extrato alergénico da reivindicação 9 em que o material de base é selecionado de entre amendoim (Arachis hypogea), pólen (Olea europaea, Parietaria judaica, Phragmites communis e Phleum pratense) , ácaros (Dermatophagoides pteronyssinus) e epitélio (pelo de gato).
11. 11. Um extrato alergénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-10 para uso no fabrico de um medicamento para o tratamento de alergia. 3
12. 12. Uma composição farmacêutica compreendendo um extrato alergénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-11.
13. 13. A composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 12, compreendendo ainda um ou mais adjuvantes, diluentes, conservantes ou misturas destes.
14. 14. Uma vacina compreendendo um extrato alergénico de acordo com qualquer uma das reivindicações 8-13.
15. 15. A vacina de acordo com a reivindicação 14, compreendendo ainda um ou mais adjuvantes, diluentes, conservantes ou misturas destes. Lisboa, 4